WO1994028121A1 - Animal non-humain transgenique exprimant une transferrine d'origine humaine - Google Patents

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WO1994028121A1
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Eric Jacobs
Michèle LEGRAIN-JACOBS
Manfred Theisen
Marie-Josée QUENTIN-MILLET
Bernard Danve
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Transgene S.A.
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    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Definitions

  • the present invention relates to a non-human transgenic animal, and more particularly to a transgenic mouse, as an animal model for evaluating or selecting potential drugs intended for the prevention and treatment of infections induced by pathogenic organisms which have developed a receptor system. specific for human transferrin to capture the iron necessary for their growth in the infected host.
  • Tf Transferrin family
  • Transferrin is encoded by a single gene. Numerous studies, both in vitro and in vivo, have established the complexity of the regulation of this gene. Transgenic mice into which have been injected chimeric genes resulting from the fusion of the promoter region of a transferrin gene and a reporter gene whose expression product is easily measurable, have made it possible to highlight a multitude of elements controlling positively and negatively, tissue-specific expression and regulation of this gene. These elements make it possible to modulate the level of transcription of the transferrin gene in response to various stimuli, such as the plasma concentration of iron and certain hormones (Idzerza et al., Molecular and Cellular Biol., 1989, 9, 5154-5162; Adrian et al ., J. Biol. Chem., 1990, 265, 13340-13350).
  • Transferrin is mainly synthesized in the liver, then secreted into the bloodstream. Transferrin is a glycoprotein formed from two globular domains which each have a ferric iron binding site. Thus, we can highlight in the bloodstream, different types of transferrin according to their iron load. We can detect:
  • iron-free transferrin also called apotransferrin.
  • transferrin can transfer iron to cellular proteins that specifically bind iron. Among other things, they depend on the cell type into which the transfer takes place and physiological conditions. A particularly effective mechanism uses a specific transferrin receptor.
  • This receptor is present on the surface of certain types of cells. It has a strong affinity for diferric transferrin and progressively weaker affinities for monoferric transferrins and apotransferrin respectively. After binding to the iron-loaded transferrin receptor, the complex is internalized and passes into endosomes. The acidification of endosomes contributes to the dissociation of iron and transferrin. The process of transferring iron to cellular proteins is unknown. Microorganisms, like higher eukaryotic cells, need iron for their growth. In general, they have developed various systems that allow them to capture iron in the outside environment. Thus, most microorganisms produce siderophores for this purpose.
  • microorganisms do not produce siderophores but express on their surface a specific transferrin receptor which allows them to divert and acquire the iron linked to transferrin.
  • specific receptors for human transferrin have been demonstrated in a number of human pathogenic micro ⁇ organisms. Mention may in particular be made of the pathogenic bacteria Neisseria meningiti ⁇ s, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumo iae, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis and Bordetella pertussis or the pathogenic protozoa of the genera Trypanosoma cruzi, Leishmania and Plasmodium.
  • microorganisms are all human pathogens responsible for serious diseases, such as meningitis often fatal in children, pneumonia, sexually transmitted genital tract infections representing one of the major causes of sterility in women, whooping cough and diseases such as leishmaniasis and malaria which affect millions of people in tropical and subtropical regions.
  • Neisseria meningitidis There is already a mouse model that can be infected with Neisseria meningitidis (Holbein, Infect. Immun., 1981, 34, 120-125; Schryvers and Gonzales, Infect. Immun., 1989, 57, 2425-2429).
  • a mouse is first administered with iron complexed with human transferrin (Fe-Tf).
  • Fe-Tf human transferrin
  • CFU colony forming unit
  • the bacteria are cultivated under iron deficiency conditions, these conditions induce the expression of specific receptors for human transferrin on the surface of the bacteria.
  • bacterial receptors are specific for human transferrin.
  • Neisseria meningitidis cannot capture iron bound to endogenous mouse transferrin since its receptors cannot bind mouse transferrin.
  • Holbein reports that mortality directly depends on the amount of human Fe-Tf administered. Under its experimental conditions, it obtains a 100% mortality starting from 17.5 mg of Fe-Tf administered intraperitoneally (IP).
  • IP intraperitoneally
  • Schryvers and Gonzales recommend administration of 24mg of Fe-Tf prior to the bacterial test.
  • the transgenic animals of the present invention can produce a level of transferrin of human origin close to the physiological concentration in humans (around 1 to 2 mg / ml), which makes it possible to develop a model. reproducing the physiological conditions compared to the models of the prior art, which imply an administration of Fe-Tf at significantly higher concentrations, of the order of 10 times.
  • the subject of the invention is a non-human transgenic animal into the genome of which is inserted a DNA fragment coding for a transferrin of human origin, in particular a precursor of a transferrin of human origin, placed under the control of the elements necessary for its expression.
  • control elements useful for the purposes of the present invention contain a liver-specific promoter region, that is to say capable of effectively promoting the expression of a fragment of DNA in a limited number of cell types, essentially including liver cells.
  • a liver-specific promoter mention may in particular be made of the promoter of the ⁇ 1-antitrypsin gene or that of the transferrin gene.
  • transgenic animal In order to use a transgenic animal according to the invention, it is particularly advantageous to choose a promoter region derived from the genus or species of animal which it is desired to obtain in transgenic form.
  • a transgenic mouse will be produced using the promoter region of a murine gene, preferably of a mouse gene and in particular the liver-specific promoter of the mouse transferrin gene.
  • the DNA fragment coding for a precursor of a transferrin of human origin can be: Of genomic type, such as for example described by Schaeffer et al. (Gene, 1987, 56, 109-116) (17 exons separated by 16 introns); it can also be a similar fragment, modified at the intron level, for example comprising a partial deletion of one or more of the 16 introns;
  • cDNA Complementary DNA type
  • the DNA fragment of the minigene type comprises the first exon, the first intron and the following exons (2 nd to 17 th ) in the form of cDNA.
  • the DNA fragment is integrated into the genome of a transgenic animal according to the invention, outside the homologous gene coding for transferrin.
  • the precursor for which a DNA fragment useful for the purposes of the present invention must code essentially comprises a transferrin of human origin, in mature form, and a signal peptide attached by peptide bond to the NH 2 end of the transferrin.
  • a signal peptide generally comprises a mainly hydrophobic amino acid sequence and has the function of promoting the secretion in the blood of transferrin in mature form. Once its function has been fulfilled, the signal peptide is eliminated by cleavage.
  • any signal peptide can be used; however, the homologous signal peptide encoded by the human transferrin gene is preferably used.
  • transferrin of human origin a protein having the following characteristics:
  • the DNA fragment codes for a precursor of human transferrin, the amino acid sequence of which is as shown in the sequence identifier SEQ ID N0: 1, from the methionine residue in position 1 to the proline residue in position 698.
  • a transferrin of human origin is preferably capable of being recognized by antibodies specific for human transferrin. This can be demonstrated according to immunological detection methods known to those skilled in the art, which can be implemented with polyclonal or monoclonal antibodies originating from various species and directed against various antigenic determinants of human transferrin. As an indication, a detailed description of a particular operating mode of an ELISA test is provided below (see
  • Example 2 This ELISA technique may in particular be used to evaluate the serum concentration of transferrin of human origin in the transgenic animals according to the invention.
  • a transgenic animal according to the invention expresses a transferrin of human origin at a serum level of between 0.1 and 5 mg / ml, advantageously 0.2 and 4 mg / ml and preferably 0.3 and 3 mg / ml.
  • transgenic animal according to the invention is preferably a non-human mammal, more particularly a rodent, in particular a murine and preferably a mouse.
  • transgenic animal according to the invention is meant an animal which is transgenic for a DNA fragment coding for a precursor of a transferrin of human origin.
  • a transgenic animal according to the invention can be a complete transgenic (the DNA fragment coding for a precursor of a transferrin of human origin is integrated into the genome of all the cells, somatic and germinal, of said animal; this is by example the case when the DNA fragment is introduced into an embryo at the "cell” stage) or mosaic (the DNA fragment is integrated into the genome of a certain percentage of cells, but not in all; the percentage will depend the number of cells constituting the embryo at the time of the introduction of the DNA fragment).
  • a DNA fragment coding for a precursor of a transferrin of human origin is introduced into a non-human embryo, in order to obtain a transgenic embryo,
  • transgenic embryo is transplanted into a pseudo-pregnant female animal
  • said embryo is allowed to develop to completion
  • a simple transgenic male animal and a simple transgenic female animal are crossed, each obtained by the first process according to the invention, and at least one double transgenic descendant is selected in the genome of which two alleles of the DNA fragment coding for a precursor of a transferrin of human origin are integrated.
  • the first and second methods according to the invention apply to the preparation of murins, more particularly of mice, respectively single and double transgenic.
  • the introduction of the DNA fragment into an embryo as well as the implantation of the transgenic embryo in a pseudo-pregnant female can be implemented according to the methods conventionally in use.
  • a DNA fragment is introduced into embryonic cells maintained in culture or into an embryo preferably comprising 1 to 8 cells, advantageously 1 to 4 cells and preferably 1 cell.
  • One method consists in transfecting the cells or the embryo with a recombinant virus, in particular a recombinant retrovirus, into the genome of which the DNA fragment is inserted.
  • the DNA fragment is injected as it is into the embryo.
  • a transgenic animal according to the invention can also be a descendant of an animal directly obtained by one of the methods described above.
  • a transgenic animal according to the invention includes the founding animal (F 0 ) of a transgenic line as well as the descendants of the first generation founder (F j ) and of the following generations (F 2 and following) .
  • the descendants can be obtained by crossing a transgenic animal according to the invention with an animal of the same non-transgenic species.
  • approximately half of the animals resulting from this crossing will include an allele of the DNA fragment in all their germinal and somatic cells, and consequently are heterozygous.
  • the descendants can also be obtained by crossing with another transgenic animal according to the invention, of an identical or different line.
