WO1991013987A2 - Cdna coding for the gene n of the viral haemorrhagic septicaemia virus and utilizations thereof - Google Patents

Cdna coding for the gene n of the viral haemorrhagic septicaemia virus and utilizations thereof

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WO1991013987A2
WO1991013987A2 PCT/FR1991/000198 FR9100198W WO9113987A2 WO 1991013987 A2 WO1991013987 A2 WO 1991013987A2 FR 9100198 W FR9100198 W FR 9100198W WO 9113987 A2 WO9113987 A2 WO 9113987A2
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Jacqueline Bernard
Florence Lecoq-Xhonneux
Michel Thiry
Pierre De Kinkelin
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Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
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Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid sequences derived from viral haemorrhagic septicemia virus (SHV virus), to products for transcribing the genomic RNA of said virus, to the use of said sequences as probes or as primers and for the expression of nucleoprotein N and / or fragments thereof, plasmids useful for said expression as well as the use of the expressed nucleoprotein and / or its fragments as an immunogenic agent, especially for the prevention of viral haemorrhagic septicemia.
  • SHV virus viral haemorrhagic septicemia virus
  • the present invention also relates to a screening test for viral haemorrhagic septicemia 0.
  • the viral haemorrhagic septicemia virus (HSV-V or SHV virus) of salmonids is responsible for an average annual loss of 15 ⁇ 000 tonnes for European trutti- culture.
  • This virus belongs to the family Rhajoviridae, genus Lyssavirus.
  • the object of the present invention is therefore to provide a composition with an immunogenic and / or protective power, specific for the viral haemorrhagic septicemia virus, obtained by expressing a viral antigen, in particular N-nucleoprotein and / or a fragment. of the latter, involved in the immune response, the obtaining by genetic engineering having for advan ⁇ tage to solve the problems of virus production.
  • the subject of the present invention is a nucleotide sequence derived from the genomic RNA of the virus of viral haemorrhagic septicemia (VHS), characterized in that it comprises the gene encoding Nucleoprotein N and in that it comprises approximately 1346 nucleotides; this sequence corresponds to the messenger RNA.
  • VHS viral haemorrhagic septicemia
  • the latter comprises the sequence of nucleotides and the deduced sequence of the ino-acids of formula I below: C TTT CAA GTT TGA AAT TCC AAG AAT TTG GAA AGT GAA AGT TGA ACA 46
  • AAA A as well as the sequences derived therefrom and fragments of said sequence and derived sequences.
  • Such a sequence corresponds to the cDNA of the mRNA of the N protein of the SHV virus.
  • derived sequence means both a single-stranded and double-stranded nucleic acid sequence, the nucleic acid representing both a DNA and an RNA.
  • the subject of the present invention is also a transcription product of the SHV virus, characterized in that it consists of a monocistronic fragment corresponding to nucleotides 1-1346 of the for ⁇ mule sequence (I) above, associated with a poly A and in that it encodes nucleoprotein N or a fragment thereof.
  • the present invention also relates to fragments or combinations of fragments of a nucleotide sequence according to the invention, coding for a peptide or a peptide fragment of the SHV virus, possibly associated with a poly A segment.
  • fragments includes inter alia: a fragment of 105 base pairs which corresponds to nucleotides 1-105 of the sequence of formula I above;
  • SHV-N1 a fragment of 1235 base pairs, hereinafter referred to as SHV-N1, which corresponds to nucleotides 101-1336 of the sequence of formula I above;
  • SHV-N2 a fragment of 1346 base pairs, called SHV-N2, which corresponds to nucleotides 1-1346 of the sequence of formula I above;
  • a fragment of 1214 base pairs which codes for the N-nucleoprotein of the SHV virus comprises 404 amino acids and which corresponds to nucleotides 92-1306 of said sequence of formula I.
  • the subject of the present invention is also oligonucleotides, characterized in that they consist of a fragment of a nucleotide sequence according to the invention and in that they correspond to any one of formulas 1 to 10 below:
  • the present invention also relates to nucleotide probes, characterized in that they comprise a nucleotide sequence or a fragment thereof in accordance with the invention, optionally labeled with a marker such as a radioactive isotope. , a suitable enzyme or other suitable non-radioactive substance.
  • a marker such as a radioactive isotope.
  • a suitable enzyme or other suitable non-radioactive substance are chosen from the group which comprises the oligonucleotides of formula (1) to (5), which hybridize specifically with the genomic RNA of the SHV virus.
  • they are chosen from the group which comprises the oligonucleotides of formula (6) to (10), which hybridize specifically with the mRNA of the SHV virus.
  • the subject of the present invention is also primer pairs for the synthesis of a cDNA or an RNA of SHV virus, characterized in that each primer comprises a nucleotide sequence or a nucleotide fragment according to the invention .
  • primers make it possible in particular to synthesize a DNA or RNA sequence or a fragment thereof in accordance with the invention and / or its complementary strand.
  • primer pairs consist of an oligonucleotide of formula (1) paired with an oligonucleotide of formula (10).
  • the present invention also relates to a peptide and / or a peptide fragment, characterized in that it is encoded by a nucleotide sequence or a combination of several nucleotide fragments as defined above.
  • said peptide is encoded by the nucleoprotein N gene, comprising 404 amino acids and has a molecular weight of 44590 Da.
  • said nucleoprotein has an amino acid sequence which corresponds to formula II below:
  • the subject of the present invention is also fragments or combinations of fragments of the peptide according to the invention and in particular a fragment of amino acids, corresponding to the terminal COOH moiety of the sequence of formula II.
  • the said peptides are advantageously obtained by synthesis, in particular by Merrifield synthesis.
  • the present invention also relates to a recombinant cloning and / or expression vector, ca ⁇ characterized in that it comprises a nucleotide sequence according to the invention.
  • the term "recombinant vector” means both a plasmid, a cosmide and a phage.
  • said vector consists of a suitable plasmid com ⁇ taking an origin of replication, at least one selection marker and a nucleotide sequence according to the invention, which vector is a cloning vector.
  • a first selection marker is in particular a gene whose expression allows the selection of bacteria having incorporated said plasmid.
  • this technique only makes it possible to select the bacteria which have incorporated a plasmid, " it does not make it possible to distinguish those which have incorporated a recombinant plasmid from those which have incorporated an empty plasmid. use, directly or in a second time, a second selection marker.
  • said cloning vector consists of a plasmid pUC13 in which the sequence is inserted.
  • the SHV-N 2 sequence is inserted at the Sma I site of said plasmid.
  • said cloning vector is constituted by killed by a plasmid pBS in which is inserted the SHV-L sequence of 1235 base pairs, as defi ⁇ nie above, said plasmid being called pSHV-Nl.
  • VHS-N * j _ sequence is inserted at the EcoRI site of said plasmid.
  • said vec ⁇ tor consists of an appropriate recombinant vector comprising in particular an origin of replication in a suitable host microorganism, including a bac ⁇ teria or a eukaryotic cell, at least one gene whose expression allows the selection of either bacteria or eukaryotic cells having received said vector, a pro ⁇ engine for the expression of genes in said bacteria or eukaryotic cells, and in which is embedded a nucleotide sequence. or a sequence fragment as defined above, which vector is an expression vector of a peptide, a peptide fragment or a combination of peptide fragments of the SHV virus.
  • said expression vector consists of a plasmid pATH1 in which is inserted, in phase at its Eco RI site, the Eco RI fragment of the plasmid pSHV-N2 according to the invention. .
  • Said vector expresses a trpE-N protein fusion protein.
  • said expression vector consists of a plasmid pUEX2 into which is inserted. in phase at its site S to I, the Eco RI fragment of the plasmid pSHV-Nl according to the invention.
  • Said vector expresses a ⁇ -galactosidase-N protein fusion protein.
  • the subject of the present invention is also an expression product for nucleoprotein N, characterized in that it is expressed in a recombinant expression vector such as defined above.
  • said expression product comprises the nucleoprotein N or a fragment thereof and the ⁇ -galactosidase or fragment thereof and is recognized by onoclonal antibodies specific for the N protein. .
  • said expression product it comprises the nucleoprotein
  • the present invention also relates to a suitable host cell obtained by genetic transformation, characterized in that it is transformed by an expression vector according to the invention, Such a cell is capable of expressing an expression product
  • the host cell is in particular Saccharomyces cerevisiae transformed with an expression vector according to the invention.
  • the subject of the present invention is also a process for the expression of a peptide according to the invention, characterized in that the host cell results from the transformation with a vector containing a nucleotide sequence or a fragment thereof coding for a protein comprising nucleoprotein N or a fragment thereof, is cultured to produce and accumulate said peptide, which is then collected.
  • said peptide is either secreted in the periplasmic space or excreted in the culture medium.
  • the subject of the present invention is also a composition with an immunogenic and / or protective capacity, characterized in that it comprises a peptide according to the invention, optionally combined with at least one other immunogenic or immunostimulatory substance and / or with a vehicle. pharmaceutically acceptable.
  • composition it comprises a peptide according to the invention associated with the VHS virus G protein or with a fragment thereof.
  • the present invention also relates to a composition with immunogenic and / or protective power, characterized in that it comprises a transformed host cell according to the invention, appropriately inactivated.
  • composition comprises Saccharomyces cerevisiae transformed with an expression vector according to the invention.
  • Inactivation comprises, in particular, chemical inactivation (formalin, peracetic acid in particular) associated with physical inactivation (in particular U.V.).
  • the subject of the present invention is, moreover, a method for detecting SHV virus, characterized in that it consists in detecting an SHV virus using at least one nucleotide probe or a nucleotide probe fragment conforming to the invention, by putting in pre ⁇ ence the sample to be analyzed with said / said nucleotide probes, to which / to which the RNA binds genomic or the SHV virus transcription products, if such products are present in the sample, the reading of the result being revealed by an appropriate means, including EA, RA, fluorescence.
  • the nucleic sequence to be detected is amplified by the so-called PCR amplification method (reaction of polymerization by a suitable polymerase, especially Taq polymerase) using a pair of primers according to the invention.
  • PCR method is described in particular by SAIKI et al. in Science 1988, 239, 487 and in the European Patent Applications CETUS No. 200,362 and No. 201,184.
  • the pair of primers is preferably the oligonucleotide of formula (1) paired with the oligonucleotide of formula (10).
  • the present invention furthermore relates to a method for detecting anti-SHV virus antibodies, characterized in that it consists in detecting the anti-SHV virus antibodies possibly present in a biological sample with the aid of a peptide or fragment of peptides according to the invention, optionally fixed on a suitable solid support, by bringing said biological sample into contact with said peptides or fragment (s) of peptides, to which the anti-human antibodies bind.
  • VHS virus if such antibodies are present in the sample to be analyzed, the reading of the result being revealed by an appropriate means, in particular EIA, RIA, fluorescence.
  • This method makes it possible, in particular, to verify the seroconversion of the vaccinated animals or to carry out epidemiological serological surveys.
  • the present invention furthermore relates to a ready-to-use kit for implementing the method for detecting the VHS virus, characterized in that it comprises, in addition to the useful quantities of buffers suitable for implementation of said detection, ap ⁇ appropriate doses of at least one probe and / or nucleotide probe fragment according to the invention and optionally appropriate doses of at least two primers according to the invention.
  • the present invention furthermore relates to a ready-to-use kit for carrying out the method for detecting anti-virus SHV virus, characterized in that it comprises, in addition to useful amounts. tam ⁇ pons suitable for the implementation of said detec ⁇ tion, appropriate doses of at least one peptide and / or a peptide fragment according to the invention.
  • the present invention further relates to the application of the nucleotide sequences according to the invention or fragments thereof to the production of genetically modified animals.
  • sequences according to the invention make it possible in particular to obtain fish cells and fish which have become resistant to the VHS virus.
  • the invention also comprises other arrangements, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the method which is the subject of the present invention.
  • Total RNA is prepared as described in CHOMCZYNSKI et al. (Anal Biochem., 1987, 162, 156-159) and the poly A + RNA is purified on a oligo-dT cellulose column (Pharmacia).
  • the cDNA is synthesized using the Boehringer cDNA kit (catalog number 1013882), and inserted at the Sma I site of the vector pUC13 (Pharmacia).
  • E. Coli strain D1210 is transformed and the colonies are transferred to replication filters and screened by hybridization with labeled single-stranded cDNA fragments prepared from total RNA from infected or non-infected cells. VHSV, reverse transcription primed at random. Clones that hybridize only with the RNA of infected cells are purified and their plasmids used as probes for the Northern RNA blot sourced from infected cells.
  • Colonies containing a plasmid that hybridizes to an RNA having the mobility assessed for the N gene mRNA are selected.
  • a 1346 nucleotide insert (clone SHV-N2) was cut with restriction enzymes Hind III and EcoRI (partial digest) and transferred to the M13mp18 and M13mp19 sequencing vectors.
  • the cells are harvested 8 hours after the viral infection.
  • the total nucleic acids are extracted in a buffer at 1'isothiocyanate guanidium (Maniatis et al., Molecular Cloning, 1982) and "total RNA is document ⁇ cipotti with 2M LiCl.
  • the poly A + RNA was purified on Hybond affinity paper (mAP-Amersham)
  • the cDNAs are synthesized using an Amersham cDNA kit (catalog number RPN 1256) and inserted at the EcoRI site of an ⁇ gt10 vector
  • the EcoRI-EcoRI fragment is then transferred in an ⁇ ZAP vector (SHORT et al., Nucleic Acids Research, 1988, 16, 7583-7600) between the Smal and Hind III site of the polylinker, XL1-Blue coli cells are infected and pBS plasmids are cleaved.
  • the plasmid pSHV-N1 is in particular transcribed in vitro in the presence of T3 and T .7 RNA polymerases and the labeled RNAs are hybridized with RNA extracts obtained from the virion and from infected and uninfected cells, so as to determine the orientation of the insert.
  • the RNA can be cloned directly into a pBS vec ⁇ tor as can be seen in FIG. 1 in which a plasmid pBS-SK (STRATAGENE) is cut at the unique EcoRI site of its polylinker by the restriction enzyme EcoRI and at this level. site, insert SHV-N1 is inserted.
  • Example 3 Obtaining a plasmid in the form of single-stranded DNA leaving the cells in the culture medium, embedded in the proteins of the disinfectant folding fl.
  • a fragment of the nucleotide sequence of the genomic RNA cDNA of SHV virus of 1235 pairs of bases is inserted into a plasmid pBS-SK (Catalog No. 212206 and 212207) at the Eco RI site of the polylinker as shown in Figure la.
  • the bacteria in the exponential growth phase are infected at a multiplicity of 10 phages per bacteria.
  • a fragment of the nucleotide sequence of the 1346 base pair SHV virus messenger RNA cDNA was inserted into a plasmid pUC13 at the Sma I site, between the BamHI site, on one side and the sites.
  • Example 5 Expression of the SHV-N2 insert.
  • the Eco RI fragment of pSHV-N2 is inserted in phase at the Eco RI site of a pATH1 plasmid.
  • the translation of the message contained in the insert is carried out under the control of the TRPE promoter (anthranylate synthetase).
  • the fusion protein corresponding to the SHV-N2 insert is expressed from said plasmid pATH (DIECKMAN et al., J. Biol, "Chenu, 1985, 260, 1513-1520.)
  • Recombinant clones are cultured overnight in M9 medium supplemented with tryptophan at 20 mg / 1 casamino acids and 0.5%. the culture is diluted 10-fold in the same medium without tryptophan and grown for one hour at 30 ° C prior to induction with the 5 mg / l indole-acrylic acid for 2 hours.
  • the protein expressed by the SHV-N2 migrates on SDS-Page at the position 70 000-73 000. As the trpE corresponds to 35 000, the protein N has a molecular weight of the order of 35 -38,000.
  • Example 6 Expression of the SHV-Nl fragment.
  • Plasmid pSHV-N1 is digested with the Eco RI enzyme and the fragment obtained is inserted in phase at the Sma I site of a pUEX 2 plasmid as shown in FIG.
  • the translation of the message contained in the insert is carried out under the control of the galactosidase promoter.
  • the translation of the message contained in the insert is under the control of the T4 or T7 promoters in a PBS plasmid.
  • the fusion protein corresponding to the HSV-N1 is expressed from said plasmid pUEX (AMERSHAM).
  • the recombinant clones were cultured overnight at 27 ° C in L medium Broth. The culture is diluted in the same medium and grown for 5 hours at 27 ° C and then 2 hours at 42 ° C for induction.
  • the ⁇ -Gal-N fusion protein has a molecular weight of about 160,000 and ⁇ -Gal corresponds to a molecular weight of 120,000.
  • This protein is recognized by a monoclonal antibody specific for the N nucleoprotein.
  • Figure 2a shows the migration of protein N and ⁇ -galactosidase.
  • the N- ⁇ Gal fusion protein and the ⁇ -gal are electrophoresed in parallel and the gel is stained with Comassie blue.
  • the molecular weight markers are 94, 67, 43, 30 and 20 kDa on the right and 200, 92.5, 69, 46, 21.5 and 14.3 kDa on the left. Between 200 and 92.5, the distance is not proportional to the logarithm of molecular weight.
  • N- ⁇ Gal, ⁇ -Gal and purified virus proteins are electrophoresed in parallel, then transferred to nitrocellulose membranes and treated either with the monoclonal antibodies F5 (dilution 1/5000), specific for nucleoprotein N or with monoclonal antibodies 110
  • FIG. 2b shows the recognition of the N protein by a monoclonal antibody specific for the N protein called F5, said protein not being recognized by a monoclonal antibody specific for the G protein designated 110.
  • the tasks correspond to 1 to 0.13 ⁇ g of ⁇ -
  • Gal-N or ⁇ -Gal deposited on nitrocellulose and treated with the same antibodies as above.
  • Example 7 Sequencing of inserts SHV-N1 and SHV-N2.
  • the nucleotide sequence 1 to 105 is obtained from M13mp19 (SHV-N2) and M13mp18 (SHV-N2) and represents both strands of pSHV-N2.
  • the nucleotide sequence 105 to 1300 is verified on both strands of the two inserts (SHV-N1 and SHV-N2); there is homology of the two inserts at the level of this fragment which includes the open reading phase.
  • the sequencing is carried out either in the presence of sequenase (modified T7 DNA polymerase), according to the proto ⁇ cole described in the United States Biochemical kit, or in the presence of a KlenoI fragment of DNA polymerase I, according to the protocol described in US Pat. the Boehringer kit.
  • sequenase modified T7 DNA polymerase
  • KlenoI fragment of DNA polymerase I according to the protocol described in US Pat. the Boehringer kit.
  • EXAMPLE 8 Method for Detecting the SHV Virus According to the Invention in the Presence of Appropriate Antibodies at.
  • Anti-virus SHV polyclonal antibodies are prepared from a fusion protein according to the invention.
  • An ELISA technique such as that described in AY and DIXON (J.Applied Ichtyol, 1988, 4, 182-189) is applied, in particular to the sampling of fish organs.
