WO1994027151A1 - Utilisation de molecules reconnues par des autoanticorps de serums humains pour le diagnostic ou le traitement du sida - Google Patents

Utilisation de molecules reconnues par des autoanticorps de serums humains pour le diagnostic ou le traitement du sida Download PDF

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WO1994027151A1
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the use of molecules recognized by autoantibodies contained in the sera of patients carrying virus of the HIV type (Human Immunodeficiency Virus), for the implementation of methods of in vitro diagnosis of infection of an individual with an HIV type virus, as well as for obtaining drugs intended for the treatment of AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome).
  • virus of the HIV type Human Immunodeficiency Virus
  • the invention also relates to these molecules as well as the pharmaceutical compositions containing them.
  • the subject of the invention is also the above-mentioned in vitro diagnostic methods, as well as the kits, containing said molecules, for the implementation of these diagnostic methods.
  • the object of the present invention is to provide new methods of in vitro diagnosis of AIDS which are considerably less costly, for simplicity of implementation and reliability at least equal to those of methods for diagnosing AIDS. currently on the market.
  • Another object of the present invention is to provide methods of in vitro diagnosis of AIDS which allow the monitoring of the clinical course of an apparently healthy individual carrying a virus of the HIV type, towards a pathological state, as well as the pathological follow-up.
  • the invention also aims to provide new AIDS diagnostic kits, having excellent storage conditions.
  • the invention also aims to provide new drugs for the treatment of pathological conditions linked to the declaration of AIDS in an individual, or for the prevention of the appearance of these pathological conditions in apparently healthy carriers of HIV type virus. .
  • the subject of the present invention is the use of one or more molecules capable of being recognized by autoantibodies present in the serum of patients carrying virus of the HIV type, for the implementation of methods of in vitro diagnosis of the infection of an individual with a virus of the type
  • HIV HIV
  • drugs for the treatment of AIDS are examples of drugs for the treatment of AIDS.
  • a more particular subject of the invention is the use of one or more molecules capable of being recognized by autoantibodies directed against lipid antigenic structures and / or comprising a thiol group, this group being optionally substituted, these autoantibodies being present in the serum of patients carrying HIV type virus, for the implementation of in vitro diagnostic methods for the infection of an individual by an HIV type virus, or for obtaining drugs intended for the treatment of AIDS.
  • the invention relates more particularly to the abovementioned use of one or more molecules capable of being recognized by autoantibodies directed against lipid antigenic structures.
  • the molecules used in the context of the present invention are advantageously those capable of being recognized by autoantibodies directed against lipid antigenic structures, where appropriate membrane, and more particularly belonging to one of the following three categories which are capable of to recognize the compounds described below: - the antibodies directed against fatty acids with linear or branched chain, saturated or unsaturated, these fatty acids notably comprising 4 to 22 carbon atoms, preferably 12 to 18 carbon atoms, and more particularly the antibodies directed against myristic acid , lauric acid, oleic acid or palmitic acid;
  • the invention relates more particularly to the aforementioned use of one or more molecules capable of being recognized by autoantibodies directed against antigenic structures comprising a thiol group, this group being optionally substituted.
  • the molecules used in the context of the present invention are advantageously those capable of being recognized by autoantibodies directed against antigenic structures, where appropriate membrane, comprising a thiol group, this group being where appropriate substituted, said autoantibodies being more particularly those belonging to a fourth category, namely antibodies directed against cysteine and its derivatives, in particular its derivatives of formula:
  • antibodies directed against the abovementioned compounds namely fatty acids, the compounds involved in the mechanism of anchoring of cellular proteins, cholesterol and its derivatives, and cysteine and its derivatives, cited above, is meant the autoantibodies susceptible to recognize these compounds, and more particularly when the latter are linked or adsorbed to carrier polypeptides (such as human serum albumin) in the body of individuals carrying HIV type viruses, the size of these carrier polypeptides conferring on the latter have the property of being sufficiently antigenic to allow recognition of these compounds by said autoantibodies.
  • carrier polypeptides such as human serum albumin
  • the subject of the present invention is the autoantibodies of the four categories described above, and capable of being obtained from the sera of patients carrying the HIV type virus by affinity chromatography using supports on which are grafted. the above-mentioned compounds.
  • the compounds used in the context of the present invention are:
  • the carrier molecule is either that naturally linked in the organism to said compounds recognized by the abovementioned autoantibodies, in particular human serum albumin, or a carrier molecule chosen from bovine serum albumin or other carrier polypeptides, where appropriate synthetic, such as polyL-lysine.
  • the subject of the invention is more particularly the conjugates between, on the one hand, a compound chosen from fatty acids, the compounds involved in the mechanism for anchoring proteins to cell membranes, cholesterol and its derivatives, and cysteine and its derivatives, as defined above and, on the other hand, an antigenic carrier molecule chosen in particular from bovine serum albumin, or other carrier polypeptides.
  • the coupling between said molecules and the carrier molecule can be carried out between an amino function of the carrier molecule and a carboxylic function of said molecules, or conversely, between a carboxylic function of the carrier molecule and an amino function of said molecules. molecules.
  • the bond with the carrier molecule is carried out between a function amine of the latter and the carboxylic function of the above-mentioned molecules
  • the bond with the carrier molecule takes place between an acid function of the latter and the amino function of these molecules.
  • TAS taurine succinic anhydride-protein
  • CAS cysteine succinic anhydride-protein
  • the coupling with the carrier molecule is advantageously carried out via the hydroxyl group of cholesterol.
  • the invention also relates to polyclonal or monoclonal antibodies capable of recognizing the above-mentioned conjugates.
  • cholesterol and its derivatives are adsorbed on the carrier proteins.
  • mice are immunized with the above-mentioned conjugates, according to conventional immunization methods (in particular by mixing with complete Freund's adjuvant, or with agar with 2%).
  • immunization methods in particular by mixing with complete Freund's adjuvant, or with agar with 2%.
  • the subcutaneous injections of the antigens (namely the abovementioned conjugates) into the animals are made every two to three weeks, and the sera of the animals are taken ten days after each series of injection.
  • the titles, affinities and specificities of the sera obtained will be assessed by specific immunoenzymatic tests, in particular of the type of those currently used to test the sera of patients suffering from AIDS.
  • the sera of animals having good immune responses are purified according to conventional techniques, in particular by precipitation with ammonium sulphate followed by separations by chromatography on an ion exchange column, or by gel filtration.
  • the first generation monoclonal antibodies are obtained by removing spleen lymphocytes from animals previously immunized and whose sera have a good specific response against each of the abovementioned antigens, these spleen lymphocytes then being hybridized with an appropriate myeloma cell line, in particular with the SP20 / Ag line, according to conventional hybridization techniques, such as that with PEG1500 (Chagnaud et al., 1987, 1989a).
  • the hybrid cells are distributed in plate wells. After ten days, the supernatant of each well is tested for its ability to recognize the abovementioned antigens, in particular using immunoenzymatic techniques using the purified abovementioned autoantibodies.
  • hybridomas producing monoclonal immunoglobulins directed against each antigen is carried out according to the protocol conventionally described in
  • the invention also relates to polyclonal antibodies to the second generation monoclonals (or anti-idiotypes), capable of recognizing the first generation polyclonal or monoclonal antibodies described above, or even the autoantibodies present in the sera of patients carrying the virus. HIV type, and more particularly the autoantibodies belonging to the four categories described above.
  • polyclonal and monoclonal anti-idiotypes are obtained in particular according to the methods described above for obtaining the idiotypes, these methods being carried out using, as antigens, either the polyclonal or monoclonal idiotypes mentioned above, or the autoantibodies such as obtained according to the method described above from sera of patients carrying HIV type virus.
  • the subject of the invention is also a method of in vitro diagnosis of the infection of an individual by a virus of the HIV type, this diagnostic method comprising the following sequence of steps:
  • the in vitro diagnostic method makes it possible to monitor the progress of the infection of an individual carrying a virus of the HIV type.
  • the subject of the present invention is an in vitro diagnostic method allowing the evolutionary monitoring towards AIDS in an individual carrying an HIV virus and characterized in that it comprises a step of assaying the autoantibodies present in the biological sample taken from this individual, this assay being carried out using the abovementioned conjugates or anti-idiotypes.
  • the diagnostic method according to the invention makes it possible more particularly to distinguish the different stages of the evolution of infection by an HIV type virus, these different stages being able to be classified as follows: I Primary infection
  • HA subjects without biological abnormalities IIB subjects with biological abnormalities anemia, leukopenia, lymphopenia or T4 lymphopenia, thrombocytopenia, hypergammaglobulinemia, skin anergy.
  • biological abnormalities anemia, leukopenia, lymphopenia or T4 lymphopenia, thrombocytopenia, hypergammaglobulinemia, skin anergy.
  • Presence for at least three months of lymph nodes, of at least 1 cm in diameter in at least two extra-inguinal areas.
  • HLA subjects without biological abnormalities.
