WO1994019696A1 - Procede pour mettre en evidence l'affinite du fibrinogene et de ses derives aux formes filamentaires de levures, utilisation dans le domaine de la determination des levures pathogenes notamment en hemoculture - Google Patents

Procede pour mettre en evidence l'affinite du fibrinogene et de ses derives aux formes filamentaires de levures, utilisation dans le domaine de la determination des levures pathogenes notamment en hemoculture Download PDF

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WO1994019696A1
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yeasts
forms
filamentary
yeast
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Application number
PCT/FR1993/000180
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Geneviève CONTANT-PUSSARD
Monique Debruyne
Jean Amiral
Jean-Luc Martinoli
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Diffusion Bacteriologie Du Var
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    • G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
    • G01N2333/75—Fibrin; Fibrinogen

Definitions

  • the present invention relates to a new method for demonstrating 1 • affinity of fibrinogen and its derivatives [ie fibrin and FDP which include fibrinogen degradation products (FgDP) and fibrin degradation products (FnDP )] to filamentary forms of yeast.
  • Candida albicans are those which are encountered most often in cases of candidiasis and that they represent approximately 50% of the cases of positive blood cultures; we also know that the strains of Candida glabrata (old nomenclature: Torulopsis glabrata) have become the second agent, in order of importance, of septicemia, and that strains of Candida tropica ' lily and Candida krusei are at the origin of the others cases of candidiasis encountered in pathology.
  • infectious agents are also known which are also frequently isolated and which are constituted by strains of Trichosporon and Cryptococcus (in particular strains of Cryptococcus neoformans) whose incidence is increasing more and more in patients suffering from the syndrome of acquired immunodeficiency (AIDS).
  • AIDS acquired immunodeficiency
  • a new method is recommended to demonstrate the possible affinity of a substance (F) chosen from the group consisting of fibrinogen (Fg), fibrin
  • this process may only include steps (2 °) to (4 °), step (1 °) being able to be suppressed when a sample containing yeasts is available, essentially consisting of blastospores with one concentration greater than or equal to 10 * yeasts / ml, and preferably at a concentration of not less than 10 5 yeasts / ml, and essentially devoid or depleted substance which may interfere in the adhéren- that o f said substance mechanism (F) said yeasts.
  • the method according to the invention for demonstrating the possible affinity of a yeast strain is useful in determining the affinity of a substance (F) with respect to the filamentary forms of yeast strains in the therapeutic area in cli- human or veterinary, in the agricultural and food fields.
  • a method for determining the pathogenic or non-pathogenic character of yeast strains to be tested, characterized in that it comprises
  • FDP ethylenediaminotetraacetic acid
  • FBF fibrinogen fixing factor (or fibrinogen fixing factor) [from English:” fibrino-gen-binding factor "; other French nomenclature: FFF]
  • FDP product of degradation of fibrinogen or fibrin [other French nomenclature: PDF]; the expression FDP generally includes the specific degradation products of fibrinogen / fibrin, namely the fragments D, E, X and Y, on the one hand, and the overall degradation products of fibrinogen / fibrin, of somewhere else ; unless otherwise stated,
  • Fn fibrin
  • FnDP degradation products of fibrin [other French nomenclature: PDFn]
  • GT germ tubes [in English: “germ-tubes”; other French nomenclature: TG]
  • filamentary forms is understood here the whole constituted by the germinative forms, which are essentially constituted by the GTs, and the • filamentous forms, which are essentially constituted by PMy and My.
  • strains of yeast which filament means all the strains which give GT, PMy and My, on the one hand, and strains which give rise to a pseudofilamentation, on the other hand.
  • the BL multiplication medium and the fila ⁇ menting medium of said BL are devoid or essentially depleted of substance (s) which can interfere with said substance (F) during the production of the 'step (3 e ).
  • substance (s) which can interfere with said substance (F) during the production of the 'step (3 e ).
  • fibrinogen and its derivatives namely:
  • interfering substances listed above or some of them may be present in whole blood or blood plasma, on the one hand, as well as in the yeast samples which have been taken, on the other hand.
  • blood and plasma generally contain fibrinogen and, where appropriate, one or more of its derivatives, and in particular in pathological cases of inflammation proteins and / or anti (yeast) antibodies [in particular anti ( Candida) in cases of candidiasis]; and samples of yeast strains of the Candida family may contain an antifungal compound such as cycloheximide which inhibits most yeasts and in particular Candida with the exception of strains of Candida albicans and some strains of Candida zeylanoides (see for this purpose the French patent application No. 90 03 726 of March 23, 1990 of the plaintiff).
  • interfering substance (s) is avoided in the nutrient medium for multiplying BLs and in the nu ⁇ tritive medium for filamentation of BLs already multiplied by means of the appropriate choice of said nutrient media. Furthermore, depending on the origin of the yeast sample to be tested, it may be imperative to dilute said sample to deplete it with interfering substance (s).
  • the nutrient media for multiplication and lamentation can be liquid (ie aqueous media called homogeneous or monophasic) or heterogeneous (ie aqueous media containing one or more solids and said two-phase).
  • Multiplication and fila ⁇ mentation can be carried out aerobically or anaerobically.
  • Preferred according to the invention are aerobic monophasic aqueous media.
  • blood culture the fungal blood culture
  • a blood sample whole blood or plasma
  • a nutritive multiplication and / or filamentation medium Generally such a medium is Sabouraud medium or trypticase-soy medium, supplemented with SPS, EDTA or sodium citrate.
  • SPS swine serum
  • EDTA EDTA sodium citrate
  • the duration of the step (1 °) is generally less than or equal to 48 h at a temperature between 25 and 40 e C, preferably 37 e C, when said step (I e ) is carried out.
  • the multiplication medium of step (I e ) will advantageously be an aerobic aqueous medium.
  • said nutritive medium for multiplying BL may advantageously comprise a substance, which (i) does not affect the growth of yeasts, (ii) is inert with respect to of the affinity of the filamentary forms for substance (F), and (iii) lysis of erythrocytes, leukocytes and macrophages to release the vitamins and growth factors contained in said erythrocytes, on the one hand, and for release any yeasts that fix or immobilize said leukocytes and macrophages, on the other hand.
  • lysing substances of this type which are suitable, mention may in particular be made of detergents such as saponin.
  • saponin this substance occurs at a concentration of 0.1 to 12 g / 1 (preferably 0.2-0.4 g / 1) in the nutrient medium.
  • the preferred anticoagulant is heparin.
  • Sodium citrate and EDTA are not suitable as anticoagulant means, in the sense that they are capable of inhibiting the development of filamentary forms.
  • step (2 e ) is the filamentation of the BLs to obtain the filamentary forms.
  • the filamentation of step (2 e ) is carried out for a period of at least 1 hour at 25-40 "C to obtain the filamentary forms chosen from the group comprising the germinative forms and filamentous forms in the case of yeast strains which filament, or blastospore-spherule forms in the case of yeast strains which give rise to pseudofilamentation.
  • nutrient media which are suitable for carrying out the filamentation of step (2 e ), there are may in particular cite synthetic blastesis media and in particular those conventionally used for the identification of isolated strains of Candida.
  • the nutritive multiplication medium may contain, in particular in the context of a blood culture:
  • an anticoagulant agent preferably heparin
  • the bringing into contact of step (3 e ) is an incubation for at least 0.5 h at 37 e C of the filamentary forms with said substance (F) previously fixed on an inert support.
  • the duration of the step (3 e ) will generally be between 0.5 h and 4 h at 37 "C and advantageously between 1 h and 3 h at 37 e C. In practice, a duration of 1 h to 37 ° C will be sufficient for most of the yeast strains to be tested which filament, and a period of 1 to 3 h at 37 ° C will be used for the strains which give a pseudofilamentation such as Candida glabrata.
  • the substance (F) intervening at step (3 e ) is chosen from fibrinogen and its derivatives (Fn, D, E, FDP, in particular FgDP and FnDP).
  • step (4 e ) comprises a reading operation chosen from the group consisting of:
  • Solution II is an effective technique for determining affinity according to the invention.
  • Observation (b) implements the agglutination of a filamentary-F-support complex and preferably the complex
  • GT-FDP-latex Depending on the choice of latex, the determination can be either qualitative or quantitative. With latex beads having a diameter greater than 1 micrometer and on which the substance (F) is fixed, a qualitative agglutination is obtained. With submicron latex beads having a diameter of less than 1 micrometer and on which the substance (F) is fixed [preferably the latex beads described in the international PCT application published WO-A-90/08 321] a quantitative agglutination is obtained. According to technical solution II, there is qualitatively observed (i) agglutination on the macroscopic scale only with the naked eye, or (ii) agglutination on the microscopic scale by measuring the variation in OD. When the support consists of latex beads, it acts as a means "amplifying" the result of the agglutination reaction.
  • Solution III is a technique also effective for determining the affinity according to the invention. It is based on an enzymatic mechanism.
  • observation (c) implements the use of an enzyme substrate specific for enzymes having leucine activity.
  • arylamidase By "enzyme having leucine-arylamidase activity” is meant the enzymes which cleave into -L-Leu-OH and HR, the amino acid, dipeptide, tripeptide or tetrapeptide substrates ending at the CO end -terminal by a remainder
  • Leu is the leucyl residue of the CO-terminal end and R is pNA or a chromogenic group analogous to pNA, such as the p-nitroanilino residues comprising a substituent on the phenyl nucleus (in particular Cl, Br , F, CH or OCH 3 ) and described in EP-A-0 110 306.
  • the enzymes having such a leucine-aryla idase activity are enzymes characteristic of yeasts found in particular in filamentary forms.
  • the enzyme substrate that is preferred according to
  • 1'invention is an amino acid substrate, namely: H-L-Leu-pNA.
  • the method of determination by enzymatic route comprises the stages consisting of - using an appropriate support (in particular a microplate for titration or a set of cuvettes),
  • the affinity F / filamentary forms is manifested only for the yeast strains which are pathogenic.
  • the affinity Global FgDP / GT or Global FnDP / GT is a quick, efficient and reliable way to determine whether or not yeast strains to be tested are pathogenic.
  • a method is recommended for determining the pathogenic or non-pathogenic character of yeast strains to be tested, characterized in that it comprises
  • the multiplication of blastos ⁇ pores in step (I e ) and / or the filamentation of said blastospores in step (2 e ) by blood culture are carried out in a liquid medium, preferably aerobic, from a blood or plasma sample containing yeast strains to be tested and previously diluted according to a dilution of x _x where x is a number greater than or equal to 50, to essentially eliminate any interference with other substances contained in the blood or plasma and which may interfere in the adhesion mechanism of said substance (F) on said yeasts, the interfering substances being capable of comprising in particular Fg, Fn, FgDP and FnDP, on the one hand, and the inflammation proteins, the anti-fungal compounds which may have been administered, anti antibodies (Candidate, on the other hand.
  • a liquid medium preferably aerobic
  • the technical solution recommended by the invention is particularly well suited to determining the pathogenic or non-pathogenic character of the yeast strains which filament to give GT, PMy and My.
