WO1995008624A1 - HUMAN PHOSPHOLIPASE C-α AND DNA SEQUENCE CODING FOR THE SAME - Google Patents

HUMAN PHOSPHOLIPASE C-α AND DNA SEQUENCE CODING FOR THE SAME Download PDF

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Naoto Hirano
Hisamaru Hirai
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Shionogi & Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a human phospholipase C- ⁇ , which is a secretory protein having redox activity, and a gene encoding said human phospholipase C- ⁇ .
  • the present invention relates to an expression vector containing the gene and a transformant having the expression vector.
  • PLC- ⁇ host lipase C- a
  • PLC- ⁇ host lipase C- a
  • This PLC is an enzyme that hydrolyzes glyceline and sphingolin lipids (hereinafter referred to as PLC activity), and is present in the spleen, small intestinal mucosa, and placenta of mammals. It is known that it plays an important role in vivo.
  • PLC activity hydrolyzes glyceline and sphingolin lipids
  • PI-PLC phosphatidylinositol C
  • Hydrolysis of phosphoric acid produces 1,2-diacylglycerol and inositol 4,5-triphosphoric acid (Rhee.
  • PLC-a The function of PLC-a is not well understood, but its expression is known to increase in stressed organisms and organisms with cancerous tissues.
  • Examples of mammalian PLC- ⁇ include mouse (Herapel. WM et al., J. Immunol. 146, 3713-3720 (1991)) and rat (Bennett, CF. et al., Nature 334.268). -270 (1988)) and PLC (Hirano et al., Proceedings of the 15th Annual Meeting of the Molecular Biology 4L-23, 1992) have reported PLC- ⁇ . These PLC-a have no significant homology to any of the known sequences of other known PLC family members.
  • the mammalian PLC- ⁇ described above has two conserved amino acid sequences, 1 ⁇ -Cys-Gly-His-Cys-Lys, at two sites.
  • This amino acid-preserved sequence is identical to that of amino acids, protein disulfide isomerase (PDI) and thiore doxin. It is identical or very similar to the amino acid sequence of the active site of redox activity.
  • PDI and thioredoxin are both protein disulphide reductases and isomerases. It is a multifunctional protein that acts by catalysis and catalyzes a conversion reaction between a thiol group and a disulfide group.
  • Mammalian PDI has two conserved sequences in the amino acid sequence, the PLC- ⁇ and the conserved sequence, and prokaryotic and eukaryotic thioredoxins contain The amino acid sequence has one Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-Lys similar to the conserved sequence described above.
  • the Cys residues in these sequences are presumed to be catalytically active sites (Holmgren. AL Biol. Chei. 264.13963-13966, Freedman, RB Cell 57.1 069-1702) o
  • the present inventors have proposed that the expression of E. coli
  • PLC- ⁇ is a PLC superfamily. It belongs to a family of redox-regulated proteins that does not belong to one family and has been renamed thymuredoxin (Hirano et al., Supra). This is supported by the commonality of column E above.
  • PLC- ⁇ is a gene transformed with the oncogene v-src gene. Expression level is elevated in target cells, which may be related to carcinogenesis (Hirai. H et al. Genes Dev 4.2342-2352 (1990), Moj. Cell. Biol.10.1307-1318 (1990), Proc Natl. Acad. S ci. USA 87.8592-8596 (1990)) o
  • Human thiodoxin is a factor derived from adult T-cell leukemia (ATL).
  • ATL-derived factor also known as (ATL-derived factor), it is known to induce the expression of interlokin-12 receptor and stimulate cell proliferation (Tagaya, Y. et al., EMB0 J. 8, 757-764 (1989)) 0 Protein levels of thioredoxin are generally high in actively proliferating tissues and elevated levels of thioredoxin raRNA. (Jones, SW et al., J. Biol. Chem.
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned conventional problems, and an object of the present invention is to provide a human PLC-a, a human PLC-like gene, an expression vector containing the gene, and a transformation having the expression vector. In providing the body.
  • the present inventors have obtained a cypress csk protein (Noda, S. et al., 351, 69-72 (1991)) from the thymus and partially purified the cyst csk protein. A linear antiserum was prepared. Using this antiserum, the thymus cDNA library was screened to find the DNAS2 sequence encoding the oxy PLC-gene. Furthermore, isolation of the human PLC-cDNA from the human placenta cDNA library by the hybridization method using this PLC-fr cDNA. As a result, the present invention has been completed.
  • polypeptide of the present invention is a Ser at position 1 in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. It contains the amino acid sequence from position 481 to Leu.
  • the DNA sequence of the present invention encodes an amino acid sequence from Ser at position 1 to Leu at position 481 in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the expression vector of the present invention has the above DNA sequence.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing the above-mentioned expression vector into a host.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequences of PLC-like genes of mouse, human, and mouse.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequences of human PLC- and human PDI genes.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequences of human PLC- ⁇ and human thioredoxin arresters.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of measuring PLC activity in a crude extract, cytoplasmic fraction and membrane fraction of animal cells transformed with the Pseudo PLC- ⁇ gene.
  • - Figure 5 shows the measurement of the insulin-degrading activity of native and mutated PLC-a proteins produced by Escherichia coli transformed with native and mutated PLC- ⁇ genes. It is a figure showing a result.
  • polypeptide of the present invention and the DNA sequence encoding the same are prepared, for example, according to the following steps.
  • the human placenta cDNA library is prepared by a conventional method. First, all BNAs are separated from the human placenta by a method such as the Guanidine.Funol / Cross-mouth Holm method (Gene.28 (1984) .263-270). The polyclonal RNA is obtained by repeatedly subjecting the DNA to an oligo dT cellulose chromatograph to obtain polyA RNA, and a double-stranded cDNA is synthesized from the BNA. Synthesis of the cDNA can be performed according to the method of Gubler and Hofrafra (Gene, 25 (1983) .263-269).
  • a human placenta cDNA library is prepared.
  • a cloning vector a phage vector such as gtll is preferably used, but is not limited thereto, and a cloning vector known to those skilled in the art. Either cutter may be used.
  • Drosophila csk protein can be partially purified from Drosophila thymus according to a protein purification method known to those skilled in the art, for example, the method of Noda et al.
  • Polyclonal antiserum is obtained by a method known to those skilled in the art, for example, after immunizing a rabbit with a partially purified porcine csk protein, collecting the serum and precipitating it by ammonium sulfate precipitation. It can be prepared by purification. Instead of partially purified ⁇ csl (protein, a synthesized ⁇ csk protein or a fragment thereof may be used.
  • the thymus thymus cDNA library can be prepared using the thymus thymus as a material by a conventional method in the same manner as in (1) Preparation of the human placenta cDNA library.
  • the plaque derived from the phage into which the thymus cDNA was inserted for example, a ProtoBlot system (promega) was used. And screening with the polyclonal antiserum obtained in (ii) above, whereby the PLC-a protein DNA fragment can be excised. Positive phage clones can be isolated.
  • the sequencing of the DNA fragment of the positive phage clone obtained in the above (iv) can be directly performed using a method known to those skilled in the art, for example, a DNA sequencing kit. .
  • sequencing can be performed using phage DNA containing the DNA insert prepared from the clone. Preparation of the phage DNA containing the above DNA insert fragment was performed according to the protocol of Ie *, Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1982). You can do this with The thus determined DNA sequence of thymus cDNA clone and the corresponding amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. (3) Isolation of human thymus cDNA phage clone
  • the human placental cDNA library obtained in the above (1) was probed with 32 P-labeled mouse PLC- ⁇ cDNA under mild hybridization conditions. Then, positive phage clones containing human PLC-DNA fragments can be isolated.
  • the probe of the above-mentioned 32 P-labeled mouse PLC- ⁇ cDNA can be prepared by a method known to those skilled in the art based on the sequence E determined in the above (V).
  • the DNA insert fragment base sequence of the positive phage clone obtained in the above section (3) can be determined by the same method as in the above (V).
  • the DNA sequence of the determined human thymus cDNA clone and the corresponding amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the human PLC- ⁇ protein can be produced using a gene recombination technique using a host ⁇ expression vector known to those skilled in the art. Many different host / expression vector combinations can be used for expression of the human PLC- ⁇ protein of the present invention.
  • useful expression vectors can include chromosomal, non-chromosomal, and synthetic DNA sequence segments.
  • Preferred examples are SV40 and various known derivatives of known bacterial plasmids. Plasmids from E.
  • coli such as pCRl, pBR322, pMB9, pET-3A, and their derivatives, the broader host range of the plasmid RP4, many derivatives of ⁇ phage, 13 And phage DNA such as single-filament phage DNA, 2 Yeast plasmids such as plasmids or derivatives thereof, plasmids containing the adenovirus major late promoter enhanced by the presence of the SV40 enhancer. And so on.
  • expression control sequences i.e., sequences that regulate expression of a DNA sequence when operably linked thereto, are described above in order to express the human PLC- ⁇ protein of the present invention.
  • useful expression control sequences include, for example, the early and late promoters of SV40, the early promoter of adenovirus or site megalovirus, the lac series, Trp system, TAC or TRC system, T7 promoter whose expression is induced by T7 RNA polymerase, major operator region and ⁇ phage Motor domain, regulatory domain of fd coat protein, promoter of 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes, acidic phosphoproteinase, e.g.
  • Pho5 promoter Promoters for yeast ⁇ -mating factor polynuclear promoters in the Pacu-Virus virus system and known regulation of the expression of prokaryotic or eukaryotic cells or genes of these viruses Other ⁇ columns, and their various It encompasses combinations.
  • Single-cell host cells are useful for expressing the human PLC- ⁇ protein of the present invention.
  • These hosts include Escherichia coli, Pseudomonas, genus, * Bacillus, Streptomyces, and Saccharomyc es) and other strains of bacteria, chiney shamster ovary ("CH0") cells and cultured mouse cells, C0S1, C0S7, BSC1, BSC40 and And eukaryotic and prokaryotic cells such as animal cells, cultured insect cells, cultured human cells, and cultured plant cells such as African and BMT10 African monkey cells.
