WO1994015217A1 - Verfahren zur bestimmung von herzmuskelnekrosen mittels antikörper gegen das n-terminale troponin i-peptid - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von herzmuskelnekrosen mittels antikörper gegen das n-terminale troponin i-peptid Download PDF

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WO1994015217A1
WO1994015217A1 PCT/EP1993/003661 EP9303661W WO9415217A1 WO 1994015217 A1 WO1994015217 A1 WO 1994015217A1 EP 9303661 W EP9303661 W EP 9303661W WO 9415217 A1 WO9415217 A1 WO 9415217A1
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peptide
antibody
seq
amino acid
amino acids
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Helmut Lill
Frédéric DONIÉ
Anneliese Borgya
Christoph Seidel
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Boehringer Mannheim Gmbh
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Definitions

  • the invention relates to a method for the determination of cardiac muscle necrosis by means of antibodies against the N-termina troponin I peptide, in which a blood sample with an antibody against the N-terminal troponin I peptide is added and the complex which is formed is detected and the complex formed therein drive antibodies used and a method for the production of such antibodies.
  • the myofibrils of the striated muscle consist of two interacting protein filaments, the thick filament with myosin as the main component and the thin filament containing actin, tropomyosin and troponine.
  • Troponin is a complex structural component in the cells and consists of three different proteins:
  • Troponin C binds calcium ions
  • Troponin I an actin binding subunit
  • Troponin T attaches to tropomyosin.
  • troponin Three isoforms of troponin I are known, corresponding to their occurrence in the heart muscle (Tnlc), slow skeletal muscles (Tnls) and fast skeletal muscles (Tnlf). Cardiac troponin I differs from skeletal troponin I mainly by an additional N-terminal sequence of approx. 30 amino acids.
  • Cardiac troponin I is released after an acute myocardial infarction and can be detected in the blood plasma. It thus represents a marker for myocardial cell necrosis. Cummins, J. Mol. Cell. Card. 19 (1987), 999-1010 and Cummi and Cummins, Clin. Invest. 113 (1987), 1333-1344 could prove that Tnlc in serum normally occurs in concentrations of 10 ng / ml. It was shown that an increased serum concentration z can be observed in transmural infarction. Tnlc was increased from the 4th to 168th hour after the onset of pain in 37 patients with acute transmural infarction. Similar results were obtained in the animal model. Thereafter, the time interval for the absolute diagnostic sensitivity for Tnlc is the 10th - 50th hour after the infarction event.
  • MAK monoclonal antibodies
  • Tnlc monoclonal antibodies
  • some of the MAK bind the MAK 3C6 or 11E12 in the N-terminal region of Tnlc. None of these antibodies recognize an epitope between amino acids 14 to 24 well.
  • the MAK 11E1 obviously recognizes an epitope between the amino acids 14 to 37.
  • this MAK requires the amino acids N and Y in position 25 and 26, that is to say its epitope lies approximately between the amino acids 21 to 30. The same applies to the others published MAKs. Bodor et al., Clin. Chem.
  • Tnlc is subject to proteolytic cleavage, which can take place both intra- and extracellularly.
  • an N-terminal fragment of Tnlc can be cleaved off here.
  • Tnl recovery may be too low in the tests described so far, since the epitopes are separated from antibodies between which there is a cleavage site.
  • the object of the present invention was to develop a determination method which avoids false negative results in the Tnlc determination.
  • Another object of the invention is an antibody which recognizes the N-terminal peptide of cardiac troponin I and is obtainable by immunization with an immunogen which contains a peptide of the amino acid sequence SEQ ID NO 1 or at least a partial sequence thereof with at least 6 amino acids in length and Isolation of the antibody from the serum of the immunized animals by known methods and a monoclonal antibody which recognizes the N-terminal peptide of cardiac troponin I and is obtainable by immunization with an immunogen which is a peptide of the amino acid sequence SEQ ID NO 1 or at least one Contains partial sequence thereof with at least 6 amino acids in length, immortalization of the spleen cells of the immunized animals, cloning of those immortalized cells that produce the desired antibody and isolation of the antibody from d cloned cells by known methods.
  • Another object of the invention is the use of synthetic peptides of the amino acid sequence SEQ ID NO 1 or at least a partial sequence thereof with at least 6 amino acids in length as an immunogen for the production of polyclonal and monoclonal antibodies, as standard material, polyhapten or labeled antigen in immunoassays.
  • a synthetic peptide is to be understood as meaning peptides which have been produced by chemical synthesis as well as by recombinant production.
  • the immunological determination method for cardiac muscle necrosis is carried out using methods familiar to the person skilled in the art.
  • the determination in samples, ie body fluids such as blood, plasma or serum can be carried out by a radio immunoassay, enzyme immunoassay chemiluminescence immunoassay or by immunofluorescence. All known methods such as competitive immunoassays, sandwich immunoassays and IE methods or homogeneous immunoassays such as CEDIA ® can be used as a method variant. It is possible to carry out the test in the form of a wet test or dry test. In some cases it is advantageous to denature the sample before or during the determination.
  • the Tnlc-specific body is immobilized on a solid phase.
  • the immobilization can be done adsorptively, covalently or via a specific binding such as biotin / streptavidin, antibody / antigen or sugar / lectin.
  • the Tnlc-specific antibody according to the invention is bound to one of these binding partners.
  • the other binding partner is bound to the solid phase.
  • materials such as. B. tubes, plastic cuvettes, microtiter plates, spheres, magnetic particles or microcarries made of plastics such as polystyrene, vinyl polymers, Polypropylene, polycarbonate, polysaccharides, silicones, rubber or treated glass (see, for example, ET Maggio, Enzyme Immunoassays, CAC. Press, Florida (1980), in particular pages 175-178, EP-A-0 063 064, Bioengineering 16 (1974) , 997-1003, CJ Senderson and DV Wilson, Immunology 20 (1971), 1061-1065).
  • plastics such as polystyrene, vinyl polymers, Polypropylene, polycarbonate, polysaccharides, silicones, rubber or treated glass
  • a carrier material coated with avidin or streptavidin, in particular polystyrene, preferably produced as described in EA-0 269 092, is used as the solid phase.
  • the usual nonwovens such as cellulose or glass fiber nonwovens as well as membranes are to be used as the solid phase in a dry test.
  • the sandwich test has proven particularly useful. At least one antibody according to the invention must be used.
  • the second antibody can be a further antibody according to the invention, but an antibody of the prior art can also be used. The prerequisite is that the two antibodies do not, or only insignificantly, cross-react with one another.
  • An immobilized antibody which recognizes the N-terminal peptide of cardiac troponin I is preferably used in combination with a second Tnlc-specific antibody to which a determinable group is coupled. Common label groups such as enzymes or fluorescent or luminescent residues can be used as a definable group.
  • the second antibody which also preferably recognizes the N-terminal peptide of Tnlc, is selected so that it does not or only insignificantly interferes with the binding of the first antibody to this peptide.
  • Both antibodies can be directed against different epitopes on the N-terminal peptide of Tnlc.
  • the test can be carried out successively, ie an antibody is first incubated with the sample before the second antibody is added, or simultaneously, ie all the reactants are added simultaneously in the test. Since the N-terminal peptide of Tnlc can be phosphorylated on the two serine residues in positions 23 and 24, an anti-phosphorus serine antibody can be used as a second antibody in the sandwich immunoassay. Anti-phosphorus-serine antibodies are known per se.
  • Another preferred embodiment is the competitive test.
  • the use of a synthetic peptide as the labeled antigen in the test is preferred because it always has the same and therefore standardizable composition and, in contrast to the naturally occurring Tnlc, is not unstable.
  • TINIA the turbidometric metric inhibition immunoassay
  • a sample is mixed with a polyhapten, which consists of a carrier, for example a late particle or dextran and attached N-terminal Tnl peptides of the amino acid sequence SEQ ID NO 1 or at least a partial sequence thereof with a length of at least 6 amino acids, exists and incubated the antibodies of the invention.
  • Immune complexes are formed from polyhapten or Tnlc and antibodies. The binding of the antibodies to the polyhapten leads to aggregates that can be measured by increasing the turbidity.
  • the binding of antibodies to the free analyte does not lead to any major aggregates, which therefore cause turbidity, since the epitopes recognized by the antibodies according to the invention occur only once on the analyte.
  • the agglutination of the polyhapten is thus partially inhibited.
  • the exact content of analyte in a sample can be determined using a standard curve.
  • the antigen which contains a peptide of the amino acid sequence SEQ ID NO 1 or at least a partial sequence thereof with at least 6 amino acids in length is coupled to ED.
  • An antibody in the sense of the invention is to be understood as a complete antibody or bi- or monovalent fragments thereof.
  • the antibodies can be both monoclonal and polyclonal. The use of monoclonal antibodies is preferred.
  • Another object of the invention is a process for the production of polyclonal antibodies which recognize the N-terminal peptide of cardiac troponin I and the antibodies obtainable therewith.
  • the method consists in that ma test animals, preferably sheep, with an immunogen which contains the amino acid sequence according to SEQ ID NO 1 or a partial sequence thereof with at least 6 amino acids in length Combination with an adjuvant, immunized at least four times at four- to six-week intervals over several months (preferably 4-6 months), crude serum is obtained and this is purified using methods known to the person skilled in the art.
  • Adsorbers are used for immunoadsorption which have a peptide m of the amino acid sequence according to SEQ ID NO 1 or a partial sequence thereof with at least 6 amino acids in length covalently bound.
  • Another object of the invention is a process for the production of monoclonal antibodies which recognize the N-terminal peptide of cardiac troponin I and the antibodies obtainable therewith.
  • the method consists in m experimental animals, preferably inbred mice, with an immunogen which contains the amino acid sequence according to SEQ ID NO 1 or a partial sequence thereof with at least 6 amino acids in length, in combination with an adjuvant, over several months with at least four immunizations immunized intraperitoneally at four- to six-week intervals, spleen cells obtained and fused with a permanent myeloma cell line, the clones isolated and the antibodies obtained therefrom.