  • the blastospores contained in a sample of yeast strains to be tested are multiplied, in particular a sample of whole blood or blood plasma, in a BL multiplication medium which is aqueous, aerobic and constituted by a Shadomy medium enriched in yeast extract (where said yeast extract is at a concentration of 1 to 4 g / 1) and supplemented with saponin (0.2-0.4 g / 1), heparin, urea and, where appropriate, means antibacterial, for a period less or equal to 48 h at 37 e C and at pH 7.0-7.5, the plasma or blood sample is diluted by means of said multiplication medium to a x dilution -1 (where x is a number greater than or equal to 50), so as to obtain a population greater than or equal to 10 5 yeasts / ml.
  • a BL multiplication medium which is aqueous, aerobic and constituted by a Shadomy medium enriched in yeast extract (where said yeast extract is at a concentration of 1 to 4
  • the blastospores obtained according to step (I e ) or its aforementioned variant are filamented, in an aerobic aqueous medium constituted by the non-enriched and non-supplemented Shadomy medium, for 1-4 h at 37 e C and at pH 7.0-7.5, so as to obtain a sufficient volume of GT.
  • Stage (3 )
  • step (2 e ) A sample of the medium containing GT obtained at the end of step (2 e ) is incubated with a reagent (FDP-latex) consisting of latex beads coated with global FDP (global FgDP or global FnDP), during minus 1 h at 37 ° C and pH 7.0-7.5. Step (4 e ) The formation of the resulting complex is observed
  • Examples 1 to 5 relate to tests in a so-called purified system
  • Examples 6 to 9 relate to tests in the plasma system (whole blood or plasma).
  • the incubate is taken at different times and placed in the presence, for 2 h at 37 "C, of fibrin covalently attached to a microtiter plate so as to study the affinity of the yeasts for fibrin.
  • 199 IP is not an appropriate filament medium, as demonstrated below.
  • Yeast forms OD incubation time (at 37 "C (at 405 nm) and at pH 7.0-7.5)
  • rare neopeptone rare budding BL forms rare GT
  • Fg and its derivatives were evaluated with respect to the filamentary forms of various yeasts, according to the operating methods described in Example 3 above, in function of the inoculum.
  • the BLs of various strains of reference yeast (from recognized collections) and isolates (from clinical samples) are multiplied in an aerobic aqueous medium consisting of enriched Shadomy medium (yeast extract at 2 g / 1) and supplemented with urea (2 g / 1), saponin (0.2 g / 1), heparin and ampicillin, for 18 h at 37 "C and at pH 7.0-7.5; filamentation of the blastospores thus obtained, in an aerobic aqueous medium constituted by the normal Shadomy medium, for 1-4 h at 37 "C and at pH 7.0-7.5, to obtain the GT forms (or their analogs blastospores- spherules), strains subjected to filamentation (or pseudofilamentation) having a popula- tion of 10 5 to 10 6 yeasts / ml.
  • enriched Shadomy medium enriched Shadomy medium
  • saponin 0.2 g / 1
  • heparin and ampicillin for 18 h
  • resulting filamentation medium which contains GT (or analogs thereof called) to wells of microtiter plates coated with covalently Fg, then allowed to incubate for 1-3 h at 37 e C. then assesses affinity revealed by the HL-Leu-pNA substrate by the variation of OD at 405 nm.
  • the results obtained are recorded in Tables Va (reference strains) and Vb (isolate strains) below.
  • Candida albicans 2 Candida albicans 0 Candida tropicalis 0
  • Candida kr ⁇ isei 1 Candida krusei 0
  • Candida glabrata 1 Candida glabrata 0
  • Candida parapsilosis 0
  • Rhodotorula 1
  • Rhodotorula 0
  • Trichosporum 1
  • Cryptococcus 1
  • Cryptococcus 0
  • Saccharomyces 0
  • the plasma sample blood plasma or whole blood
  • an anti-coagulant means in the minute following the blood test, then diluted then by means of enriched Shadomy medium (yeast extract 2 g / 1) and supplemented with saponin (10 g / 1), urea (2 g / 1) and ampicillin.
  • filamentai ⁇ res essentially consist here of GT was contacted samples of filamentation medium (as obtained after culturing for 4 hours at 37 e C and pH 7 7,0-, 5) with the FDP-latex reagent of Example 6 for 1 h at 37 "C and at pH 7.0-7.5.
  • affinity is not brought to the fore for the yeast forms themselves, that is to say the blastospores.
  • affinity is specific for the filamentary forms of the yeasts tested and more mainly the GTs of said yeasts.
  • the filamentary forms are covered by the FDP-latex reagent (adhesion of said reagent)
  • Candida strains are recorded in Table VIII below. It is noted, as in Example 7, that the affinity is not demonstrated for the yeast forms properly speaking. say, that is to say the blastospores. On the other hand, the affinity is specific for the fila ⁇ mentary forms of the yeasts tested and more mainly the GTs of said yeasts. The advantage of separating the multiplication stage (if necessary) from the filamentation stage is also confirmed. TABLE VIII Influence of the concentration of yeasts

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Abstract

La présente invention a trait à un procédé pour mettre en évidence l'éventuelle affinité d'une substance (F) choisie parmi l'ensemble constitué par Fg, Fn, FDP et leurs mélanges, vis-à-vis des formes filamentaires de souches de levures, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (1°) cultiver (A) un échantillon contenant des levures à tester essentiellement sous forme de blastospores, susceptible de contenir au moins une substance pouvant interférer dans le mécanisme d'adhérence de ladite substance (F) sur lesdites levures et convenablement dilué pour éliminer essentiellement toute interférence dans ledit mécanisme, dans (B) un milieu nutritif favorisant la multiplication des blastospores jusqu'à ce que l'on obtienne une population supérieure ou égale à 104 levures/ml; (2°) cultiver les blastospores de levures, ainsi obtenues, dans un milieu nutritif favorisant la filamentation; (3°) mettre en contact les formes filamentaires, ainsi obtenues, avec une substance (F) choisie parmi l'ensemble constitué par le fibrinogène, la fibrine, les FDP et leurs mélanges; puis (4°) apprécier l'adhérence ou la non-adhérence de ladite substance (F) sur lesdites formes filamentaires. Ce procédé est utile pour distinguer les levures pathogènes des levures non-pathogènes.

Description

Procédé pour mettre en évidence l 'affinité du fibrinogène et de ses dérivés aux formes filamentaires de levures, utilisation dans le domaine de la détermination des levures pathogènes notamment en hémoculture
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention a trait à un nouveau procédé pour mettre en évidence 1•affinité du fibrinogène et de ses dérivés [i.e. la fibrine et les FDP qui comprennent les produits de dégradation du fibrinogène (FgDP) et les produits de dégradation de la fibrine (FnDP)] aux formes filamentaires de levures.
Ce procédé permet de distinguer les souches de levures affines qui fixent le fibrinogène et ses dérivés sur leurs formes filamentaires, notamment leurs formes germinatives qui comprennent les tubes germinatifs [en anglais : "germ-tubes"], des souches de levures non- affines qui ne fixent pas le fibrinogène et ses dérivés sur lesdites formes filamentaires. L'invention concerne également 1*utilisation de ce procédé dans le domaine de la détermination de l'affinité des levures, d'une part, et dans le domaine de la détermination des levures pathogènes, notamment en hémoculture, en particulier pour distinguer avantageu- sèment les souches de levures qui sont pathogènes de celles qui sont non-pathogènes, d'autre part. Une telle utilisation est particulièrement intéressante dans le domaine thérapeutique en clinique humaine ou vétérinaire, dans le domaine agricole et dans le domaine alimentaire. ART ANTERIEUR
On sait que, parmi les agents infectieux qui ont été observés en pathologie, les levures jouent un rôle important et que leur influence est malheureusement en nette progression. On sait en particulier que les souches de Candida albicans sont celles que 1'on rencontre le plus souvent dans les cas de candidoses et qu'elles représentent environ 50 % des cas des hémocultures positives ; on sait également que les souches de Candida glabrata (ancienne nomenclature : Torulopsis glabrata ) sont devenues le second agent, par ordre d'importance, des septicémies, et que des souches de Candida tropica'lis et Candida krusei sont à 1'origine des autres cas de candidoses rencontrés en pathologie. On connait par ailleurs d'autres agents infectieux qui sont également fréquemment isolés et qui sont constitués par des souches de Trichosporon et de Cryptococcus (notamment les souches de Cryptococcus neoformans) dont l'incidence augmente de plus en plus chez les patients atteints du syndrome d'immuno-déficience acquise (SIDA).
Il se trouve que les diagnostics clinique et biologique des candidoses disséminées qui sont associées de façon croissante à 1*immuno-dépression induite notamment par une thérapeutique ou une pathologie, ont une importance capitale sur le pronostic vital du malade. Or, le diagnostic des candidoses profondes soulève de nombreux problèmes essentiellement liés à une absence de spécificité des signes cliniques, à 1'insensi¬ bilité des hémocultures conventionnelles (négativité dans plus de 50 % des cas), à l'inaptitude de distinguer la colonisation de l'invasion, aux faibles sensibilité et fiabilité des méthodes sérologiques, et à la fugacité de
• la présence des antigènes solubles. En particulier, il se trouve que 5% des souches pathogènes de Candida albicans ne sont pas détectées par le test de blastèse après hémoculture ou tout autre isolement, dès lors que leurs blastospores ne donnent pas de tubes germinatifs dans les conditions usuelles de filamentation. Par ailleurs, les souches de levures conservées dans les collections et qui sont réputées pathogènes peuvent perdre leur caractère pathogène par repiquages successifs.
On sait par ailleurs, (a) des articles de P.A. MAISCH et al.. Infect . Immun . , 1980, 21_ (No 2), 650-656 et 1981, 31 (No 1), 92-97, (b) de l'article de L.P. SAMARANAYA E et al., Mycopathologia, 1988, 102, 135-138, (c) des articles de A. BOUALI, R. ROBERT, G. TRONCHIN et J.M. SENET, J. Med. Vet . Hycol . , 1986, 24, 345-348 et J. Gen . Microbiol . , 1987, 133, 545-551, et (d) de l'article de G. TRONCHIN, R. ROBERT, A. BOUALI et J.M. SENET, J in . Inst . Pasteur /Hier obiol . , 1987, 138, 177-187, que des souches de Candida albicans et, à un degré moindre d'autres espèces de levures appartenant notamment à l'ensemble des Candida peuvent fixer le fibrinogène (Fg) ou son dérivé, la fibrine (Fn) . Selon le premier article P.A. MAISCH et al., neuf isolats de levures ont été testés en ce qui concerne leur adhérence à des matrices fibrino-plaquettaires [en anglais : "fibrin-platelet matrices" (c'est-à-dire ici des caillots de fibrine-plaquettes, en anglais : "fibrin- platelet clots")], à savoir deux souches isolées de Candida albicans, une souche isolée de Candida stellatoidea, une souche isolée de Candida tropicalis, une souche isolée de Candida parapsilosis, une souche isolée de Candida pseudotropicalis, une souche isolée de Saccharomyces cerevisiae, une souche isolée de Candida guillermondii et une souche isolée de Candida krusei , et les résultats obtenus figurent dans le tableau 4 de la page 654. Ce tableau montre que (i) toutes les souches testées se fixent sur les matrices fibrino-plaquettaires, qu'elles soient présumées pathogènes (surtout les souches de Candida albicans, Candida glabrata et à la rigueur les souches de Candida tropicalis, Candida parapsilosis et Candida pseudotropicalis) ou réputées généralement peu pathogènes ou non-pathogènes (les souches de Candida krusei , Saccharomyces cerevisiae et Candida guiller- mondii), et (ii) la fixation ou adhérence est plus ou moins importante en fonction de la nature de la souche testée. Enfin cet article n'enseigne pas comment distin- guer les souches de levures pathogènes des souches de levures non-pathogènes.
