WO1995016459A1 - Methode de superovulation dirigee des femelles bovines mises en anoestrus prolonge, methode de mise en anoestrus et kit de superovulation - Google Patents

Methode de superovulation dirigee des femelles bovines mises en anoestrus prolonge, methode de mise en anoestrus et kit de superovulation Download PDF

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WO1995016459A1
WO1995016459A1 PCT/FR1994/001464 FR9401464W WO9516459A1 WO 1995016459 A1 WO1995016459 A1 WO 1995016459A1 FR 9401464 W FR9401464 W FR 9401464W WO 9516459 A1 WO9516459 A1 WO 9516459A1
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lhrh
hormone
formulation
days
fsh
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PCT/FR1994/001464
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Raymond Dufour
Marc Maurice Teichner
Claire Chouvet
Original Assignee
Rhone Merieux
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    • A61K38/09—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH], i.e. Gonadotropin-releasing hormone [GnRH]; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]

Definitions

  • the present invention relates to a method of supervised superovulation of bovine females after anestrus and also, in particular, to the specific method of anestrus of these animals. It also relates to a superovulation kit for female bovines.
  • Each of them is formed by the simultaneous recruitment of several small diameter antral follicles which are detected as soon as their diameter is close to 4 mm. Their growth quickly reveals a dominant follicle, larger than the others, which can be ovulatory (dominant follicle of the 2nd or 3rd wave in the cycles of 2 or 3 waves respectively) or anovulatory (dominant follicle of the or the 2nd wave in the cycles with 2 or 3 waves respectively).
  • the other follicles, or overlapped follicles differ from the previous one by stopping their growth, which is followed by their regression.
  • the inhibitory action of the dominant follicle present on the superovulation response to FSH treatment has been clearly demonstrated (LA.
  • the superovulation treatments carried out on the 1st wave of follicles only make it possible to obtain a number of ovulations lower than that which is obtained by the application of the treatment on the other waves.
  • the comparison of the results obtained on the 1st wave (GP Adams et al., Anim. Reprod. Sci., 1993, 30, 259-71) are clearly lower than those obtained by intervening on the 2nd wave (LA Guilbaut et al ., J. Reprod. Fert., 1991, 91, 81-89) between days 7 and 12 of the cycle. It shows that the application of the superovulation treatment on the 1st wave cannot bring any advantage in current practice although the follicular development of the 1st wave is a preferred physiological study model.
  • FSH appears after the selection period at the time of basal FSH secretion and is believed to be due to the direct inhibitory action of growing follicles.
  • hCG chorionic gonadotropin
  • the subject of the invention is therefore a method of directed superovulation of bovine females, comprising the following steps:
  • the proposed superovulation method therefore consists in deciding when to recruit the follicles, to stimulate their growth by treatment with the hormone.
  • FSH gonadotrope associated or not with LH to isolate the growing follicles from any indirect inhibitory or stimulatory action originating from the ovarian action on the hypothalamic-pituitary-ovarian axis to suppress or greatly reduce the divergence between ovulatory and non-ovulatory follicles and induce ovulation by providing, at a determined time in the development of follicles, LH or hCG in sufficient quantity and for a sufficient time.
  • the new mode of secretion of gonadotropic hormones has resulted in the suppression of oestrus cycles.
  • This state of anoestrus is controlled, after the disappearance of the luteal phase existing at the time of application of the treatment (preferred time), by maintaining the level of plasma progesterone below the detection threshold. Treatment preferably begins at the start of this luteal phase.
  • Desensitization of the pituitary gland to the action of the endogenous LHRH hormone can be obtained in particular either by the administration of a LHRH agonist analogue at high (supraphysiological) and continuous dose, or by the administration of an analogue LHRH antagonist, during the time necessary for the establishment and maintenance of the deep anestrus allowing the application of the successive treatment or treatments of superovulation, fertilization of the oocytes by artificial insemination and harvesting of the embryos, which will be followed by their transfer before or after freezing.
  • These last three techniques are the usual techniques used by people specialized in artificial insemination operations, harvesting and transfer of embryos.
  • formulations allowing the continuous release of the LHRH analog over a duration which determines the duration of the deep anestrus phase.
  • LHRH agonist analogue it is necessary to understand as is the custom any molecule possessing the biological properties of natural LHRH, that is to say in particular action on the pituitary gland triggering a secretion of LH and FSH. It can also be the LHRH itself.
  • LHRH agonist analogues are known to specialists today and it is therefore not within the scope of this request to cite them all. They can be of natural, recombinant or synthetic origin, that is to say obtained by complete chemical synthesis or by chemical modification of a natural molecule, for example by substitution of amino acids and / or modification of the carboxyterminal or aminoterminal ends.
  • the invention preferably uses the analogue D.Trp 6 -LHRH (patent FR-A-2 313 940) or Des-Gly-D.Trp 6 -LHRH ethylamide (patent FR-A-2 397 192).
  • the effect sought with the agonist is a saturation of the LHRH receptors that lasts throughout the chosen period of deep anestrus.
  • the agonist is therefore administered so that, throughout the period of administration, it is in supraphysiological concentration in the blood, which means that the agonist concentration remains at a level always higher than the peaks of secretion of endogenous LHRH by l 'hypothalamus. This is the application to the pituitary gland of the well-known phenomenon of desensitization (called "downregulation" of LHRH receptors by the Anglo-Saxons).
  • the dosage depends on the formulation which itself defines the duration of release. We cannot in fact define the minimum plasma content required for analog because, below a certain threshold, techniques no longer allow the actual concentration of analog to be detected and measured.
  • the desired deep anestrus effect is characterized specifically by a stop in follicular development during the entire deep anestrus phase, this state being able to be confirmed in particular by ultrasound examinations. In particular, the ultrasound examination will essentially reveal the existence of follicles of diameter not not exceeding approximately 14 mm, preferably approximately 10 mm.
  • the doses of agonists may be as follows: - for a release formulation of the order of 40 to 50 days: from 15 to 150 mg, in particular from 25 to 100 mg.
  • a release formulation of the order of 85 to 100 days from 30 to 300 mg, in particular from 50 to 200 mg, or approximately twice the doses chosen for the shorter release.
  • the minimum doses may be increased or decreased for animals whose weight deviates appreciably from the arbitrary average of 500 kg (respectively greater than 500 kg and less than 500 kg)
  • the animal is administered a dose of this LHRH agonist of between 40 and 150 mg approximately and preferably approximately 50 and 100 mg.
  • the dose can be between 100 and 300 mg approximately.
  • Des-Gly-D.Trp 6 -LHRH ethylamide has been shown to be effective at doses slightly lower than those of the previous one; in particular, efficacy has been demonstrated at doses of 16.7, 33.7 and 50.1 mg of agonist with a release time of the order of 40 to 50 days approximately.
  • the effective dose under these conditions is greater than 16-17 mg and even approximately 15 mg, preferably greater than 25 mg, in particular between 30 and 40 mg approximately and more particularly of the order of 33 or 34 mg, agonist for a formulation with a release time of the order of 40 to 50 days.
  • the effective dose for a release formulation of approximately 85 to 100 days preferably corresponds approximately to twice the dose for 40 to 50 days.
  • a dose greater than 30 mg may therefore be administered in particular, in particular a dose between 60 and 80 mg.
  • the invention also provides for the use of LHRH antagonist analogues.
  • LHRH antagonist analogues This is what is commonly known as molecules opposing the action of endogenous LHRH by their attachment to receptors specific to this hormone. Their action is faster than that of agonists and requires concentration to block the receptors on the duration chosen for deep anestrus.
  • the antagonists do not cause a short-term prime stimulation effect on the secretion of LH and FSH, as is the case with the agonists before obtaining the state of desensitization.
  • LHRH LHRH.
  • Use may in particular be made of the antagonists described in international patent application WO 92/19651 (agonists according to the sequences SEQ ID NO: 1 and NO: 2 described in this application) and the agonists ORG 30850 (GHJ Deckers et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol., Vol. 42, 705 - 712, 1992), Antide (K. Wallen et al., Physiology & Behavior, vol. 50, 429-435, Pergamon Press pic, 1991). See also in V.J. Cseraus et al., P.N.A.S. USA, vol. 89, 5759-5763, 1992.
  • GnRH has already been described in cattle for a different purpose from that which is the subject of the invention.
  • the administrations of synthetic GnRH to the prepubescent heifer (SE Dodson et al., J. Reprod. Fertil., 1988, 82, 526-538) or of busereiine (F. Grassalli et al., Anim. Reprod. Sci. , 1993, 32, 153-161) are performed at low doses, are limited to 10-15 days, and are intended to trigger early ovulation.
  • FSH FSH
  • This parenteral supply is carried out by administration at least twice a day, at regular intervals, or by a continuous release system (for example as described for the LHRH analog).
  • This intake is preferably maintained for 4 to 7 days.
  • Administration of LH or hCG is preferably carried out for about 1 to 2 days, and preferably begins on the last day of administration of FSH. LH or hCG should generally be avoided during heat.
  • the administration will be carried out when the size of the follicles is at least 14 mm, in particular of the order of 14-15 mm.
  • the LH used is either an extraction hormone, porcine, ovine or bovine or equine or a recombinant hormone.
  • the subject of the invention is also the method itself, as defined above, which consists in administering to the animal an analog, agonist or antagonist, of LHRH so as to desensitize the pituitary gland to the action of endogenous LHRH, to obtain a deep anestrus.
  • desensitization of the pituitary gland to endogenous LHRH can also be achieved by anti-LHRH immunoneutralization by active or passive route.
  • the invention also relates to a superovulation kit for bovine females, comprising, separately, a continuous-release formulation comprising as active ingredient an LHRH analog, a formulation comprising as active ingredient FSH hormone and a formulation comprising an active principle chosen from the group consisting of hormone LH and hormone hCG.
  • a superovulation kit for bovine females comprising, separately, a continuous-release formulation comprising as active ingredient an LHRH analog, a formulation comprising as active ingredient FSH hormone and a formulation comprising an active principle chosen from the group consisting of hormone LH and hormone hCG.
  • the formulations are in particular in accordance with what has been described above.
  • FIG. 1 a graph presenting, for cow no 1, the profile of the plasma concentration of progesterone, determined by radioimmunoassay, after injection on day 0 of a PLG 50:50 / D.Trp 6 -LHRH formulation (150 mg of agonist analog) having a release profile of the order of 40 days, the plateau which corresponds to the absence of detection of plasma progesterone representing the phase of deep anestrus - this graph corresponds to table 1;
  • FIG. 5 a graph presenting the profile of the plasma progesterone concentration of a control cow which has not received an LHRH analog formulation - the cycles are proceeding normally.