  • Aluminum hydroxide is preferably used as an adjuvant together with Bordetella pertussis or Freund's adjuvant.
  • the immunogen which contains the amino acid sequence according to SEQ ID NO 1 or a partial sequence thereof with a length of at least 6 amino acids, is preferably coupled to a carrier protein to increase the antigenicity.
  • Several different partial sequences can also be used in combination in an immunization.
  • hybrid cells obtained in the fusion according to the known method of Köhler and Milstein are obtained in the usual way, for example using a commercially available cell sorter or by "limiting dilution "cloned.
  • Cultures that react positively to the N-terminal peptide of cardiac troponin I are processed in each case.
  • hybridoma cell lines are obtained which produce the monoclonal antibodies according to the invention. These cell lines can be cultivated according to known methods and the monoclonal antibodies produced by them can be isolated.
  • the polyclonal or monoclonal antibodies according to the invention are used in all known immunochemical processes, for example in immunoassays or immunohistology. They are ideally suited for the specific determination of cardiac muscle necrosis in a sample, for example serum or plasma. False negative results can be minimized or avoided in this way.
  • the antibodies as such or fragments thereof which have the appropriate immunological properties, for example F (ab) 2 or Fab fragments, can be used for these determination methods. The term antibody is therefore understood to mean both complete antibodies and their fragments.
  • an antigen which is a pep of the amino acid sequence is used as the immunogen, screening reagent in the selection of the monoclonal antibodies, standard material in the immunoassay, polyhapten in the TINIA test or as the labeled antigen in an immunoassay
  • the antigens ie the amino acid sequences, have proven to be particularly suitable
  • SEQ ID NO 3 SDAAREPRPA
  • the amino acid sequence SEQ ID NO 1 corresponds to the 30 N-terminal amino acids of human cardial Tnl.
  • the sequence v human Tnlc is known from Vallins et al., FEBS Letters 270 (199 57-61. It was surprising, however, that by using antibodies which were produced by means of peptide immunogens, the peptides of the amino acid sequence SEQ NO 1 or at least one Partial sequence of which contain at least amino acids in length, cardiac muscle necrosis could be detected, samples which were assessed negatively in the determination of total Tnlc, since the measurement signal was just below the "cut-off", ie the measurement signal which was just as positive was evaluated, were still recognized as positive.
  • Another object of the invention is a test kit for determining cardiac muscle necrosis, which contains at least one polyclonal or monoclonal antibody according to the invention in a container.
  • the other components and reagents necessary for carrying out the method according to the invention such as the solid phase, which can be coated with streptavidin, are further antibodies according to the invention which can be labeled, polyhaptens, auxiliary substances such as buffers or Anti-interference reagents included.
  • the invention furthermore relates to a test kit which contains a standard for use in the determination of Tnlc, which contains a peptide of the amino acid sequence SEQ ID NO 1 or at least a partial sequence thereof.
  • example 1 The invention is illustrated by the following examples: example 1
  • the peptide was synthesized on 180 mg of 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl) -phenoxy resin with a loading of 0.45 mmol.
  • the sequence was constructed with a combination of Fmoc as temporary and P c / tBu / Trt as permanent protective groups. 16 equivalents of the following amino acid derivatives were used:
  • the coupling reactions were carried out with 1.1 equivalents of di-propylcarbodiimide / N-hydroxybenzotriazole in relation to the amino acid derivatives as activation reagents.
  • the coupling times were 90 minutes and were carried out twice with 8 equivalent amino acid derivatives each.
  • the temporary protective group was removed by means of piperidine within 20 minutes.
  • the reactions were carried out in dimethylformamide, and the same solvent was used for the washing steps that followed the reaction steps.
  • the synthesis was carried out fully automatically on a Zinsser SMPS 350 in 6 tubes of 30 mg synthesis each carried out.
  • the peptide was released with the elimination of the side chain protective groups, except Acm, with a mixture of 95% trifluoroacetic acid, 3% ethanedithiol and 2 anisole within 90 minutes.
  • the cleavage solution was filtered off with 10 times the amount of diisopropyl ether. added and the precipitate formed is filtered off.
  • the precipitate was washed with diisopropyl ether, dissolved in 20% acetic acid and lyophilized. 107 mg of white lyophilisate were obtained.
  • the purity was checked by means of HPLC (92% area), the identity was checked by means of mass spectroscopy (MH +: 1603).
  • Fmoc- fluorenylmethyloxycarbonly- -tBU: tertiary butyl- Trt-: trityl- Acm-: acetamidomethyl-
  • peptide immunogens comprising amino acids 1-10, 6-15, 11-20, 16-26 and 1-30 of the N-terminal troponin I was prepared using the following peptides:
  • KLH Keyhole limpet hemocyanin
  • the peptide is derivatized with 6-maleimidohexanoic acid, Ac -protected and MH-derivatized peptide can then be distinguished on HPLC based on different retention times (Vydac C18, 5 ⁇ m, 300 A, 4.6 x 250 mm; 0-45% B in 30 minutes; A: 0.1% TFA in H 2 0; B: 0.1% TFA in acetonitrile / H 2 65:35).
  • reaction mixture is loaded onto a filtration column (AcA 202, 24 x 4 cm, IBF Biotechnology) and the protein / peptide conjugate is eluted with the above-mentioned phosphate buffer.
  • the protein concentration is again determined by BCA, the peptide coupling efficiency using Ellman's test. 14.8 mg (72% of theory) of the immunogen were obtained with a loading of 547 peptide / KLH-MH.
  • the peptide was synthesized on 30 mg of 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-Fmocaminomethyl) phenoxy resin with a loading of 0.45 mmol /.
  • the sequence was constructed with a combination of Fmoc as temporary and Pmc / tBU / Trt / DmTr / Boc as permanent protective groups. 16 equivalents of the following Fmoc amino acid derivatives were used:
  • the coupling reactions were carried out with 1.1 equivalents of diisopropylcarbodiimide / N-hydrobenzotriazole in relation to the amino acid derivatives as activation reagents.
  • the coupling times were 90 minutes and were carried out twice with 8 equivalents of amino acid derivative.
  • the temporary protective group was removed using piperidine within 20 minutes.
  • the reactions were carried out in dimethylformamide, and the same solvent was used for the washing steps which followed the reaction steps iy
  • the synthesis was carried out fully automatically on a Zinsser SMPS 350.
  • the peptide was released with elimination of the side chain protective groups with a mixture of 95% trifluoroacetic acid, 3% ethanedithio and 2% anisole within 90 minutes.
  • the cleavage solution was filtered off, 10 times the amount of diisopropyl ether was added and the precipitate was filtered off.
  • the precipitate was washed with diisopropyl ether, dissolved in 20% acetic acid and lyophilized. 22.5 mg of white lyophilizate were obtained.
  • the purity was checked by HPLC (% Area), the identity was checked by mass spectroscopy (MH +: 1996).
  • Balb / c mice 8-12 weeks old, were immunized intraperitoneally with 100 ⁇ g Pepti immunogens from Example 2, with a complete Freund's adjuvant. After 6 weeks, three further immunizations were carried out at 4-week intervals. In each case 50 ⁇ g immunogen, adsorbed on aluminum hydroxide and Bordetella pertussis, were administered intraperitone. One week after the last immunization, blood was drawn and the antibody titer in the serum of the test animals was determined. If the course of the immunization was positive, fusion was carried out. Four days before the fusion, one more intravenous immunization was carried out with 50 ⁇ g immunogen in phosphate-buffered saline.
  • the primary cultures which contained antigen-specific antibodies, go into the single cell depot with the aid of a fluorescence-activating cell sorter (FACS).
  • FACS fluorescence-activating cell sorter
  • the clones obtained were cultivated and tested for specificity in the ELISA method.
  • Hybridoma cell lines were established from positive clones and larger amounts of antibodies were produced using cell fermenters or ascites production. -
  • Microtiter plates (Nunc company) were coated with streptavidin and loaded with 1 ⁇ g / ml biotinylated peptide. After a washing step, the antibody sample was incubated. After another washing step, the detection antibody was incubated with polyclonal sheep anti-mouse Fcg, Fab peroxidase conjugate. After a further washing step, the peroxidase activity was determined using a color substrate (ABTS).
  • ABTS color substrate
  • the specificity of the binding of the antibody sample to the biotinylated peptides was checked by inhibition with free peptide.
  • the antibody sample was incubated with 10 ⁇ g / ml peptide with the amino acid sequence SEQ ID NO 1 before the antibodies were used in the above microtiter plate test. A greatly reduced binding under these conditions was only obtained from specific antibodies.
  • the cell clone MAK ⁇ TnIc peptide, II-20> M-7.3.1 was obtained by immunizing mice with the peptide SEQ ID NO 4 coupled to KLH and by cloning according to Example 4.
  • the monoclonal antibodies produced by these cells are distinguished by the fact that they recognize very specifically an epitope of the N-terminal peptide of Tnlc which can be seen from Table 1. Analysis of the peptides bound by the antibody reveals that this antibody recognizes, as a core epitope, a linear amino acid sequence which corresponds to positions 11 to 19 of SEQ ID NO 1.
  • the cell clone MAK ⁇ TnIc peptide, 6-15> M-3.10.3 was obtained by immunizing mice with the peptide SEQ ID NO 3 coupled to KLH and by cloning according to Example 4.
  • the monoclonal antibodies produced by these cells are distinguished by the fact that they recognize very specifically an epitope of the N-terminal peptide of Tnlc which can be seen from Table 1.
  • Analysis of the peptides bound by the antibody reveals that this antibody recognizes, as a core epitope, a linear amino acid sequence which corresponds to positions 7 to 12 of SEQ ID NO 1.