Selon l'article de L.P. SAMARANAYAKE et al., l'adhérence à des caillots de fibrine de six souches isolées de Candida a été étudiée, à savoir trois souches isolées de cavités orales de patients atteints de stomatite : Candida albicans, Candida krusei et Candida guillermondii , d'une part, et trois souches de référence provenant d'une collection : Candida parapsilosis, Candida glabrata et Candida tropicalis, d'autre part. Les résultats obtenus, consignés dans le tableau 1 de la page 136, conduisent aux mêmes conclusions que celles énumérées ci-dessus pour les résultats de P.A. MAISCH et al.
Par ailleurs, les techniques opératoires fournies par les articles de P.A. MAISCH et al., d'une part, et l'article de L.P. SAMARANAYAKE et al., d'autre part, à la différence de la solution technique préconisée par la présente invention, ne permettent pas de distinguer les souches de levures qui sont pathogènes des souches de levures qui ne sont pas pathogènes.
De plus, les modalités opératoires qui figurent dans lesdits articles de P.A. MAISCH et al., d'une part,
• et de L.P. SAMARANAYAKE et al., d'autre part, ne permettent pas de préciser clairement les formes des souches qui ont été testées, à savoir les formes levures proprement dites (i.e. les blastospores ou blastoco- nidies) qui ne conviennent pas dans le procédé de l'invention, et les formes filamentaires qui compiennent les formes germinatives (i.e. les tubes ger inatifs) et les formes filamenteuses (i.e. le pseudomycélium et le mycélium) et qui elles conviennent selon le procédé de 1*invention.
Les articles précités de A. BOUALI et al., qui sont plus précis en ce qui concerne la mention des formes testées, ont trait à l'adhérence du fibrinogène sur les blastospores, les levures et le mycélium de souches de Candida albicans. Selon le second article de A. BOUALI et al., (i) le fragment D (qui est un FDP particulier) a une plus grande affinité vis-à-vis du Candida albicans que le fragment E (qui est un autre FDP particulier), (ii) il existe une compétition au niveau de 1'adhérence sur le mycélium entre le fibrinogène, le fragment D et le fragment E présents, et (iii) le fibrinogène présente une plus grande affinité pour le mycélium que pour les tubes germinatifs. Cependant, les deux articles de A. BOUALI et al., à la différence de la présente invention, n'ensei¬ gnent pas l'utilisation de l'éventuelle affinité et de l'éventuelle adhérence de Fg, D et E dans le cadre d'un procédé permettant de distinguer les souches de levures affines, qu'elles appartiennent ou non à l'ensemble des Candida, qui fixent le fibrinogène et ses dérivés, des souches de levures non-affines, qui ne fixent pas le fibrinogène ni ses dits dérivés.
Selon l'article précité de G. TRONCHIN et al., on connaît en tant que réactif un matériau constitué par du fibrinogène fixé sur des billes de latex submicroniques ayant un diamètre de 300 nm (voir paragraphe intitulé "Reagents", page 178, en bas). Ce réactif Fg-latex a été utilisé dans une mesure impliquant la mise en oeuvre d'un microscope électronique à balayage [en anglais : "scan- ning électron microscope"] peur localiser le site de l'adhérence sur le mycélium et les tubes germinatifs d'une souche de Candida albicans isolée d'un cas de septicémie. L'article de G. TRONCHIN et al., à la diffé¬ rence de la présente invention ne décrit ni ne suggère l'utilisation de l'affinité du réactif Fg-latex dans le cadre d'un procédé permettant de distinguer les levures affines des levures non-affines, d'une part, et de distinguer les souches de levures qui sont pathogènes de celles qui ne sont pas pathogènes, d'autre part.
En bref, les articles de A. BOUALI et al., d'une part, et l'article de G. TRONCHIN et al., d'autre part, visaient en d'autres termes la recherche et 1'identi- fication d'un facteur de fixation du fibrinogène, en abrégé FBF [de l'anglais : "fibrinogen-binding factor"], susceptible d'intervenir le cas échéant dans les mécanismes de patho-génicité, alors que selon l'invention on a voulu en premier lieu, distinguer les souches de levures qui fixent le fibrinogène et ses dérivés de celles qui ne les fixent pas, et en second lieu, distinguer les souches de levures qui sont pathogènes de celles qui ne sont pas pathogènes pour apprécier, notamment après prélèvement chez le patient, s'il y a eu colonisation ou invasion. BUT DE L'INVENTION
Selon l'invention on se propose de fournir une nouvelle solution technique pour mettre en évidence l'éventuelle affinité de Fg et de ses dérivés, Fn et FDP, vis-à-vis des formes filamentaires de levures. Cette nouvelle solution technique repose sur 1'observation de l'adhérence ou de la non-adhérence de Fg et de ses dérivés sur les formes filamentaires de levures.
Selon cette nouvelle solution technique, on se propose de fournir un procédé permettant de distinguer les souches de levures affines, qu'elles appartiennent ou non à l'ensemble des Candida, qui fixent le fibrinogène et ses dérivés, des souches de levures non-affines, qui ne fixent pas le fibrinogène ni ses dits dérivés. Selon un autre aspect de l'invention, on se propose de fournir un procédé permettant de distinguer les souches de levures qui sont pathogènes de celles qui ne sont pas pathogènes. OBJET DE L'INVENTION La nouvelle solution technique selon l'invention, qui permet de pallier aux inconvénients précités de l'art antérieur, repose sur
- la multiplication des blastospores des souches de levures à tester, - la filamentation desdites levures pour obtenir un volume relativement important de formes filamentaires essentiellement constituées de tubes germinatifs et/ou de mycélium,
- la mise en contact des formes filamentaires avec le fibrinogène, l'un de ses dérivés ou l'un de leurs mélanges, et
- l'appréciation de l'adhérence ou de la non-adhérence qui résulte de ladite mise en contact.
Selon un premier aspect de l'invention, on préco- nise un nouveau procédé pour mettre en évidence l'éventuelle affinité d'une substance (F) choisie parmi l'ensemble constitué par le fibrinogène (Fg), la fibrine
(Fn), leurs produits de dégradation (FDP) et leurs mélanges, vis-à-vis des formes filamentaires de souches de levures, ledit procédé, qui comporte la mise en contact desdites formes filamentaires avec ladite substance (F) pour distinguer les souches de levures qui fixent ladite substance (F) de celles qui ne la fixent pas, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (1°) cultiver (A) un échantillon contenant des levures à tester essentiellement sous forme de blastospores, susceptible de contenir au moins une substance pouvant interférer dans le méca- nisme d'adhérence de ladite substance (F) sur les formes filamentaires desdites levures et convena¬ blement dilué pour éliminer essentiellement toute interférence dans ledit mécanisme, dans (B) un milieu nutritif favorisant la multiplication des blastospores jusqu'à ce que l'on obtienne une population supérieure ou égale à 10* levures/ml, (2°) cultiver les blastospores de levures, ainsi obtenues, dans un milieu nutritif favorisant la filamentation, (3°) mettre en contact les formes filamentaires, ainsi obtenues, avec une substance (F) choisie parmi l'ensemble constitué par le fibrinogène, la fibrine, les FDP et leurs mélanges, puis (4" ) apprécier 1'adhérence ou la non-adhérence de ladite substance (F) sur lesdites formes filamen¬ taires.
En variante, ce procédé peut ne comprendre que les étapes (2°) à (4°), l'étape (1°) pouvant être suppri¬ mée quand on dispose d'un échantillon contenant des levures, essentiellement constitué de blastospores à une concentration supérieure ou égale à 10* levures/ml et mieux à une concentration supérieure ou égale à 105 levures/ml, et essentiellement dépourvu ou appauvri en substance pouvant interférer dans le mécanisme d'adhéren- ce de ladite substance (F) sur lesdites levures.
Le procédé selon 1'invention pour mettre en évidence l'éventuelle affinité d'une souche de levure, est utile dans la détermination de l'affinité d'une substance (F) vis-à-vis des formes filamentaires de souches de levures dans le domaine thérapeutique en cli- nique humaine ou vétérinaire, dans le domaine agricole et dans le domaine alimentaire.
Selon un second aspect de l'invention, on préco¬ nise un procédé pour déterminer le caractère pathogène ou non-pathogène de souches de levures à tester, caractérisé en ce qu'il comprend
(1°) si nécessaire, la multiplication des blastospores d'un échantillon de souches de levures à tester jusqu'à ce que l'on obtienne une population d'au moins 10* levures/ml et mieux une population supérieure ou égale à 10s levures/ml, (2° ) la filamentation des blastospores, (3°) l'incubation des formes filamentaires, ainsi obtenues, avec ladite substance (F) fixée sur un support inerte, de préférence des PDF globaux fixés sur un latex, et
(4e) l'observation du complexe éventuellement formé, de formule formes filamentaires-F-support, par agglutination.