  • ⁇ iB subjects with biological anomalies anemia, leukopenia, lymphopenia or T4 lymphopenia, thrombocytopenia, hypergammaglobulinemia, cutaneous anergy.
  • Group IV is divided into 5 subgroups A General signs: One or more signs among which: fever, lasting more than a month; unwanted weight loss of more than 10% of usual body weight; diarrhea lasting more than a month.
  • Bl central disease meningitis, encephalitis, myelopathy.
  • B2 peripheral neuropathy Bl central disease (meningitis, encephalitis, myelopathy).
  • infections including: pneumocytosis; cryptosporidiosis; cerebral toxoplasmosis; isosporosis; esophageal candidiasis; bronchial or pulmonary; cryptococcosis; disseminated histoplasmosis; disseminated coccidioidomycosis; atypical mycobacteriosis; disseminated cytomegalovirosis; chronic cutaneous-mucous herpes; digestive, respiratory or disseminated herpes virosis; progressive multifocal leukoencephalitis.
  • C2 other infections, including: "hairy" leukoplakia of the oral cavity; shingles reaching several areas; recurrent salmonella sepsis; tuberculosis; oral candidiasis; nocardiosis.
  • the aforementioned in vitro diagnostic methods are carried out by detection and / or determination of at least two categories of autoantibodies capable of recognizing different molecules, in particular two categories of antibody chosen from the four categories defined above, this detection being itself carried out using molecules recognized by these autoantibodies and chosen from: - the aforementioned conjugates between on the one hand the compounds recognized by these autoantibodies, in particular fatty acids, and / or the compounds involved in the mechanism for anchoring proteins to cell membranes, and / or cholesterol and its derivatives and / or cysteine and its derivatives, as defined above, and, on the other hand, a carrier molecule of sufficient size to allow recognition of these compounds by said antibodies, and / or
  • a subject of the invention is also pharmaceutical compositions characterized in that they comprise at least one of the abovementioned anti-idiotypes, and / or at least one molecule capable of being recognized by the abovementioned autoantibodies, in particular a molecule chosen from the conjugates described above between a carrier molecule and fatty acids, and / or the compounds involved in the mechanism of anchoring proteins to cell membranes, and / or cholesterol and its derivatives and / or cysteine and its derivatives, such as defined above, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the invention relates more particularly to the use of at least one anti-idiotype and / or at least one conjugate mentioned above, for obtaining medicaments intended for the treatment of pathologies linked to the infection of an individual by a virus responsible for AIDS, or for preventing the development of the apparently healthy stage of an individual carrying an HIV virus, towards a pathological stage characteristic of declared AIDS.
  • the invention will be further illustrated with the aid of the detailed description which follows of obtaining conjugates and anti-idiotypes according to the invention, and of their specificities with respect to the autoantibodies present in the sera of patients carrying HIV type virus.
  • I - INTRODUCTION This study focused on three chemically defined hydrophobic molecules, acting either as an anchoring antigen for many cellular proteins, or as an essential constituent of the lipid bilayer: 1. myristic acid: Many proteins as precursors of the capsid of certain retroviruses (Towler et al., 1988) and picornaviruses (Kra ⁇ sich et al., 1990; Marc e
  • myristoylation of proteins takes place by the formation of a stable amide bond between myristic acid and the N-terminal glycine residue (Heuckeroth and Gordon, 1988; Oison, 1988; Gordon et al., 1991).
  • the object of this study was to reproduce this physiological situation by coupling myristic acid (A Myr) to the glycine groups of non-specific carrier proteins (bovine serum albumin: BSA, human serum albumin: S AH) for the purpose of '' identify autoantibodies specifically directed against this epitope.
  • BSA bovine serum albumin
  • S AH human serum albumin
  • the farnesyl residue is always covalently linked to a C-terminal cysteine: It allows the anchoring of certain proteins essentially with GTPase activity (Barracid et al., 1987; Fukada et al., 1990, Maltese et al. , 1990).
  • the farnesyl-cysteine compound (Far-cyst) was hung on bovine and human serum albumin. It was found by immunoenzymatic tests adapted to this type of conjugate:
  • T and B lymphocytes by HIV viral proteins which are capable of subsequently stimulating self-reactive T cells and the production of autoantibodies (Fujinami, 1988; Schattner, 1990); - formation of immune complexes including these antigens and induction of various disorders by deposition of these on different tissues (for example the central nervous system);
  • the conjugate is purified by dialysis.
  • the solutions obtained are transferred into dialysis tubes (Visking dialysis tube, Prolabo), the pores of which allow the uncoupled molecules to pass (PM ⁇ 12 to 14000 Da).
  • the 1st dialysis solution includes: 1/3 of DMF, 1/3 of methanol, 1/3 of phosphate buffer
  • the solution containing the conjugate is purified by dialysis for 24 hours.
  • the first dialysis is carried out against a mixture: 1/3 of methanol, 1/3 of DMF, and 1/3 of ÎO ' ⁇ M phosphate buffer containing 10 ⁇ 3 M CaCl2 salt.
  • Step 2 Application of human sera diluted 1/1000 in phosphate buffer 10- 2 M, 0.15 M NaCl, and 1 g BSA / 1 for 2 hours at 37 ° C; 1 rinse with 0.5% PS tween buffer; 3rd step:
  • the secondary antibodies labeled with peroxidase are diluted 1/10000 in PS tween - SAB buffer 1 g / 1 and applied for 1 hour at 37 ° C on the plates;
  • the optical density (OD) is read at 492 nm on a computerized Dynatech spectrophotometer.
  • the experimental value obtained is that measured on the wells covered with the fatty acid-SAB conjugate subtracted from that read on the wells covered with SAB alone.
  • the immunogen is purified by dialysis, the first bath consists of a v / v mixture of methanol, DMF, and phosphate 10 _3 M CaC12 10 ⁇ 3 M. Two other baths are made with phosphate buffer CaCl2. Tritiated cholesterol is used as a marker for the absorption reaction.
  • the coupling ratio varies between 10 and 30.
  • the protein concentration is determined by the Bradford method. Optimization of the enzyme immunoassay
  • optical density is read at 492 nm on a Dynatech spectrophotometer.
  • This enzyme immunoassay can also be performed as follows:
  • HIV pop 86 0.532 + L0.273 0.587 ⁇ 0.297 ⁇ 0.001
  • stage II total stage II 27 0.519 ⁇ 0.285 0.57 ⁇ 0.31 ⁇ 0.001 stage III 17 0.57. ⁇ 0.276 0.63. ⁇ 0.248 ⁇ 0.001 stage IV 30 0.532 ⁇ 0.285 0.59_ £ 0.342 ⁇ 0.001
  • the correlation test is considered statistically significant when the critical value prob ⁇ t is less than 0.05: - S: significant - NS: not significant 2) Analysis of 17 patients classified stage III correlations R prob ⁇ t tested
  • the correlation test is considered significant when the critical value prob ⁇ t is less than 0.05:
  • the correlation test is considered significant when the critical value prob ⁇ t is less than 0.05:
  • gag polyprotein precursor inhibits its proteolytic processing and virus production in a chronically infected human lymphoid cell fine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA ££, 2055-2059.
  • Myristic acid is attached to the transforming protein of Rous sarcoma virus during or immediately after synthesis and is present in both soluble and membrane-bound forms of the protein. Mol. Cell. Biol., 4, 2697-2704.

Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation d'une ou plusieurs molécules susceptibles d'être reconnues par des autoanticorps présents dans le sérum de patients porteurs de virus de type VIH, pour la mise en ÷uvre de méthodes de diagnostic in vitro de l'infection d'un individu par un virus du type VIH, ou pour l'obtention de médicaments destinés au traitement du SIDA.

Description

UTILISATION DE MOLECULES RECONNUES PAR DES AUTOANTICORPS DE SERUMS HUMAINS POUR LE DIAGNOSTIC OU LE TRAITEMENT DU SIDA
La présente invention à pour objet l'utilisation de molécules reconnues par des autoanticorps contenus dans les sérums de patients porteurs de virus du type VIH (Virus de l'Immunodéficience Humaine), pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro de l'infection d'un individu par un virus de type VIH, ainsi que pour l'obtention de médicaments destinés au traitement du SIDA (Syndrome de l'ImmunoDéficience Acquise).
L'invention concerne également ces molécules ainsi que les compositions pharmaceutiques les contenant.
L'invention a également pour objet les méthodes de diagnostic in vitro susmentionnées, ainsi que les kits, contenant lesdites molécules, pour la mise en oeuvre de ces méthodes de diagnostic.
Il a déjà été démontré que les infections virales sont à l'origine de processus autoimmuns (Fujinami et al., 1988; Schattner et al., 1990). Les travaux de Gabbiani ont rapporté l'existence d'anticorps anti-muscle lisse spécifiques de l'actine chez des patients infectés par le virus de l'hépatite (Gabbiani et al., 1973). D'autres auteurs ont noté la présence d' autoanticorps dirigés contre les filaments cytoplasmiques intermédiaires pouvant être induits par divers agents viraux comme le virus de la rougeole ou même celui de l'hépatite (Toh et al., 1979).