  • EXAMPLE 9 Method for Detecting Antinucleoprotein N Antibody, in Accordance with the Invention
  • RNA is hybridized with 100 ng of the oligonucleotide (1) according to the invention of sense (+) and extending at positions 290 and 307 of the genome of the SHV virus and a sense DNA ( +) complementary to the genome is specifically primed and synthesized.
  • the reaction medium is extracted with phenol, precipitated with ethanol, washed and dried. It is then taken up in 50 .mu.l comprising the primer corresponding to an oligonucleotide of formula (10) of direction (-) and extending between the positions 740 to 757 of the gene, appropriate buffers commonly used during the treatment. amplification and Taq DNA polymerase.
  • the reaction medium is incubated in a "PCR machine" subjecting it to the steps of: + 95 ° C 5 min to denature + 50 ° C 2 min so that the primers hybridize + 72 ° C 2 min for the Taq polymerase to lengthen the cDNA strands.
  • the for ⁇ mule oligonucleotide (1) hybridizes with the genomic RNA and serves as a reverse transcription primer.
  • the second strand is then synthesized using, as primer, the oligonucleotide of formula (10). Both can then be used for amplification.
  • the for ⁇ mule oligonucleotide (10) can hybridize with the messenger for the reverse transcription reaction and the oligonucleotide of formula (1) be used for second strand synthesis.
  • Example 11 Immunogenic Power and Protection of the Compositions in Accordance with the Invention Batches with more than 50 troutels per lot receive nucleosome protein N, protein G preparations and the combination of both.
  • Example 12 Preparation of fish cells that have become resistant to the SHV virus.
  • the sequence of the first 100 nucleotides of the sequence of formula I according to the invention is taken; it is inserted into a plasmid vector under the control of an active promoter in eukaryotic cells especially able to express itself in fish cells and in fish, so that the cRNA of the cited fragment is synthesized so as to show whether these antisense se ⁇ quences are capable of protecting fish cells and fish against an infection with the virus.
  • the plasmid vector used is, for example, a pCMV CAT in which the sequence is under the control of a promoter of the immediate early human CMV (cytomegalovirus) protein.
  • the promoter results from the fusion of the URS (Upstream Regulating Sequences) of ADH2, the alcohol dehydrogenase 2 gene which is inducible by alcohol and the GAPDH promoter (glyceraldehyde phosphate dehydrogenase) which is one of the most potent constitutive promoters of yeast, this hybrid promoter combines the potency of the GAPDH promoter with the inducibility of ADH2,
  • the terminator of the GAPDH gene Selection in yeast is accomplished by complementation of an auxotrophy of the host strain by the Ura3 or leu2d (d deficient) genes; these two genes used to study the influence of the number of copies on the production of the protein of interest, as URA3 allele is a wild the mutated gene, supplementation is effec- cace, the number of copies of the vector is minimal, the gene leu 2d is very little translated, to ensure the biosynthesis of leucine essential for its growth the cell has only one possibility to increase the number of copies of the leu gene 2d and by therefore the number of copies of the vec ⁇ tor.
  • the N protein gene was reproduced by PCR from plasmid pSHVN2.
  • the first oligonucleotide CGA CCA TGG AAG GAG GAA TTC GT places a Ncol Ncol site on the initiator codon of the N protein. This modification does not change the sequence of amino acids.
  • Sali AGA GTC CTC GGG places a Sali site downstream of the ter- minator codon.
  • the synthesized DNA is digested with the NcoI and SalI enzymes, is inserted into the NCEP and SalI-mediated intermediate pEGTIO1 intermediate between the ADH2 / GAPDH promoter, by virtue of the NcoI site placed on the ATG initiator, and the plasmid terminator.
  • pEGTIO1 intermediate through the SalI site located after the stop codon and introduced by transformation into E. coli.
  • a plasmid called pEGTIO1-SHVN is thus obtained.
  • the characteristics of this plasmid were verified by digestion with NcoI and SalI restriction enzymes which releases the cDNA of the above amino acid sequence as a 1.2 kb band.
  • the BamHI fragment containing the promoter, the N protein gene and the terminator is in turn introduced at the unique BamHI site of the E. coli-yeast pEGTHO shuttle vector; the plasmids are introduced by transformation and the presence of the BamHI fragment in the vector na ⁇ vette is verified by the BamHI digestion which shows a 3.4 kb band.
  • the plasmid thus obtained, pYSHVN is introduced by transformation with PEG in the conventional strain of yeast DC04 (adele leu2-04 cir °) .
  • the construction of the vector pYSHVN is shown in FIG.
  • the protocol of fermentation and induction is particular because the induction of ADH2 is sensitive to catabolic repression.
  • the first phase of the fermentation aims to obtain a biomass by maintaining the plasmid.
  • the selection is made by completion of the mutation leu 2, therefore the medium is YNB (Yeast nitrogen base without amino acids Difco 0919-15), with 3% glucose.
  • the medium is made as rich as possible by adding all the amino acids except leucine, and the nitrogenous bases.
  • the generation time of the strain in this medium is close to 4 hours, compared with only 2 hours in a complex medium.
  • the optical density reached is 2.5.
  • the cells are then transferred to an identical medium overnight, where glucose has been replaced by glycerol to remove the catabolic repression.
  • Induction is in YM rich medium (Yeast Broth Difco 0711-01) in the presence of 3% ethanol.
  • the culture is continued to an optical density of 4.
  • the cells are harvested by centrifugation and resuspended in 20 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, methylphenyl fluoride (PMSF). 1mM sulfonyl), pH 8.0.
  • the cells are then broken by three passes to the French press so as to obtain a crude extract of the amino acid sequence.
  • the invention is not limited to those of its modes of implementation, implementation and application which come to be described more explicitly; on the other hand, it engages all the variants that can To the mind of the technician in this field, without departing from the scope or scope of the present invention.

Abstract

Nucleotidic sequences from the viral haemorrhagic septicaemia (VHS) virus, transcription products of the genomic RNA of said virus, use of said sequences as probes or triggers and for the expression of the nucleoprotein N and/or its fragments, plasmides useful for said expression and use of the expressed nucleoprotein and/or its fragments as an immunogenic agent, especially for the prevention of viral haemorrhagic septicaemia. Application of said sequences to the detection of viral haemorrhagic septicaemia and the obtaining of genetically modified animals. The nucleotidic sequence from the genomic RNA of the VHS virus comprises the coding gene for the nucleoprotein N, corresponds to the messenger RNA and comprises about 1346 nucleotides.

Description

ADNC CODANTE POUR LE GENE N DU VIRUS DE LA SEPTICEMIE HEMORRAGIQUE VIRALE ET S ES UTILISATIONS.CODING CODING FOR THE VIRAL HAEMORRHAGIC SEVENTRY VIRUS VIRUS GENE AND USES THEREOF.
La présente invention est relative à des sé¬ quences nucléotidiques issues du virus de la septicémie hémorragique virale (virus SHV) , aux- produits de trans- 0 cription de l'ARN génomique dudit virus, à l'utilisation desdites séquences comme sondes ou comme amorces et pour l'expression de la nucléoprotéine N et/ou des fragments de celle-ci, aux plasmides utiles pour ladite expression ainsi qu'à l'utilisation de la nucléoprotéine exprimée 5 et/ou de ses fragments comme agent à pouvoir immunogene, notamment pour la prévention de la septicémie hémor¬ ragique virale.The present invention relates to nucleic acid sequences derived from viral haemorrhagic septicemia virus (SHV virus), to products for transcribing the genomic RNA of said virus, to the use of said sequences as probes or as primers and for the expression of nucleoprotein N and / or fragments thereof, plasmids useful for said expression as well as the use of the expressed nucleoprotein and / or its fragments as an immunogenic agent, especially for the prevention of viral haemorrhagic septicemia.
La présente invention est également relative à un test de dépistage de la septicémie hémorragique 0 virale. Le virus de la septicémie hémorragique virale (VHS-V ou virus SHV) des salmonidés est responsable d'une perte annuelle moyenne de 15~000 tonnes pour la trutti- culture européenne. Ce virus appartient à la famille des Rhajoviridae, genre Lyssavirus .The present invention also relates to a screening test for viral haemorrhagic septicemia 0. The viral haemorrhagic septicemia virus (HSV-V or SHV virus) of salmonids is responsible for an average annual loss of 15 ~ 000 tonnes for European trutti- culture. This virus belongs to the family Rhajoviridae, genus Lyssavirus.
25 II est connu que ce virus n'inhibe pas complè¬ tement les synthèses des cellules hôtes en dépit du fait que le rendement en particules virales est élevé. Il est également connu que l'ARN viral génomique, à polarité négative, est transcrit séquentiellement, l'ordre desIt is known that this virus does not completely inhibit syntheses of host cells despite the fact that the yield of virus particles is high. It is also known that genomic viral RNA, with negative polarity, is transcribed sequentially, the order of
30 gènes de 3' en 5', étant similaire à celui des autres membres de la famille, à savoir N, Ml, M2, G et L (BERNARD J. et al., Ann Inst. Pasteur/virol. , 1985, 136E, 213-222) .5 '3' genes, being similar to that of the other members of the family, namely N, M1, M2, G and L (BERNARD J. et al., Ann Inst Pasteur / Virol., 1985, 136E , 213-222).
Il a également été montré que la protéine NIt has also been shown that N protein
35 est phosphor lée et que son poids moléculaire relatif, déterminé par SDS-Page, varie de 38 000 à 62 000 daltons, selon les Auteurs (A. DEUTER et al., J. VET. MED.,1986, 33, 36-46) .
Figure imgf000004_0001
It is phosphorated and its relative molecular weight, determined by SDS-Page, varies from 38,000 to 62,000 daltons, according to the authors (A. DEUTER et al., J. VET MED, 1986, 33, 36- 46).
Figure imgf000004_0001
2 Au cours des dernières années, ont été isolés et étudiés essentiellement les Rhabdovirus apparentés au virus de la rage ; notamment un certain nombre de docu¬ ments décrivent des séquences nucleotidiques de ces dif- férentε Rhabdovirus ainsi que leurs applications (TORDO N. et al., PROC. NAT. ACAD. SCI. USA, 1986, 83, 3914- 3918) . Cependant, en ce qui concerne les maladies à virus des poissons, peu d'études ont été réalisées, alors que 1'incidence économique de ces maladies est très impor- tante.2 In recent years, rabies virus-related Rhabdoviruses have been isolated and studied mainly; in particular, a number of documents describe nucleotide sequences of these different Rhabdoviruses as well as their applications (Tordo, N, et al., Proc Nat., ACAD, Sci USA, 1986, 83, 3914-3918). However, with regard to fish-virus diseases, few studies have been carried out, whereas the economic impact of these diseases is very important.
En particulier, aucune détection efficace, ra¬ pide et simple du virus, ni aucune prévention de la septicémie hémorragique virale ne permet, à l'heure actuelle, de surveiller et de protéger les Salmonidés d'Europe.In particular, no effective, rapid and simple detection of the virus, nor any prevention of viral haemorrhagic septicemia, currently makes it possible to monitor and protect European Salmonids.
La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à une composition à pouvoir immunogene et/ou protecteur, spécifique du virus de la septicémie hémorragique virale, obtenue en exprimant un antigène viral, notamment la- nucléoprotéine N et/ou un fragment de celle-ci, impliqué dans la réponse immuni¬ taire, l'obtention par génie génétique ayant pour avan¬ tage de résoudre les problèmes de production de virus.The object of the present invention is therefore to provide a composition with an immunogenic and / or protective power, specific for the viral haemorrhagic septicemia virus, obtained by expressing a viral antigen, in particular N-nucleoprotein and / or a fragment. of the latter, involved in the immune response, the obtaining by genetic engineering having for advan¬ tage to solve the problems of virus production.
C'est également un but de l'invention de pour- voir à des sondes et des amorces nucleotidiques pour la détection spécifique dudit virus.It is also an object of the invention to provide probes and nucleotide primers for the specific detection of said virus.
La présente invention a pour objet une séquence nucléotidique issue de l'ARN génomique du virus de la septicémie hémorragique virale (SHV), caractérisée en ce qu'elle comprend le gène codant pour la nu¬ cléoprotéine N et en ce qu'elle comporte environ 1346 nucleotides ; cette séquence correspond à l'ARN messager.The subject of the present invention is a nucleotide sequence derived from the genomic RNA of the virus of viral haemorrhagic septicemia (VHS), characterized in that it comprises the gene encoding Nucleoprotein N and in that it comprises approximately 1346 nucleotides; this sequence corresponds to the messenger RNA.
Selon un mode de réalisation avantageux de la¬ dite séquence, celle-ci comprend la séquence en nucléo- tides et la séquence déduite en a ino-acides de formule I ci-après : C TTT CAA GTT TGA AAT TCC AAG AAT TTG GAA AGT GAA AGT TGA ACA 46According to an advantageous embodiment of the said sequence, the latter comprises the sequence of nucleotides and the deduced sequence of the ino-acids of formula I below: C TTT CAA GTT TGA AAT TCC AAG AAT TTG GAA AGT GAA AGT TGA ACA 46
Met 1Met 1
CAG AGT CAT ATC TCA TAA TCG TTG AAC AAA AGA ACT CAG TCG AAG ATG 94CAG AGT CAT ATC TCA TAA TCG TTG AAC AAA AGA ACT CAG TCG AAG ATG 94
Glu Gly Gly Ile Arg Ala Ala Phe Sêr Gly Leu Asn Asp Val Arg Ile 17Glu Gly Gly Arg Island Ala Ala Phe Ser Gly Leu Asn Asp Val Arg Island 17
GAA GGA GGA ATT CGT GCA GCG TTT TCA GGC CTG AAT GAT GTT AGG ATT 142GAA GGA GGA ATT CGT GCA GCG TTT TCA GGC CTG AAT GAT GTT AGG ATT 142
Asp Pro T r Gly Gly Glu Gly Arg Val Leu Val Pro Gly Glu Val Glu 33Asp Pro T Gly Gly Glu Gly Arg Val Val Pro Val Gly Glu Val Glu 33
GAC CCC ACC GGT GGA GAG GGA CGG GTA CTT GTA CCT GGT GAA GTG GAG 190GAC ACC ACC GGT GGA GAG GGA GTC GTA CTT CAG GTA GGT GAA GTG GAG 190
Leu Ile Val Tyr Val Gly Glu Phe Gly Glu Glu Asp Arg Lys Val Ile 49Leu Ile Val Tyr Val Gly Glu Phe Gly Glu Glu Asp Arg Lys Val Ile 49
CTC ATC GTG TAT GTT GGT GAA TTT GGT GAG GAA GAT AGG AAG GTG ATT 238CTC ATC GTG TAT GTT GGT GAA TTT GGT GAG GAA GAT AGG AAG GTG ATT 238