Selon l'invention, on a trouvé de façon surpre¬ nante que les souches de levures, qui sont affines et fixent ladite substance (F) sont exclusivement ou essen¬ tiellement celles qui sont pathogènes. On préconise enfin selon l'invention, un néces¬ saire, trousse ou kit de dosage ou de détermination, qui est caractérisé en ce qu'il comprend au moins un réactif substance (F)-support pour mettre en oeuvre la réaction : formes filamentaires + F-support > formes filamentaires-F-support La présente invention s'applique à l'ensemble des souches de levures qui filamentent. Elle s'applique éga¬ lement à l'ensemble des souches qui ne filamentent pas mais donne lieu à une pseudofilamentation dans laquelle les blastospores se recouvrent de petites spherules, la configuration blastospore-sphérules se comportant ici comme un tube germinatif. En revanche, la présente inven¬ tion ne s'applique pas aux levures qui ne donnent pas lieu à filamentation ni à pseudofilamentation. ABREVIATIONS ET NOTATIONS
Dans la présente description, on a utilisé les abréviations suivantes par commodité :
BL = blastospores (ou formes "levures" proprement dites)
D = fragment D, il s'agit d'un FDP particulier qui peut se présenter sous la forme "D monomère" (produit constitué d'une seule chaîne linéaire) ou sous la forme "D dimère" (produit essentiel- lement constitué de deux chaînes linéaires sensi¬ blement parallèles) E = fragment E, il s'agit d'un FDP particulier qui peut se présenter sous la forme "E monomère" (produit constitué d'une seule chaîne linéaire) ou sous la forme "E dimère" (produit essentielle¬ ment constitué de deux chaînes linéaires sensi¬ blement parallèles) EDTA = acide éthylènediaminotétraacétique FBF = facteur de fixation du fibrinogène (ou facteur fixant le fibrinogène) [de l'anglais : "fibrino- gen-binding factor"; autre nomenclature fran¬ çaise : FFF] FDP = produit de dégradation du fibrinogène ou de la fibrine [autre nomenclature française : PDF] ; l'expression FDP englobe d'une manière générale les produits de dégradation particuliers de fibrinogène/fibrine, à savoir les fragments D, E, X et Y, d'une part, et les produits de dégradation globaux de fibrinogène/fibrine, d'autre part ; sauf indication contraire, ici FDP désignera plutôt les produits de dégradation glo^ baux. Fg = fibrinogène
FgDP = produits de dégradation du fibrinogène [autre nomenclature française : PDFg]
Fn = fibrine FnDP = produits de dégradation de la fibrine [autre nomenclature française : PDFn] GT = tubes germinatifs [en anglais : "germ-tubes" ; autre nomenclature française : TG]
Leu = leucyle, L-Leu désignant le reste leucyle de configuration L My = mycélium OD = densité optique PMy = pseudomycélium pNA = paranitroanilino [ou (4-N02)CeH_a,NH] SPS = polyméthanolsulfate de sodium
YNB = source d'azote commercialisée sous la nomencla¬ ture commerciale de "YEAST NITROGEN BASE" Par ailleurs, les notations usuelles pour évaluer soit l'affinité soit l'agglutination, qui figurent dans plusieurs tableaux ci-après, sont les suivantes :
= néant +/- = néant et/ou faible + = faible
++ = moyenne +++ = intense ++++ = très intense DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Par "formes filamentaires" on entend ici l'ensemble constitué par les formes germinatives, qui sont essentiellement constituées par les GT, et les • formes filamenteuses, qui sont essentiellement constituées par PMy et My. D'une manière générale dans l'ensemble des levures qui filamentent, les BL sont approximativement des sphères ayant un diamètre moyen de 5 micromètres environ ; les GT sont approximativement constitués chacun d'un cylindre ayant une longueur moyenne de 15 micromètres environ et un diamètre moyen de 3 micromètres environ et qui est lié par l'une de ses extrémités à une sphère ayant un diamètre moyen de 5 micromètres environ ; et My est approximativement constitué par des cylindres ayant chacun une longueur moyenne de 250 micromètres environ et un diamètre moyen de 5 micromètres environ. Par filamentation, les blastospores (ou blastoconidies) donnent les GT, puis les PMy et les My qui sont issus des GT. Dans ce qui suit, on désigne, sauf indication contraire, par l'expression "souches de levures qui filamentent" l'ensemble des souches qui donnent des GT, PMy et My, d'une part, et des souches qui donnent lieu à une pseudofilamentation, d'autre part. Lors de la mise au point de la présente invention on a (i) observé que la présence de Fg ou de FDP (i.e. FgDP et/ou FnDP) inhibe la multiplication des BL au cours de l'étape (Ie), les BL ne fixant pas lesdits Fg et FDP, (ii) vérifié que Fn notamment sous la forme de caillot de fibrine présente une grande affinité vis-à-vis des BL comme indiqué par A. BOUALI et al., et constaté que la formation du complexe Fn-BL empêche la multiplication des BL au cours de l'étape (1°), (iii) observé que la pré¬ sence de Fg ou de FDP (notamment FgDP et/ou FnDP) favo- rise la filamentation lors de l'obtention des formes filamentaires au cours de l'étape (2°), et (iv) découvert que les blastospores comportant des spherules dans le cas des souches donnant lieu à une pseudofilamentation présentent une affinité vis-à-vis de la substance (F) analogue mais qualitativement plus faible que celle des tubes germinatifs des souches de levures qui filamentent.. Par suite, la présence de Fg ou de l'un de ses dérivés, soit au cours de 1*étape (Ie) dans le milieu de multiplication des BL, qui est constitué de l'échantillon de levures à tester, d'une part, et du milieu nutritif de multiplication, d'autre part, soit au cours de l'étape (2°) dans le milieu de filamentation qui est constitué au départ des BL qui ont déjà été multipliées et qui proviennent de l'échantillon de levures à tester, d'une part, et du milieu nutritif favorisant la filamentation," d'autre part, va fausser la mesure de l'adhérence (i.e. l'affinité) ou de la non-adhérence (i.e. l'absence d'affinité) de l'étape (4°), dès lors que à l'étape (3e) il y aura compétition entre (a) ladite substance (F) (i.e. le Fg ou l'un de ses dérivés, de préférence fixé sur un support inerte) que 1'on ajoute à 1'étape (3e), et (b) le Fg ou l'un au moins de ses dérivés déjà présent(s) à 1'étape (1° ) ou à 1'étape (2e).
En conséquence, il convient selon l'invention que le milieu de multiplication des BL et le milieu de fila¬ mentation desdites BL soient dépourvus ou essentiellement appauvris en substance(s) pouvant interférer avec ladite substance (F) au cours de la réalisation de l'étape (3e). Parmi les produits ou substances pouvant inter- férer avec ladite substance (F), on peut notamment citer le fibrinogène et ses dérivés, à savoir :
- la fibrine,
- les FDP particuliers que sont les fragments D, E, X et
Figure imgf000015_0001
- les FDP globaux que sont les produits de dégradation FgDP et FnDP, d'une part, et, le cas échéant,
- les protéines de l'inflammation,
- les composés antifongiques, et - les anticorps anti(levure) , d'autre part.
Les substances interférentes énumérées ci-dessus ou certaines d'entre elles peuvent être présentes dans le sang total ou le plasma sanguin, d'une part, ainsi que dans les échantillons de levures qui ont été prélevés, d'autre part. Ainsi, le sang et le plasma contiennent en général du fibrinogène et le cas échéant un ou plusieurs de ses dérivés, et notamment dans les cas pathologiques des protéines de l'inflammation et/ou des anticorps anti(levure) [notamment des anticorps ant (Candida) dans les cas de candidoses] ; et les prélèvements de souches de levures de la famille des Candida peuvent contenir un composé antifongique tel que le cycloheximide qui inhibe la plupart des levures et en particulier les Candida à l 'exception des souches de Candida albicans et de quelques souches de Candida zeylanoides (voir à cet effet la demande de brevet français No 90 03 726 du 23 mars 1990 de la demanderesse). Dans la pratique de l'invention, on évite la présence de substance(s) interférente(s) dans le milieu nutritif de multiplication des BL et dans le milieu nu¬ tritif de filamentation des BL déjà multipliées grâce au choix approprié desdits milieux nutritifs. Par ailleurs, en fonction de l'origine de l'échantillon de levures à tester, il peut être impératif de diluer ledit échantil¬ lon pour l'appauvrir en substance(s) interférente(s) .
Les milieux nutritifs de multiplication et de fi¬ lamentation peuvent être liquides (i.e. milieux aqueux dits homogènes ou monophasiques) ou hétérogènes (i.e. milieux aqueux contenant une ou plusieurs matières soli¬ des et dits diphasiques) . La multiplication et la fila¬ mentation peuvent être réalisées de façon aérobie ou anaérobie. On préfère selon l'invention les milieux aqueux monophasiques aérobies. Par ailleurs, s'il est possible dans certains cas de procéder simultanément à la multiplication et à la fi¬ lamentation, il est plus sûr et plus efficace de procéder à la multiplication (quand elle est nécessaire) puis à la filamentation. On recommande donc, notamment pour les hémocultures, de séparer les deux étapes : d'abord la multiplication puis la filamentation.
Une hémoculture consiste à prélever du sang (sang total ou plasma) et à faire pousser les microorganismes qu'il contient, à savoir les bactéries (hémoculture bactérienne) ou les levures (hémoculture fongique), la pousse des levures étant effectuée en présence d'un moyen antibactérien pour inhiber le développement des bactéries ou détruire lesdites bactéries dès lors qu'elles crois- sent généralement avant ou plus rapidement que les levures. Si nécessaire, les souches de levures qui ont poussé au cours de l'hémoculture fongique sont ensuite, soit isolées pour identification, soit identifiées sans isolation (quand il s'agit de Candida) selon l'enseigne- ment de la demande française No 90 03 726 précitée.
On sait que l'hémoculture fongique (désignée ci- après "hémoculture" par commodité) est réalisée de façon standardisée sur un prélèvement de sang (sang total ou plasma) préalablement dilué à 10_1 dans un milieu nutritif de multiplication et/ou filamentation. Générale¬ ment un tel milieu est le milieu de Sabouraud ou le milieu trypticase-soja, additionné de SPS, de EDTA ou de citrate de sodium. Cependant, un tel milieu qui permet la croissance des champignons ne conduit pas toujours à l'obtention des formes filamentaires, notamment dans le cas de certaines souches de Candida par exemple.
Or, il se trouve que la dilution de 10_x comporte une teneur en substance(s) interférente(s) trop importan¬ te. Selon l'invention, pour disposer dans le cadre d'une hémoculture d'un échantillon essentiellement appauvri en substance(s) interférente(s) , il est critique d'utiliser à l'étape (1°) eu à l'étape (2e) un échantillon de sang préalablement dilué au moyen d'un milieu nutritif aqueux de multiplication ou de filamentation jusqu'à une dilu- tion de x-1, où x est un nombre supérieur ou égal à 50, c'est-à-dire par exemple une dilution allant de 50_1 à notamment ISO-1 ou 200-χ.
L'étape (Ie) a pour objet la multiplication des BL jusqu'à ce que l'on obtienne une population supérieure ou égale à 104 levures/ml (i.e. 10Λ blastospores/ml)
• et de préférence une population supérieure ou égale à 10s levures/ml (i.e. 10s blastospores/ml). La durée de l'étape (1°) est en général inférieure ou égale à 48 h à une température comprise entre 25 et 40eC, de préférence à 37eC, lorsque ladite étape (Ie) est mise en oeuvre.
Le milieu de multiplication des BL, qui est pré¬ féré selon l'invention, surtout pour les hémocultures, est constitué par un milieu aqueux, à savoir le milieu de Shadomy (qui renferme YNB, glucose et asparagine) enrichi en extrait de levure (1 à 4 g/1) et, si nécessaire, com- plémenté en saponine, urée et/ou antibactérien.