  • this antibody is particularly suitable for the detection of cardiac muscle necrosis. It can be used in both competitive assays and sandwich immunoassays.
  • the peptides were 12-amino acid partial sequences of the N-terminal sequence of cardiac troponin I (SEQ ID NO 1) and each differed by one amino acid so that the entire sequence could be covered.
  • Streptavidin-coated microtiter plates (microcoat) were loaded with 100 ⁇ l / well of the following biotinylated peptides (1 ⁇ g / ml each): 5-16, 6-17, 7-18, 8-19, 9-20, 10-21, 11 -22, 12-23, 13-24, 14-25 and 15-26, prepared analogously to Example 3 (the numbers given relate to SEQ ID NO 1 and denote the first and last position of the partial amino acid sequence of the respective peptide ).
  • the absorption is measured after 30-60 min at 405 nm.
  • MAK development with Immunogen SEQ ID NO 2 was discontinued because suitable PAKs are available.
  • the peptide was synthesized on 120 mg of 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-Fmocaminomethyl) phenoxy resin with a loading of 0.45 mmol / g.
  • the sequence was constructed with a combination of Fmoc as temporary and Pmc / tBU / Trt / OtBu as permanent protective groups. 16 equivalents of the following Fmoc amino acid derivatives were used:
  • the coupling reactions were carried out with 1.1 equivalents of diisopropylcarbodiimide / N-hydrobenzotriazole in relation to the amino acid derivatives as activation reagents.
  • the coupling time was 90 minutes and was carried out twice with 8 equivalents of amino acid derivative.
  • the temporary protective group was removed using piperidine within 30 minutes cleaved.
  • the reactions were carried out in diethylformamide, and the same solvent was used for the washing steps which followed the reaction steps.
  • the synthesis was carried out fully automatically on a Zinsser SMPS 350.
  • the peptide was released with elimination of the side chain protecting groups with a mixture of 95% trifluoroacetic acid, 3% ethanedithiol and 2% anisole within 90 minutes.
  • the cleavage solution was filtered off, 10 times the amount of diisopropyl ether was added and the precipitate was filtered off. The precipitate was washed with diisopropyl ether, dissolved in 20% acetic acid and lyophilized. 29.5 mg of white lyophilizate were obtained. The purity was checked by means of HPLC (% area).
  • the crude peptide was passed over a 20 mx 300 ⁇ m RP-HPLC column (column material: C-18, 5 ⁇ , 300 A) with a gradient system from 0% B to 100% B in 100 minutes (Puff A: 0.1% trifluoroacetic acid in water, Buffer B: 0.1% trifluoroacetic acid in water / acetonitrile 40:60) to a purity according to HPLC of 97%.
  • Microtiter plates (Nunc-Maxisorb) were coated overnight at 4 ° C. with 100 ⁇ l 5 ⁇ g / ml PAK ⁇ Dig> S (IS) (Boehringer Mannheim CAT.-NO. 1330713), with 200 ⁇ l / well PBS / 1% RSA reload and washed 3 times.
  • Table 3 shows the results obtained with sera from normal people (NS) and people after myocardial infarction (MI). A clear distinction could be made between the two groups.
  • the serum of a patient with myocardial infarction marked with * showed a signal which deviated significantly from the normal sera only in one test according to the present patent. In other test versions, which recognize Tnlc and not the N-terminal peptide, this serum could hardly be distinguished from the normal sera.
  • Tnlc solution (0; 0.4; 2; 5; 10; 20; 40; 100 ng / ml human cardial troponin I, double concentrated) or sample (sera from normal people (NS) or from people ( MI) after a heart attack, diluted 1 + 1) pipetted.
  • 60 ⁇ l / tube of wall antibodies (5 ⁇ g / ml MAK ⁇ TnIc peptide, 6-15> M- 3.10.3-IgG-Bi, 4-fold concentrated) are added.
  • the monoclonal antibody was obtained by purification according to the prior art with ProteinA-Sepharose and derivatized with Biotinoyl- ⁇ -aminocaproic acid-N-hydroxysuccinimide.
  • the absorption is measured after 30-60 min at 405 nm.
  • the results of the sandwich immunoassay with Tnic solution as analyte are shown in Table 4 and Figure 2/2. The measurement signal increases depending on the amount of analyte.
  • Table 5 shows the results obtained with sera from normal people (NS) and people after myocardial infarction (MI). A clear distinction could be made between the two groups.
  • the serum of a patient with a myocardial infarction marked with * showed a signal that differed significantly from the normal sera only in one test according to the present patent. In other test versions, which recognize Tnlc and not the N-terminal peptide, this serum could hardly be distinguished from the normal sera.

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Abstract

In einem Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Herzmuskelnekrosen wird eine Probe mit mindestens einem Antikörper, der das N-terminale Peptid von kardialem Troponin I erkennt und erhältlich ist durch Immunisierung mit einem Immunogen, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder Teilsequenzen davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, und Isolierung des polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers aus dem Serum beziehungsweise den immortalisierten und klonierten Milzzellen der immunisierten Tiere nach bekannten Verfahren, versetzt und der sich bildende Komplex in geeingneter Weise nachgewiesen.

Description

Verfahren zur Bestimmung von Herzmuskelnekrosen mittels Antikörper gegen das N-terminale Troponin I-Peptid
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung Herzmuskelnekrosen mittels Antikörper gegen das N-termina Troponin I-Peptid, bei dem man eine Blutprobe mit einem A körper gegen das N-terminale Troponin I-Peptid versetzt u den sich bildenden Komplex nachweist sowie die in diesem fahren verwendeten Antikörper und ein Verfahren zur Herst lung solcher Antikörper.
Die Myofibrillen des quergestreiften Muskels bestehen aus zwei zusammenwirkenden Proteinfilamenten, den dicken Fila menten mit Myosin als Hauptbestandteil und den dünnen Fil menten, die Actin, Tropomyosin und Troponine enthalten. Troponin ist in den Zellen als regulatives Strukturprotei einem Komplex zusammengelagert und besteht aus drei ver¬ schiedenen Proteinen:
Troponin C : bindet Calciumionen
Troponin I : eine Actin-bindende Untereinheit
Troponin T : lagert sich an Tropomyosin an.
Die vergleichbare Nomenklatur hat historische Gründe, da sprünglich der Komplex als solcher gereinigt und als ein Protein angesehen und mit Troponin benannt wurde. Von Troponin I sind drei Isoformen bekannt entsprechend ih Auftreten im Herzmuskel (Tnlc) , langsamen Skelettmuskeln (Tnls) und schnellen Skelettmuskeln (Tnlf) . Kardiales Troponin I unterscheidet sich von skelettärem Troponin I hauptsächlich durch eine zusätzliche N-terminale Sequenz a ca. 30 Aminosäuren.
Kardiales Troponin I wird nach einem akuten Myokardinfarkt freigesetzt und kann im Blutplasma nachgewiesen werden. Es stellt somit einen Marker für Herzmuskelzellnekrosen dar. Cummins, J. Mol. Cell. Card. 19 (1987), 999-1010 und Cummi and Cummins, Clin. Invest. 113 (1987) , 1333-1344 konnten nachweisen, daß Tnlc im Serum normalerweise in Konzentra¬ tionen in der Höhe von 10 ng/ml auftritt. Es zeigte sich, d beim transmuralen Infarkt eine erhöhte Serumkonzentration z beobachten ist. Tnlc war von der 4. bis 168. Stunde nach Schmerzbeginn bei 37 Patienten mit akutem transmuralen Infarkt erhöht. Ähnliche Ergebnisse wurden im Tiermodell er halten. Danach ergibt sich als Zeitintervall für die absolu diagnostische Sensitivität für Tnlc die 10. - 50. Stunde na dem Infarktereignis.
Larue et al., Mol. Immunol. 29. (1992) 271 - 278 beschreiben monoklonale Antikörper (MAK) gegen Tnlc, die durch Immuni¬ sierung mit humanen Tnlc hergestellt wurden. Einige der MAK binden im N-terminalen Bereich von Tnlc beispielsweise die MAK 3C6 oder 11E12. Keiner dieser Antikörper erkennt ein Epitop zwischen den Aminosäuren 14 bis 24 gut. Der MAK 11E1 erkennt jedoch offensichtlich ein Epitop zwischen den Amino säuren 14 bis 37. Dieser MAK benötigt hierzu die Aminosäure N und Y in Position 25 und 26, das heißt, sein Epitop liegt ungefähr zwischen den Aminosäuren 21 bis 30. Ähnliches gilt für die anderen publizierten MAKs. Bodor et al., Clin. Chem. 3ji (1992) 2203 - 2214 beschreibe Tnlc spezifische MAK, die ebenfalls durch Immunisierung mi humanem Tnlc gewonnen wurden. Ein MAK erkennt den N- terminalen Bereich von Tnlc. Eine genaue Analyse der Bindungsstelle wird nicht offenbart. Aufgrund der Analogie der obigen Arbeit von Larue ist anzunehmen, daß der hier beschriebene Antikörper eine ähnliche Spezifität wie die dortigen Antikörper besitzt und zwischen den Aminosäuren 2 und 31 das N-terminale Peptid bindet.
Weiterhin ist bekannt, daß Tnlc im Zuge des nekrotischen Zelltods im Verlauf eines Infarkts einer proteolytischen Spaltung, die sowohl intra- als auch extrazellulär statt¬ finden kann, unterliegt. Hierbei kann insbesondere ein N-terminales Fragment von Tnlc abgespalten werden. Bei der Spaltung von Tnlc kann es bei den bisher beschriebenen Tes möglicherweise zu einer zu niedrigen Wiederfindung von Tnl kommen, da die Epitope von Antikörpern, zwischen denen ein Spaltstelle liegt, getrennt werden.
