WO1994016681A1

WO1994016681A1 - Composition de vaccin sous unitaire recombinant vivant et procede de preparation

Info

Publication number: WO1994016681A1
Application number: PCT/FR1994/000106
Authority: WO
Inventors: Vincent Ganne
Original assignee: Societe D'exploitation De Produits Pour Les Industries Chimiques, S.E.P.P.I.C
Priority date: 1993-01-29
Filing date: 1994-01-28
Publication date: 1994-08-04
Also published as: ES2089923T3; CA2154902A1; DE69400312T2; JP2004137283A; EP0681470B1; DK0681470T3; DE69400312D1; EP0681470A1; FR2700957B1; JPH08505866A; FR2700957A1

Abstract

Une composition de vaccin vivant recombinant comprenant un vaccin sous unitaire recombinant vivant associé à une émulsion injectable, son procédé de préparation et son utilisation.

Description

COMPOSITION DE VACCIN SOUS UNITAIRE RECOMBINANT VIVANT

ET PROCEDE DE PREPARATION

La présente invention concerne de nouvelles compositions vaccinantes associant des vaccins sous unitaires recombinants vivants associés à des émulsions injectables, notamment du type eau dans huile (E/H), huile dans eau (H/E) ou eau dans huile dans eau (E/H/E), pour radmi stration en médecine vétérinaire ou humaine.

La présente invention concerne plus particulièrement les vaccins vivants recombinants dans lesquels la protéine recombinante, qui est une protéine recombinante impliquée dans la réponse immunitaire protectrice contre un micro- organisme, en particulier contre un virus enveloppé, est exprimée in vivo par un vecteur viral constitué par un virus non enveloppé tel l'adénovirus, le virus de la vaccine, le Canarypox virus ou les baculovirus.

La vaccination par des microorganismes vivants présente de nombreux avantages bien connus comparés à la vaccination par des vaccins non vivants constitués de micro-organismes tués ou de protéines ou peptides isolés.

Parmi les vaccins vivants, les vaccins vivants atténués sont largement utilisés, mais ils ont comme inconvénient de présenter des risques pathogènes ; ainsi, il existe toujours une possibilité d'une part, d'intégration de l'acide nucléique viral dans le génome de l'hôte, et d'autre part, de réversion vers une forme virulente.

Par ailleurs, les mutations ou délétions conduisant à l'atténuation de la virulence des vaccins vivants atténués entraînent parfois une diminution de la réponse immunitaire, nécessitant l'injection de doses importantes de composition vaccinale. L'utilisation d'adjuvants a été testé afin de combler la diminution de la réponse immunitaire.

Ainsi le brevet EP 129923 utilise des adjuvants huileux de type H/E pour améliorer la réponse immunitaire.

Si l'on constate ainsi une certaine amélioration de la réponse immunitaire, les microorganismes vivants atténués tels des virus vivants atténués, se présentant habituellement sous forme de lyophilisât, nécessite une solubilisation dans un milieu essentiellement aqueux. La quantité d'huile que l'on peut alors introduire dans la phase aqueuse est très limitée.

Il s'ensuit que seules des émulsions du type H/E peuvent être préparées à partir d'un vaccin vivant atténué.

Par ailleurs, certains microorganismes vivants atténués, tels les virus enveloppés vivants atténués, au contact direct d'une huile ou d'une phase huileuse, peuvent être inactivés, notamment sous l'effet d'une perte de l'intégrité de leur membrane biologique. Les progrès du génie génétique permettent d'obtenir des vaccins sous unitaires recombinants, consistant en des antigènes de plus en plus purifiés, ou totalement synthétiques.

La pureté des vaccins sous unitaires recombinants est un atout incontestable sur le plan de la sécurité du vaccin comparativement aux vaccins atténués vivants.

Habituellement, les vaccins sous unitaires recombinants consistent en une ou plusieurs protéines purifiées produites par des micro-orgamsmes recombinants et injectées chez l'hôte.

En raison de leur pureté même, ces vaccins sous unitaires recombinants non vivants, correspondant à ces vaccins constitués de protéines purifiées produites par des microorganismes recombinants, conduisent en général à une diminution de l'efficacité immunologique ; c'est pourquoi, l'emploi de vaccins sous unitaires recombinants nécessite d'utiliser une quantité importante d'antigènes.

De plus, les vaccins sous unitaires recombinants non vivants nécessitent plusieurs injections ce qui est difficilement compatible avec des impératifs économiques.

Plus récemment, ont été élaborés des vaccins sous unitaires recombinants vivants, consistant en un micro-organisme vivant, généralement un virus, en tant que vecteur recombinant et dans lequel est inséré un gène exogène. Selon l'invention, les vaccins sous-unitaires recombinants vivants sont directement introduits chez l'hôte, dans lequel la protéine est exprimée in vivo, par le gène exogène, inséré dans ledit microorganisme, pour déclencher la réaction immunitaire.

De tels vaccins ont été décrits dans l'article de M. Eloit et al., Journal of General Virology (1990), 71, 2425-2431 ou dans la demande internationale WO-A- 91.00107. Cette dernière décrit plus précisément une méthode pour produire une réponse immune chez l'homme ou l'animal au moyen d'un tel vaccin sous unitaire recombinant vivant qu'il est toutefois nécessaire d'associer à un autre vaccin, consistant en un vecteur codant pour la HTV reverse transcriptase (HTVRT).