  • fatty substances represented in particular by fatty acids and esters of fatty acid or of polyethylene glycol.
  • the first formulation method uses degradable polymers from the poly (lactide-glycolide) and poly (lactic-glycolic) (PLG) family. These polymers have a very satisfactory biocompatibility and have the capacity to hydrolyse to generate natural components, lactic acid and glycolic acid.
  • the rate of hydrolysis of these polymers is adjustable as a function essentially of the ratio of the lactide and glycolide comonomers, of the molecular mass of the polymers, and of the lactide isomers used. This speed is maximum when the ratio is equal to 50/50, then it decreases when the proportion of lactide increases. This property is used to modulate the release time of the LHRH analogs from a dosage form produced with these polymers.
  • LHRH analogs and more particularly LHRH agonists are peptides insoluble in a PLG matrix. These compounds are generally present in the form of a microdispersion in the excipient PLG.
  • the dosage form can be variable: films, implants or microspheres. The latter dosage form has the advantage of being easily injectable, after resuspension in a suitable liquid.
  • the microencapsulation methods allowing this galenical form to be obtained are variable, essentially: microencapsulation by coacervation, by evaporation of solvent, and the spray-drying method. The microencapsulation method by solvent evaporation is described in Example 1.
  • the release mechanisms of the LHRH agonist from the dosage form are varied:
  • this mode of diffusion of an active principle dispersed in a hydrophobic polymer matrix is linked to the interconnection of the particles of active principle between them, this interconnected network itself being in contact with the external medium.
  • the release of the active ingredient is linked to the gradual penetration of biological fluids into the network, allowing the active ingredient to dissolve and spread to the outside environment.
  • This release mode is modulated quantitatively and over time by the proportion of active ingredient dispersed in the polymer matrix, the solubility of the active ingredient, its particle size.
  • the hydrolysis of the polymer for example a PLG, splits the polymer chains into shorter, water-soluble fragments over time. This phenomenon induces an increase in hydrophilicity and in the porosity of the dosage form, allowing the penetration of biological fluids and the extraction of the active principle. This release mechanism is modulated over time by the rate of hydrolysis of the polymer and by the initial molecular weight of the polymer.
  • 2nd phase diffusion phase linked to percolation, the release rate of which is controlled by the proportion of LHRH agonists used in the formulation of microspheres.
  • the duration of this phase is controlled by the ratio of lactide / glycolide co-monomers, and by the initial molecular weight of the polymer. This phase is all the shorter as the lactide / glycolide ratio is close to 50/50 and the initial molecular weight of the polymer is low.
  • 3rd phase release phase linked to the hydrolysis of the polymer, the duration of which is controlled essentially by the lactide / glycolide ratio. This duration can vary from about a month to more than a year. The release rate is generally higher than that of the previous phase.
  • the three-phase release profile can be modified with the formulation parameters:
  • the increase in the release rate during the 2nd phase is obtained by increasing the proportion of active ingredient in the formulation, the release kinetics tending towards a regularly decreasing profile over time.
  • Non-triphasic, but relatively constant or regularly decreasing release profiles are also obtained with low molecular weight polymers, for example poly (DL lactide) with molecular weight of the order of 2000. These polymers can be used pure in the formulation, or previously mixed with polymers of higher molecular weight, then formulated.
  • poly (DL lactide) with molecular weight of the order of 2000.
  • the combination of the formulation parameters makes it possible to obtain durations and controlled release profiles.
  • the total release time of an LHRH agonist can be adjusted to reach periods varying from a few days to more than a year.
  • a second formulation method uses fatty substances, for example fatty acids or fatty acid esters, formulated as implants or microspheres with the active principle.
  • fatty substances for example fatty acids or fatty acid esters, formulated as implants or microspheres with the active principle.
  • the release mechanism of an agonist for example fatty acids or fatty acid esters, formulated as implants or microspheres with the active principle.
  • the proportion of agonist incorporated into the formulation the duration of release decreases with the increase in the proportion of agonist incorporated.
  • the HLB value Lipophilic Hydrophilic Balance of the lipid excipient: the increase for example from 1 to 5 of the HLB value of the lipid excipient makes it possible to reduce from 5 months to one week the total duration of release of a LHRH agonist incorporated into lipid implants.
  • the measurement of the plasma concentrations of released D.Trp 6 -LHRH and of progesterone is carried out by radioimmunological method.
  • the radioimmunoassay of plasma D.Trp 6 -LHRH is based on the principle of a competitive inhibition reaction between D.Trp 6 -LHRH labeled with 125 I in constant quantity and the standard D.Trp 6 -LHRH or that contained in the plasma samples, with respect to the binding sites of an anti-D.Trp 6 -LHRH serum.
  • the amount of D.Trp 6 -LHRH is expressed in ng / ml of plasma.
  • the radioimmunoassay of progesterone plasma is carried out by direct method using progesterone marked by the 25 I. It is based on a competitive inhibition reaction between the labeled progesterone in a constant quantity and the standard progesterone or that contained in plasma samples. The amount of progesterone is expressed in ng / ml of plasma.
  • the desensitization treatment was applied to 4 cows using the LHRH agonist analog, D.Trp 6 -LHRH. This was incorporated into microspheres of lactic-glycolic copolymers which ensure a detectable plasma concentration in the bovine female for 40 days for a first formulation and 85-100 days for the second.
  • This formulation allows the agonist D.Trp 6 -LHRH to be released for approximately 40 days at detectable levels in cows.
  • 45 mg of a lyophilizate of D. Trp 6 -LHRH (trifluoroacetate) are weighed and then dispersed in a solution composed of 1455 mg of poly (DL lactide-glycolide) 50:50 with an inherent viscosity 0.4 dl / g, in 5 , 4 ml of dichloromethane with stirring.
  • This solvent allows the fine dispersion of the lyophilisate and allows the polymer to dissolve.
  • the dispersion is injected through a tube 2 mm in diameter into 450 ml of a solution of 1% polyvinyl alcohol in demineralized water at 25oC, with stirring of a propeller rotating at 700 revolutions per minute.
  • Two drops of an anti-foam silicone emulsion are distributed, then the dichloromethane is evaporated by diffusion of compressed air into the mixture.
  • the hardened microspheres are collected by vacuum filtration, washed with demineralized water and are then dried on a filter paper. Additional washing with 40 ml of trichloro 1,1,2 trifluoro 1,2,2 ethane eliminates the residual anti-foam silicone.
  • the microspheres are dried, then stored at + 4oC.
  • D.Trp 6 -LHRH The amount of D.Trp 6 -LHRH present in the microspheres is determined by an extraction method then assay in high performance liquid chromatography.
  • microspheres equivalent to 150 mg of D.Trp 6 -LHRH incorporated is distributed in 2 syringes.
  • the microspheres of each syringe are suspended in 20 ml of a viscous liquid composed of 2% carboxymethyl cellulose and 0.2% Tween 80 in solution in physiological water, then are injected by deep intramuscular route in the neckline.
  • This formulation frees the agonist for approximately 85-100 days.
  • the same method of preparation is adopted with a 65:35 poly (DL lactide-glycolide) polymer with an inherent viscosity 0.34 dl / g: 90 mg of a lyophilizate D. Trp 6 -LHRH are weighed and then dispersed in a compound solution. 1410 mg of poly (DL lactide-glycolide) 63:35 in 3 ml of dichloromethane, with stirring. The subsequent steps are identical to the previous description.
  • microspheres based on lactic-glycolic copolymers were carried out at the start of the luteal phase. It resulted in an extension of the luteal phase on all animals, compared with the duration of the luteal phase of the previous cycle.
  • progesterone secretion defined anoestrus in the absence of other examinations (ultrasound, LH and FSH assays).
  • the end of the anestrus period is less precise and must occur a few days before the reappearance of progesterone.
  • the ultrasound examination was limited to 2 observations at one week intervals at specific times during treatment, on the one hand towards the probable end of its effectiveness, one month after the disappearance of detectable traces of D.Trp 6 -LHRH in plasma, on the other hand during the stationary phase of treatment, marked by a stable concentration characteristic of the LHRH agonist.
  • This anestrus could be classified into two very different states in one and the other moment, a deep anestrus during the phase corresponding to the demonstration in the plasma of the agonist, a light anestrus one month after the disappearance of plasma of D.Trp 6 -LHRH.
  • Table 1 and Figures 1 and 2 relate to cows 1 and 4 having received short-term desensitization treatment (40 detectable days).
  • the end of the luteal phase begins 21 days after administration at the start of the luteal phase for cows 1 and 4.
  • the ultrasound examination was carried out 1 month after the disappearance of the measurable plasma D.Trp 6 -LHRH, i.e. 65 and 72 days for cow 1 and 58 and 65 days for cow 2 after administration of the microspheres; it led to the following observations (number of follicles F and diameter in mm) which reflect a slight anoestrus: a) Cow no 1 (1393)
  • Table 2 and Figures 3 and 4 relate to cows 5 and 6 having received long-term desensitization treatment (D.Trp 6 -LHRH detectable in plasma for 86 and 103 days).
  • the end of the luteal phase begins, for cow 5, 15 days, and for cow 6, 25 days, after administration at the start of the luteal phase.
  • Table 3 and Figure 5 relate to the progesterone measurements made on a control cow (1398).
  • the desensitization treatment was applied to 6 cows using the LHRH agonist analogue, D.Trp 6 -LHRH.
  • This stage can be triggered at any time during the deep anestrus phase.
  • the time necessary to reach the embryos and their harvest since it is preferable that all operations, including the harvesting of the embryos, be carried out inside the deep anestrus phase. From the start of FSH treatment, it takes around 18 to 21 days until the embryos are collected. For the formulations used during the tests described above, the period of establishment of the deep anestrus is on average:
  • This period is easy to determine for each formulation during an anestrus test and the monitoring of the evolution of the progesterone concentration (and ultrasound examination and possibly FSH measurement to confirm the state of deep anestrus ).
  • the animal is administered FSH hormone, possibly in the presence of the LH hormone.
  • - FSH extraction hormone preferably of porcine, ovine (or bovine or equine) origin, had recombinant hormone;
  • - daily dosage depending on the origin of the hormone from 30 to 300 ⁇ g / d, preferably between 80 and 140 ⁇ g / d approximately, for example of the order of 125 ⁇ g / d.
  • Duration of treatment 4 to 7 days, the objective being to obtain follicles of approximately 14-15 mm.
  • - dose from 2 to 6 mg / day for LH or from 3,000 to 6,000 IU / day for hCG.
  • a continuous release formulation can be used.
  • This treatment triggers ovulation.
  • estrus preceding the treatment can be synchronized (which is optional) by methods well known to specialists.
  • the observation of the ovaries is recorded on videotape. It is performed daily from the detection of heat that precedes the pituitary desensitization treatment until the end of the superovulation treatment.