Certains travaux viennent appuyer l'hypothèse autoimmune dans le cadre de la physiopathologie du SIDA. C'est ainsi que des autoanticorps de différentes spécificités : anti-phospholipides, anti-noyau ou même anti-collagène dénaturé (Grant et al. , 1989) ont été mis en évidence dans les sérums de patients atteints de SIDA. Klaassen et al. (1990) ont décrit des autoanticorps anti-polynucléaires neutrophiles et anti-plaquettes très tôt lors d'infection par le virus VIH, dont la prévalence croît avec l'évolution de la maladie.
D'autres auteurs ont insisté sur les similarités structurales (mimétisme moléculaire) existant entre la gpl20 du VIH, le récepteur cellulaire CD4 et les antigènes d'histocompatibilité de classe II (CMH, Complexe Majeur d'Histocompatibilité). Ainsi les anticorps anti-gpl20 dirigés contre les régions homologues pourraient se comporter comme des anti-CMH, et participer ainsi au déficit immunitaire en bloquant certaines interactions nécessaires au bon fonctionnement du système immunitaire (Hoffmann, 1990; Kennedy, 1991; Kion et Hoffmann, 1991). Ainsi la production d'autoanticorps par un organisme infecté par un virus du type VIH reste très controversée, et les méthodes actuelles de diagnostic du SIDA procèdent par détection d'anticorps dirigés contre les virus du type VIH, à l'aide d'antigènes provenant de ces derniers. La présente invention a pour but de fournir de nouvelles méthodes de diagnostic in vitro du SIDA qui sont d'un prix de revient nettement moins élevé, pour une simplicité de mise en oeuvre et une fiabilité au moins égale à ceux des méthodes de diagnostic du SIDA actuellement sur le marché.
Un autre but de la présente invention est de fournir des méthodes de diagnostic in vitro du SIDA qui permettent le suivi de l'évolution clinique d'un individu porteur apparemment sain d'un virus de type VIH, vers un état pathologique, ainsi que le suivi pathologique.
L'invention a également pour but de fournir de nouveaux kits de diagnostic du SIDA, présentant d'excellentes conditions de conservation. L'invention a également pour but de fournir de nouveaux médicaments pour le traitement des états pathologiques liés à la déclaration du SIDA chez un individu, ou pour la prévention de l'apparition de ces états pathologiques chez les porteurs apparemment sains de virus du type VIH.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'une ou plusieurs molécules susceptibles d'être reconnues par des autoanticorps présents dans le sérum de patients porteurs de virus du type VIH, pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro de l'infection d'un individu par un virus du type
VIH, ou pour l'obtention de médicaments destinés au traitement du SIDA.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation d'une ou plusieurs molécules susceptibles d'être reconnues par des autoanticorps dirigés contre des structures antigéniques lipidiques et/ou comportant un groupe thiol, ce groupe étant le cas échéant substitué, ces autoanticorps étant présents dans le sérum de patients porteurs de virus de type VIH, pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro de l'infection d'un individu par un virus du type VIH, ou pour l'obtention de médicaments destinés au traitement du SIDA.
L'invention vise plus particulièrement l'utilisation susmentionnée d'une ou plusieurs molécules susceptibles d'être reconnues par des autoanticorps dirigés contre des structures antigéniques lipidiques.
A ce titre, les molécules utilisées dans le cadre de la présente invention sont avantageusement celles susceptibles d'être reconnues par des autoanticorps dirigés contre des structures antigéniques lipidiques, le cas échéant membranaires, et appartenant plus particulièrement à l'une des trois catégories suivantes susceptibles de reconnaître les composés décrits ci-dessous: - les anticorps dirigés contre des acides gras à chaîne linéaire ou ramifiée, saturés ou insaturés, ces acides gras comprenant notamment 4 à 22 atomes de carbone, de préférence 12 à 18 atomes de carbone, et plus particulièrement les anticorps dirigés contre l'acide myristique, l'acide laurique, l'acide oléique ou 1 ' acide palmitique ;
- les anticorps dirigés contre des composés impliqués dans le mécanisme d'ancrage des protéines aux membranes cellulaires, voire également dans le cytoplasme des cellules, ces composés intervenant, le cas échéant, en tant que métabolites dans la synthèse du cholestérol, et plus particulièrement contre des isoprénoïdes liés à une cystéine, notamment les isoprénoïdes de 6 à 20 atomes de carbone, tels que le farnésyl-cystéine, le géranyl-géranyl-cystéine, le mévalonate-cystéine et le dolichol-cystéine;
- les anticorps dirigés contre le cholestérol et ses dérivés, notamment contre le 7-déshydrocholestérol; L'invention vise plus particulièrement l'utilisation susmentionnée d'une ou plusieurs molécules susceptibles d'être reconnues par des autoanticorps dirigés contre des structures antigéniques comportant un groupe thiol, ce groupe étant le cas échéant substitué.
A ce titre, les molécules utilisées dans le cadre de la présente invention sont avantageusement celles susceptibles d'être reconnues par des autoanticorps dirigés contre des structures antigéniques, le cas échéant membranaires, comportant un groupe thiol, ce groupe étant le cas échéant substitué, lesdits autoanticorps étant plus particulièrement ceux appartenant à une quatrième catégorie, à savoir les anticorps dirigés contre la cystéine et ses dérivés, notamment ses dérivés de formule:
RlS-R2-CH(NH2)-R3 dans laquelle Rj représente H, CH3 ou HO3, R2 représente une chaîne hydrocarbonée de 1 à 10 atomes de carbone, ramifiée ou non, saturée ou non, R3 représente H ou COOH.
Par anticorps dirigés contre les composés susmentionnés, à savoir les acides gras, les composés impliqués dans le mécanisme d'ancrage des protéines cellulaires, le cholestérol et ses dérivés, et la cystéine et ses dérivés, cités ci- dessus, on entend les autoanticorps susceptibles de reconnaître ces composés, et ce plus particulièrement lorsque ces derniers sont liés ou adsorbés à des polypeptides porteurs (tels que l'albumine sérique humaine) dans l'organisme des individus porteurs de virus du type VIH, la taille de ces polypeptides porteurs conférant à ces derniers la propriété d'être suffisamment antigéniques pour permettre la reconnaissance de ces composés par lesdits autoanticorps. Ainsi la présente invention a pour objet les autoanticorps des quatre catégories décrites ci-dessus, et susceptibles d'être obtenus à partir de sérums de patients porteurs de virus de type VIH par chromatographie d'affinité à l'aide de supports sur lesquels sont greffés les composés susmentionnés. Les composés utilisés dans le cadre de la présente invention sont:
- soit des conjugués entre les composés reconnus par les autoanticorps susmentionnés et une molécule porteuse suffisamment antigénique pour permettre la reconnaissance desdits composés par ces autoanticorps,
- soit des anti-idiotypes (ou anticorps de deuxième génération) dirigés contre les idiotypes (ou anticorps de première génération) eux-mêmes dirigés contre les conjugués susmentionnés.
S 'agissant des conjugués susmentionnés, la molécule porteuse est soit celle naturellement liée dans l'organisme auxdits composés reconnus par les autoanticorps susmentionnés, notamment l'albumine sérique humaine, soit une molécule porteuse choisie parmi l'albumine sérique bovine ou autres polypeptides porteurs, le cas échéant synthétiques, tels que la polyL-lysine.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les conjugués entre, d'une part, un composé choisi parmi les acides gras, les composés impliqués dans le mécanisme d'ancrage des protéines aux membranes cellulaires, le cholestérol et ses dérivés, et la cystéine et ses dérivés, tels que définis ci-dessus et, d'autre part, une molécule porteuse antigénique choisie notamment parmi l'albumine sérique bovine, ou autres polypeptides porteurs.
Les méthodes de couplage entre lesdites molécules et la molécule porteuse, pour l'obtention de ces conjugués, sont notamment celles décrites dans Geffard et al., (1982).
A titre illustratif, le couplage entre lesdites molécules et la molécule porteuse peut être effectuée entre une fonction aminé de la molécule porteuse et une fonction carboxylique desdites molécules, ou à l'inverse, entre une fonction carboxylique de la molécule porteuse et une fonction aminé desdites molécules. Avantageusement, dans le cas des acides gras, notamment l'acide myristique, l'acide palmitique, ainsi que dans le cas des isoprénoïdes liés à une cystéine, notamment de la farnésyl-cystéine, la liaison avec la molécule porteuse est effectuée entre une fonction aminé de cette dernière et la fonction carboxylique des molécules susmentionnées Avantageusement, dans le cas de la cystéine et ses dérivés, la liaison avec la molécule porteuse se fait entre une fonction acide de cette dernière et la fonction aminé de ces molécules. A titre d'exemple de dérivés de la cystéine conjugués à une molécule porteuse (protéine) dans le cadre de la présente invention, on peut citer:
- la taurine anhydride succinique-protéine (TAS) de formule: HO3S-CH2- CH2-NH-CO-protéine, - la cystéine anhydride succinique-protéine (CAS) de formule: HS-CH2-
CH(COOH)-NH-CO-protéine.