  • Such a cross gives about 25% double animals transgenic having two alleles of the DNA fragment.
  • the level of expression of the product encoded by the DNA fragment in double transgenic animals is expected to be higher than that seen in single transgenics.
  • the two alleles can be present at the same locus (double homozygous transgenic resulting from the crossing of two transgenic animals of the same line). They can also be located in different loci of the genome corresponding to the sites of integration of the DNA fragment in each of the parents (double transgenic heterozygote resulting from the crossing of two transgenic animals of different lines).
  • a double transgenic animal such as, for example, derived from the second method according to the invention, can in particular be identified by the conventional techniques of genetic engineering known to those skilled in the art, for example the Southern technique or by "back crossing". ".
  • Such a cross between a homozygous double transgenic animal and a non-transgenic animal must give rise to 100% single transgenic animals in the genome of which is integrated an allele of the DNA fragment.
  • an animal according to the invention can therefore be single, double or multi-transgenic for the DNA fragment coding for a precursor of a transferrin of human origin.
  • An animal according to the invention is advantageously a double transgenic, preferably homozygous.
  • transgenic animal (i) The use of a transgenic animal according to the invention, as an animal model for evaluating or selecting a potential drug intended for the prevention or treatment of an infection induced by a pathogenic organism having a receptor capable of fixing a transferrin of human origin;
  • step b) the evolution of the infection is measured for a period of at least 24 hours after step a) in order to assess the activity and possibly select the drug giving the best results.
  • the invention also relates to the drugs used by the above method.
  • a potential drug can be a substance of any kind, chemical or biological, such as an antibody or a vaccine agent; it can also be a mixture of substances.
  • a pathogenic organism possessing a receptor capable of fixing a transferrin of human origin can be a pathogenic bacterium such as Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis and Bordetella pertussis or a pathogenic protozoan of the genus Trypanosoma cruzi, Leishmania Plasmodium.
  • a pathogenic organism of choice is Neisseria meningitidis.
  • the potential drug can be administered to the animal in a single or repeated dose, several times after a certain interval; by any route of administration commonly used; beforehand, concomitantly or after the test stage by the pathogenic organism.
  • an agent used for preventive purposes in particular a vaccine agent
  • the latter will be administered prior to the administration of the pathogenic microorganism.
  • the drug will be administered before, concomitantly or after the trial stage.
  • the test step is carried out by administering an appropriate and previously determined amount of a pathogenic organism, most often in a single dose and by any route of administration commonly used. However, the subcutaneous or intraperitoneal route is preferred.
  • the amount to administer must be sufficient to trigger in a control animal (no prior administration of medication), a pathogenic condition which can be signaled in different ways (spiky hair, reduced mobility, prostration, death); it depends on various factors such as the animal species or the pathogenic organism. It can be determined according to the general practices of a person skilled in the art. In the case of a bacterial infection, one will seek for example, the minimum dose which induces a significant bacteremia.
  • a transgenic mouse should be administered, intraperitoneally, a suspension of Neisseria meningitidis titrating from 1.10 5 to 1.10 8 CFU, advantageously from 1.10 6 to 5.10 7 CFU and preferably about 1.10 7 CFU.
  • This suspension will preferably be obtained by culture of the bacteria in an iron deficiency medium.
  • a method according to the invention can also include an optional step, called "overload step”.
  • the animal is then administered a reduced amount of human transferrin loaded with iron (Fe-Tf) before or concomitantly at the testing stage.
  • Fe-Tf human transferrin loaded with iron
  • This administration can take place in a single dose or repeated several times and can be done by any route of administration commonly used, preferably by intraperitoneal or intravenous route.
  • the amount of Fe-Tf which is administered is from 0.5 to 6 mg, advantageously from 0.6 to 5 mg and preferably from 1 to 4 mg.
  • a method according to the invention intended for the evaluation of a bacterial vaccine agent can for example be implemented within the framework of the experiment described below in general terms.
  • Transgenic animals according to the invention are divided into several test lots. Each animal in the same batch receives a determined dose of the vaccine agent to be tested. The dose varies depending on the batch. A positive control batch is formed in parallel; transgenic animals in this batch do not receive the vaccine to be tested.
  • a negative control batch can be formed with animals of the same non-transgenic species which do not receive the vaccine agent to be tested. About 15 to 20 days later, the animals of all the batches receive a determined dose of the bacteria. The absence of infection or its progression is recorded according to various parameters such as bacteremia and the physiological state of the animals.
  • the vaccine agent is considered to be protective when the bacteremia measured in the transgenic animals of the test batches is significantly reduced compared to that measured in the transgenic animals of the positive control batch; or when the physiological condition of the animals in the test batches is significantly improved (manifested for example by a reduced percentage of mortality) compared to that of the animals in the positive control batch.
  • bacteremia is considered high when it is at least a factor of 100, 1000 or 10 000 higher than that observed in the negative control batch; this under strictly parallel measurement conditions.
  • Figure 1 schematically represents the construction of the DNA fragment coding for the precursor of human transferrin, specifying the restriction sites used in the cloning steps; the promoter region of the murine transferrin gene (mTf pro) is indicated by dotted lines; exon 1 of the human transferrin gene is represented by a shaded area; intron 1 by a grid area; the cDNA part by a white box; and the termination region of the transcription of SV40 by a black box. The location of the sequences corresponding to the oligonucleotides used during the construction steps is indicated.
  • EXAMPLE 1 Preparation of the plasmid pTG2728 comprising a minigene coding for the precursor of human transferrin
  • the example relates to the construction of a plasmid comprising a minigene coding for the precursor of human transferrin (hTf) placed under the control of the promoter of the murine transferrin gene (mTf).
  • hTf human transferrin
  • mTf murine transferrin gene
  • the promoter part is isolated from the plasmid -3kb mTf-hGH (Idzerda et al., Mol.
  • the cDNA region comes from the plasmid Tf23 (Parle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 3149-3153). All the cloning steps using bacterial plasmids are carried out by passage through the Escherichia coli (E. coli) 5K strain, while those which use vectors derived from phage Ml 3 are carried out by passage through E. coli NM522.
  • a BglU site is created upstream of the ATG initiator of the hTf gene by site-directed mutagenesis. Mutagenesis is carried out by PCR using the mutagenic oligonucleotide OTG3320, the sequence of which is given in SEQ ID NO: 2.
  • the vector M13TG1779 is used as template. The latter comes from the cloning of the 1.1 kb Bam ⁇ l genomic fragment isolated from p7.3 kb AT (comprising exon 1, intron 1, exon 2 and the 5 'part of intron 2 of the hTf gene. ) in the Bam ⁇ l site of M13mpl9 (Gibco BRL).
  • Mutagenesis implements a reverse primer, complementary to a sequence of the vector M13mpl9 and close to the cloning site.
  • the reverse primer designated OTG3321 is described in SEQ ID NO: 3. 30 amplification cycles are carried out.
  • the fragment generated is checked on agarose gel and digested with the enzymes BgRl and Bam ⁇ I. The latter is inserted between the same sites of the vector polyI + p (Lathe et al., Gene, 1987, 57, 193-201) generating the vector pTG2715. The sequence of the BglU-Bam ⁇ l fragment is verified.
  • the vector -3kb mTf-hGH which comprises the promoter region of the mTf gene is digested with EcoRI and then treated with Klenow polymerase in order to generate blunt ends. H is then digested with Bamim.
  • the generated fragment comprising 3kb of promoter region of the mTf gene, and the BglR-Ec ⁇ KV fragment isolated from pTG2715 are integrated between the HindIH site treated with Klenow polymerase and the EcoRV site from pTG5919. This insertion destroys the BglR and BarnirU sites which have compatible ends. This results in the vector pTG2723.
  • the plasmid pTG5919 results from the insertion of the Bgl ⁇ fragment. 0.15 kb comprising the SV40 virus transcription termination sequence (Simian virus 40), in the Bam ⁇ l site of p polyi ⁇ I * (Lathe et al., supra).
  • This plasmid is derived from pTG173 (described in European application 298 807) and comprises in particular the SV40 termination sequence but is distinguished from pTG173 at the level of the restriction sites which surround said sequence: 5 'a BglR site and 3 Sali, Pstl and Bg ⁇ sites Any other plasmid having the same termination sequence and adequate restriction sites could be used.
  • a fragment extending from codon 25 to the Bam ⁇ l site covering codons 90 and 91 (codon +1 represents the first amino acid of mature human transferrin) is generated by chemical synthesis.
  • the 6 oligonucleotides used OTG3336 to 3341 are reported in S ⁇ Q ID NO: 4 to 9.
  • the oligonucleotide of S ⁇ Q ID NO: 4 contains upstream an Ht “dL ⁇ site to facilitate cloning of the synthetic fragment.
  • the synthetic fragment Htwdffl-itormHI thus formed is subcloned into the vector M13mpl9 giving the vector M13TG1787 and its sequence is verified.
  • the cDNA sequence downstream of the BamHS site. comes from the clone Tf23.
  • the latter includes the coding region of human transferrin from codon 98 and a 3 ′ non-coding sequence of 138 bp.
  • the sequences between the Bam ⁇ l site and codon 98 are added by PCR.
  • the PCR reaction implements the primer OTG3343 reported in S ⁇ Q ID
  • the BamlH-Ndel fragment isolated from p7.3kb AT (comprising the 3 'part of intron 1 and the 5' part of exon 2) as well as the Ndel-Ec ⁇ Rl fragment isolated from M13TG2713 are inserted into the digested vector pTG2723 by Bam ⁇ l and EcoRI. This results in the plasmid pTG2726.
  • the cDNA sequence coding for human transferrin is completed by inserting the EcoRI fragment isolated from Tf23 into the vector pTG2726.
  • the resulting vector with the correct orientation of the EcoRI fragment is designated pTG2728.
  • EXAMPLE 2 Transgenic mice expressing human transferrin.