  • CH0 chiney shamster ovary
  • C0S1, C0S7, BSC1, BSC40 chiney shamster ovary
  • eukaryotic and prokaryotic cells such as animal cells, cultured insect cells, cultured human cells, and cultured plant cells such as African and BMT10 African monkey cells.
  • a vector having the DNA sequence of the human PLC- ⁇ polypeptide is introduced into a host to obtain a transformant. By culturing this in an appropriate medium, human PLC- ⁇ polypeptide is produced.
  • human PLC-a a secreted protein having redox activity, human PLC-a arrested gene, an expression vector containing the gene, and an expression vector containing the gene A transformant having a protein is provided.
  • polypeptides of the present invention have a conserved sequence that is identical or very similar to the active site of thioredoxin, which stimulates cell growth, and has a protein-like disant. Since it has activity to reduce sulfide bonds, it can be used as an anti-inflammatory agent. In addition, since the expression of PLC- ⁇ increases in vivo at the time of canceration or stress, it can be used as an index of these symptoms, and can also provide a measurement system for clinical evaluation of these symptoms.
  • the first and second strands of cDNA were synthesized from polyA RNA prepared from human placenta, and EcoRI-Notl-BamH was added to both ends of the resulting double-stranded DNA.
  • First and second strands of cDNA were synthesized from polyA RNA prepared from thymus gland, and EcoRI linkers were added to both ends of the obtained DNA. It was inserted into the EcoRI site to obtain a cDNA library.
  • the EcoRI-EcoRV fragment of the phage clone ⁇ 12 insert (located closest to the 5 ′ end of the phage clone ⁇ 12 insert) was used as the probe and The library was screened to obtain phage clone ⁇ 21 having a DNA insert longer than the phage clone ⁇ 12 insertion fragment.
  • the sequence of the inserted fragment in the obtained phage clone ⁇ 21 is as described above.
  • the phage clone; 121 contained the full length PLC- ⁇ sequence containing the sequence of the 5 ′ portion described above.
  • the full-length DNA sequence of the thus-obtained PLC-a and the corresponding amino acid sequence obtained in this manner are shown in E sequence No. 2 of the sequence listing.
  • the ⁇ ZAP11 human placenta cDNA library obtained in (1) above was subjected to mild high pre-digestion conditions. Then, the inserted DNA fragment of phage clone ⁇ 21 labeled with 32 P was screened as a probe to obtain a positive phage clone designated as ⁇ ⁇ 7. Was.
  • the sequence of the inserted fragment in the obtained phage clone was determined by the same method as in the above (1) ( ⁇ ).
  • the obtained human PLC-like full-length DNA system!] And the corresponding amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • FIG. 1 shows the determined amino acid sequence of the human and human PLC- ⁇ and the amino acid sequence of the known mouse PLC- ⁇ (Hempel et al., Supra).
  • Each of the obtained mouse and human PLC-a cDNA sequences consisted of an open reading frame of 1515 bp and contained a hydrophobic N-terminal signal peptide (amino acid residue). It encodes a 505 amino acid polypeptide having a group -24 to -1). The molecular weight of each polypeptide was calculated to be 56.895 and 56,698 Da.
  • the amino acid @ ⁇ sequence of " ⁇ PLC-" showed 903 ⁇ 4, 87%. 943 ⁇ 4 homology, respectively, compared to the mouse, rat and human PLC- C sequences. .
  • Figure 2 shows the sequence of the determined human PLC- ⁇ and the known human tan.
  • 1 shows the sequence of protein disulphide reductase (PDI) (Pihlajaniemi, T. et al., EMBQ J. 6, 643-649 (1987)).
  • Human PLC-na had a homozygosity of 563 ⁇ 4 and a similarity of 32S at the amino acid level compared to human PDI.
  • FIG. 3 shows the determined sequence of human PLC-like column E and known human thioredoxin.
  • the amino acid at positions 1-105 of the human PLC-sequence is 55% smaller than that of human thioredoxin (Tagaya, Y. et al., EMBQ J. 8.75 7-764 (1989)). It showed homology and 23% similarity.
  • the PLC- ⁇ cDNAE sequence obtained in Example 1 was inserted in the forward direction of the mammalian cell expression vector pUC-CAGGS; downstream of the 3 actin promoter. And an antisense vector in which the above-mentioned PLC-a cDNA sequence was inserted in the reverse direction.
  • NIH3T3 mouse fibroblasts were transformed together with pSV2NE0 by the calcium phosphate co-precipitation method known to those skilled in the art. Changed.
  • the resulting transformants were selected with 80Q / zg / inl G418, and three independent and stable transfectants with high expression of Pseudo PLC-a protein into which the vector was introduced were introduced. (Independently named F01, F02s F03) and two independent transformants (named R01, R06) into which the antisense vector was introduced.
  • the cells of the obtained transformants F01, F02, F03, RO1 and R06 were collected and 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl. 0.05% (W / V) Sodium sulfate, l3 ⁇ 4 (v / v) Triton X-100, lOU / nil abrotinin, 2raM PMSF, lOOmg / 1 loliptin, and lmM orthoton, '
  • the cells were lysed on ice in a cell lysate containing sodium nadiruna.
  • the obtained lysate was separated by SDS-PAGE using 93 ⁇ 4 acryloamide, and transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (Mi 11 pore). Then, using a polyclonal antiserum 507, immuno-prototyping was carried out to measure the expression level of PLC in three cell lines.
  • the PLC-expression levels of the three stable transformants were 10 to 15 times that of endogenous PLC- ⁇ .
  • a 1.8 kb fragment of phage clone ⁇ 12 obtained in Example 1 was treated with Mung bean nucl ease to make both ends blunt.
  • the obtained fragment was subcloned into the Smal site of the bacterial expression vector pGEX2T (Pharraacia) to construct a plasmid pGEX-PLC-.
  • This plasmid was used to transform E. coli -1B.
  • the obtained transformant was cultured overnight according to a conventional method, and the obtained culture was diluted 1:10 with a new medium.
  • Trp-Cys-Gly-His-Cys-Lys was site-specifically mutated to prepare a mutant PLC-ff DNAE sequence.
  • the site-specific mutation was performed using Muta-Gene kit (Bio-Bad). Mutation primers 5 '-GCCCCCTGGTCTCCACACAGCAAAAAGCTT-3' (sense) and 5 ⁇ -GCTCCTTGGTCTGGTCACTCTAAGAATCTG-3 '(sense) have Cys at positions 33 and 36 as Ser, and Cys at positions 382 and 385. s was changed to Ser. The obtained site-specific mutation was confirmed by determining the nucleotide sequence.
  • the mutant PLC-protein replaced four Cys residues with Ser in both conserved sequences. That is, this mutant PLC-ff protein has two Trp-Ser-Gly-His-Ser-Lys sequences.
  • the mutant PLC-ct DNA sequence was expressed in Escherichia coli in the same manner as the above-mentioned natural PLC-a DNA sequence to obtain a mutant PLC-protein.
  • the insulin digestion assay was performed in the same manner as Holgeman et al. (Supra) except that the reaction volume was 60 // 1. Non-enzymatic degradation of insulin by dithiothreitol recorded as control did.
  • Escherichia coli thioredoxin was purchased from Promega.
  • Figure 5 shows the results of the measurement using the standard Atsushi. As shown by the curve connecting the black circles and the white squares in the figure, the natural type PLC-flt showed insulin reducing action, but as shown by the curves connecting the white squares. Mutant strain PLC- ⁇ did not show any insulin reducing action.
  • thioredoxin which is represented by a curve connecting white and black squares, has two to three times the activity per mole of protein than tandem PLC-. Had.
  • PLC- ⁇ has the ability to catalyze the reduction of disulfide bonds, similar to thioredoxin, and exhibits Trp-Cys-Gly-Hi The two Cys residues in it were found to be essential for its redox activity.
  • the F02 and R06 transformant cells were grown in a 150 mra culture dish containing DMEM medium (GIBC0) supplemented with 10 ⁇ l serum. The grown cells were washed with a phosphate buffer and cultured in 20 ml of a serum-free medium (Cell Grosser P. Sumitomo Pharmamaceuticals Co.). After 10 hours, collect the culture medium4. The mixture was centrifuged at 100.000 g for 1 hour at C, and the supernatant was collected. The obtained supernatant was dialyzed against water and freeze-dried.
  • DMEM medium GIBC0
  • serum-free medium Cell Grosser P. Sumitomo Pharmamaceuticals Co.
  • the F02 and E06 transformant cells grown on the culture dish in the same manner as described above were washed with DMEM medium containing no methionine, and 15 ml of a medium containing 1 ml of dialyzed sera.
  • the cells were in vivo labeled with linCi [, ">> S] Met in DMEM medium without thionin at 37.
  • the culture supernatant of the in vivo-labeled transformant cells was used as in Example 4.
  • the obtained culture supernatant was subjected to 9XSDS-PAGE, and then subjected to Fuji Bass imaging plate. £ (Fuji) to detect secreted PLC- ⁇ . In addition, it was confirmed that PLC- was highly secreted in the culture supernatant.