Dans le cas du cholestérol et des ses dérivés, le couplage avec la molécule porteuse est avantageusement réalisé par l'intermédiaire du groupe hydroxyle du cholestérol. L'invention concerne également les anticorps polyclonaux ou monoclonaux susceptibles de reconnaître les conjugués susmentionnés.
Avantageusement le cholestérol et ses dérivés sont adsorbés sur les protéines porteuses.
Ces anticorps idiotypiques sont obtenus notamment de la manière suivante. S'agissant des anticorps polyclonaux, des animaux (lapins, souris, etc.) sont immunisés avec les conjugués susmentionnés, selon les méthodes d'immunisation classiques (notamment par mélange à de l'adjuvant complet de Freund, ou à de la gélose à 2 %). A titre illustratif les injections sous-cutanées des antigènes (à savoir des conjugués susmentionnés) aux animaux, sont faites toutes les deux à trois semaines, et les sérums des animaux sont prélevés dix jours après chaque série d'injection.
Les titres, affinités et spécificités des sérums obtenus seront appréciés par des tests immunoenzymatiques spécifiques, notamment du type de ceux utilisés à l'heure actuelle pour tester les sérums de malades atteints du SIDA. Les sérums des animaux présentant de bonnes réponses immunes sont purifiés selon des techniques classiques, notamment par précipitation au sulfate d'ammonium suivie de séparations par chromatographies sur colonne échangeuse d'ions, ou par filtration sur gel.
Les anticorps monoclonaux de première génération sont obtenus par prélèvement des lymphocytes spléniques sur les animaux précédemment immunisés et dont les sérums présentent une bonne réponse spécifique contre chacun des antigènes susmentionnés, ces lymphocytes spléniques étant ensuite hybrides avec une lignée de cellules myelomateuses appropriée, notamment avec la lignée SP20/Ag, selon les techniques d'hybridation classiques, telles que celle au PEG1500 (Chagnaud et al., 1987, 1989a).
Les cellules hybrides sont réparties dans des puits de plaques. Après dix jours, le surnageant de chaque puits est testé pour sa capacité à reconnaître les antigènes susmentionnés, notamment à l'aide des techniques immunoenzymatiques utilisant les autoanticorps susmentionnés purifiés.
La sélection des hybridomes producteurs d'immunoglobulines monoclonales dirigées contre chaque antigène (notamment contre les acides gras, le farnésyl-cystéine, le cholestérol et la cystéine et leurs dérivés, couplés à une molécule porteuse) est réalisée selon le protocole classiquement décrit dans
Chagnaud et al., 1987, 1989b, 1992, 1993a, 1993b.
L'invention concerne également les anticorps polyclonaux au monoclonaux de deuxième génération (ou anti-idiotypes), susceptibles de reconnaître les anticorps polyclonaux ou monoclonaux de première génération décrits ci-dessus, ou encore les autoanticorps présents dans les sérums des patients porteurs de virus du type VIH, et plus particulièrement les autoanticorps appartenant aux quatre catégories décrites ci-dessus.
Ces anti-idiotypes polyclonaux et monoclonaux sont obtenus notamment selon les méthodes décrites ci-dessus pour l'obtention des idiotypes, ces méthodes étant réalisées en utilisant en tant qu'antigènes, soit les idiotypes polyclonaux ou monoclonaux susmentionnés, soit les autoanticorps tels qu'obtenus selon le procédé décrit ci-dessus à partir de sérums de patients porteurs de virus du type VIH. L'invention a également pour objet une méthode de diagnostic in vitro de l'infection d'un individu par un virus du type VIH, cette méthode de diagnostic comprenant la succession d'étapes suivantes:
- mise en présence d'un échantillon biologique, notamment du sérum, prélevé chez un patient avec les molécules susmentionnées susceptibles d'être reconnues par les autoanticorps présents dans les sérums de patients porteurs de virus du type VIH, ces molécules étant avantageusement sous forme de conjugués tels que décrits ci-dessus, ou de préférence avec des anti-idiotypes susmentionnés;
- détection de la présence éventuelle d'anticorps reconnus par les conjugués ou les anti-idiotypes susmentionnés.
Selon un aspect particulièrement avantageux de l'invention, la méthode de diagnostic in vitro permet le suivi de l'évolution de l'infection d'un individu porteur de virus du type VIH.
Les inventeurs ont en effet mis en évidence que les doses des autoanticorps, notamment des autoanticorps des quatre catégories susmentionnées, dans les sérums des patients porteurs de virus du type VIH, reflètent l'état physiopathologique du patient et permettent de connaître le stade évolutif de la maladie chez ce dernier. En particulier, ces doses permettent de suivre l'évolution de l'état apparemment sain d'un individu porteur du virus du type VIH, vers l'état pathologique, et à l'intérieur même de ce dernier état, le suivi des différents stades d'évolution de cette pathologie.
A ce titre, la présente invention a pour objet une méthode de diagnostic in vitro permettant le suivi évolutif vers le SIDA chez un individu porteur de virus de type VIH et caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de dosage des autoanticorps présents dans l'échantillon biologique prélevé chez cet individu, ce dosage étant réalisé à l'aide des conjugués ou des anti-idiotypes susmentionnés. La méthode de diagnostic selon l'invention permet plus particulièrement de distinguer les différentes étapes de l'évolution de l'infection par un virus du type VIH, ces différentes étapes pouvant être classées de la manière suivante: I Primo-infection
Séroconversion prouvée, symptomatique ou non II Sans symptômes cliniques
HA sujets sans anomalies biologiques IIB sujets avec anomalies biologiques (anémie, leucopénie, lymphopénie ou lymphopénie T4, thrombopénie, hypergammaglobulinémie, anergie cutanée). m Syndrome lymphadénopathique chronique
Présence, pendant au moins trois mois de ganglions, d'au moins 1 cm de diamètre dans au moins deux aires extra-inguinales. HLA sujets sans anomalies biologiques. πiB sujets avec anomalies biologiques (anémie, leucopénie, lymphopénie ou lymphopénie T4, thrombopénie, hypergammaglobulinémie, anergie cutanée). IV Symptomatiques
Le groupe IV est divisé en 5 sous-groupes A Signes généraux: Un ou plusieurs signes parmi lesquels: fièvre, durant plus d'un mois; amaigrissement non désiré de plus de 10% du poids corporel habituel; diarrhée durant plus d'un mois.
B Signes neurologiques:
Bl atteinte centrale (méningite, encéphalite, myélopathie). B2 neuropathie périphérique.
C Infections opportunistes:
Cl : infections, parmi lesquelles: pneumocytose; cryptosporidiose; toxoplasmose cérébrale; isosporose; candidose oesophagienne; bronchique ou pulmonaire; cryptococcose; histoplasmose disséminée; coccidioïdomycose disséminée; mycobactériose atypique; cytomégalovirose disséminée; herpès cutanéo-muqueux chronique; herpès-virose digestive, respiratoire ou disséminée; leucoencéphalite multifocale progressive. C2: autres infections, parmi lesquelles: leucoplasie "velue" de la cavité bucale; zona atteignant plusieurs zones; septicémie à salmonelles récidivante; tuberculose; candidose buccale; nocardiose. D Infections malignes: parmi lesquelles: sarcome de Kaposi, lymphome malin non hodgkinien, lymphome malin cérébral isolé.
E Autres manifestations: parmi lesquelles: pneumopathie lymphoïde interstitielle chronique; manifestations ne pouvant être classées dans un des groupes précédents.
Avantageusement, les méthodes de diagnostic in vitro susmentionnées sont réalisées par détection et/ou dosage d'au moins deux catégories d' autoanticorps susceptibles de reconnaître des molécules différentes, notamment deux catégories d'anticorps choisis parmi les quatre catégories définies ci-dessus, cette détection étant elle-même réalisée à l'aide de molécules reconnues par ces autoanticorps et choisies parmi: - les conjugués susmentionnés entre d'une part les composés reconnus par ces autoanticorps, notamment les acides gras, et/ou les composés impliqués dans le mécanisme d'ancrage des protéines aux membranes cellulaires, et/ou le cholestérol et ses dérivés et/ou la cystéine et ses dérivés, tels que définis ci- dessus, et, d'autre part, une molécule porteuse d'une taille suffisante pour permettre la reconnaissance de ces composés par lesdits anticorps, et/ou
- les anti-idiotypes susceptibles de reconnaître les autoanticorps susmentionnés, notamment les anticorps des quatre catégories définies ci-dessus.