  • the plasmid pTG2728 is purified on a cesium chloride gradient and digested with NotI so as to obtain a DNA fragment comprising a minigene coding for the hTf precursor under the control of 3kb of the promoter region of the mTf gene.
  • the NotI fragment is purified on sucrose gradient and injected into the male pronucleus of a fertilized egg of 2 nd generation hybrid mice resulting from the crossing of a C57 / B16 female mouse with an SJL male according to the technique known to those skilled in the art. Each egg is then reimplanted in the uterus of a mouse so that gestation is continued.
  • the AD ⁇ of the tail tissues of newborns is isolated so as to verify the integration of the transgene into the genome of the animal by Southern analysis (Southern, E, J. Mol. Biol., 1975, 98, 503 ).
  • the genomic AD ⁇ thus obtained is digested with the EcoRI enzyme and the digestion mixture is separated on 1% agarose gel. After transfer to the Hybond ⁇ + membrane (Amersham), the DNA is hybridized using an appropriate probe specific for the hTf gene labeled with the 3 p isotope.
  • the probe consists of the 2to / wHI-EcoRI fragment of 0.6 kb isolated from M13TG2713. Under the stringency conditions conventionally used, no cross hybridization with the endogenous mouse transferrin gene is observed.
  • Transgenic lines are established from 7 founders. Heterozygous descendants are generated by crossing each of the founders with non-transgenic C57 / B16 x SJL hybrid mice. Transmission to descendants is also verified by Southern. The number of copies of the transgene is stable from generation to generation, and no rearrangements are detected.
  • Blood is taken from the mice positive for the hybridization test and the level of expression of human transferrin in the serum is determined by the ELISA method described below.
  • a polyclonal goat anti-human transferrin antibody (Sigma, reference T-6265) previously diluted 100 times in a PBS buffer (Na 2 HPO 4 0.008M, KH2PO4 0.002M, 0.15M NaCl, pH 7.2), are placed at the bottom of each well of a 96-well microtiter plate (Nunc) and incubated at 4 ° C for 16 h.
  • the non-adsorbed antibodies are removed by extensive washing with a PBS buffer comprising 0.2% of Tween 80.
  • the wells are saturated by addition of 50 ⁇ l of 2% BSA dissolved in PBS buffer.
  • the peroxidase enzymatic activity is revealed by adding 100 ⁇ l of the following preparation (Na 2 HPO 4 0.066M, C 6 H 8 O 7 0.035M, pH5, 0.04% of orthophenylendiami ⁇ e and 0.014% hydrogen peroxide).
  • the reaction is stopped by adding 150 ⁇ l of a H 2 S ⁇ 4 1M solution. The absorbance is measured at 490nm.
  • the quantity of transferrin of human origin contained in the serum of transgenic animals is established according to a calibration range prepared as follows: a purified solution of human transferrin (Sigma, reference T-3400) prepared at a concentration of 5 ⁇ 10 " 5 mg / ml is diluted 2 in 2 in PBS buffer. The absorbance is measured for each of the dilutions and the calibration curve is established (ng of human transferrin as a function of the absorbance).
  • the procedure described above makes it possible to detect up to 1 ng of human transferrin.
  • the test is specific for human transferrin and does not show cross-reaction with mouse transferrin.
  • the level of expression of the founding animals varies on average and according to the lines between 0.16 and 0.40 mg / ml. In general, the expression is slightly increased in first generation animals ( ⁇ ) and reaches 0.40 to 0.75 mg / ml, reflecting the mosaic of the founders. Then for the lines for which the descendants of 2nd generation (F 2) are generated, the expression level is relatively stable with the exception of a line.
  • Homozygous mice are generated by crossing brothers and sisters from the same transgenic line. The homozygous animals are determined by quantitative Southern blot carried out on the tail tissues taken from the descendants of said cross. In addition, homozygotes are confirmed by "return" crossing with non-transgenic hybrid mice, which must give 100% of single transgenic descendants. Homozygous mice were generated from different lines. Homozygotes from line 13 have a level of expression of human transferrin increased by a factor close to 2 compared to that of single parent transgenics. Homozygous mice of line 13 produce approximately 1 mg / ml of human transferrin (the serum concentration measured in 4 animals varies from 0.92 to 1.2 mg / ml).
  • EXAMPLE 3 Use of transgenic mice as an animal model for the infection of Neisseria meningitidis.
  • the Neisseria meningitidis B16B6 strain is used as a test strain.
  • the bacteria are cultivated on a Mueller-Hinton agar plate for 16 hours at 37 ° C. under 10% CO. Then a culture is carried out in a liquid medium by suspending colonies previously obtained in a BMH medium (Mueller-Hinton broth) pH 6.6, EDDA (Ethylenediamine-di O-hydroxyphenyl-acetic acid, Sigma) 30 ⁇ M at an OD6go (optical density measured at 680 nm) of approximately 0.2.
  • the bacteria are thus cultivated under iron deficiency conditions for 4 hours at 37 ° C. with stirring.
  • the absorbance at 680nm is precisely measured. It is generally around 1.
  • the suspension is adjusted to a concentration of 2.10 7 CFU / ml, knowing that a germ suspension at 1.10 9 corresponds to an optical density measured at 680 nm of 0.5.
  • the suspension is prepared in a ⁇ TTG medium [buffered physiological water (Aguettant), Tryptone l% o (DIFCO) and gelatin l% o (Bio-Mérieux)].
  • the equivalence between absorbance and number of CFUs is verified by counting on agar medium.
  • the virulence of the strain is checked at each experiment. This control is carried out on groups of 8 female CD ⁇ mice (Charles River) 8 weeks old and pretreated with Fe-Tf. These mice are administered by the IP route 0.5 ml of an iron-saturated solution of human transferrin at 48 mg / ml (Intergen, ref 4455-00, holoform, purity approximately 98%) a few minutes before the bacterial test. Then 0.5 ml of progressive doses of reason 10 of the bacterial suspension (generally from 1.10 3 to 1.10 7 CFU / mouse) are injected by the IP route. Lethality is recorded during the following 5 days.
  • the lethal dose 50 (LD50) of the bacterial suspension is determined, that is to say the dose of bacteria at which 50% of the animals thus treated die.
  • the LD50 of the Neisseria meningitidis B16B6 strain is around 5.10 CFU.
  • mice are divided into different groups:
  • mice which are administered a few minutes before the bacterial test and IP 24 mg of Fe-Tf (as indicated in the previous paragraph).
  • This group which comprises approximately 5 mice corresponds to the model disclosed in the prior art and constitutes the positive control of infection, and (3) transgenic mice which express a serum concentration of hTfde O, 3 to O, 6 mg / ml.
  • 0.5 ml of the bacterial suspension are administered to all the mice, or approximately 1.10 7 CFU / ml.
  • Blood samples are taken from the retro orbital sinus at regular time intervals. The sample is immediately diluted 1/10 in ⁇ TTG medium and progressive dilutions of reason 10 are then made in the same diluent. The number of bacteria is evaluated by depositing for each dilution 4 drops of 25 ⁇ l on supplemented Mueller-Hinton agar. After incubation overnight at 37 ° C under 10% CO2, the colonies are counted. The results are expressed as the average number of CFUs per ml of blood. On the other hand, the physiological state of the animals is recorded during the 5 days following the bacterial test.
  • a transient bacteremia is measured less than the number of CFU injected, which rapidly decreases with time.
  • the infection generally results in the death of animals in less than 48 hours.
  • ORGANISM synthetic oligonucleotide OTG3320
  • ORGANISM Synthetic oligonucleotide OTG3321
  • ORGANISM Synthetic oligonucleotide OTG3337
  • ORGANISM Synthetic oligonucleotide OTG3338
  • ORGANISM Synthetic oligonucleotide OTG3339
  • ORGANISM Synthetic oligonucleotide OTG3340

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Abstract

La présente invention concerne un animal transgénique dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN codant pour une transferrine d'origine humaine, notamment un précurseur d'une transferrine d'origine humaine, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression et son procédé de préparation. L'invention a également pour objet l'usage d'un tel animal transgénique à titre de modèle animal pour évaluer ou sélectionner un médicament potentiel destiné au traitement ou à la prévention d'une infection induite par un organisme pathogène possédant un récepteur capable de fixer une transferrine d'origine humaine.

Description

ANIMAL NON-HUMAIN TRANSGENIQUE EXPRIMANT UNE TRANSFERRINE D'ORIGINE HUMAINE
La présente invention concerne un animal transgénique non-humain, et plus particulièrement une souris transgénique, en tant que modèle animal pour évaluer ou sélectionner des médicaments potentiels destinés à la prévention et au traitement des infections induites par des organismes pathogènes ayant développé un système de récepteurs spécifiques de la transferrine humaine pour capturer le fer nécessaire à leur croissance dans l'hôte infecté.
Les protéines appartenant à la famille des transferrines (Tf) jouent un rôle essentiel dans le métabolisme du fer. Elles interviennent dans l'absorption du fer, son transport et sa redistribution dans les différentes cellules et protéines d'un organisme. Le fer est un des métaux les plus abondants chez les eucaryotes et il est nécessaire à la croissance cellulaire. Certaines protéines essentielles à la vie d'un organisme lient spécifiquement un ou plusieurs atomes de fer et cette liaison est nécessaire à leur fonction. C'est le cas notamment de l'hémoglobine. L'ensemble du fer plasmatique est virtuellement transporté par son transporteur plasmatique, la transferrine.