Val Asp Ala Leu Ser Ala Leu Gly Gly Pro Gin Thr Val Gin Ala Leu 65Val Asp Ala Leu Ser Leu Ala Gly Gly Pro Gin Al Val Val Gin Ala Leu 65
GTG GAT GCA CTC TCC GCA CTC GGG GGA CCC CAG ACT GTA CAG GCG TTG 286GTG GAT GCA CTC TCC GCA CTC GGG GGA CCC CAG ACT GTA CAG GCG TTG 286
Ser Val Leu Leu Ser Tyr Val Leu Gin Gly Asn Thr Gin Glu Asp Leu 81Ser Val Leu Leu Ser Tyr Leu Val Gin Gly Asn Thr Gin Glu Asp Leu 81
TCC GTG CTT CTC TCC TAT GTA CTC CAA GGG AAC ACA CAG GAG GAC CTA 334TCC GTG CTT CTC TCC TAT GTA CTC CAA GGG AAC ACA CAG GAG GAC CTA 334
Glu Thr Lys Cys Lys Val Leu Thr Asp Met Gly Phe Lys Val Thr Gin 97 GAA ACA AAG TGC AAG GTC CTC ACA GAC ATG GGC TTC AAG GTG ACA CAG 382Glu Thr Lys Cys Lys Val Leu Thr Asp Met Gly Phe Lys Val Thr Gin 97 GAA ACA AAG TGC AAG GTC CTC ACA GAC ATG GGC TTC AAG GTG ACA CAG 382
Ala Val Arg Ala Thr Ser Ile Glu Ala Gly Ile Met Met Pro Met Arg 113Ala Val Arg Ala Thr Ser Glu Island Ala Gly Island Met Met Pro Met Arg 113
GCA GTC AGG GCC ACG AGC ATC GAG GCG GGA ATC ATG ATG CCC ATG AGA 430GCA GTC AGG GCC ACG AGC ATC GAG GCG GGA ATC ATG ATG CCC ATG AGA 430
Glu Leu Ala Leu Thr Val Asn Asp Asp Asn Leu Met Glu Ile Val Lys 129 GAA CTG GCC CTG ACT GTC AAT GAC GAC AAC CTC ATG GAA ATC GTC AAG 478Glu Leu Ala Leu Thr Val Asn As Asp Asp Asn Leu Met Glu Ile Val Lys 129 GAA CTG GCC CTG ACT GTC AAT GAC GAC AAC CTC ATG GAA ATC GTC AAG 478
Gly Thr Leu Met Thr Cys Ser Leu Leu Thr Lys Tyr Ser Val Asp Lys 145 GGG ACC TTG ATG ACA TGC TCC CTT CTT ACC AAG TAC TCG GTG GAC AAG 526Gly Thr Leu Met Thr Cys Ser Leu Leu Thr Lys Tyr Ser Val Asp Lys 145 GGG ACC TTG ATG ACG TGC TCC CTT CTT ACC AAG TAC TCG GTG GAC AAG 526
Met Ile Lys Tyr Ile Thr Lys Lys Leu Gly Glu Leu Ala Asp Thr Gin 161Met Ile Lys Tyr Ile Thr Lys Leu Leu Leu Gly Glu Leu Ala Asp Thr Gin 161
ATG ATC AAG TAC ATC ACC AAG AAA CTC GGG GAG CTG GCA GAC ACC CAG 574ATG ATC AAG TAC ATC ACC AAG AAA CTC GGG GAG CTG GCA GAC ACC CAG 574
Gly Val Gly Glu Leu Gin His Phe Thr Ala Asp Lys Ala Ala Ile Arg 177 GGA GTT GGG GAA CTG CAG CAC TTC ACC GCT GAC AAG GCA GCC ATC AGG 622Gly Val Gly Glu Leu Gin His Phe Thr Ala Asp Lys Ala Ala Island Arg 177 GGA GTT GGG GAA CTG CAG CAC TTC ACC GCT GAC AAG GCA GCC ATC AGG 622
Lys Leu Ala Gly Cys Val Arg Pro Gly Gin Lys Ile Thr Lys Ala Leu 193Lys Leu Ala Gly Cys Val Arg Pro Gly Gin Lily Lys Thr Lys Ala Leu 193
AAA CTC GCA GGG TGT GTG CGT CCC GGG CAG AAG ATC ACC AAG GCC CTC 670AAA CTC GCA GGG TGT GTG CGT CCC GGG CAG AAG ATC ACC AAG GCC CTC 670
Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Glu Ile Ala Asp Pro Thr Thr Gin Ser Arg 209Tyr Ala Phe Island Leu Thr Glu Island Ala Asp Pro Thr Thr Gin Ser Arg 209
TAT GCG TTC ATC CTG ACT GAG ATC GCA GAC CCC ACC ACC CAG TCG AGG 718TAT GCG TTC ATC CTG GAG ACT ATC GCA CCC ACC ACC GAS TCG AGG 718
Val Pro Ser Met Gly Ala Leu Arg Leu Asn Gly Thr Gly Met Thr Met 225Val Pro Ser Met Gly Ala Leu Arg Asn Leu Gly Thr Gly Met Thr Met 225
GTC CCG AGC ATG GGG GCG TTG AGA CTC AAC GGG ACA GGA ATG ACC ATG 766GTC CCG AGC ATG GGG GCG TTG AGC CTC AAC GGG ACA GGA ATG ACC ATG 766
Ile Gly Leu Phe Thr Gin Ala Ala Asn Asn Leu Gly Ile Ala Pro Ala 241Ile Gly Leu Phe Thr Gin Ala Ala Asn Asn Leu Gly Ala Pro Ala 241
ATT GGG TTG TTC ACC CAG GCC GCC AAC AAC TTG GGC ATT GCC CCG GCA 814ATT GGG TTG TTC ACC CAG GCC GCC AAC AAC TTG GGC ATT GCC CCG GCA 814
Lys Leu Leu Glu Asp Leu Cys Met Glu Ser Leu Val Glu Ser Ala Arg 257 AAG CTG CTG GAG GAC CTC TGC ATG GAG TCC CTG GTT GAG TCA GCC AGA 862 Arg Ile Ile Gin Leu Met Arg Gin Val Ser Glu Ala Lys Ser Ile Gin 273 CGG ATC ATC CAG TTG ATG AGA CAG GTG TCA GAG GCG AAG TCC ATC CAA 910Lys Leu Leu Glu Asp Leu Cys Met Glu Ser Leu Val Glu Ser Ala Arg 257 AAG CTG CTG GAG GAC CTC TGC ATG GAG TCC CTG GTT GAG TCA GCC AGA 862 Arg Ile Ile Gin Leu Met Arg Gin Val Ser Glu Ala Lys Ser Gin Island 273 CGG ATC ATC CAG TTG ATG AGA CAG GTG TCA GAG GCG AAG TCC ATC CAA 910
Glu Arg Tyr Ala Ile Met Met Ser Arg Met Leu Gly Glu Ser Tyr Tyr 289 GAG CGC TAC GCC ATC ATG ATG AGT CGG ATG CTG GGA GAG TCC TAC TAC 958Glu Arg Tyr Ala Ile Met Met Ser Arg Met Leu Gly Glu Ser Tyr Tyr 289 GAG CGC TAC GCC ATC ATG ATG AGT CGG ATG CTG GGA GAG TCC TAC TAC 958
Lys Ser Tyr Gly Leu Asn Asp Asn Ser Lys Ile Ser Tyr Ile Leu Ser 305 AAG TCG TAT GGA CTC AAT GAC AAC TCC AAG ATC TCT TAC ATT CTG TCA 1006Ser Tyr Ser Gly Leu Asn Asp Asn Ser Lys Ser Ser Tyr Ile Leu Ser 305 AAG TCG TAT GGA CTC AAT GAC AAC TCC AAG ATC TCT ATT ATT CTG TCA 1006
Gin Ile Ser Gly Lys Tyr Ala Val Asp Ser Leu Glu Gly Leu Glu Gly 321 CAG ATC AGT GGG AAG TAC GCA GTG GAC TCC CTG GAA GGC CTG GAG GGG 1054Gin Ile Ser Gly Lys Tyr Ala Val Asp Ser Leu Glu Gly Glu Gly Leu 321 CAG ATC AGT GGG AAG TAC GCA GTG GAC TCC CTG GAA GGC CTG GAG GGG 1054
Ile Lys Val Thr Glu Lys Phe Arg Glu Phe Ala Glu Leu Val Ala Glu 337 ATC AAG GTG ACA GAG AAG TTC CGC GAG TTC GCT GAG CTT GTT GCA GAA 1102Ile Lys Val Thr Glu Lys Phe Arg Glu Phe Ala Glu Leu Val Ala Glu 337 ATC AAG GTG ACA GAG AAG TTC CGC GAG TTC GCT GAG CTT GTT GCA GAA 1102
Val Leu Val Asp Lys Tyr Glu Arg Ile Gly Glu Asp Ser Thr Glu Val 353 GTC CTG GTG GAC AAG TAC GAG AGG ATT GGA GAG GAC AGC ACG GAG GTC 1150Val Leu Val Asp Lys Tyr Glu Arg Gly Glu Asp Asp Thr Glu Glu Val 353 GTC CTG GGG GAC GAG AGG GAG GAG GAG GAC ACG AGG GAG GTC 1150
Ser Asp Val Ile Arg Glu Ala Ala Arg Gin His Ala Arg Arg Thr Ser 369 TCA GAT GTC ATC AGG GAG GCG GCC AGA CAG CAC GCG CGC AGG ACA TCT 1198Ser Asp Val Ile Arg Glu Ala Ala Arg Gin His Ala Arg Arg Thr Ser 369 TCA GAT GTC ATC AGG GAG GCG GCC AGA CAG CAC GCG CGC AGG ACA TCT 1198
Ala Lys Pro Glu Pro Lys Ala Arg Asn Phe Arg Ser Ser Thr Gly Arg 385 GCC AAG CCA GAG CCA AAG GCC CGC AAC TTC AGG AGC TCC ACC GGA AGG 1246Ala Lys Pro Glu Pro Lys Ala Arg Asn Phe Arg Ser Ser Gly Arg Arg 385 GCC AAG CCA GAG CCA AAG GCC CGC AAC TTC AGG AGC TCC ACC GGA AGG 1246
Gly Arg Glu Gin Glu Thr Gly Glu Ser Asp Asp Asp Asp Tyr Pro Glu 401 GGA AGG GAG CAG GAG ACG GGG GAG TCC GAT GAT GAC GAC TAC CCC GAG 1294Gly Arg Glu Gin Glu Thr Gly Asp Asp Asp Asp Tyr Glu 401 GGA AGG GAG GAG AGG GG GG GAG GAC GAT GAC GAC GAC TAC CCC GAG 1294
Asp Ser Asp ***Asp Ser Asp ***
GAC TCT GAC TAA AAG GCA CTC CCG TCT CAT AAC CAA CAT AGA TAG AAA 1342GAC TCT GAC TAA AAG GCA CTC CCG TCT CAT AAC CAA CAT AGA TAG AAA 1342
AAA A ainsi que les séquences dérivées de celle-ci et les frag¬ ments de ladite séquence et des séquences dérivées.AAA A as well as the sequences derived therefrom and fragments of said sequence and derived sequences.
Figure imgf000006_0001
Une telle séquence correspond à l'ADNc de l'ARNm de la protéine N du virus SHV.
Figure imgf000006_0001
Such a sequence corresponds to the cDNA of the mRNA of the N protein of the SHV virus.
On entend, au sens de la présente invention, par séquence dérivée, aussi bien une séquence d'acide nu- cléique simple brin que double brin, l'acide nucléique représentant aussi bien un ADN qu'un ARN.Within the meaning of the present invention, the term "derived sequence" means both a single-stranded and double-stranded nucleic acid sequence, the nucleic acid representing both a DNA and an RNA.
La présente invention a également pour objet un produit de transcription du virus SHV, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un fragment monocistronique cor- respondant aux nucleotides 1-1346 de la séquence de for¬ mule (I) ci-dessus, associé à un poly A et en ce qu'il code pour la nucléoprotéine N ou un fragment de celle-ci.The subject of the present invention is also a transcription product of the SHV virus, characterized in that it consists of a monocistronic fragment corresponding to nucleotides 1-1346 of the for¬ mule sequence (I) above, associated with a poly A and in that it encodes nucleoprotein N or a fragment thereof.
La présente invention a également pour objet des fragments ou des combinaisons de fragments d'une sé- quence nucléotidique conforme à l'invention, codant pour un peptide ou un fragment de peptide du virus SHV, éven¬ tuellement associé à un segment poly A.The present invention also relates to fragments or combinations of fragments of a nucleotide sequence according to the invention, coding for a peptide or a peptide fragment of the SHV virus, possibly associated with a poly A segment.
Parmi lesdits fragments, elle englobe entre autres : - un fragment de 105 paires de bases qui cor¬ respond aux nucleotides 1-105 de la séquence de formule I ci-dessus ;Among said fragments, it includes inter alia: a fragment of 105 base pairs which corresponds to nucleotides 1-105 of the sequence of formula I above;
- un fragment de 1235 paires de bases, dénommé ci-après SHV-N1, qui correspond aux nucleotides 101-1336 de la séquence de formule I ci-dessus ;a fragment of 1235 base pairs, hereinafter referred to as SHV-N1, which corresponds to nucleotides 101-1336 of the sequence of formula I above;
- un fragment de 1346 paires de bases, dénommé SHV-N2, qui correspond aux nucleotides 1-1346 de la séquence de formule I ci-dessus ;a fragment of 1346 base pairs, called SHV-N2, which corresponds to nucleotides 1-1346 of the sequence of formula I above;
- un fragment de 1214 paires de bases qui code pour la nucléoprotéine N du virus SHV, comprend 404 amino-acides et qui correspond aux nucleotides 92-1306 de ladite séquence de formule I.a fragment of 1214 base pairs which codes for the N-nucleoprotein of the SHV virus, comprises 404 amino acids and which corresponds to nucleotides 92-1306 of said sequence of formula I.
La présente invention a également pour objet des oligonucléotides, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par un fragment d'une séquence nucléotidique conforme à l'invention et en ce qu'ils répondent à l'une quelconque des formules 1 à 10 ci-après :The subject of the present invention is also oligonucleotides, characterized in that they consist of a fragment of a nucleotide sequence according to the invention and in that they correspond to any one of formulas 1 to 10 below:
(1) 5'TGCTTCTCTCCTATGTAC, correspondant au fragment 291 à 308 de la séquence de formule I, (2) 5'GTGTGCGTCCCGGGCAGAAGATCACC, correspon¬ dant au fragment 636 à 661 de la séquence de formule I,(1) 5'TGCTTCTCTCCTATGTAC, corresponding to fragment 291 to 308 of the sequence of formula I, (2) 5'GTGTGCGTCCCGGGCAGAAGATCACC, corresponding to fragment 636 to 661 of the sequence of formula I,
(3) 5*CCCCACCACCCAGTCGA, correspondant au fragment 700 à 716 de la séquence de formule I,(3) CCCCACCACCCAGTCGA, corresponding to fragment 700 to 716 of the sequence of formula I,
(4) 5'GGACCTCTGCATGGAGTCCC, correspondant au fragment 826 à 845 de la séquence de formule I,(4) 5'GGACCTCTGCATGGAGTCCC, corresponding to fragment 826 to 845 of the sequence of formula I,
(5) 5*GCCAAGCCAGAGCCAAAG, correspondant au fragment 1199 à 1216 de la séquence de formule I,(5) GCCAAGCCAGAGCCAAAG, corresponding to fragment 1199 to 1216 of the sequence of formula I,
(6) 5'TCTTCGACTGAGTTC, correspondant au frag¬ ment 92 à 78 de la séquence de formule I, (7) 5'AACATACACGATGAGCTC, correspondant au fragment 205 à 188 de la séquence de formule I,(6) 5'TCTTCGACTGAGTTC, corresponding to fragment 92 to 78 of the sequence of formula I, (7) 5'AACATACACGATGAGCTC, corresponding to fragment 205 to 188 of the sequence of formula I,
(8) 5-GGTGATCTTCTGCCCGGGACGCACAC, correspon¬ dant au fragment 661 à 636 de la séquence de formule I,(8) 5-GGTGATCTTCTGCCCGGGACGCACAC, corresponding to the fragment 661 to 636 of the sequence of formula I,
(9) 5'TCCTGTCCCGTTGAGTCT, correspondant au fragment 757 à 740 de la séquence de formule I,(9) 5'TCCTGTCCCGTTGAGTCT, corresponding to fragment 757 to 740 of the sequence of formula I,
(10) 5'GTCAGAGTCCTCGGGGTAGTC, correspondant au fragment 1306 à 1283 de la séquence de formule I.(10) 5'GTCAGAGTCCTCGGGGTAGTC, corresponding to fragment 1306 to 1283 of the sequence of formula I.
La présente invention a également pour objet des sondes nucleotidiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci conforme à l'invention, éventuellement marqué à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée ou tout autre substance non radioactive appropriée. Selon un mode de réalisation avantageux des¬ dites sondes, elles sont choisies dans le groupe qui com¬ prend les oligonucléotides de formule (1) à (5), qui s'hybrident spécifiquement avec l'ARN génomique du virus SHV. Selon un autre mode de réalisation avantageux desdites sondes, elles sont choisies dans le groupe qui comprend les oligonucléotides de formule (6) à (10), qui s'hybrident spécifiquement avec 1'ARNm du virus SHV. La présente invention a également pour objet des paires d'amorces pour la synthèse d'un ADNc ou d'un ARN de virus SHV, caractérisé en ce que chaque amorce comprend une séquence ou un fragment de séquence nucléo¬ tidique conforme à l'invention. De telles amorces permettent notamment la syn¬ thèse d'une séquence d'ADN ou d'ARN ou d'un fragment de celle-ci conforme à l'invention et/ou de son brin complé¬ mentaire.The present invention also relates to nucleotide probes, characterized in that they comprise a nucleotide sequence or a fragment thereof in accordance with the invention, optionally labeled with a marker such as a radioactive isotope. , a suitable enzyme or other suitable non-radioactive substance. According to an advantageous embodiment of the said probes, they are chosen from the group which comprises the oligonucleotides of formula (1) to (5), which hybridize specifically with the genomic RNA of the SHV virus. According to another advantageous embodiment of said probes, they are chosen from the group which comprises the oligonucleotides of formula (6) to (10), which hybridize specifically with the mRNA of the SHV virus. The subject of the present invention is also primer pairs for the synthesis of a cDNA or an RNA of SHV virus, characterized in that each primer comprises a nucleotide sequence or a nucleotide fragment according to the invention . Such primers make it possible in particular to synthesize a DNA or RNA sequence or a fragment thereof in accordance with the invention and / or its complementary strand.
Selon un mode de réalisation avantageux des- dites paires d'amorces, elles sont constituées par un oligonucléotide de formule (1) apparié à un oligonucléo- tide de formule (10) .According to an advantageous embodiment of said primer pairs, they consist of an oligonucleotide of formula (1) paired with an oligonucleotide of formula (10).
Ces deux amorces permettent la synthèse d'au moins un fragment de la séquence de formule I conforme à l'invention.These two primers allow the synthesis of at least one fragment of the sequence of formula I according to the invention.
La présente invention a également pour objet un peptide et/ou un fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique ou une combinaison de plusieurs fragments nucleotidiques tels que définis ci-dessus.The present invention also relates to a peptide and / or a peptide fragment, characterized in that it is encoded by a nucleotide sequence or a combination of several nucleotide fragments as defined above.