Ces deux vaccins sont injectés indépendamment l'un de l'autre, à plusieurs jours, voir plusieurs semaines d'intervalle. Le vaccin HIVRT peut être associé à un adjuvant tel une emulsion E/H, des sels minéraux, des polynucléotides ou des substances naturelles d'origine bactérienne. Le vaccin HIVRT est utile en tant que stimulant (booster) immunitaire du vaccin sous unitaire recombinant vivant.

L'utilisation de vaccins sous unitaires recombinants vivants permet de combler partiellement les inconvénients des vaccins sous unitaires recombinants non vivants ; il nécessite cependant d'injecter des micro-organismes recombinants tels des virus recombinants en des quantités et concentrations très importantes. Mais même ainsi, les réponses immunitaires obtenues restent encore insatisfaisantes. Pour éviter ces inconvénients, comme préconisé dans ladite demande internationale WO-A-91.00107, il est considéré comme nécessaire d'injecter outre le vaccin sous unitaire recombinant, un autre vaccin jouant le rôle de stimulant (booster) immunitaire.

L'invention consiste alors en des vaccins sous unitaires recombinants vivants obviant aux inconvénients mentionnés ci-dessus.

De façon surprenante, l'invention permet en outre d'associer directement des huiles en quantité importante à des microorganismes vivants, tels des virus recombinants vivants, exprimant au moins un antigène d'un virus enveloppé.

La présente invention concerne une nouvelle composition de vaccin vivant recombinant caractérisé en ce qu'elle comprend au moins un vaccin sous unitaire recombinant vivant associée à une emulsion injectable comportant (i) au moins une phase aqueuse et (ii) une phase huileuse comprenant au moins une huile.

Plus particulièrement, les vaccins de l'invention sont des vaccins sous- unitaires recombinants vivants comprenant à titre de vecteur recombinant, un virus recombinant Avantageusement, ce virus est non enveloppé. Il peut notamment être choisi parmi les adénovirus, le virus de la vaccine, le virus Canarypox, les herpès virus, les baculovirus.

Les vaccins recombinants de l'invention sont également caractérisés par l'association avec une emulsion injectable à base d'huile et d'eau ,et le cas échéant d'un système émulgateur, d'un vecteur recombinant viral non enveloppé vivant dont le génome contient, insérée de préférence dans une partie non essentielle pour la réplication du virus enveloppé correspondant, une séquence codant pour une sous- unité antigénique induisant une synthèse d'anticorps et/ou un effet protecteur contre le susdit virus enveloppé ou micro-organisme pathogène. Les sous-unités antigéniques peuvent être par exemple, une protéine, une glycoprotéine, un peptide, ou une fraction peptidique immunogène et/ou protectrice contre une infection par un micro-organisme vivant tel un virus enveloppé, une bactérie ou un parasite.

Ladite emulsion peut être du type H/E, E/H ou E/H/E.

L'intérêt de l'invention consiste dans la possibilité d'obtenir une composition stable, immunogène, fluide, dans une emulsion huileuse et permettant, de manière surprenante, de diminuer la quantité d'immunogènes par rapport à une composition aqueuse du même immunogène.

Les huiles, constituées de ladite phase huileuse, pouvant être utilisées dans la composition de vaccin selon l'invention sont avantageusement des huiles fluides choisies parmi les huiles minérales naturelles ou synthétiques, ou les huiles non minérales d'origines végétales, animales ou synthétiques, connues pour leur absence ou leur faible toxicité.

Elles doivent être liquides à la température de stockage (+4°C) ou au moins donner des émulsions liquides à cette température.

On choisira en particulier des huiles minérales à chaîne linéaire ayant un nombre d'atomes de carbone de préférence supérieur à 16 et exemptes de composés aromatiques.

Des exemples connus sont le MARCOL 52 (produit par ESSO France) et le DRAKEOL 6VR (produit par PENRECO USA).

On peut également utiliser des huiles synthétiques telles que les polyisobutènes ou les polyisoproprènes.

Parmi les huiles végétales, on choisira des huiles insaturées riche en acide oléique qui sont biodégradables, par exemple les huiles d'arachide, d'olive, de sésame, de soja, de germe de blé.

Pour les huiles animales, les mêmes critères de tolérance et d'efficacité immunologiques sont requis. A titre d'exemple d'huile animale, on peut citer, le squalène, le squalane, l'huile de spermaceti.

Un mélange des huiles citées précédemment est avantageusement utilisé dans le cadre de la présente invention.

Habituellement les compositions vaccinales selon l'invention comportent en outre un système émulgateur.

Il doit être adapté pour donner des préparations injectables de type E/H, H/E ,E/H/E fluides et stables.

Il se compose d'un ou plusieurs agents tensioactifs ayant en mélange un caractère lipophile ou hydrophile caractérisé par un nombre HLB (Hydrophile - Lipophile - Balance) compris entre 1 et 19.

Les émulgateurs sont de préférence des esters obtenus par condensation d'un acide gras liquide à 20°C sur un sucre (mannitol, glucose, saccharose) ou du glycérol ou des dérivés de ces esters.

Les acides gras saturés sont de préférence ceux ayant au moins 16 atomes de carbone et en particulier les acides oléique, linoléique, ricinoléique, cétostéarique.