  • Sequence type nucleic acid
  • GGCGCCGACC TCCGCAGTCC CAGCCGAGCC
  • GCGACCCTTC CGGCCGTCCC CACCCCACCT 60 CGCCGCC ATG CGC CTC CGC CGC CTA GCG CTG TTC CCG GGT GTG GCG CTG 109
  • GCA AAG AAA TTC CTG GAT GCT GGG CAC AAA CTC AAC TTT GCT GTA GCT 973 Ala Lys Lys Phe Leu Asp Ala Gly His Lys Leu Asn Phe Ala Val Ala
  • ACTTTGTAAA AGGACTCTTC CATCAGAGAT GGAAAACCAT TGGGGAGGGA CTAGGACCCA 1662 TATGGGAATT ATTACCTCTC AGGGCCGAGA GGACAGAATG GAAATAATCT GAATCCTGTT 1722 AAATTTTCTC TAAACTGTTT CTTAGCTGCA CTGTTTATGG AAATACCAGG AACCAGTTTA 1782 TGTTTGTGGT TTTGGGAAAA ATTATTTGTG TTGGGGGAAA TGTTGTGGGG GTGGGGTTGA 1842 GTTGGGGGAT ATTTTCTAAT TTTTTGTA CATTTGGAAC AGTGACCAAT AAATGAGACC 1902 CCTTTAAACT GTCAAAAAAAAAAAA A 1933
  • Sequence type nucleic acid
  • Type of row E cDNA to mRNA
  • Organism name ⁇ ⁇
  • CAC TGC AAA AAG CTT GCC CCA GAG TAT GAA GCT GCA GCT ACC AGA TTA 305 His Cys Lys Lys Leu Ala Pro Glu Tyr Glu Ala Ala Ala Thr Arg Leu
  • GGA ATT GTC AGC CAC CTG AAG AAA CAG GCT GGA CCA GCT TCA GTT CCT 497 Gly lie Val Ser His Leu Lys Lys Gin Ala Gly Pro Ala Ser Val Pro
  • GCA AAA GGA GAG AAG TTT GTC ATG CAG GAG GAG TTC TCG CGT GAT GGC 1121 Ala Lys Gly Glu Lys Phe Val Met Gin Glu Glu Phe Ser Arg Asp Gly
  • TAAAGCAGCA GCCAAACATC ATATACTTTG TCAAAGGACT TTTCCACCAG AGATGGGAAA 1658 ACCAATGGGG AGGACTGGGA CCCGTATGGG AATTACTGCC TCTCAGGGCT GAGAGGGCAG 1718 AATGGTTATA ATCTGAGTCC TGTTAAATTT TCTCTATAACT GTTTCTTTGGTC ATGA TGA TGA TGA GATT ATGA AATGTTGTGG GGGTGGGGGGGG AATTGAGTTG GGGGGTTATT TTCTAATTTT TTTTGTACAT 1898 TTGGAACAGT GACAATAAAT GCGCCCCCTT TAAAAAAAAA AAAA 1942

Description

明細害 ヒ ト ホス ホ リ パーゼ C 一 な およびこれを コ ー ドする
D N A配列 技術分野
本発明は、 酸化還元活性を有する分泌タ ン パ ク 質であ る ヒ ト ホ ス ホ リ パー ゼ C- α、 該 ヒ ト ホ ス ホ リ パー ゼ C-な を コ ー ド する遗伝子、 該遗伝子を含む発現ベク タ ーおよび該発現べ ク タ ーを有する形質転換体に関する。 背景技術
ホ スホ リ パーゼ C-a (以下 PLC-α とする） は、 従来、 ホ ス ホ 'ーゼ c (以下 PLCとする） の種々 の ア イ ソ ザィ ム の ス一 パー フ ァ ミ リ ー に属する と考え られていた。
この PL Cは、 グ リ セ 口 リ ン脂質およびス フ ィ ン ゴ リ ン脂質を 加水分解する （以下 PLC活性とする） 酵素であ り、 哺乳類の脾 臓、 小腸粘膜、 胎盤などに存在し、 生体内で重要な役割を果 た している こ とが知られている。 例えば、 生体内に広く 存在 する ホ ス フ ァ チ ジルイ ノ シ ト ール特異性ホ ス ホ 一ゼ C ( P I -PLC) は、 ホ ス フ ァ チ ジルイ ノ シ ト ー ル 4, 5-二 リ ン酸を加水 分解 して、 1 , 2 -ジァ シル グ リ セ ロー ルおよびイ ノ シ トー ル 4, 5-三 リ ン酸を生成する （Rhee. S. G. ら、 Science 244, 546 - 550 (1989) ) 。 PLCの種々の ァ イ ソ ザィ ム につ いて は、 次の よ う な多 く の報告がある ： Bennet t, C. F. ら、 Nature 334, 268-270 (1988) ； Emori, Y. ら、 J. Biol. Chem. 264, 21885 -21890 (1989) ； Katan, M. ら、 Cell 54, 171-177 (1988) ； 0 hta. S. ら、 FEBS Lett. 242, 31 -35 ( 1988 ) ； Stahl. M. L. ら、 Nature 332. 269-272 ( 1988 ) ； Suh, P. G. ら、 Cel 1 54. 161 -169 (1988) ； Kritz. R. W. ら、 CIBA Found. Symp.150, 112 -127 (1990)。
上記 PLC- a については、 その機能についてはよ く わかっ て いないが、 ス ト レ スを受けた生体および癌化組織を有する生 体においてその発現が増加する こ とが知られている。
哺乳類の PLC- α と しては、 マ ウ ス （ Herapel. W. M. ら、 J. I mmunol. 146, 3713-3720 (1991) ) 、 ラ ッ ト （Bennett, C. F . ら、 Nature 334. 268 -270 ( 1988 ) ) およびゥ シ （平野ら、 第 15回分子生物学会年会講演要旨集 4L-23、 1992 ) の PLC-α が 報告されている。 これら PLC- a は、 他の既知の PLCフ ァ ミ リ ー メ ンバーの既知の配列のいずれと も有意な相同性を有 して いない。
上記の哺乳動物の PLC-α は、 保存さ 1たァ ミ ノ酸配列1^ - Cys-Gly-His-Cys-Lysを 2 ケ所に有している。 こ のア ミ ノ 酸保 存配列は、 夕 ン ノ、 'ク質ジ ス ル フ ィ ドイ ソ メ ラ ーゼ （protein disulf ide isomerase、 PDI) およびチ ォ レ ド キ シ ン （ thiore doxin) の酸化還元活性の活性部位のア ミ ノ 酸配列 と同一も し く は極めて類似 している。 上記 PD Iと チ ォ レ ド キ シ ンは、 いず れ も タ ン パ ク 質 ジ ス ル フ ィ ド還元酵素および異性化酵素と し て作用し、 チオール基と ジス ルフ イ ド基との変換反応を触媒 する多機能タ ンパク質である。 哺乳類の PDIは、 そのア ミ ノ酸 配列中に上記 PLC- α と栢同の保存された配列を 2 ケ所に有し、 そ して原核生物と真核生物のチォ レ ドキ シ ンは、 そのア ミ ノ 酸 Ε列中に上記保存された配列と類似な Trp-Cys-Gly-Pro-Cy s-Lysを 1 つ有する。 これらの配列の Cys残基は、 それぞれ触 媒活性の活性部位である と推定されている （Holmgren. A. L. Biol. Chei. 264.13963-13966 , Freedman, R. B. Cell 57.1 069-1702) o
本発明者らは、 大腸菌で発現したゥ シ PLC-な は機能的に PL
C活性を有さず、 ィ ン シュ リ ンなどのタ ンノ ク質のジス ルフ ィ ド結合を還元する活性を有する分泌タ ンパク 質である こ とを 見出した （平野ら、 ゥ シ PLC- α のク ロー ニ ングとその生物学 的意義、 第 1 5 回日本分子生物学会年会プロ グ ラ ム · 講演要 旨集 -23 , 1992) 従って、 PLC-α は、 PLCス ーパー フ ァ ミ リ 一 に属さず、 酸化還元制御タ ンパク 質フ ァ ミ リ ー に属すべき も のであり、 サイ マ レ ドキシ ン （ thymuredoxin) と改名され た （平野ら、 上述） 。 このこ とは、 上記 E列の共通性から も 支持される。
PLC-α. チ ォ レ ドキ シ ン、 PDIな どの酸化還元制御タ ンパ ク 質フ ァ ミ リ 一は、 生体の正常機能の維持に必要である と考え られている。 以下に、 酸化還元制御タ ンパク 質フ ァ ミ リ 一の 種々の メ ンバーにつ いての種々の報告による知見を示す。
PLC-α は、 癌遺伝子である v-src遺伝子で形質転換された動 物細胞において、 発現レベルが上昇しており、 発癌との関連 が考えられる （Hirai. Hら Genes Dev 4. 2342-2352 (1990)、 M oj. Cell. Biol.10.1307-1318 (1990)、 Proc. Natl. Acad. S ci. U. S. A. 87.8592-8596 (1990)) o
ヒ ト チ ォ レ ドキ シ ンは、 成人 T細胞白血病 （ATL) 由来因子
( ATL-derived factor) と も呼ばれ、 イ ンタ ー ロ イ キ ン一 2 レセブターの発現を誘導し、 細胞の増殖を刺激する こ とが知 られている （Tagaya, Y. ら、 EMB0 J. 8 , 757-764 ( 1989 )) 0 チ ォ レ ド牛 シ ンのタ ンパク質レベルは、 活発に増殖してい る組織中で一般的に高く 、 チ ォ レ ドキ シ ンの raRNAレベルが上 昇する （Jones, S. W. ら J. Biol. Chem. 263.9607-9611 (1988 ))0 酸化還元タ ンパ ク質制御フ ァ ミ リ ーの正常な細胞形態およ び 細胞機能を維持する作用機構の一つ と して、 Cys残基を介する DNA-夕 ンパク質間および夕 ンパク質-タ ンパク質間の連関の制 御が考え られ、 本明細害において参照によ っ て援用される以 下の文献に記載されている。