Selon un mode de réalisation avantageux, ledit peptide est codé par le gène de la nucléoprotéine N, com¬ porte 404 amino-acides et présente un poids moléculaire de 44590 Da. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite nucléoprotéine présente une séquence en acides aminés qui répond à la formule II ci- après :According to an advantageous embodiment, said peptide is encoded by the nucleoprotein N gene, comprising 404 amino acids and has a molecular weight of 44590 Da. According to an advantageous arrangement of this embodiment, said nucleoprotein has an amino acid sequence which corresponds to formula II below:
Mét-Glu-G.ly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-Phé-Ser-Gly-Leu-Asn-Asp- Val-Arg-Ile-Asp-Pro-Thr-Gly-Gly-Glu-Gly-Arg-Val-Leu-Val- Pro-Gly-Glu-Val-Glu-Leu-Ile-Val-Tyr-Val-Gly-Glu-Phé-Gly- Glu-Glu-Asp-Arg-Lys-Val-Ile-Val-Asp-Ala-Leu-Ser-Ala-Leu- Gly-Gly-Pro-Gln-Thr-Val-Gln-Ala-Leu-Ser-Val-Leu-Leu-Ser- Tyr-Val-Leu-Gln-Gly-Asn-Thr-Gln-Glu-Asp-Leu-Glu-Thr-Lys- Cys-Lys-Val-Leu-Thr-Asp-Mét-Gly-Phé-Lys-Val-Thr-Gln-Ala- Val-Arg-Ala-Thr-Ser-Ile-Glu-Ala-Gly-Ile-Mét-Mét-Pro-Mét- Arg-Glu-Leu-Ala-Leu-Thr-Val-Asn-Asp-Asp-Asn-Leu-Mét-Glu- Ile-Val-Lys-Gly130-Thr-Leu-Mét-Thr-Cys-Ser-Leu-Leu-Thr- Lys-Tyr-Ser-Val-Asp-Lys-Met-Ile-Lys-Tyr-Ile-Thr-Lys-Lys- Leu-Gly-Glu-Leu-Ala-Asp-Thr-Gln1βl-Gly-Val-Gly-Glu-Leu- Gln-His-Phe-Thr-Ala-Asp-Lys-Ala-Ala-Ile-Arg-Lys-Leu-Ala- Gly-Cys-Val-Arg-Pro-Gly-Gln-Lys-Ile-Thr-Lys-Ala-Leu-Tyr- Ala-Phe-Ile-Leu-Thr-Glu-Ile-Ala-Asp-Pro-Thr-Thr-Gln-Ser- Arg-Val-Pro-Ser-Met-Gly-Ala-Leu-Arg-Leu-Asn-Gly-Thr-Gly- Met-Thr-Met-Ile-Gly-Leu-Phe-Thr-Gln-Ala-Ala-Asn-Asn-Leu- Gly-Ile-Ala-Pro-Ala-Lys-Leu-Leu-Glu-Asp-Leu-Cys-Met-Glu- Ser-Leu-Val-Glu-Ser-Ala-Arg-Arg-Ile-Ile-Gln-Leu-Met-Arg- Gln-Val-Ser-Glu-Ala-Lys-Ser-Ile-Gln-Glu-Arg-Tyr-Ala-Ile- Met-Met-Ser-Arg-Met-Leu-Gly-Glu-Ser-Tyr-Tyr-Lys-Ser-Tyr- Gly-Leu-Asn-Asp-Asn-Ser-Lys-Ile-Ser-Tyr-Ile-Leu-Ser-Gln- Ile-Ser-Gly-Lys-Tyr-Ala-Val-Asp-Ser-Leu-Glu-Gly-Leu-Glu- Gly-Ile-Lys-Val-Thr-Glu-Lys-Phe-Arg-Glu-Phe-Ala-Glu-Leu- Val-Ala-Glu-Val-Leu-Val-Asp-Lys-Tyr-Glu-Arg-Ile-Gly-Glu- Asp-Ser-Thr-Glu-Val-Ser-Asp-Val-Ile-Arg-Glu-Ala-Ala-Arg- Gln-His-Ala-Arg-Arg-Thr-Ser-Ala-Lys-Pro-Glu-Pro-Lys-Ala- Arg-Asn-Phe-Arg-Ser-Ser-Thr-Gly-Arg-Gly-Arg-Glu-Gln-Glu- Thr-Gly-Glu-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Tyr-Pro-Glu-Asp-Ser-AspMet-Glu-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-Phe-Ser-Gly-Leu-Asn-Asp-Val-Arg-Ile-Asp-Pro-Thr-Gly-Gly-Glu-Gly- Arg-Val-Leu-Val Pro-Gly-Glu-Val-Glu-Leu-Ile-Val-Tyr-Val-Gly-Glu-Phe-Gly-Glu-Glu-Asp-Arg-Lys-Val-Ile-Val-Asp-Ala-Leu- Ser-Ala-Leu-Gly-Gly-Pro-Gln-Thr-Val-Gln-Ala-Leu-Ser-Val-Leu-Leu-Ser-Tyr-Val-Leu-Gln-Gly-Asn-Thr-Gln- Glu-Asp-Leu-Glu-Thr-Lys-Cys-Lys-Val-Leu-Thr-Asp-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Thr-Gln-Ala-Val-Arg-Ala-Thr-Ser- Ile-Glu-Ala-Gly-Ile-Met-Met-Pro-Met-Arg-Glu-Leu-Ala-Leu-Thr-Val-Asn-Asp-Asp-Asn-Leu-Met-Glu- Ile-Val- Lys-Gly 130- Thr-Leu-Met-Thr-Cys-Ser-Leu-Leu-Thr-Lys-Tyr-Ser-Val-Asp-Lys-Met-Ile-Lys-Tyr-Ile-Thr-Lys-Lys Leu-Gly-Glu-Leu-Ala-Asp-Thr-Gln 1β1 -Gly-Val-Gly-Glu-Leu-Gln-His-Phe-Thr-Ala-Asp-Lys-Ala-Ala-Ile-Arg- Lys-Leu-Ala-Gly-Cys-Val-Arg-Pro-Gly-Gln-Lys-Ile-Thr-Lys-Ala-Leu-Tyr-Ala-Phe-Ile-Leu-Thr-Glu-Ile-Ala Asp-Pro-Thr-Thr-Gln-Ser-Arg-Val-Pro-Ser-Met-Gly-Ala-Leu-Arg-Leu-Asn-Gly-Thr-Gly-Met-Thr-Met-Ile-Gly- Leu-Phe-Thr-Gln-Ala-Ala-Asn-Asn-Leu-Gly-Ile-Ala-Pro-Ala-Lys-Leu-Leu-Glu-Asp-Leu-Cys-Met-Glu-Ser-Leu- Val-Glu-Ser-Ala-Arg-Arg-Ile-Ile-Gln-Leu-Met-Arg-Gln-Val-Ser-Glu-Ala Lys-Ser-Ile-Gln-Glu-Arg-Tyr-Ala-Ile-Met-Met-Ser-Arg-Met-Leu-Gly-Glu-Ser-Tyr-Tyr-Lys-Ser-Tyr-Gly-Leu- Asn-Asp-Asn-Ser-Lys-Ile-Ser-Tyr-Ile-Leu-Ser-Gln-Ile-Ser-Gly-Lys-Tyr-Ala-Val-Asp-Ser-Leu-Glu-Gly-Leu- Glu- Gly-Ile-Lys-Val-Thr-Glu-Lys-Phe-Arg-Glu-Phe-Ala-Glu-Leu-Val-Ala-Glu-Val-Leu-Val-Asp-Lys-Tyr-Glu- Arg-Ile-Gly-Glu- Asp-Ser-Thr-Glu-Val-Ser-Asp-Val-Ile-Arg-Glu-Ala-Ala-Arg-Gln-His-Ala-Arg-Arg-Thr-Ser- Ala-Lys-Pro-Glu-Pro-Lys-Ala-Arg-Asn-Phe-Arg-Ser-Ser-Thr-Gly-Arg-Gly-Arg-Glu-Gln-Glu-Thr-Gly-Glu-Ser- Asp-Asp-Asp-Asp-Tyr-Pro-Glu-Asp-Asp-Ser
(II) Parmi les 27 résidus serine du peptide de formule II, lesquels sont des sites de phosphorylation potentielle, 17 sont localisés sur le fragment COOH ter¬ minal comportant 154 amino-acides.(II) Of the 27 serine residues of the peptide of formula II, which are potential phosphorylation sites, 17 are located on the ter minal COOH fragment comprising 154 amino acids.
La présente invention a également pour objet des fragments ou des combinaisons de fragments du peptide conforme à l'invention et notamment un fragment de 154 amino-acides, correspondant au fragment COOH terminal de la séquence de formule II.The subject of the present invention is also fragments or combinations of fragments of the peptide according to the invention and in particular a fragment of amino acids, corresponding to the terminal COOH moiety of the sequence of formula II.
Lesdits peptides sont avantageusement obtenus par synthèse, notamment par synthèse de Merrifield. La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, ca¬ ractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique conforme à l'invention.The said peptides are advantageously obtained by synthesis, in particular by Merrifield synthesis. The present invention also relates to a recombinant cloning and / or expression vector, ca¬ characterized in that it comprises a nucleotide sequence according to the invention.
On entend, au sens de la présente invention par vecteur recombinant, aussi bien un plasmide, un cos- mide qu'un phage.For the purposes of the present invention, the term "recombinant vector" means both a plasmid, a cosmide and a phage.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, il est constitué par un plasmide approprié com¬ prenant une origine de réplication, au moins un marqueur de sélection et une séquence nucléotidique conforme à l'invention, lequel vecteur est un vecteur de clonage.According to an advantageous embodiment of said vector, it consists of a suitable plasmid com¬ taking an origin of replication, at least one selection marker and a nucleotide sequence according to the invention, which vector is a cloning vector.
Un premier marqueur de sélection est notamment un gène dont l'expression permet la sélection de bacté¬ ries ayant incorporé ledit plasmide. Toutefois, cette technique ne permet que de sélectionner les bactéries qui ont incorporé un plasmide," elle ne permet pas de distin¬ guer celles qui ont incorporé un plasmide recombinant de celles qui ont incorporé un plasmide vide. Pour y parve¬ nir, il faut utiliser, directement ou dans un second temps, un second marqueur de sélection.A first selection marker is in particular a gene whose expression allows the selection of bacteria having incorporated said plasmid. However, this technique only makes it possible to select the bacteria which have incorporated a plasmid, " it does not make it possible to distinguish those which have incorporated a recombinant plasmid from those which have incorporated an empty plasmid. use, directly or in a second time, a second selection marker.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur de clonage est constitué par un plasmide pUC13 dans lequel est insérée la séquenceAccording to an advantageous arrangement of this embodiment, said cloning vector consists of a plasmid pUC13 in which the sequence is inserted.
SHV-N2 de 1346 paires de bases, telle que définie ci- dessus, ledit plasmide étant dénommé pSHV-N2.SHV-N2 of 1346 base pairs, as defined above, said plasmid being called pSHV-N 2 .
Selon une modalité avantageuse de cette dispo¬ sition, la séquence SHV-N2 est insérée au niveau du site Sma I dudit plasmide.According to an advantageous modality of this dispo¬ sition, the SHV-N 2 sequence is inserted at the Sma I site of said plasmid.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur de clonage est consti- tué par un plasmide pBS dans lequel est insérée la séquence SHV- -L de 1235 paires de bases, telle que défi¬ nie ci-dessus, ledit plasmide étant dénommé pSHV-Nl.According to another advantageous arrangement of this embodiment, said cloning vector is constituted by killed by a plasmid pBS in which is inserted the SHV-L sequence of 1235 base pairs, as defi¬ nie above, said plasmid being called pSHV-Nl.
Selon une modalité avantageuse de cette dispo- sition, la séquence SHV-N*j_ est insérée au niveau du site EcoR I dudit plasmide.According to an advantageous mode of this Avail- sition, VHS-N * j _ sequence is inserted at the EcoRI site of said plasmid.
Selon un autre mode de réalisation dudit vec¬ teur, il est constitué par un vecteur recombinant appro¬ prié comprenant en particulier une origine de réplication dans un microorganisme hôte approprié, notamment une bac¬ térie ou une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection soit des bactéries, soit des cellules eucaryotes ayant reçu ledit vecteur, un pro¬ moteur permettant l'expression des gènes dans lesdites bactéries ou cellules eucaryotes, et dans lequel est in¬ sérée une séquence nucléotidique . ou un fragment de séquence tels que définis ci-dessus, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'un peptide, d'un fragment de peptide ou d'une combinaison de fragments de peptides du virus SHV.According to another embodiment of said vec¬ tor, it consists of an appropriate recombinant vector comprising in particular an origin of replication in a suitable host microorganism, including a bac¬ teria or a eukaryotic cell, at least one gene whose expression allows the selection of either bacteria or eukaryotic cells having received said vector, a pro¬ engine for the expression of genes in said bacteria or eukaryotic cells, and in which is embedded a nucleotide sequence. or a sequence fragment as defined above, which vector is an expression vector of a peptide, a peptide fragment or a combination of peptide fragments of the SHV virus.
Dans la suite on entend par peptide aussi bien la nucléoprotéine N ou un fragment de celle-ci que les protéines de fusion (produit d'expression) contenant la nucléoprotéine N ou un fragment de celle-ci. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur d'expression est constitué par un plasmide pATHl dans lequel est inséré, en phase au niveau de son site Eco RI, le fragment Eco RI du plasmide pSHV-N2 conforme à l'invention. Ledit vecteur exprime une protéine de fusion trpE-protéine N.In the following, we mean by peptide both the nucleoprotein N or a fragment thereof that the fusion proteins (expression product) containing the nucleoprotein N or a fragment thereof. According to an advantageous arrangement of this embodiment, said expression vector consists of a plasmid pATH1 in which is inserted, in phase at its Eco RI site, the Eco RI fragment of the plasmid pSHV-N2 according to the invention. . Said vector expresses a trpE-N protein fusion protein.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur d'expression est constitué par un plasmide pUEX2 dans lequel est inséré. en phase au niveau de son site S a I, le fragment Eco RI du plasmide pSHV-Nl conforme à l'invention.According to another advantageous arrangement of this embodiment, said expression vector consists of a plasmid pUEX2 into which is inserted. in phase at its site S to I, the Eco RI fragment of the plasmid pSHV-Nl according to the invention.
Ledit vecteur exprime une protéine de fusion β-galactosidase-protéine N. La présente invention a également pour objet un produit d'expression de la nucléoprotéine N, caracté¬ risé en ce qu'il est exprimé dans un vecteur d'expression recombinant tel que défini ci-dessus.Said vector expresses a β-galactosidase-N protein fusion protein. The subject of the present invention is also an expression product for nucleoprotein N, characterized in that it is expressed in a recombinant expression vector such as defined above.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit produit d'expression, il comprend la nucléoprotéine N ou un fragment de celle-ci et la β-galactosidase ou un frag¬ ment de celle-ci et est reconnu par des anticorps onoclonaux spécifiques de la protéine N.According to an advantageous embodiment of said expression product, it comprises the nucleoprotein N or a fragment thereof and the β-galactosidase or fragment thereof and is recognized by onoclonal antibodies specific for the N protein. .
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit produit d'expression, il comprend la nucléoprotéineAccording to another advantageous embodiment of said expression product, it comprises the nucleoprotein
N du virus SHV ou un fragment de celle-ci et le trpE ou un fragment de celui-ci et est reconnu par des anticorps monoclonaux spécifiques de la protéine N.N of the SHV virus or a fragment thereof and the trpE or a fragment thereof and is recognized by monoclonal antibodies specific for the N protein.
La présente invention a également pour objet une cellule hôte appropriée obtenue par transformation génétique, caractérisée en" ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression conforme à l'invention. Une telle cellule est capable d'exprimer un produit d'expression tel que défini ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux, la cellule hôte est notamment Saccharomyces cerevisiae transformée par un vecteur d'expression conforme à l'invention.The present invention also relates to a suitable host cell obtained by genetic transformation, characterized in that it is transformed by an expression vector according to the invention, Such a cell is capable of expressing an expression product As defined above, according to an advantageous embodiment, the host cell is in particular Saccharomyces cerevisiae transformed with an expression vector according to the invention.
La présente invention a également pour objet un processus d'expression d'un peptide conforme à l'invention, caractérisé en ce que la cellule hôte résul¬ tant de la transformation avec un vecteur contenant une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci codant pour une protéine comprenant la nucléoprotéine N ou un fragment de celle-ci, est cultivée de manière à produire et accumuler ledit peptide, qui est ensuite collecté.The subject of the present invention is also a process for the expression of a peptide according to the invention, characterized in that the host cell results from the transformation with a vector containing a nucleotide sequence or a fragment thereof coding for a protein comprising nucleoprotein N or a fragment thereof, is cultured to produce and accumulate said peptide, which is then collected.
Selon la cellule hôte, ledit peptide est soit sécrété dans l'espace périplasmique, soit excrété dans le milieu de culture.According to the host cell, said peptide is either secreted in the periplasmic space or excreted in the culture medium.
La présente invention a également pour objet une composition à pouvoir immunogene et/ou protecteur, caractérisée en ce qu'elle comprend un peptide conforme à l'invention, éventuellement associé à au moins une autre substance immunogene ou immunostimulante et/ou à un véhi¬ cule pharmaceutiquement acceptable.The subject of the present invention is also a composition with an immunogenic and / or protective capacity, characterized in that it comprises a peptide according to the invention, optionally combined with at least one other immunogenic or immunostimulatory substance and / or with a vehicle. pharmaceutically acceptable.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, elle comprend un peptide conforme à 1'invention associé à la protéine G du virus de la SHV ou à un fragment de celle-ci.According to an advantageous embodiment of said composition, it comprises a peptide according to the invention associated with the VHS virus G protein or with a fragment thereof.
La présente invention a également pour objet une composition à pouvoir immunogene et/ou protecteur, caractérisée en ce qu'elle comprend une cellule hôte transformée conforme à l'invention, inactivée de manière appropriée.The present invention also relates to a composition with immunogenic and / or protective power, characterized in that it comprises a transformed host cell according to the invention, appropriately inactivated.
Selon un mode de réalisation préféré de ladite composition, elle comprend du Saccharomyces cerevisiae transformé par un vecteur d'expression conforme à l'invention. L*inactivation comprend notamment une inacti- vation chimique (formol, acide peracétique en particu¬ lier) associée à une inactivation physique (notamment U.V.) .According to a preferred embodiment of said composition, it comprises Saccharomyces cerevisiae transformed with an expression vector according to the invention. Inactivation comprises, in particular, chemical inactivation (formalin, peracetic acid in particular) associated with physical inactivation (in particular U.V.).
La présente invention a, en outre, pour objet un procédé de détection du virus SHV, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter un virus SHV à l'aide d'au moins une sonde nucléotidique ou un fragment de sonde nucléotidique conforme à l'invention, en mettant en pré¬ sence l'échantillon à analyser avec ladite/lesdites sondes nucleotidiques, à laquelle/auxquelles se lie l'ARN génomique ou les produits de transcription du virus SHV, si de tels produits sont présents dans l'échantillon, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié, notamment EA, RA, fluorescence. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de ce procédé, préalablement à l'hybridation avec lesdites sondes, on amplifie la séquence nucléique à détecter (ARN génomique ou ARN messager du virus SHV notamment) par la méthode d'amplification dite PCR (réaction de polymérisa- tion en chaîne à l'aide d'une polymérase appropriée, notamment la Taq polymérase) en utilisant une paires d'amorces conforme à l'invention.The subject of the present invention is, moreover, a method for detecting SHV virus, characterized in that it consists in detecting an SHV virus using at least one nucleotide probe or a nucleotide probe fragment conforming to the invention, by putting in pre¬ ence the sample to be analyzed with said / said nucleotide probes, to which / to which the RNA binds genomic or the SHV virus transcription products, if such products are present in the sample, the reading of the result being revealed by an appropriate means, including EA, RA, fluorescence. According to a preferred embodiment of this method, prior to hybridization with said probes, the nucleic sequence to be detected (genomic RNA or messenger RNA of the SHV virus in particular) is amplified by the so-called PCR amplification method (reaction of polymerization by a suitable polymerase, especially Taq polymerase) using a pair of primers according to the invention.
La méthode PCR est notamment décrite par SAIKI et al. dans Science, 1988, 239, 487 ainsi que dans les Demandes de Brevet Européen CETUS n* 200 362 et n' 201 184.The PCR method is described in particular by SAIKI et al. in Science 1988, 239, 487 and in the European Patent Applications CETUS No. 200,362 and No. 201,184.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, la paire d'amorces est de préférence 1'oligonucléotide de formule (1) apparié à l'oligo- nucléotide de formule (10) .According to an advantageous arrangement of this embodiment, the pair of primers is preferably the oligonucleotide of formula (1) paired with the oligonucleotide of formula (10).
La présente invention a, de plus, pour objet un procédé de détection d'anticorps anti-virus SHV, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter les anticorps anti-virus SHV éventuellement présents dans un échantil- Ion biologique à l'aide d'un peptide ou fragment de pep- tides conforme à l'invention, éventuellement fixé sur un support solide approprié, en mettant en présence ledit échantillon biologique avec ledit/lesdits peptides ou fragment(s) de peptides, auxquels se lient les anticorps anti-virus SHV si de tels anticorps sont présents dans l'échantillon à analyser, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié, notamment EIA, RIA, fluo¬ rescence. Ce procédé permet notamment de vérifier la sé- roconversion des animaux vaccinés ou de procéder à des enquêtes sérologiques à visée épidémiologique.The present invention furthermore relates to a method for detecting anti-SHV virus antibodies, characterized in that it consists in detecting the anti-SHV virus antibodies possibly present in a biological sample with the aid of a peptide or fragment of peptides according to the invention, optionally fixed on a suitable solid support, by bringing said biological sample into contact with said peptides or fragment (s) of peptides, to which the anti-human antibodies bind. VHS virus if such antibodies are present in the sample to be analyzed, the reading of the result being revealed by an appropriate means, in particular EIA, RIA, fluorescence. This method makes it possible, in particular, to verify the seroconversion of the vaccinated animals or to carry out epidemiological serological surveys.
