WO1991007663A1 - Recherches sur la proliferation et la differentiation de certaines cellules sous certaines conditions et leurs consequences - Google Patents

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Definitions

  • the cells of this line are usually maintained at 37 ° C in "normal" medium (RPM1 1640, fetal calf serum 10%, Penicillin - Streptomycin - Neomycin 1%, Glutamine 1%) at a rate of 0.5 x 10 cel ⁇ lules / ml.
  • the living cells are counted after staining with trypan blue and then centrifuged for 10 minutes at 1,500 rpm. The cells are then resuspended in a normal medium at the concentration of 0.5 x 10 cells / ml and gassed (mixture of oxygen, nitrogen and carbon dioxide).
  • Acetylcholine is the neuromediator that was chosen because it is released during orgasm and during the act of crime and because cholinergic neurons are directly involved in thermo- regulation allowing an interpretation to be given to the heterosexual mode of transmission of the disease, for example in Black Africa.
  • the cells ⁇ - q -. 7 said to be indistinguishable and not infected with mycoplasmas are amplified in a normal RPM1 medium (RPMI 1640, SVF 10%, PSN 1%, Glutamine 1%) up to the final quantity of 126 million cells maintained at the concentration of 800,000 cells / ml.
  • the cells are washed in RPMI 1640 (two successive centrifugations of 5 minutes at 1500 rpm) and resuspended in each bottle at the concentration of 0.5 x 10 cells / ml.
  • Immunostaining relates to cells maintained at 37 ° C. They are carried out in a non-sterile manner at ambient temperature and partly at + 4 ° C. (incubations) after a pause time of 2 h at ambient temperature, ie at ⁇ R. . The cells are centrifuged for one minute at 10,000 rpm before being resuspended in 50 ⁇ l of an IgG antibody solution, of anti-human mice, 0KT.A, I0T diluted respectively 1/50, 1/30 and 1/30 in PBS-FCS 20. After incubation for 30 minutes at + 4 ° C., the cells are centrifuged for one minute (10,000 rpm) before being washed once in labeling medium.
  • the cells After incubation for 30 minutes at + 4 ° C., the cells are centrifuged for one minute (10,000 rpm) and then washed twice in labeling medium.
  • the immunostaining is carried out entirely at + 4 ° C. on cells washed with all traces of acetylcholine for 41 h and not transplanted. - at t, n _ (overnight cooling stress): lUu ⁇
  • the immunostaining is carried out entirely at + 4 ° C. on cells maintained overnight at + 4 ° C., not transplanted, and washed with all traces of acetylcholine for 84 h.
  • the slide is mounted with 10 ⁇ l of a PBS-glycerol solution (1 vol / 9 vol) and luted with nail varnish. The results are read under an epifluorescence microscope.
  • PBS-FCS 20% for the identification of 100% of the target cells of the virus This method will allow the identification of the nature of the various HIV retroviruses selected by these cells and in particular of a non-pathogenic, low-energy retrovirus, and who will be trapped there.
  • the low pathogenic HIV retrovirus can serve as an immune vaccine: it will exclusively destroy cells infected with the HIV virus when they are stressed.
  • the integration of the anhidrotic ectodermal dysplasia gene into the genome of U qz , - cells, and cells where it is deficient, and the study of its expression under permanent or intermittent cooling stress conditions during immunostaining and in conditions of absence of subculturing of these cells will constitute a marker of the infectivity and of the infectious power of the HIV virus.
  • This marker will be the HSP 70 heat shock protein or an unidentified cooling stress protein or an antibody directed against the peptide signal of the myc protein or the soluble factor nt ...
  • This method will also apply to the study of cells of the immune system of healthy men or people suffering from chronic diseases where stress factors play a triggering or aggravating role and o f the involvement of retroviruses is suspected but not yet demonstrated (psoriasis, male or female breast cancer, auto sterility, chronic mycoplasma infections, manic-depressive psychosis, schizophrenia, hypertension for example in Black Africa , seasickness, space sickness, AIDS, etc ).