癌遗伝子と しての活性を有する v-jun遠伝子および v-fos遗 伝子に関連する iosおよび junヘテロ ダイ マーの DNAへの結合は、 こ の 2種類のタ ンパク質の DNA結合領域にある保存された Cys 残基の酸化還元制御によ り調節され、 チ ォ レ ドキ シ ンは こ の 調節を触媒する こ とができ る （Abate. Cら、 Science 249. 115 7-1161 ( 1990))。 レセプター型チ ロ シ ンキナーゼ （ltk) は細 胞酸化還元能における変化を介して調節され、 そのキナーゼ 活性はジ ス ルフ ィ ド結合から な る多量体の形成によ り増大す る （Bauskin, Α· Bら、 Cell 66, 685-696 (1991) ) 0
イ ン ビボにおける Cys介在酸化還元能の制御因子は未だ同定 されていないが、 PLC-£t、 チォ レ ドキ シンおよび PDIは Trp-C ys-Gl -His/Pro-Cys-LysE?iJ tこよ り ィ ン ビ ト 口 でチ 才ーノレ依 存性触媒活性を有するため、 これらがそ の制御因子である可 能性がある。 発明の開示
上記のとおり、 マ ウ ス、 ラ ッ トおよびゥ シの PLC- α につい て詳細な報告がなされているがヒ ト の PLC- α につ いては報告 がな く、 ヒ ト PLC-な 夕 ンパク質およびこれをコー ドする DMA配 列が待望されていた。 本発明は、 上記従来の課題を解決する も のであり、 その目的は、 ヒ ト PLC-a、 ヒ ト PLC-な遺伝子、 該遗伝子を含む発現ベク ターおよび該発現ベク ターを有する 形質転換体を提供する こ と にある。
本発明者らは、 ゥ シ胸腺からゥ シ cskタ ンパ ク 質 （Noda, S. ら、 ature 351 , 69-72 (1991)) を得てこれを部分精製し、 こ のタ ンパク質に対する ゥサギポ リ ク ロ ーナル抗血清を調製し た。 こ の抗血清を用いてゥ シ胸腺 cDNAラ イ ブラ リ ーをス ク リ 一 二 ン グして、 ゥ シ PLC-な遺伝子をコー ドする DNAS2列を見い だした。 さ らに、 こ の ゥ シ PLC-fr cDNAを用いたノ、イ ブリ ダィ ゼー シ ヨ ン によ り、 ヒ ト胎盤 cDNAラ イ ブラ リ ーから ヒ ト PLC- cDNAを単離する こ とにより本発明を完成するに至った。
本発明のポ リ ぺプチ ドは、 配列表の配列番号 1 の 1位の S er か ら 481位の Leuまでのア ミ ノ 酸配列を含む。
本発明の DNA配列は、 配列表の配列番号 1 の 1位の Serか ら 4 81位の Leuまでのァ ミ ノ 酸配列を コー ドする。
本発明の発現ベク ターは、 上記の DNA配列を有す る。
本発明の形質転換体は、 上記発現ベク ターを宿主に導入 し て得られる。
図面の簡単な説明
図 1 は、 ゥ シ、 ヒ ト およびマ ウ ス の PLC-な 遺伝子のァ ミ ノ 酸配列を示す。
図 2 は、 ヒ ト PLC-な および ヒ ト PD I遺伝子のァ ミ ノ酸配列を 示す。
図 3 は、 ヒ ト PLC- α および ヒ ト チ ォ レ ドキ シ ン逮伝子のァ ミ ノ 酸配列を示す。
図 4 は、 ゥ シ PLC- α遺伝子で形質転換された動物細胞の粗 抽出液、 細胞質分画および膜画分中の PLC活性の測定結果を示 す図であ る。 - 図 5 は、 天然型および変異型のゥ シ PLC-α遺伝子で形質転 換 された大腸菌が生産する天然型および変異型のゥ シ PLC- a タ ンパク質のィ ン ス リ ン分解活性測定結果を示す図である。
発明を実施する ための最良の形態
本発明のポ リ ぺプチ ドおよびこれをコ ー ドする D NA配列は、 例えば、 以下の工程に従って調製される。 (1)ヒ ト胎盤 cDNAラ イ ブラ リ ーの調製
ヒ ト胎盤 c DNAラ イ ブラ リ 一は、 常法を用いて調製される。 それにはまず、 ヒ ト胎盤から全 BNAをグァニ ジ ン .フ ユ ノ ー ル /ク ロ 口 ホ ルム法 (Gene.28 (1984).263-270) な どの方法によ り分離し、 こ れをオ リ ゴ dTセ ル ロー ス カ ラ ム ク ロ マ ト グラ フ ィ 一にかける こ とを緣り返して polyA RNAを得、 該 BNAか らニ 本鑌 cDNAを合成する。 ニ本鑌 cDNAの合成は、 Gublerおよび Ho ffraanの方法 (Gene, 25 ( 1983 ) .263-269) などに従って行う こ とができ る。 得られたニ本鎮 cDNAに適当な リ ンカー E列を付 加して制限酵素切断部位を形成し、 ク ロー ニ ング用ベク タ ー の、 上記リ ン カ一配列と同じ制限酵素切断部位に挿入する こ と によ り、 ヒ ト胎盤 cDNAラ イ ブラ リ ーが調製される。 ク ロー ニ ング用べク ターと しては gtllな どのフ ァ ー ジべク タ ーが 好適に使用されるが、 これに限定されず、 当業者に公知のク ロ ー ニ ン グ用べク ターがいずれも使用され得る。
(2)ゥ シ PLC-な cDNAの調製
(i)ゥ シ cskタ ンパク質の部分精製
ゥ シ cskタ ンパク 質は、 ゥ シ胸腺から当業者に公知のタ ンパ ク質の精製方法、 例えば、 Nodaらの方法に従って部分精製さ れ得る。
(ii)ポ リ ク ローナル抗血清の調製
ポ リ ク ローナル抗血清は、 当業者に公知の方法によ り、 例 えば、 部分精製された ゥ シ cskタ ンパク 質を ゥ サ ギに免疫 した 後、 血清を採取し硫安沈殿によ り部分精製して調製し得る。 部分精製された ゥ シ csl (タ ンパク質の代わ り に、 合成したゥ シ cskタ ンパク 質も し く はその断片を使用 し得る。
( i i i )ゥ シ胸腺 cDNAラ ィ ブ ラ リ 一の調製
ゥ シ胸腺 cDNAラ イ ブラ リ ー は、 ゥ シ胸腺を材料に して上記 (1) ヒ ト胎盤 c DNAラ イ ブ ラ リ 一 の調製と同様、 常法によ り 調 製 し得る。
(iv)ゥ シ胸腺 cDNAフ ァ ー ジ ク ロ ー ンの単離
上記（iii)で得られた ゥ シ胸腺 cDNAラ ィ ブラ リ 一の分析は、 ゥ シ胸腺 cDNAが挿入されたフ ァ ー ジ由来のプラ ーク を、 例え ば ProtoBlot system (Promega社製） を用いて、 上記（ii)で得 られたポ リ ク ロ ーナル抗血清でス ク リ ーニ ン グする こ と に よ り 実施し得、 それによ つてゥ シ PLC-a 夕 ンパク質 DNA断片を含 む陽性フ ァ ー ジ ク ロ ー ンを単離 し得る。
( V )ゥ シ胸腺 c DNAの配列決定
上記（iv)で得 られた陽性フ ァ ー ジク ロー ンの DNA揷入断片の 配列決定は、 例えば、 DNAシーゲ ン シ ン グキ ッ ト な どの当業者 に公知の方法を用いて直接実施 し得る。 ある いは、 該ク ロ ー ンか ら調製 した上記 DNA挿入断片を含むフ ァ ー ジ DNAを用いて 配列決定 し得る。 上記 DNA挿入断片を含むフ ァ ー ジ DNAの調製 は、 伊 jえは *、 Maniatisら、 Molecular Cloning. A Laborat or y manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yor k(1982)の プ ロ ト コ ルに よ り行う こ と がで き る。 こ のよ う に し て決定された ゥ シ胸腺 c DN Aク ロ ー ン の D NA配列、 およびそれに 対応する ァ ミ ノ 酸配列を配列表の配列番号 2 に示す。 (3) ヒ ト胸腺 cDNAフ ァ ー ジ ク ロ ー ンの単離
上記（1)で得られた ヒ ト胎盤 cDNAラ イ ブラ リ ーを、 緩和なハ イ ブリ ダィ ゼー シ ョ ン条件下で、 32P標識したゥ シ PLC- α cDN Aをプロ ー ブと してス ク リ ー ユ ン グす る こ と によ り、 ヒ ト PLC - DNA断片を含む陽性フ ァー ジク ローンを単.離し得る。 上記 32P標識したゥ シ PLC-α cDNAをプローブは、 上記（V)で配列決 定された E列を もとに、 当業者に公知の方法によ り調製され 得る。
)ヒ ト胸腺 cDNAフ ァ ー ジ ク ロ ー ンの配列決定
上記（3)項で得られた陽性フ ァ ー ジ ク ロ ー ンの DNA挿入断片 塩基配列の決定は、 上記（V)と同様の方法で決定され得る。 決 定された ヒ ト胸腺 cDNAク ロ ー ン の DNA配列およびそれに対応す るァ ミ ノ酸配列を配列表の配列番号 1 に示す。
(5) ヒ ト PLC-な タ ンパク 質の生産
ヒ ト PLC- α タ ンパク質は、 当業者に公知の宿主 Ζ発現べク ターを用いた遣伝子組換え技術を用いて生産し得る。 多種類 の宿主/発現ベ ク タ ーの組合せが、 本発明の ヒ ト PLC-α タ ン パク質の発現に使用し得る。 例えば、 有用な発現ベ ク タ ーは、 染色体、 非染色体、 および合成 D N A配列のセ グメ ン ト を含 み得る。 好適な例は、 SV40および既知の細菌ブラ ス ミ ドの種 々 の公知の誘導体である。 例えば pCRl、 pBR322、 pMB9、 pET- 3A、 それらの誘導体などの大腸菌からのプラ ス ミ ド、 よ り広 い宿主範囲のプ ラ ス ミ ド RP4、 λ フ ァ ー ジの多く の誘導体、 Μ 13および繊維状一本鎮フ ァ ー ジ DNAな どのフ ァ ー ジ DNA、 2 プ ラ ス ミ ドある いはその誘導体のよ う な酵母プ ラ ス ミ ド、 SV 40 のェ ン ハ ンサ一の存在によ り増強される アデノ ウ イ ルス主 要後期プロモーターを含むプラ ス ミ ドな どがある。
さ らに、 多種類の発現調節配列、 すなわち作動可能にそれ に連結する と き に D N A配列の発現を調節する配列が、 本発 明の ヒ ト PLC-α 夕 ンパク質を発現するために上記ベ ク タ ーに おいて使用し得る。 そのよ う な有用な発現調節配列は、 例え ば、 SV40 の初期および後期プロ モー タ ー、 アデノ ウ イ ルス あ る いはサ イ ト メ ガロ ウ ィ ルス の初期プロ モー タ ー、 lac系、 t rp系、 TAC ある いは TRC系、 T7 RNA ボ リ メ ラーゼによ り その 発現が引 き起こ される T7 プ ロ モー タ ー、 λ フ ァ ー ジの主要 オ ペ レー タ ー領域およびプロ モータ ー領域、 fd コ ー ト タ ンパ ク 質の調節領域、 3-ホ ス ホグ リ セ レー ドキナーゼあ るいは他 の解糖酵素のプロモータ ー、 酸性ホ ス フ ァ タ ーゼ、 例えば P ho5 プロモータ ー、 酵母 α -接合因子のプロ モータ ー.、 パキュ 口 ゥ ィ ル ス系の多核体プロ モーターおよび原核細胞または真 核細胞またはそれらのゥ ィ ル ス の遗伝子の発現を調節する公 知の他の Ε列、 およびそれらの種々 の組合せを包含する。