La présente invention a, de plus, pour objet un kit, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du pro¬ cédé de détection du virus SHV, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection, des doses ap¬ propriées d'au moins une sonde et/ou fragment de sonde nucléotidique conforme à l'invention et éventuellement des doses appropriées d'au moins deux amorces conformes à l'invention.The present invention furthermore relates to a ready-to-use kit for implementing the method for detecting the VHS virus, characterized in that it comprises, in addition to the useful quantities of buffers suitable for implementation of said detection, ap¬ appropriate doses of at least one probe and / or nucleotide probe fragment according to the invention and optionally appropriate doses of at least two primers according to the invention.
La présente invention a, en outre, pour objet un kit, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du pro- cédé de détection d'anticorps anti-virus SHV, caractérisé en ce qu'il comprend, outre des quantités utiles de tam¬ pons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détec¬ tion, des doses appropriées d'au moins un peptide et/ou un fragment peptidique conforme à l'invention. La présente invention a, de plus, pour objet, l'application des séquences nucleotidiques conformes à l'invention ou des fragments de celles-ci, à l'obtention d'animaux génétiquement modifiés.The present invention furthermore relates to a ready-to-use kit for carrying out the method for detecting anti-virus SHV virus, characterized in that it comprises, in addition to useful amounts. tam¬ pons suitable for the implementation of said detec¬ tion, appropriate doses of at least one peptide and / or a peptide fragment according to the invention. The present invention further relates to the application of the nucleotide sequences according to the invention or fragments thereof to the production of genetically modified animals.
Les séquences conformes à 1*invention permet- tent notamment d'obtenir des cellules de poisson et des poissons devenus résistants au virus SHV.The sequences according to the invention make it possible in particular to obtain fish cells and fish which have become resistant to the VHS virus.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se ré- fère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.In addition to the foregoing, the invention also comprises other arrangements, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the method which is the subject of the present invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de 1'objet de 1'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 Clonage de l'ARNm du virus SHV dans le vecteur pUC13 et M13.It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject matter of the invention, of which they in no way constitute a limitation. Example 1 Cloning of SHV virus mRNA into pUC13 and M13 vector
Des cellules (Epithelioma papulosum cyprini, EPC) sont infectées par des virus SHV. On récolte les virus au bout de 20 h.Cells (Epithelioma papulosum cyprini, EPC) are infected with VHS viruses. The viruses are harvested after 20 hours.
L'ARN total est préparé comme décrit dans CHOMCZYNSKI et al. (Anal. Biochem., 1987, 162, 156-159) et l'ARN-poly A+ est purifié sur une colonne de cellulose oligo-dT (Pharmacia) . L'ADNc est synthétisé en utilisant le kit d'ADNc Boehringer (numéro de catalogue 1013882), et inséré au niveau du site Sma I du vecteur pUC13 (Pharmacia) .Total RNA is prepared as described in CHOMCZYNSKI et al. (Anal Biochem., 1987, 162, 156-159) and the poly A + RNA is purified on a oligo-dT cellulose column (Pharmacia). The cDNA is synthesized using the Boehringer cDNA kit (catalog number 1013882), and inserted at the Sma I site of the vector pUC13 (Pharmacia).
Une souche E. Coli D1210 est transformée et les colonies sont transférées sur des filtres de réplica- tion et criblées par hybridation avec des fragments d'ADNc simple brin marqués, préparés à partir de l'ARN total de cellules infectées ou non infectées par du virus SHV, par transcription réverse amorcée au hasard. Les clones qui hybrident uniquement avec l'ARN de cellules infectées sont purifiés et leurs plasmides utilisés comme sondes pour le Northern blot d'ARN prove¬ nant de cellules infectées.E. Coli strain D1210 is transformed and the colonies are transferred to replication filters and screened by hybridization with labeled single-stranded cDNA fragments prepared from total RNA from infected or non-infected cells. VHSV, reverse transcription primed at random. Clones that hybridize only with the RNA of infected cells are purified and their plasmids used as probes for the Northern RNA blot sourced from infected cells.
Les colonies contenant un plasmide qui hybride avec un ARN ayant la mobilité évaluée pour l'ARNm du gène N sont sélectionnées.Colonies containing a plasmid that hybridizes to an RNA having the mobility assessed for the N gene mRNA are selected.
Un insert de 1346 nucleotides (clone SHV-N2), est coupé à l'aide des enzymes de restriction Hind III et EcoRI (digestion partielle) et transféré dans les vec- teurs de séquençage M13mpl8 et M13mpl9.A 1346 nucleotide insert (clone SHV-N2) was cut with restriction enzymes Hind III and EcoRI (partial digest) and transferred to the M13mp18 and M13mp19 sequencing vectors.
Exemple 2 : Clonage de l'ARNm du virus SHV dans les vecteurs λZAP ou pBS.Example 2 Cloning of the SHV Virus mRNA in the λZAP or pBS Vectors
Les cellules sont récoltées 8 heures après l'infection virale. Les acides nucléiques totaux sont extraits dans un tampon à 1'isothiocyanate de guanidium (Maniatis et al., Molecular cloning, 1982) et "l'ARN total est pré¬ cipité avec du LiCl 2M. L'ARN-poly A+ est purifié sur un papier d'affinité Hybond (mAP-Amersham) . Les ADNc sont synthétisés en utilisant un kit ADNc Amersham (numéro de catalogue RPN 1256) et insérés au niveau du site EcoRI d'un vecteur λgtlO. Le fragment EcoRI-EcoRI est ensuite transféré dans un vecteur λZAP (SHORT et al., Nucleic acids Research, 1988, 16, 7583-7600) entre le site Smal et Hind III du polylinker. Des cellules d*_7. Coli XL1- Blue sont infectées et des plasmides pBS sont coupés (SHORT et al., 1988). Les plages et colonies sont cri¬ blées avec de 1'IPTG-BluO-Gal (BRL) et par hybridation des plasmides purifiés avec de l'ADNc obtenu par trans¬ cription réverse au hasard à partir d'ARN génomique puri¬ fié. Les cartes de restriction des plasmides sont réali¬ sées.The cells are harvested 8 hours after the viral infection. The total nucleic acids are extracted in a buffer at 1'isothiocyanate guanidium (Maniatis et al., Molecular Cloning, 1982) and "total RNA is pré¬ cipité with 2M LiCl. The poly A + RNA was purified on Hybond affinity paper (mAP-Amersham) The cDNAs are synthesized using an Amersham cDNA kit (catalog number RPN 1256) and inserted at the EcoRI site of an λgt10 vector The EcoRI-EcoRI fragment is then transferred in an λZAP vector (SHORT et al., Nucleic Acids Research, 1988, 16, 7583-7600) between the Smal and Hind III site of the polylinker, XL1-Blue coli cells are infected and pBS plasmids are cleaved. (SHORT et al., 1988) The plaques and colonies are screened with IPTG-BluO-Gal (BRL) and by hybridization of the purified plasmids with cDNA obtained by reverse transcription at random from Purified genomic RNA The restriction maps of the plasmids are carried out.
Le plasmide pSHV-Nl est notamment transcrit in vitro en présence de T3 et T.7 ARN polymérases et les ARN marqués sont hybrides avec des extraits d'ARN obtenus à partir du virion et à partir de cellules infectées et non infectées, de manière à déterminer l'orientation de 1'insert. L'ARN peut être clone directement dans un vec¬ teur pBS comme visible dans la figure la dans laquelle un plasmide pBS-SK (STRATAGENE) est coupé au site unique EcoRI de son polylinker par l'enzyme de restriction EcoRI et au niveau de ce site, l'insert SHV-N1 est inséré. Exemple 3 : Obtention d'un plasmide sous forme d'ADN simple brin sortant des cellules dans le milieu de culture, enrobé dans les protéines du pliage surinfectant fl.The plasmid pSHV-N1 is in particular transcribed in vitro in the presence of T3 and T .7 RNA polymerases and the labeled RNAs are hybridized with RNA extracts obtained from the virion and from infected and uninfected cells, so as to determine the orientation of the insert. The RNA can be cloned directly into a pBS vec¬ tor as can be seen in FIG. 1 in which a plasmid pBS-SK (STRATAGENE) is cut at the unique EcoRI site of its polylinker by the restriction enzyme EcoRI and at this level. site, insert SHV-N1 is inserted. Example 3: Obtaining a plasmid in the form of single-stranded DNA leaving the cells in the culture medium, embedded in the proteins of the disinfectant folding fl.
Un fragment de la séquence nucléotidique de l'ADNc de l'ARN génomique du virus SHV de 1235 paires de bases est inséré dans un plasmide pBS-SK (n' de catalogue 212206 et 212207) au niveau du site Eco RI du polylinker comme visible en figure la.A fragment of the nucleotide sequence of the genomic RNA cDNA of SHV virus of 1235 pairs of bases is inserted into a plasmid pBS-SK (Catalog No. 212206 and 212207) at the Eco RI site of the polylinker as shown in Figure la.
Les bactéries en phase exponentielle de crois- sance sont infectées à une multiplicité de 10 phages fl par bactéries.The bacteria in the exponential growth phase are infected at a multiplicity of 10 phages per bacteria.
Exemple 4 : Construction du plasmide pSHV-N2Example 4 Construction of Plasmid pSHV-N2
Un fragment de la séquence nucléotidique de l'ADNc de l'ARN messager du virus SHV de 1346 paires de bases a été inséré dans un plasmide pUC13 au niveau du site Sma I, entre le site BamHI, d'un côté et les sitesA fragment of the nucleotide sequence of the 1346 base pair SHV virus messenger RNA cDNA was inserted into a plasmid pUC13 at the Sma I site, between the BamHI site, on one side and the sites.
Sst I et Eco RI de l'autre côté.Sst I and Eco RI on the other side.
Exemple 5 : Expression de l'insert SHV-N2. Le fragment Eco RI de pSHV-N2 est inséré en phase au site Eco RI d'un plasmide pATHl.Example 5: Expression of the SHV-N2 insert. The Eco RI fragment of pSHV-N2 is inserted in phase at the Eco RI site of a pATH1 plasmid.
Chez les bactéries, la traduction du message contenu dans l'insert est réalisée sous le contrôle du promoteur de la TRPE (anthranylate synthétase) .In bacteria, the translation of the message contained in the insert is carried out under the control of the TRPE promoter (anthranylate synthetase).
La protéine de fusion correspondant à 1'insert SHV-N2 est exprimée à partir dudit plasmide pATH (DIECKMAN et al. J. Biol." Chenu, 1985, 260, 1513-1520). Les clones recombinants sont mis en culture une nuit dans un milieu M9 supplémenté en tryptophane à 20 mg/1 et en casamino-acides à 0,5 %. La culture est diluée 10 fois dans le même milieu sans tryptophane et cultivée pendant une heure à 30*C avant l'induction avec l'acide indole- acrylique à 5 mg/1 pendant 2 heures.The fusion protein corresponding to the SHV-N2 insert is expressed from said plasmid pATH (DIECKMAN et al., J. Biol, "Chenu, 1985, 260, 1513-1520.) Recombinant clones are cultured overnight in M9 medium supplemented with tryptophan at 20 mg / 1 casamino acids and 0.5%. the culture is diluted 10-fold in the same medium without tryptophan and grown for one hour at 30 ° C prior to induction with the 5 mg / l indole-acrylic acid for 2 hours.
La protéine exprimée par le SHV-N2 (trpE-N) migre sur SDS-Page à la position 70 000-73 000. Comme le trpE correspond à 35 000, la protéine N a un poids molé¬ culaire de l'ordre de 35-38 000.The protein expressed by the SHV-N2 (trpE-N) migrates on SDS-Page at the position 70 000-73 000. As the trpE corresponds to 35 000, the protein N has a molecular weight of the order of 35 -38,000.
Cette protéine est reconnue par un anticorps monoclonal spécifique de la nucléoprotéine N. Exemple 6 : Expression du fragment SHV-Nl.This protein is recognized by a monoclonal antibody specific for the N nucleoprotein. Example 6: Expression of the SHV-Nl fragment.
Le plasmide pSHV-Nl est digéré par l'enzyme Eco RI et le fragment obtenu est inséré en phase au niveau du site Sma I d'un plasmide pUEX 2 comme visible sur la figure lb.Plasmid pSHV-N1 is digested with the Eco RI enzyme and the fragment obtained is inserted in phase at the Sma I site of a pUEX 2 plasmid as shown in FIG.
Chez les bactéries, la traduction du message contenu dans l'insert est réalisée sous le contrôle du promoteur de la galactosidase.In bacteria, the translation of the message contained in the insert is carried out under the control of the galactosidase promoter.
En système acellulaire, la traduction du mes- sage contenu dans l'insert est sous le contrôle des pro¬ moteurs T4 ou T7, dans un plasmide PBS.In acellular system, the translation of the message contained in the insert is under the control of the T4 or T7 promoters in a PBS plasmid.
La protéine de fusion correspondant à 1'SHV-Nl est exprimée à partir dudit plasmide pUEX (AMERSHAM) . Les clones recombinants sont mis en culture une nuit à 27*C dans un milieu L Broth. La culture est diluée dans le même milieu et cultivée pendant 5 heures à 27*C puis 2 heures à 42*C pour l'induction.The fusion protein corresponding to the HSV-N1 is expressed from said plasmid pUEX (AMERSHAM). The recombinant clones were cultured overnight at 27 ° C in L medium Broth. The culture is diluted in the same medium and grown for 5 hours at 27 ° C and then 2 hours at 42 ° C for induction.
La protéine de fusion β-Gal-N présente un poids moléculaire de l'ordre de 160 000 et la β-Gal cor- respond à un poids moléculaire de 120 000.The β-Gal-N fusion protein has a molecular weight of about 160,000 and β-Gal corresponds to a molecular weight of 120,000.
Cette protéine "est reconnue par un anticorps monoclonal spécifique de la nucléoprotéine N.This protein is recognized by a monoclonal antibody specific for the N nucleoprotein.
La figure 2a montre la migration de la pro¬ téine N et de la β-galactosidase. La protéine de fusion N-βGal et- la β-gal sont soumises à une électrophorèse en parallèle et le gel est coloré au bleu de Comassie.Figure 2a shows the migration of protein N and β-galactosidase. The N-βGal fusion protein and the β-gal are electrophoresed in parallel and the gel is stained with Comassie blue.
Les marqueurs de poids moléculaire sont à droite 94, 67, 43, 30 et 20 kDa et à gauche 200, 92,5, 69, 46, 21,5 et 14,3 kDa. Entre 200 et 92,5, la distance n'est pas proportionnelle au logarithme du poids molécu¬ laire.The molecular weight markers are 94, 67, 43, 30 and 20 kDa on the right and 200, 92.5, 69, 46, 21.5 and 14.3 kDa on the left. Between 200 and 92.5, the distance is not proportional to the logarithm of molecular weight.
Dans un autre essai, la N-βGal, la β-Gal et les protéines de virus purifiées sont soumises à une électrophorèse en parallèle, puis transférées sur des membranes de nitrocellulose et traitées soit avec les an- ticorps monoclonaux F5 (dilution 1/5000), spécifiques de la nucléoprotéine N ou avec les anticorps monoclonaux 110In another assay, N-βGal, β-Gal and purified virus proteins are electrophoresed in parallel, then transferred to nitrocellulose membranes and treated either with the monoclonal antibodies F5 (dilution 1/5000), specific for nucleoprotein N or with monoclonal antibodies 110
(dilution 1/500) , spécifiques de la protéine G. La figure(dilution 1/500), specific for the G protein.
2b montre la reconnaissance de la protéine N par un anti- corps monoclonal spécifique de la protéine N dénommé F5, ladite protéine n'étant pas reconnue par un anticorps monoclonal spécifique de la protéine G dénommé 110. Dans cette figure. Les tâches correspondent à 1 à 0,13 μg de β-2b shows the recognition of the N protein by a monoclonal antibody specific for the N protein called F5, said protein not being recognized by a monoclonal antibody specific for the G protein designated 110. In this figure. The tasks correspond to 1 to 0.13 μg of β-
Gal-N ou de β-Gal déposées sur de la nitrocellulose et traitées avec les mêmes anticorps que ci-dessus.Gal-N or β-Gal deposited on nitrocellulose and treated with the same antibodies as above.
Exemple 7 : Sόquençage des inserts SHV-Nl et SHV-N2.Example 7: Sequencing of inserts SHV-N1 and SHV-N2.
Les oligomères conformes à l'invention sont utilisés. La séquence de nucleotides 1 à 105 est obtenue à partir de M13mpl9 (SHV-N2) et de M13mpl8 (SHV-N2) et représente les deux brins de pSHV-N2.Oligomers according to the invention are used. The nucleotide sequence 1 to 105 is obtained from M13mp19 (SHV-N2) and M13mp18 (SHV-N2) and represents both strands of pSHV-N2.
La séquence de nucleotides 105 à 1300 est vérifiée sur les deux brins des deux inserts (SHV-Nl et SHV-N2) ; il y a homologie des deux inserts au niveau de ce fragment qui comprend la phase ouverte de lecture.The nucleotide sequence 105 to 1300 is verified on both strands of the two inserts (SHV-N1 and SHV-N2); there is homology of the two inserts at the level of this fragment which includes the open reading phase.
Le séquençage est réalisé soit en présence de séquenase (T7 ADN polymérase modifiée) , selon le proto¬ cole décrit dans le kit United States Biochemical, soit en présence d'un fragment de Kleno de l'ADN polymérase I, selon le protocole décrit dans le kit Boehringer.The sequencing is carried out either in the presence of sequenase (modified T7 DNA polymerase), according to the proto¬cole described in the United States Biochemical kit, or in the presence of a KlenoI fragment of DNA polymerase I, according to the protocol described in US Pat. the Boehringer kit.
Exemple 8 : Procédé de détection du virus SHV, conforme à l'invention, en présence d'anticorps appro¬ priés. a. On prépare des anticorps polyclonaux anti- virus SHV à partir d'une protéine de fusion conforme à l'invention. b. On applique une technique ELISA telle que celle décrite dans AY et DIXON (J. Applied Ichtyol, 1988, 4, 182-189), notamment à des prélèvements d'organes de poissons. Exemple 9 : Procédé de détection d'anticorps antinucléoprotéine N, conforme à l'invention.EXAMPLE 8 Method for Detecting the SHV Virus According to the Invention in the Presence of Appropriate Antibodies at. Anti-virus SHV polyclonal antibodies are prepared from a fusion protein according to the invention. b. An ELISA technique such as that described in AY and DIXON (J.Applied Ichtyol, 1988, 4, 182-189) is applied, in particular to the sampling of fish organs. EXAMPLE 9 Method for Detecting Antinucleoprotein N Antibody, in Accordance with the Invention
30 μl de protéine de fusion en dilutions séries 1/2 (concentration de départ 5 μg) sont déposés dans les puits d'un appareil "dot blot" équipé d'une mem¬ brane de nitrocellulose, puis les puits sont lavés avec 100 μl de tampon (Tris-HCl) 10 mM (pH 8), EDTA 1 mM) . La feuille de nitrocellulose est ensuite découpée et saturée par immersion pendant 30 minutes à 37*C dans du PBS 3 % gélatine. Après 4 lavages en PBS 0,05 % - Tween 20, la feuille de nitrocellulose est incubée pendant 30 minutes à 37*C en PBS 3 % gélatine 0,5 % Triton XI00 contenant le sérum à étudier.30 .mu.l of fusion protein in serial 1/2 dilutions (starting concentration of 5 .mu.g) are deposited in the wells of a dot blot apparatus equipped with a nitrocellulose membrane, and then the wells are washed with 100 .mu.l 10 mM buffer (Tris-HCl) (pH 8), 1 mM EDTA). The nitrocellulose sheet is then cut and saturated by immersion for 30 minutes at 37 ° C in 3% PBS gelatin. After 4 washes in PBS 0.05% - Tween 20, the nitrocellulose sheet is incubated for 30 minutes at 37 ° C in 3% gelatin PBS 0.5% Triton XI00 containing serum to be investigated.