On utilise de préférence les esters du mannitol ou des dérivés d'esters de mannitol. A titre d'ester de mannitol, on peut notamment citer, les oléates de mannitol obtenus, par anhydrisation de la chaîne carbonée polyhydroxylée du mannitol qui se cyclise en 1-4 ou en 2-6. Lesdits dérivés d'ester peuvent consister en des esters dont l'hydrophilie est modifiée par greffage de fonctions hydrophiles telles qu'alcool, polyol, oxyde d'éthylène, oxyde de propylène, acide carboxylique, aminé, amide.

Tous les émulgateurs utilisés doivent être pharmaceutiquement acceptables pour un usage en injectable, notamment être dépourvus de métaux lourds, et présenter des indices d'acide ou de peroxydes très faibles.

Il est également souhaitable qu'ils satisfassent les normes de tests d'innocuité tels que , par exemple, celui décrit par S. S. BERLIN (Annals of allergy,1962, 20, 473).

Les émulgateurs utilisés forment avec l'huile choisie une phase huileuse, homogène, limpide et stable qui sera émulsionnée avec le milieu aqueux propre à chaque préparation injectable.

Le tableau 1 résume la nature minérale ou non minérale, c'est-à-dire métabolisable des huiles, le type d'émulsion vaccinale obtenu et les principales caractéristiques de ces huiles.

Les compositions de vaccin selon l'invention peuvent être utilisées pour préparer un vaccin destiné à vacciner l'homme ou l'-animal, notamment les porcs, les ovins, les bovins, les amidés, les félidés, les volailles et les poissons.

Les concentrations de vaccins sous unitaires recombinants vivants dans les compositions selon l'invention peuvent varier en fonction de la nature de l'animal à vacciner et de celle dudit vaccin. Ces concentrations sont généralement comprises entre 10-2 et 1015 micro-organismes ou virus / ml et de préférence entre 10-5 et 1012 micro-organismes ou virus/ml.

Les volumes de la composition de vaccin selon l'invention à injecter à l'homme ou à l'animal, sont fonction du poids de celui-ci ainsi que de la nature dudit vaccin. Ces volumes peuvent être compris entre 10 μl et 5 ml. Pour l'homme ou un animal de poids voisin, tel certains primates, les volumes injectés peuvent être compris entre 0,25 et 2ml.

Habituellement, une composition de vaccin selon l'invention comprend moins de 1 μg/ml, de préférence moins de 0,3 μg/ml d'antigène, exprimée par le gène exogène dudit vaccin sous-unitaire recombinant vivant, préalablement à l'injection de ladite composition. Selon l'invention, en effet, l'antigène déclenchant le phénomène immunitaire est essentiellement synthétisé in vivo par ledit vaccin ; soit après que celui-ci ait été injecté à l'homme ou à l'animal à vacciner.

Les compositions de vaccin selon l'invention peuvent être préparées par différents procédés classiques, par exemple selon les procédés décrits dans EP 480981 et EP 480982. Un tel procédé permettant l'obtention d'une composition selon rinvnetion peut consister à émulsionner un vaccin vivant recombinant en solution aqueuse avec une huile minérale ou non minérale ou un mélange d'huile minérale et non minérale sous la forme d'une emulsion E/H, H/E ou E/H/E. L'huile ou les huiles peuvent être associées à un adjuvant de l'immunité cellulaire telle l'avridine".

Les proportions pondérales de la phase huileuse contenant l'huile associée ou non au système émulgateur et de la phase aqueuse contenant le antigènes ou les principes actifs varient respectivement dans l'émulsion de 5 à 95% de phase huileuse, pour de 95 à 5% de phase aqueuse notamment de 25 à 75% de phase huileuse pour 75 à 25% de phase aqueuse.

Le mélange de la phase huileuse et de la phase aqueuse se fait de manière classique, sous agitation à des températures comprises entre 20° et 40°C. L'ensemble des préparations obtenues doivent être stables, c'est à dire que la préparation émulsionnée ne doit pas déphaser, ce qui signifie l'absence de libération de la phase antigénique ou de la phase huileuse dans les conditions de stockage normales pour ce type de produit. Les compositions selon l'invention peuvent présenter une stabilité supérieure ou égale à 12 mois à 4°C.

De plus, ces préparations vaccinales sont fluides, c'est à dire que la viscosité mesurée par un appareil à mobile tournant du type BROOKFLELD peut être inférieure à 200 mPa.s, avantageusement inférieure à 300 mPa.s à 25 °C.

Le caractère huileux ou aqueux de la phase continue de l'émulsion est caractérisée par la conductivité mesurée en microsiemens par cm.

Pour des valeurs inférieures à 20 microsiemens par cm environ, on obtient une phase continue huileuse à température ambiante.

Font également parties de l'invention les vaccins recombinants vivants dans lequel la séquence codante dans ledit vaccin code par exemple pour une sous- unité antigénique des virus HIV tels les virus HTV1 ou HTV2, ou le virus FIV, l'expression de cette sous-unité antigénique induisant une synthèse d'anticorps et/ou un effet protecteur contre ces mêmes virus.

Dans les exemples qui suivent, la composition vaccinale utilisée est un adénovirus défectif exprimant la glycoprotéine gp 50 du virus de la pseudorage (PRV). La construction de l'adénovirus recombinant Ad-gp 50, l'expression de l'antigène gp 50 dans des cultures cellulaires, la réponse immunitaire et la protection conférée par vaccination de souris et de lapins avec Ad-gp 50 sont décrits dans la publication de M.Eloit et al, Journal of General Virology (1990), 71 : 2425-2431.