  • the hormones FSH, LH and progesterone were measured:
  • LH 6 times a day, every hour between 8 and 12 hours from the day before the agonist's injection until the start of superovulation treatment.
  • FSH 2 times a day, at 8 and 9 a.m., from the day before the agonist's injection until the start of superovulation treatment. The day of the injection of the agonist, 5 samples were taken, every hour between 8 and
  • Progesterone 1 time per day from the day before the agonist's injection until the end of the superovulation treatment. The animals were their own control in an oestrian cycle preceding the treatment.
  • the first folliculogenesis stimulation treatment using the Stimufol product (sold by RHONE MERIEUX, FRANCE; composition: FSH porcine 500 ⁇ g and LH porcine 100 ⁇ g per bottle, to be taken up in a volume of 10 ml) started 10 days after the disappearance of the last follicle with a diameter greater than 10 mm and was carried out under the usual conditions of a superovulation treatment at constant daily dose. The dosage used was different depending on the animals. Stimufol injections were given twice a day by intramuscular injection and were spaced 10 to 12 hours apart.
  • prostaglandins Prosolvin 3 ml
  • Stimufol treatment was stopped at the onset of heat, at the earliest after the 8th injection.
  • the ovulatory injection of purified porcine LH or hCG was carried out at the time of heat, at the earliest 12 hours after the 8th injection of Stimufol, or after their appearance on the criterion of a follicular size at least equal to 14 mm .
  • the average concentrations of LH between D4 and D14 of the cycle on the same animals do not differ from those which are measured after treatment; only the standard error is greater before treatment and reflects fluctuations in secretion in the untreated (0.07 - 0.139 ng / ml compared to 0.015 - 0.022 ng / ml).
  • the number of follicles from the size of 5 to 7.5 mm is greater than or equal to 10.
  • the average size of the follicles ranges from 11.9 to 15.9 mm depending on the animal.
  • Ovulation induction was only effective when it occurred in follicles 14-15 mm in size. Performed at the time of heat on follicles smaller in size, it was not effective.

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Abstract

Méthode de superovulation dirigée des femelles bovines, comprenant les étapes suivantes: administrer à l'animal un analogue de la LHRH de manière à désensibiliser l'hypophyse à l'action de la LHRH endogène, à l'instant de son choix à l'intérieur de la période d'anoestrus profond ainsi induite, administrer à l'animal de l'hormone FSH de manière à induire le recrutement et le développement des follicules ovulatoires, en fin de développement, administrer à l'animal une hormone choisie parmi le groupe consistant en LH et hCG, de manière à déclencher l'ovulation de ces follicules. La méthode peut être mise en ÷uvre avec des kits contenant les préparations d'hormones.

Description

Méthode de superovulation dirigée des femelles bovines mises en anoestrus prolongé, méthode de mise en anoestrus et kit de superovulation.
La présente invention a trait à une méthode de superovulation dirigée des femelles bovines après mise en anoestrus et aussi, en particulier, à la méthode spécifique de mise en anoestrus de ces animaux. Elle concerne aussi un kit de superovulation pour femelles bovines.
La variabilité dans le nombre d'ovocytes obtenus après le traitement de superovulation couramment appliqué et reposant sur l'emploi combiné, d'une part de l'hormone gonadotrope FSH (Follicle Stimulating Hormone) en présence de plus ou moins de LH (Luteinizing Hormone) et, d'autre part, d'un médicament lutéolytique, limite le développement de la technique de production d'embryons de bovins par la femelle suoerovulée. Bien que l'importance du moment de l'application du traitement sur les résultats de la superovulation ait été décrite très antérieurement (D. Monniaux et al-, Theriogenelogy, 1983, 19, 55-81), ce sont les travaux récents sur les propriétés respectives des follicules apparaissant au cours de l'intervalle interovulatoire et les modifications concomitantes de la FSH plasmatique qui ont mis en lumière le rôle de certains mécanismes de régulation de la croissance des follicules antraux.
Chez les bovins, l'observation des follicules par les méthodes d'échographie a montré que la croissance folliculaire intervient sous forme de vagues au nombre de 2 ou 3 (Travaux de J. Ireland et J.F. Roche, 1983 cités par J.F. Roche et al., Theriogenelogy, 1991, 3 (1), 81-89) dans l'intervalle interovulatoire normal.
Chacune d'elles est constituée par le recrutement simultané de plusieurs follicules antraux de petit diamètre qui sont décelés dès que leur diamètre est voisin de 4 mm. Leur croissance laisse apparaître rapidement un follicule dominant, plus grand que les autres, qui peut être ovulatoire (follicule dominant de la 2e ou de la 3e vague dans les cycles à 2 ou 3 vagues respectivement) ou anovulatoire (follicule dominant de la le ou de la 2e vague dans les cycles à 2 ou 3 vagues respectivement). Les autres follicules, ou follicules surbordonnés, se différencient du précédent par l'arrêt de leur croissance, qui est suivie de leur régression. L'action inhibitrice du follicule dominant présent sur la réponse de superovulation au traitement par la FSH a été bien mise en évidence (L-A. Guilbaut et al., J. Reprod. Fert., 1991, 91, 81-89). Ces auteurs ont en effet montré qu'en l'absence de follicule dominant, le taux d'ovulation est plus élevé et moins variable qu'en sa présence. Cependant, ils observent qu'en présence du follicule dominant deux classes de réponse ovulatoire peuvent être décrites qu'ils qualifient de réponse de superovulation élevée ou basse. Cette expérimentation montre l'intérêt d'appliquer le traitement de superovulation au moment du cycle oestrien ne présentant pas de follicule dominant et conduit à mettre en oeuvre systématiquement un examen échographique quotidien avant de déterminer le moment le plus propice à l'application du traitement par la FSH.
Une étude reposant sur les variations de la concentration plasmatique de FSH entourant la sélection du follicule dominant a permis de comparer les réponses de superovulation obtenues après l'application du traitement avant ou immédiatement après la sélection du follicule dominant (G.P. Adams et al., Anim. Reprod. Sci, 1993, 30, 259-271). Les auteurs ont montré dans leurs deux essais effectués sur la première vague de follicules l'importance de l'apport de FSH au moment de l'émergence du follicule dominant sur le maintien de la croissance des follicules subordonnés et leur transformation en follicules ovulatoires. L'accroissement de la taille des follicules subordonnés jusqu'au stade ovulatoire sous l'effet du traitement de superovulation par la FSH a entraîné une moindre croissance du follicule dominant. Les auteurs n'ont pas observé l'émergence d'une nouvelle vague sous l'action du traitement, même s'il intervient après la phase de sélection ( jour 5 ) où la concentration plasmatique de FSH est à son niveau le plus bas. Cet état réfractaire serait rapporté à l'action suppressive directe, des autres follicules, bien qu'il n'en existe aucune démonstration expérimentale. Cet état réfractaire à l'apparition d'une nouvelle vague fut également observé en présence du follicule dominant actif de la vague précédente (O.J. Ginther et al., J. Reprod. Fert., 1989, 87, 223-230).
Les connaissances acquises ces dernières années, illustrées par les travaux précités, montrent que l'efficacité du traitement de superovulation est augmentée si celui-ci intervient dès l'émergence du follicule dominant et pendant la durée de la phase dite de compétition au cours de laquelle les follicules subordonnés peuvent se développer si une quantité appropriée de FSH leur est fournie. Cette efficacité serait également augmentée en l'absence de follicules d'une vague antérieure pour éviter tout effet suppresseur de leur part. Les conditions physiologiques pouvant le mieux répondre à cette double exigence se rencontrent immédiatement après l'oestrus, état ovarien qui est caractérisé par la disparition du follicule dominant, l'absence concomitante de follicules en régression et le début de la croissance des follicules de la lère vague. Cependant les traitements de superovulation effectués sur la lère vague de follicules ne permettent d'obtenir qu'un nombre d'ovulations inférieur à celui qui est obtenu par l'application du traitement sur les autres vagues. La comparaison des résultats obtenus sur la lère vague (G. P. Adams et al., Anim. Reprod. Sci., 1993, 30, 259-71) sont nettement inférieurs à ceux qui furent obtenus en intervenant sur la 2ème vague (L.A. Guilbaut et al., J. Reprod. Fert., 1991, 91, 81-89) entre les jours 7 et 12 du cycle. Elle montre que l'application du traitement de superovulation sur la 1ère vague ne peut apporter aucun avantage dans la pratique courante bien que le développement folliculaire de la 1ère vague soit un modèle d'étude physiologique privilégié.
L'analyse descriptive de l'évolution des follicules ovariens a fait simultanément l'objet d'études sur les mécanismes indirects faisant intervenir les variations de la FSH plasmatique sur la croissance des follicules, la sélection du follicule dominant et la régression des follicules subordonnés (G. P. Adams et al., J. Reprod. Fert., 1992, 94, 179-188). Les auteurs ont étudié d'une part l'effet de la suppression du follicule dominant sur le devenir des follicules subordonnés et l'apparition d'une nouvelle vague de follicules. Ils ont étudié d'autre part l'action inhibitrice de l'injection de liquide folliculaire qui entraîne l'abaissement ou la suppression de la sécrétion de FSH, action due essentiellement à l'inhibine, sur le retard apporté à l'apparition d'une nouvelle vague de follicules ou sur des follicules en croissance d'une nouvelle vague. Des essais avaient permis à cette équipe (J.P. Kastelic et al., Theriogenology, 1990, 34, 499-509) de proposer qu'une nouvelle vague de follicules n'est pas à l'origine de l'atrésie du follicule dominant et des follicules subordonnés de la vague précédente. Dans leur étude (Adams, 1992), ils ont en effet observé que l'administration de liquide folliculaire, d'une part, entraînait l'arrêt de la croissance et la régression des follicules de la nouvelle vague, respectivement 1 et 5 jours après le début du traitement, et, d'autre part, entraînait la disparition de la FSH plasmatique sans accélérer l'involution des follicules de la vague précédente. Ces essais (Adams 1992 et Kastelic 1990-supra), ont permis également de montrer que l'abaissement de la sécrétion basale de FSH par ce traitement inhibait la croissance du follicule dominant. Pour les auteurs, cette observation renforcerait l'hypothèse que le follicule dominant reste dépendant d'une concentration basale de FSH, inférieure à celle qui est nécessaire aux autres follicules de la même cohorte.
Ces travaux (Adams, 1992 et 1993) ont montré qu'une décharge de FSH précède de 1 à 2 jours l'émergence d'une nouvelle vague de follicules, décelable par échographie, et qu'elle décline dès l'apparition de cette émergence. Cette diminution aboutit à la disparition de FSH 1 à 2 jours après l'apparition de la nouvelle vague.