多種類の単細胞宿主細胞が、 本発明の ヒ ト PLC- α タ ンパク 質の発現に有用である。 これら宿主は、 大腸菌、 シ ユー ドモ ナ ス属 (Pseudomonas)、 ノ、 *チ ノレス属（Bacillus)、 ス 卜 レブ 卜 マ イ セ ス属 (Streptomyces)、 サ ッ 力 ロ マ ィ セ ス 属 （Saccharomyc es)および他の力 ビの菌株、 チ ャ イ ニー ズハ ム ス タ ー卵巣（"C H0")細胞および培養マウ ス細胞、 C0S1、 C0S7、 BSC1、 BSC40およ び BMT10の ア フ リ カ ミ ド リ ザル細胞な どのよ う な動物細胞、 培 養昆虫細胞、 培養ヒ ト細胞および培養植物細胞な ど公知の真 核細胞および原核細胞を包含 し得る。
上記ヒ ト PLC- α ポ リ べプチ ドの DNA配列を有する ベク ターを 宿主に導入し、 形質転換体を得る。 これを適当な培地で培養 する こ と によ り、 ヒ ト PLC- α ポ リ ペプチ ドが生産される。
本発明によれば、 こ の よ う に、 酸化還元活性を有する分泌 夕 ンパク質であ る ヒ ト PLC-な 、 ヒ ト PLC-a逮伝子、 該遺伝子 を含む発現ベク ターおよび該発現ベク タ ーを有する形質転換 体が提供される。
本発明のポ リ ぺプチ ドは、 細胞の増殖を刺激する チォ レ ド キ シ ンの活性部位と同一も し く はきわめて類似する保存され た配列を有し、 そ してタ ンパク質の ジス ルフ ィ ド結合を還元 する活性を持つので、 抗炎症剤と して利用され得る。 また癌 化やス ト レ ス時に生体内で PLC-α の発現が増加するので、 こ れら症状の指標とな り、 さ ら にこれら症状の臨床評価の測定 系を提供 し得る。
(実施例）
以下に、 本発明を実施例に基づいて説明する。
[実施例 1 ]
(1)ヒ ト胎盤 cDNAラ イ ブラ リ ーの調製
ヒ ト胎盤よ り 調製 した polyA RNAか ら cDNAの第 1 鎖および第 2 鎖を合成し、 得られた二本鎖 DNAの両端に EcoRI-Notl-BamH
Iアダプタ ーを付加 した後、 λ ZAP Hベク ター に挿入 し ヒ ト 胎 盤 cDNAラ イ ブラ リ ーを調製した。
(2) ゥ シ PLC- cDNAの調製
(i ) ゥ シ cskタ ンパ ク 質の部分精製
cskタ ン パ ク 質の一部分であ って、 srcタ ン パ ク 質フ ア ミ リ 一 に共通の SH2 (Src-Homology2) 部分に保存されている ア ミ ノ 酸配列 Gly— Thr-Phe— Leu— Val-Arg - Glu— Ser力 ら な るぺプチ ド を合成 し、 こ れに対する抗血清を ゥサギから調製 した。 こ の 抗血清を用いた ゥ - ス タ ンプロ ッ ト解析を指標と してゥ シ胸 腺か ら部分精製された 50 kDのタ ンパク質であ る cskを得た。
( i i ) ポ リ ク ローナル抗血清の調製
部分精製した ゥ シ cskタ ンパク質を ゥ サギに免疫 した後、 血 清を採取 し、 硫安沈殿によ り 部分精製して、 抗血清を得た。 得 られた抗血清をポ リ ク ロ ーナル抗血清 507と命名 した。
( i i i )ゥ シ胸腺 cDNAラ ィ ブラ リ 一の調製
ゥ シ胸腺よ り 調製 した polyA RNAか ら cDNAの第 1 鎖および第 2 鎖を合成し、 得られたニ本鎮 DNAの両端に EcoRI リ ンカ 一を 付加 した後、 L gtllベ ク タ 一 の EcoRI部位に挿入 し、 cDNAラ イ ブラ リ ーを得た。
( i V)ゥ シ胸腺 cDNAク ロー ン の単離およ び配列決定
上記（ i i U項で得られたゥ シ胸腺 c DNAラ ィ ブラ リ 一の分析を、 ゥ シ胸腺 cDNAが挿入されたフ ァ ー ジ λ gtll由来の 1.8 X 106 個のプラ ーク を、 ProtoBlot system (Promega社製） を用 Lヽて、 ポ リ ク ロ ーナ ル 507抗血清でス ク リ ーユ ン グする こ と によ り 実 施 し、 それによ つて 3 つの陽性フ ァ ー ジク ロ ー ンを単離 した。 即ち、 上記 cDNAラ イ ブラ リ ーを大腸菌 Y 1090R-にプ レー ト し、 小さなプラーク が生じる まで 4 Cで 4時間培養した。 その後、 λ llgtべク ターの lacプロモータ ーか らの発現を誘発する IPT Gに前も っ て浸した二 ト ロ セ ルロ ー ス シー ト （Hybond C-Extr a、 Amersham社製） を上記小さなプラ ーク を含むプレー ト上に のせ、 3 時間保温した。 次いでニ ト ロ セ ルロ ー ス シー ト を注 意深く はがし、 ポ リ ク ローナル 507抗血清と反応する陽性フ ァ ー ジク ロー ンを同定した。
上記（iv)で得られたフ ァ ー ジク ロ ー ンの う ち最も大き い 1. 8kbの挿入断片を持つフ ァ ー ジク ロ ー ン λ 12の両鎮を、 ェキ ソ ヌ ク レアーゼ I I 1 (Pharmacia社製） でネ ス テ ツ ドデ ィ リ ー シ ョ ンを生成させて、 Sequenase 2.0 (USB社製） で配列を決定 した。
決定した配列を FASTAおよび TFASTAプロ グラ ム （Peason, . E. ら， Proc. Natn. Acad. Sci. U. S. A. 85. 2444-2448 (1988 )) を用い、 DDBJ (DNA Data Bank of Japan) データベー ス を用 いて既知の配列とのホモ ロ ジ一検索した。 その結果、 ゥ シ PL C-α と類似の配列であるが、 ゥ シ PL C- α の 5 ·部分が欠けた DN Α配列であ る こ とが判明 した。 そ こで、 フ ァ ー ジク ロー ン λ 1 2挿入断片の EcoRI-EcoRV断片（フ ァ一ジク ロー ン λ 12挿入断片 の最も 5'末端寄り に位置する） をプローブと して、 同じ ラ イ ブラ リ ーをス ク リ ーニ ングし、 フ ァ ー ジク ロ ー ン λ 12挿入断 片よ り長い DNA挿入断片を持つフ ァ ー ジク ロー ン λ 21を得た。 得 られたフ マ ー ジク ロー ン λ 21中の挿入断片の配列を上記と 同 じ方法で決定 したと こ ろ、 フ ァ ー ジク ロ ー ン ； 1 21は上記の 5 '部分の配列を含む、 ゥ シ PLC- α全長 §£列を含んでいた。 こ のよ う に して得 られたゥ シ PLC- a の全長の DNA配列、 およびそ れに対応する ァ ミ ノ酸配列を配列表の E列番号 2 に示す。
(3) ヒ ト胎盤 cDNAフ ァ ー ジ ク ロ ー ンの単離
ヒ ト PLC- a cDNAフ ァ ー ジク ロー ンを得るため、 上記（1)で得 られた λ ZAP 11ヒ ト胎盤 cDNAラ イ ブラ リ ーを、 緩和なハイ プ リ ダイ ゼー シ ヨ ン条件下で、 32P標識した上記フ ァ ー ジク ロー ン λ 21の挿入 DNA断片をプ ロー ブと して ス ク リ ーニ ン グ し、 λ ΐ 7と命名 した陽性フ ァ ー ジク ロー ンを得た。 得られたフ ァ ー ジ ク ロ ー ン中の挿入断片の配列を上記（1) (ν)と同 じ方法で決定 した。 得られた ヒ ト PLC-な の全長の DNA配歹!]、 およびそれに対 応するァ ミ ノ酸配列を配列表の配列番号 1 に示す。
決定されたゥ シおよびヒ ト PL C- α のァ ミ ノ 酸配列および公 知のマ ウ ス の PLC-α のア ミ ノ 酸配列（Hempelら、 上述）を図 1 に示す。 得られたゥ シおよび ヒ ト PLC- a cDNA配列は、 いずれ も 1515 bpのオ ー プン リ ーデ ィ ン グフ レー ムか ら な り 、 疎水性 の N末端シグナルペプチ ド （ア ミ ノ酸残基 -24〜- 1) を有す る 505ァ ミ ノ 酸のポ リ ぺプチ ドをコ一 ド していた。 それぞれの ポ リ ぺプチ ドの分子量は 56. 895および 56, 698Daと算出された。 ゥ シ PLC- " のア ミ ノ酸 @Ξ列は、 マ ウ ス、 ラ ッ ト およびヒ ト PL C -な の配列と比較して、 それぞれ、 90¾、 87%. 94¾の相同性を 示 した。
図 2 に決定された ヒ ト PLC- α の配列および公知の ヒ ト タ ン パク質ジ ス ル フ イ ド還元酵素 （以下 PD I) (Pihlajaniemi, T. ら、 EMBQ J. 6 , 643 -649 (1987 )) の配列を示す。 ヒ ト PLC-な は、 ヒ ト PDIと比較して、 ア ミ ノ酸レベルで 56¾の栢同性およ び 32Sの類似性を有していた。
図 3 に決定された ヒ ト PLC-な の E列および公知の ヒ ト チォ レ ドキ シ ンの配列を示す。 ヒ ト PLC-な配列の 1〜 105位のァ ミ ノ 酸は、 ヒ ト チ ォ レ ドキ シン （ Tagaya, Y. ら、 EMBQ J. 8.75 7-764 (1989 )) と比較して、 55¾の相同性および 23¾の類似性 を示した。
[実施例 2 ]
実施例 1 で得られたゥ シ PLC-な cDNAE列を、 哺乳動物細胞 発現べク タ ー pUC-CAGGSの；3 ァ ク チ ンプロモータ ー の下流に順 方向に挿入した PLC-α セ ン スベク ター （発現ベク ター） およ び上記ゥ シ PLC- a cDNA配列を逆方向に挿入したア ンチセ ン ス ベク ターを構築した。 こ のセ ン スベク ターおよびア ンチ セ ン スベク ターを用いて、 pSV2NE0と共に当業者に公知の リ ン酸カ ル シ ゥム共沈殺法によ り 、 NIH3T3マ ゥ ス繊維芽細胞を形質転 換した。 得られた形質転換体を 80Q/z g/inlの G418で選択し、 セ ン ス べク ターが導入された、 ゥ シ PLC- a タ ンパク質を高発現 する 3種の独立した安定な形質転換体 （F01、 F02s F03と命名 した） 、 およびア ンチセ ン スベク ターが導入された、 2 種の 独立した形質転換体 （R01、 R06と命名） を得た。
得られた形質転換体 F01、 F02、 F03、 RO 1および R 06の細胞を 集め、 50mM Tris-HCl pH7.4, 150mM NaCl. 0.05%(W/V) ドデ シ ル硫酸ナ ト リ ウ ム、 l¾(v/v) ト リ ト ン X- 100、 lOU/nilアブロ チ ニ ン、 2raM PMSF、 lOOmg/1ロ イ ぺプチ ンおよ び lmMォ ル トノ、'ナ ジルナ ト リ ウ ムを含む細胞溶解液中、 氷上で溶解した。 得ら れた溶解液を 9¾の ァ ク リ ノレア ミ ドを用いた SDS-PAGEによ り分 離し、 ボ リ ビニ リ デ ン ジ フ ルオ ラ ィ ド膜（Mi 11 i pore社製）に移 し、 ポ リ ク ローナル抗血清 507を用いて、 免疫プロ ッ トする こ と によ り、 3種の細胞株の PLC-な発現レ ベルを測定した。 3 種の安定な形質転換体の PLC-な発現レベルは、 内在性 PLC- α の 10〜 15倍であ つた。