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Abstract

Mise au point d'une méthode de culture cellulaire prenant en compte les capacités de résistance à différents types de stress et sélectionnant certaines sous-populations de cellules et certains virus. Application à la meilleure compréhension et à la prévention de maladies chroniques où les facteurs de stress jouent un rôle déclenchant ou aggravant et dans lesquelles la participation de rétrovirus est soupçonnée mais non encore démontrée.

Description

Recherches sur la prolifération et la différentiation de certaines cellules sous certaines conditions et leurs conséquences.
La présente invention concerne les moyens (produits et procédés) d'études des mécanismes d'entrée du virus HIV et de son tropisme dans une lignée cellulaire monocytaire immature continue T.+ qui est un des modèles classiques employés dans la recherche des mécanismes impliqués dans la cytotoxicité cellulaire à médiation d'anticorps = la lignée Ug-,7 dite indifférentiable et non infectable par les mycoplasmes. Les cellules de cette lignée sont habituellement entretenues à 37°C dans du milieu "normal" (RPM1 1640, sérum de veau foetal 10 %, Pénicilline - Streptomycine - Néomycine 1 %, Glutamine 1 %) à raison de 0,5 x 10 cel¬ lules/ml. Tous les deux ou trois jours, les cellules vivantes sont comptées après coloration au bleu trypan puis centrifugées 10 minutes à 1 500 rpm. Les cellules sont alors resuspendues dans un milieu normal à la concentra¬ tion de 0,5 x 10 cellules/ml et gazées (mélange d'oxygène, d'azote et de gaz carbonique).
Partant du principe que les malades atteints de Sida sont stressés avant, pendant et après l'infection par le retrovirus HIV, que les stress sont à la fois la cause et la conséquence d'un "neural mismatch" susceptible d'interférer avec l'affinité des récepteurs muscariniques comme c'est le cas notamment dans le mal de l'espace (en association avec un trouble de l'affinité des récepteurs aux endorphines comme dans les toxicomanies et en association avec un trouble de l'affinité des récepteurs aux glucocorticoïdes) et dans les psychoses de type maniaco¬ dépressif (notamment après l'arrêt brutal d'un traitement prolongé par un antidépresseur anticholinergique) et que ces stress diminuent l'expression de CD. et de CD„, une nouvelle méthode de culture et d'immunomarquage a été mise au point. Elle part du principe qu'il existe un point commun à tous les sujets contaminables et contaminés par le virus HIV : l'hyperactivation des neurones cholinergiques destinée à compenser les effets bloquants d'une contrainte passée et à l'origine d'un épuisement progressif des capacités de synthèse de la choline-acétyl-transférase par ces neurones (épuisement déjà constaté au stade de la séropositivité) . L'acétylcholine est le neuromédiateur qui a été choisi car il est libéré pendant l'orgasme et pendant le passage à l'acte criminel et parce que les neurones cholinergiques sont directement impliqués dans la thermo- régulation permettant de donner une interprétation au mode de transmission hétérosexuel de la maladie, par exemple en Afrique Noire.
La technique préférée de mise en oeuvre des procédés et méthodes selon l'invention est indiquée dans la description détaillée qui suit :
Préparation des cellules :
Les cellules \-q-.7 dites indifférentiables et non infectées par les mycoplasmes sont amplifiées dans un milieu RPM1 normal (RPMI 1640, SVF 10 %, PSN 1 %, Glutamine 1 %) jusqu'à la quantité finale de 126 millions de cellules maintenues à la concentration de 800 000 cellules/ml.
Elles sont resuspendues en milieu RPMI 1640 normal à la concentration y de 10 cellules/ml.
Traitement des cellules par l'acétylcholine :
12 millions de ces cellules sont répartis dans 5 flacons et traités une nuit (16 h) à 37°C par différentes dilutions d'acétylcholine en eau ssttéérriillee :: 1100~~10 M, 10-9 M, 10"8 M, 10"7 M. Le cinquième flacon est le flacon témoin.
Lavage des cellules traitées et non traitées :
Les cellules sont lavées en RPMI 1640 (deux centrifugations successives de 5 minutes à 1 500 rpm) et remises en suspension dans chaque flacon à la concentration de 0,5 x 10 cellules/ml.