L'incubation avec l'anticorps anti-immuno- globuline de truite est effectué dans les mêmes condi¬ tions.Incubation with the anti-immunoglobulin trout antibody is carried out under the same conditions.
Exemple 10 : Procédé de détection du virus SHV par amplification.EXAMPLE 10 Method for Detecting SHV Virus by Amplification
Environ 1 μg d'ARN total est hybride avec 100 ng de 1'oligonucléotide (1) conforme à l'invention de sens (+) et s'étendant entxe les positions 290 et 307 du génome du virus SHV et un ADN de sens (+) complémentaire au génome est amorcé spécifiquement et synthétisé. Le milieu réactionnel est extrait au phénol, précipité à l'éthanol, lavé puis séché. Il est alors repris dans 50 μl comprenant l'amorce correspondant à un oligonucléo¬ tide de formule (10) de sens (-) et s'étendant entre les positions 740 à 757 du gène, des tampons appropriés habi¬ tuellement utilisés lors de l'amplification et de la Taq DNA polymérase.About 1 μg of total RNA is hybridized with 100 ng of the oligonucleotide (1) according to the invention of sense (+) and extending at positions 290 and 307 of the genome of the SHV virus and a sense DNA ( +) complementary to the genome is specifically primed and synthesized. The reaction medium is extracted with phenol, precipitated with ethanol, washed and dried. It is then taken up in 50 .mu.l comprising the primer corresponding to an oligonucleotide of formula (10) of direction (-) and extending between the positions 740 to 757 of the gene, appropriate buffers commonly used during the treatment. amplification and Taq DNA polymerase.
Le milieu réactionnel est incubé dans une "machine à PCR" lui faisant subir les étapes suivantes : + 95*C 5 min pour dénaturer + 50*C 2 min pour que les amorces s'hybrident + 72"C 2 min pour que la Taq polymérase allonge les brins d'ADNc.The reaction medium is incubated in a "PCR machine" subjecting it to the steps of: + 95 ° C 5 min to denature + 50 ° C 2 min so that the primers hybridize + 72 ° C 2 min for the Taq polymerase to lengthen the cDNA strands.
Dans le cas présent, l'oligonucléotide de for¬ mule (1) s'hybride avec l'ARN génomique et sert d'amorce de transcription inverse. Le second brin est alors syn¬ thétisé en utilisant comme amorce l'oligonucléotide de formule (10) . Tous les deux peuvent ensuite servir à l'amplification. Inversement, l'oligonucléotide de for¬ mule (10) peut s'hybrider avec le messager pour la réac- tion de transcription inverse et 1Oligonucléotide de formule (1) être utilisée pour la synthèse du deuxième brin.In the present case, the for¬ mule oligonucleotide (1) hybridizes with the genomic RNA and serves as a reverse transcription primer. The second strand is then synthesized using, as primer, the oligonucleotide of formula (10). Both can then be used for amplification. Conversely, the for¬ mule oligonucleotide (10) can hybridize with the messenger for the reverse transcription reaction and the oligonucleotide of formula (1) be used for second strand synthesis.
Exemple 11 : Pouvoir immunogene et protection des compositions conformes à l'invention. Des lots comportant plus de 50 truitelles par lot reçoivent respectivement des préparations de nucléo¬ protéine N, de protéine G et de l'association des deux.Example 11 Immunogenic Power and Protection of the Compositions in Accordance with the Invention Batches with more than 50 troutels per lot receive nucleosome protein N, protein G preparations and the combination of both.
Parallèlement d'autres lots reçoivent des cel¬ lules hôtes non transformées inactivées (Saccharomyces cerevisiae) (témoin négatif) .In parallel, other batches receive inactivated non-transformed host cells (Saccharomyces cerevisiae) (negative control).
A l'issue d'une période d'immunisation de 6 semaines, à 10βC, des réplicats de chacun des lots seront infectés soit par un virus SHV de type 1, soit par deux autres virus SHV de types 2 et 3. Après une période d'épreuve d'un minimun de 30 jours à 10*C, les pourcentages de protection relative sont calculés.After a 6-week immunization period at 10 β C, replicates of each of the lots will be infected with either a type 1 VHS virus or two other type 2 and 3 VHS viruses. a test period of a minimum of 30 days at 10 ° C, relative protection of the percentages are calculated.
Le pourcentage de survie des poissons qui ont été immunisés est significativement supérieur. Exemple 12 : Préparation de cellules de pois¬ sons devenues résistantes au virus SHV.The survival percentage of fish that have been immunized is significantly higher. Example 12: Preparation of fish cells that have become resistant to the SHV virus.
On prend la séquence des 100 premiers nucleo¬ tides de la séquence de formule I conforme à 1'invention ; on 1'insère dans un vecteur plasmidique sous contrôle d'un promoteur actif en cellules eucaryotes notamment apte à s'exprimer en cellules de poissons et chez le poisson, de telle sorte que soit synthétisé l'ARNc du fragment cité de façon à montrer si ces sé¬ quences anti-sens sont capables de protéger les cellules de poissons et les poissons contre une infection par le virus.The sequence of the first 100 nucleotides of the sequence of formula I according to the invention is taken; it is inserted into a plasmid vector under the control of an active promoter in eukaryotic cells especially able to express itself in fish cells and in fish, so that the cRNA of the cited fragment is synthesized so as to show whether these antisense se¬ quences are capable of protecting fish cells and fish against an infection with the virus.
Le vecteur plasmidique utilisé est par exemple un pCMV CAT dans lequel la séquence est sous contrôle d'un promoteur de la protéine immédiate précoce de CMV (cytomégalovirus) humain.The plasmid vector used is, for example, a pCMV CAT in which the sequence is under the control of a promoter of the immediate early human CMV (cytomegalovirus) protein.
Exemple 13 : Expression d'une séquence d'acide nucléique codant pour la protéine N du virus SHV en levure :EXAMPLE 13 Expression of a Nucleic Acid Sequence Coding for the N Protein of SHV Virus in Yeast
Les caractéristiques du vecteur d'expression inductible par la levure sont les suivantes :The characteristics of the yeast-inducible expression vector are as follows:
- la réplication et le maintien dans la bacté¬ rie (E. coli)- sont assurés par pBR322, résistant à l'ampicilline (AmpR) ,replication and maintenance in the bacterium (E. coli) are ensured by pBR322, ampicillin-resistant (Amp R ),
- la réplication dans la levure est assurée par les fonctions du 2 μ,the replication in the yeast is ensured by the functions of the 2 μ,
- le promoteur" résulte de la fusion des sé¬ quences régulatrices (URS, Upstream Regulating Séquences) de l'ADH2, le gène de l'alcool déhydrogénase 2 qui est inductible par l'alcool et le promoteur GAPDH, (glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase) , qui est un des promoteurs constitutifs les plus puissants de la levure, ce promoteur hybride combine la puissance du promoteur GAPDH avec 1'inductibilité de l'ADH2,the promoter results from the fusion of the URS (Upstream Regulating Sequences) of ADH2, the alcohol dehydrogenase 2 gene which is inducible by alcohol and the GAPDH promoter (glyceraldehyde phosphate dehydrogenase) which is one of the most potent constitutive promoters of yeast, this hybrid promoter combines the potency of the GAPDH promoter with the inducibility of ADH2,
- le terminateur du gène GAPDH. La sélection dans la levure se fait par com¬ plémentation d'une auxotrophie de la souche hôte par les gènes Ura3 ou leu 2d (d pour déficient) ; ces deux gènes permettent d'étudier l'influence du nombre de copies sur la production de la protéine d'intérêt, car Ura3 est un allèle' sauvage du gène muté, la complémentation est effi- cace, le nombre de copies du vecteur est minimal, le gène leu 2d est très peu traduit, pour assurer la biosynthèse de leucine indispensable pour sa croissance la cellule n'a qu'une possibilité augmenter le nombre de copies du gène leu 2d et par conséquent le nombre de copies du vec¬ teur.the terminator of the GAPDH gene. Selection in yeast is accomplished by complementation of an auxotrophy of the host strain by the Ura3 or leu2d (d deficient) genes; these two genes used to study the influence of the number of copies on the production of the protein of interest, as URA3 allele is a wild the mutated gene, supplementation is effec- cace, the number of copies of the vector is minimal, the gene leu 2d is very little translated, to ensure the biosynthesis of leucine essential for its growth the cell has only one possibility to increase the number of copies of the leu gene 2d and by therefore the number of copies of the vec¬ tor.
Le gène de la protéine N a été reproduit par PCR à partir du plasmide pSHVN2. Le premier oligonucléo¬ tide CGA CCA TGG AAG GAG GAA TTC GT place un site Ncol Ncol sur le codon initiateur de la protéine N. Cette modifica¬ tion ne change pas l'enchaînement des acides aminés.The N protein gene was reproduced by PCR from plasmid pSHVN2. The first oligonucleotide CGA CCA TGG AAG GAG GAA TTC GT places a Ncol Ncol site on the initiator codon of the N protein. This modification does not change the sequence of amino acids.
Le second oligonucléotide CTT GTC GAC TTA GTCThe second CTT GTC oligonucleotide GAC TTA GTC
Sali AGA GTC CTC GGG place un site Sali en aval du codon ter¬ minateur.Sali AGA GTC CTC GGG places a Sali site downstream of the ter- minator codon.
Le DNA synthétisé est digéré par les enzymes Ncol et Sali, est inséré dans le vecteur intermédiaire pEGTIOl ouvert par Ncol et Sali, entre le promoteur ADH2/GAPDH, grâce au site Ncol placé sur l'ATG initia¬ teur, et le terminateur du plasmide intermédiaire pEGTIOl grâce au site Sali situé après le codon stop et introduit par transformation dans E. coli . On obtient ainsi un plasmide dénommé pEGTIOl-SHVN. Les caractéristiques de ce plasmide ont été vérifiées par la digestion par les enzymes de restriction Ncol et Sali qui libère le cDNA de la susdite séquence d'acides aminés sous la forme d'une bande de 1,2 kb. Le fragment BamHl contenant le promoteur, le gène de la pro- téine N et le terminateur est à son tour introduite au site unique BamHl du vecteur navette E. coli-levure pEGTHO ; les plasmides sont introduits par transforma¬ tion et la présence du fragment BamHl dans le vecteur na¬ vette est vérifiée par la digestion BamHl qui fait appa- raître une bande de 3,4 kb. Le plasmide ainsi obtenu, pYSHVN est introduit par transformation au PEG dans la souche classique de levure DC04 (a adel leu2-04 cir°).La construction du vecteur pYSHVN est représentée à la fi¬ gure 3.The synthesized DNA is digested with the NcoI and SalI enzymes, is inserted into the NCEP and SalI-mediated intermediate pEGTIO1 intermediate between the ADH2 / GAPDH promoter, by virtue of the NcoI site placed on the ATG initiator, and the plasmid terminator. pEGTIO1 intermediate through the SalI site located after the stop codon and introduced by transformation into E. coli. A plasmid called pEGTIO1-SHVN is thus obtained. The characteristics of this plasmid were verified by digestion with NcoI and SalI restriction enzymes which releases the cDNA of the above amino acid sequence as a 1.2 kb band. The BamHI fragment containing the promoter, the N protein gene and the terminator is in turn introduced at the unique BamHI site of the E. coli-yeast pEGTHO shuttle vector; the plasmids are introduced by transformation and the presence of the BamHI fragment in the vector na¬ vette is verified by the BamHI digestion which shows a 3.4 kb band. The plasmid thus obtained, pYSHVN is introduced by transformation with PEG in the conventional strain of yeast DC04 (adele leu2-04 cir °) .The construction of the vector pYSHVN is shown in FIG.
Le protocole de la fermentation et de l'induction est particulier car l'induction de l'ADH2 est sensible à la répression catabolique. La première phase de la fermentation vise à obtenir une biomasse en mainte¬ nant le plasmide. La sélection se fait par complé¬ mentation de la mutation leu 2, par conséquent le milieu est le YNB (Yeast nitrogen base without aminoacids Difco 0919-15), avec 3 % de glucose. Le milieu est rendu aussi riche que possible en ajoutant tous les acides aminés à l'exception de la leucine, et les bases azotées. Le temps de génération de la souche dans ce milieu est proche de 4 heures, contre 2 heures seulement dans un milieu com¬ plexe. La densité optique atteinte est de 2,5. Les cel¬ lules sont ensuite transférées dans un milieu identique, pendant une nuit, où le glucose a été remplacé par du glycérol pour lever la répression catabolique. L'induction se fait dans le milieu riche YM (Yeast Broth Difco 0711-01), en présence de 3 % d'éthanol.The protocol of fermentation and induction is particular because the induction of ADH2 is sensitive to catabolic repression. The first phase of the fermentation aims to obtain a biomass by maintaining the plasmid. The selection is made by completion of the mutation leu 2, therefore the medium is YNB (Yeast nitrogen base without amino acids Difco 0919-15), with 3% glucose. The medium is made as rich as possible by adding all the amino acids except leucine, and the nitrogenous bases. The generation time of the strain in this medium is close to 4 hours, compared with only 2 hours in a complex medium. The optical density reached is 2.5. The cells are then transferred to an identical medium overnight, where glucose has been replaced by glycerol to remove the catabolic repression. Induction is in YM rich medium (Yeast Broth Difco 0711-01) in the presence of 3% ethanol.
La culture est poursuivie jusqu'à une densité optique de 4. A ce moment, les cellules sont récoltées par centrifugation et remises en suspension dans le Tarn- pon Tris-HCl 20 mM EDTA, 10 mM, PMSF (fluorure de méthyl- phényl-sulfonyl) 1 mM, pH 8,0. Les cellules sont alors brisées par trois passages à la presse de French de manière à obtenir un extrait brut de la séquence en acides aminés. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien¬ nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en em¬ brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve- nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écar¬ ter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. The culture is continued to an optical density of 4. At this time, the cells are harvested by centrifugation and resuspended in 20 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, methylphenyl fluoride (PMSF). 1mM sulfonyl), pH 8.0. The cells are then broken by three passes to the French press so as to obtain a crude extract of the amino acid sequence. As is apparent from the foregoing, the invention is not limited to those of its modes of implementation, implementation and application which come to be described more explicitly; on the other hand, it engages all the variants that can To the mind of the technician in this field, without departing from the scope or scope of the present invention.