Ils font ressortir :
a) que la présence de FSH est nécessaire pour assurer le recrutement des follicules d'une nouvelle vague, b) que le déclin rapide de la FSH entraîne la sélection du follicule dominant. L'origine de ce déclin de la sécrétion de FSH est attribué d'une part à l'action inhibitrice indirecte plus ou moins précoce des nouveaux follicules en croissance et d'autre part à l'abaissement important de la sécrétion hypophysaire après la libération initiale de la FSH stockée. Ce dernier serait responsable de la sélection et précéderait le mécanisme d'inhibition qui ne se mettrait en place qu'avec l'apparition de la sécrétion d'inhibine qui serait issue du follicule dominant.
c) qu'un certain état réfractaire à l'action de
FSH apparaît après la période de sélection au moment de la sécrétion basale de FSH et serait dû à l'action inhibitrice directe des follicules en croissance.
Les mécanismes d'action de la FSH dans la sélection du follicule dominant chez les femelles bovines ont été également décrits dans d'autres espèces et plus spécialement chez les femelles ovines, qui, à la différence des femelles bovines, présentent un anoestrus saisonnier (A. S. McNeilly, W. Crow, J. Bordes et G. Evans, J. Reprod. Fert. Suppl. 45, 1992, 5-19). Ces auteurs ont pu montrer que le recrutement et la croissance des follicules ovulatoires ne dépendaient que de l'apport de FSH en présence d'une sécrétion basale de LH en utilisant un modèle d' anoestrus qui est obtenu par l'administration continue et prolongée d'un analogue agoniste de GnRH (Busereline), décrit antérieurement (A. S. McNeilly, H.M. Fraser, J. of Endocrin., 1987, 115, 273-282). Ils ont démontré également l'importance de la sécrétion puisée de la LH (Luteinizing Hormone) et sa compensation par un apport accru de FSH dans la sélection du ou des follicules dominants pendanr la phase lutéale de l'espèce ovine en appliquant à leur modèle expérimental des décharges de LH à la fréquence de ceux de la phase lutéale (1 toutes les 4 heures). Les auteurs ont observé que des brebis mises en anoestrus par un traitement prolongé à l'aide d'un analogue agoniste de LHRH et soumises à un traitement par la FSH pendant 120 heures développaient des follicules oestrogéniques comparables à ceux d'un cycle normal. L'administration de la hCG ( gonadotrophine chorionique) a entraîné une ovulation supérieure à la normale, suivie de la formation de corps jaunes sécrétant des quantités normales de progestérone (A.M. Picton, C.G. Tsonis, A. S. McNeilly, J. of Endocrin., 1990, 126, 297-307). Ils ont également observé que les ovocytes obtenus ont pu être fécondés par insémination intra-utérine (G. Evans, J. Brooks, W. Crow, A. S. McNeilly, non publié et cité dans J. Reprod. Fert. Suppl. 45, 1992, 5-19).
Des différences existent cependant entre les caractères de la physiologie ovarienne, polyovulatoire et saisonnière entre les femelles ovines et les femelles bovines. Notamment, pour certains auteurs (M.A. Driancourt, R. Webb, R.C. Fry, J. of Reprod. Fert., 1991, 93, 63-70), la folliculogénèse chez les femelles ovines présenterait certaines particularités la différenciant de celle des femelles bovines : c'est ainsi que le follicule dominant de la femelle ovine ne produirait pas de signal inhibant les autres follicules.
Aux difficultés rencontrées dans les techniques de superovulation des femelles bovines s'ajoute la trop grande variabilité des résultats obtenus dans la pratique.
En effet, si l'on peut avancer une moyenne de 4,5 à 5,5 embryons transférables par traitement de superovulation, ce nombre varie en fait dans la pratique entre 0 et 15 embryons environ sans qu'il soit possible de contrôler cette variabilité. Les objectifs recherchés sont donc avant tout de rechercher une méthode permettant d'obtenir un nombre d'embryons satisfaisant et cela d'une manière fiable en ce qui concerne la constance du nombre d'embryons transférables pour chaque traitement de superovulation.
Lors de travaux sur la superovulation dirigée des femelles bovines, la demanderesse a découvert qu'il était possible de s'affranchir de toutes les contraintes physiologiques qui conduisaient les auteurs à déterminer de manière précise le moment propice pour essayer d'induire une superovulation, en amenant la femelle bovine dans un état d'anoestrus plus intense que l'état d' anoestrus physiologique et qui sera qualifié ci-après de profond. Il se caractérise par une désensibilisation de l'hypophyse à l'action de la LHRH endogène.
En outre, il a été découvert que l'on pouvait maintenir un état d' anoestrus profond chez la femelle bovine, pouvant atteindre ou dépasser cent jours, au cours duquel, et cela est très surprenant et avantageux, il est possible de réaliser plus d'une superovulation menée jusqu'au stade de récolte des embryons.
L'invention a donc pour objet une méthode de superovulation dirigée des femelles bovines, comprenant les étapes suivantes :
- administrer à l'animal un analogue de la LHRH de manière à désensibiliser l'hypophyse à l'action de la LHRH endogène, ce qui induit un état d'anoestrus profond caractérisé notamment par l'arrêt du développement des follicules antraux,
- à l'instant de son choix à l'intérieur de la période d'anoestrus profond ainsi induite, administrer à l'animal de l'hormone FSH, associée ou non à la LH, de manière à induire le recrutement et le développement des follicules ovulatoires,
- en fin de développement de ces follicules, administrer à l'animal une hormone choisie parmi le groupe consistant en
LH et hCG, de manière à déclencher l'ovulation de ces follicules.
La méthode de superovulation proposée consiste donc à décider du moment du recrutement des follicules, de stimuler leur croissance par un traitement par l'hormone gonadotrope FSH associée ou non à LH, à isoler les follicules en croissance de toute action inhibitrice ou stimulatrice indirecte ayant pour origine l'action ovarienne sur l'axe hypothalamo-hypophyso-ovarien pour supprimer ou diminuer fortement la divergence entre follicules ovulatoires et non ovulatoires et provoquer l'ovulation par un apport, à un moment déterminé du développement des follicules, de la LH ou de l'hCG en quantité et pendant un temps suffisant.
Ces conditions sont remplies au cours de l'anoestrus profond que la méthode de traitement conforme à l'invention entraine. Il est tel qu'il permette le développement des follicules antraux jusqu'au stade de prérecrutement. Cet état d'anoestrus qui est obtenu et qui est décrit dans les exemples a limité la croissance des follicules décelables à une valeur ne dépassant pas 5 mm avec l'agoniste D.Trp6-LHRH et 14 mm avec l'agoniste DesGly-D.Trp6-LHRH éthylamide. Le mécanisme peut sans doute être rapporté à la suppression de la sécrétion de la LH puisée et à l'abaissement de la sécrétion basale de FSH, ainsi qu'à la suppression des mécanismes d'inhibition indirecte partant des ovaires.
Le nouveau mode de sécrétion des hormones gonadotropes a entraîné la suppression des cycles oestriens. Cet état d'anoestrus est contrôlé, après la disparition de la phase lutéale existant au moment de l'application du traitement (moment préféré), par le maintien du taux de progestérone plasmatique au-dessous du seuil de détection. Le traitement commence de préférence au début de cette phase lutéale.
La désensibilisation de l'hypophyse à l'action de l'hormone LHRH endogène peut être obtenue notamment soit par l'administration d'un analogue agoniste de LHRH à dose élevée ( supraphysiologique) et continue, soit par l'administration d'un analogue antagoniste de LHRH, pendant le temps nécessaire à la mise en place et au maintien de l'anoestrus profond permettant l'application du ou des traitements successifs de superovulation, de fertilisation des ovocytes par insémination artificielle et de récolte des embryons, qui sera suivie de leur transfert avant ou après congélation. Ces trois dernières techniques sont les techniques habituelles utilisées par les personnes spécialisées dans les opérations d'insémination artificielle, de récolte et de transfert des embryons.
Plutôt que de recourir à de multiples injections, on préfère utiliser des formulations permettant la libération continue de l'analogue de la LHRH sur une durée qui détermine la durée de la phase d'anoestrus profond.
Pour ce faire, on dispose des nombreuses techniques mises au point pour la préparation des formulations à libération continue, notamment à base de polymères dégradables, en particulier poly (lactide-glycolide) ou poly (lactique-glycolique), ou de corps gras, notamment acides gras ou esters d'acides gras ou de polyéthylène-glycol, réalisées notamment sous forme de films, implants ou microsphères.
On préférera des microsphères de poly(lactide-glycolide) ou de poly(lactique-glycolique), ou éventuellement d'autres compositions, préparées notamment selon le procédé décrit dans la demande de brevet français FR-A-2 693 905. Le procédé de préparation décrit dans les essais est conforme à cette demande antérieure.
Par analogue agoniste de la LHRH, il faut entendre comme il est d'usage toute molécule possédant les propriétés biologiques de la LHRH naturelle, c'est-à-dire notamment action sur l'hypophyse déclenchant une sécrétion de LH et de FSH. Il peut également s'agir de la LHRH elle-même. De nombreux analogues agonistes de la LHRH sont aujourd'hui connus des spécialistes et il n'entre donc pas dans le cadre de cette demande de les citer tous. Ils peuvent être d'origine naturelle, de recombinaison ou synthétique, c'està-dire obtenus par synthèse chimique complète ou par modification chimique d'une molécule naturelle, par exemple par substitution d'acides aminés et/ou modification des extrémités carboxyterminale ou aminoterminale. L'invention utilise préférentiellement l'analogue D.Trp6-LHRH (brevet FR-A-2 313 940) ou le Des-Gly-D.Trp6-LHRH éthylamide (brevet FR-A-2 397 192).
L'effet recherché avec l' agoniste est une saturation des récepteurs hvpophysaires de la LHRH qui dure tout au long de la période d' anoestrus profond qui a été choisie. L'agoniste est donc administré de manière que, durant toute la période d'administration, il soit en concentration supraphysiologique dans le sang, ce qui signifie que la concentration en agoniste reste à un niveau toujours supérieur aux pics de sécrétion de LHRH endogène par l'hypothalamus. Il s'agit là de l'application à l'hypophyse du phénomène bien connu de désensibilisation (appelé "downregulation" des récepteurs de la LHRH par les Anglo-Saxons).