La transferrine est codée par un gène unique. De nombreuses études tant in vitro qu'in vivo, ont établi la complexité de la régulation de ce gène. Des souris transgéniques dans lesquelles ont été injectés des gènes chimériques issus de la fusion de la région promotrice d'un gène de la transferrine et d'un gène reporteur dont le produit d'expression est facilement mesurable, ont permis de mettre en évidence une multitude d'éléments contrôlant de manière positive et négative, l'expression tissu-spécifique et la régulation de ce gène. Ces éléments permettent de moduler le niveau de transcription du gène transferrine en réponse à divers stimuli, comme la concentration plasmatique en fer et certaines hormones (Idzerza et al., Molecular and Cellular Biol., 1989, 9, 5154-5162 ; Adrian et al., J. Biol. Chem., 1990, 265, 13340-13350).
La transferrine humaine est synthétisée majoritairement dans le foie, puis sécrétée dans la circulation sanguine. La transferrine est une glycoprotéine formée de deux domaines globulaires qui possèdent chacun un site de liaison au fer ferrique. Ainsi, on peut mettre en évidence dans la circulation sanguine, différents types de transferrine selon leur charge en fer. On peut détecter :
- la transferrine sous forme diferrique dont chacun des domaines a lié un atome de fer,
- la transferrine monoferrique dont l'un des domaines, soit le domaine N- terminal soit le C-terminal, a lié un atome de fer, et
la transferrine dépourvue de fer, encore appelée apotransferrine.
On suppose qu'il existe différents mécanismes par lesquels la transferrine peut transférer le fer aux protéines cellulaires liant spécifiquement le fer. Ils dépendent entre autre du type cellulaire dans lequel le transfert a lieu et des conditions physiologiques. Un mécanisme particulièrement efficace, met en oeuvre un récepteur spécifique de la transferrine.
Ce récepteur est présent à la surface de certains types de cellules. Il présente une forte affinité pour la transferrine diferrique et des affinités progressivement plus faibles pour respectivement les transferrines monoferriques et l'apotransferrine. Après liaison au récepteur de la transferrine chargée en fer, le complexe est internalisé et passe dans des endosomes. L'acidification des endosomes contribue à la dissociation du fer et de la transferrine. Le processus de transfert du fer aux protéines cellulaires n'est pas connu. Les micro-organismes, tout comme les cellules eucaryotes supérieures ont besoin de fer pour leur croissance. D'une manière générale, ils ont développé divers systèmes qui leur permettent de capturer le fer dans le milieu extérieur. Ainsi, la plupart des micro-organismes produisent des sidérophores à cet effet. D'autres micro-organismes ne produisent pas de sidérophores mais expriment à leur surface un récepteur spécifique de la transferrine qui leur permet de détourner et d'acquérir le fer lié à la transferrine. En particulier, des récepteurs spécifiques de la transferrine humaine ont été mis en évidence chez un certain nombre de micro¬ organismes pathogènes de l'homme. On peut citer notamment les bactéries pathogènes Neisseria meningitiώs, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumo iae, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis et Bordetella pertussis ou les protozoaires pathogènes des genres Trypanosoma cruzi, Leishmania et Plasmodium.
Ces micro-organismes sont tous des pathogènes de l'homme responsables de maladies graves, comme par exemple des méningites souvent mortelles chez l'enfant, des pneumonies, des infections des voies génitales sexuellement transmissibles représentant une des causes majeures de stérilité chez la femme, la coqueluche et des maladies telles que la leishmaniose et la malaria qui touchent plusieurs millions de personnes dans les régions tropicales et subtropicales.
Il existe déjà un modèle de souris infectables par Neisseria meningitidis (Holbein, Infect. Immun., 1981, 34, 120-125 ; Schryvers et Gonzales, Infect. Immun., 1989, 57, 2425-2429). D'une manière générale, on administre tout d'abord à une souris, du fer complexé à la transferrine humaine (Fe-Tf). Puis on injecte une quantité déterminée en nombre de CFU (colony forming unit) de Neisseria meningitidis. Cette dernière étape est désignée étape d'épreuve bactérienne. Les bactéries sont cultivées en condition de carence en fer, ces conditions induisent l'expression des récepteurs spécifiques de la transferrine humaine à la surface des bactéries.
L'administration de Fe-Tf humaine permet la croissance des Neisseria dans la souris ainsi traitée. En effet, les récepteurs bactériens sont spécifiques de la transferrine humaine. Neisseria meningitidis ne peut capturer le fer lié à la transferrine endogène de souris puisque ses récepteurs ne peuvent lier la transferrine de souris. On suit l'évolution de l'infection bactérienne dans les souris en fonction du temps, par exemple par la mesure de la bactériémie sanguine (comptage du nombre de bactéries par ml de sang prélevé des souris) ou par l'observation de l'état physiologique des souris (mauvais état à mortalité). Holbein rapporte que la mortalité dépend directement de la quantité de Fe-Tf humaine administrée. Dans ses conditions expérimentales, il obtient une mortalité de 100 % à partir de 17,5mg de Fe-Tf administrée par voie intrapéritonéale (IP). Schryvers et Gonzales recommandent une administration de 24mg de Fe-Tf préalablement à l'épreuve bactérienne.
Il est possible d'injecter le fer dans la souris sous d'autres formes, par exemple sous forme de dextran de fer. Dans ces conditions, les Neisseria se trouveront en excès de fer, ne produiront pas les récepteurs bactériens spécifiques de la transferrine humaine et pourront capter le fer par un simple phénomène de perméabilité. Il sera alors impossible d'évaluer ou sélectionner des médicaments potentiels agissant au niveau du récepteur bactérien.
Du fait de l'importance des pathologies induites par les micro-organismes tels que ceux énoncés ci-dessus, il est nécessaire de disposer de modèles expérimentaux qui permettent d'identifier des médicaments à leur encontre et d'en évaluer l'efficacité. A l'aide de ces modèles, on pourra tester diverses substances, notamment celles qui peuvent agir au niveau des récepteurs bactériens, et ainsi trouver des médicaments susceptibles d'induire une protection efficace et durable à encontre de ces micro- organismes et de traiter les maladies qu'ils induisent.
On a maintenant généré des lignées de souris transgéniques produisant la transferrine humaine et on a trouvé que ces lignées pouvaient être utilisées à titre de modèle animal pour évaluer ou sélectionner des médicaments potentiels, plus particulièrement des vaccins, destinés à la prévention ou au traitement d'une infection telle que la méningite, maladie induite entre autre par la bactérie Neisseria meningitidis. Ceci n'était pas acquis d'emblée puisqu'il y a d'une part, une incertitude sur la capacité de la transferrine humaine à charger le fer dans un organisme de souris, et d'autre part, un risque d'interférence avec la transferrine de souris pouvant provoquer une éventuelle toxicité.
Enfin, les animaux transgéniques de la présente invention peuvent produire un taux de transferrine d'origine humaine proche de la concentration physiologique chez l'homme (aux environs de 1 à 2 mg/ml), ce qui permet de développer un modèle reproduisant les conditions physiologiques par rapport aux modèles de l'art antérieur, qui eux impliquent une administration de Fe-Tf à des concentrations nettement supérieures, de l'ordre de 10 fois.
D'autre part, il est important de noter qu'un tel modèle animal devrait être d'un emploi simplifié et d'un coût raisonnable en comparaison avec le modèle animal actuellement en usage jusqu'à ce jour, qui implique une injection d'une quantité importante de transferrine chargée en fer aux animaux.
Par conséquent, l'invention a pour objet un animal transgénique non-humain dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN codant pour une transferrine d'origine humaine, notamment un précurseur d'une transferrine d'origine humaine, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression.
Par "éléments nécessaires au contrôle de l'expression d'un fragment d'ADN", on entend l'ensemble des éléments nécessaires à la transcription d'un fragment d'ADN en ARN et à la traduction de ce dernier en protéine. Parmi ceux-ci, la région promotrice revêt une importance particulière. En effet, selon un mode de réalisation avantageux, les éléments de contrôle utiles aux fins de la présente invention contiennent une région promotrice foie-spécifique, c'est-à-dire capable de promouvoir avec efficacité l'expression d'un fragment d'ADN dans un nombre restreint de types cellulaires comprenant essentiellement les cellules hépatiques. En faisant usage d'une telle région promotrice, le fragment d'ADN pourrait être exprimé dans des cellules autres qu'hépatiques ; mais alors il le serait à un moindre taux. A titre d'exemple de promoteur foie-spécifique, on peut notamment citer le promoteur du gène αl-antitrypsine ou celui du gène transferrine.
Afin de mettre en oeuvre un animal transgénique selon l'invention, il est particulièrement avantageux de choisir une région promotrice issue du genre ou de l'espèce d'animal que l'on veut obtenir sous forme transgénique. Ainsi, une souris transgénique sera réalisée en utilisant la région promotrice d'un gène murin, de préférence d'un gène de souris et notamment le promoteur foie-spécifique du gène transferrine de souris.
Le fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une transferrine d'origine humaine peut être : De type génomique, tel que par exemple décrit par Schaeffer et al. (Gène, 1987, 56, 109-116) (17 exons séparés par 16 introns) ; il peut également s'agir d'un fragment similaire, modifié au niveau des introns, par exemple comportant une délétion partielle d'un ou plusieurs des 16 introns ;
De type ADN complémentaire (ADNc), c'est-à-dire dépourvu d'intron tel que décrit par Yang et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 2752- 2756) ; ou
- De type minigène, c'est-à-dire mixte comprenant tout ou partie d'au moins un des 16 introns. Ce dernier type est plus particulièrement préféré. D'une manière tout à fait préférée, le fragment d'ADN de type minigène comprend le premier exon, le premier intron et les exons suivants (du 2ième au 17ième) sous forme d'ADNc.
Selon un mode de réalisation avantageux, le fragment d'ADN est intégré dans le génome d'un animal transgénique selon l'invention, à l'extérieur du gène homologue codant pour la transferrine.
Le précurseur pour lequel doit coder un fragment d'ADN utile aux fins de la présente invention, comprend essentiellement une transferrine d'origine humaine, sous forme mature, et un peptide signal fixé par liaison peptidique à l'extrémité NH2 de la transferrine. Un peptide signal comporte généralement une séquence d'acides aminés principalement hydrophobe et a pour fonction de promouvoir la sécrétion dans le sang de la transferrine sous forme mature. Une fois sa fonction remplie, le peptide signal est éliminé par clivage.