Brièvement, la lignée cellulaire 293, une lignée embryonnaire humaine transformée par un adénovirus de type 5 (Ad-5) (Graham et al, 1977, Journal of General Virology, 36 : 59-72) a été utilisée pour la transfection, la multiplication et le titrage de l'adénovirus. La construction de Ad - gp 50 utilise un Ad 5 délété dans la région E3 non essentielle à la croissance du virus.

L'Ad - gp 50 exprime de hauts niveaux de gp 50 dans les lignées cellulaires complétant ou non El A, et notamment dans les cellules Hela déplétées pour le gène El A.

Les auteurs remarquent que, in vivo, la réponse en anticorps, mesurée par un test ELISA,est significative pour des concentrations élevées en Ad-gp50 tandis que la protection conférée à des souris ou des lapins est faible après épreuve à l'infection par le PRV.

L'intérêt de l'invention consiste à émulsionner ce type de vaccin vivant recombinant dans des huiles associées à des émulgateurs décrits plus haut afin d'augmenter, d'une part, leur pouvoir immunogène et protecteur en diminuant les doses de virus vivants injectés, et d'autre part, d'augmenter la synthèse de cytokines telles les erleukines, en particulier les IL2 et les IL6.

Dans les différents exemples qui suivent le virus Aujeszky est équivalent à PRV.

Exemple 1 (comparatif) : Induction d'anticorps et efficacité de la vaccination en absence d'adjuvants

Le vaccin est constitué d'adénovirus recombinants Ad - gp 50 décrits précédemment.

Les compositions de vaccins, à trois concentrations d' Ad-gp 50, Cl, C2 et C3, sont inoculés à JO par voie sous cutanée dans des souris OF1, réparties en trois groupes, (10 souris par groupe), à raison de 100 μl par souris. Les trois concentrations vaccinales utilisées sont définies comme suit : - 109 -virus/ml, soit 10⁸ TC ID50/souris (Cl)

- 3.108 virus/ml, soit 10^4 TCID/50 souris (C2)

- 3.107 virus/ml, soit lθ TCID/50 souris (C3)

Le protocole utilisé pour évaluer l'efficacité de la préparation vaccinale est décrit sur la figure 1.

Un prélèvement de sérum est effectué deux semaines plus tard pour évaluer la quantité d'anticorps anti gp 50 induite par les préparations vaccinales.

Pour évaluer l'efficacité des vaccins, une épreuve "challenge" est effectuée en présence d'une préparation de virus Aujeszky virulente à la concentration de 20 DL50, définie par une expérimentation préliminaire.

Ladite concentration correspond à une mortalité de 100% chez des souris non vaccinées. La mortalité est observé sur 240 heures ; au - delà de cette période toutes les souris résistent à l'épreuve. Deux paramètres sont validés :

- le taux de survie, exprimé en pourcentage, observé à la fin de rexpérimentation

- la cinétique de mortalité.

Résultats

- Dosage des anticorps anti gp 50 :

Le prélèvement du sérum est effectué deux semaines après les immunisations.

Le dosage des anticorps anti gp 50 est effectué par ELISA, par la technique décrite par Eloit et coll.,Veterinary Record, 1989, 124 : 91-94.

Les résultats obtenus sont représentés dans la figure 2, dans laquelle :

- Cl, C2, C3 représentent respectivement les trois concentrations d' Ad-gp 50 : 10^, 3.10⁸ et 3.10⁷ virus/ml.

- les titres sont indiqués en ordonnées et indiquent la dilution nécessaire à l'obtention d'une D.O.(densité optique) supérieure au bruit de fond;

- T indique un témoin absolu : non vacciné ;

En absence d'adjuvant, une induction d'anticorps est obtenue uniquement à la concentration de 10^ Ad-gp50/ml ; aux concentration de 3.10⁸ et 3.10⁷ Ad- gp50/ml, on ne détecte pas d'anticorps anti gp 50.

- Epreuve avec le virus virulent

La résistance à l'épreuve par du virus Aujeszky est évaluée aux trois concentrations vaccinales Cl, C2 et C3.

Les taux de survie après l'épreuve sont présentées sur la figure 3. Le pourcentage de survie est exprimée en ordonnées.

Une protection partielle au challenge (50%) est observé en présence de Cl (lθ9 Ad-gp50/ml).

Pour C2 (3.10⁸ /ml ) et C3 (3.10⁷ /ml), une absence de protection significative est observée par rapport à un témoin absolu (non vacciné). Le témoin absolu (non vacciné) présente un taux de mortalité de 100%.

La figure 4 représente la cinétique de survie à l'épreuve de l'infection par le virus Aujeszky après immunisation sans adjuvant. Le pourcentage de viabilité est exprimé en ordonnée. On note que la mortalité est observée avant 120 heures pour le témoin comme pour les concentrations C2 et C3.

On remarque donc qu'en l'absence d'adjuvant, l'adénovirus recombinant est incapable d'induire des anticorps anti gp50 et d'induire une quelconque protection au challenge avec le virus Aujeszky infectieux à une concentration inférieure à lu-⁹ Ad- gp50 /ml. Seule une protection partielle est obtenue avec une concentration de 10^ Ad-gp50/ml.