Pour un analogue donné, la posologie dépend de la formulation qui elle-même définit la durée de libération. On ne peut pas en effet définir la teneur plasmatique minimale requise en analogue car, en dessous d'un certain seuil, les techniques ne permettent plus de détecter et mesurer la concentration réelle en analogue. Lors de l'anoestrus profond, on constatera comme dans l'anoestrus léger une disparition persistante de la sécrétion de progestérone (dosage par les techniques usuelles). Toutefois, l'effet l'anoestrus profond recherché se caractérise spécifiquement par un arrêt du développement folliculaire pendant toute la phase d' anoestrus profond, cet état pouvant être confirmé notamment par des examens échographiques. Notamment, l'examen échographique révélera essentiellement l'existence de follicules de diamètre ne dépassant pas 14 mm environ, de préférence 10 mm environ. Il est aisé de déterminer les doses d'analogue qui sont nécessaires en liaison avec une formulation donnée, en recourant à des essais et en vérifiant, par les techniques ci-dessus, l'obtention d'un anoestrus profond sur une période donnée, en s'aidant des essais décrits plus loin. Une autre caractéristique spécifique de l'état d'anoestrus profond est sans doute la suppression de la FSH puisée. Il s'agit là cependant d'une caractéristique difficile à mettre en évidence, notamment dans la pratique courante, en raison des difficultés de dosage.
Les doses d'agonistes pourront être les suivantes: - pour une formulation de libération de l'ordre de 40 à 50 jours : de 15 à 150 mg, notamment de 25 à 100 mg.
- pour une formulation de libération de l'ordre de 85 à 100 jours : de 30 à 300 mg, notamment de 50 à 200 mg, soit environ le double des doses choisies pour la libération plus courte.
On remarque que le passage à une formulation de durée de libération double nécessite le doublement de la dose. Cette règle dose/durée pourra être transposée à des formulations de durées de libération différentes.
Les doses minimales pourront être augmentées ou diminuées pour des animaux dont le poids s'écarte sensiblement de la moyenne arbitraire des 500 kg (respectivement supérieur à 500 kg et inférieur à 500 kg)
Pour le D.Trp6-LHRH, on a pu déterminer des doses efficaces de 150 mg d'analogue agoniste avec une libération continue de l'ordre de 40 à 50 jours et de 300 mg avec une libération continue de l'ordre de 85 à 100 jours, et même de 50 mg pour avec une libération de l'ordre de 40 jours.
De préférence, pour une formulation à libération continue de l'ordre de 40 à 50 jours, on administre à l'animal une dose de cet agoniste de la LHRH comprise entre 40 et 150 mg environ et de préférence environ 50 et 100 mg. Pour une formulation de type 85 à 100 jours environ, la dose peut être comprise entre 100 et 300 mg environ.
De façon avantageuse, le Des-Gly-D.Trp6-LHRH éthylamide s'est révélé efficace à des doses légèrement inférieures à celles du précédent ; on a notamment pu démontrer une efficacité aux doses de 16,7, 33,7 et 50,1 mg d'agoniste avec une durée de libération de l'ordre de 40 à 50 jours environ. La dose efficace dans ces conditions est supérieure à 16-17 mg et même à 15 mg environ, de préférence supérieure à 25 mg, notamment comprise entre 30 et 40 mg environ et plus particulièrement de l'ordre de 33 ou 34 mg, d'agoniste pour une formulation de durée de libération de l'ordre de 40 à 50 jours.
La dose efficace pour une formulation de libération de 85 à 100 jours environ correspond de préférence environ au double de la dose pour 40 à 50 jours. On pourra donc administrer notamment une dose supérieure à 30 mg, en particulier une dose comprise entre 60 et 80 mg.
Si l'on ne souhaite réaliser qu'une seule phase de superovulation, on choisira avantageusement des formulations à libération courte, par exemple de l'ordre de 40 à 50 jours, afin que l'animal retrouve rapidement son état normal après la récolte des embryons.
Les formulations à plus longue durée de libération seront plus appropriées à l'induction de plusieurs phases de superovulation successives au cours d'un anoestrus profond unique. On a toutefois démontré que cela était aussi possible avec la libération courte de 40 à 50 jours.
L'invention prévoit aussi l'utilisation d'analogues antagonistes de la LHRH. Il s'agit là de ce qu'il est communément convenu d'appeler les molécules s'opposant à l'action de la LHRH endogène par leur fixation sur les récepteurs spécifiques à cette hormone. Leur action est plus rapide que celle des agonistes et requiert une concentration permettant de bloquer les récepteurs sur la durée choisie pour l'anoestrus profond. Les antagonistes ne provoquent pas un effet de stimulation premier de courte durée de la sécrétion de LH et FSH, comme c'est le cas avec les agonistes avant d'obtenir l'état de désensibilisation.
On connaît un grand nombre d'antagonistes de la
LHRH. On pourra notamment utiliser les antagonistes décrits dans la demande de brevet internationale WO 92/19651 (agonistes selon les séquences SEQ ID NO : 1 et NO : 2 décrites dans cette demande) et les agonistes ORG 30850 (G.H.J. Deckers et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol., vol. 42, 705 - 712, 1992), Antide (K. Wallen et al., Physiology & Behavior, vol. 50, 429-435, Pergamon Press pic, 1991). Voir aussi dans V.J. Cseraus et al., P.N.A.S. USA, vol. 89, 5759 - 5763, 1992.
La libération continue des agonistes de LHRH (ou
GnRH) a déjà été décrite chez les bovins dans un but différent de celui qui fait l'objet de l'invention. Les administrations de la GnRH synthétique à la génisse prépubère (S.E. Dodson et al., J. Reprod. Fertil., 1988, 82, 526-538) ou de la buséréiine (F. Grassalli et al., Anim. Reprod. Sci., 1993, 32, 153-161) sont effectuées à faible dose, sont limitées à 10-15 jours, et ont pour but le déclenchement d'une ovulation précoce. Les auteurs ont observé une forte augmentation de la LH dès l'administration de GnRH ou de son agoniste. Faisant suite à cette libération précoce succède une sécrétion basale de LH augmentée (F. Grasselli, 1993) ou abaissée (S.E. Dodson, 1988). Cette diminution de la sécrétion basale de LH est également observée par traitement de vaches en post-partum à faible dose à l'aide d'implants de buséréline (B.J. McLeod et al., Anim. Reprod., Sci., 1991, 24, 1-11) et est rapportée à un état de downregulation ou désensibilisation de l'hypophyse. Ces travaux ne sont pas orientés vers la superovulation, ils visent à diminuer la période prépubère et à obtenir une ovulation précoce pour les deux premiers et à supprimer l'anoestrus post-partum pour l'emploi de doses faibles de GnRH ou de ses agonistes pour le dernier.
Le recrutement et la croissance folliculaire sont assurés par un apport de FSH, qu'elle soit une hormone d'extraction FSH porcine ou ovine ou bovine ou équine, ou qu'elle soit une hormone FSH de recombinaison. Cet apport par voie parentérale est réalisé par administration au moins deux fois par jour, à intervalle régulier, ou par un système à relargage continu (par exemple tel que décrit pour l'analogue de la LHRH). Cet apport est maintenu de préférence pendant de 4 à 7 jours. L'administration de LH ou d'hCG est de préférence effectuée pendant de 1 à 2 jours environ, et commence de préférence le dernier jour de l'administration de FSH. On évitera en général d'administrer la LH ou l'hCG pendant les chaleurs. De préférence, l'administration se fera lorsque la taille des follicules sera d'au moins 14 mm, notamment de l'ordre de 14-15 mm. La LH utilisée est soit une hormone d'extraction, porcine, ovine ou bovine ou équine ou une hormone de recombinaison.
L'invention a aussi pour objet la méthode elle-même, telle que définie ci-dessus, qui consiste à administrer à l'animal un analogue, agoniste ou antagoniste, de la LHRH de manière à désensibiliser l'hypophyse à l'action de la LHRH endogène, pour obtenir un anoestrus profond.
En variante, la désensibilisation de l'hypophyse à la LHRH endogène peut aussi être réalisée par immunoneutralisation anti-LHRH par voie active ou passive.
Enfin, l'invention a encore pour objet un kit de superovulation pour les femelles bovines, comprenant, séparément, une formulation à libération continue comprenant comme principe actif un analogue de la LHRH, une formulation comprenant comme principe actif de l'hormone FSH et une formulation comprenant un principe actif choisi dans le groupe consistant en hormone LH et hormone hCG. Les formulations sont notamment conformes à ce qui a été décrit ci-dessus.
L'invention va être maintenant décrite plus en détail dans ce qui suit, avec la description des modes préférés de préparation des formulations d'analogue de la LHRH, la présentation d'essais de mise en anoestrus profond et la description des étapes subséquentes de la méthode de superovulation.
Les figures annexées montrent :
- à la figure 1, un graphe présentant, pour la vache nº 1, le profil de la concentration plasmatique de progestérone, déterminée par dosage radioimmunologique, après injection au jour 0 d'une formulation PLG 50:50 / D.Trp6-LHRH (150 mg d'analogue agoniste) ayant un profil de libération de l'ordre de 40 jours, le plateau qui correspond à l'absence de détection de progestérone plasmatique représentant la phase d'anoestrus profond - ce graphe correspond au tableau 1 ;
- à la figure 2, un graphe analogue à celui de la figure 1, pour la vache nº 4, traitée dans les mêmes conditions que la vache nº 1 ;
- à la figure 3, un graphe analogue aux précédents, pour une formulation PLG 65:35 / D.Trp6-LHRH (300 mg d'analogue agoniste) ayant un profil de libération de l'ordre de 85 à 100 jours - vache nº 5 - ce graphe correspond au tableau 2;
- à la figure 4, un graphe analogue à celui de la figure 3, pour la vache nº 6, traitée dans les mêmes conditions que la vache nº 5 ; et
- à la figure 5, un graphe présentant le profil de la concentration plasmatique de progestérone d'une vache témoin n'ayant pas reçu de formulation d'analogue de la LHRH - les cycles se déroulent normalement.
A - PREPARATION DES FORMULATIONS D'ANALOGUES DE LA LHRH.
Plusieurs méthodes de formulation des analogues de LHRH permettent d'obtenir une libération prolongée et continue du principe actif à partir de la forme galénique. Les méthodes citées ci-dessous permettent de moduler la durée de libération de l'analogue en fonction de certains paramètres de formulation. Ces méthodes font appel à deux catégories d'excipients :
- des polymères dégradables représentés en particulier par la famille des poly(lactide-glycolide) et poly(lactique- glycolique);
- des corps gras représentés en particulier par des acides gras et des esters d'acide gras ou de pαlyéthylène-glycol.