Dans le contexte de la présente invention, n'importe quel peptide signal peut être utilisé ; mais on utilise de préférence le peptide signal homologue codé par le gène humain de la transferrine.
Par "transferrine d'origine humaine", on entend une protéine ayant les caractéristiques suivantes :
Elle est capable de lier le fer ; - Elle est capable de se lier au récepteur de la transferrine humaine ;
- Elle est capable de se lier au récepteur de la transferrine d'un micro- organisme ;
- Elle possède une séquence d'acides aminés qui présente un degré d'homologie d'au moins 80%, de manière avantageuse d'au moins 90%, de manière préférée d'au moins 95 % et de manière tout à fait préférée de 100%, avec la séquence de la transferrine humaine native telle que montrée dans l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 1, du résidu Valine en position 20 au résidu Proline en position 698.
Selon un mode avantageux, le fragment d'ADN code pour un précurseur de la transferrine humaine dont la séquence d'acides aminés est telle que montrée dans l'identificateur de séquence SEQ ID N0: 1, du résidu Méthionine en position 1 au résidu Proline en position 698.
Enfin une transferrine d'origine humaine est, de préférence, capable d'être reconnue par des anticorps spécifiques de la transferrine humaine. Ceci peut être mis en évidence selon des méthodes de détection immunologiques connues de l'homme de l'art, qui peuvent être mises en oeuvre avec des anticorps polyclonaux ou monoclonaux issus d'espèces variées et dirigés contre divers déterminants antigéniques de la transferrine humaine. A titre indicatif, une description détaillée d'un mode opératoire particulier d'un test ELISA est fournie ci-après (voir
Exemple 2). Cette technique ELISA pourra notamment être mise en oeuvre pour évaluer la concentration sérique en transferrine d'origine humaine chez les animaux transgéniques selon l'invention. Selon un mode préféré de l'invention, un animal transgénique selon l'invention exprime une transferrine d'origine humaine à un taux sérique compris entre 0, 1 et 5 mg/ml, de manière avantageuse 0,2 et 4 mg/ml et de manière préférée 0,3 et 3 mg/ml.
Un animal transgénique selon l'invention est de préférence un mammifère non- humain, plus particulièrement un rongeur, notamment un murin et de préférence une souris. Par "animal transgénique selon l'invention", on entend un animal qui est transgénique pour un fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une transferrine d'origine humaine.
Un animal transgénique selon l'invention peut être un transgénique complet (le fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une transferrine d'origine humaine est intégré dans le génome de toutes les cellules, somatiques et germinales, dudit animal ; ceci est par exemple le cas lorsque le fragment d'ADN est introduit dans un embryon au stade "une cellule") ou mosaïque (le fragment d'ADN est intégré dans le génome d'un certain pourcentage de cellules, mais pas dans toutes ; le pourcentage dépendra du nombre de cellules constituant l'embryon au moment de l'introduction du fragment d'ADN).
Par ailleurs, l'invention propose également:
(i) Un premier procédé de préparation d'un animal simple transgénique selon l'invention, selon lequel :
on introduit dans un embryon non-humain, un fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une transferrine d'origine humaine, pour obtenir un embryon transgénique,
on transplante ledit embryon transgénique dans un animal femelle pseudo-gestante,
on permet audit embryon de se développer jusqu'à son terme, et
on sélectionne au moins un animal simple transgénique dans le génome duquel est intégré un allèle dudit fragment d'ADN ; et
(ii) Un deuxième procédé de préparation d'un animal double transgénique selon l'invention, selon lequel :
on croise un animal mâle simple transgénique et un animal femelle simple transgénique, chacun obtenu par le premier procédé selon l'invention, et on sélectionne au moins un descendant double transgénique dans le génome duquel sont intégrés deux allèles du fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une transferrine d'origine humaine.
Selon un mode préféré, les premier et deuxième procédés selon l'invention s'appliquent à la préparation de murins, plus particulièrement de souris, respectivement simple et double transgéniques.
L'introduction du fragment d'ADN au sein d'un embryon ainsi que l'implantation de l'embryon transgénique chez une femelle pseudo-gestante peuvent être mis en oeuvre selon les méthodes conventionnellement en usage.
D'une manière générale, un fragment d'ADN est introduit dans des cellules embryonnaires maintenues en culture ou dans un embryon comportant de préférence 1 à 8 cellules, de manière avantageuse 1 à 4 cellules et de manière préférée 1 cellule. Une méthode consiste à transfecter les cellules ou l'embryon par un virus recombinant, notamment un rétrovirus recombinant, dans le génome duquel est inséré le fragment d'ADN. Selon une autre méthode, on injecte le fragment d'ADN tel quel dans l'embryon.
Un animal transgénique selon l'invention peut être aussi un descendant d'un animal directement obtenu par un des procédés décrit ci-avant. En d'autres termes, un animal transgénique selon l'invention inclut l'animal fondateur (F0) d'une lignée transgénique ainsi que les descendants du fondateur de première génération (Fj) et des générations suivantes (F2 et suivantes).
Les descendants peuvent être obtenus par croisement d'un animal transgénique selon l'invention avec un animal de la même espèce non transgénique. Dans ce cas, environ la moitié des animaux issus de ce croisement comprendront un allèle du fragment d'ADN dans toutes leurs cellules germinales et somatiques, et par conséquent sont hétérozygotes.
D'une manière alternative, les descendants peuvent également être obtenus par croisement avec un autre animal transgénique selon l'invention, d'une lignée identique ou différente. Un tel croisement donne environ 25 % d'animaux double transgéniques comportant deux allèles du fragment d'ADN. On s'attend à ce que le niveau d'expression du produit codé par le fragment d'ADN dans les animaux double transgéniques soit supérieur à celui observé chez des simple transgéniques. Les deux allèles peuvent être présents au niveau du même locus (double transgénique homozygote résultant du croisement de deux animaux transgéniques d'une même lignée). Ils peuvent également être situés en des loci différents du génome correspondant aux sites d'intégration du fragment d'ADN dans chacun des parents (double transgénique hétérozygote résultant du croisement de deux animaux transgéniques de lignées différentes).
Un animal double transgénique, tel que dérivé par exemple du deuxième procédé selon l'invention, peut être notamment identifié par les techniques classiques du génie génétique connues de l'homme de l'art, par exemple la technique de Southern ou par croisement "retour". Un tel croisement entre un animal double transgénique homozygote et un animal non transgénique, doit donner lieu à 100 % d'animaux simple transgéniques dans le génome desquels est intégré un allèle du fragment d'ADN.
Compte tenu de ce qui précède, on précise qu'un animal selon l'invention peut donc être simple, double ou multi-transgénique pour le fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une transferrine d'origine humaine. Un animal selon l'invention est avantageusement un double transgénique, préférentiellement homozygote.
Enfin l'invention a pour objet :
(i) L'usage d'un animal transgénique selon l'invention, à titre de modèle animal pour évaluer ou sélectionner un médicament potentiel destiné à la prévention ou au traitement d'une infection induite par un organisme pathogène possédant un récepteur capable de fixer une transferrine d'origine humaine ; et
(ii) Un procédé pour évaluer ou sélectionner un médicament potentiel destiné à la prévention ou au traitement d'une infection induite par un organisme pathogène possédant un récepteur capable de fixer une transferrine d'origine humaine, procédé selon lequel : a) on administre à un animal transgénique selon l'invention ledit médicament, avant pendant ou après l'administration d'une quantité déterminée dudit organisme pathogène, et
b) on mesure l'évolution de l'infection pendant une période d'au moins 24 heures après l'étape a) pour évaluer l'activité et éventuellement sélectionner le médicament donnant les meilleurs résultats.
L'invention concerne également les médicaments mis en oeuvre par le procédé précédent.
Dans le contexte de la présente invention, un médicament potentiel peut être une substance de toute nature, chimique ou bien biologique telle qu'un anticorps ou un agent vaccinal ; ce peut être aussi un mélange de substances.
Un organisme pathogène possédant un récepteur capable de fixer une transferrine d'origine humaine peut être une bactérie pathogène telle que Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis et Bordetella pertussis ou un protozoaire pathogène du genre Trypanosoma cruzi, Leishmania et Plasmodium. Dans le contexte de la présente invention, un organisme pathogène de choix est Neisseria meningitidis.
Le médicament potentiel peut être administré à l'animal en dose unique ou répétées, plusieurs fois après un certain délai d'intervalle ; par n'importe quelle voie d'administration communément en usage ; de façon préalable, concomitante ou postérieure à l'étape d'épreuve par l'organisme pathogène. Lorsqu'il s'agit d'un agent utilisé à titre préventif, notamment un agent vaccinal, ce dernier sera administré de façon préalable à l'administration du micro-organisme pathogène. Dans les autres cas, le médicament sera administré de façon préalable, concomitante ou postérieure à l'étape d'épreuve.
L'étape d'épreuve s'effectue en administrant une quantité appropriée et préalablement déterminée d'un organisme pathogène, le plus souvent en dose unique et par n'importe quelle voie d'administration communément en usage. On préférera néanmoins, la voie sous-cutanée ou intrapéritonéale. La quantité à administrer doit être suffisante pour déclencher chez un animal contrôle (pas d'administration préalable de médicament), un état pathogène qui peut se signaler de différentes manières (poil hérissé, mobilité réduite, prostration, mort) ; elle dépend de divers facteurs tels que l'espèce animal ou l'organisme pathogène. Elle peut être déterminée selon les pratiques générales d'un homme du métier. Dans le cas d'une infection bactérienne, on recherchera par exemple, la dose minimale qui induit une bactériémie significative.