L'étape (Ie) peut être supprimée quand on dispose déjà d'un échantillon de souches de levures ayant la population requise précitée et qui est dépourvu ou essentiellement appauvri en substance(s) interférente(s) . Si nécessaire, le milieu nutritif de multiplica¬ tion des BL pourra comporter un moyen antibactérien pour inhiber ou éviter la croissance des éventuelles bactéries contenues dans l'échantillon de levures à tester (cette circonstance pourra se présenter dans le cas d'une hémoculture où ledit échantillon est un prélèvement de sang total ou de plasma), d'une part, et pourra comporter de préférence de l'urée pour permettre le développement de certaines souches de levures qui croissent difficile- ment, notamment les Cryptococcus et les Candida glabrata . L'utilisation du milieu de Shadomy enrichi en ex¬ trait de levure, d'une part, et complémenté en saponine, urée et agent antibactérien (notamment la gentamycine et/ou l'a picilline) , d'autre part, assure le dévelop- pement des champignons qui filamentent difficilement ou qui donnent lieu à une pseudofilamentation, à savoir (i) les souches de Cryptococcus, et de Candida glabrata précitées, (ii) les souches de Rhodotorula et de Aspergillus, et (iii) les souches particulières de Candida albicans présentes quelquefois dans des cas pathologiques mais non détectées par les hémocultures classiques en raison de leur faible développement.
Le milieu de multiplication de 1'étape (Ie) sera avantageusement un milieu aqueux aérobie. Par ailleurs, dans le cadre d'une hémoculture, ledit milieu nutritif de multiplication des BL pourra avantageusement comporter une substance, qui (i) n'inter¬ vient pas sur la croissance des levures, (ii) est inerte vis-à-vis de l'affinité des formes filamentaires à la substance (F), et (iii) lyse les érythrocytes, les leucocytes et les macrophages pour libérer les vitamines et les facteurs de croissance contenus dans lesdits éry¬ throcytes, d'une part, et pour libérer les éventuelles levures que fixent ou immobilisent lesdits leucocytes et macrophages, d'autre part. Parmi les substances lysantes de ce type qui conviennent on peut notamment citer les détergents tels que la saponine. Lorsque la saponine est utilisée, cette substance intervient à une concentration de 0,1 à 12 g/1 (de préférence 0,2-0,4 g/1) dans le mi- lieu nutritif.
De plus, toujours dans le cadre d'une hémocul¬ ture, il est important d'incorporer un agent anticoagu¬ lant approprié dans le milieu nutritif de multiplication des BL pour éviter la formation d'un caillot de Fn qui fausserait la réaction : formes filamentaires + F-support > formes filamentaires-F-support par le mécanisme de compétition précité
Le moyen anticoagulant préféré est l'héparine. Le citrate de sodium et 1'EDTA ne conviennent pas en tant que moyens anticoagulants, en ce sens qu'ils sont suscep¬ tibles d'inhiber le développement des formes filamentai¬ res.
L'étape (2e) a pour objet la filamentation des BL pour obtenir les formes filamentaires. De façon pratique selon l'invention, la filamentation de l'étape (2e) est réalisée pendant une durée d'au moins 1 h à 25-40"C pour obtenir les formes filamentaires choisies parmi 1'ensemble comprenant les formes germinatives et les formes filamenteuses dans le cas des souches de levures qui filamentent, ou des formes blastospores-sphérules dans le cas des souches de levures qui donnent lieu à une pseudofilamentation.
L'étape (2e) est réalisée dans un milieu aqueux, le pH optimal du milieu de filamentation se situant dans la gamme de 7,0 à 7,5 [c'est ce domaine de pH optimal qui sera avantageusement utilisé lors de 1'étape (3e)].
Pour gagner du temps au cours de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, il suffit de cesser la filamentation dès que l'on a obtenu un volume suffi¬ sant de GT (ou de blastospores-sphérules) sans avoir be¬ soin de poursuivre ladite filamentation jusqu'aux formes PMy et My. En d'autres termes, la filamentation de l'éta¬ pe (2°) est réalisée pendant 1 à 4 h à 37eC pour obtenir principalement les formes germinatives, qui sont essen¬ tiellement constituées par les tubes germinatifs (ou dans le cadre des souches de levures donnant lieu à une pseu¬ dofilamentation, les blastospores-sphérules) .
Parmi les milieux nutritifs qui conviennent pour la mise en oeuvre de la filamentation de l'étape (2e), on peut notamment citer les milieux de blastèse synthétiques et en particulier ceux utilisés de façon classique pour l'identification des souches isolées de Candida .
Le milieu nutritif que 1'on préconise de préfé- rence pour la filamentation de 1•étape (2e) sera avanta¬ geusement le milieu de Shadomy (qui est un milieu aqueux contenant YNB, glucose et asparagine) non-enrichi en extrait de levure. En d'autres termes, le milieu nutritif préféré pour la filamentation, à savoir le milieu de Shadomy, sera différent du milieu nutritif préféré pour la multiplication, à savoir le milieu de Shadomy enrichi en extrait de levure, où ledit extrait de levure inter¬ vient à une concentration de 1 à 4 g/1 dans le milieu de filamentation. Dans ce qui suit, on a désigné par l'expression "milieu de shadomy enrichi", le milieu de Shadomy complémenté en extrait de levure à une concentration de 1-4 g/1 (notamment à la concentration de
2 g/i).
Comme indiqué ci-dessus pour 1'étape (Ie), le mi- lieu nutritif de multiplication pourra contenir, notam¬ ment dans le cadre d'une hémoculture :
- une substance lysant les érythrocytes, les leucocytes et les macrophages pour libérer les formes fongiques phagocytées par les leucocytes et les macrophages, d'une part, et les substances contenues dans les érythrocytes, d'autre part, ladite substance lysante devant bien entendu être inerte vis-à-vis de la croissance des levures à tester et de 1•affinité des formes filamentaires desdites levures à tester à la substance (F), la substance lysante étant, comme indiqué ci-dessus, de préférence un détergent acceptable, et mieux la saponine ;
- un agent anticoagulant, de préférence l'héparine,
- de l'urée, et - le cas échéant, un moyen antibactérien. Dans le cadre d'une hémoculture, si l'échantil¬ lon de sang ou de plasma contient au départ une popula¬ tion importante de blastospores, 1'on pourra en variante procéder à une dilution à x-1, où x est un nombre supérieur ou égal à 50, de l'échantillon à tester conte¬ nant un anticoagulant, avec de préférence le milieu nutritif aqueux de multiplication, pour arriver à une population supérieure ou égale à 10* ou mieux une population supérieure ou égale à 10s, et éviter ainsi la mise en oeuvre de l'étape (Ie) en débutant directement par 1'étape (2e).
En pratique, le milieu de filamentation de l'éta¬ pe (2e) sera avantageusement un milieu aqueux aérobie.
Selon l'invention, la mise en contact de l'étape (3e) est une incubation pendant au moins 0,5 h à 37eC des formes filamentaires avec ladite substance (F) préalable¬ ment fixée sur un support inerte. La durée de 1'étape (3e) sera en général comprise entre 0,5 h et 4 h à 37"C et avantageusement comprise entre 1 h et 3 h à 37eC. En pratique, une durée de 1 h à 37°C sera suffisante pour la plupart des souches de levures à tester qui filamentent, et une durée de 1 à 3 h à 37°C sera utilisée pour les souches qui donnent une pseudofilamentation telles que les Candida glabrata . La substance (F) intervenant à l'étape (3e) est choisie parmi le fibrinogène et ses dérivés (Fn, D, E, FDP, notamment FgDP et FnDP) .
De façon avantageuse, on utilisera des FDP glo¬ baux, à savoir les FgDP globaux et/ou les FnDP globaux. Selon l'invention la substance (F) sera, pour la réalisation de l'étape (3e), fixée sur un support inerte, soit par liaison covalente, soit par adsorption. De façon avantageuse, ledit support inerte sera une substance po- lymérique telle que les latex. Selon le meilleur mode de mise en oeuvre de l'in-^ vention, l'on fera appel à une substance (F) constituée par des PDF globaux fixés par covalence sur un support latex. L'existence d'une affinité entre les formes filamentaires des souches de levures à tester et ladite substance (F) préalablement fixée sur un support inerte, se traduit par une agglutination.
Selon 1'invention, 1'étape (4e) comprend une opération de lecture choisie parmi l'ensemble constitué • par
(a) l'observation de l'éventuelle adhérence au microscope de ladite substance (F) sur lesdites formes filamentaires de levures, (b) l'observation de l'éventuelle agglutination du complexe formes filamentaires-F-support et,
(c) l'observation de l'éventuelle formation du complexe formes filamentaires-F ou formes filamentaires-F-support par un substrat enzymatique spécifique des enzy- mes de levures.
Ainsi, on dispose de trois solutions techniques pour apprécier l'éventuelle affinité de la substance (F) vis-à-vis des formes filamentaires de souches de levures. La solution I, selon l'observation (a) ci-dessus, consiste à préparer des lames de microscope que l'on dispose sur la platine d'un microscope optique pour visualiser et/ou compter le nombre de particules F-latex fixées sur les GT (ou leurs analogues blastospores- sphérules) et, le cas échéant, les PMy et My. La solution I est essentiellement une observation de confirmation dès lors qu'elle est fastidieuse et exige beaucoup d'habitude ou expérience pour lire les lames de microscope.
La solution II, selon l'observation (b) ci- dessus, est une technique efficace pour déterminer l'af- finité selon l'invention. L'observation (b) met en oeuvre l'agglutination d'un complexe forme filamentaire-F-support et de préférence, le complexe
GT-FDP-latex. Selon le choix du latex, la détermination peut être soit qualitative, soit quantitative. Avec des billes de latex ayant un diamètre supérieur à 1 micromètre et sur lesquelles est fixée la substance (F) on obtient une agglutination qualitative. Avec des billes de latex sub- microniques ayant un diamètre inférieur à 1 micromètre et sur lesquelles est fixée la substance (F) [de préférence les billes de latex décrites dans la demande internatio¬ nale PCT publiée WO-A-90/08 321] on obtient une aggluti¬ nation quantitative. Selon la solution technique II, on observe quali¬ tativement (i) une agglutination à l'échelle macroscopi¬ que à l'oeil nu, ou (ii) une agglutination à l'échelle microscopique par mesure de la variation de OD. Lorsque le support est constitué par des billes de latex, il in- tervient en tant que moyen "amplifiant" le résultat de la réaction d'agglutination.
Avec des billes de latex submicroniques selon le document O-A-90/08321 précité, on évalue quantitative¬ ment l'agglutination par la variation de OD. La solution III, selon l'observation (c) ci- dessus, est une technique également efficace pour déter¬ miner l'affinité selon l'invention. Elle repose sur un mécanisme enzymatique. En pratique, l'observation (c) met en oeuvre l'utilisation d'un substrat enzymatique spécifique des enzymes ayant une activité leucine- arylamidase. Par "enzyme ayant une activité leucine-aryl- amidase" on entend les enzymes qui clivent en -L-Leu-OH et H-R, les substrats aminoacides, dipeptides, tripepti- des ou tétrapeptides se terminant au niveau de 1'extrémi- té CO-terminale par un reste
-L-Leu-R où Leu est le reste leucyle de l'extrémité CO-terminale et R est pNA ou un groupe chromogène analogue à pNA, tel que les restes p-nitroanilino comportant un substituant sur le noyau phényle (notamment Cl, Br, F, CH ou OCH3) et décrits dans EP-A-0 110 306. Les enzymes ayant une telle activité leucine-aryla idase sont des enzymes caractéristiques des levures se trouvant notamment dans les formes filamentaires. Le substrat enzymatique que l'on préfère selon
1'invention, est un substrat aminoacide, à savoir : H-L-Leu-pNA.