- Exemple 2 : Induction d'une réponse immunitaire et d'une protection à l'épreuve du virus Aujeszky en présence d'adjuvant huileux de type E/H, H E, E H/E ;

Les 6 adjuvants décrits dans le tableau 1 ci-après ont été testés quant à leur potentialité à induire des anticorps anti gp 50 et à induire une résistance après une épreuve avec des virus Aujeszky infectieux telle que définie dans l'exemple 1. Les préparations vaccinales sont réalisées à la seringue par mélange de l'adjuvant et des virus recombinants aux concentrations Cl, C2 et C3, telles que définies dans l'exemple 1, dans les préparations suivantes :

1) Préparations vaccinales H/E

préparation n°l

25% adjuvant (huile + système émulgateur)(l) 75% composition immunogène (1)= Montanide ISA 25

préparation n°2

25% adjuvant (huile + système émulgateur + avridine) (²) 75% composition immunogène (2)= Montanide ISA 25A

préparation n°3

20% adjuvant (huile + système émulgateur)(³) 80% composition immunogène (3) Montanide ISA 28 2) Préparations vaccinales E H E

préparation n°4

50% adjuvant (huile + système émulgateur)(4) 50% composition immunogène (4) Montanide ISA 206

3 ) Préparations vaccinales E H

préparation n°5

55% adjuvant (huile + système émulgateur)(5) 45% composition immunogène

(5) Montanide ISA 50

préparation n°6

70% adjuvant (huile + système émulgateur)W 30% composition immunogène

(6) Montanide ISA 708

TABLEAU I

N° ADJUVANT HUILE TYPE DE % Phase VISCOSITE CONDUCTTVΠΈ VACCIN aqueuse/Adjuvant (m.Pa.s) 25°C

(en poids) (μ S. cm"*

1 MONTANIDE Minérale H/E 75 % 20 5000 ISA 25

2 MONTANIDE Minérale + H/E 75 % 20 5000 ISA 25A Avridine*

3 MONTANIDE Minérale + H/E 75 % 25 1000 ISA 28 non minérale

4 MONTANIDE Minérale E/H E 50 % 50 1000 ISA 206

5 MONTANIDE Minérale E/H 50 % 200 1 ISA 50

6 MONTANIDE Non E H 30 % 70 1 ISA 708 minérale

* Avridine = N,N-dioctadecyl-N-bis (2-hydroxye1hyl)-propanediamine

Tous les Montanides ISA mentionnés ci-dessus sont fabriqués et commercialisés par la société SEPPIC. Les émulgateurs qu'ils comportent, sont des dérivés d'ester de mannitol. Ces préparations sont comparées :

- aux préparations vaccinales sans adjuvant décrites dans l'exemple 1 (Tl)

- à deux groupes témoins constitués pour l'un des souris non vaccinées (T2) et pour l'autre de souris dans lesquelles on injecte l'adjuvant,Montanide ISA 50, en absence d'Ad-gp50 (T3).

Les dosages des anticorps anti gp50, les mesures des pourcentages de taux de survie et les mesure de cinétique de mortalité sont réalisés selon les protocoles décrits dans l'exemple 1 ci-dessus.

Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 2 ci-dessous et sur les figures 5, 6, 7, 8, 9, 10, dans lesquels Cl, C2, C3 ont les mêmes significations que dans l'exemple 1. TABLEAU π

ADJUVANT Ad - gp50 concentration ELISA titre

Montanide ISA 25 Cl > 256

Montanide ISA 25 C2 128

Montanide ISA 25 C3 < 4

Montanide ISA 25 A Cl > 256

Montanide ISA 25 A C2 90

Montanide ISA 25 A C3 90

Montanide ISA 28 Cl > 256

Montanide ISA 28 C2 256

Montanide ISA 28 C3 32

Montanide ISA 206 Cl > 256

Montanide ISA 206 C2 256

Montanide ISA 206 C3 > 256

Montanide ISA 50 Cl > 256

Montanide ISA 50 C2 > 256

Montanide ISA 50 C3 < 4

Montanide ISA 708 Cl > 256

Montanide ISA 708 C2 > 256

Montanide ISA 708 C3 < 4 néant (Tl) Cl 256 néant C2 < 4 néant C3 < 4

Montanide ISA 50 (T3) 0 < 4 néant (T2) 0 < 4

a) Résultats avec des émulsions type H/E

- Dosage des anticorps anti gp 50

Le tableau 2 montre que les taux d'anticorps anti gp 50 sont significativement supérieurs à ceux obtenus avec le témoin sans adjuvant et ce respectivement pour les Montanides ISA 25 , Montanide ISA 25 A, qui est le Montanide ISA 25 additionnée d'avridine, stimulant de l'immunité cellulaire et le Montanide ISA 28.

-Epreuve avec le virus virulent

Les figures 5, 6, 7, indiquent le pourcentage de viabilité en fonction du temps pour les trois concentrations vaccinales, comparées au témoin T2, et ce respectivement pour les Montanides ISA 25 (figure 5), Montanide ISA 25 A (figure 6), et le Montanide ISA 28 (figure 7); L'effet adjuvant est à comparer aux résultats obtenus sans adjuvant et représenté sur la figure 4.

b) Résultats avec des émulsions de type E/H/E ;

- Dosage des anticorps anti gp 50

Les résultats représentée sur le tableau 2 montrent clairement que le taux d'anticorps anti gp 50 obtenu en présence de Montanide ISA 206 est significativement supérieur à ceux obtenus avec le témoin T2 pour les 3 concentrations de gp50 testés.