Les méthodes de diagnostic in vitro selon l'invention sont plus particulièrement caractérisées en ce qu'elles comprennent successivement les étapes suivantes:
- fixation des conjugués ou anti-idiotypes susmentionnés sur un support solide, notamment sur les parois de puits de plaques de microtitration;
- addition de l'échantillon biologique sur le support solide;
- rinçage du support solide; - addition d'anticorps marqués, notamment de manière radioactive ou enzymatique ou par fluorescence, susceptibles de reconnaître les complexes formés, lors de l'étape d'addition de l'échantillon biologique sur le support solide, entre les conjugués ou anti-idiotypes susmentionnés et les autoanticorps éventuellement présents dans l'échantillon biologique;
- rinçage du support solide;
- détection ou dosage des anticorps marqués susmentionnés. L'invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un des anti-idiotypes susmentionnés, et/ou au moins une molécule susceptible d'être reconnue par les autoanticorps susmentionnés, notamment une molécule choisie parmi les conjugués décrits ci-dessus entre une molécule porteuse et des acides gras, et/ou les composés impliqués dans le mécanisme d'ancrage des protéines aux membranes cellulaires, et/ou le cholestérol et ses dérivés et/ou la cystéine et ses dérivés, tels que définis ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L'invention vise plus particulièrement l'utilisation d'au moins un anti- idiotype et/ou d'au moins un conjugué susmentionnés, pour l'obtention de médicaments destinés au traitement des pathologies liées à l'infection d'un individu par un virus responsable du SIDA, ou à la prévention de l'évolution du stade apparemment sain d'un individu porteur de virus de type VIH, vers un stade pathologique caractéristique d'un SIDA déclaré. L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'obtention de conjugués et d' anti-idiotypes selon l'invention, et de leurs spécificités vis à vis des autoanticorps présents dans les sérums de patients porteurs de virus de type VIH. I - INTRODUCTION Cette étude a porté sur trois molécules hydrophobes chimiquement définies, intervenant, soit comme antigène d'ancrage pour de nombreuses protéines cellulaires, soit comme constituant essentiel de la bicouche lipidique : 1. l'acide myristique: De nombreuses protéines comme les précurseurs de la capside de certains rétrovirus (Towler et al., 1988) et picornavirus (Kraϋsich et al., 1990; Marc et al;
1990), la protéine VP2 du SV40 (Krauzewicz et al., 1990), les polypeptides M35 et M25 du virus de la vaccine (Franke et al., 1989), la tyrosine kinase p60src du virus responsable du sarcome de Rous (Buss et al., 1984) et d'autres enzymes subissent au cours de leur maturation co-translationnelle une myristoylation sur le résidu glycine N-terminal. Celle-ci leur permet ainsi de s'ancrer dans la bicouche lipidique et d'assurer leur fonction biologique. De plus, de nombreux travaux ont montré que les précurseurs polypeptides du VIH (pr55 gag, pr 190 gag-pol) ainsi que certaines protéines régulatrices (tat et nef) sont elles-mêmes myristoylées. In vitro, la perte de cette fonction empêcherait le virus de se répliquer et même de s'assembler (Tashiro et al., 1989; Bryant et Ratner, 1990; Bryant et al., 1991); 2. le farnésyl-cystéine: Plusieurs équipes ont montré que certaines protéines comme les p21 ras, la transducine subissent après leur synthèse l'addition d'un groupement isoprénoïde de 15 atomes de carbone appelé farnésyl (Barracid et al., 1990; Fukada et al., 1990). Ainsi, le résidu farnésyl a été trouvé comme élément d'ancrage toujours lié à une cystéine C-terminale, facilitant l'ancrage des protéines dans les membranes cellulaires. 3. le cholestérol:
Des travaux récents ont montré que l'entrée de virus à enveloppe utilise le cholestérol membranaire (Phalen et al., 1991).
Les résultats rapportés ci-dessous illustrent pour la première fois la présence dans les sérums de malades d' autoanticorps circulants dirigés contre : - l'acide myristique conjugué (A.Myr c) et ses analogues structuraux;
- le farnésyl-cystéine conjugué (Far-cyst c);
- le cholestérol (CHO).
II - RESULTATS OBTENUS
a) DETECTION ET CARACTERISATION D'AUTOANTICORPS ANTI-ACIDES GRAS CONJUGUES DANS LES SERUMS DE PATIENTS INFECTES PAR LE VIH
Dans la cellule, la myristoylation des protéines se fait par la formation d'une liaison amide stable entre l'acide myristique et le résidu glycine N- terminal (Heuckeroth et Gordon, 1988; Oison, 1988; Gordon et al., 1991). L'objet de cette étude a été de reproduire cette situation physiologique en couplant l'acide myristique (A Myr) aux groupements glycine de protéines porteuses non-spécifiques (sérum albumine bovine : SAB, sérum albumine humaine: S AH) dans le but d'identifier des autoanticorps spécifiquement dirigés contre cet épitope. Toutefois, les premières études ont montré que les résultats étaient identiques en utilisant un conjugué A Myr-glycine-porteur ou bien en couplant directement l'A Myr sur les résidus NH2 libres de la protéine porteuse. Cette étude à donc été restreinte à l'utilisation de conjugués acide myristique-porteur.
A l'aide de tests immunoenzymatiques (Geffard et al., 1985a et b) optimisés, prenant en compte le caractère hydrophobe de cette molécule, il a été trouvé: (i) des titres significativement élevés en autoantico s sériques anti-A Myr conjugué (c) sur une large population (n=98) de patients infectés par le VIH;
(ii) par ailleurs, nous avons noté que ces autoanticorps sont incapables de discriminer l'A Myr c, de l'acide palmitique conjugué (A Pal c) ou même de l'acide oléique conjugué (A Ole c). Toutefois ces immunoglobulines ne reconnaissent pas le conjugué choline glutaryl (C-AG c). Par conséquent et par souci de terminologie, ces autoanticorps sont désignés: "anti-acides gras conjugués".
b) DETECTION ET CARACTERISATION D'AUTO ANTICORPS ANTI-FARNESYLCYSTEINE CONJUGUE DANS LES SERUMS DE PATIENTS INFECTES PAR LE VIH
Comme mentionné plus haut, le résidu farnésyl est toujours lié covalemment à une cystéine C-terminale: Il permet l'ancrage de certaines protéines essentiellement à activité GTPasique (Barracid et al., 1987; Fukada et al., 1990, Maltese et al., 1990).
Le composé farnésyl-cystéine (Far-cyst) a été accroché sur des sérum albumine bovine et humaine. II a été trouvé par des tests immunoenzymatiques adaptés à ce type de conjugué:
(i) sur une large population de malades infectés par le VIH (n=98), des taux statistiquement élevés en auto-anticorps anti-Far-cyst c circulants;
(ii) parmi les molécules proches du Far-cyst susceptibles de présenter ce signal immunologique, on peut citer d'autres isoprénoïdes comme:
- le géranyl-géranyl, isoprénoïde à 20 atomes de carbone, décrit comme intervenant dans l'ancrage de certaines protéines cellulaires (Casey et al., 1991) et lié également à une cystéine dans les protéines;
- le mévalonate, composé précédent la synthèse du farnésyl; - le dolichol, isoprénoïde complexe.
c) DETECTION ET CARACTERISATION D'AUTO ANTICORPS ANTI-CHOLESTEROL "LIKE" DANS LES SERUMS DE PATIENTS INFECTES PAR LE VIH II a été trouvé dans les sérums de malades, selon un test immunoenzymatique décrit par Swartz et Alving (1988) mais modifié et adapté:
(i) un titre statistiquement élevé en autoanticorps anti-cholestérol sur une large population de malades (n = 98); (ii) ces autoanticorps dont le titre décroît en fonction de la dilution, discriminent parfaitement les divers analogues structuraux du cholestérol.
Ils ne reconnaissent que le cholestérol et le 7 déshydrocholestérol, alors que la vitamine D3, l'acétate de cholestéryl (estérification de la fonction hydroxyle en position 3 du cycle) et même le coprostane (5β-cholestane) ne sont pas du tout reconnus. Cette discrimination confère à ces immunoglobulines un caractère indéniable de spécificité .
Ces autoanticorps sont désignés par anti- "cholestérol like".
d) CONCLUSION
Ces autoanticorps circulants sont dirigés contre des structures antigéniques bien définies, lipidiques et membranaires. Ils sont le résultat de la sollicitation du système immunitaire par différents mécanismes possibles:
- mimétisme moléculaire: de nombreuses protéines virales et eucaryotes présentent ces antigènes d'ancrage, au moins en ce qui concerne les acides gras et le farnésyl-cystéine;
- activation des lymphocytes T et B par les protéines virales du VIH qui sont capables de stimuler dans un second temps des cellules T autoréactives et la production d' autoanticorps (Fujinami, 1988; Schattner, 1990); - formation de complexes immuns incluant ces antigènes et induction de désordres variés par dépôt de ceux-ci sur différents tissus (par exemple le système nerveux central);
- libération de cytokines en grande quantité pouvant être secondairement à l'origine de réponse autoimmune par présentation anormale de certains autoantigènes.
La formation d' autoanticorps dans le SIDA résulte de l'induction d'un ou plusieurs de ces mécanismes.
Mais, leur présence doit être très vraisemblablement corrélée avec les symptômes observés dans cette affection.