Dans ces conditions, la méthode de détermination par voie enzymatique comprend les stades consistant à - faire appel à un support approprié (notamment une microplaque de titration ou un ensemble de cuvettes) ,
- revêtir ce support avec la substance (F),
- laver le support approprié pour éliminer la substance (F) non liée audit support approprié, - mettre en contact ladite substance (F) fixée audit sup¬ port approprié avec les formes filamentaires (de préfé¬ rence les GT) des souches de levures à tester provenant de 1'étape (2e) et incuber pendant au moins 0,5 h à 37eC (de préférence 1 à 2 h à 37°C), _ laver pour écarter les substances non fixées,
- révéler la réaction d'affinité, si elle s'est produite, au moyen d'un substrat enzymatique (H-L-Leu-pNA) spéci¬ fique des enzymes des levures, puis
- mesurer la variation de OD (notamment à 405 nm) pour quantifier l'activité enzymatique des formes filamen- taires par rapport à un milieu témoin traité dans les mêmes conditions mais dépourvu de levures.
On a par ailleurs découvert de façon surprenante que dans la quasi-totalité des souches de levures tes- tées, l'affinité F/formes filamentaires ne se manifeste que pour les souches de levures qui sont pathogènes. Par suite, l'affinité FgDP globaux/GT ou FnDP globaux/GT, d'une part, FgDP globaux/blastospores-sphérules ou FnDP globaux/blastospores-sphérules, d'autre part, constitue un moyen rapide, efficace et sûr pour déterminer si oui ou non des souches de levures à tester sont pathogènes.
Dans l'état actuel des connaissances, on présume que le mécanisme d'adhérence selon la réaction formes filamentaires + F > formes filamentaires-F est similaire aux mécanismes de la transformation des souches de levures non-pathogènes en souches pathogènes. Cependant, il s'agit là d'une théorie qui ne lie pas la Demanderesse. Il suffit dans le cadre de la présente in¬ vention de constater le résultat général que les souches de levures, dont les formes filamentaires sont affines vis-à-vis de la substance (F), sont essentiellement des souches pathogènes.
Cette découverte est particulièrement intéressan¬ te dans _la détermination des levures pathogènes que 1•on peut rencontrer en clinique humaine ou vétérinaire (notamment chez les animaux à sang chaud tels que les mammifères) , dans le domaine agricole et dans le domaine alimentaire.
En particulier, il est très important de pouvoir apprécier (A) si des aliments sont ou non contaminés par des souches de levures pathogènes, (B) si des souches de levures destinées à (i) la fabrication des fromages à pâte persillée ou à croûte fleurie, ou (ii) à la fabrica¬ tion des moûts de bière sont ou non contaminées par des levures pathogènes, et (C) si des souches de levures de- vant être utilisées pour coloniser des récoltes (arachides, céréales et houblons notamment), afin d'empê¬ cher le développement des levures néfastes vis-à-vis desdites récoltes, ne sont pas contaminées par des levures pathogènes. La protection des récoltes et des aliments par des levures est notamment décrite dans les documents FR-B-2 355 509 et FR-A-2 355 453 incorporés ici à titre de référence.
En conséquence, on préconise l'utilisation de l'éventuelle affinité formes filamentaires/F pour déterminer le caractère pathogène ou non-pathogène de souches de levures à tester.
Comme indiqué plus haut, on préconise un procédé pour déterminer le caractère pathogène ou non-pathogène de souches de levures à tester, caractérisé en ce qu'il comprend
(Ie) si nécessaire, la multiplication des blastospores d'un échantillon de souches de levures à tester jusqu'à ce que l'on obtienne une population d'au moins 10* levures/ml et mieux une population supérieure ou égale à 10s levures/ml, (2e) la filamentation des blastospores, (3e) 1'incubation des formes filamentaires, ainsi obtenues, avec ladite substance (F) fixée sur un support inerte, de préférence des PDF globaux fixés sur un latex, et
(4e) l'observation du complexe éventuellement formé, de formule formes filamentaires-F-support, par agglutination.
Selon ce procédé, la multiplication des blastos¬ pores à 1'étape (Ie) et/ou la filamentation desdites blastospores à 1'étape (2e) par hémoculture sont effec¬ tuées dans un milieu liquide, de préférence aérobie, à partir d'un échantillon de sang ou plasma contenant des souches de levures à tester et préalablement dilué suivant une dilution de x_x où x est un nombre supérieur ou égal à 50, pour éliminer essentiellement toute interférence avec les autres substances contenues dans le sang ou le plasma et pouvant interférer dans le mécanisme d'adhérence de ladite substance (F) sur lesdites levures, les substances interférentes étant susceptibles de comprendre notamment Fg, Fn, FgDP et FnDP, d'une part, et les protéines de l'inflammation, les composés anti- fongiques qui ont pu être administrés, les anticorps anti(Candidat, d'autre part.
La solution technique préconisée par 1'invention est particulièrement bien adaptée à la détermination du caractère pathogène ou non-pathogène des souches de levures qui filamentent pour donner des GT, PMy et My. MEILLEUR MODE
Le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention pour les étapes (Ie) à (4e) a été décrit ci-après, en ce qui concerne notamment les hémocultures. Etape (Ie)
On procède à la multiplication des blastospores contenues dans un échantillon de souches de levures à tester, notamment un échantillon de sang total ou de plasma sanguin, dans un milieu de multiplication des BL qui est aqueux, aérobie et constitué par un milieu de Shadomy enrichi en extrait de levure (où ledit extrait de levure est à une concentration de 1 à 4 g/1) et complé- menté en saponine (0,2-0,4 g/1), en héparine, en urée et le cas échéant en moyen antibactérien, pendant une durée inférieure ou égale à 48 h à 37eC et à pH 7,0-7,5, l'échantillon de sang ou de plasma étant dilué au moyen dudit milieu de multiplication jusqu'à une dilution de x-1 (où x est un nombre supérieur ou égal à 50), de façon à obtenir une population supérieure ou égale à 105 levures/ml. En variante, si on dispose d'un échantillon ayant une population convenable (i.e. une population supérieure ou égale à 5 x 106 levures/ml), il suffit de diluer ledit échantillon au moyen du milieu de multiplication jusqu'à ladite dilution de x- . Etape (2e)
On procède à la filamentation des blastospores obtenues selon l'étape (Ie) ou sa variante sus-visée, dans un milieu aqueux aérobie constitué par le milieu de Shadomy non-enrichi et non-complémenté, pendant 1-4 h à 37eC et à pH 7,0-7,5, de façon à obtenir un volume suffi¬ sant de GT. Etape (3" )
On incube un prélèvement du milieu contenant des GT obtenu à l'issue de l'étape (2e) avec un réactif (FDP- latex) constitué par des billes de latex revêtues de FDP globaux (FgDP globaux ou FnDP globaux), pendant au moins 1 h à 37°C et à pH 7,0-7,5. Etape (4e) On observe la formation du complexe résultant
GT-FDP-latex ou l'absence dudit complexe, par agglutination.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture de la des- cription des exemples qui va suivre. Bien entendu, ces éléments ne sont nullement limitatifs mais sont donnés à titre d'illustration.
Dans ce qui suit, les exemples 1 à 5 ont trait à des essais en système dit purifié, et les exemples 6 à 9 ont trait à des essais en système plasmatique (sang total ou plasma) .
EXEMPLE 1 (comparatif) a) Protocole
On opère en système dit purifié. Différentes levures ayant poussé en 24 heures à 37βC sur milieu de Sabouraud sont ensemencées en milieu aqueux aérobie de. filamentation à pH 7,0-7,-5 de façon à obtenir des formes germinatives et/ou filamenteuses.
L'incubât est prélevé à différents temps et mis en présence, pendant 2 h à 37 " C , de fibrine fixée de façon covalente sur une plaque de microtitration de façon à étudier l'affinité des levures à la fibrine.
Après lavage de la plaque, pour éliminer les levures non fixées, 1*activité enzymatique leucine- arylamidase des levures fixées à la fibrine est révélée sur un substrat synthétique (H-L-Leu-pNA) et appréciée par la mesure de la OD à 405 nm. b) Réaction d'affinité
Avec un milieu aqueux aérobie de filamentation constitué par le milieu synthétique "199" (commercialisé par l'Institut Pasteur et désigné ci-après "199 IP"), on a observé que Fn présente une affinité vis-à-vis des BL et des formes filamenteuses et que l'adhérence de Fn aux formes filamentaires (après incubation pendant 18 h à 37eC) est plus importante que celle de Fn aux BL (mesure à l'instant T = 0 h) .
Les résultats consignés dans le tableau I ci- après, pour une souche de Candida albicans, confirment ceux donnés dans les articles A. BOUALI et al. précités. II convient de remarquer cependant que le milieu
199 IP n'est pas un milieu de filamentation approprié, ainsi que cela est démontré ci-après.
TABLEAU I Affinité à la fibrine en milieu synthétique 199 IP d'une souche de Candida albicans
Formes de la levure Durée OD d'incubation (à 37"C (à 405 nm) et à pH 7,0-7,5)
BL T = O h 0,057 formes germinatives et filamenteuses T = 18 h 0,253
EXEMPLE 2 (comparatif)
On a testé différents milieux de développement de levures pour apprécier ceux qui favorisent la filamenta¬ tion. Dans cette optique, on a mis à incuber 12 souches isolées de Candida albicans (connues pour filamenter fa¬ cilement) dans chacun des milieux de développement (i.e. milieux de multiplication-filamentation) pendant 18 h à 37"C et à pH 7,0-7,5, puis on a observé au microscope la présence éventuelle des formes BL, GT, PMy et My.