- Epreuve avec le virus virulent

La figure 8 représente les résultats après challenge obtenus avec l'huile minérale Montanide ISA 206 en association avec l'Ad-gp 50.

Un taux de survie de 70% et 50% sont obtenus pour les concentrations les plus faibles d'Ad-gp 50

c) Résultats avec des émulsions de type E/H

- Dosage des anticorps anti gp 50

Le tableau 2 montre un taux d'anticorps significativement détectables . à la concentration de 3.10^ Ad- gp50/ml tandis que pour cette même concentration la détection d'anticorps anti gp 50 est impossible en l'absence d'adjuvant.

- Epreuve avec le virus virulent

Les résultats obtenus avec le Montanide ISA 50 (huile minérale) et le Montanide ISA 708 (huile minérale) sont représentés respectivement sur la figure 9 et 10. Un taux de survie supérieur à 60% pour le Montanide ISA 50 et à 50% pour le Montanide ISA 708 est obtenu pour toutes les concentrations d'Ad- gp50.

En l'absence d'adjuvant selon l'invention, on rappelle (voir figure 4) que le taux de survie est de 10% avec les concentrations C2 et C3.

Le tableau 2 indique donc clairement que le taux d'anticorps anti gp 50 en présence des adjuvants selon l'invention est significativement supérieur à celui obtenu en absence d'adjuvant huileux.

Les figures 4 à 10 indiquent que, alors qu'en l'absence d'adjuvant huileux selon l'invention, (figure 4) on observe une protection partielle (50%) au challenge en présence de 10^ Ad-gp50/ml et une absence de protection (10%) en présence de 3.10⁸ et 3.10⁷ Ad-gp50/ml. L'utilisation de Montanide ISA permet d'obtenir des taux de protection jusqu'à 100%. pour la concentration la plus élevée (10⁹ Ad-gp50/ml), 90% (3.10⁸ Ad-gp50/ml) et 60% (3.107 Ad-gp50/ml).

L'ensemble de cet étude permet de montrer l'intérêt d'utiliser des adjuvants de type huileux selon l'invention sur des vaccins sous-unitaires recombinants vivants permettant d'augmenter de manière significative le taux d'anticorps spécifiques du gène exprimé et la protection contre l'agent infectieux. Ces résultats significatifs sont obtenus en primovaccination. Parmi les vaccins adjuvés efficaces testés on distingue donc :

- Les vaccins de type E/H (Montanide ISA 50 et ISA 708):

* ils induisent d'importants taux d'anticorps aux concentrations de 10⁹ et 3.10⁸ Ad-gp50/ml tandis qu'ils ne sont pas détectables à la concentration de 3.10⁷ Ad-gp50/ml.

* ils protègent contre le challenge avec le virus Aujeszky infectieux pour les trois concentrations testées à des taux supérieurs à 50%.

Il semble donc ici qu'il n'y a pas ici de stricte corrélation entre le taux de survie et l'induction d'anticorps anti gp 50. Ce phénomène pourrait être lié à :

- une induction très importante d'une classe d'immunoglobuline non détectable par le dosage ELISA utilisé (IgM, IgA, IgE).

- et/ou l'induction d'une immunité de type cellulaire.

- Les vaccins de type E/H/E (Montanide ISA 206) :

* ils induisent des taux d'anticorps très importants pour les trois concentrations d'Ad-gp50 testés (10⁹/ml, 3.10⁸/ml, 3.10⁷/ml).

* ils protègent contre le virus Aujeszky infectieux pour les trois concentrations testées à des taux supérieurs à 50%.

- Les vaccins de type H/E avec les Montanide ISA 25 et ISA 28

* ils induisent des taux d'anticorps spécifiques anti gp 50 importants aux concentrations de 10⁹ et 3.10⁸ Ad-gp50/ml tandis qu'en présence de Montanide ISA 28 on détecte encore la présence d'anticorps anti gp 50 à la concentration d'Ad-gp 50 la plus faible (3.10⁷/ml)-

* ils protègent contre le virus Aujeszky infectieux avec le Montanide ISA 28 à des taux compris entre 40 et 55%.

Ce type de vaccins (H/E) apparaît cependant globalement moins efficaces que les vaccins de type E/H ou E/H/E. - Les vaccins de type H/E avec un adjuvant de l'immunité cellulaire.

L'adjonction d'un adjuvant de type avridine au Montanide ISA 25 permet d'obtenir des protections à l'épreuve de 100 % pour la concentration d'Ad-gp50 la plus élevée (10 /ml) sans induire une quantité plus importante d'anticorps anti gp 50.

- Obervations de réactions locales:

Une observation macrocospique ne révèle ni de réactions locales, ni de granulomes au site d'injection.

EXEMPLE 3

Induction de la synthèse d'anticorps et d'Interleukines

Les 6 adjuvants décrits dans le Tableau 1 ont été testés quant à leur potentialité à induire la synthèse de l'Interleukine IL2.

Les compositions de vaccin comprenant lesdits adjuvants ont été injectées à différents groupes de 10 souris chacun.

Chaque groupe a été vacciné avec une composition de vaccin comprenant l'un des 6 adjuvants et Ad-gp 50 en des concentrations Cl, C2 ou C3, telle que définies dans l'exemple 1.

A titre comparatif, on a injecté à d'autres groupes de 10 souris une composition ne comprenant pas, soit un adjuvant selon l'invention, soit Ad-gp 50, soit encore ni adjuvant ni Ad-gp 50.