III - SYNTHESE DES DIFFERENTS IMMUNOGENES UTILISES DANS LES TESTS IMMUNOENZYMATIQUES QUI SUIVENT
a ) SYNTHESE DES CONJUGUES ACIDES-GRAS Cinq mg d'haptène (acide myristique ou acide palmitique) sont dissouts dans 500 μl de méthanol anhydre contenant 5 μl de triéthylamine anhydre (TEA,
Merck), accepteur de protons. Un μl de A. Pal (NEN), utilisé comme marqueur de la réaction de couplage, est ajouté au mélange. On laissse 30 minutes sous atmosphère sèche. On active cette solution avec 200 μl d'éthylchloroformate (ECF, Fluka) dilué au 1/16 dans du diméthylformamide (DMF, Prolabo) anhydre pendant 15 minutes à 4°C au sec. On rajoute 20 mg de protéines délipidées qui ont été préalablement dissoutes dans 2 ml de tampon phosphate 10"2M avec du sel CaCl2 10~3 M et 20 μl de TEA anhydre.
La réaction terminée, le conjugué est purifié par dialyse. On transfère les solutions obtenues dans des tubes de dialyse (Tube dialyse Visking, Prolabo), dont les pores laissent passer les molécules non couplées (PM < 12 à 14000 Da). Pour éliminer le maximum de molécules non couplées, la 1ère solution de dialyse comprend : 1/3 de DMF, 1/3 de méthanol, 1/3 de tampon phosphate
10"2M avec du sel CaCl2 à 10'^M. Deux autres dialyses sont faites avec une solution de tampon phosphate ÎO'-^M contenant du CaCl2 ÎO'-^M sur 24h. Le rôle du sel CaCl2 est de rendre les conjugués plus solubles par interaction des ions Ca2+ avec les chaînes aliphatiques. Mais ce tampon peut être remplacé par un tampon guanidine 10 mM pH7.
b) SYNTHESE DES CONJUGUES FARNESYL-CYSTEINE
La synthèse du farnésyl-cystéine est effectuée à l'aide des méthodes décrites dans les articles de Taba et Allen, 1978; Brown et al., 1991; Xue et al., 1991 et 1992; Yang et al., 1991.
5 mg de Far-cyst sont dissouts dans 1 ml de méthanol anhydre contenant 10 μl de TEA anhydre et 1 μl d'(^H) tyrosine (NEN), pour suivre la réaction de couplage. On active les COOH libres de la cystéine par addition de 200 μl d'ECF dilué au 1/16 dans du DMF anhydre pendant 15 minutes à 4°C. Puis, on rajoute une solution contenant 10 mg de protéines délipidées reprises dans 1 ml d'eau contenant 10 μl de TEA.
La solution contenant le conjugué est purifiée par dialyse pendant 24 heures. La première dialyse est faite contre un mélange : 1/3 de méthanol, 1/3 de DMF, et 1/3 de tampon phosphate ÎO'^M contenant du sel CaCl2 10~3 M.
c) SYNTHESE DES CONJUGUES CYSTEINE OU TAURINE ANHYDRIDE SUCCINIQUE
(i) synthèse des composés cystéine et taurine succinylés: 30 mg de cystéine ou taurine sont repris dans 1 ml H2O auquel sont ajoutés 10 mg d'anhydride succinique (AS). La réaction doit s'effectuer à pH neutre. Le mélange ainsi obtenu est mis à lyophiliser.
(ii) synthèse des conjugué cystéine- AS (CAS) et taurine- AS (TAS). Le protocole est exactement le même que celui employé pour l' activation des acides gras ou farnésyl-cystéine. Les dialyses sont seulement effectuées contre de l'eau.
IV - DEROULEMENT DES TESTS IMMUNOENZYMATIQUES UTILISES LORS DE CETTE ETUDE POUR LE DIAGNOSTIC IN VITRO
DU SIDA SELON L'INVENTION
a) TEST DE DETECTION D'AUTO ANTICORPS ANTI-FARNESYL- CYSTEINE CONJUGUE 1ère étape:
Revêtement des plaques de microtitration (Nunc, Polysorb) par une solution contenant 10 μg/ml de Far-cyst-SAB (SAB = Sérum Albumine Bovine)
(puits expérimentaux) dissout dans un tampon carbonate de sodium (0,05M) contenant du CaCl2 10_3M pH 9,6 et par une solution contenant 10 μg/ml de SAB (puits contrôles) toute la nuit à 4°C sous agitation lente et régulière;
Saturation des sites libres de fixation 1 heure à 37 °C avec du phosphate salé (PS) SAB 1 g/1;
2 rinçages avec du tampon PS; 2ème étape: Application des sérums humains dilués au 1/1000 dans du tampon phosphate 10-2M, NaCl 0,15 M, et SAB 1 g/1 pendant 2 heures à 37 °C; 1 rinçage avec du tampon PS tween 0,5 % ; 3ème étape:
Les anticorps secondaires marqués à la péroxydase (anti- immunoglobulines Ig humaines de type G ou M) sont dilués au 1/10000 dans du tampon PS tween - SAB 1 g/1 et appliqués pendant 1 heure à 37 °C sur les plaques;
3 rinçages avec du tampon PS tween; 4ème étape: Révélation des complexes antigène-anticorps humains-anti Ig humaines marquées par addition d'une solution de citrate (0,1 M) phosphate (0,1 M) contenant pour 20 ml, 1 mg d'orthophénilènediamine à 4% (OPD) et 20 μl d'H2θ2 (30 volumes). Après 10 minutes à l'obscurité, la réaction est stoppée par ajout de 50 μl d'H2S04 4N dans tous les puits de la plaque. La densité optique est lue à 492 nm par un spectrophotomètre multiscan informatisé. La valeur expérimentale obtenue est celle mesurée sur les puits expérimentaux soustraite à celle lue sur les puits contrôles. b) TEST DE DETECTION D'AUTO ANTICORPS ANTI-ACIDES GRAS CONJUGUES
1ère étape:
Revêtement des plaques de microtitration (Nunc, Polysorb) par 50 μg du conjugué acide gras-SAB dilué dans du tampon carbonate CaCl2 10~3 M pH
9,6 et d'une solution de SAB délipidée à la même concentration toute la nuit à 4°C;
2 rinçages avec du tampon phosphate salé CaCl2 (tp A); 2èroe étape: Application des sérums humains dilués au 1/2500 dans du tampon PS
CaCl2 SAB 1 g/1 (tp B) pendant 2 heures à 37 °C; 1 rinçage avec du tp A; 3ème étape:
Application d'une dilution (1/5000) d'anticorps anti-Ig humaines G ou M conjugués à la péroxydase dans du tp B pendant une à 37 °C;
3 rinçages avec du tp PS tween 0,5 % ; 4ème étape:
Révélation des complexes antigène-anticorps anti-acide gras anti-Ig humaines par addition d'une solution de citrate (0,1 M) phosphate (0,1 M ; pH 5) contenant pour 20 ml de ce même tampon 125 μl d'OPD à 4 % et 2,5 μl
H2O2 (30 volumes).
Après 10 min à l'obscurité, la réaction a été stoppée par ajout de 50 μl d'H2S04 4N dans tous les puits.
La densité optique (DO), est lue à 492 nm sur un spectrophotomètre Dynatech informatisé. La valeur expérimentale obtenue est celle mesurée sur les puits recouverts par le conjugué acide gras - SAB soustraite de celle lue sur les puits recouvert de SAB seule.
c) TEST DE DETECTION D'AUTO ANTICORPS ANTI- "CHOLESTEROL LIKE" (CHO) synthèse des conjugués
10 mg de CHO sont repris dans 5OO μl de méthanol anhydre et 500 μl de DMF anhydre. Lorsque le cholestérol est solubilisé, on ajoute 20 mg de sérum- albumine bovine délipidée reprise dans 1 ml de tampon acétate de sodium 3M. On vortexe le mélange pendant environ 3 minutes.
L'immunogène est purifié par dialyse, le premier bain est constitué d'un mélange v/v de méthanol, de DMF, et de phosphate 10_3M CaC12 10~3M. Deux autres bains sont faits avec du tampon phosphate CaCl2. On utilise le cholestérol tritié comme marqueur de la réaction d'absorption.
Le rapport de couplage oscille entre 10 et 30.
La concentration en protéines est déterminée par la méthode de Bradford. Optimisation du test immunoenzymatique
1ère étape:
Revêtement des plaques de microtitration (Nunc, Maxisorp) par une solution à 10 μg/ml de cholestérol dissout dans de l'éthanol absolu. Les plaques sont placées toute une nuit à 37 °C. 3 rinçages au tampon PS sont nécessaires. Les sites libres de fixation sont bloqués par addition de tampon PS SAB 5 g/1. 2ème étape:
Application des sérums humains dilués au 1/200 dans du tampon PS SAB 5 g/1 pendant 2 heures à 37 °C; 3 rinçages avec du tampon PS tween 0,5 % ;
3ème étape:
Application d'une dilution (1/10000) d'anticorps anti-Ig humaines G, M ou A conjugués à la péroxydase dans du tampon PS-SAB 5g/l pendant une heure à 37 °C; 3 rinçages avec du tampon PS-tween 0,5 % ;
4ème étape:
Révélation des complexes antigène-anticorps anti-cholestérol, anti-Ig humaines par addition d'une solution de citrate (0,1 M) phosphate (0,1 M ; pH 5) contenant pour 20 ml de ce même tampon 1ml d'OPD et 20 μl H2O2.