A titre d'exemple, on indique qu'il convient d'administrer à une souris transgénique, par voie intrapéritonéale, une suspension de Neisseria meningitidis titrant de 1.105 à 1.108 CFU, de manière avantageuse de 1.106 à 5.107 CFU et de manière préférée, environ 1.107 CFU. Cette suspension sera obtenue de préférence par culture de la bactérie dans un milieu carence en fer.
Un procédé selon l'invention peut également comprendre une étape optionnelle, dite "étape de surcharge". On administre alors à l'animal une quantité réduite de transferrine humaine chargée en fer (Fe-Tf) préalablement ou de façon concomitante à l'étape d'épreuve. Cette administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée plusieurs fois et peut se faire par n'importe quelle voie d'administration communément en usage, de préférence par voie intrapéritonéale ou intraveineuse. La quantité de Fe-Tf que l'on administre est de 0,5 à 6 mg, de manière avantageuse de 0,6 à 5 mg et de manière préférée de 1 à 4 mg.
Un procédé selon l'invention destiné à l'évaluation d'un agent vaccinal bactérien peut être par exemple mis en oeuvre dans le cadre de l'expérience décrite ci-après en des termes généraux.
Des animaux transgéniques selon l'invention sont répartis en plusieurs lots d'épreuve. Chaque animal d'un même lot reçoit une dose déterminée de l'agent vaccinal à tester. La dose varie en fonction des lots. Un lot témoin positif est constitué en parallèle ; les animaux transgéniques de ce lot ne reçoivent pas le vaccin à tester.
De même on peut constituer un lot témoin négatif avec des animaux de la même espèce non transgéniques qui ne reçoivent pas l'agent vaccinal à tester. Environ 15 à 20 jours après, les animaux de tous les lots reçoivent une dose déterminée de la bactérie. L'absence d'infection ou sa progression est enregistrée selon différents paramètres tels que la bactériémie et l'état physiologique des animaux. L'agent vaccinal est considéré comme protecteur lorsque la bactériémie mesurée chez les animaux transgéniques des lots d'épreuve est réduite de manière significative par rapport à celle mesurée chez les animaux transgéniques du lot témoin positif ; ou lorsque l'état physiologique des animaux des lots d'épreuve est notablement amélioré (se manifestant par exemple par un pourcentage de mortalité réduit) par rapport à celui des animaux du lot témoin positif.
Chez les animaux du lot témoin négatif, les bactéries ne peuvent pas proliférer avec efficacité en raison de leur incapacité à s'approvisionner en fer. La bactériémie que l'on observe est faible (inférieure au nombre de CFU injecté), transitoire et suivie d'une phase de clearance rapide. L'infection n'a aucun effet en principe sur la survie de ces animaux.
Bien évidemment, plus la bactériémie et l'état physiologique des animaux d'épreuve se rapproche de ce qui est observé dans le lot témoin négatif, plus l'agent vaccinal ou sa dose doit être considéré comme efficace. Dans un lot d'épreuve, une bactériémie est considérée comme élevée lorsque elle est supérieure d'au moins un facteur 100, 1000 ou 10 000 à celle observée dans le lot témoin négatif ; ceci dans des conditions de mesure strictement parallèles.
L'invention est illustrée ci-après et par référence à la figure suivante.
La Figure 1 représente schématiquement la construction du fragment d'ADN codant pour le précurseur de la transferrine humaine en précisant les sites de restriction utilisés dans les étapes de clonage ; la région promotrice du gène murin de la transferrine (mTf pro) est indiquée par des pointillés ; l'exon 1 du gène humain de la transferrine est représenté par une zone hachurée ; l'intron 1 par une zone quadrillée ; la partie ADNc par une boîte blanche ; et la région de terminaison de la transcription de SV40 par une boîte noire. La localisation des séquences correspondant aux oligonucléotides utilisés lors des étapes de construction est indiquée. EXEMPLE 1 : Préparation du plasmide pTG2728 comportant un minigène codant pour le précurseur de la transferrine humaine
L'exemple a trait à la construction d'un plasmide comportant un minigène codant pour le précurseur de la transferrine humaine (hTf) placé sous le contrôle du promoteur du gène de la transferrine murine (mTf). (Figure 1)
La partie promotrice est isolée du plasmide -3kb mTf-hGH (Idzerda et al., Mol.
Cell. Biol., 1989, 9, 5154-5162), le fragment génomique comportant l'exon 1, l'intron 1 et une portion 5' de l'exon 2 du plasmide p7.3kb AT. Ce dernier résulte du clonage du fragment génomique comprenant les exons 1 et 2 du gène de la transferrine humaine issu du phage Tf A2 (Schaeffer et al, Gène, 1987, 56, 109-
116) dans le vecteur pAT153/PvwII/8 (Anson et al., EMBO J., 1984, 1053-1060).
La région ADNc provient du plasmide Tf23 (Parle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 3149-3153). L'ensemble des étapes de clonage mettant en oeuvre des plasmides bactériens est réalisé par passage dans la souche Escherichia coli (E. coli) 5K, alors que celles qui mettent en oeuvre des vecteurs dérivés du phage Ml 3 sont réalisées par passage dans E. coli NM522.
Un site BglU est créé en amont de l'ATG initiateur du gène hTf par mutagenèse dirigée. La mutagenèse est réalisée par PCR en utilisant l'oligonucléotide mutagène OTG3320 dont la séquence est reportée dans la SEQ ID NO: 2. On utilise le vecteur M13TG1779 en tant que matrice. Ce dernier provient du clonage du fragment génomique BamΑl de 1,1 kb isolé de p7.3 kb AT (comprenant l'exon 1, l'intron 1, l'exon 2 et la partie 5' de l'intron 2 du gène hTf) dans le site de BamΑl de M13mpl9 (Gibco BRL). La mutagenèse met en oeuvre une amorce reverse, complémentaire à une séquence du vecteur M13mpl9 et proche du site de clonage. L'amorce reverse désignée OTG3321 est décrite dans la SEQ ID NO: 3. On réalise 30 cycles d'amplification.
Le fragment généré est vérifié sur gel d'agarose et digéré par les enzymes BgRl et BamΗI. Ce dernier est inséré entre les mêmes sites du vecteur p polyI+ (Lathe et al., Gène, 1987, 57, 193-201) générant le vecteur pTG2715. La séquence du fragment BglU-BamΗl est vérifiée. Le vecteur -3kb mTf-hGH qui comprend la région promotrice du gène mTf est digéré par EcoRI puis traité à la polymérase Klenow afin de générer des extrémités franches. H est ensuite digéré par BamïΩ.. Le fragment généré comportant 3kb de région promotrice du gène mTf, et le fragment BglR-EcόKV isolé de pTG2715 sont intégrés entre le site HindïH traité à la polymérase Klenow et le site EcoRV de pTG5919. Cette insertion détruit les sites BglR et BarnirU qui possèdent des extrémités compatibles. Il en résulte le vecteur pTG2723.
Le plasmide pTG5919 résulte de l'insertion du fragment BglΩ. de 0,15kb comportant la séquence de terminaison de transcription du virus SV40 (Simian virus 40), dans le site BamΗl de p polyiπ I* (Lathe et al., supra). Ce plasmide est issu de pTG173 (décrit dans la demande européenne 298 807) et comprend notamment la séquence de terminaison de SV40 mais se distingue de pTG173 au niveau des sites de restriction qui encadrent ladite séquence : respectivement en 5' un site BglR et en 3' les sites Sali, Pstl et Bgïï Tout autre plasmide comportant la même séquence de terminaison et des sites de restriction adéquates pourrait être utilisé.
Par ailleurs, un fragment s'étendant du codon 25 au site BamΗl recouvrant les codons 90 et 91 (le codon +1 représente le premier acide aminé de la transferrine humaine mature) est généré par synthèse chimique. Les 6 oligonucléotides utilisés OTG3336 à 3341 sont reportés dans les SΕQ ID NO: 4 à 9. L'oligonucléotide de la SΕQ ID NO: 4 contient en amont un site Ht«dLÏÏ pour faciliter le clonage du fragment synthétique. Le fragment synthétique Htwdffl-itormHI ainsi constitué est sous-cloné dans le vecteur M13mpl9 donnant le vecteur M13TG1787 et sa séquence est vérifiée.
La séquence ADNc en aval du site BamHS. provient du clone Tf23. Ce dernier comprend la région codante de la transferrine humaine à partir du codon 98 et une séquence 3' non-codante de 138pb. Les séquences comprises entre le site BamΗl et le codon 98 sont ajoutées par PCR.
La réaction de PCR met en oeuvre l'amorce OTG3343 reportée dans la SΕQ ID
NO: 10, l'amorce reverse OTG3344 de la SΕQ ID NO: 11 comprenant le site EcoRI interne de l'ADNc hTf et le clone Tf23 en tant que matrice. Le fragment
PCR généré, après digestion par les enzymes BamΗl et EcoRI, est introduit entre les mêmes sites de M13TG1787. La séquence du vecteur M13TG2713 en résultant est vérifiée.
Le fragment BamlH-Ndel isolé de p7.3kb AT (comprenant la partie 3' de l'intron 1 et la partie 5' de l'exon 2) ainsi que le fragment Ndel-EcόRl isolé de M13TG2713 sont insérés dans le vecteur pTG2723 digéré par BamΗl et EcoRI. Il en résulte le plasmide pTG2726. La séquence ADNc codant pour la transferrine humaine est complétée en insérant le fragment EcoRI isolé de Tf23 dans le vecteur pTG2726. Le vecteur en résultant et présentant une orientation correcte du fragment EcoRI est désigné pTG2728.
EXEMPLE 2 : Souris transgéniques exprimant la transferrine humaine.