これら 5 つの細胞株の粗抽出液、 細胞質分画、 膜分画を Ka toらの方法 (J. Biol. Chem.267 , 6483 -6487 (1991 ) )に徒って調 製した。 得られた粗抽出液、 細胞質分画、 膜分画中の PLC活性 を、 Katoらの方法に従って、 [3H]PtdIns 4, 5-P2を基質と して 測定した。 図 4 に測定結果を示す。 図中 a は粗抽出液中の、 b は細胞質分画中の、 c は膜分画中の PLC活性をそれぞれ示す。 図示したよ う にいずれの分画においても、 PLC活性は各細胞株 間で実質的に差はなかった。
[実施例 3 ]
哺乳類 PLC- α が、 PDIの酸化還元活性部位と全く 同一の配列 をそのア ミ ノ酸配列中に有するため、 PLC-な が PDIと同様の還 元作用を有する と推定し、 大腸菌に発現させた天然型および 変異型ゥ シ PLC- α タ ンパク質の還元作用を、 ィ ン ス リ ン の ジ チ オ ス レィ ト ー ル依存性分解を測定する公知のア ツ セィ （Hoi mgren. A. J. Biol. Chem. 254. 9627- 9632 ( 1979 ))法で測定 した。
(1)ゥ シ PLC-α タ ンパク質の発現
実施例 1 で得られたフ ァ ー ジク ロ ー ン λ 12の 1.8kbの挿入断 片を Mung bean nucl easeで処理 し両端を平滑末端と した。 得 られた断片をバク テ リ ア発現べク タ一 pGEX2T(Pharraacia社製） の Smal部位にサ ブク ロ ー ン し、 ブラ ス ミ ド pGEX-PLC-な を構築 した。 このプラ ス ミ ドを用いて大腸菌 -1Bを形質転換 した。 得られた形質転換体を常法に従い一晩培養し、 得られた培養 液を新鲜培地と 1:10で希釈し 25。Cで培養 した。 18時間後 0.1m 1の IPTGを添加し、 さ ら に 6 時間培養 し 1.8kbの挿入断片の発 現を誘導した。 得られた大腸菌菌体を 50mM Tris-HCl pH7.5. 25% シ ユ ーク ロ ー ス . 0. NP-40および 5mM MgCl2を含む溶解 緩衝液中で凍結融解する こ と によ り溶解 した。 この溶解物を 遠心分離によ り 清澄化して得た上清を 1.2/z in Acrodisc (Gelm anSciences社製〉で濾過 し、 得られた濾過液をグルタ チ オ ンセ フ ァ ロ ー ス 4 B (Pharmacia社製）力 ラ ム にかけた。 カ ラ ムを 2 OinM Tris-HCl pH7.5. 2πΜ MgCl2fcよび ImM ジチ オ ス レ ィ 卜一 ルを含む緩衝液で洗浄し、 5πΜグルタ チ オ ンおよび 50mMTi s-H CI pH9.5を含む溶出緩衝液で溶出した。 溶出液は、 1.5mlずつ 分画 し、 8SKSDS-ポ リ アク リ ルア ミ ドゲルを用いた電気泳動に よ り分析した。 PLC-な タ ンパク質を含む画分を集め、 20mM T ris-HCl pH7.5および 10mM ジチオ ス レィ トー ルを含む透析緩 衝液に対 して透析した。 透析された試料は、 2.5mM CaCl2. 5 OmM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaClおよびタ ン ノヽ。ク質 lmg当り 4 00Uの ヒ ト ト ロ ン ビ ン （Sigma社製）を含む消化緩衝液で 1.5時間 室温でイ ンキュ ベー ト した。 この試料液を リ ン酸緩衝液で平 衡化したセ フ ア デッ ク ス 16/60 (Pharmacia社製）にかけ、 lral/ 分の溶出速度で溶出した。 得られた画分を 12¾SDS-PAGEで分析 し ゥ シ PLC-α タ ンパ ク質を含む画分を集め、 水に対して透析 した後、 凍結乾燥し PLC-a タ ンパク 質を得た。 これは天然型 の PLC-なである。
次いで、 保存 E列 Trp-Cys-Gly-His-Cys-Lysを部位特異的に 変異する こ と に よ り変異型 PLC-ff DNAE列を調製した。 部位特 異的な変異は、 Muta-Gene kit(Bio-Bad社製）を使用して行つ た。 変異ブラ ィ マ ー 5' - GCCCCCTGGTCTCCACACAGCAAAAAGCTT - 3' (センス）およ び 5· -GCTCCTTGGTCTGGTCACTCTAAGAATCTG-3' (センス）は 33位および 36位の Cysを Serに、 そ して 382位および 385位の Cy sを Serにそれぞれ変えた。 得られた部位特異的変異は、 塩基 配列を決定する こ と によ り確認した。 変異型 PLC-な タ ンパク 質は、 2 ケ所の保存配列の両方で、 計 4 つの Cys残基を Serに 置換した。 すなわち、 こ の変異型 PLC-ff タ ンパク質は、 2 つ の Trp-Ser-Gly-His-Ser-Lys配列を有する。 変異型 PLC-ct DNA 配列を、 上記天然型 PLC- a DNA配列と同様に大腸菌で発現し変 異型 PLC- タ ンパク 質を得た。
(2)ィ ン ス リ ン分解を測定する標準ァ ッ セ ィ
イ ン ス リ ン分解ア ツ セ ィ は、 反応容量を 60// 1と した点を除 いて、 Holgemanら （上述） と同じ方法で行った。 ジチオ ス レ ィ トールによる ィ ン ス リ ンの非酵素的分解を対照と して記録 した。 大腸菌チォ レ ドキ シ ンは、 Promega社力 1ら購入した。 標準ア ツセ ィ による測定の結果を図 5 に示す。 図中黒丸お よび中点白四角印で結ぶ曲線で示される よ う に天然型ゥ シ PL C-flt はィ ン ス リ ン還元作用を示したが、 白四角を結ぶ曲線で 示すよ う に変異型ゥ シ PLC-α はイ ン ス リ ン還元作用を全く 示 さなかった。 このア ツセィ において、 白四角および黒四角を 結ぶ曲線で示すチ ォ レ ドキ シ ン は、 ゥ シ PLC-な よ り も タ ン ノ、' ク質 1 モルあた り 2〜 3倍の活性を有していた。
これらの結果から明らかなよ う に、 PLC- α はチォ レ ドキ シ ン と同様にジ ス ルフ ィ ド結合の還元を触媒する能力を有し、 Trp-Cys-Gly-Hi
Figure imgf000021_0001
中の 2 つの Cys残基がその酸化 還元活性に必須である こ とがわかった。
[実施例 4 ]
実施例 2 で得られた形質転換体 F02および R06が生産する分 泌型の PLC-α を検出した。 F02および R06形質転換体細胞を、 10¾ゥ シ血清を添加した DMEM培地 （GIBC0社製） を含む 150mraの 培養皿で生育させた。 生育した細胞を リ ン酸緩衝液で洗浄し、 20mlの血清を含まない培地 ( Cell Grosser P. Sumitomo Pha rmaceuticals Co. ) で培養した。 10時間後、 培養培地を集め、 4 。Cで 1 時間 100.000gで遠心分離し、 上清を集めた。 得られ た上清を水に対して透析した後凍結乾燥した。 その後実施例 2 と同じ方法でポ リ ク ロ ーナル抗血清 507を用いたィ ム ノ プロ ッ ト分析を行い分泌型 PLC-な を検出 した。 ィ ム ノ ブ ロ ッ ト分 析は、 F02細胞の上清中に分泌型の PLC- αが過剰産生されてお り B06細胞でも少量ながら産生されている こ とを示した。
さ らに、 上記と同じ方法で培養皿で生育させた F02および E 06形質転換体細胞をメ チ ォ ニ ンを含まない DMEM培地で洗浄し、 15mlの 1¾の透析済ゥ シ血清を含むメ チォニ ンを含まない DMEM 培地中、 37でで、 linCiの [，"》S] Metを用いてイ ン ビボ標識し た。 イ ン ビボ標識した形質転換体細胞の培養上清を実施例 4 と同じ方法で培養して得た。 得られた培養上清を 9XSDS-PAGE にかけた後、 Fuji Bass imaging plate. £ (Fuji社製） に瞜 して分泌型の PLC-αを検出した。 その結果、 培養上清中に PL C-な が高分泌される こ と を確認した。
(配列表）
配列番号： 1
配列の長さ ： 1 99 3
配列の型：核酸
鎮の数：ニ本鎮
ト ポロ ジー ：直線状
ΒΞ列の種類： cDNA to nRNA
起源
生物名： ヒ ト
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 68-1585
特徴を決定した方法： S
E列
GGCGCCGACC TCCGCAGTCC CAGCCGAGCC GCGACCCTTC CGGCCGTCCC CACCCCACCT 60 CGCCGCC ATG CGC CTC CGC CGC CTA GCG CTG TTC CCG GGT GTG GCG CTG 109
Met Arg Leu Arg Arg Leu Ala Leu Phe Pro Gly Val Ala Leu
-20 -15
CTT CTT GCC GCG GCC CGC CTC GCC GCT GCC TCC GAC GTG CTA GAA CTC 157 Leu Leu Ala Ala Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ser Asp Val Leu Glu Leu
-10 -5 1 5
ACG GAC GAC AAC TTC GAG AGT CGC ATC TCC GAC ACG GGC TCT GCG GGC 205 Thr Asp Asp Asn Phe Glu Ser Arg lie Ser Asp Thr Gly Ser Ala Gly
10 15 20
CTC ATG CTC GTC GAG TTC TTC GCT CCC TGG TGT GGA CAC TGC AAG AGA 253 Leu Met Leu Val Glu Phe Phe Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Arg
25 30 35
CTT GCA CCT GAG TAT GAA GCT GCA GCT ACC AGA TTA AAA GGA ATA GTC 301 Leu Ala Pro Glu Tyr Glu Ala Ala Ala Thr Arg Leu Lys Gly I le Val 40 45 50
CCA TTA GCA AAG GTT GAT TGC ACT GCC AAC ACT AAC ACC TGT AAT AAA 349 Pro Leu Ala Lys Val Asp Cys Thr Ala Asn Thr Asn Thr Cys Asn Lys
55 60 65 70
TAT GGA GTC AGT GGA TAT CCA ACC CTG AAG ATA TTT AGA GAT GGT GAA 397 Tyr Gly Val Ser Gly Tyr Pro Thr Leu Lys I le Phe Arg Asp Gly Glu