Auch bei Verwendung von gereinigtem Tnlc als Kalibrator od als Einsatzmaterial in einem I munoassay können Probleme durch dessen Instabilität auftreten.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es ein Bestimmungs¬ verfahren zu entwickeln, das falsch negative Ergebnisse be der Tnlc-Bestimmung vermeidet.
Gelöst wurde die Aufgabe durch die in den Ansprüchen näher charakterisierte Erfindung. Insbesondere durch ein Verfahr zur immunologischen Bestimmung von Herzmuskelnekrosen, da- durch gekennzeichnet, daß man eine Probe mit mindestens ei Antikörper, der das N-terminale Peptid von kardialem Tropo I erkennt und erhältlich ist durch Immunisierung mit einem Immunogen, das ein Peptid der Aminosäuresequenz SEQ ID NO oder mindestens eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, und Isolierung des polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers aus dem Serum bzw. den immortalisierten und klonierten Milzzellen der immunisiert Tiere nach bekannten Verfahren, versetzt und den sich bildenden Komplex in geeigneter Weise nachweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Antikörper, d das N-terminale Peptid von kardialem Troponin I erkennt und erhältlich ist durch Immunisierung mit einem Immunogen, das ein Peptid der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder mindesten eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält und Isolierung des Antikörpers aus dem Serum der immunisierten Tiere nach bekannten Verfahren sowie ein monoklonaler Antikörper, der das N-terminale Peptid von kardialem Troponin I erkennt und erhältlich ist durch Immunisierung mit einem Immunogen, das ein Peptid der Amino säuresequenz SEQ ID NO 1 oder mindestens eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, Immortali sierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Klonierung derjenigen immortalisierten Zellen, die den gewünschten Antikörper produzieren und Isolierung des Antikörpers aus d klonierten Zellen nach bekannten Verfahren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung synthetischer Peptide der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 ode mindestens einer Teilsequenz davon mit mindestens 6 Amino¬ säuren Länge als Immunogen zur Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, als Standardmaterial, Poly- hapten oder markiertes Antigen in Immunoassays. Unter eine synthetischen Peptid sind Peptide zu verstehen, die durch chemische Synthese als auch durch rekombinante Herstellung erzeugt worden sind.
Die Durchführung des immunologischen Bestimmungsverfahrens von Herzmuskelnekrosen erfolgt mit dem Fachmann geläufigen Methoden. Beispielsweise kann die Bestimmung in Proben, da heißt Körperflüssigkeiten wie beispielsweise Blut, Plasma oder Serum, durch einen Radio-Immunoassay, Enzy -Immunoass Chemilumineszenz-Immunoassay oder durch Immunfluoreszenz e folgen. Als Verfahrensvariante sind alle bekannten Verfahr wie kompetitive Immunoassays, Sandwich-Immunoassays und IE Verfahren oder homogene Immunoassays wie CEDIA® anwendbar. ist möglich den Test in Form eines Naßtestes oder Trocken¬ testes durchzuführen. In einigen Fällen ist es vorteilhaft, die Probe vor oder während der Bestimmung zu denaturieren.
Bei den heterogenen Verfahren wird der Tnlc-spezifische An körper an eine Festphase immobilisiert. Die Immobilisierun kann adsorptiv, kovalent oder über ein spezifisches Bindep wie Biotin/ Streptavidin, Antikörper/Antigen oder Zucker/ Lectin erfolgen. Dabei wird der erfindungsgemäße Tnlc- spezifische Antikörper an einen dieser Bindepartner gebund Der andere Bindepartner ist an die Festphase gebunden. Methoden zur adsorptiven oder kovalenten Kopplung sind dem Fachmann bekannt.
Als Festphase bei einem Naßtest können Materialien verwend werden, wie z. B. Röhrchen (tubes) , Kunststoffküvetten, Mikrotiterplatten, Kugeln, Magnetpartikel oder Mikrocarrie aus Kunststoffen wie Polystyrol, Vinylpolymeren, Polypropylen, Polycarbonat, Polysaccariden, Silikone, Gumm oder behandeltes Glas (vgl. beispielsweise E.T. Maggio, Enzyme Immunoassays, CAC. Press, Florida (1980) , insbesond Seiten 175-178, EP-A-0 063 064, Bioengineering 16 (1974), 997-1003, C.J. Senderson und D.V. Wilson, Immunology 20 (1971) , 1061-1065) . Insbesondere wird als Festphase ein mi Avidin oder Streptavidin beschichtetes Trägermaterial, insbesondere Polystyrol, vorzugsweise hergestellt wie in E A-0 269 092 beschrieben, verwendet. Als Festphase bei eine Trockentest sind die hierbei üblichen Vliese wie Cellulose oder Glasfaservliese als auch Membranen zu verwenden.
Besonders zweckmäßig hat sich der Sandwich-Test erwiesen. Dabei muß mindestens ein erfindungsgemäßer Antikörper ein¬ gesetzt werden. Der zweite Antikörper kann ein weiter erfindungsgemäßer Antikörper sein, es kann aber auch ein Antikörper des Standes der Technik benutzt werden. Voraus¬ setzung ist, daß beide Antikörper nicht oder nur unwesentl miteinander kreuzreagieren. Bevorzugt wird ein immobili¬ sierter Antikörper, der das N-terminale Peptid von kardial Troponin I erkennt, in Kombination mit einem zweiten Tnlc- spezifischen Antikörper, an den eine bestimmbare Gruppe gekoppelt ist, eingesetzt. Als bestimmbare Gruppe können a gängigen Markierungsgruppen wie Enzyme oder fluoreszierend oder lumineszierende Reste eingesetzt werden. Der zweite Antikörper, der ebenfalls bevorzugt das N-terminale Peptid von Tnlc erkennt, wird so ausgewählt, daß er nicht oder nu unwesentlich die Bindung des ersten Antikörpers an diesem Peptid stört. Beide Antikörper können gegen verschiedene Epitope am N-terminalen Peptid von Tnlc gerichtet sein. Die Testführung kann sowohl sukzessiv, d. h. ein Antikörpe wird zunächst mit der Probe inkubiert bevor der zweite Antikörper zugegeben wird, als auch simultan, d. h. alle Reaktionspartner werden im Test gleichzeitig zugegeben, erfolgen. Da das N-Terminale Peptid von Tnlc an den beiden Serin-Resten in Position 23 und 24 phosphoryliert sein kan kann ein Anti-Phosphor-Serin-Antikörper als zweiter Antikörper im Sandwich-Immunoassay eingesetzt werden. Anti Phosphor-Serin-Antikörper sind an sich bekannt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist der kompetitiv Test. Dabei wird ein vor oder während der Bestimmung immo¬ bilisierter Antikörper gegen das N-terminale Peptid von Tn und ein Konjugat aus Tnlc oder einem Antigen, das ein Pept der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder mindestens eine Tei sequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, einer bestimmbaren Gruppe verwendet. Werden lediglich Teil sequenzen der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 verwendet, so der verwendete Antikörper mit diesem Teil spezifisch binde fähig sein. Die Verwendung eines synthetischen Peptids als markiertes Antigen im Test ist bevorzugt, da dieses eine immer gleiche und damit standardisierbare Zusammensetzung besitzt und im Gegensatz zum natürlich vorkommenden Tnlc nicht instabil ist.
Die kompetitive Testführung ist insbesondere bei homogenen Immunoassays geeignet. Bevorzugt ist der TINIA, der turbidi metrische Inhibierungs-Immunoassay. Eine Probe wird mit ein Polyhapten, das aus einem Träger, beispielsweise einem Late partikel oder Dextran und daran gebundenen N-terminalen Tnl Peptiden der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder mindestens einer Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge, besteht und den erfindungsgemäßen Antikörpern inkubiert. Es bilden sich Immunkomplexe aus Polyhapten oder Tnlc und Anti körpern. Die Bindung der Antikörper an das Polyhapten führt zu Aggregaten, die durch Zunahme der Trübung gemessen werde können. Die Bindung von Antikörpern an den freien Analyten führt hingegen zu keinen größeren und damit Trübungs¬ verursachenden Aggregaten, da die von den erfindungsgemäßen Antikörpern erkannten Epitope nur einmal auf dem Analyt vor kommen. Die Agglutination des Polyhaptens wird somit teil¬ weise inhibiert. Der genaue Gehalt einer Probe an Analyt ka über eine Standardkurve bestimmt werden.
Geeignet ist auch ein homogener Immunoassay, bevorzugt ein CEDIA® (vergleiche Henderson et al., Clin. Chem. 32 (1986) 1637 - 1641) . Das Antigen, das ein Peptid der Aminosäure¬ sequenz SEQ ID NO 1 oder mindestens eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, wird an ED gekoppelt.
Unter einem Antikörper im Sinne der Erfindung ist ein kompletter Antikörper oder bi- oder monovalente Fragmente hiervon zu verstehen. Die Antikörper können sowohl monoklona als auch polyklonal sein. Bevorzugt ist die Verwendung von monoklonalen Antikörpern.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern, die das N-terminal Peptid von kardialem Troponin I erkennen sowie die hiermit erhältlichen Antikörper. Das Verfahren besteht darin, daß ma Versuchstiere, vorzugsweise Schafe, mit einem Immunogen, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequen davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, in Kombination mit einem Adjuvans, über mehrere Monate (vorzugsweise 4 - 6 Monate) mindestens vier mal in vier- bi sechs-wöchigem Abstand immunisiert, Roh-serum gewinnt und dieses mit dem Fachmann bekannten Methoden reinigt. Zur Immunadsorption werden Adsorber verwendet, die ein Peptid m der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 1 oder eine Teil¬ sequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge kovalent gebunden haben.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die das N-terminal Peptid von kardialem Troponin I erkennen sowie die hiermit erhältlichen Antikörper. Das Verfahren besteht darin, daß m Versuchstiere, vorzugsweise Inzucht-Mäuse, mit einem Immunogen, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, in Kombination mit einem Adjuvans, über mehrere Monate mit mindestens vier Immunisierungen in vier- bis sechs-wöchigem Abstand intraperitoneal immunisiert, Milz¬ zellen gewinnt und mit einer permanenten Myelom-Zellinie fusioniert, die Klone isoliert und hieraus die Antikörper ge winnt.