A. Obtention de souris simple transgéniques hétérozygotes
Le plasmide pTG2728 est purifié sur gradient de chlorure de césium et digéré par Notl de manière à obtenir un fragment d'ADN comportant un minigène codant pour le précurseur de hTf sous le contrôle de 3kb de région promotrice du gène mTf Le fragment Notl est purifié sur gradient de sucrose et injecté dans le pronucléus mâle d'un oeuf fertilisé de souris hybrides de 2ième génération issues du croisement d'une souris femelle C57/B16 avec un mâle SJL selon la technique connue de l'homme du métier. Chaque oeuf est ensuite réimplanté dans l'utérus d'une souris pour que la gestation soit poursuivie.
L'ADΝ des tissus de la queue des nouveau-nés est isolé de manière à vérifier l'intégration du transgène dans le génome de l'animal par analyse Southern (Southern, E, J. Mol. Biol., 1975, 98, 503). L'ADΝ génomique ainsi obtenu est digéré par l'enzyme EcoRI et le mélange de digestion est séparé sur gel d'agarose 1%. Après transfert sur membrane Hybond Ν+ (Amersham), l'ADN est hybride en utilisant une sonde appropriée spécifique du gène hTf marquée à l'isotope 3 p. La sonde est constituée par le fragment 2to/wHI-EcoRI de 0,6kb isolé de M13TG2713. Dans les conditions de stringence classiquement utilisées, on n'observe aucune hybridation croisée avec le gène endogène transferrine de souris. L'analyse des résultats montre que le transgène est intégré dans le génome de 12 souris sur les 86 analysées. Des lignées transgéniques sont établies à partir de 7 fondateurs. On génère des descendants hétérozygotes par croisement de chacun des fondateurs avec des souris hybrides non-transgéniques C57/B16 x SJL. La transmission aux descendants est également vérifiée par Southern. Le nombre de copies du transgène est stable d'une génération à l'autre, et on ne détecte aucun réarrangement.
Du sang est prélevé sur les souris positives au test d'hybridation et le niveau d'expression de la transferrine humaine dans le sérum est déterminé par la méthode ELISA décrite ci-après.
B. Détermination de la concentration sérique de transferrine humaine dans les souris transgéniques.
lOOμl d'un anticorps polyclonal de chèvre anti-transferrine humaine (Sigma, référence T-6265) préalablement dilué 100 fois dans un tampon PBS (Na2 HPO4 0,008M, KH2PO4 0.002M, NaCl 0,15M, pH7,2), sont déposés au fond de chaque puit d'une plaque de microtitration de 96 puits (Nunc) et incubés à 4°C pendant 16h. Les anticorps non adsorbés sont éliminés par lavages extensifs avec un tampon PBS comprenant 0,2 % de Tween 80. Les puits sont saturés par addition de 50μl de BSA 2 % dissoute dans un tampon PBS. Après lOmn, on ajoute 50μl d'une solution PBS-Tween 4 % et lOOμl de dilution d'échantillons de sérum prélevés d'une souris positive au test d'hybridation. Les plaques sont incubées 2h à température ambiante, et lavées extensivement avec le tampon PBS-Tween 0,2 %. On les incube ensuite 2 heures à température ambiante avec lOOμl d'un anticorps de mouton anti-transferrine humaine couplé à la peroxydase (Binding Site Limited, référence PPO70) dilué 1000 fois dans un tampon PBS-Tween 0,2 %. Après lavages extensifs dans les mêmes conditions que précédemment, l'activité enzymatique peroxydase est révélée par addition de lOOμl de la préparation suivante (Na2HPO4 0,066M, C6H8O7 0,035M, pH5, 0,04 % d'ortho- phénylendiamiπe et 0,014 % de peroxyde d'hydrogène). La réaction est stoppée par addition de 150μl d'une solution H2Sθ4 1M. L'absorbance est mesurée à 490nm.
La quantité de transferrine d'origine humaine contenue dans le sérum des animaux transgéniques est établie en fonction d'une gamme d'étalonnage préparée comme suit : une solution de transferrine humaine purifiée (Sigma, référence T-3400) préparée à une concentration de 5X10"5 mg/ml est diluée de 2 en 2 dans du tampon PBS. L'absorbance est mesurée pour chacune des dilutions et la courbe d'étalonnage est établie (ng de transferrine humaine en fonction de l'absorbance).
Le mode opératoire ci-dessus décrit permet de détecter jusqu'à lng de transferrine humaine. Le test est spécifique de la transferrine humaine et ne montre pas de réaction croisée avec de la transferrine de souris.
Le niveau d'expression des animaux fondateurs (FQ) varie en moyenne et selon les lignées entre 0,16 et 0,40mg/ml. D'une manière générale, l'expression est légèrement augmentée chez les animaux de première génération (¥ ) et atteint 0,40 à 0,75mg/ml, reflétant le mosaïsme des fondateurs. Puis pour les lignées pour lesquelles les descendants de 2ième génération (F2) sont générés, le taux d'expression est relativement stable à l'exception d'une lignée.
C. Etablissement de lignées de souris double transgéniques homozygotes
Les souris homozygotes sont générées en croisant des frères et des soeurs provenant d'une même lignée transgénique. On détermine les animaux homozygotes par Southern blot quantitatif effectué sur les tissus de queue prélevés des descendants dudit croisement. De plus, les homozygotes sont confirmés par croisement "retour" avec des souris hybrides non transgéniques, qui doit donner 100 % de descendants simples transgéniques. On a généré des souris homozygotes à partir de différentes lignées. Les homozygotes issus de la lignée 13 présentent un niveau d'expression de la transferrine humaine augmenté d'un facteur proche de 2 par rapport à celui des simple transgéniques parents. Les souris homozygotes de la lignée 13 produisent environ 1 mg/ml de transferrine humaine (la concentration sérique mesurée dans 4 animaux varie de 0,92 à l,2mg/ml).
EXEMPLE 3 : Usage des souris transgéniques à titre de modèle animal pour l'infection de Neisseria meningitidis.
On utilise la souche Neisseria meningitidis B16B6 à titre de souche d'épreuve. Les bactéries sont cultivées sur boîte de gélose Mueller-Hinton pendant 16 heures à 37°C sous 10 % de CO . Puis on réalise une culture en milieu liquide en mettant en suspension des colonies précédemment obtenues dans un milieu BMH (bouillon Mueller-Hinton) pH6,6, EDDA (Ethylènediamine-di O-hydroxyphényl-acetic acid, Sigma) 30 μM à une DOôgo (densité optique mesurée à 680 nm) d'environ 0,2. Les bactéries sont ainsi cultivées en condition de carence de fer pendant 4 heures à 37°C sous agitation. L'absorbance à 680nm est précisément mesurée. Elle se situe en général aux environs de 1.
On ajuste la suspension à une concentration de 2.107 CFU/ml, sachant qu'une suspension de germes à 1.109 correspond à une densité optique mesurée à 680 nm de 0,5. La suspension est préparée dans un milieu φTTG [eau physiologique tamponnée (Aguettant), Tryptone l%o (DIFCO) et gélatine l%o (Bio-Mérieux)]. L'équivalence entre absorbance et nombre de CFU est vérifiée par numération sur milieu gélosée.
La virulence de la souche est contrôlée à chaque expérimentation. Ce contrôle est effectué sur des groupes de 8 souris CD\ femelles (Charles River) âgées de 8 semaines et prétraitées à la Fe-Tf. On administre à ces souris par voie IP 0,5ml d'une solution de transferrine humaine à 48 mg/ml saturée en fer (Intergen, ref 4455-00, holoform, pureté environ 98 %) quelques minutes avant l'épreuve bactérienne. Puis on leur injecte 0,5 ml de doses progressives de raison 10 de la suspension bactérienne (en général de 1.103 à 1.107 CFU/souris) par voie IP. La létalité est enregistrée pendant les 5 jours suivants. On détermine la dose létale 50 (DL50) de la suspension bactérienne, c'est à dire la dose de bactérie à laquelle 50 % des animaux ainsi traités meurent. D'une manière générale la DL50 de la souche Neisseria meningitidis B16B6 se situe aux environs de 5.10 CFU.
Les souris sont réparties en différents groupes :
(1) des souris non-transgéniques et non traitées à la Fe-Tf. Ce groupe qui comprend en général 5 souris, constitue le témoin négatif d'infection,
(2) des souris non-transgéniques auxquelles on administre quelques minutes avant l'épreuve bactérienne et par voie IP 24mg de Fe-Tf (comme indiqué dans le paragraphe précédent). Ce groupe qui comprend environ 5 souris correspond au modèle divulgué dans l'art antérieur et constitue le témoin positif d'infection, et (3) des souris transgéniques qui expriment une concentration sérique de hTfde O,3 à O,6mg/ml.
(4) On peut également inclure, de manière facultative, un groupe supplémentaire constitué par des souris transgéniques, auxquelles on administre une quantité très réduite de Fe-Tf (1,3 mg) par voie IP.
On administre à l'ensemble des souris 0,5ml de la suspension bactérienne, soit environ 1.107 CFU/ml. L'administration est réalisée par voir IP et représente le temps 0 (t=0) de l'expérimentation.
Des prises de sang sont effectuées au niveau du sinus rétro orbitaire à intervalle de temps régulier. L'échantillon est dilué immédiatement au 1/10 dans le milieu φTTG et des dilutions progressives de raison 10 sont ensuite effectuées dans le même diluant. On évalue le nombre de bactéries en déposant pour chaque dilution 4 gouttes de 25 μl sur gélose Mueller-Hinton supplémentée. Après incubation une nuit à 37°C sous CO2 10%, les colonies sont comptées. Les résultats sont exprimés en nombre de CFU moyen par ml de sang. D'autre part l'état physiologique des animaux est enregistré pendant les 5 jours qui suivent l'épreuve bactérienne.
Les résultats peuvent être résumés de la façon suivante:
Dans les souris non-transgéniques et non traitées à la Fe-Tf, on mesure une bactériémie transitoire inférieure au nombre de CFU injecté, qui régresse rapidement en fonction du temps. La bactériémie est non détectable ou très faible à partir de t=48h Tous les animaux de ce groupe survivent et ne présentent aucun signe de maladie.