Claims

REVENDICATIONS 1") Séquence nucléotidique issue de l'ARN génomique du virus SHV, caractérisée en ce qu'elle com¬ prend le gène codant pour la nucléoprotéine N et en ce qu'elle comprend la séquence en nucleotides et la séquence déduite en amino-acides de formule I ci-après : C TTT CAA GTT TGA AAT TCC AAG AAT TTG GAA AGT GAA AGT TGA ACA 46 Met 1 CAG AGT CAT ATC TCA TAA TCG TTG AAC AAA AGA ACT CAG TCG AAG ATG 94 Glu Gly Gly Ile Arg Ala Ala Phe Ser Gly Leu Asn Asp Val Arg Ile 17 GAA GGA GGA ATT CGT GCA GCG TTT TCA GGC CTG AAT GAT GTT AGG ATT 142 Asp Pro Thr Gly Gly Glu Gly Arg Val Leu Val Pro Gly Glu Val Glu 33 GAC CCC ACC GGT GGA GAG GGA CGG GTA CTT GTA CCT GGT GAA GTG GAG 190 Leu Ile Val Tyr Val Gly Glu Phe Gly Glu Glu Asp Arg Lys Val Ile 49 CTC ATC GTG TAT GTT GGT GAA TTT GGT GAG GAA GAT AGG AAG GTG ATT 238 Val Asp Ala Leu Ser Ala Leu Gly Gly Pro Gin Thr Val Gin Ala Leu 65 GTG GAT GCA CTC TCC GCA CTC GGG GGA CCC CAG ACT GTA CAG GCG TTG 286 Ser Val Leu Leu Ser Tyr Val Leu Gin Gly Asn Thr Gin Glu Asp Leu 81 TCC GTG CTT CTC TCC TAT GTA CTC CAA GGG AAC ACA CAG GAG GAC CTA 33 Glu Thr Lys Cys Lys Val Leu Thr Asp Met Gly Phe Lys Val Thr Gin 97 GAA ACA AAG TGC AAG GTC CTC ACA GAC ATG GGC TTC AAG GTG ACA CAG 382 Ala Val Arg Ala Thr Ser Ile Glu Ala Gly Ile Met Met Pro Met Arg 113 GCA GTC AGG GCC ACG AGC ATC GAG GCG GGA ATC ATG ATG CCC ATG AGA '430 Glu Leu Ala Leu Thr Val Asn Asp Asp Asn Leu Met Glu Ile Val Lys 129 GAA CTG GCC CTG ACT GTC AAT GAC GAC AAC CTC ATG GAA ATC GTC AAG 478 Gly Thr Leu Met Thr Cys Ser Leu Leu Thr Lys Tyr Ser Val Asp Lys 145 GGG ACC TTG ATG ACA TGC TCC CTT CTT ACC AAG TAC TCG GTG GAC AAG 526 Met Ile Lys Tyr Ile Thr Lys Lys Leu Gly Glu Leu Ala Asp Thr Gin 161 ATG ATC AAG TAC ATC ACC AAG AAA CTC GGG GAG CTG GCA GAC ACC CAG 574 Gly Val Gly Glu Leu Gin His Phe Thr Ala Asp Lys Ala Ala Ile Arg 177 GGA GTT GGG GAA CTG CAG CAC TTC ACC GCT GAC AAG GCA GCC ATC AGG 622 Lys Leu Ala Gly Cys Val Arg Pro Gly Gin Lys Ile Thr Lys Ala Leu 193 AAA CTC GCA GGG TGT GTG CGT CCC GGG CAG AAG ATC ACC AAG GCC CTC 670 Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Glu Ile Ala Asp Pro Thr Thr Gin Ser Arg 209. TAT GCG TTC ATC CTG ACT GAG ATC GCA GAC CCC ACC ACC CAG TCG AGG 718 Val Pro Ser Met Gly Ala Leu Arg Leu Asn Gly Thr Gly Met Thr Met 225 GTC CCG AGC ATG GGG GCG TTG AGA CTC AAC GGG ACA GGA ATG ACC ATG 766 Ile Gly Leu Phe Thr Gin Ala Ala Asn Asn Leu Gly Ile Ala Pro Ala 241 ATT GGG TTG TTC ACC CAG GCC GCC AAC AAC TTG GGC ATT GCC CCG GCA 814 Lys Leu Leu Glu Asp Leu Cys Met Glu Ser Leu Val Glu Ser Ala Arg 257 AAG CTG CTG GAG GAC CTC TGC ATG GAG TCC CTG GTT GAG TCA GCC AGA 862 28 Arg Ile Ile Gin Leu Met Arg Gin Val Ser Glu Ala Lys Ser Ile Gin 273 CGG ATC ATC CAG TTG ATG AGA CAG GTG TCA GAG GCG AAG TCC ATC CAA 910 Glu Arg Tyr Ala Ile Met Met Ser Arg Met Leu Gly Glu Ser Tyr Tyr 289 GAG CGC TAC GCC ATC ATG ATG AGT CGG ATG CTG GGA GAG TCC TAC TAC 958 Lys Ser Tyr Gly Leu Asn Asp Asn Ser Lys Ile Ser Tyr Ile Leu Ser 305 AAG TCG TAT GGA CTC AAT GAC AAC TCC AAG ATC TCT TAC ATT CTG TCA 1006 Gin Ile Ser Gly Lys Tyr Ala Val Asp Ser Leu Glu Gly Leu Glu Gly 321 CAG ATC AGT GGG AAG TAC GCA GTG GAC TCC CTG GAA GGC CTG GAG GGG 1054 Ile Lys Val Thr Glu Lys Phe Arg Glu Phe Ala Glu Leu Val Ala Glu 337 ATC AAG GTG ACA GAG AAG TTC CGC GAG TTC GCT GAG CTT GTT GCA GAA 1102 Val Leu Val Asp Lys Tyr Glu Arg Ile Gly Glu Asp Ser Thr Glu Val 353 GTC CTG GTG GAC AAG TAC GAG AGG ATT GGA GAG GAC AGC ACG GAG GTC 1150 Ser Asp Val Ile Arg Glu Ala Ala Arg Gin His Ala Arg Arg Thr Ser 369 TCA GAT GTC ATC AGG GAG GCG GCC AGA CAG CAC GCG CGC AGG ACA TCT 1198 Ala Lys Pro Glu Pro Lys Ala Arg Asn Phe Arg Ser Ser Thr Gly Arg 385 GCC AAG CCA GAG CCA AAG GCC CGC AAC TTC AGG AGC TCC ACC GGA AGG 1246 Gly Arg Glu Gin Glu Thr Gly Glu Ser Asp Asp Asp Asp Tyr Pro Glu 401 GGA AGG GAG CAG GAG ACG GGG GAG TCC GAT GAT GAC GAC TAC CCC GAG 1294 Asp Ser Asp *** GAC TCT GAC TAA AAG GCA CTC CCG TCT CAT AAC CAA CAT AGA TAG AAA 1342 AAA A ainsi que les séquences dérivées de celle-ci et les frag¬ ments de ladite séquence et des séquences dérivées . 2' ) Produit de transcription du virus SHV, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un fragment mono- cistronique correspondant aux nucleotides 1-1346 de la séquence de formule (I) selon la revendication 1, associé à un poly A et en ce qu'il code pour la nucléoprotéine N ou un fragment de celle-ci. 3") Fragment ou combinaison*de fragments d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des reven¬ dications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il code pour un peptide ou un fragment de peptide du virus SHV, éven¬ tuellement associé à un segment poly A. 4') Fragment selon la revendication 3, carac¬ térisé en ce qu'il comprend 105 paires de bases et cor¬ respond aux nucleotides 1-105 de la séquence de formule I selon la revendication 1. 5") Fragment selon la revendication 3, carac¬ térisé en ce qu'il comprend 1235 paires de bases, est dénommé SHV-Nl et correspond aux nucleotides 101-1336 de la séquence de formule I selon la revendication 1. 6") Fragment selon- la revendication 3, carac¬ térisé en ce qu'il comprend 1346 paires de bases, est dénommé SHV-N2 et correspond aux nucleotides 1-1346 de la séquence de formule I selon la revendication 1. 7*) Fragment selon la revendication 3, carac- térisé en ce qu'il comprend 1214 paires de bases, code pour la nucléoprotéine N du virus SHV qui comprend 404 amino-acides et correspond aux nucleotides 92-1306 de ladite séquence de formule I. 8*) Oligonucléotides, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par un fragment d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et en ce qu'ils répondent à l'une quelconque des for¬ mules 1 à 10 ci-après : CLAIMS 1") Nucleotide sequence derived from the genomic RNA of the SHV virus, characterized in that it comprises the gene coding for the N nucleoprotein and in that it comprises the nucleotide sequence and the deduced amino sequence. acids of formula I below: C TTT CAA GTT TGA AAT TCC AAG AAT TTG GAA AGT GAA AGT TGA ACA 46 Met 1 CAG AGT CAT ATC TCA TAA TCG TTG AAC AAA AGA ACT CAG TCG AAG ATG 94 Glu Gly Gly Ile Arg Ala Ala Phe Ser Gly Leu Asn Asp Val Arg Ile 17 GAA GGA GGA ATT CGT GCA GCG TTT TCA GGC CTG AAT GAT GTT AGG ATT 142 Asp Pro Thr Gly Gly Glu Gly Arg Val Leu Val Pro Gly Glu Val Glu 33 GAC CCC ACC GGT GGA GAG GGA CGG GTA CTT GTA CCT GGT GAA GTG GAG 190 Leu Ile Val Tyr Val Gly Glu Phe Gly Glu Glu Asp Arg Lys Val Ile 49 CTC ATC GTG TAT GTT GGT GAA TTT GGT GAG GAA GAT AGG AAG GTG ATT 238 Val Asp Ala Leu Ser Ala Leu Gly Gly Pro Gin Thr Val Gin Ala Leu 65 GTG GAT GCA CTC TCC GCA CTC GGG GGA CCC CAG ACT GTA CAG GCG TTG 286 Ser Val Leu Leu Ser Tyr Val Leu Gin Gly Asn Thr Gin Glu Asp Leu 81 TCC GTG CTT CTC TCC TAT GTA CTC CAA GGG AAC ACA CAG GAG GAC CTA 33 Glu Thr Lys Cys Lys Val Leu Thr Asp Met Gly Phe Lys Val Thr Gin 97 GAA ACA AAG TGC AAG GTC CTC ACA GAC ATG GGC TTC AAG GTG ACA CAG 382 Ala Val Arg Ala Thr Ser Ile Glu Ala Gly Ile Met Met Pro Met Arg 113 GCA GTC AGG GCC ACG AGC ATC GAG GCG GGA ATC ATG ATG CCC ATG AGA '430 Glu Leu Ala Leu Thr Val Asn Asp Asp Asn Leu Met Glu Ile Val Lys 129 GAA CTG GCC CTG ACT GTC AAT GAC GAC AAC CTC ATG GAA ATC GTC AAG 478 Gly Thr Leu Met Thr Cys Ser Leu Leu Thr Lys Tyr Ser Val Asp Lys 145 GGG ACC TTG ATG ACA TGC TCC CTT CTT ACC AAG TAC TCG GTG GAC AAG 526 Met Ile Lys Tyr Ile Thr Lys Lys Leu Gly Glu Leu Ala Asp Thr Gin 161 ATG ATC AAG TAC ATC ACC AAG AAA CTC GGG GAG CTG GCA GAC ACC CAG 574 Gly Val Gly Glu Leu Gin His Phe Thr Ala Asp Lys Ala Ala Ile Arg 177 GGA GTT GGG GAA CTG CAG CAC TTC ACC GCT GAC AAG GCA GCC ATC AGG 622 Lys Leu Ala Gly Cys Val Arg Pro Gly Gin Lys Ile Thr Lys Ala Leu 193 AAA CTC GCA GGG TGT GTG CGT CCC GGG CAG AAG ATC ACC AAG GCC CTC 670 Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Glu Ile Ala Asp Pro Thr Thr Gin Ser Arg 209. TAT GCG TTC ATC CTG ACT GAG ATC GCA GAC CCC ACC ACC CAG TCG AGG 718 Val Pro Ser Met Gly Ala Leu Arg Leu Asn Gly Thr Gly Met Thr Met 225 GTC CCG AGC ATG GGG GCG TTG AGA CTC AAC GGG ACA GGA ATG ACC ATG 766 Ile Gly Leu Phe Thr Gin Ala Ala Asn Asn Leu Gly Ile Ala Pro Ala 241 ATT GGG TTG TTC ACC CAG GCC GCC AAC AAC TTG GGC ATT GCC CCG GCA 814 Lys Leu Leu Glu Asp Leu Cys Met Glu Ser Leu Val Glu Ser Ala Arg 257 AAG CTG CTG GAG GAC CTC TGC ATG GAG TCC CTG GTT GAG TCA GCC AGA 862 28 Arg Ile Ile Gin Leu Met Arg Gin Val Ser Glu Ala Lys Ser Ile Gin 273 CGG ATC ATC CAG TTG ATG AGA CAG GTG TCA GAG GCG AAG TCC ATC CAA 910 Glu Arg Tyr Ala Ile Met Met Ser Arg Met Leu Gly Glu Ser Tyr Tyr 289 GAG CGC TAC GCC ATC ATG ATG AGT CGG ATG CTG GGA GAG TCC TAC TAC 958 Lys Ser Tyr Gly Leu Asn Asp Asn Ser Lys Ile Ser Tyr Ile Leu Ser 305 AAG TCG TAT GGA CTC AAT GAC AAC TCC AAG ATC TCT TAC ATT CTG TCA 1006 Gin Ile Ser Gly Lys Tyr Ala Val Asp Ser Leu Glu Gly Leu Glu Gly 321 CAG ATC AGT GGG AAG TAC GCA GTG GAC TCC CTG GAA GGC CTG GAG GGG 1054 Ile Lys Val Thr Glu Lys Phe Arg Glu Phe Ala Glu Leu Val Ala Glu 337 ATC AAG GTG ACA GAG AAG incl. tax CGC GAG inc. Glu Ala Ala Arg Gin His Ala Arg Arg Thr Ser 369 TCA GAT GTC ATC AGG GAG GCG GCC AGA CAG CAC GCG CGC AGG ACA TCT 1198 Ala Lys Pro Glu Pro Lys Ala Arg Asn Phe Arg Ser Ser Thr Gly Arg 385 GCC AAG CCA GAG CCA AAG GCC CGC AAC TTC AGG AGC TCC ACC GGA AGG 1246 Gly Arg Glu Gin Glu Thr Gly Glu Ser Asp Asp Asp Asp Tyr Pro Glu 401 GGA AGG GAG CAG GAG ACG GGG GAG TCC GAT GAT GAC GAC TAC CCC GAG 1294 Asp Ser Asp *** GAC TCT GAC TAA AAG GCA CTC CCG TCT CAT AAC CAA CAT AGA TAG AAA 1342 AAA A as well as the sequences derived therefrom and the fragments of said sequence and the derived sequences. 2') Transcription product of the SHV virus, characterized in that it consists of a mono-cistronic fragment corresponding to nucleotides 1-1346 of the sequence of formula (I) according to claim 1, associated with a poly A and in that it codes for the N nucleoprotein or a fragment thereof. 3") Fragment or combination of fragments of a nucleotide sequence according to any one of claims 1 or 2, characterized in that it codes for a peptide or a peptide fragment of the SHV virus, possibly associated to a poly A segment. 4') Fragment according to claim 3, characterized in that it comprises 105 base pairs and corresponds to nucleotides 1-105 of the sequence of formula I according to claim 1. 5" ) Fragment according to claim 3, characterized in that it comprises 1235 base pairs, is called SHV-Nl and corresponds to nucleotides 101-1336 of the sequence of formula I according to claim 1. 6") Fragment according to- claim 3, characterized in that it comprises 1346 base pairs, is called SHV-N2 and corresponds to nucleotides 1-1346 of the sequence of formula I according to claim 1. 7*) Fragment according to claim 3, characterized in that it comprises 1214 base pairs, codes for the N nucleoprotein of the SHV virus which comprises 404 amino acids and corresponds to nucleotides 92-1306 of said sequence of formula I. 8*) Oligonucleotides, characterized in that that they are constituted by a fragment of a nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 7 and in that they correspond to any one of the formulas 1 to 10 below:
(1) 5'TGCTTCTCTCCTATGTAC (1) 5'TGCTTCTCTCCTATGTAC
(2) 5'GTGTGCGTCCCGGGCAGAAGATCACC(2) 5'GTTGCGTCCCGGGCAGAAGATCACC
(3) 5'CCCCACCACCCAGTCGA (3) 5'CCCCACCACCCAGTCGA
(4) 5 'GGACCTCTGCATGGAGTCCC(4) 5' GGACCTCTGCATGGAGTCCC
(5) 5 'GCCAAGCCAGAGCCAAAG(5) 5'GCCAAGCCAGAGCCAAAG
(6) 5 ' CTTCGACTGAGTTC(6) 5' CTTCGACTGAGTTC
(7) 5 ' ACATACACGATGAGCTC (7) 5' ACATACACGATGAGCTC
(8) 5'GGTGATCTTCTGCCCGGGACGCACAC(8) 5'GGTGATCTTCTGCCCGGGACGCACAC
(9) 5 'TCCTGTCCCGTTGAGTCT(9) 5'TCCTGTCCCGTTGAGTCT
(10) 5 'GTCAGAGTCCTCGGGGTAGTC(10) 5' GTCAGAGTCCTCGGGGTAGTC
9") Sondes nucleotidiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci selon l'une quelconque des revendi¬ cations 1 à 8, éventuellement marqué à l'aide d'un mar¬ queur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée ou tout autre substance non radioactive appropriée.9") Nucleotide probes, characterized in that they comprise a nucleotide sequence or a fragment thereof according to any one of claims 1 to 8, optionally marked using a marker such as a radioactive isotope, a suitable enzyme or any other suitable non-radioactive substance.
10') Sondes selon la revendication 9, carac- térisées en ce qu'elles sont choisies dans le groupe qui comprend les oligonucléotides de formule (1) à (5) , qui s'hybrident spécifiquement avec l'ARN génomique du virus10') Probes according to claim 9, characterized in that they are chosen from the group which comprises the oligonucleotides of formula (1) to (5), which hybridize specifically with the genomic RNA of the virus
SHV.SHV.
11*) Sondes selon la revendication 9, carac- térisées en ce qu'elles sont choisies dans le groupe qui comprend les oligonucléotides de formule (6) à (10), qui s'hybrident spécifiquement avec l'ARNm du virus SHV.11 * ) Probes according to claim 9, characterized in that they are chosen from the group which comprises the oligonucleotides of formula (6) to (10), which hybridize specifically with the mRNA of the SHV virus.
12') Paires d'amorces pour la synthèse d'un ADNc ou d'un ARN de virus SHV, caractérisées en ce que chaque amorce comprend une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique selon l'une quelconque des reven¬ dications 1 à 8.12') Pairs of primers for the synthesis of a cDNA or an RNA of SHV virus, characterized in that each primer comprises a sequence or a fragment of a nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 8 .
13*) Paires d'amorces selon la revendication 12, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par un oligonucléotide de formule (1) apparié à un oligonucléo¬ tide de formule (10) .13 * ) Pairs of primers according to claim 12, characterized in that they consist of an oligonucleotide of formula (1) paired with an oligonucleotide of formula (10).
14*) Peptide et/ou fragment de peptide, carac¬ térisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléo¬ tidique ou une combinaison de plusieurs fragments nucléo- tidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 15*) Peptide se'lon la revendication 14, carac¬ térisé en ce qu'il comprend 154 amino-acides et corres¬ pond au fragment COOH terminal de la protéine N.14 * ) Peptide and/or peptide fragment, characterized in that it is encoded by a nucleotide sequence or a combination of several nucleotide fragments according to any one of claims 1 to 7. 15 * ) Peptide according to claim 14, characterized in that it comprises 154 amino acids and corresponds to the terminal COOH fragment of the N protein.
16') Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une sé¬ quence nucléotidique selon l'une quelconque des revendi¬ cations 1 à 7.16') Recombinant cloning and/or expression vector, characterized in that it comprises a nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 7.
17*) Vecteur selon la revendication 16, carac¬ térisé en ce qu'il est constitué par un plasmide appro- prié comprenant une origine de réplication, au moins un marqueur de sélection et une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, lequel vecteur est un vecteur de clonage.17 * ) Vector according to claim 16, characterized in that it is constituted by an appropriate plasmid comprising an origin of replication, at least one selection marker and a nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 7, which vector is a cloning vector.
18*) Vecteur selon la revendication 17, carac- térisé en ce que ledit vecteur de clonage est constitué par un plasmide pUC13 dans lequel est insérée la séquence18 * ) Vector according to claim 17, characterized in that said cloning vector consists of a pUC13 plasmid into which the sequence is inserted
SHV-N2 de 1346 paires de bases selon la revendication 6, ledit plasmide étant dénommé PSHV-N2.SHV-N2 of 1346 base pairs according to claim 6, said plasmid being called PSHV-N2.
19*) Vecteur selon la revendication 18, carac- térisé en ce que la séquence SHV-N2 est insérée au niveau du site Sma I dudit plasmide.19 * ) Vector according to claim 18, characterized in that the SHV-N2 sequence is inserted at the Sma I site of said plasmid.
20*) Vecteur selon la revendication 17, carac¬ térisé en ce que ledit vecteur de clonage est constitué par un plasmide pBS dans lequel est insérée la séquence SHV-Nι_ de 1235 paires de bases selon la revendication 5, ledit plasmide étant dénommé pSHV-Nl.20 * ) Vector according to claim 17, characterized in that said cloning vector consists of a pBS plasmid into which the SHV-Nι_ sequence of 1235 base pairs according to claim 5 is inserted, said plasmid being called pSHV- Nl.
21") Vecteur selon la revendication 20, carac¬ térisé en ce que "la séquence SHV-N-]_ est insérée au niveau du site EcoR I dudit plasmide. 22") Vecteur selon la revendication 16, carac¬ térisé en ce qu'il est constitué par un vecteur recombi¬ nant approprié comprenant en particulier une origine de réplication dans un microorganisme hôte approprié, notam¬ ment une bactérie ou une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection soit des bac¬ téries, soit des cellules eucaryotes ayant reçu ledit vecteur, un promoteur permettant l'expression des gènes dans lesdites bactéries ou cellules eucaryotes, et dans lequel est insérée une séquence nucléotidique ou un frag¬ ment de séquence selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 7, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'un peptide, d'un fragment de peptide ou d'une combinai¬ son de fragments de peptides du virus SHV.21") Vector according to claim 20, characterized in that "the SHV-N- ] _ sequence is inserted at the EcoR I site of said plasmid. 22") Vector according to claim 16, characterized in that it consists of an appropriate recombinant vector comprising in particular an origin of replication in an appropriate host microorganism, in particular a bacterium or a eukaryotic cell, at least one gene whose expression allows the selection either of bacteria or of eukaryotic cells having received said vector, a promoter allowing the expression of genes in said bacteria or eukaryotic cells, and into which is inserted a nucleotide sequence or a fragment of sequence according to any one of claims 1 to 7, which vector is a vector expression of a peptide, a peptide fragment or a combination of peptide fragments of the SHV virus.