Après 10 min à l'obscurité, la réaction a été stoppée par ajout de 50 μl d'H2S04 4N dans tous les puits.
La densité optique (DO), est lue à 492 nm sur un spectrophotomètre Dynatech. Ce test immunenzymatique peut également être effectué comme suit:
- revêtement de la plaque avec 50 μg de CHO, avec dans les puits de contrôle la SAB délipidée dans du tampon carbonate pH 9,6 et CaC12, la nuit à 4°C sous agitation,
- 2 rinçages des plaques avec du tampon PS, dilution des sérums des malades au 1/1000 dans du tampon PS contenant de la SAB délipidée à 5 g/1, incubation 2 heures à 37°C,
- 2 rinçages avec du tampon PS, - les anticorps marqués à la péroxydase sont dilués dans du tampon PS- SAB 5g/l au 1/5000 et incubés 1 heure à 37°C,
- 3 rinçages avec du tampon PS-tween 0,05 % ,
- révélation des complexes secondaires avec pour 20 ml de citrate 500μl d'OPD (4g/100ml) et lOμl dΗ2O2 30 Vol.
V- ETUDE DES SIGNAUX ANTI-DERIVES SOUFRES CONJUGUES OBTENUS DANS LES SERUMS DE MALADES ATTEINTS DU SIDA
a) DETECTION D'AUTO ANTICORPS DIRIGES CONTRE LES CYSTEINE OU TAURINE CONJUGUEES
L'étude a porté sur 55 sérums contrôlés et 86 sérums de patients infectés par le VIH (tous stades confondus). Le tableau suivant montre les valeurs moyennes et leur écart-type des densités optiques reflétant les titres en autoanticorps anti-cystéine conjuguée (CAS) et anti-taurine conjuguée (TAS) d' isotype G sur les différents groupes de malades par rapport à une population de sujets sains : n TAS CAS significance Témoins 55 0,117^0,072 0,12^0,051
VIH pop 86 0,532+L0,273 0,587±0,297 < 0,001
totale stade II 27 0,519±0,285 0,57±0,31 <0,001 stade III 17 0,57.±0,276 0,63.±0,248 < 0,001 stade IV 30 0,532^0,285 0,59_£0,342 < 0,001
La répartition des densités optiques lues pour chaque patient infecté par le VIH et chaque sujet contrôle (Te) sur les conjugués taurine ou cystéine est représentée figure 1.
b) ANALYSE STATISTIQUE DES RELATIONS EXISTANT ENTRE LES DIFFERENTS SIGNAUX IMMUNOLOGIQUES SELON LE STADE EVOLUTIF DE LA PATHOLOGIE Cette étude a porté sur 27 patients VIH positifs classés stade II, 17 patients VIH positif classés stade III, et 30 patients VIH positif classés stade IV. La détection d' autoanticorps sériques circulants, par des tests immunoenzymatiques adaptés, a été effectuée sur les antigènes suivants : - Acide myristique conjugué (MYR) ;
- Acide palmitique conjugué (PALM) ;
- Farnésyl-cystéine conjugué (FAR) ;
- Cholestérol (CHO) ; - Taurine AS c'est à dire taurine couplée par l'anhydride succinique
(TAS);
- Cystéine AS c'est à dire couplée par l'anhydride succinique (CAS).
Tous les signaux détectés (correspondant à des densités optiques) ont été comparés entre eux comme le montrent les représentations graphiques ci-jointes.
Un coefficient de corrélation (R) et une significance (Prob <t) ont été déterminées à l'aide d'un programme statistique (Statworks). Ces données sont représentées dans les tableaux ci-joints :
D analyse sur 27 patients classés stade II corrélations R prob <t testées
CHO/MYR 0,278 0,122 NS
CHO/FAR 0,613 0,0001 S
CHO/CAS 0,785 0,000 S
CHO/TAS 0,713 0,000 S
CHO/PALM 0,373 0,063 NS
MYR/PALM 0,86 0,000 S
MYR/TAS 0,447 0,022 S
MYR/CAS 0,44 0,025 S
MYR/FAR 0,626 0,0001 S
FAR/CAS 0,87 0,000 S
TAS/FAR 0,887 0,000 S
TAS/CAS 0,98 0,000 s
PALM/TAS 0,585 0,002 S
PALM/CAS 0,608 0,000 s
PALM/FAR 0,69 0,000 s
Le test de corrélation est considéré comme statistiquement signatif lorsque la valeur critique prob < t est inférieure à 0,05: - S : significatif - NS : non significatif 2) Analvse sur 17 patients classés stade III corrélations R prob <t testées
CHO/MYR 0 1 NS
CHO/FAR 0,4 0,1 NS
CHO/CAS 0,619 0,008 S
CHO/TAS 0,547 0,023 S
CHO/PALM 0,157 0,546 NS
MYR/PALM 0,5 0,042 S
MYR/TAS 0,233 0,367 NS
MYR/CAS 0,281 0,161 NS
MYR/FAR 0,461 0,065 NS
FAR/CAS 0,64 0,006 S
TAS/FAR 0,674 0,000 S
TAS/CAS 0,98 0,000 S
PALM/TAS 0,07 0,789 NS
PALM/CAS 0,06 0,75 NS
PALM/FAR 0,18 0,49 NS
Le test de corrélation est considéré comme significatif lorsque la valeur critique prob <t est inférieure à 0,05 :
- S : sigmficatif - NS : non sigmficatif
corrélations R prob <t testées
CHO/MYR 0,15 0,426 NS
CHO/FAR 0,19 0,09 NS
CHO/CAS 0,547 0,008 S
CHO/TAS 0,594 0,000 S
CHO/PALM 0,21 0,135 NS
MYR/PALM 0,638 0,000 S
MYR/TAS 0,228 0,137 S
MYR/CAS 0,240 0,132 S
MYR/FAR 0,608 0,000 S
FAR/CAS 0,623 0,000 S
TAS/FAR 0,574 0,001 S
TAS/CAS 0,965 0,000 s PALM/TAS 0,327 0,02 S
PALM/CAS 0,514 0,03 S
PALM/FAR 0,748 0,000 S
Le test de corrélation est considéré comme significatif lorsque la valeur critique prob <t est inférieure à 0,05 :
- S : significatif - NS : non significatif
Une réponse significative IgG est observée chez les malades atteints de SIDA quelque soit le stade de la maladie.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une ou plusieurs molécules susceptibles d'être reconnues par des autoanticorps dirigés contre des structures antigéniques lipidiques et/ou comportant un groupe thiol, ce groupe étant le cas échéant substitué, ces autoanticorps étant présents dans le sérum de patients porteurs de virus de type VIH, pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro de l'infection d'un individu par un virus du type VIH, ou pour l'obtention de médicaments destinés au traitement du SIDA.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ces autoanticorps sont dirigés contre des structures antigéniques lipidiques, le cas échéant membranaires, lesdits autoanticorps appartenant plus particulièrement à l'une des trois catégories suivantes d'anticorps dirigés contre les composés décrits ci-dessous:
- les anticorps dirigés contre des acides gras à chaîne linéaire ou ramifiée, saturés ou insaturés, comprenant notamment 4 à 22 atomes de carbone, de préférence 12 à 18 atomes de carbone, et plus particulièrement les anticorps dirigés contre l'acide myristique, l'acide laurique, l'acide oléique ou l'acide palmitique;
- les anticorps dirigés contre des composés impliqués dans le mécanisme d'ancrage des protéines aux membranes cellulaires, voire également dans le cytoplasme des cellules, ces composés intervenant, le cas échéant, en tant que métabolites dans la synthèse du cholestérol, et plus particulièrement contre des isoprénoïdes liés à une cystéine, notamment les isoprénoïdes de 6 à 20 atomes de carbone, tels que le farnésyl-cystéine, le géranyl-géranyl-cystéine, le mévalonate-cystéine et le dolichol-cystéine;
- les anticorps dirigés contre le cholestérol et ses dérivés, notamment contre le 7-déshydrocholestérol, ces anticorps étant susceptibles de reconnaître les composés susmentionnés, notamment lorsque ces derniers sont liés ou adsorbés à une molécule porteuse d'une taille suffisante pour permettre la reconnaissance de ces composés par lesdits anticorps.