Les souris non-transgéniques traitées à la Fe-Tf (24mg/IP) présentent une bactériémie élevée très tôt après l'épreuve bactérienne (dès t=4h) qui s'accentue encore au cours du temps. L'infection entraîne généralement la mort des animaux en moins de 48h.
Les souris transgéniques (concentration plasmatique en hTf environ 0,5 mg/ml) présentent une bactériémie élevée avec un maximum à t=24h. Les animaux sont malades et la plupart se rétablissent progressivement alors que dans quelques cas, l'infection entraîne la mort par septicémie.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: TRANSGENE
(B) RUE: 11 rue de Molsheim
(C) VILLE: STRASBOURG
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 67082
(G) TELEPHONE: (33) 88.27.91.00 (H) TELECOPIE: (33) 88.22.58.07
(ii) TITRE DE L* INVENTION: Animal transgénique exprimant une transferrine d'origine humaine.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 11
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(v) DONNEES DE LA DEMANDE ACTUELLE: NUMERO DE DEPOT: FR 93 06105
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 698 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(B) SOUCHE: Transferrine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu
1 5 10 15
Cys Leu Ala Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu 20 25 30
His Glu Ala Thr Lys Cys Gin Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val 35 40 45
Ile Pro Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr 50 55 60 Leu Asp Cys Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr 65 70 75 80
Leu Asp Ala Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu 85 90 95
Lys Pro Val Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gin Thr 100 105 110
Phe Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gin Met 115 120 125
Asn Gin Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser 130 135 140
Ala Gly Trp Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu 145 150 155 160
Pro Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser 165 170 175
Cys Ala Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gin Leu Cys Gin Leu 180 185 190
Cys Pro Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gin Tyr Phe Gly Tyr Ser 195 200 205
Gly Ala Phe Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val 210 215 220
Lys His Ser Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp 225 230 235 240
Gin Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu 245 250 255
Tyr Lys Asp Cys His Leu Ala Gin Val Pro Ser His Thr Val Val Ala 260 265 270
Arg Ser Met Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gin 275 280 285
Ala Gin Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gin Leu Phe 290 295 300
Ser Ser Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly 305 310 315 320
Phe Leu Lys Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr 325 330 335
Glu Tyr Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu 340 345 350
Ala Pro Thr Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His 355 360 365
His Glu Arg Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys 370 375 380 Ile Glu Cys Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile 385 390 395 400
Met Asn Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr 405 410 415
Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn 420 425 430
Lys Ser Asp Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val 435 440 445
Ala Val Val Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys 450 455 460
Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn 465 470 475 480
Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp 485 490 495
Glu Phe Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser 500 505 510
Leu Cys Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn 515 520 525
Asn Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val 530 535 540
Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Gin Thr Val Pro Gin Asn 545 550 555 560
Thr Gly Gly Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys 565 570 575
Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu 580 585 590
Tyr Ala Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr 595 600 605
Arg Lys Asp Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gin Gin Gin 610 615 620
His Leu Phe Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu 625 630 635 640
Phe Arg Ser Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys 645 650 655
Leu Ala Lys Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu 660 665 670
Glu Tyr Val Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser 675 680 685
Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro 690 695 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthèse OTG3320
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: GGGAAAAGAT CTCGGAAGAT GAGGCTCGCC GTG 33
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Oligonucleotide de synthèse OTG3321
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: CACACAGGAA ACAGCTATGA CCATG 25
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 69 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Oligonucleotide de synthèse 0TG3336
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: AGCTTCATAT GAAAAGCGTC ATTCCATCCG ATGGTCCCAG TGTTGCTTGT GTGAAGAAAG 60 CCTCCTACC 69
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 69 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Oligonucleotide de synthèse OTG3337
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: TTGATTGCAT CAGGGCCATT GCGGCAAACG AAGCGGATGC TGTGACACTG GATGCAGGTT 60 TGGTGTATG 69
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 62 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii ) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
( iii ) HYPOTHETIQUE : NON
( iii ) ANTI-SENS : NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Oligonucleotide de synthèse OTG3338
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: ATGCTTACTT GGCTCCCAAT AACCTGAAGC CTGTGGTGGC AGAGTTCTAT GGGTCAAAAG 60 AG 62
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 75 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Oligonucleotide de synthèse OTG3339
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: GATCCTCTTT TGACCCATAG AACTCTGCCA CCACAGGCTT CAGGTTATTG GGAGCCAAGT 60 AAGCATCATA CACCA 75
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 68 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Oligonucleotide de synthèse OTG3340
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: AACCTGCATC CAGTGTCACA GCATCCGCTT CGTTTGCCGC AATGGCCCTG ATGCAATCAA 60 GGTAGGAG 68
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 57 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Oligonucleotide de synthèse 0TG3341
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: GCTTTCTTCA CACAAGCAAC ACTGGGACCA TCGGATGGAA TGACGCTTTT CATATGA 57
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 56 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(Vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Oligonucleotide de synthèse OTG3343
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: GGGAAAGGAT CCACAGACTT TCTATTATGC TGTTGCTGTG GTGAAGAAGG ATAGTG 56
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Oligonucleotide de synthèse OTG3344
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: TAGTTGGAAT TCTTTTGATT TGTCTTTGCC 30

Claims

Revendications
1. Un animal transgénique dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN codant pour une transferrine d'origine humaine, en particulier un précurseur d'une transferrine d'origine humaine, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression.
2. Un animal transgénique selon la revendication 1, dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une transferrine d'origine humaine, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression ; lesdits éléments comprenant une région promotrice foie- spécifique.
3. Un animal transgénique selon la revendication 2, dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une transferrine d'origine humaine, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression ; lesdits éléments comprenant une région promotrice foie- spécifique qui est celle du gène murin de la transferrine.
4. Un animal transgénique selon l'une des revendications 1 à 3, dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une transferrine d'origine humaine, ledit fragment d'ADN étant de type minigène.
5. Un animal transgénique selon l'une des revendications 1 à 4, dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une transferrine d'origine humaine ; ledit précurseur comprenant le peptide signal codé par le gène humain de la transferrine.
6. Un animal transgénique selon l'une des revendications 1 à 5, dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN codant pour un précurseur de la transferrine humaine ; ladite transferrine ayant la séquence d'acides aminés telle que montrée dans l'identificateur de séquence n° 1, du résidu Val en position 20 au résidu Pro en position 698.
7. Un animal transgénique selon l'une des revendications 1 à 6, dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN codant pour un précurseur de la transferrine humaine ; ledit précurseur ayant la séquence d'acides aminés telle que montrée dans l'identificateur de séquence n° 1, du résidu Met en position 1 au résidu Pro en position 698.
8. Un animal transgénique selon l'une des revendications 1 à 7, dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une transferrine d'origine humaine, à l'extérieur du gène homologue codant pour la transferrine.
9. Un animal transgénique selon l'une des revendications 1 à 8, qui est de type rongeur.
10. Une souris transgénique selon la revendication 9.
11. Un animal transgénique selon l'une des revendications 1 à 10, qui est simple transgénique pour le fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une transferrine d'origine humaine.
12. Un animal transgénique selon l'une des revendications 1 à 10, qui est double transgénique pour le fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une transferrine d'origine humaine.
13. Un procédé de préparation d'un animal simple transgénique selon la revendication 11, selon lequel :
on introduit dans un embryon non-humain, un fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une transferrine d'origine humaine, pour obtenir un embryon transgénique,
on transplante ledit embryon transgénique dans un animal femelle pseudo-gestante,
on permet audit embryon transgénique de se développer jusqu'à son terme, et on sélectionne au moins un animal simple transgénique dans le génome duquel est inséré un allèle dudit fragment d'ADN.
14. Un procédé d'obtention d'un animal double transgénique selon la revendication 12, selon lequel :
on croise un animal mâle simple transgénique et un animal femelle simple transgénique, chacun obtenu par le procédé selon la revendication 13, et
on sélectionne au moins un descendant double transgénique dans le génome duquel sont intégrés deux allèles du fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une transferrine d'origine humaine.
15. Usage d'un animal transgénique selon l'une des revendications 1 à 12, à titre de modèle animal pour évaluer ou sélectionner un médicament potentiel destiné à la prévention ou au traitement d'une infection induite par un organisme pathogène possédant un récepteur capable de fixer une transferrine d'origine humaine.
16. Usage d'un animal transgénique selon l'une des revendications 1 à 12, à titre de modèle animal pour évaluer ou sélectionner un médicament potentiel destiné à la prévention ou au traitement d'une infection induite par un organisme pathogène sélectionné parmi les bactéries pathogènes Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis et Bordetella pertussis et les protozoaires pathogènes des genres Trypanosoma cruzi, Leishmania et Plasmodium.
17. Usage d'un animal transgénique selon l'une des revendications 1 à 12, à titre de modèle animal pour évaluer ou sélectionner un médicament potentiel destiné à la prévention ou au traitement d'une infection induite par Neisseria meningitidis.
18. Un procédé pour évaluer ou séleαionner un médicament potentiel destiné à la prévention ou au traitement d'une infection induite par un organisme pathogène possédant un récepteur capable de fixer une transferrine d'origine humaine, selon lequel :
a) on administre ledit médicament à un animal transgénique selon l'une des revendications 1 à 12, avant pendant ou après l'administration d'une quantité déterminée dudit organisme pathogène audit animal transgénique, et
b) on suit l'évolution de l'infection pendant une période d'au moins 24 h après l'étape a), puis on évalue l'activité pour sélectionner le médicament donnant les meilleurs résultats.
19. Un procédé selon la revendication 18, selon lequel on administre à un animal transgénique selon l'une des revendications 1 à 12 une quantité d'au plus 6 mg de transferrine humaine chargée en fer, préalablement ou de façon concomitante à l'étape d'épreuve a).
20. Médicament obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 18 ou 19.
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