La première méthode de formulation fait appel à des polymères dégradables de la famille des poly(lactide-glycolide) et poly(lactique-glycolique) (PLG). Ces polymères présentent une biocompatibilité très satisfaisante et ont la capacité de s'hydrolyser pour générer des composants naturels, l'acide lactique et l'acide glycolique. La vitesse d'hydrolyse de ces polymères est modulable en fonction essentiellement du ratio des comonomères lactide et glycolide, de la masse moléculaire des polymères, et des isomères lactide utilisés. Cette vitesse est maximale lorsque le ratio est égal à 50/50, puis elle diminue lorsque la proportion de lactide augmente. Cette propriété est utilisée pour moduler la durée de libération des analogues LHRH à partir d'une forme galénique réalisée avec ces polymères. Les analogues de LHRH et plus particulièrement les agonistes de LHRH sont des peptides insolubles dans une matrice de PLG. Ces composés se présentent généralement sous forme d'une microdispersion dans l'excipient PLG. La forme galénique peut être variable: films, implants ou microsphères. Cette dernière forme galénique présente l'avantage d'être aisément injectable, après remise en suspension dans un liquide adéquat. Les méthodes de microencapsulation permettant d'obtenir cette forme galénique sont variables, essentiellement: la microencapsulation par coacervation, par évaporation de solvant, et la méthode d'atomisation ou "spray-drying". La méthode de microencapsulation par évaporation de solvant est décrite dans l'exemple nº 1.
Les mécanismes de libération de l'agoniste LHRH à partir de la forme galénique sont variés :
- Libération par dissolution rapide de l'agoniste situé en périphérie de la forme galénique, et exposé directement aux fluides biologiques.
- Libération par percolation : ce mode de diffusion d'un principe actif dispersé dans une matrice polymère hydrophobe est lié à l'interconnexion des particules de principe actif entre elles, ce réseau interconnecté étant lui-même en contact avec le milieu extérieur. La libération du principe actif est liée à la pénétration progressive des fluides biologiques dans le réseau, permettant la dissolution du principe actif et sa diffusion dans le milieu extérieur. Ce mode de libération est modulé quantitativement et dans le temps par la proportion de principe actif dispersé dans la matrice polymère, la solubilité du principe actif, sa granulométrie.
- Libération liée à l'hydrolyse du polymère : l'hydrolyse du polymère, par exemple un PLG, scinde les chaînes polymériques en fragments plus courts hydrosolubles à terme. Ce phénomène induit une augmentation de l'hydrophilie et de la porosité de la forme galénique, permettant la pénétration des fluides biologiques et l'extraction du principe actif. Ce mécanisme de libération est modulé dans le temps par la vitesse d'hydrolyse du polymère et par la masse moléculaire initiale du polymère.
Ces trois mécanismes interviennent lors de la libération d' agonistes LHRH à partir de microsphères de PLG, et sont à l'origine de cinétiques de libération triphasiques :
1ère phase: libération instantanée ou "burst effect", se produisant peu après l'administration du produit .
2ème phase: phase de diffusion liée à la percolation, dont le débit de libération est contrôlé par la proportion d'agonistes de LHRH utilisée dans la formulation de microsphères. La durée de cette phase est contrôlée par le ratio de co-monomères lactide/glycolide, et par la masse moléculaire initiale du polymère. Cette phase est d'autant plus courte que le ratio lactide/glycolide est proche de 50/50 et la masse moléculaire initiale du polymère est faible.
3ème phase : phase de libération liée à l'hydrolyse du polymère dont la durée est contrôlée essentiellement par le ratio lactide/glycolide. Cette durée peut varier de un mois environ à plus d'une année. Le débit de libération est généralement supérieur à celui de la phase précédente.
Le profil triphasique de libération peut être modifié avec les paramètres de formulation:
- La réduction de la durée, voire la disparition de la 2ème phase est observée avec des polymères de forte vitesse de dégradation et de faible masse moléculaire initiale, par exemple des polymères PLG50:50 de faible masse moléculaire, ceci permettant d'obtenir des débits de libération relativement constants.
- L'augmentation du débit de libération pendant la 2ème phase est obtenue en augmentant la proportion de principe actif dans la formulation, la cinétique de libération tendant vers un profil régulièrement décroissant avec le temps.
Des profils de libération non triphasiques, mais relativement constants ou régulièrement décroissants sont également obtenus avec des polymères de faible masse moléculaire, par exemple des poly (D.L. lactide) de masse moléculaire de l'ordre de 2000. Ces polymères peuvent être utilisés purs dans la formulation, ou préalablement mélangés avec des polymères de plus haute masse moléculaire, puis formulés.
La combinaison des paramètres de formulation permet d'obtenir des durées et des profils de libération contrôlés. La durée totale de libération d'un agoniste LHRH peut être ajustée pour atteindre des périodes variant de quelques jours à plus d'un an.
Une deuxième méthode de formulation fait appel à des corps gras, par exemple des acides gras ou des esters d'acides gras, formulés en implants ou microsphères avec le principe actif. Le mécanisme de libération d'un agoniste
LHRH à partir de ces formulations est lié:
- à la diffusion du principe actif dans l'excipient lipidique. La durée de libération d'un agoniste LHRH peut être ajustée:
par la proportion d'agoniste incorporée dans la formulation: la durée de libération décroit avec l'augmentation de la proportion d' agoniste incorporée.
par la valeur HLB (Balance Hydrophile Lipophile) de l'excipient lipidique: l'augmentation par exemple de 1 à 5 de la valeur HLB de l'excipient lipidique permet de réduire de 5 mois à une semaine la durée totale de libération d'un agoniste LHRH incorporé dans des implants lipidiques.
- à l'érosion de l'excipient lipidique: ce phénomène est d'autant plus rapide que la température de fusion de l'excipient lipidique utilisé est faible. La durée de libération de l'agoniste LHRH peut être contrôlée en modifiant ce paramètre. B - ESSAIS DE MISE EN ANOESTRUS PROFOND
La mesure des concentrations plasmatiques de la D.Trp6-LHRH libérée et de la progestérone est effectuée par méthode radioimmunologique. Le dosage radioimmunologique de la D.Trp6-LHRH plasmatique repose sur le principe d'une réaction d'inhibition compétitive entre la D.Trp6-LHRH marquée à l'125I en quantité constante et la D.Trp6-LHRH étalon ou celle contenue dans les échantillons de plasma, vis-à-vis des sites de liaison d'un sérum anti-D.Trp6-LHRH.
La quantité de D.Trp6-LHRH est exprimée en ng/ml de plasma.
Le dosage radioimmunologique de la progestérone plasmatique est effectué par méthode directe à l'aide de la progestérone marquée par l'l25I. Elle repose sur une réaction d'inhibition compétitive entre la progestérone marquée en quantité constante et la progestérone étalon ou celle contenue dans les échantillons de plasma. La quantité de progestérone est exprimée en ng/ml de plasma.
1er exemple (3 tableaux (1 à 3), 2 figures (1 et 2))
Le traitement de désensibilisation a été appliqué sur 4 vaches à l'aide, de l'analogue agoniste de la LHRH, la D.Trp6-LHRH. Celle-ci fut incorporée dans des microsphères de copolymères lactique-glycolique qui assurent une concentration plasmatique décelable chez la femelle bovine pendant 40 jours pour une première formulation et 85-100 jours pour la seconde.
Préparation et administration de microsphères de PLG incorporant l'analogue D.Trp6-LHRH:
a) Formulation PLG50:50
Cette formulation permet de libérer l'agoniste D.Trp6-LHRH pendant environ 40 jours à des niveaux détectables chez la vache. 45 mg d'un lyophilisât de D.Trp6-LHRH (trifluoroacétate) sont pesés puis dispersés dans une solution composée de 1455 mg de poly(D.L. lactide-glycolide) 50:50 de viscosité inhérente 0,4 dl/g, dans 5,4 ml de dichlorométhane sous agitation. Ce solvant permet la dispersion fine du lyophilisât et permet la solubilisation du polymère. Lorsque la répartition du peptide est homogène, la dispersion est injectée à travers un tube de 2 mm de diamètre dans 450 ml d'une solution d'alcool polyvinylique à 1% dans de l'eau déminéralisée à 25ºC, sous l'agitation d'une hélice tournant à 700 tours par minute. Deux gouttes d'une émulsion silicone antimousse sont réparties, puis le dichlorométhane est évaporé par diffusion d'air comprimé dans le mélange. Après évaporation, les microsphères durcies sont récoltées par filtration sous vide, lavées à l'eau déminéralisée puis sont séchées sur un papier filtre. Un lavage complémentaire avec 40 ml de trichloro 1,1,2 trifluoro 1,2,2 éthane permet d'éliminer le silicone antimousse résiduel. Les microsphères sont séchées, puis stockées à + 4ºC.
Cette opération est répétée jusqu'à l'obtention d'une quantité suffisante de microsphères incorporant
D.Trp6-LHRH. La quantité de D.Trp6-LHRH présente dans les microsphères est déterminée par une méthode d'extraction puis dosage en chromatographie liquide haute performance.
Administration aux vaches : La quantité de microsphères équivalent à 150 mg de D.Trp6-LHRH incorporée est répartie dans 2 seringues. Les microsphères de chaque seringue sont mises en suspension dans 20 ml d'un liquide visqueux composé de 2% de carboxyméthyl-cellulose et de 0,2% de Tween 80 en solution dans de l'eau physiologique, puis sont injectées par voie intramusculaire profonde dans l'encolure.
b) Formulation PLG65:35
Cette formulation permet de libérer l'agoniste pendant environ 85-100 jours. Le même mode de préparation est adopté avec un polymère poly(D.L. lactide-glycolide) 65:35 de viscosité inhérente 0,34 dl/g: 90 mg d'un lyophilisât D.Trp6-LHRH sont pesés puis dispersés dans une solution composée de 1410 mg de poly(D.L. lactide-glycolide) 63:35 dans 3 ml de dichlorométhane, sous agitation. Les étapes ultérieures sont identiques à la description précédente.
Administration : la quantité de microsphères équivalent à 300 mg de D.Trp6-LHRH incorporée est répartie dans 2 seringues, puis administrée dans les mêmes conditions que précédemment.
L'administration des microsphères à base de copolymères lactique-glycolique a été effectuée en début de la phase lutéale. Elle a entraîné sur tous les animaux un allongement de la phase lutéale, par comparaison avec la durée de la phase lutéale du cycle précédent.
La disparition persistante de la sécrétion de progestérone a défini l'anoestrus en l'absence d'autres examens (échographie, dosages de LH et FSH). La fin de la période d'anoestrus est moins précise et doit intervenir quelques jours avant la réapparition de la progestérone.