Préincubation des cellules en PBS-FCS 20 % :
500 Λ.1 des différentes populations de cellules sont distribués dans des tubes eppendorf et centrifugés une minute à 10 000 rpm. Une solution de 50 l de PBS-FCS 20 % est ensuite ajoutée aux culots 1/2 h à + 4°C.
Immunomarquages :
- à t.,. (stress refroidissants répétés) :
Les immunomarquages portent sur des cellules entretenues à 37°C. Ils sont réalisés de manière non stérile à température ambiante et en partie à + 4°C (incubations) après un temps de pause de 2 h à température ambiante, soit à ^ R. . Les cellules sont centrifugées une minute à 10 000 rpm avant d'être resuspendues dans 50 ul d'une solution d'anticorps IgG, de souris anti- Homme, 0KT.A, I0T dilués respectivement au 1/50, au 1/30 et au 1/30 en PBS-FCS 20 . Après incubation 30 minutes à + 4°C, les cellules sont centrifugées une minute (10000 tours/ mn) avant d'être lavées une fois en milieu de marquage.
La présence des anticorps fixés aux cellules est révélée par l'addition de 50 „,! d'une dilution au 1/30 des i munoglobines de chèvre anti-souris marquées à la fluorescéine.
Après incubation 30 minutes à + 4°C, les cellules sont centrifu¬ gées une minute (10000 tours/ mn) puis lavées deux fois en milieu de marquage.
- à -.ç.. (stress refroidissant permanent) : Les immunomarquages sont réalisés en totalité à + 4°C sur des cellules lavées de toute trace d'acetylcholine depuis 14 h.
" à ^h :
Les immunomarquages sont réalisés en totalité à + 4°C sur des cellules lavées de toute trace d'acetylcholine depuis 41 h et non repiquées. - à t,n _ (stress refroidissant d'une nuit) : lUuπ
Les immunomarquages sont réalisés en totalité à + 4°C sur des cellules entretenues une nuit à + 4°C, non repiquées, et lavées de toute trace d'acetylcholine depuis 84 h.
Lecture des résultats :
La lame est montée avec 10 υl d'une solution de PBS-glycerol (1 vol/ 9 vol) et lutée au vernis a ongle. La lecture des résultats se fait au microscope à épifluorescence.
Mise en évidence par cette méthode d'une double population de cellules
:
- cellules T.+ résistantes à l'infection par le retrovirus HIV quand elles sont stressées : population de cellules antérieurement exposées à
1 nM d'acetylcholine et à la surface desquelles l'amplitude du signal lumineux transmis par RFcy à T. est diminuée. - cellules T.+ infectables par le retrovirus HIV quand elles sont stressées : population de cellules antérieurement exposées à 100 nM d'ace¬ tylcholine et à la surface desquelles l'amplitude du signal lumineux transmis par RFcv"à T est augmentée. Ces cellules seront triées et clonées. Pour le triage des cellules Un.,- cultivées et marquées dans ces conditions, l'utilisation de sérum- albumine à 20 % dans du PBS-FCS 1 % sera plus appropriée que la solution de sérum de veau foetal (PBS-FCS 20 %) à l'identification de 100 % des cellules cibles du virus. Cette méthode permettra l'identification de la nature des différents retrovirus HIV sélectionnés par ces cellules et notamment d'un retrovirus non pathogène, peu énergétique, et qui y sera piégé.
Le retrovirus HIV peu pathogène pourra servir de vaccin immunitaire : il détruira exclusivement les cellules infectables par le virus HIV lorsqu'elles sont stressées.
On pourra l'intégrer à l'oeuf humain et protéger ainsi l'organisme tout entier : pour cela, on pourra utiliser comme vecteur de ce vaccin le matériel génétique contenu dans le spermatozoïde. Le procédé s'applique donc à l'utilisation du spermatozoïde (éventuellement par microinjection) comme vecteur de retrovirus HIV peu pathogènes permettant à l'oeuf conservé par congélation de se différentier sans apport supplémentaire de forskoline lors de la décongélation et de protéger l'organisme tout entier des effets du stress refroidissant.