Les résultats consignés dans le tableau II ci- après mettent en évidence que le milieu néopeptone ne favorise pas la filamentation, alors que les autres mi¬ lieux, à savoir le milieu de Shadomy enrichi et éventuel¬ lement complémenté, le milieu 199 IP et le milieu plasma oxalaté favorisent ladite filamentation. On verra plus loin que le supplément G (commer¬ cialisé par l'Institut Pasteur), le milieu 199 IP et le plasma oxalaté faussent la réaction d'affinité. TABLEAU II Formes des levures selon les milieux de développement pour 12 souches de Candida albicans (incubation 18 h à 37"C à pH 7,0-7,5)
Milieux Formes des levures
néopeptone rares formes BL bourgeonnantes rares GT
milieu 199 IP très nombreuses formes BL bourgeonnantes et GT + PMy + My
milieu de Shadomy nombreuses formes BL bourgeonnantes et GT + PMy + My
milieu de Shadomy très nombreuses formes BL
+ extrait de levure (2 g/1) bourgeonnantes et GT + PMy + My
milieu. de Shadomy très nombreuses formes BL + extrait de levure (4 g/1) bourgeonnantes et + urée (2 g/1) + ampicilline GT + PMy + My
milieu de Shadomy très nombreuses formes BL + supplément G (IP) bourgeonnantes et GT + PMy + My
plasma oxalaté très nombreuses formes BL bourgeonnantes et GT + PMy + My EXEMPLE 3 (comparatif)
On a apprécié 1'affinité de différentes substan¬ ces (F) vis-à-vis des formes filamentaires de plusieurs souches de levures. Dans cette optique, des souches iso- lées ont été mises à multiplier dans le milieu de Shadomy enrichi (extrait de levure à 2 g/1) pendant 18 h à 37°C et à pH 7,0-7,5, puis à filamenter dans le milieu de Shadomy normal (i.e. non-enrichi et non-complémenté) pen¬ dant 1-3 h à 37°C et à pH 7,0-7,5. A l'issue de la fila- mentation, des prélèvements du milieu de filamentation résultant ont été déposés dans les cupules de plaques de icrotitration revêtues par liaison covalente de fibrinogène (Fg), de fibrine (Fn) obtenue par action de la thrombine sur le fibrinogène, de fragment D purifié (D), de FgDP obtenus par action de la plasmine sur le fibrinogène, et de FnDP obtenus par action de la thrombi¬ ne puis d'un activateur du plasminogène tel que l'uroki- nase. Les formes filamentaires obtenues, à partir de souches pathogènes de Candida albicans et de Candida tropicalis, et de souches non-pathogènes de Candida krusei et de Candida glabrata (toutes ces souches ayant été isolées en clinique humaine), ont été mises en con¬ tact avec Fg, Fn, D, FgDP ou respectivement FnDP pendant 2 h à 37eC et à pH 7,0-7,5. La mesure de l'activité enzymatique leucine- arylamidase a été déterminée sur un substrat synthétique (H-L-Leu-pNA) par la détermination de la variation de OD à 405 nm, comme indiqué à l'exemple 1 ci-dessus.
Les résultats obtenus sont consignés dans le ta- bleau III ci-après où sont données lesdites variations de OD à 405 nm. TABLEAU III
Variation de OD à 405 nm
Souches Fg Fn D FgDP FnDP
Candida albicans 0,10 0,23 0,01 0,22 0,19 latence
Candida tropicalis 0,61 0,64 0,60 0,89 0,89 latence
Candida krusei
Candida glabrata 0
EXEMPLE 4 (comparatif) (a) Première série d'essais
On a évalué l'affinité de Fg et de ses dérivés (Fn, D, E, FgDP et FnDP) vis-à-vis des formes filamentaires de diverses levures, selon les modalités opératoires décrites à l'exemple 3 ci-dessus, en fonction de l'inoculum.
On a constaté que l'affinité vis-à-vis desdites formes filamentaires se manifeste effectivement pour les souches de levures pathogènes quand l'inoculum soumis à la filamentation a une population supérieure ou égale à ιo* levures/ml et mieux une population supérieure ou égale à 10s levures/ml. (b) Seconde série d'essais
On a évalué -1'influence du milieu de développe¬ ment de levures sur ladite affinité. Dans ce but, on a procédé au développement (i.e. multiplication et filamen- tation simultanées dans le même milieu) de souches de. levures dans divers milieux de développement pendant 24 h à 37"C et à pH 7,0-7,5 ; ensuite on a déposé des prélève¬ ments de chaque milieu de développement résultant dans des cupules de plaques de microtitration revêtues de Fg par liaison covalente, et laissé incuber pendant 2 h à 37eC et à pH 7,0-7,5 ; on a enfin mesuré l'activité enzy¬ matique sur un substrat synthétique (H-L-Leu-pNA) par la détermination de la variation de OD (notamment à 405 nm) pour apprécier l'éventuelle affinité, comme indiqué à l'exemple 1 ci-dessus.
Les résultats obtenus avec des souches pathogènes de Candida albicans et de Candida tropicalis isolées en clinique humaine sont consignés dans le tableau- IV ci- après.
TABLEAU IV
Milieux C. albicans C. tropicalis
milieu 199 IP 0,002 0,02 milieu de Shadomy 0,21 0,83 milieu de Shadomy
+ extrait de levure 0,32 1,1 milieu de Shadomy
+ supplément G 0 0 plasma oxalaté 0 0
Les résultats du tableau IV montrent que le milieu 199 IP, le milieu de Shadomy contenant le supplé¬ ment G et le plasma oxalaté ne conviennent pas pour la mise en oeuvre de l'invention. Le supplément G, qui con- tient Fn, empêche l'adhérence des formes filamentaires sur le Fg des plaques de microtitration eu égard au méca¬ nisme de compétition précité. De même, le milieu 199 IP fausse le résultat de la mesure d'affinité par ledit mé- canisme de compétition. Le plasma oxalaté inhibe la fila¬ mentation des BL.
Le milieu de Shadomy normal (i.e. non-enrichi et non-complémenté) convient en tant que milieu de dévelop¬ pement (i.e. milieu de multiplication-filamentation). En revanche, le milieu de Shadomy enrichi (extrait de levure à 1-4 g/1) utilisé en tant que milieu de développement est susceptible de fausser la réaction d'affinité, en ce sens que le Fg contenu dans l'extrait de levure, qui fa¬ vorise la multiplication, peut se fixer sur les formes filamentaires lors de la filamentation , et les complexes formes filamentaires-Fg formés lors de ladite filamentation peuvent se fixer sur le Fg de la plaque de microtitration. Par suite, il est plutôt préférable d'utiliser le milieu de Shadomy enrichi lors de la multiplication puis le milieu de Shadomy nor¬ mal lors de la filamentation. EXEMPLE 5
On procède à la multiplication des BL de diverses souches _de levures de référence (provenant de collections reconnues) et d'isolats (provenant de prélèvements cliniques) , dans un milieu aqueux aérobie constitué du milieu de Shadomy enrichi (extrait de levure à 2 g/1) et complémenté en urée (2 g/1), saponine (0,2 g/1), héparine et ampicilline, pendant 18 h à 37"C et à pH 7,0-7,5 ; on procède ensuite à la filamentation des blastospores ainsi obtenues, dans un milieu aqueux aérobie constitué par le milieu de Shadomy normal, pendant 1-4 h à 37"C et à pH 7,0-7,5, pour obtenir les formes GT (ou leurs analogues blastospores-sphérules), les souches soumises à la filamentation (ou pseudofilamentation) ayant une popula- tion de 105 à 106 levures/ml. On introduit ensuite le milieu de filamentation ainsi obtenu qui contient des GT (ou leurs dits analogues) dans les cupules de plaques de microtitration revêtues de façon covalente de Fg, puis laisse incuber pendant 1-3 h à 37eC. On évalue ensuite l'affinité révélée par le substrat H-L-Leu-pNA par la variation de OD à 405 nm. Les résultats obtenus sont consignés dans les tableaux Va (souches de référence) et Vb (souches d'isolats) ci-après.
TABLEAU Va (Souches de référence)
Nombre de souches
Espèces testées affines
Candida albicans 2 Candida albicans 0 Candida tropicalis 0 Candida tropicalis 0 Candida krτisei 1 Candida krusei 0
Candida glabrata 1 Candida glabrata 0 Candida parapsilosis 0 Rhodotorula 1 Rhodotorula 0 Trichosporum 1 Cryptococcus 1 Cryptococcus 0 Saccharomyces 0 Geotrichum 1
Aspergillus
Figure imgf000037_0001
1
Notes
(a) : souche(s) réputée(s) pathogène(s)
(b) : souche(s) réputée(s) non-pathogène(s) TABLEAU Vb (souches d'isolats)
Nombre de souches
Espèces testées affines
Candida albicans 4 (c 4 Candida albicans 7 (d 0 Candida tropicalis 5 (c 5 Candida tropicalis 4 (d 0 Candida krusei 2 (c 2 Candida krusei 8 (d 0 Candida glabrata 2 (c 2 Candida glabrata 13 (d 0 Candida parapsi losis 1 (d 0
Notes
(c) : souche(s) reconnue(s) pathogène(s)
(d) : souche(s) reconnue(s) non-pathogène(s)
Les résultats des tableaux Va et surtout Vb mettent en évidence 1'intérêt de 1*invention pour distin¬ guer les-souches de levures qui sont pathogènes de celles qui ne le sont pas. Le tableau Va confirme par ailleurs que des souches de référence réputées pathogènes perdent leur pathogénicité par repiquages successsifs. EXEMPLE 6 (comparatif) (a) Protocole on fait filamenter dans le milieu de Shadomy nor¬ mal, pendant 4 h à 37eC et à pH 7,0-7,5, des souches de levures ayant une population supérieure ou égale à 105 levures/ml et provenant d'un prélèvement de sang (contenant de la fibrine) , selon une technique d'hémo- culture après dilution à ÎO-1 du prélèvement sanguin dans un milieu de multiplication constitué par le milieu de Shadomy enrichi (extrait de levure à 2 g/1) et complémen- té en urée (2 g/1) .
On procède ensuite à la mise en évidence de l'éventuelle affinité en mettant en contact, pendant 1 h à 37eC, des prélèvements du milieu de filamentation ré¬ sultant avec un réactif fixé par liaison covalente à des billes de latex, à savoir le réactif FDP-latex. (b) Résultats Les résultats obtenus avec des souches de Candida qui sont consignés dans le tableau VI ci-après, mettent en évidence la nécessité de faire filamenter les levures en milieu plasmatique après avoir incorporé un agent anticoagulant. Dans cet exemple, la présence de Fn sous la forme d'un caillot qui s'est formé fausse la mesure de 1'affinité du réactif FDP-latex du fait du mécanisme de compétition entre Fn et FDP-latex.
TABLEAU VI Affinité de Candida à FDP-latex en présence d'un caillot de Fn
Milieux Pousse Affinité (FDP-latex (4 h à 37°C) 1 h à 37°C)
plasma citrate + CaCl≈)
. caillot Fn +++ (Candida fixés à Fn)
. sérum (absence de Candida) plasma citrate +++ plasma héparine ++++ sang héparine + saponine (10 g/1) ++++ EXEMPLE 7 (comparatif)
On a étudié 1*influence de la dilution du système plasmatique sur l'évaluation de l'affinité de souches de Candida qui filamentent normalement (en donnant les GT, PMy et My).
Dans ce but, le prélèvement plasmatique (plasma sanguin ou sang total) a été additionné d'un moyen anti¬ coagulant dans la minute qui suit la prise de sang, puis dilué ensuite au moyen du milieu de Shadomy enrichi (extrait de levure à 2 g/1) et complémenté en saponine (10 g/1), urée (2 g/1) et ampicilline.
La filamentation a été réalisée dans le milieu de Shadomy normal, pendant 4 h à 37°C et à pH 7,0-7,5, à partir d'une population initiale de souches de levures de 105 à 106 levures/ml.
Pour apprécier 1'affinité des formes filamentai¬ res essentiellement constituées ici de GT, on a mis en contact des prélèvements du milieu de filamentation (tel qu'obtenu après culture pendant 4 h à 37eC et à pH 7,0- 7,5) avec le réactif FDP-latex de l'exemple 6 pendant 1 h à 37"C et à pH 7,0-7,5.
La lecture de l'éventuelle affinité a été effec¬ tuée par la détermination de 1'agglutination et a été vérifiée par examen microscopique. .Les résultats qui ont été obtenus sont consignés dans le tableau VII ci-après.