Bevorzugt wird als Adjuvans Aluminiumhydroxid zusammen mit Bordetella pertussis oder Freund'schem Adjuvans eingesetzt. Das Immunogen, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, ist vorzugsweise an ein Trägerprotein zur Erhöhung der Antigenität gekoppelt werden. Es können auch mehrere verschiedene Teilsequenzen in Kombination bei einer Immunisierung eingesetzt werden.
Die bei der Fusionierung nach dem bekannten Verfahren von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975) , 495 - 497) gewonnene Pri är-Kulturen von Hybridzellen, werden in üblicher Weise, zum Beispiel unter Verwendung eines handelsüblichen Zell- sorters oder durch "limiting dilution" kloniert. Es werden jeweils die Kulturen weiterverarbeitet, die positiv gegenübe dem N-terminalen Peptid von kardialem Troponin I reagieren. Man erhält auf diese Weise Hybridoma-Zellinien, die die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produzieren. Nach bekannten Methoden können diese Zellinien kultiviert und die von ihnen produzierten monoklonalen Antikörper isoliert werden.
Die folgenden Hybridoma Zellinien, die monoklonale Antikörpe gegen das N-terminale Peptid von kardialem Troponin I erkennen, wurden am 16.12.1993 unter dem Budapester Vertrag bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany) hinterlegt:
MAK<TnIc-Peptid,ll-20>M-7.3.1 MAK<TNIc-Peptid,6-15>M-3.10.3 Die erfindungsgemäßen polyklonalen oder monoklonalen Anti¬ körper finden Verwendung in allen bekannten immunchemische Verfahren, beispielsweise in Immunoassays oder der Immunhistologie. Sie eignen sich hervorragend dazu, in ein Probe, beispielsweise Serum oder Plasma, Herzmuskelnekrose spezifisch zu bestimmen. Falsch negative Ergebnisse lassen sich hierdurch minimieren oder vermeiden. Für diese Bestimmungsverfahren können die Antikörper als solche oder Fragmente hiervon, welche die entsprechenden immunologisch Eigenschaften aufweisen, beispielsweise F(ab)2- oder Fab- Fragmente verwendet werden. Unter dem Begriff Antikörper werden daher sowohl vollständige Antikörper als auch deren Fragmente verstanden.
Als Immunogen, Screeningreagenz bei der Auswahl der mono¬ klonalen Antikörper, Standardmaterial im Immunoassay, Polyhapten beim TINIA-Test oder als markiertes Antigen in einem Immunoassay wird ein Antigen eingesetzt, das ein Pep der Aminosäuresequenz
SEQ ID NO 1: MADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNYRAYA
oder mindestens eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält.
Als besonders geeignet haben sich die Antigene erwiesen, d die Aminosäuresequenzen
SEQ ID NO 2: MADGSSDAAR
SEQ ID NO 3: SDAAREPRPA
SEQ ID NO 4: EPRPAPAPIR
SEQ ID NO 5: PAPIRRRSSNY
SEQ ID NO 6: MADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNY
SEQ ID NO 7: APAPIRRRSSNY
enthalten. Die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 entspricht den 30 N-term nalen Aminosäuren des humanen cardialen Tnl. Die Sequenz v humanem Tnlc ist aus Vallins et al., FEBS Letters 270 (199 57-61 bekannt. Es war allerdings überraschend, daß durch d Verwendung von Antikörpern, die mittels Peptidimmunogenen hergestellt wurden, die Peptide der Aminosäuresequenz SEQ NO 1 oder mindestens eine Teilsequenz davon mit mindestens Aminosäuren Länge enthalten, Herzmuskelnekrosen nachgewies werden konnten, wobei Proben, die bei der Bestimmung von Gesamt-Tnlc negativ bewertet wurden, da das Meßsignal knap unter dem "cut-off" lagen, d. h. dem Meßsignal, das gerade noch als positiv bewertet wurde, noch als positiv erkannt wurden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testkit zur Bestimmung von Herzmuskelnekrosen, der in einem Behältnis mindestens einen erfingungsgemäßen polyklonalen oder mono¬ klonalen Antikörper enthält. In mindestens einem weiteren Behältnis sind die übrigen zur Durchführung des erfindungs¬ gemäßen Verfahrens notwendigen Komponenten und Reagenzien, wie beispielsweise die Festphase, die mit Streptavidin be¬ schichtet sein kann, weitere einfindungsgemäße Antikörper, die markiert sein können, Polyhaptene, Hilfsstoffe, wie Puffer oder Entstörreagenzien, enthalten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testkit, der einem Behältnis einen Standard zur Verwendung bei der Bestimmung von Tnlc enthält, der ein Peptid der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder mindestens eine Teilsequenz davon enthält.
Anhand der nachfolgenden Beispiele soll die Erfindung ver¬ deutlicht werden: Beispiel 1
Synthese von Peptiden zur Immunogensynthese am Beispiel H- Cys(-Acm)-eAca-Pro-Ala-Pro-Ile-Arg-Arg-Arg-Ser-Ser-Asn-Tyr A id (entspricht SEQ ID NO 5)
Das Peptid wurde an 180 mg 4-(2' ,4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc- aminomethy1)-phenoxy Harz mit einer Beladung von 0.45 mMol synthetisiert. Die Sequenz wurde mit einer Kombination von Fmoc als temporärer und P c/tBu/Trt als permanente Schutz- gruppen aufgebaut. Dazu wurden 16 Äquivalente folgender Aminosäure-Derivate verwendet:
Fmoc-Cys(-Acm)-OH Fmoc-e-Aminocapronsäure
2 x Fmoc-Pro-OH Fmoc-Ala-OH Fmoc-Ile-OH
3 x Fmoc-Arg(-Pmc)-OH 2 x Fmoc-Ser(-tBu)-OH Fmoc-Asn(-Trt)-OH Fmoc-Tyr(-tBu)-OH
Die Kopplungsreaktionen erfolgten mit 1.1 Äquivalenten Dii propylcarbodiimid/N-Hydroxybenzotriazol in Bezug auf die Aminosäurederivate als Aktivierungsreagenzien. Die Kopplungszeiten betrugen 90 Minuten und wurden mit je 8 äquivalenten Aminosäure-Derivaten zweimal durchgeführt. Di temporäre Schutzgruppe wurde mittels Piperidin innerhalb v 20 Minuten abgespalten. Die Reaktionen wurden in Dimethylformamid durchgeführt, für die Waschschritte, die nach den Reaktionsschritten erfolgten, wurde das gleiche Lösungsmittel verwendet. Die Synthese wurde vollautomatisc an einem Zinsser SMPS 350 in 6 tubes zu je 30 mg Syntheseh durchgeführt. Die Freisetzung des Peptides unter Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen, außer Acm, erfolgte mit eine Gemisch aus 95 % Trifluoressigsäure, 3 % Ethandithiol und 2 Anisol innerhalb von 90 Minuten. Die Abspaltlösung wurde abfiltriert, mit der 10-fachen Menge Diisopropylether. versetzt und der entstandene Niederschlag abfiltriert. Der Niederschlag wurde mit Diisopropylether gewaschen, in 20- %iger Essigsäure gelöst und lyophilisiert. Es fielen 107 mg weißes Lyophilisat an. Die Reinheit wurde mittels HPLC kontrolliert (92 % Area) , die Identität mittels Massenspektroskopie (MH+: 1603) geprüft.
Abkürzungen:
Fmoc-: Fluorenylmethyloxycarbonly- -tBU: tertiär Butyl- Trt-: Trityl- Acm-: Acetamidomethyl-
HPLC: Hochdruckflüssigkeitschromatographie Pmc-: PentamethyIchroman-
Analog dieser Vorschrift wurden auch alle anderen verwendet Peptide hergestellt.
Beispiel 2
Herstellung von Immunogenen
Synthese und Charakterisierung von Troponin I - Immunoσene
5 Peptidimmunogene, die die Aminosäuren 1-10, 6-15, 11-20, 16-26 und 1-30 des N-terminalen Troponin I umfassen, wurde unter Verwendung der folgenden Peptide hergestellt:
Peptid 1:
Tropl, H(1-10)Cys(-Acm)-NH2 (MADGSSDAARZC)
[Entspricht SEQ ID NO 2]
Peptid 2:
Tropl, Cys(-Acm)6-15-NH2 (CZSDAAREPRPA)
[Enspricht SEQ ID NO 3]
Peptid 3:
Tropl, Cys(-Acm)11-20)-NH2 (CZEPRPAPAPIR)
[Entspricht SEQ ID NO 4]
Peptid 4:
Tropl, Cys(-Acm)16-26-NH2 (CZPAPIRRRSSNY)
[Entspricht SEQ ID NO 5]
Peptid 5:
Tropl, H(l-30)Cys-NH2 (MADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNYRAYA
[Entspricht SEQ ID NO 1]
C: Cys(-Acm)-OH Z: e-AHS-OH Die Synthese wird am Beispiel von Tropl, H(l-10)Cys-NH2 mit der Aminosäuresequenz MADGSSDAARZC beschrieben.
Als Trägerprotein wird Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) ) , da mit Maleimido-hexanoyl-N-hydroxysuccinimid aktiviert wurde (KLH-MH, Boehringer Mannheim Biochemica) , verwendet.