L'examen échographique fut limité à 2 observations à une semaine d'intervalle à des moments précis du traitement, d'une part vers la fin probable de son efficacité, un mois après la disparition de trace décelable de D.Trp6-LHRH dans le plasma, d'autre part pendant la phase stationnaire du traitement, marquée par une concentration stable et caractéristique de l'agoniste de LHRH. Cet anoestrus a pu être classé en deux états bien différents dans l'un et l'autre moment, un anoestrus profond pendant la phase correspondant à la mise en évidence dans le plasma de l'agoniste, un anoestrus léger un mois après la disparition plasmatique de D.Trp6-LHRH. L'état d'anoestrus profond, pendant lequel les follicules ne dépassent pas le diamètre de 3-4 mm, correspond à l'état nécessaire à l'application du traitement de superovulation. Il permet le recrutement par l'apport de la FSH (vaches 5 et 6). Il est suivi d'un état d' anoestrus moins profond pendant lequel le recrutement et la sélection des follicules sont observés spontanément (vaches 1 et 4). Cet anoestrus léger est comparable l 1'anoestrus physiologique observé après la mise-bas ou pendant la gestation. Il précède la réapparition de l'oestrus dans cette expérimentation. Le tableau 1 et les figures 1 et 2 concernent les vaches 1 et 4 ayant reçu un traitement de désensibilisation de courte durée (40 jours décelables). La fin de la phase lutéale commence 21 jours après l'administration en début de phase lutéale pour les vaches 1 et 4. L'examen échographique fut effectué 1 mois après la disparition de la D.Trp6-LHRH plasmatique mesurable, soit respectivement 65 et 72 jours pour la vache 1 et 58 et 65 jours pour la vache 2 après l'administration des microsphères ; il a conduit aux observations suivantes (nombre de follicules F et diamètre en mm) qui traduisent un anoestrus léger : a) Vache nº 1 (1393)
1er examen 2e examen
+ 65 j + 72 j ovaire droit 1 F .2 mm 1 F 12-13 mm
5 F 4 mm 1 F 5 mm ovaire gauche 2 F 6 mm 1 F 20 mm
4 F 4 mm b) Vache nº 4 (1866)
1er examen 2e examen
+ 58 j + 65 j ovaire droit 2 F 4 mm 1 F 12 mm
4 F 3 mm ovaire gauche 0 F (non décelé) 5 F mm
Le tableau 2 et les figures 3 et 4 concernent les vaches nº 5 et 6 ayant reçu un traitement de désensibilisation de longue durée (D.Trp6-LHRH décelable dans le plasma pendant 86 et 103 jours). La fin de la phase lutéale commence, pour la vache nº 5, 15 jours, et pour la vache nº 6, 25 jours, après l'administration en début de phase lutéale.
L'examen échographique fut effectué pendant la phase de libération stable et caractéristique des microsphères de D.Trp6-LHRH respectivement 65 et 72 jours pour la vache nº 6 et 58 et 65 jours pour la vache nº 5 après l'administration des microsphères. Il correspond à la phase d'anoestrus profond au cours duquel aucun follicule supérieur à 5 mm n'est observé. a) Vache nº 6
1er examen 2e examen
+ 65 j + 72 j ovaire droit 3 F 3 mm 4 F 3 mm ovaire gauche 2 F 3 mm 3 F 3 mm b) Vache nº 5
1er examen 2e examen ovaire droit 1 F 5 mm 2 F 4 mm
1 F 3 mm
ovaire gauche 3 F 3 mm 5 F 3 mm
Le tableau 3 et la figure 5 concernent les mesures de progestérone faites sur une vache témoin (1398).
Le retour de l'oestrus a été observé sur les 4 vaches.
Après le début du traitement de courte durée :
· 100 jours chez la vache 1 (1393)
· 80 jours chez la vache 4 (1866)
2e exemple - 2 tableaux (nº 4 et 5)
Le traitement de désensibilisation a été appliqué sur 6 vaches à l'aide de l'analogue agoniste de la LHRH, la D.Trp6-LHRH.
Il est appliqué en début de la phase lutéale à l'aide de la formulation D.Trp6-LHRH/PLG 50-50 à la dose de 50 mg ou de 16,7 mg par vache.
a) Dose de 50 mg - tableau 4
· vache 1 - 1393
Suppression de la phase lutéale 14 jours après le début du traitement de désensibilisation.
Retour de la sécrétion de progestérone 114 jours après le début du traitement.
·vache 7 - 1901
Suppression de la phase lutéale 17 jours après le début du traitement de désensibilisation.
· vache 10 - 1923
Suppression de la phase lutéale 21 jours après le début du traitement de désensibilisation.
b) Dose de 16,7 mg - tableau 5
- vache 3 - 1398
Dose inefficace
- vache 4 - 1866
Dose inefficace
- vache 5 - 1867
Dose partiellement efficace
C - ETAPES ULTERIEURES A LA MISE EN ANOESTRUS PROFOND
1ère étape : Recrutement et développement des follicules.
Cette étape peut être déclenchée à tout moment de la phase d'anoestrus profond.
Il suffit de respecter :
- la période de mise en place de l'anoestrus profond après injection de la formulation d'analogue de la LHRH, celle-ci variant selon le type d'analogue, agoniste (plusieurs jours selon la formulation retard utilisée) ou antagoniste (immédiate: absence de phase de latence) ;
- le temps nécessaire pour aboutir aux embryons et à leur récolte, étant donné qu'il est préférable que l'ensemble des opérations, y compris la récolte des embryons, soit réalisée à l'intérieur de la phase d' anoestrus profond. A partir du début du traitement par la FSH, il faut compter de 18 à 21 jours environ jusqu'à la récolte des embryons. Pour les formulations utilisées au cours des essais décrits plus haut, la période de mise en place de l'anoestrus profond est en moyenne de :
- PLG 50:50 : moins de 20 jours (environ 18 jours)
- PLG 65:35 : moins de 25 jours (environ 21 jours).
Cette période est facile à déterminer pour chaque formulation au cours d'un essai de mise en anoestrus et du suivi de l'évolution de la concentration en progestérone (et examen échographique et éventuellement mesure de la FSH pour confirmer l'état d'anoestrus profond).
Au jour choisi, on administre à l'animal de l'hormone FSH en présence éventuellement de l'hormone LH.
Formulation :
- hormone FSH d'extraction de préférence d'origine porcine, ovine (ou encore bovine ou équine), eu hormone de recombinaison ;
- posologie journalière selon l'origine de l'hormone : de 30 à 300 μg/j, de préférence entre 80 et 140 μg/j environ, par exemple de l'ordre de 125 μg/j.
- autres constituants : éventuellement LH à un maximum de 40 à 60 μg/j.
Durée du traitement : de 4 à 7 jours , l ' objectif étant d ' obtenir des follicules de 14-15 mm environ.
On peut aussi choisir d'utiliser une formulation à libération continue du type décrit plus haut, permettant de libérer la dose journalière requise sur la période totale de 4 à 7 jours.
L'apport de FSH déclenche le recrutement et la croissance des follicules qui se trouvaient au stade de prérecrutement dans la phase d'anoestrus profond (follicules antraux). Après de 4 à 7 jours de traitement par la FSH, on aboutit à des follicules ovulatoires.
2ème étape : Déclenchement de l'ovulation.
Le dernier jour du traitement à la FSH, on administre en sus à l'animal de l'hormone LH ou de l'hormone hCG.
Formulation :
- hormone d'extraction d'origine porcine, ovine, bovine ou équine, ou hormone de recombinaison ;
- dose : de 2 à 6 mg/j pour LH ou de 3 000 à 6 000 UI/j pour la hCG.
Pour les essais, on a choisi d'administrer 3 mg de LH d'origine porcine par jour en 1 ou 2 administrations par voie intramusculaire, pendant de 1 à 2 jours.
On peut avantageusement utiliser une formulation à libération continue.
Ce traitement déclenche l'ovulation.
On applique ensuite les étapes classiques des méthodes de superovulation, jusqu'à la récolte des embryons, à savoir :
- fertilisation des ovocytes par insémination artificielle,
- récolte des embryons, et
- transfert des embryons. D - 3ème EXEMPLE : TRAITEMENT DE SUPEROVULATION UTILISANT L'AGONISTE Des-Gly-D.Trp6-LHRH
L'expérimentation conduisant à démontrer la faisabilité de la superovulation a été réalisée sur 6 femelles bovines mises en anoestrus profond obtenu par l'administration de microsphères de PLG 50/50 incorporant le Des-Gly-D.Trp6-LHRH éthylamide (dénommé agoniste dans la suite du texte). Les microsphères ont été préparées selon la méthode décrite au 1er exemple pour les doses d'agoniste indiquées plus loin. 1. Le protocole expérimental.
1.1 Synchronisation de l'oestrus
L'oestrus précédant le traitement peut être synchronisé (ce qui est facultatif) par les méthodes bien connues des spécialistes.
1.2 Détection de l'oestrus
Elle est effectuée 2 fois par jour à l'aide d'un taureau vasectomisé. Les génisses sont considérées en chaleur si elles acceptent le chevauchement.
1.3 Traitement de mise en anoestrus par injection des microsphères PLG/50-50 incorporant l'agoniste de LHRH.
Au jour 2 du cycle oestrien (2 jours après l'apparition des chaleurs).
Trois doses ont été utilisés : 16,7 ; 33,7 et 50,1 mg d'agoniste.
1.4 Examen échographique de l'ovaire.
L'observation des ovaires est enregistrée sur cassette vidéo. Elle est effectuée quotidiennement à partir de la détection des chaleurs qui précèdent le traitement de désensibilisation hypophysaire jusqu'à la fin du traitement de superovulation.
1.5 Dosages hormonaux.
Les hormones FSH, LH et progestérone ont été dosées:
LH : 6 fois par jour, toutes les heures entre 8 et 12 heures à partir de la veille de l'injection de l'agoniste jusqu'au début du traitement de superovulation.
FSH: 2 fois par jour, à 8 et 9 h, à partir de la veille de l'injection de l'agoniste jusqu'au début du traitement de superovulation. Le jour de l'injection de l' agoniste, 5 prélèvements ont été réalisés, toutes les heures entre 8 et
12 heures.
Progestérone : 1 fois par jour à partir de la veille de l'injection de l'agoniste jusqu'à la fin du traitement de superovulation. Les animaux ont été leur propre témoin dans un cycle oestrien précédant le traitement.
1.6 Traitement de superovulation par les hormones gonadotropes sur les génisses en aonestrus.
Pendant la période de l'anoestrus provoqué les animaux ont reçu 1 ou 2 traitements de superovulation.
Le premier traitement de stimulation de la folliculogénèse à l'aide de produit Stimufol (vendu par RHONE MERIEUX, FRANCE ; composition : FSH porcine 500 μg et LH porcine 100 μg par flacon, à reprendre dans un volume de 10 ml) a débuté 10 jours après la disparition du dernier follicule présentant un diamètre supérieur à 10 mm et a été conduit dans les conditions habituelles d'un traitement de superovulation à dose quotidienne constante. La posologie utilisée a été différente suivant les animaux. Les injections de Stimufol ont été effectuées 2 fois par jour en injection intramusculaire et ont été espacées de 10 à 12 heures.