3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ces autoanticorps sont dirigés contre des structures antigéniques, le cas échéant membranaires, comportant un groupe thiol, ce groupe étant le cas échéant substitué, lesdits autoanticorps étant plus particulièrement ceux appartenant à une catégorie d'anticorps dirigés contre la cystéine et ses dérivés, notamment ses dérivés de formule:
RχS-R2-CH(NH2)-R3 dans laquelle Ri représente H, CH3 ou HO3, R2 représente une chaîne hydrocarbonée de 1 à 10 atomes de carbone, ramifiée ou non, saturée ou non, R3 représente H ou COOH, ces anticorps étant susceptibles de reconnaître les composés susmentionnés, notamment lorsque ces derniers sont liés ou adsorbés à une molécule porteuse d'une taille suffisante pour permettre la reconnaissance de ces composés par lesdits anticorps.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les méthodes de diagnostic in vitro de l'infection d'un individu par un virus du type VIH, sont réalisées par détection et/ou dosage d'au moins deux catégories d' autoanticorps susceptibles de reconnaître des molécules différentes, notamment deux catégories d'anticorps choisies parmi les quatre catégories définies dans les revendications 3 et 4, cette détection étant elle-même réalisée à l'aide de molécules reconnues par ces autoanticorps et choisies parmi:
- les conjugués entre d'une part les composés reconnus par ces autoanticorps, notamment les acides gras, et/ou les composés impliqués dans le mécanisme d'ancrage des protéines aux membranes cellulaires, et/ou le cholestérol et ses dérivés et/ou la cystéine et ses dérivés, tels que définis dans les revendications 2 et 3, et, d'autre part, une molécule porteuse d'une taille suffisante pour permettre la reconnaissance de ces composés par lesdits anticorps, et/ou - les anti-idiotypes susceptibles de reconnaître les autoanticorps susmentionnés, notamment les anticorps des quatre catégories définies dans les revendications 2 et 3.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les médicaments destinés au traitement du SIDA comprennent:
- au moins un conjugué entre d'une part les composés reconnus par les autoanticorps présents dans les sérums des individus porteurs de virus du type VIH, notamment les acides gras, et/ou les composés impliqués dans le mécanisme d'ancrage des protéines aux membranes cellulaires, et/ou le cholestérol et ses dérivés et/ou la cystéine et ses dérivés, tels que définis dansles revendications 2 et 3, et, d'autre part, une molécule porteuse d'une taille suffisante pour permettre la reconnaissance de ces composés par lesdits anticorps, et/ou , - des anti-idiotypes susceptibles de reconnaître les autoanticorps susmentionnés, notamment les anticorps des quatre catégories définies dans les revendications 2 et 3.
6. Anticorps anti-acide gras caractérisés en ce qu'ils sont présents dans les sérums d'individus porteurs de virus du type VIH, ces anticorps étant dirigés contre des acides gras à chaîne linéaire ou ramifiée, saturés ou insaturés, comprenant notamment 4 à 22 atomes de carbone, et de préférence 12 à 18 atomes de carbone, et plus particulièrement les anticorps dirigés contre l'acide myristique, l'acide laurique, l'acide oléique ou l'acide palmitique, ces anticorps étant susceptibles de reconnaître les composés susmentionnés lorsque ces derniers sont liés ou adsorbés à une molécule porteuse d'une taille suffisante pour permettre la reconnaissance de ces composés par lesdits anticorps.
7. Anticorps caractérisés en ce qu'ils sont présents dans les sérums de patients porteurs de virus du type VIH, et en ce qu'ils sont dirigés contre des composés impliqués dans le mécanisme d'ancrage des protéines aux membranes cellulaires, voire également dans le cytoplasme des cellules, ces protéines intervenant, le cas échéant, en tant que métabolites dans la synthèse du cholestérol, et plus particulièrement les anticorps dirigés contre des isoprénoïdes liés à une cystéine, notamment les isoprénoïdes de 6 à 20 atomes de carbone, tels que le farnésyl-cystéine, le géranyl-géranyl-cystéine, le mévalonate-cystéine et le dolichol-cystéine, ces anticorps étant susceptibles de reconnaître les composés susmentionnés lorsque ces derniers sont liés ou adsorbés à une molécule porteuse d'une taille suffisante pour permettre la reconnaissance de ces composés par lesdits anticorps.
8. Anticorps caractérisés en ce qu'ils sont présents dans le sérum de patients porteurs de virus du type VIH, et en ce qu'ils sont dirigés contre le cholestérol et ses dérivés, notamment contre le 7-déshydrocholestérol, ces anticorps étant susceptibles de reconnaître les composés susmentionnés lorsque ces derniers sont liés ou adsorbés à une molécule porteuse d'une taille suffisante pour permettre la reconnaissance de ces composés par lesdits anticorps.
9. Anticorps caractérisés en ce qu'ils sont présents dans le sérum de patients porteurs de virus du type VH, et en ce qu'ils sont dirigés contre la cystéine et ses dérivés, notamment ses dérivés de formule RιS-R2-CH(NH2)-R3 dans laquelle R représente H, CH3 ou HO3, R2 représente une chaîne hydrocarbonée de 1 à 10 atomes de carbone, ramifiée ou non, saturée ou non, R3 représente H ou COOH ces anticorps étant susceptibles de reconnaître les composés susmentionnés lorsque ces derniers sont liés ou adsorbés à une molécule porteuse d'une taille suffisante pour permettre la reconnaissance de ces composés par lesdits anticorps.
10. Conjugués entre, d'une part, une molécule choisie parmi les acides gras, et/ou les composés impliqués dans le mécanisme d'ancrage des protéines aux membranes cellulaires, et/ou le cholestérol et ses dérivés et/ou la cystéine et ses dérrivés, tels que définis dans les revendications 2 et 3, et, d'autre part, une molécule porteuse antigénique choisie notamment parmi l'albumine sérique bovine.
11. Anticorps polyclonaux ou monoclonaux susceptibles de reconnaître les conjugués selon la revendication 10.
12. Anti-idiotypes polyclonaux ou monoclonaux susceptibles de reconnaître les anticorps selon l'une des revendications 6 à 9, et/ou les anticorps selon la revendication 11.
13. Méthode de diagnostic in vitro de l'infection d'un individu par un virus du type VIH, cette méthode de diagnostic comprenant la succession d'étapes suivantes:
- mise en présence d'un échantillon biologique, notamment du sérum, prélevé chez un patient avec des conjugués selon la revendication 10, ou de préférence avec des anti-idiotypes selon la revendication 12;
- détection de la présence éventuelle d'anticorps reconnus par les conjugués ou les anti-idiotypes susmentionnés.
14. Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 13, permettant le suivi de l'évolution du SIDA chez un individu porteur de virus du type VIH, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de dosage de la quantité d' autoanticorps présente dans l'échantillon biologique prélevé, ce dosage étant réalisé à l'aide de conjugués selon la revendication 10, ou d' anti-idiotypes selon la revendication 12.
15. Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 13 ou la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle est réalisée par détection et/ou dosage d'au moins deux catégories d' autoanticorps susceptibles de reconnaître des molécules différentes, notamment deux catégories d'anticorps choisies parmi les quatre catégories définies dans les revendications 2 et 3, à l'aide d'au moins deux conjugués ou anti-idiotypes différents susceptibles de reconnaître respectivement un anticorps appartenant à l'une de ces catégories.
16. Méthode de diagnostic in vitro selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisée en ce qu'elle comprend successivement les étapes suivantes:
- fixation des conjugués ou anti-idiotypes sur un support solide, notamment sur les parois de puits de plaques de microtitration;
- addition de l'échantillon biologique sur le support solide;
- rinçage du support solide;
- addition d'anticorps marqués, notamment de manière radioactive ou enzymatique ou par fluorescence, susceptibles de reconnaître les complexes formés, lors de l'étape d'addition de l'échantillon biologique sur le support solide, entre les conjugués ou les anti-idiotypes susmentionnés et les anticorps anti-acide gras éventuellement présents dans l'échantillon biologique;
- rinçage du support solide;
- détection ou dosage des anticorps marqués susmentionnés.
17. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un des anti-idiotypes selon la revendication 11, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
18. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un conjugué entre d'une part les composés reconnus par les autoanticorps présents dans les sérums des individus porteurs de virus de type VIH, notamment les acides gras, et/ou les composés impliqués dans le mécanisme d'ancrage des protéines aux membranes cellulaires, et/ou le cholestérol et ses dérivés et/ou la cystéine et ses dérivés, tels que définis dans les revendications 2 et 3, et, d'autre part, une molécule porteuse d'une taille suffisante pour permettre la reconnaissance de ces composés par lesdits anticorps.
19. Utilisation d'au moins un des anti-idiotypes selon la revendication 11, et/ou d'au moins un conjugué entre d'une part les composés reconnus par les autoanticorps présents dans les sérums des individus porteurs de virus de type
VIH, notamment les acides gras, et/ou les composés impliqués dans le mécanisme d'ancrage des protéines aux membranes cellulaires, et/ou le cholestérol et ses dérivés et/ou la cystéine et ses dérivés, tels que définis dans les revendications 2 et 3, et, d'autre part, une molécule porteuse d'une taille suffisante pour permettre la reconnaissance de ces composés par lesdits anticorps, pour l'obtention de médicaments destinés au traitement des pathologies liées à l'infection d'un individu par un virus responsable du SIDA.
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