L'intégration du gène de la dysplasie ectodermique anhidrotique au génome des cellules Uqz,-, et de cellules où il serait déficient, et l'étude de son expression dans des conditions de stress refroidissants permanents ou intermittents lors de l'immunomarquage et dans des conditions d'absence de repiquage de ces cellules constituera un marqueur de l'infectabilité e du pouvoir infectieux du virus HIV. Ce marqueur sera la protéine de choc thermique HSP 70 ou une protéine de stress refroidissant non encor identifiée ou un anticorps dirigé contre le signal peptide de la protéine myc ou le facteur soluble nt...
Cette méthode s'appliquera aussi à l'étude des cellules du systèm immunitaire de l'homme en bonne santé ou atteint de maladies chronique où les facteurs de stress jouent un rôle déclenchant ou aggravant et o f la participation de retrovirus est soupçonnée mais non encore démontrée (psoriasis, cancer du sein de l'homme ou de la femme, stérilités auto- i munes, infections chroniques à mycoplasmes, psychose maniaco-dépressive, schizophrénies, hypertension par exemple en Afrique Noire, mal de mer, mal de l'espace, Sida, etc ...).
Les conséquences et les retombées de ces découvertes tant dans le domaine pharmacologique que dans le domaine de l'industrie chimique sont nombreuses et on peut, notamment, citer les applications suivantes parmi les plus importantes : a) Application du procédé à l'étude des relations fonctionnelles existant entre les conditions d'adhérence, la cytotoxicité cellulaire à médiation d'anticorps, les variations de température, le degré de salinité du milieu et le vieillissement cellulaire. b) Application du procédé à l'étude des conséquences du dysfonc- tionnement des cellules d'origine histio-monocytaire sur les relations qui existent entre l'affinité des récepteurs pour l'acetylcholine, les possibilités de concentration du virus HIV et la qualité de la préacti- vation des précurseurs des cellules T suppressives par l'interleukine 1. c) Application du procédé à l'étude des troubles engendrés par un excès ou un défaut de contre-suppression portant sur les lymphocytes T helper immatures et les macrophages stressés. d) Application du procédé à d'autres cellules cytotoxiques-suppressives notamment d'origine ly phocytaire. e) Application du procédé à l'étude du dysfonctionnement d'autres cellules de la lignée histio-monocytaire, notamment les cellules de
Langerhans parce que l'acetylcholine active la prolifération des kérati- nocytes et les cellules microgliales du cerveau parce que l'acetylcholine est libérée dans le cerveau pendant l'orgasme et lors du passage à l'acte criminel. f) Application du procédé à l'étude de produits susceptibles d'inter¬ férer avec la durée de l'action de l'acetylcholine, notamment en inhibant l'action de l'acétylcholinestérase (comme le font les armes chimiques utilisées lors de la guerre Iran-Irak) et donc avec la sélection immuno- logique de différents retrovirus susceptibles d'altérer le système immunitaire ainsi que le fonctionnement de n'importe quel organe. g) Application du procédé à l'étude des perturbations du système immunitaire provoquées par un "neural mismatch", notamment lors des troubles de la thermorégulation ou engendrés par les stress associés à l'idée de mort et lors des troubles de l'adaptation à l'apesanteur ou au contraire aux accélérations subies lors des centrifugations. h) Application du procédé à la correction éventuelle des perturbations citées plus haut par les techniques de désensibilisation aux stress utilisées en médecine aérospatiale en préparation des vols habités dans l'espace.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production de cellules capables, lorsqu'elles sont stressées, de proliférer en l'absence d'exposition à tout antigène étranger puis de devenir les cellules-cibles et les cellules résistantes au virus HIV.
L'originalité de ce procédé tient à ce qu'il prend en compte la varia¬ bilité des capacités de fixation des anticorps I0Ta ainsi que sa limitation conditionnée par la qualité des mécanismes d'adaptation au froid de ces cellules repiquées et non repiquées.