On constate que 1'affinité n'est pas mise en évi¬ dence pour les formes levures proprement dites, c'est-à- dire les blastospores. En revanche, l'affinité est spéci- fique pour les formes filamentaires des levures testées et plus principalement les GT desdites levures.
Par ailleurs, il est important de séparer l'étape de multiplication de l'étape de filamentation pour éviter de fausser la détermination de l'affinité lors de la mise en contact de portions du milieu résultant de la filamen¬ tation avec le réactif FDP-latex. TABLEAU VII Influence de la dilution
Figure imgf000041_0001
ne se pas recouvertes par le réactif FDP-latex (absence d'adhérence dudit réactif) les formes filamentaires (essentiellement GT) sont recouvertes par le réactif FDP-latex (adhérence dudit réactif)
EXEMPLE 8 (comparatif)
On a étudié 1'influence de la concentration des souches de levures dans le système plasmatique sur 1'éva- luation de l'affinité de souches de Candida qui filamen¬ tent normalement (en donnant les GT, PMy et My) . Dans ce but, le prélèvement plasmatique (sang total) a été additionné d'héparine en tant que moyen anti-coagulant dans la minute qui suit la prise de sang, puis dilué ensuite à 50-x au moyen du milieu de Shadomy enrichi (extrait de levure à 2 g/1) et complémenté en saponine (10 g/1), urée (2 g/1) et a picilline.
La filamentation a été réalisée ensuite (avec ou sans multiplication dans le milieu de Shadomy normal pendant 4 h à 37°C et à pH 7,0-7,5, à partir d'une popu¬ lation initiale de souches de levures ayant une population de 102 à 106 levures/ml.
Pour apprécier 1'affinité des formes filamentai¬ res essentiellement constituées ici de GT, on a mis en contact des prélèvements du milieu de filamentation (tel qu'obtenu après culture pendant 4 h à 37°C et à pH 7,0- 7,5) avec le réactif FDP-latex de 1'exemple 6 pendant 1 h à 37°C.
La lecture de l'éventuelle affinité a été effec¬ tuée par la détermination de 1'agglutination et a été vérifiée par examen microscopique, comme indiqué à 1'exemple 7 ci-dessus.
Les résultats qui ont été obtenus avec des souches de Candida sont consignés dans le tableau VIII ci-après.. On constate, comme à l'exemple 7, que l'affi- nité n'est pas mise en évidence pour les formes levures proprement dites, c'est-à-dire les blastospores. En re¬ vanche, l'affinité est spécifique pour les formes fila¬ mentaires des levures testées et plus principalement les GT desdites levures. L'intérêt de séparer l'étape de multiplication (si elle est nécessaire) de l'étape de filamentation est également confirmé. TABLEAU VIII Influence de la concentration des levures
Figure imgf000043_0001
1'évaluation de 1'agglutination NR : les formes filamentaires (essentiellement GT) ne se pas recouvertes par le réactif FDP-latex (absence d'adhérence dudit réactif) R : les formes filamentaires (essentiellement GT) sont recouvertes par le réactif FDP-latex (adhérence dudit réactif) EXEMPLE 9
On a mesuré 1'affinité de diverses souches de levures en système plasmatique (sang total héparine) qui ont été soumises d'abord à une multiplication pendant 24 h à 37eC, après dilution à 50~x dans le milieu de Shadomy enrichi (extrait de levure à 2 g/1) et complémenté en urée (2 g/1), saponine (0,2 g/1) et anti¬ bactérien (ampicilline), pour multiplier les BL jusqu'à une population de 10Ξ à 10e ; puis à une filamentation ou pseudofilamentation dans le milieu de Shadomy normal pendant 1-3 h à 37"C et à pH 7,0-7,5.
L'évaluation de 1'affinité a été effectuée en mettant en contact pendant 1 h à 37°C des portions du milieu de filamentation résultant avec le réactif FDP- latex de l'exemple 6.
Les résultats qui ont été .obtenus sont consignés dans le tableau IX ci-après.
TABLEAU IX Affinité de souches de levures en sang total héparine
Espèces Nombre de souches testées affines
Candida albicans Candida albicans Candida tropicalis Candida tropicalis Candida glabrata Candida glabrata Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus laurentii
Figure imgf000044_0001
Notes
(c) : souche(s) reconnue(s) pathogène(s) (d) : souche(s) reconnue(s) non-pathogène(s) Les résultats du tableau IX mettent en évidence l'intérêt considérable de la solution technique selon l'invention pour distinguer, en milieu plasmatique, les souches de levures pathogènes des souches de levures qui ne sont pas pathogènes.
Selon les modalités opératoires décrites à l'exemple 9 ci-dessus, mais en utilisant
(i) un milieu de multiplication diphasique et non monophasique, (ii) un milieu de filamentation diphasique et non monophasique, et (iii) un milieu de multiplication diphasique et non monophasique, puis un milieu de filamentation diphasique et non monophasique, on obtient des résultats analogues à ceux consignés dans le tableau IX ci-dessus.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour mettre en évidence l'éventuelle affinité d'une substance (F) choisie parmi l'ensemble constitué par le fibrinogène (Fg), la fibrine (Fn), leurs produits de dégradation (FDP) et leurs mélanges, vis-à- vis des formes filamentaires de souches de levures, ledit procédé, qui comporte la mise en contact desdites formes filamentaires avec ladite substance (F) pour distinguer les souches de levures qui fixent ladite substance (F) de
• celles qui ne la fixent pas, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à
(Ie) cultiver (A) un échantillon contenant des levures à tester essentiellement sous forme de blastospores, susceptible de contenir au moins une substance pouvant interférer dans le méca- nisme d'adhérence de ladite substance (F) sur lesdites levures et convenablement dilué pour éliminer essentiellement toute interférence dans ledit mécanisme, dans (B) un milieu nutritif favorisant la multiplication des blastospores jusqu'à ce que l'on obtienne une population supérieure ou égale à 10* levures/ml, -(2e) cultiver les blastospores de levures, ainsi obtenues, dans un milieu nutritif favorisant la filamentation, (3°) mettre en contact les formes filamentaires, ainsi obtenues, avec une substance (F) choisie parmi l'ensemble constitué par le fibrinogène, la fibrine, les FDP et leurs mélanges, puis (4e) apprécier l'adhérence ou la non-adhérence de ladite substance (F) sur lesdites formes filamen¬ taires.
2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes (2e) à (4e), l'étape (Ie) pouvant être supprimée quand on dispose d'un échantillon contenant des levures, essentiellement constitué de blastospores à une concentration supérieure ou égale à 10* levures/ml et mieux supérieure ou égale à 105 levures/ml, et essentiellement dépourvu ou appauvri en substance pouvant interférer dans le mécanisme d'adhéren¬ ce de ladite substance (F) sur lesdites levures.
3. Procédé suivant l'une quelconque des revendica¬ tions 1 et 2, caractérisé en ce que la filamentation de l'étape (2e) est réalisée pendant une durée d'au moins lh à 25-40° C pour obtenir les formes filamentaires choisies parmi l'ensemble comprenant les formes germinatives et les formes filamenteuses dans le cas des souches de levures qui filamentent, ou des formes blastospores- spherules dans le cas des souches de levures qui donnent lieu à une pseudofilamentation.
4. Procédé suivant l'une quelconque des revendica¬ tions 1 et 2, caractérisé en ce que la filamentation de l'étape (2e) est réalisée pendant 1 à 4 h à 37°C pour obtenir principalement les formes germinatives, qui sont essentiellement constituées par les tubes germinatifs ou leurs analogues blastospores-sphérules.
5. Procédé suivant l'une quelconque des revendica¬ tions 1 et 2, caractérisé en ce que la mise en contact de l'étape (3e) est une incubation pendant au moins 0,5 h à 37eC des formes filamentaires avec ladite substance (F) préalablement fixée sur un support inerte.
6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que ledit support inerte est un latex.
7. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que ladite substance (F) est choisie parmi l'ensemble des PDF du fibrinogène (FgDP) et de la fibrine (FnDP).
8. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que ladite substance (F) est choisie parmi l'ensem- ble des PDF globaux fixés sur un support latex.
9. Procédé suivant l'une quelconque des revendica¬ tions 1, 2 et 5, caractérisé en ce que l'étape (4e) comprend une opération de lecture choisie parmi 1'ense - ble constitué par
(a) l'observation de l'éventuelle adhérence au microscope de ladite substance (F) sur lesdites formes filamentaires de levures,
(b) l'observation de l'éventuelle agglutination du complexe formes filamentaires-F-support et,
(c) l'observation de l'éventuelle formation du complexe formes filamentaires-F ou formes filamentaires-F-support par un substrat enzymatique spécifique des enzymes de levures.
10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que l'observation (c) met en oeuvre un substrat enzymatique spécifique des enzymes ayant une activité leucine-arylamidase.
11. -Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que ledit substrat enzymatique est H-L-Leu-pNA.
12. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que l'observation (b) met en oeuvre l'agglutination du complexe
GT-FDP-latex où GT représente les tubes germinatifs ou leurs analogues blastospores-sphérules.
13. Utilisation du procédé suivant l'une quelconque des revendications -l à 12 pour la détermination de l'affinité d'une substance (F) vis-à-vis des formes filamentaires de souches de levures dans le domaine thérapeutique en clinique humaine ou vétérinaire, dans le domaine agricole et dans le domaine alimentaire.
14. utilisation suivant la revendication 13, pour déterminer le caractère pathogène ou non-pathogène de souches de levures à tester.
15. Procédé pour déterminer le caractère pathogène ou non-pathogène de souches de levures à tester, conforme à l'utilisation suivant la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend (Ie) si nécessaire, la multiplication des blastospores d'un échantillon de souches de levures à tester jusqu'à ce que l'on obtienne une population d'au moins 10* levures/ml et mieux une population supérieure ou égale à 10s levures/ml, (2e) la filamentation des blastospores,
(3e) l'incubation des formes filamentaires, ainsi obtenues, avec ladite substance (F) fixée sur un support inerte, de préférence des PDF globaux fixés sur un latex, et (4e) l'observation du complexe éventuellement formé, de formule formes filamentaires-F-support, par agglutination.
16. Procédé suivant' la revendication 15, caractérisé en ce que la multiplication des blastospores à l'étape
(Ie) ou la filamentation desdites blastospores à 1'étape (2e) est effectuée par hémoculture dans un milieu liquide de préférence aérobie, à partir d'un échantillon de sang ou plasma contenant des souches de levures à tester et préalablement dilué suivant une dilution de χ-χ, où x est un nombre supérieur ou égal à 50, pour éliminer essentiellement toute interférence avec les autres substances contenues dans le plasma et pouvant interférer dans le mécanisme d'adhérence de ladite substance (F) sur lesdites levures, les substances interférentes étant susceptibles de comprendre notamment Fg, Fn, FgDP et FnDP, d'une part, et les protéines de l'inflammation, les composés anti-fongiques qui ont pu être administrés, les anticorps anti(Candidat, d'autre part.
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