Abspaltung der Acetamidomethyl-(Acm)-Schutzgruppe am Cystein
Alle Lösungen werden vor Gebrauch mit Argon gespült, da die Acm-Schutzgruppe unter Ausschluß von Sauerstoff abgespalten wird. 35,4 mg (28 μmol) des Peptids 1 werden in 20 ml 50- %iger Essigsäure (v/v, pH = 4) gelöst. Dazu gibt man (0,7 mmol) Quecksilberacetat und rührt die Lösung unter Arg im Dunkeln für 20 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird für 15 Minuten Argongas eingeleitet, danach 30 Minuten lang H2S (g) . Das restliche H2S-Gas wird durch nochmaliges Einleiten vor Argon (10 Minuten) ausgetrieben. Man zentrifugiert bei 4000 U/min den schwarzen Niederschlag ab und filtriert die Lösung über einen 0,45 μm Filter. Die Lösung wird 1:1 mit bidest. Wasser verdünnt und lyophilisiert. Die Freisetzung der SH-Gruppe wird durch Reversed-Phase-HPLC überprüft. Dazu wird das Peptid mit 6- Maleinimidohexansäure derivatisiert, Ac -geschütztes und MH derivatisiertes Peptid lassen sich dann aufgrund unterschiedlicher Retensionszeit auf der HPLC unterscheiden (Vydac C18, 5 μm, 300 A, 4,6 x 250 mm; 0-45 % B in 30 Minuten; A: 0,1 % TFA in H20; B: 0,1 % TFA in Acetonitril/H2 65:35) .
Eine Quantifizierung der Sulfhydrylgruppe wurde nach Ellman, G.L. (1959) Arch. Biochem. Biophys. 82., 70 - 77 durchgeführ Man erhielt 35 mg (97 % d. Th.) ungeschütztes Peptid. Konjugation an Maleinidohexanoyl aktiviertes KLH Als Trägerprotein wird Maleimidohexanoyl aktiviertes Keyho Limpet Hemocyanin (KLH-MH, Boehringer Mannheim Biochemica) verwendet. Unmittelbar vor der Peptidkopplung wird die Proteinkonzentration durch BCA-Proteinbestimmung (Bicin- choninic acid, Pierce Company, Rockford, IL, USA) und der Gehalt von KLH-MH anhand es Ellman's Testes bestimmt. Zu 1 mg (5,4 nmol) KLH-MH mit einer Beladung von 547 MH-Gruppen pro Äquivalent KLH in 6,6 ml Phosphatpuffer (20 mM K2HP04, mM KH2P04, 10 mM CaCl, 0,2 % Saccharose, pH7) werden tropf weise 10,5 mg (8,8 μmol) des entschützten Peptids in 3 ml Phosphatpuffer gegeben. Der pH-Wert wird mit verdünnter Na auf 6-7 eingestellt. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur langsam geschüttelt. Zur Abtrennung des überschüssigen Peptids wird der Reaktionsansatz auf eine G filtrationssäule geladen (AcA 202, 24 x 4 cm, IBF Bio- technics) und das Protein/Peptid-Konjugat mit oben erwähnte Phosphatpuffer eluiert.
Die Proteinkonzentration wird wiederum durch BCA bestimmt, die Peptidkopplungseffizienz mittels Ellman's Test. Man er¬ hielt 14,8 mg (72 % d. Th.) des Immunogens mit einer Beladu von 547 Peptid/KLH-MH.
Analog dieser Vorschrift wurden auch alle anderen Peptid¬ immunogene hergestellt.
Beispiel 3
Synthese von biotinylierten Peptiden als Sceeningreagenzie
Synthese von H-Lys(-Bi)-ßAla-eAca-ßAla-Ala-Pro-Ala-Pro-Ile Arg-Arg-Arg-Ser-Ser-Asn-Tyr-Amid (entspricht SEQ ID NO 7)
Das Peptid wurde an 30 mg 4-(2' ,4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc- aminomethyl)-phenoxy Harz mit einer Beladung von 0.45 mMol/ synthetisiert. Die Sequenz wurde mit einer Kombination von Fmoc als temporärer und Pmc/tBU/Trt/DmTr/Boc als permanente Schutzgruppen aufgebaut. Dazu wurden 16 Äquivalente folgend Fmoc-Aminosäure-Derivate verwendet:
DmTR-Biotin
Boc-Lys(-Fmoc)-OH
2 x Fmoc-ßAla-OH
Fmoc-e-Aminocapronsäure
2 x Fmoc-Ala-OH
2 x Fmoc-Pro-OH Fmoc-Ile-OH
3 x Fmoc-Arg(-Pc)-OH 2 x Fmoc-Ser(-tBU-OH Fmoc-Asn(-Trt)-OH Fmoc-Tyr(-tBu)-OH
Die Kopplungsreaktionen erfolgten mit 1.1 Äquivalenten Diisopropylcarbodiimid/N-Hydrobenzotriazol in Bezug auf die Aminosäurederivate als Aktivierungsreagenzien. Die Kopplung zeiten betrugen 90 Minuten und wurden mit je 8 Äquivalenten Aminosäure-Derivat zweimal durchgeführt. Die temporäre Schutzgruppe wurde mittels Piperidin innerhalb von 20 Minut abgespalten. Die Reaktionen wurden in Dimethylformamid durc geführt, für die Waschschritte, die nach den Reaktions¬ schritten erfolgten, wurde das gleiche Lösungsmittel i y
verwendet. Die Synthese wurde vollautomatisch an einem Zinsser SMPS 350 durchgeführt. Die Freisetzung des Peptide unter Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen erfolgte mi einem Gemisch aus 95 % Trifluoressigsäure, 3 % Ethandithio und 2 % Anisol innnerhalb von 90 Minuten. Die Abspaltlösun wurde abfiltriert, mit der 10-fachen Menge Diisopropylethe versetzt und der Niederschlag abfiltriert. Der Niederschla wurde mit Diisopropylether gewaschen, in 20 %iger Essigsäu gelöst und lyophilisiert. Es fielen 22,5 mg weißes Lyo- philisat an. Die Reinheit wurde mittels HPLC kontrolliert % Area) , die Identität wurde mittels Massenspektroskopie (MH+: 1996) geprüft.
Abkürzungen
Fmoc-: Fluorenylmethyloxycarbonyl-
-tBU: tertiär Butyl-
-Trt: Trityl-
HPLC: Hochdruckflüssigkeitschromatographie
DmTr: Dimethoxyltrityl
Boc-: tertiär Butyloxycarbonyl
Beispiel 4
Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen ein Peptid der N-terminalen Seguenzen des Troponin I Proteins
Balb/c-Mäuse, 8 - 12 Wochen alt, wurden mit je 100 μg Pepti Immunogenen aus dem Beispiel 2, mit komplettem Freund'schem Adjuvans, intraperitoneal immunisiert. Nach 6 Wochen wurden drei weitere Immunisierungen in 4-wöchigem Abstand durchge¬ führt. Dabei wurden jeweils 50 μg Immunogen, an Aluminium¬ hydroxid und Bordetella pertussis adsorbiert, intraperitone verabreicht. Eine Woche nach der letzten Immunisierung er¬ folgte eine Blutentnahme und die Bestimmung des Antikörper- titers im Serum der Versuchstiere. Bei positivem Verlauf de Immunisierung wurde fusioniert. Vier Tage vor der Fusionie¬ rung wurde jeweils noch einmal mit 50 μg Immunogen in phosphat-gepufferter Kochsalzlösung intravenös immunisiert. In Anlehnung an Galfre, (Methods in Enyzmology, 73 (1981) u Köhler, Milstein, Nature 256 (1975), S. 495 - 497) wurden 1 108 Milzzellen einer immunisierten Maus mit 2 x 107 Myelom- zellen (P3x63Ag8-653, ATCC-CRL 8375) gemischt und mit PEG- Lösung fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden mit 5 x 1 Zellen pro Vertiefung in 24well-Platten ausplattiert und in Selektionsmedium kultiviert. Nach 7 - 10 Tagen, wenn Klon¬ wachstum sichtbar war, wurde der Kulturüberstand der Primä kulturen auf Spezifität im ELISA-Verfahren getestet. Die Primärkulturen, die antigen-spezifische Antikörper ent¬ hielten, gehen mit Hilfe eines fluoreszenzaktivierenden Zei sorters (FACS) in die Einzelzellablage. Die erhaltenen Klon wurden kultiviert und auf Spezifität im ELISA-Verfahren ge¬ testet. Aus positiven Klonen wurden Hybridoma-Zellinien etabliert und größere Mengen an Antikörpern, mittels Zell- fermenter beziehungsweise Aszitesproduktion hergestellt. -
Für die Bestimmung der Spezifität der Antikörper wurde ein ELISA-Verfahren als Testprinzip verwendet.
Mikrotiterplatten (Firma Nunc) wurden mit Streptavidin beschichtet und mit lμg/ml biotinylierte Peptid beladen. Nach einem Waschschritt erfolgte die Inkubation der Antikörperprobe. Nach einem erneuten Waschschritt erfolgte die Inkubation des Nachweisantikörpers, mit polyklonalem Schaf-anti-Maus-Fcg,Fab-Peroxidase-Konjugat. Nach einem weiteren Waschschritt wurde die Peroxidaseaktivität mit Farbsubstrat (ABTS) bestimmt.
Die Spezifität der Bindung der Antikörperprobe an die biotinylierten Peptide wurde durch Inhibition mit freiem Peptid überprüft. Hierzu wurde die Antikörperprobe mit 10 μg/ml Peptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 inkubiert, bevor die Antikörper in obigem Mikrotiterplatte Test eingesetzt wurden. Eine stark verringerte Bindung unt diesen Bedingungen wurde nur von spezifischen Antikörpern erhalten.