75 80 85
GAA GCA GGT GCT TAT GAT GGA CCT AGG ACT GCT GAT GGA ATT GTC AGC 445 Glu Ala Gly Ala Tyr Asp Gly Pro Arg Thr Ala Asp Gly lie Val Ser
90 95 100
CAC TTG AAG AAG CAG GCA GGA CCA GCT TCA GTG CCT CTC AGG ACT GAG 493 His し eu Lys Lys Gin Ala Gly Pro Ala Ser Val Pro Leu Arg Thr Glu
105 110 115
GAA GAA TTT AAG AAA TTC ATT AGT GAT AAA GAT GCC TCT ATA GTA GGT 541 Glu Glu Phe Lys Lys Phe lie Ser Asp Lys Asp Ala Ser lie Val Gly
120 125 130
TTT TTC GAT GAT TCA TTC AGT GAG GCT CAC TCC GAG TTC CTA AAA GCA 589 Phe Phe Asp Asp Ser Phe Ser Glu Ala His Ser Glu Phe Leu Lys Ala
135 140 145 150
GCC AGC AAC TTG AGG GAT AAC TAC CGA TTT GCA CAT ACG AAT GTT GAG 637 Ala Ser Asn Leu Arg Asp Asn Tyr Arg Phe Ala His Thr Asn Val Glu
155 160 165
TCT CTG GTG AAC GAG TAT GAT GAT AAT GGA GAG GGT ATC ATC TTA TTT 685 Ser Leu Val Asn Glu Tyr Asp Asp Asn Gly Glu Gly lie lie Leu Phe
170 175 180
CGT CCT TCA CAT CTC ACT AAC AAG TTT GAG TAC AAG ACT GTG GCA TAT 733 Arg Pro Ser His Leu Thr Asn Lys Phe Glu Tyr Lys Thr Val Ala Tyr
185 190 195
ACA GAG CAA AAA ATG ACC AGT GGC AAA ATT AAA AAG TTT ATC CAG GAA 781 Thr Glu Gin Lys Met Thr Ser Gly Lys lie Lys Lys Phe lie Gin Glu
200 205 210
AAC ATT TTT GGT ATC TGC CCT CAC ATG ACA GAG GAC AAT AAA GAT TTG 829 Asn He Phe Gly He Cys Pro His Met Thr Glu Asp Asn Lys Asp Leu
215 220 225 230
ATA CAG GGC AAG GAC TTA CTT ATT GCT TAC TAT GAT GTG GAC TAT GAA 877 lie Gin Gly Lys Asp Leu Leu lie Ala Tyr Tyr Asp Val Asp Tyr Glu
235 240 245
AAG GAC GCT AAA GGT TCC AAC TAC TGG AGA AAC AGG GTA ATG ATG GTG 925 Lys Asp Ala Lys Gly Ser Asn Tyr Trp Arg Asn Arg Val Met Met Val
250 255 260
GCA AAG AAA TTC CTG GAT GCT GGG CAC AAA CTC AAC TTT GCT GTA GCT 973 Ala Lys Lys Phe Leu Asp Ala Gly His Lys Leu Asn Phe Ala Val Ala
265 270 275
AGC CGC AAA ACC TTT AGC CAT GAA CTT TCT GAT TTT GGC TTG GAG AGC 1021 Ser Arg Lys Thr Phe Ser His Glu Leu Ser Asp Phe Gly Leu Glu Ser
280 285 290
ACT GCT GGA GAG ATT CCT GTT GTT GCT ATC AGG ACT GCT AAA GGA GAG 1069 Thr Ala Gly Glu lie Pro Val Val Ala He Arg Thr Ala Lys Gly Glu
295 300 305 310
AAG TTT GTC ATG CAG GAG GAG TTC TCG CGT GAT GGG AAG GCT CTG GAG 1117 Lys Phe Val Met Gin Glu Glu Phe Ser Arg Asp Gly Lys Ala Leu Glu
315 320 325
AGG TTC CTG CAG GGT TAC TTT GGT GGC AAT CTG AAG AGA TAC CTG AAG 1165 Arg Phe Leu Gin Gly Tyr Phe Gly Gly Asn Leu Lys Arg Tyr Leu Lys
330 335 340
TCT GAC CCT ATC CCA GAG AGC AAT GAT GGG CCT GTG AAG GTA GTG GTA 1213 Ser Asp Pro lie Pro Glu Ser Asn Asp Gly Pro Val Lys Val Val Val
345 350 355 GCA GAG AAT TTT GAT GAA ATA GTG AAT AAT GAA AAT AAA GAT GTG CTG 1261 A la Glu Asn Phe Asp Glu l ie Val Asn Asn G lu Asn Lys Asp Val Leu
360 365 370
ATT GAA TTT TAT GCC CCT TGG TGT GGT CAT TGT AAG AAC CTG GAG CCC 1309 I le G lu Phe Tyr A la Pro Trp Cys G ly Hi s Cys Lys Asn Leu G lu Pro
375 380 385 390
AAG TAT AAA GAA CTT GGC GAG AAG CTC AGC AAA GAC CCA AAT ATC GTC 1357 Lys Tyr Lys Glu Leu Gly G lu Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn I le Val
395 400 405
ATA GCC AAG ATG GAT GCC ACA GCC AAT GAT GTG CCT TCT CCA TAT GAA 1405 l i e Ala Lys Met Asp Ala Thr Ala Asn Asp Val Pro Ser Pro Tyr Glu
410 415 420
GTC AGA GGT TTT CCT ACC ATA TAC TTC TCT CCA GCC AAC AAG AAG CTA 1453 Val Arg G ly Phe Pro Thr l ie Tyr Phe Ser Pro Ala Asn Lys Lys Leu
425 430 435
AAT CCA AAG AAA TAT GAA GGT GGC CGT GAA TTA AGT GAT TTT ATT AGC 1501 Asn Pro Lys Lys Tyr G lu G ly G ly Arg G lu Leu Ser Asp Phe l ie Ser
440 445 450
TAT CTA CAA AGA GAA GCT ACA AAC CCC CCT GTA ATT CAA GAA GAA AAA 1549 Tyr Leu G in Arg G lu Ala Thr Asn Pro Pro Val l ie G in Glu G lu Lys
455 460 465 470
CCC AAG AAG AAG AAG AAG GCA CAG GAG GAT CTC TAAAGCAGTA GCCAAACACC 1602 P ro Lys Lys Lys Lys Lys A la Gin G lu Asp Leu
475 480
ACTTTGTAAA AGGACTCTTC CATCAGAGAT GGAAAACCAT TGGGGAGGGA CTAGGACCCA 1662 TATGGGAATT ATTACCTCTC AGGGCCGAGA GGACAGAATG GAAATAATCT GAATCCTGTT 1722 AAATTTTCTC TAAACTGTTT CTTAGCTGCA CTGTTTATGG AAATACCAGG AACCAGTTTA 1782 TGTTTGTGGT TTTGGGAAAA ATTATTTGTG TTGGGGGAAA TGTTGTGGGG GTGGGGTTGA 1842 GTTGGGGGAT ATTTTCTAAT TTTTTTTGTA CATTTGGAAC AGTGACCAAT AAATGAGACC 1902 CCTTTAAACT GTCAAAAAAA AAAAAAAAAA A 1933
E列番号： 2
配列の長さ ： 1 94 2
配列の型：核酸
鎖の数：ニ本鑌
トポロジー ：直線状
E列の種類： cDNA to mRNA
起源
生物名： ゥシ
K列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 84-1601
特徴を決定した方法： S
配列
GGGTACGTGG TTGCCGGCCC GGTCTCCGCA GTCCCCACCG AGCCCCGACC CTCCTGGCCG 60 CCCCCTCGCC TTACCTCGTC GCC ATG CGC CTC CGC CGC CTA GCG CTG TTC CCA 113
Met Arg Leu Arg Arg Leu Ala Leu Phe Pro
-20 - 15
GGC CTG GCG CTG CTC CTC GCC GCG GCC CGC CTC GCT GCT GCC TCC GAT ' 161 Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ala Ala Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ser Asp
-10 -5 1
GTG CTG GAA CTC ACG GAC GAC AAC TTC GAG AGT CGC ATC ACC GAC ACG 209 Val Leu Glu Leu Thr Asp Asp Asn Phe Glu Ser Arg lie Thr Asp Thr
5 10 15
GGC TCT TCT GGC CTC ATG CTC GTC GAG TTC TTC GCC CCC TGG TGT GGA 257 Gly Ser Ser Gly Leu Met Leu Val Glu Phe Phe Ala Pro Trp Cys Gly