Une injection de Prostaglandines (Prosolvin 3 ml) a été effectuée à la 5e injection de Stimufol. Le traitement de Stimufol a été arrêté à l'apparition des chaleurs, au plus tôt après la 8e injection.
L'injection ovulante de LH porcine purifiée ou d'hCG a été effectuée au moment des chaleurs, au plus tôt 12 h après la 8e injection de Stimufol, ou après leur apparition sur le critère d'une taille folliculaire au moins égale à 14 mm.
1.7 Insémination articielle.
12 h et 24 h après l'injection de LH ou de hCG.
1.8 Collecte des embryons.
Au jour 7 après la 1ère insémination.
2. Résultats
2 . 1 Dosage des hormones
2 . 1 . 1 LH La concentration de LH augmente dans les 2 heures qui suivent l'injection de l'agoniste. Vingt-quatre heures plus tard, la concentration de LH se stabilise à un niveau basal (0,5 - 1,1 ng/ml) et varie peu.
Avant traitement par l'agoniste, les concentrations moyennes de LH entre J4 et J14 du cycle sur les mêmes animaux ne différent pas de celles qui sont mesurées après traitement; seule l'erreur standard est plus importante avant traitement et traduit les fluctuations de la sécrétion chez les non traités (0,07 - 0,139 ng/ml contre 0,015 - 0,022 ng/ml).
2.1.2. FSH
Après une augmentation de la concentration de FSH dans les heures qui suivent l'injection de l'agoniste (de 1,4 à 1,8 ng/ml) les valeurs redeviennent comparables à celles des valeurs témoins mesurées dans un cycle préalable (0,36 = 0,036 et 0,29 = 0,029 pour les valeurs témoins des nº 27 et 99 et de 0,26 - 0,019 à 0,43 = 0,024 pour les valeurs des animaux 87, 08, 27, 99, 37 après traitement par les agonistes).
2.1.3. Dosage de la progestérone.
Les concentrations maximales de 9 à 25 ng/ml apparaissant vers J10-J15 sur les traités, elles sont de 8-9 ng/ml vers J10-J14 dans les cycles témoins. La régression des teneurs en progestérone intervient vers J15-J17 (cycles témoins) et J15-J22 chez les animaux traités par l'agoniste.
2.2 Croissance folliculaire avant le traitement de superovulation.
a) La réponse précoce à l'agoniste se traduit par la croissance de plusieurs follicules sur les 2 ovaires, le diamètre maximum allant de 8 à 16 mm, et par l'augmentation du nombre des follicules de diamètre 7-10 mm allant de 3 à 18 par animal et dont la régression intervient 4 à 8 jours après le traitement. b) Une dizaine de jours après le traitement par l'agoniste, il y absence de follicule préovulatoire, la taille maximale des follicules n'excède pas 6 à 14 mm de diamètre suivant les animaux et traduit l'état de l'ovaire de l' anoestrus. 2 animaux sur 6 ont développé des ovaires kystiques, de taille 20-25 mm ; chez l'un, il a régressé vers J16, chez l'autre (nº 08), qui ne fut pas utilisé pour la superovulation, il fut accompagné de chaleurs sans ovulation.
c) Aucune différence de réponse n'a été observée aux trois doses du traitement par l' agoniste.
2.3 Traitement de superovulation.
2.3.1. Croissance folliculaire
Au ler jour de traitement de superovulation le nombre de follicules de la taille de 5 à 7,5 mm est supérieur ou égal à 10.
En fin de traitement, au moment d'induction de l'ovulation, la taille moyenne des follicules va de 11,9 à 15,9 mm suivant les animaux.
Exemples: génisse 37 (tableaux 6 et 7) et génisse 80 (tableaux 8 et 9) ayant reçu 50,1 mg d' agoniste et ayant subi deux traitements de superovulation successifs au cours de la même phase d' anoestrus profond.
Signification des abréviations utilisées dans les tableaux :
M = matin ; S = soir ; Pro. = prostaglandines ; CJ = corps jaune ; IA = insémination artificielle ; c = cellules.
2.3.2 Apparition des chaleurs.
Les génisses viennent en oestrus de 4 à 5 jours après le début des injections de Stimufol (tableaux 6-7, 8-9 et 10).
2.3.3. Nombre d'ovulations et d'embryons.
L'induction de l'ovulation n'a été efficace que lorsqu'elle intervenait sur des follicules de taille de 14-15 mm. Effectuée au moment des chaleurs sur des follicules de taille inférieure, elle ne fut pas efficace.
L'ovulation a été confirmée sur 2 animaux (nº 37 et 80) lors de deux traitements de superovulation mis en oeuvre successivement au cours de l'anoestrus, par la présence de corps jaunes.
L'insémination artificielle n'a été effectuée sur ces 2 animaux qu'au 2ème traitement de superovulation. Deux embryons dégénérés (stade 20-30 cellules) ont été récoltés sur le nº 37 (tableau 11).
2.3.4. La reprise de l'activité cyclique a été observée entre 55 et 100 jours après l'administration du traitement par l'agoniste.
2.4. Conclusion
Le traitement par l'agoniste de LHRH formulé dans les microsphères PLG 50/50 a été efficace pour établir l'anoestrus aux trois doses utilisées. La faisabilité du traitement de superovulation et de la fertilisation des ovocytes sur des animaux dont les ovaires ne sont soumis qu'aux seules sécrétions basaies des hormones gonadotropes hypophysaires a pu être démontrée en tenant compte du caractère particulier de la maturation des follicules liée à leur taille.
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Claims

REVENDICATIONS
1 - Méthode de superovulation dirigée des femelles bovines, comprenant les étapes suivantes :
- administrer à l'animal un analogue de la LHRH de manière à désensibiliser l'hypophyse à l'action de la LHRH endogène,
- à l'instant de son choix à l'intérieur de la période d'anoestrus profond ainsi induite, administrer à l'animal de l'hormone FSH de manière à induire le recrutement et le développement des follicules ovulatoires,
- en fin de développement, administrer à l'animal une hormone choisie parmi le groupe consistant en LH et hCG, de manière à déclencher l'ovulation de ces follicules.
2 - Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce l'on administre l'analogue de la LHRH au début de la phase lutéale.
3 - Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la mise en anoestrus profond est réalisée par l'administration d'un analogue agoniste de LHRH à dose supraphysiologique.
4 - Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la mise en anoestrus profond est réalisée par l'administration d'un analogue antagoniste de LHRH.
5 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'on administre un analogue de LHRH présenté au sein d'une formulation permettant sa libération continue.
6 - Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que la formulation comprend des polymères dégradables.
7 - Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que les polymères sont des poly (lactide-glycolide) ou des poly (lactique-glycolique).
8 - Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que, comme formulation, on utilise des microsphères de poly(lactide-glycolide) ou de poly(lactique-glycolique) de ratio allant de 50:50 à 65:35.
9 - Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que la formulation comprend des corps gras.
10 - Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que les corps gras sont des acides gras ou des esters d'acide gras ou de polyéthylène-glycol.
11 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisée en ce qu'on administre une formulation sous forme de films, implants ou microsphères.
12 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 11, caractérisée en ce que l'on administre à l'animal une dose d'analogue agoniste comprise entre 15 et 150 mg pour une formulation de libération de 40 à 50 jours environ et entre 30 et 300 mg pour une formulation de libération de 85 à 100 jours environ.
13 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que l'on administre un analogue agoniste de la LHRH choisi parmi le groupe consistant en D.Trp6-LHRH et Des-Gly-D.Trp6-LHRH éthylamide.
14 - Méthode selon l'ensemble des revendications 12 et 13, caractérisée en ce que l'on administre une dose de D.Trp6-LHRH comprise entre 40 et 150 mg pour une formulation de libération de 40 à 50 jours et entre 100 et 300 mg pour une formulation de libération de 85 à 100 jours.
15 - Méthode selon l'ensemble des revendications 12 et 13, caractérisée en ce que l'on administre une dose de Des-Gly-D.Trp6-LHRH éthylamide supérieure à 15 mg pour une formulation de libération de 40 à 50 jours et supérieure à 30 mg pour une formulation de libération de 85 à 100 jours.
16 - Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que les doses sont respectivement comprises entre 30 et 40 mg et entre 60 et 80 mg.
17 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisée en ce que, pour induire le recrutement et le développement des follicules ovulatoires, on administre de l'hormone FSH pendant de 4 à 7 jours.
18 - Méthode selon la revendication 17, caractérisée en ce que l'hormone FSH est administrée par voie parentérale à raison de deux administrations journalières.
19 - Méthode selon la revendication 17, caractérisée en ce que l'hormone FSH est administrée au sein d'une formulation permettant sa libération continue sur la période de 4 à 7 jours.
20 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 17 à 18, caractérisée en ce que l'on associe de l'hormone LH à l'hormone FSH.
21 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisée en ce que, pour déclencher l'ovulation, on administre de l'hormone LH ou hCG le dernier jour du traitement à la FSH.
22 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, caractérisée en ce que, pour déclencher l'ovulation, on administre de l'hormone LH ou hCG lorsque les follicules ont atteint ou dépassé un diamètre de
14-15 mm environ.
23 Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisée en ce que, pour déclencher l'ovulation, on administre de l'hormone LH ou hCG pendant de 1 à 2 jours environ.
24 - Méthode de mise en anoestrus profond, dans laquelle on administre à l'animal un analogue de la LHRH, choisi dans le groupe consistant dans les agonistes et les antagonistes de la LHRH, en quantité suffisante pour désensibiliser l'hypophyse à l'action de l'hormone LHRH endogène.
25 - Méthode selon la revendication 24 , caractérisée en ce qu'on administre à l 'animal , au début de sa phase lutéale, un analogue de la LHRH présenté dans une formulation permettant sa libération continue sur une durée appropriée à l'obtention de la durée choisie pour l'anoestrus profond.
26 - Méthode selon la revendication 25, caractérisée en ce que la formulation est à base de polymères choisis parmi le groupe consistant en poly(lactide-glycolide) et poly(lactique-glycolique).
27 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 24 à 26, caractérisée en ce que l'analogue de la LHRH est choisi dans le groupe consistant en D.Trp6-LHRH et Des-Gly-D.Trp6-LHRH éthylamide.
28 - Kit de superovulation pour les femelles bovines, comprenant, séparément, une formulation à libération continue comprenant comme principe actif un analogue de la LHRH, une formulation comprenant comme principe actif de l'hormone FSH et une formulation comprenant un principe actif choisi dans le groupe consistant en hormone LH et hormone hCG.
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