Die folgenden monoklonalen Antikörper wurden bei der DSM hinterlegt:
MAK<TNIc-Peptid,6-15>M-3.10.3 MAK<TnIC-Peptid,ll-20>M-7.3.1
Der Zeilklon MAK<TnIc-Peptid,ll-20>M-7.3.1 wurde durch Immunisieren von Mäusen mit dem an KLH gekoppelten Peptid SEQ ID NO 4 und durch Klonierung gemäß Beispiel 4 gewonnen. Die durch diese Zellen produzierten monoklonalen Antikörpe zeichnen sich dadurch aus, daß sie sehr spezifisch ein aus Tabelle 1 ersichtliches Epitop des N-terminalen Peptides von Tnlc erkennen. Die Analyse der Peptide, die von dem Antikörper gebunden werden, ergibt, daß dieser Antikörper als Kernepitop eine lineare Aminosäuresequenz erkennt, die den Positionen 11 bis 19 von SEQ ID NO 1 entspricht.
Der Zeilklon MAK<TnIc-Peptid,6-15>M-3.10.3 wurde durch Immunisieren von Mäusen mit dem an KLH gekoppelten Peptid SEQ ID NO 3 und durch Klonierung gemäß Beispiel 4 gewonnen. Die durch diese Zellen produzierten monoklonalen Antikörper zeichnen sich dadurch aus, daß sie sehr spezifisch ein aus Tabelle 1 ersichtliches Epitop des N-terminalen Peptides von Tnlc erkennen. Die Analyse der Peptide, die von dem Antikörper gebunden werden, ergibt, daß dieser Antikörper als Kernepitop eine lineare Aminosäuresequenz erkennt, die den Positionen 7 bis 12 von SEQ ID NO 1 entspricht. Dieser Antikörper ist, wie aus den Beispielen 7 und 8 ersichtlich, besonders zum Nachweis von Herzmuskelnekrosen geeignet. Er kann sowohl in kompetitiven Assays als auch in Sandwich- Immunoassays eingesetzt werden.
Beispiel 5
Epitopscreening
Um die Epitope der Antikörper zu bestimmen, wurde die Bindung der Antikörper an verschiedene Peptide gemessen. Die Peptide waren 12 Aminosäuren lange Teilsequenzen der N-terminalen Sequenz von cardialem Troponin I (SEQ ID NO 1) und unterschieden sich jeweils so um eine Aminosäure, daß die ganze Sequenz abgedeckt werden konnte.
Bestimmung des Epitops, das der Antikörper MAK<TnIc- Peptid,11-20>M-7.3.1 erkennt (Immunogen enthielt SEQ ID NO 4) :
Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten (Microcoat) wurden mit 100 μl/well folgender biotinylierter Peptide (je 1 μg/ml) beladen: 5-16, 6-17, 7-18, 8-19, 9-20, 10-21, 11-22, 12-23, 13-24, 14-25 und 15-26, analog zu Beispiel 3 hergestellt (die aufgeführten Zahlen beziehen sich auf SEQ ID NO 1 und bezeichnen jeweils die erste und letzte Position der Aminosäure-Teilsequenz des jeweiligen Peptids) .
Nach 60 min Schütteln wird 3 x gewaschen.
100 μl/well der Antikörperlösung (1 μg/ml) werden zugegeben.
Nach 60 min Schütteln wird 3 x gewaschen.
100 μl/well Anti-Maus-Fc-gamma-POD Konjugat (20 mU/ml) werden zugegeben.
Nach 60 min Schütteln wird 3 x gewaschen und 100 μl/well ABTS-Lösung (2,2 '-Azino-di[3-ethylbenzthiazolin- sulfonat (6)]) zugegeben.
Die Absorption wird nach 30 - 60 min bei 405 nm gemessen.
Die Epitope der Antikörper MAK<TnIc-Peptid,6-15>M-3.10.3 (Immunogen enthielt SEQ ID NO 3), MAK<TnIc-Peptid,16-26>M- 2.7.1 (Immunogen enthielt SEQ ID NO 5), PAK<TnIc-Peptid,l- 30>K-1689 bzw. K-1690 (Immunogen enthielt SEQ ID NO 1) und PAK<TnIc-Peptid,1-10,6-15,11-20,16-26>K-1692 (Immunogen enthielt eine Mischung aus SEQ ID NO 2, NO 3, NO 4 und NO 5) wurden analog mit entsprechenden Peptiden bestimmt. Die MAK- Entwicklung mit Immunogen SEQ ID NO 2 wurde eingestellt, da geeignete PAKs vorliegen.
In der Tabelle 1 sind die Ergebnisse unabhängiger Versuche mit den Antikörpern zusammengefaßt. Angegeben sind die Extinktionen in mE.
Tabelle 1
Figure imgf000027_0001
1: MAK<TnIc-Peptid,6-15>M-3.10.3
2: MAK<TnIc-Peptid,11-20>M-7.3.1
3: MAK<TnIC-Peptid,16-26>M-2.7.1
4: PAK<TnIc-Peptid,l-30>K-1689
5: PAK<TnIc-Peptid,l-30>K-1690
6: PAK<TnIC-Peptid, 1-10 ,6-15, 11-20, 16-26>K-1692 Beispiel 6
Synthese von Peptiden als Teststandards
Synthese von H-Met-Ala-Asp-Gly-Ser-Ser-Asp-Ala-Ala-Arg-Glu- Pro-Arg-Pro-Ala-Pro-Ala-Pro-Ile-Arg-Arg-Arg-Ser-Ser-Asn-Tyr- Amid (entspricht SEQ ID NO 6)
Das Peptid wurde an 120 mg 4-(2' ,4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc- aminomethyl)-phenoxy Harz mit einer Beladung von 0.45 mMol/g synthetisiert. Die Sequenz wurde mit einer Kombination von Fmoc als temporärer und Pmc/tBU/Trt/OtBu als permanente Schutzgruppen aufgebaut. Dazu wurden 16 Äqivalente folgender Fmoc-Aminosäure-Derivate verwendet:
Met
5 x Ala
2 x Asp(-OtBu)
Gly
4 x Ser(tBU)
5 x Arg(-Pmc) Glu(OtBu)
4 x Pro Ile
Asn(-Trt) Tyr(-tBu)
Die Kopplungsreaktionen erfolgten mit 1.1 Äquivalenten Diiso propylcarbodiimid/N-Hydrobenzotriazol in Bezug auf die Amino säurederivate als Aktivierungsreagenzien. Die Kopplungszeite betrugen 90 Minuten und wurden mit je 8 Äquivalenten Amino¬ säure-Derivat zweimal durchgeführt. Die temporäre Schutz¬ gruppe wurde mittels Piperidin innerhalb von 30 Minuten abgespalten. Die Reaktionen wurden in Di ethylformamid durc geführt, für die Waschschritte, die nach den Reaktions¬ schritten erfolgten, wurde das gleiche Lösungsmittel verwendet. Die Synthese wurde vollautomatisch an einem Zinsser SMPS 350 durchgeführt. Die Freisetzung des Peptides unter Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen erfolgte mit einem Gemisch aus 95 % Trifluoressigsäure, 3 % Ethandithiol und 2 % Anisol innnerhalb von 90 Minuten. Die Abspaltlösung wurde abfiltriert, mit der 10-fachen Menge Diisopropylether versetzt und der Niederschlag abfiltriert. Der Niederschlag wurde mit Diisopropylether gewaschen, in 20 %iger Essigsäur gelöst und lyophilisiert. Es fielen 29.5 mg weißes Lyo- philisat an. Die Reinheit wurde mittels HPLC kontrolliert ( % Area) . Das Rohpeptid wurde über eine 20 m x 300 um RP- HPLC-Säule (Säulenmaterial: C-18, 5μ, 300 A) mit einem Gradientensystem von 0 % B auf 100 % B in 100 Minuten (Puff A: 0.1 % Trifluoressigsäure in Wasser, Puffer B: 0.1 % Trifluoressigsäure in Wasser/Acetonitril 40:60) auf eine Reinheit lt HPLC von 97 % gereinigt.
Nach Vereinigung der Hauptfraktionen, Eindampfen im Wasser¬ strahlvakuum auf 30 % und Lyophilisation wurden 9.75 mg weißes Lyophilisat erhalten. Die Identität wurde mittels Massenspektroskopie (MH+: 2827) geprüft.
Abkürzungen
Fmoc-: Fluorenylmethyloxycarbonyl-
-tBU: tertiär Butyl-
-Trt: Trityl-
-OtBu: tertiär Buthylester
HPLC: Hochdruckflüssigkeitschromatographie
Pmc-: Pentamethylchroman-
Boc-: tertiär Butyloxycarbonyl Beispiel 7
Ko petitions-Assay mit einem Antikörper, der gegen das N- terminale Peptid von Tnlc (SEQ ID NO 1) gerichtet ist:
Mikrotiterplatten (Nunc-Maxisorb) wurden über Nacht bei 4°C mit 100 μl 5 μg/ml PAK<Dig>S(IS) (Boehringer Mannheim KAT.- NR. 1330713) beschichtet, mit 200 μl/well PBS/1% RSA nachbeladen und 3 x gewaschen.
50 μl/well Peptid-Lösung (SEQ ID NO 1, 4-fach konzentriert) oder Tnlc-Lösung (humanes cardiales Troponin I, 4-fach konzentriert) oder Probe (Seren von Normalpersonen (NS) oder von Personen (MI) nach Herzinfarkt) werden pipettiert.
50 μl/well Antikörperlösung (800 ng/ml MAK<TnIc-Peptid, 6-15>M-3.10.3.-IgG-Dig, 4fach konzentriert) werden zuge¬ geben. Der Antikörper wurde durch Aufreinigung nach Stand der Technik mit ProteinA-Sepharose gewonnen und mit Digoxi- genin-3-carboxy ethylether-N-hydroxy-succinimid derivati- siert.
30 min wird geschüttelt (100 μl Gesamtvolumen) .
100 μl/well biotinyliertes Peptid (20 ng/ml, SEQ ID NO 6, doppelt konzentriert) werden zugegeben.
Nach 60 min Schütteln (200 μl Gesamtvolumen) wird 3 x gewaschen.
200 μl/well Streptavidin-POD Konjugat (200 mU/ml, Boehringer Mannheim Kat.-Nr. 1248880) werden zugegeben.