20 25 30
CAC TGC AAA AAG CTT GCC CCA GAG TAT GAA GCT GCA GCT ACC AGA TTA 305 His Cys Lys Lys Leu Ala Pro Glu Tyr Glu Ala Ala Ala Thr Arg Leu
35 40 45 50
AAA GGA ATA GTC CCG TTA GCA AAG GTG GAT TGT ACT GCC AAC ACG AAC 353 Lys Gly lie Val Pro Leu Ala Lys Val Asp Cys Thr Ala Asn Thr Asn
55 60 65
ACC TGT AAT AAG TAT GGA GTG AGT GGA TAT CCA ACC CTG AAG ATA TTT 401 Thr Cys Asn Lys Tyr Gly Val Ser Cly Tyr Pro Thr Leu Lys lie Phe
70 75 80
AGA GAT GGT GAA GAA TCA GGT GCC TAT GAT GGG CCT AGG ACT GCC GAT 449 Arg Asp Gly Glu Glu Ser Gly Ala Tyr Asp Gly Pro Arg Thr Ala Asp
85 90 95
GGA ATT GTC AGC CAC CTG AAG AAA CAG GCT GGA CCA GCT TCA GTT CCT 497 Gly lie Val Ser His Leu Lys Lys Gin Ala Gly Pro Ala Ser Val Pro
100 105 110
CTC AAG TCT GAG GAA GAA TTT GAA AAG TTC ATT AGC GAT AAA GAT GCT 545 Leu Lys Ser Glu Glu Glu Phe Glu Lys Phe lie Ser Asp Lys Asp Ala
115 120 125 130
TCT GTG GTG GGT TTT TTC AAG GAT TTA TTC AGT GAA GCT CAC TCT GAG 593 Ser Val Val Gly Phe Phe Lys Asp Leu Phe Ser Glu Ala His Ser Glu
135 140 145
TTT CTA AAA GCA GCC AGC AAC TTG AGG GAT AAC TAC CGG TTT GCA CAC 641 Phe Leu Lys Ala Ala Ser Asn Leu Arg Asp Asn Tyr Arg Phe Ala His
150 155 160
ACC AAT GTT GAA TCT CTG GTG AAC AAA TAC GAT GAC GAT GGA GAG GGT 689 Thr Asn Val Glu Ser Leu Val Asn Lys Tyr Asp Asp Asp Gly Glu Gly
165 170 175
ATC ACC TTG TTT CGT CCT TCC CAT CTG ACG AAC AAG TTT GAA GAC AAG 737 He Thr Leu Phe Arg Pro Ser His Leu Thr Asn Lys Phe Glu Asp Lys
180 185 190 ACT GTG GCA TAT ACA GAA CAG AAA ATG ACC AGT GGG AAG ATT AAA AGA 785
Thr Val Ala Tyr Thr Glu Gin Lys Met Thr Ser Gly Lys lie Lys Arg
195 200 205 210
TTT ATT CAG GAA AAC ATT TTT GGT ATC TGC CCT CAC ATG ACA GAA GAC 833
Phe lie Gin Glu Asn He Phe Gly lie Cys Pro His Met Thr Glu Asp
215 220 225
AAT AAA GAT TTA CTA CAG GGC AAG GAT TTA CTC ATC GCT TAC TAT GAT 881 Asn Lys Asp Leu Leu Gin Gly Lys Asp Leu Leu lie Ala Tyr Tyr Asp
230 235 240
GTG GAC TAT GAA AAG AAT GCT AAA GGT TCC AAC TAC TGG AGA AAC AGA 929 Val Asp Tyr Glu Lys Asn Ala Lys Gly Ser Asn Tyr Trp Arg Asn Arg
245 250 255
GTA ATG ATG GTG GCA AAG AAA TTC CTG GAT GCT GGG CAG AAA CTC CAT 977 Val Met Met Val Ala Lys Lys Phe Leu Asp Ala Gly Gin Lys Leu His
260 265 270
TTT GCT GTA GCT AGC CGT AAA ACC TTT AGC CAT GAA CTT TCA GAT TTT 1025 Phe Ala Val Ala Ser Arg Lys Thr Phe Ser His Glu Leu Ser Asp Phe
275 280 285 290
GGC TTG GAA AGC ACT ACT GGA GAG ATT CCT GTT GTT GCT GTC AGA ACC 1073 Gly Leu Glu Ser Thr Thr Gly Glu lie Pro Val Val Ala Val Arg Thr
295 300 305
GCA AAA GGA GAG AAG TTT GTC ATG CAG GAG GAG TTC TCG CGT GAT GGC 1121 Ala Lys Gly Glu Lys Phe Val Met Gin Glu Glu Phe Ser Arg Asp Gly
310 315 320
AAG GCT CTT GAG AGA TTC CTG GAG GAT TAC TTT GAC GGC AAC CTG AAG 1169 Lys Ala Leu Glu Arg Phe Leu Glu Asp Tyr Phe Asp Gly Asn Leu Lys
325 330 335
AGA TAC CTG AAG TCT GAG CCT ATC CCT GAG AGC AAT GAT GGG CCT GTA 1217 Arg Tyr Leu Lys Ser Glu Pro lie Pro Glu Ser Asn Asp Gly Pro Val 340 345 350
AAG GTA GTG GTA GCA GAG AAT TTT GAT GAA ATA GTG AAT AAT GAA AAT 1265 Lys Val Val Val A la Glu Asn Phe Asp Glu l ie Val Asn Asn G lu Asn
355 360 365 370
AAA GAT GTG CTG ATT GAG TTT TAT GCT CCT TGG TGT GGT CAC TGT AAG 1313 Lys Asp Val Leu l ie Glu Phe Tyr A la Pro Trp Cys G ly Hi s Cys Lys
375 380 385
AAT CTG GAG CCT AAG TAT AAA GAA CTG GGA GAG AAG CTC AGA AAA GAT 1361 Asn Leu G lu Pro Lys Tyr Lys Glu Leu Gly G l u Lys Leu Arg Lys Asp
390 395 400
CCA AAT ATT GTC ATA GCC AAG ATG GAT GCT ACA GCC AAC GAT GTG CCT 1409 Pro Asn l ie Val I le Ala Lys Met Asp Ala Thr Ala Asn Asp Val Pro
405 410 415
TCT CCA TAT GAA GTC AGA GGT TTT CCT ACC ATC TAC TTC TCT CCA GCC 1457 Ser Pro Tyr Glu Val Arg G ly Phe Pro Thr I le Tyr Phe Ser Pro Ala
420 425 430
AAC AAG AAG CAA AAT CCA AAG AAA TAT GAA GGT GGC CGT GAA TTA AGT 1505 Asn Lys Lys Gin Asn Pro Lys Lys Tyr Glu G ly G ly Arg Glu Leu Ser
435 440 445 450
GAT TTT ATT AGC TAT CTA AAG CGA GAG GCT ACA AAC CCC CCT GTA ATT 1553 Asp Phe l ie Ser Tyr Leu Lys Arg G lu A la Thr Asn Pro Pro Val I le
455 460 465
CAA GAA GAA AAA CCC AAG AAG AAG AAG AAG GCA CAG GAG GAT CTC 1598 G in Glu G lu Lys Pro Lys Lys Lys Lys Lys A la Gin G lu Asp Leu
470 475 480
TAAAGCAGCA GCCAAACATC ATATACTTTG TCAAAGGACT TTTCCACCAG AGATGGGAAA 1658 ACCAATGGGG AGGACTGGGA CCCGTATGGG AATTACTGCC TCTCAGGGCT GAGAGGGCAG 1718 AATGGTTATA ATCTGAGTCC TGTTAAATTT TCTCTAAACT GTTTCTTAGC TGCACTGTTT 1778 ATGAAAATAC CAGAACCAGT TTATGTTTGT GGTTTTGGGA AAATTATTTG TGTTGAGGGG 1838 AATGTTGTGG GGGTGGGGGG AATTGAGTTG GGGGGTTATT TTCTAATTTT TTTTGTACAT 1898 TTGGAACAGT GACAATAAAT GCGCCCCCTT TAAAAAAAAA AAAA 1942

Claims

請求の範囲
1. E列表の E列番号 1 の 1位の Serから 481位の Leuまでの ァ ミ ノ酸 E列を含むヒ ト ホスホ リパーゼ C- α ポ リ ぺプチ ド。
2. Ε列表の配列番号 1 の- 24位の Metから 481位の Leuまで の E列を含む、 請求項 1 に記載のポ リ ペプチ ド。
3. 請求項 1 または 2 に記載のポ リ べプチ ドをコ一 ドする DNA配列。
4. 請求項 3 に記載の D N ΑΒΞ列を有する発現ベク ター。
5. 請求項 4 に記載の発現ベクターを宿主に導入して得ら れる形質転換体。
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