23") Vecteur selon la revendication 22, carac¬ térisé en ce que ledit vecteur d'expression est constitué par un plasmide pATHl dans lequel est inséré, en phase au niveau de son site Eco RI, le fragment Eco RI du plasmide pSHV-N2 selon la revendication 18 ou la revendication 19.23") Vector according to claim 22, characterized in that said expression vector is constituted by a plasmid pATHl in which is inserted, in phase at its Eco RI site, the Eco RI fragment of the plasmid pSHV-N2 according to claim 18 or claim 19.
24") Vecteur selon la revendication 22, carac¬ térisé en ce que ledit vecteur d'expression est constitué par un plasmide pUEX2 dans lequel est inséré, en phase au niveau de son site Sma I, le fragment Eco RI du plasmide pSHV-Nl selon la. revendication 20 ou la revendication 21.24") Vector according to claim 22, characterized in that said expression vector consists of a plasmid pUEX2 in which is inserted, in phase at its Sma I site, the Eco RI fragment of the plasmid pSHV-Nl according to claim 20 or claim 21.
25') Produit d'expression de la nucléoprotéine N, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans un vecteur d'expression recombinant selon l'une quelconque des revendications 22 à 24.25') N nucleoprotein expression product, characterized in that it is expressed in a recombinant expression vector according to any one of claims 22 to 24.
26*) Produit d'expression selon la revendica¬ tion 25, caractérisé en ce qu'il comprend la nucléopro¬ téine N ou un fragment de celle-ci et la β-galactosidase ou un fragment de celle-ci et est reconnu par des anti¬ corps monoclonaux spécifiques de la protéine N.26 * ) Expression product according to claim 25, characterized in that it comprises nucleoprotein N or a fragment thereof and β-galactosidase or a fragment thereof and is recognized by monoclonal antibodies specific for the N protein.
27*) Produit d'expression selon la revendica¬ tion 25, caractérisé en ce qu'il comprend la nucléopro¬ téine N du virus de la SHV ou un fragment de celle-ci et le trpE ou un fragment de celui-ci et est reconnu par des anticorps monoclonaux spécifiques de la protéine N.27 * ) Expression product according to claim 25, characterized in that it comprises the nucleoprotein N of the SHV virus or a fragment thereof and trpE or a fragment thereof and is recognized by monoclonal antibodies specific for the N protein.
28*) Cellule hôte appropriée obtenue par transformation génétique, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression selon l'une quel- conque des revendications 22 à 24. 29") Cellule hôte selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'il s'agit notamment de Sac¬ charomyces cerevisiae transformée par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 22 à 24.28 * ) Suitable host cell obtained by genetic transformation, characterized in that it is transformed by an expression vector according to any one of claims 22 to 24. 29") Host cell according to claim 28, characterized in that it is in particular Sac¬ charomyces cerevisiae transformed by an expression vector according to any one of claims 22 to 24.
30") Processus "d'expression d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 14 et 15 ou 25 à 27, caractérisé en ce que la cellule hôte résultant de la transformation avec un vecteur contenant une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci codant pour une protéine comprenant la nucléoprotéine N ou un fragment de celle-ci, est cultivée de manière à produire et accumuler ledit peptide, qui est ensuite collecté.30") Process for expressing a peptide according to any one of claims 14 and 15 or 25 to 27, characterized in that the host cell resulting from the transformation with a vector containing a nucleotide sequence or a fragment thereof -it encoding a protein comprising the N nucleoprotein or a fragment thereof, is cultivated so as to produce and accumulate said peptide, which is then collected.
31") Composition à pouvoir immunogene et/ou protecteur, caractérisée en ce qu'elle comprend un pep¬ tide selon l'une quelconque des revendications 14 et 15 ou 25 à 27, éventuellement associé à au moins une autre substance immunogene ou immunostimulante et/ou à un véhi¬ cule pharmaceutiquement acceptable. 32") Composition selon la revendication 31, caractérisée en ce que la nucléoprotéine N présente une séquence en acides aminés qui répond à la formule II ci- après : Mét-Glu-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-Phé-Ser-Gly-Leu-Asn-Asp- Val-Arg-Ile-Asp-Pro-Thr-Gly-Gly-Glu-Gly-Arg-Val-Leu-Val- Pro-Gly-Glu-Val-Glu-Leu-Ile-Val-Tyr-Val-Gly-Glu-Phé-Gly- Glu-Glu-Asp-Arg-Lys-Val-Ile-Val-Asp-Ala-Leu-Ser-Ala-Leu- Gly-Gly-Pro-Gln-Thr-Val-Gln-Ala-Leu-Ser-Val-Leu-Leu-Ser- Tyr-Val-Leu-Gln-Gly-Asn-Thr-Gln-Glu-Asp-Leu-Glu-Thr-Lys- Cys-Lys-Val-Leu-Thr-Asp-Mét-Gly-Phé-Lys-Val-Thr-Gln-Ala- Val-Arg-Ala-Thr-Ser-Ile-Glu-Ala-Gly-Ile-Mét-Mét-Pro-Mét- Arg-Glu-Leu-Ala-Leu-Thr-Val-Asn-Asp-Asp-Asn-Leu-Mét-Glu- Ile-Val-Lys-Gly130-Thr-Leu-Mét-Thr-Cys-Ser-Leu-Leu-Thr- Lys-Tyr-Ser-Val-Asp-Lys-Met-Ile-Lys-Tyr-Ile-Thr-Lys-Lys- Leu-Gly-Glu-Leu-Ala-Asp-Thr-Gln161-Gly-Val-Gly-Glu-Leu- Gln-His-Phe-Thr-Ala-Asp-Lys-Ala-Ala-Ile-Arg-Lys-Leu-Ala- Gly-Cys-Val-Arg-Pro-Gly-Glή-Lys-Ile-Thr-Lys-Ala-Leu-Tyr- Ala-Phe-Ile-Leu-Thr-Glu-Ile-Ala-Asp-Pro-Thr-Thr-Gln-Ser- Arg-Val-Pro-Ser-Met-Gly-Ala-Leu-Arg-Leu-Asn-Gly-Thr-Gly- Met-Thr-Met-Ile-Gly-Leu-Phe-Thr-Gln-Ala-Ala-Asn-Asn-Leu- Gly-Ile-Ala-Pro-Ala-Lys-Leu-Leu-Glu-Asp-Leu-Cys-Met-Glu- Ser-Leu-Val-Glu-Ser-Ala-Arg-Arg-Ile-Ile-Gln-Leu-Met-Arg- Gln-Val-Ser-Glu-Ala-Lys-Ser-Ile-Gln-Glu-Arg-Tyr-Ala-Ile- Met-Met-Ser-Arg-Met-Leu-Gly-Glu-Ser-Tyr-Tyr-Lys-Ser-Tyr- Gly-Leu-Asn-Asp-Asn-Ser-Lys-Ile-Ser-Tyr-Ile-Leu-Ser-Gln- Ile-Ser-Gly-Lys-Tyr-Ala-Val-Asp-Ser-Leu-Glu-Gly-Leu-Glu- Gly-Ile-Lys-Val-Thr-Glu-Lys-Phe-Arg-Glu-Phe-Ala-Glu-Leu- Val-Ala-Glu-Val-Leu-Val-Asp-Lys-Tyr-Glu-Arg-Ile-Gly-Glu- Asp-Ser-Thr-Glu-Val-Ser-Asp-Val-Ile-Arg-Glu-Ala-Ala-Arg- Gln-His-Ala-Arg-Arg-Thr-Ser-Ala-Lys-Pro-Glu-Pro-Lys-Ala- Arg-Asn-Phe-Arg-Ser-Ser-Thr-Gly-Arg-Gly-Arg-Glu-Gln-Glu- Thr-Gly-Glu-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Tyr-Pro-Glu-Asp-Ser-Asp éventuellement associé à au moins une autre substance immunogene ou immunostimulante et/ou à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 33*) Composition selon la revendication 31 ou la revendication 32, caractérisée en ce que le peptide selon l'une quelconque des revendications 14 et 15 ou 25 à 27 et/ou la protéine N est associé à la protéine G du virus de la SHV ou un à fragment de celle-ci. 34") Composition à pouvoir immunogene et/ou protecteur, caractérisée en ce qu'elle comprend une cel¬ lule hôte transformée selon la revendication 28 ou la revendication 29, inactivée de manière appropriée.31") Composition with immunogenic and/or protective power, characterized in that it comprises a pep¬ tide according to any one of claims 14 and 15 or 25 to 27, optionally associated with at least one other immunogenic or immunostimulating substance and /or to a pharmaceutically acceptable vehicle. 32") Composition according to claim 31, characterized in that the nucleoprotein N has an amino acid sequence which corresponds to formula II below: Met-Glu-Gly-Gly- Ile-Arg-Ala-Ala-Phé-Ser-Gly-Leu-Asn-Asp- Val-Arg-Ile-Asp-Pro-Thr-Gly-Gly-Glu-Gly-Arg-Val-Leu-Val- Pro- Gly-Glu-Val-Glu-Leu-Ile-Val-Tyr-Val-Gly-Glu-Phé-Gly- Glu-Glu-Asp-Arg-Lys-Val-Ile-Val-Asp-Ala-Leu-Ser- Ala-Leu- Gly-Gly-Pro-Gln-Thr-Val-Gln-Ala-Leu-Ser-Val-Leu-Leu-Ser- Tyr-Val-Leu-Gln-Gly-Asn-Thr-Gln-Glu- Asp-Leu-Glu-Thr-Lys- Cys-Lys-Val-Leu-Thr-Asp-Mét-Gly-Phé-Lys-Val-Thr-Gln-Ala- Val-Arg-Ala-Thr-Ser-Ile- Glu-Ala-Gly-Ile-Mét-Mét-Pro-Mét- Arg-Glu-Leu-Ala-Leu-Thr-Val-Asn-Asp-Asp-Asn-Leu-Mét-Glu- Ile-Val-Lys- Gly 130 -Thr-Leu-Mét-Thr-Cys-Ser-Leu-Leu-Thr- Lys-Tyr-Ser-Val-Asp-Lys-Met-Ile-Lys-Tyr-Ile-Thr-Lys-Lys- Leu -Gly-Glu-Leu-Ala-Asp-Thr-Gln 161 -Gly-Val-Gly-Glu-Leu- Gln-His-Phe-Thr-Ala-Asp-Lys-Ala-Ala-Ile-Arg-Lys- Leu-Ala- Gly-Cys-Val-Arg-Pro-Gly-Glή-Lys-Ile-Thr-Lys-Ala-Leu-Tyr- Ala-Phe-Ile-Leu-Thr-Glu-Ile-Ala-Asp-Pro-Thr- Thr-Gln-Ser- Arg-Val-Pro-Ser-Met-Gly-Ala-Leu-Arg-Leu-Asn-Gly-Thr-Gly- Met-Thr-Met-Ile-Gly-Leu-Phe-Thr- Gln-Ala-Ala-Asn-Asn-Leu- Gly-Ile-Ala-Pro-Ala-Lys-Leu-Leu-Glu-Asp-Leu-Cys-Met-Glu- Ser-Leu-Val-Glu-Ser- Ala-Arg-Arg-Ile-Ile-Gln-Leu-Met-Arg- Gln-Val-Ser-Glu-Ala-Lys-Ser-Ile-Gln-Glu-Arg-Tyr-Ala-Ile- Met-Met- Ser-Arg-Met-Leu-Gly-Glu-Ser-Tyr-Tyr-Lys-Ser-Tyr- Gly-Leu-Asn-Asp-Asn-Ser-Lys-Ile-Ser-Tyr-Ile-Leu-Ser- Gln- Ile-Ser-Gly-Lys-Tyr-Ala-Val-Asp-Ser-Leu-Glu-Gly-Leu-Glu- Gly-Ile-Lys-Val-Thr-Glu-Lys-Phe-Arg-Glu- Phe-Ala-Glu-Leu- Val-Ala-Glu-Val-Leu-Val-Asp-Lys-Tyr-Glu-Arg-Ile-Gly-Glu-Asp-Ser-Thr-Glu-Val-Ser-Asp- Val-Ile-Arg-Glu-Ala-Ala-Arg- Gln-His-Ala-Arg-Arg-Thr-Ser-Ala-Lys-Pro-Glu-Pro-Lys-Ala- Arg-Asn-Phe-Arg- Ser-Ser-Thr-Gly-Arg-Gly-Arg-Glu-Gln-Glu-Thr-Gly-Glu-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Tyr-Pro-Glu-Asp-Ser-Asp possibly associated with at least one other immunogenic or immunostimulating substance and/or a pharmaceutically acceptable vehicle. 33 * ) Composition according to claim 31 or claim 32, characterized in that the peptide according to any one of claims 14 and 15 or 25 to 27 and/or the N protein is associated with the G protein of the SHV virus or a fragment thereof. 34") Composition with immunogenic and/or protective power, characterized in that it comprises a host cell transformed according to claim 28 or claim 29, inactivated appropriately.
35*) Composition selon la revendication 34, caractérisée en ce qu'elle comprend du Saccharomyces cerevisiae transformé par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 22 à 24.35 * ) Composition according to claim 34, characterized in that it comprises Saccharomyces cerevisiae transformed by an expression vector according to any one of claims 22 to 24.
36*) Réactif de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend des fragments selon l'une quelconque des revendications 14 et 15, y compris la nucléoprotéine N. 37') Procédé de"détection du virus SHV, carac¬ térisé en ce qu'il consiste à détecter un virus SHV à l'aide d'au moins une sonde nucléotidique ou un fragment de sonde nucléotidique selon l'une quelconque des reven- dications 9 à 11, en mettant en présence l'échantillon à analyser avec ladite/lesdites sondes nucleotidiques, à laquelle/auxquelles se lie l'ARN génomique ou les pro¬ duits de transcription du virus SHV, si de tels produits sont présents dans l'échantillon, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié, notamment EA, RA, fluorescence.36 * ) Diagnostic reagent, characterized in that it comprises fragments according to any one of claims 14 and 15, including the N nucleoprotein. 37') Method for "detecting the SHV virus, characterized in that it consists of detecting an SHV virus using at least one nucleotide probe or a fragment of a nucleotide probe according to any one of the reven- dications 9 to 11, by bringing the sample to be analyzed into contact with said nucleotide probe(s), to which the genomic RNA or transcription products of the SHV virus bind, if such products are present in the sample, the reading of the result being revealed by an appropriate means, in particular EA, RA, fluorescence.
38") Procédé selon la revendication 37, carac¬ térisé en ce que préalablement à l'hybridation avec les¬ dites sondes, on amplifie la séquence nucléique à détec- ter (ARN génomique ou ARN messager du virus SHV notam¬ ment) par la méthode d'amplification dite PCR (réaction de polymérisation en chaîne en présence d'une polymérase appropriée, notamment la- Taq polymérase) en utilisant une paires d'amorces selon la revendication 12 ou la revendi- cation 13.38") Method according to claim 37, characterized in that prior to hybridization with said probes, the nucleic sequence to be detected (genomic RNA or messenger RNA of the SHV virus in particular) is amplified by amplification method known as PCR (polymerase chain reaction in the presence of an appropriate polymerase, in particular Taq polymerase) using a pair of primers according to claim 12 or claim 13.
39") Procédé selon la revendication 38, carac¬ térisé en ce que la paire d'amorces est de préférence 1 'oligonucléotide de formule (1) apparié à l'oligo¬ nucléotide de formule (10) . 40") Procédé de détection d'anticorps anti¬ virus SHV, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter les anticorps anti-virus SHV éventuellement présents dans un échantillon biologique à l'aide d'un peptide ou frag¬ ment de peptides selon l'une quelconque des revendica- tions 14 et 15, ou d'un réactif selon la revendication 37, éventuellement fixé sur un support solide approprié, en mettant en présence ledit échantillon biologique avec ledit/lesdits peptides ou fragment(s) de peptides, auxquels se lient les anticorps anti-virus SHV si de tels anticorps sont présents dans l'échantillon à analyser, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié, notamment EIA, RIA, fluorescence.39") Method according to claim 38, characterized in that the pair of primers is preferably the oligonucleotide of formula (1) paired with the oligonucleotide of formula (10). 40") Detection method of anti-SHV virus antibodies, characterized in that it consists of detecting the anti-SHV virus antibodies possibly present in a biological sample using a peptide or fragment of peptides according to any one of the claims - tions 14 and 15, or a reagent according to claim 37, optionally fixed on an appropriate solid support, by bringing said biological sample into contact with said peptide(s) or fragment(s) of peptides, to which the anti-antibodies bind -SHV virus if such antibodies are present in the sample to be analyzed, the reading of the result being revealed by an appropriate means, in particular EIA, RIA, fluorescence.
41") Kit, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de détection du virus SHV selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection, des doses appropriées d'au moins une sonde et/ou fragment de sonde nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 et éven- tuellement des doses appropriées d'au moins deux amorces selon la revendication 12 ou la revendication 13.41") Kit, ready for use, for implementing the method for detecting the SHV virus according to claim 37, characterized in that it further comprises useful quantities of buffers suitable for carrying out said detection , appropriate doses of at least one probe and/or nucleotide probe fragment according to any one of claims 9 to 11 and optionally appropriate doses of at least two primers according to claim 12 or claim 13.
42") Kit, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de détection d'anticorps anti-virus SHV selon la revendication 39, caractérisé en ce qu'il comprend, outre des quantités utiles de tampons ap¬ propriés pour la mise en oeuvre de ladite détection, des doses appropriées d'au moins un peptide et/ou un fragment peptidiquê selon l'une quelconque des revendications 14 et 15, ou d'un réactif selon la revendication 36. 43") Application des séquences nucleotidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou des fragments de celles-ci, à l'obtention d'animaux généti¬ quement modifiés. 42") Kit, ready for use, for implementing the method for detecting anti-SHV virus antibodies according to claim 39, characterized in that it comprises, in addition to useful quantities of buffers suitable for the implementation of said detection, appropriate doses of at least one peptide and/or a peptide fragment according to any one of claims 14 and 15, or of a reagent according to claim 36. 43") Application of the sequences nucleotides according to any one of claims 1 to 7 or fragments thereof, to obtain genetically modified animals.
PCT/FR1991/000198 1990-03-12 1991-03-12 Cdna coding for the gene n of the viral haemorrhagic septicaemia virus and utilizations thereof WO1991013987A1 (en)

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