Nach 60 min Schütteln wird 3 x gewaschen und 200 μl/well ABTS-Lösung (2,2 '-Azino-di[3-ethylbenzthiazolinsulfonat(6) ]) zugegeben.
Die Absorption wird nach 30 - 60 min bei 405 nm gemessen. Die Ergebnisse des Kompetitions-Assays mit Peptid-Lösung (SEQ ID NO 1) oder Tnlc-Lösung als Analyt sind in Tabelle 2 und Figur 1/2 wiedergegeben. Beide Analyten konkurrieren sehr gut mit dem biotinylierten Peptid so daß mit zunehmender Peptid- bzw. Tnlc-Konzentration das Meßsignal stark abfällt.
In der Tabelle 3 sind die Ergebnisse dargestellt ,die mit Seren von Normalpersonen (NS) und Personen nach Herzinfarkt (MI) erhalten wurden. Es konnte klar zwischen beiden Gruppe unterschieden werden.
Tabelle 2
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000031_0002
Tabelle 3
Figure imgf000032_0001
Das mit * versehene Serum eines Patienten mit Myocardinfark zeigte nur in einem Test gemäß vorliegendem Patent ein von den Normalseren deutlich abweichendes Signal. In anderen Testversionen, die Tnlc und nicht das N-terminale Peptid erkennen, war dieses Serum kaum von den Normalseren zu unterscheiden.
(1) Sandwich-Immunoassay unter Verwendung von zwei
Antikörpern, die durch Immunisierung mit Tnlc gewonnen wurden und das Peptid SEQ ID NO 1 nicht erkennen.
Beispiel 8
Sandwich-Assay mit einem Antikörper, der gegen das N- ter inale Peptid von Tnlc (SEQ ID NO 1) gerichtet ist, und einem Antikörper, der gegen Tnlc gerichtet ist:
In Reaktionsgefäße werden 120 μl Tnlc-Lösung (0; 0,4; 2; 5; 10; 20; 40; 100 ng/ml humanes cardiales Troponin I, doppelt konzentriert) oder Probe (Seren von Normalpersonen (NS) oder von Personen (MI) nach Herzinfarkt, 1+1 verdünnt) pipettiert.
60 μl/Gefäß Wandantikörper (5 μg/ml MAK<TnIc-Peptid,6-15>M- 3.10.3-IgG-Bi, 4-fach konzentriert) werden zugegeben. Der monoklonale Antikörper wurde durch Aufreinigung nach Stand der Technik mit ProteinA-Sepharose gewonnen und mit Biotinoyl-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimid derivati- siert.
60 μl/Gefäß MAK<TnIc>M-6F4/4Hl-IgG-Dig (5 μg/ml 4-fach konzentriert) werden zugegeben. Der monoklonale Antikörper (Immunogen Tnlc, erkennt das N-terminale Peptid nicht) wurde durch Aufreinigung nach Stand der Technik mit ProteinG- Sepharose gewonnen und mit Digoxigenin-3-carboxymethylether- N-hydroxy-succinimid derivatisiert.
Nach 60 min Inkubation (Gesamtvolumen 240 μl) werden jeweils 100 μl/well (Doppelbestimmungen) in Streptavidin- beschichtete Mikrotiterplatten (Microcoat) pipettiert.
Nach 30 min Schütteln wird 3 x gewaschen.
100 μl/well Detektionsantikörper (100 mU/ml Anti- digoxigenin-POD Fab Fragmente, Boehringer Mannheim Kat.-Nr. 1207733) werden zugegeben
Nach 30 min Schütteln wird 3 x gewaschen und 100 μl/well ABTS-Lösung (2,2 '-Azino-di[3-ethylbenzthiazolinsulfonat(6) ]) zugegeben.
Die Absorption wird nach 30 - 60 min bei 405 nm gemessen. Die Ergebnisse des Sandwich-Immunoassays mit Tnic-Lösung al Analyt sind in Tabelle 4 und Figur 2/2 wiedergegeben. In Abhängigkeit von der Menge an Analyt steigt das Meßsignal an.
Tabelle 4
Figure imgf000034_0001
In Tabelle 5 sind die Ergebnisse dargestellt, die mit Seren von Normalpersonen (NS) und Personen nach Herzinfarkt (MI) erhalten wurden. Es konnte klar zwischen beiden Gruppen unterschieden werden.
Tabelle 5
Figure imgf000035_0001
Das mit * versehene Serum eines Patienten mit Myocardinfarkt zeigte nur in einem Test gemäß vorliegendem Patent ein von den Normalseren deutlich abweichendes Signal. In anderen Testversionen, die Tnlc und nicht das N-terminale Peptid erkennen, war dieses Serum kaum von den Normalseren zu unterscheiden.
(1) Sandwich-Immunoassay unter Verwendung von zwei
Antikörpern, die durch Immunisierung mit Tnlc gewonnen wurden und das Peptid SEQ ID NO 1 nicht erkennen.
S EQUEN Z PROTOKO LL
(iii) Anzahl der Sequenzen: 7
(2) Information zu SEQ ID NO: 1:
(i) Sequenz Qiarakteristika
(A) Länge: 30 Aminosäuren
(B) Art: Peptid
(C) Topologie: linear
(xi) Sequenzbescinreibung: SEQ ID NO: 1:
Met Ala Asp Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala
1 5 10 15
Pro Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Ärcf Ala Tyr Ala
16 20 25 30
(2) Information zu SEQ ID NO: 2:
(i) Sequenz (.harakteristika
(A) Länge: 10 Aminosäuren
(B) Art: Peptid
(C) Topologie: linear
(xi) Sequerizbescihreibung: SEQ ID NO: 2:
Met Ala Asp Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg 1 5 10 (2) Information zu SEQ ID NO: 3 :
(i) Sequenz Qiarakteristika
(A) länge: 10 Aminosäuren
(B) Art: Peptid
(C) Topologie: linear
(xi) Sequen∑±>eschreibung: SEQ ID NO: 3:
Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala 1 5 10
(2) Information zu SEQ ID NO: 4:
(i) Sequenz Qiarakteristika
(A) Länge: 10 Aminosäuren
(B) Art: Peptid
(C) Tcpologie: linear
(xi) Saquen--bescfrre--bung: SEQ ID NO: 4:
Glu Pro Arg Pro Ala Pro Ala Pro Ile Arg 1 5 10
(2) Information zu SEQ ID NO: 5:
(i) Sequenz Qiarakteristika
(A) Länge: 11 Aminosäuren
(B) Art: Peptid
(C) Tcpologie: linear
(xi) Sequer-zbesc-hreibung: SEQ ID NO: 5:
Pro Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr 1 5 10 (2) Information zu SEQ ID NO: 6:
(i) Sequenz Qiarakteristika
(A) Länge: 26 Aminosäuren
(B) Art: Peptid
(C) Topologie: linear
(xi) Sequen--be--chreibung: SEQ ID NO: 6:
Met Ala Asp Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala
1 5 10 15
Pro Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr
16 20 25
(2) Information zu SEQ ID NO: 7:
(i) Sequenz Qiarakteristika
(A) Länge: 12 Aminosäuren
(B) Art: Peptid
(C) Tcpologie: linear
(xi) Sequenzbesdreibung: SEQ ID NO: 7:
Ala Pro Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr 1 5 10

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Herzmuske nekrosen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe m mindestens einem Antikörper, der das N-terminale Pepti von kardialem Troponin I erkennt und erhältlich ist durch Immunisierung mit einem Immunogen, das ein Pepti der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder mindestens eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, und Isolierung des polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers aus dem Serum bzw. den immortalisierten und klonierten Milzzellen der immunisierten Tiere nach bekannten Verfahren, versetzt und den sich bildenden Komplex in geeigneter Weise nachweist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da das Immunogen mindestens ein Peptid einer der Aminosäuresequenzen SEQ ID NO 2 - 7 enthält.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da die immunologische Bestimmung nach dem Prinzip eines Sandwich-Assays erfolgt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da die immunologische Bestimmung nach dem Prinzip eines kompetitiven Immunoassays erfolgt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da die immunologische Bestimmung nach dem Prinzip eines homogenen Immunoassays, wie beispielsweise einem CEDIA erfolgt. 6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da der Antikörper das gleiche Epitop wie der MAK <TnIc- Petpid,11-20>M-7.3.1 oder MAK<TnIc-Peptid,
6-15>M-3.10. erkennt.
7. Antikörper, der das N-terminale Peptid von kardialem Troponin I erkennt und erhältlich ist durch Immuni¬ sierung mit einem Immunogen, das ein Peptid der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder mindestens eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, und Isolierung des Antikörpers aus dem Serum der immunisierten Tiere nach bekannten Verfahren.
8. Monoklonaler Antikörper, der das N-terminale Peptid vo kardialem Troponin I erkennt und erhältlich ist durch Immunisierung mit einem Immunogen, das ein Peptid der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder mindestens eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Klonierung derjenigen immortalisierten Zellen, die den gewünschten Antikörpe produzieren und Isolierung des Antikörpers aus den klonierten Zellen nach bekannten Verfahren.
9. Verwendung eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche oder 8 in einem immunchemischen Verfahren.
10. Verwendung eines Peptids der Aminosäuresequenz
SEQ ID NO 1 oder mindestens einer Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält zur Herstellung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, als Standardmaterial, Polyhapten oder markiertes Antigen in Immunoassays.
11. Testkit zur Bestimmung von Herzmuskelnekrosen, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Behältnis mindestens ein Antikörper gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8 und in mindestens einem weiteren Behältnis die übrigen für de Immunoassay notwendigen Komponenten enthalten sind.
12. Testkit zur Bestimmung von kardialem Troponin I, dadur gekennzeichnet, daß in einem Behältnis ein Standardmaterial enthalten ist, das ein Peptid der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder mindestens eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält.
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