Dans tous les cas, chaque souris a été traitée par 100 μl de composition.

Le titre sérique en IL2, obtenus 14 jours après la vaccination, figurent dans le Tableau 3, ci-après. Ce titre a été mesuré par une technique ELISA commercialisée par la société Genzyme corps.

TABLEAU 3

ADJUVANT Ad - gp50 (concentration) IL2 titre (pg/ml)

Montanide ISA 25 Cl 70

Montanide ISA 25 C2 55

Montanide ISA 25 C3 60

Montanide ISA 25 A Cl 110

Montanide ISA 25 A C2 75

Montanide ISA 25 A C3 75

Montanide ISA 28 Cl 110

Montanide ISA 28 C2 75

Montanide ISA 28 C3 100

Montanide ISA 206 Cl 110

Montanide ISA 206 C2 95

Montanide ISA 206 C3 90

Montanide ISA 50 Cl 125

Montanide ISA 50 C2 100

Montanide ISA 50 C3 70

Montanide ISA 708 Cl 140

Montanide ISA 708 C2 100

Montanide ISA 708 C3 60 néant Cl 55 néant C2 < 50 néant C3 < 50

Montanide ISA 50 néant < 50 néant néant < 50

Comme il apparaît des résultats obtenus, la synthèse d'IL2 est fortement stimulée par un adjuvant associé à l'Ad-gp 50 , selon l'invention.

EXEMPLE 4

Les adjuvants Montanide ISA 25, Montanide ISA 206 et Montanide 50, tels que décrits dans le Tableau 1, ont été testés quant à leur potentialité à induire la synthèse de l' terleukine IL6.

Chaque groupe a été vacciné avec une composition de vaccin comprenant l'un desdits adjuvants et Ad-gp 50 en des concentations C , C2 ou C3, telles que définies dans l'exemple 1. A titre comparatif, on a traité d'autres groupes de 10 souris en leur injectant une composition ne comprenant pas, soit un adjuvant selon l'invention, soit Ad-gp50, soit encore, ni adjuvant, ni Ad-gp 50. Dans tous les cas, on a injecté 100 μl de composition à chaque souris. Le titre sérique en IL6, obtenu 14 jours après l'injection, figure dans le Tableau 4, ci-dessous. Ce titre en IL6 a été mesuré par une technique ELISA classique commercialisée par la société Endogen.

TABLEAU 4

ADJUVANT Ad-gp50 IL6 (pg/ml)

MONTANIDE ISA 25 Cl < 50

MONTANIDE ISA 25 C2 < 50

MONTANIDE ISA 25 C3 < 50

MONTANIDE ISA 25A Cl < 50

MONTANIDE ISA 25A C2 < 50

MONTANIDE ISA 25A C3 < 50

MONTANIDE ISA 206 Cl 1250

MONTANIDE ISA 206 C2 110

MONTANIDE ISA 206 C3 1250

MONTANIDE ISA 50 Cl < 50

MONTANIDE ISA 50 C2 < 50

MONTANIDE ISA 50 C3 <50 néant Cl < 50 néant C2 < 50 néant C3 <50

MONTANIDE ISA 50 néant < 50 néant < 50

Comme il apparaît des résultats obtenus, la synthèse d'IL6 est stimulée par la composition de vaccin comprenant l'adjuvant Montanide ISA 206, du type emulsion E/H/E, associé à l'Ad-gp50.

EXEMPLE 5

Les 6 adjuvants décrits dans le Tableau 1 ont été testés quant à leur potentialité à induire la synthèse des quatre différentes sous-classes d'Anticorps anti gp50, à savoir les Ig Gl, Ig G2a, Ig G2b et Ig G3.

Les compositions de vaccin ont été injectées à des groupes de 10 souris chacun. Chaque groupe de souris a été vacciné avec une composition de vaccin comprenant l'un des 6 adjuvants et Ad-gp50 en des concentrations Cl, C2 ou C3, telles que définies dans l'exemple 1.

A titre comparatif, on a traité d'autres groupes de 10 souris en leur injectant une composition ne comprenant pas, soit un adjuvant selon l'invention, soit Ad-gp 50, soit encore, ni adjuvant, ni Ad-gp 50.

Dans tous les cas, les souris ont chacune été traitées par injections de 100 μl de composition selon l'invention ou comparative.

Le titre sérique (exprimé par la dernière dilution à laquelle l'adsorption est supérieure à celle du témoin consistant en une composition comprenant un adjuvant et pas Ad-gp50), en chaque anticorps IgG, obtenus 14 jours après l'injection de ladite composition, figure dans le Tableau 5, ci-après. Le titre sérique a été mesuré de manière classique par une méthode ELISA.

TABLEAU 5

ADJUVANT Ad-GP 50 IgGl IgG2a IgG2b IgG3

Montanide ISA 25 Cl 1024 32 32 8

Montanide ISA 25 l 256 32 16 8

Montanide ISA 25 C3 16 <8 <8 <8

Montanide ISA 25A Cl 1024 128 128 64

Montanide ISA 25 A C2 512 16 16 8

Montanide ISA 25 A C3 128 16 32 <8

Montanide ISA 28 Cl 512 128 128 16

Montanide ISA 28 C2 512 64 128 <8

Montanide ISA 28 C3 128 <8 <8 <8

Montanide ISA 206 Cl 2048 1024 512 32

Montanide ISA 206 C2 512 128 64 16

Montanide ISA 206 C3 1024 128 64 32

Montanide ISA 50 Cl 1024 512 512 128

Montanide ISA 50 C2 512 64 64 64

Montanide ISA 50 C3 <8 <8 <8 <8

Montanide ISA 708 Cl 5096 512 512 128

Montanide ISA 708 C2 1024 64 64 32 néant Cl 128 64 32 8 néant C2 8 <8 <8 <8 néant C3 <8 <8 <8 <8

Montanide ISA 50 néant <8 <8 <8 <8 néant néant <8 <8 <8 <8

Comme il apparaît des résultats, une composition de vaccin selon l'invention permet la synthèse des 4 sous-classes d'anticorps anti-gp 50.

Il va de soi que les exemples ci-dessus sont donnés à titre illustratif. L'invention concerne aussi toute composition contenant une ou des huiles minérales, non minérales ou mixtes (minérale + non minérale) associé à un système émulgateur présentant les caractéristiques physicochimiques (viscosité, conductivité) des Montanide ISA et susceptibles d'être émulsionnée avec une solution aqueuse contenant un vaccin recombinant, dans lequel une protéine ou une peptide immunogène de n'importe quel agent pathogène est exprimé dans un vacteur dont la réplication est compatible avec une emulsion huileuse.

Claims

REVENDICATIONS

1. Composition de vaccin vivant recombinant caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un vaccin sous unitaire recombinant vivant associée à une emulsion injectable comportant (i) au moins une phase aqueuse et (ii) une phase huileuse comprenant au moins une huile.

2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le vaccin sous unitaire recombinant vivant comporte un vecteur recombinant consistant en un virus recombinant, de préférence un virus recombinant non enveloppé.

3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que le virus recombinant est choisi parmi les adénovirus, le virus de la vaccine, le Canarypox virus, les herpès virus ou les baculovirus.

4. Composition selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisée en ce que le virus recombinant est un adénovirus.

5. Composition selon l'une des revendications 2 à 3 caractérisée en ce que le virus recombinant est le canarypox virus.

6. Composition selon l'une des revendications 2 à 3 caractérisée en ce que le virus recombinant est un baculovirus.

7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la phase huileuse comporte un système émulgateur.

8. Composition selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que ladite emulsion est du type E/H/E ou du type E/H.

9. Composition de vaccin vivant contre un virus enveloppé ou un micro-organisme pathogène caractérisée par l'association avec une emulsion injectable à base d'eau et d'une phase huileuse comportant au moins une huile et, le cas échéant, un système émulgateur, d'un vaccin sous-unitaire recombinant vivant consistant en un vecteur recombinant viral vivant dont le génome contient, une séquence codant pour une sous unité antigénique induisant une synthèse d'anticorps et/ou un effet protecteur contre le susdit virus enveloppé ou micro-organisme pathogène.

10. Composition selon la revendication 9 et 10 caractérisée en ce que le vecteur viral est un virus non-enveloppé.

11. Composition selon l'une des revendications 9 et 10 caractérisée en ce que ladite séquence code pour une sous-unité antigénique induisant un effet protecteur contre les virus HIV tels les virus HIV1 ou HIV2.

12. Composition selon l'une des revendications 9 et 10 caractérisée en ce que la dite séquence code pour une sous-unité antigénique induisant un effet protecteur contre le virus FIV.

13. Composition selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisée en ce que ladite séquence code pour une sous-unité antigénique induisant un effet protecteur contre le virus Aujesky.

14. Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce que la séquence contenue dans le génome du vecteur viral est une séquence codant pour la glycoprotéine gp 50 du virus Aujeszky, et en ce qu'il est protecteur vis à vis d'une infection par le virus Aujeszky.

15. Composition selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisée en ce que l'huile est de type minéral ou non minéral.

16. Composition selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce qu'elle présente une stabilité supérieure ou égale à 12 mois à 4°C et une viscosité inférieure à 300 millipascals .s à 25 °C.

17. Composition selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisée par le fait que les proportions pondérales de la phase huileuse contenant de l'huile associée ou non au système émulgateur, et de la phase aqueuse contenant les antigènes ou les principes actifs varient respectivement de 5 à 95% de phase huileuse, pour de 95 à 5% de phase aqueuse notamment de 25 à 75% de phase huileuse pour 75 à 25% de phase aqueuse.

18. Composition selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisée en ce que la phase huileuse contient un système émulgateur comprenant (i) un ester obtenu par condensation d'un acide gras, liquide à 20°C, sur un sucre ou du glycérol, ou/et (ii) un dérivé d'un tel ester.

19. Composition selon la revendication 18 caractérisée en ce que ledit sucre est le mannitol.

20. Procédé de préparation d'une composition de vaccin vivant recombinant caractérisé en ce qu'il consiste à émulsionner un vaccin vivant recombinant en solution aqueuse avec une huile minérale ou non minérale ou un mélange d'huile minérale ou non minérale sous la forme d'une emulsion E/H ou H/E ou E/H/E.

21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que l'huile minérale ou non minérale peut être associé à un adjuvant de l'immunité cellulaire tel ravridine.

22. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 19 pour préparer un vaccin destiné à l'homme ou l'animal.

23. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 19 pour préparer un vaccin destiné à l'induction de la synthèse de cytokines, en particulier des interleukines.

24. Utilisation selon la revendication 23, caractérisée en ce que lesdites interleukines consistent en 1TL2 ou 1TL6.