Ce procédé est caractérisé en ce qu'il consiste à partir de cellules Ug,7 dites indifférentiables et non infectables par les mycoplasmes à les mettre en présence d'acetylcholine dans des conditions de surpopulation cellulaire, à les laver à température ambiante en présence de RPMI 1640, et aux différents temps de l'expérience, à les remettre en culture à diffé¬ rentes températures et à une concentration ne mettant pas en jeu la vie de ces cellules et à les marquer à froid : pour ce faire, les cellules sont préincubées à + 4°C en PBS FCS 20 % et soumises à un stress refroidissant intermittent ou permanent susceptible de conditionner les qualités des marquages réalisés à l'aide de différents anticorps monoclonaux et polyclonaux se fixant ou se détachant de récepteurs RFcY différents, notamment en ce qui concerne les anticorps 0KT.A, 10Tfi et les anticorps de chèvre anti-souris fluorescents directement impliqués dans les mécanismes de reconnaissance et de pénétration des cellules par les virus HIV. Toutes les incubations sont suivies d'une centrifugation à 10 000 tours/ mn et de lavages en milieu de marquage.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'en présence
-10 -9 -8 d'acetylcholine utilisée à une concentration de 10 M, 10 M, 10 M,
-7 10 M, le stress refroidissant intermittent est effectue de la température ambiante à + 4°C au moment de la préincubation en PBS FCS 20 %, après deux heures de pause à température ambiante, puis de la température ambiante à
+ 4°C au moment des incubations portant sur des cellules repiquées, préalablement cultivées comme de coutume à 37°C.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'en absence d'acetylcholine, préalablement éliminée par le lavage, le stress refroi¬ dissant permanent est effectué de 37°C à + 4°C pendant la totalité de l'immunomarquage sur des cellules cultivées à 37°C, non repiquées mais préincubées à + 4°C en PBS FCS 20 %.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'en absence d'acetylcholine, préalablement éliminée par le lavage, les marquages à froid portent, à tιnr). , sur des cellules non repiquées, cultivées à + 4°C pendant une nuit et préincubées à + 4°C en PBS FCS 20 %.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le lavage en RPMI 1640 comporte deux centrifugations de 5 minutes à 1 500 rpm à tempéra¬ ture ambiante.
6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les anti¬ corps 0KT.A, I0TR, anticorps de chèvre anti-souris marqués à la fluo- rescéiπe, les IgG- de souris anti-Homme sont respectivement dilués au 1/30 en PBS FCS 20 % pour les trois premiers anticorps et au 1/50 pour le dernier.
7. Application du procédé à l'identification de la nature des diffé¬ rents retrovirus HIV sélectionnés par ces cellules et notamment de retrovirus non pathogènes, peu énergétiques et susceptibles d'y être piégés.
8. Application du procédé à la fabrication de vaccins immunitaires à partir de ces retrovirus non pathogènes obtenus dans la revendication 7, susceptibles de détruire exclusivement les cellules infectables par le virus HIV lorsqu'elles sont stressées.
9. Application du procédé à d'autres cellules onocytaires exprimant, comme la lignée Ug37, les récepteurs T., T„ et RFcv" de façon à étudier les relations qui existent entre les troubles de la différentiation cellulaire, la résistance aux mycoplasmes et la sensibilité aux retrovirus HIV.
10. Application du procédé aux cellules monocytaires de sujets atteints de maladies chroniques où les facteurs de stress jouent un rôle déclenchant ou aggravant (psoriasis, cancer du sein, stérilités auto- immunes, infections chroniques à mycoplasmes, psychose maniaco-dépressive, schizophrénies, hypertension par exemple en Afrique Noire, mal de mer, mal de l'espace, Sida, etc.).
11. Application du procédé à la mise au point d'une méthode permettant de lier les perturbations de ces cellules aux manifestations cliniques des maladies chroniques citées au paragraphe 10 et de faire disparaître ces perturbations.
12. Application du procédé à l'étude de l'expression du gène de la dysplasie ectodermique anhidrotique qui, dans ces conditions de stress, est susceptible de provoquer une brusque et violente augmentation de tempéra¬ ture ainsi que l'augmentation de la salinité du milieu. Application du pro¬ cédé à l'intégration de ce gène dans des cellules où il serait déficient.
13. Application du procédé à la recherche de facteurs suppresseurs ou helper, notamment le facteur nt- soluble.
14. Application du procédé à l'utilisation du spermatozoïde (éven¬ tuellement par microinjection) comme vecteur de retrovirus HIV peu pathogènes permettant à l'oeuf conservé par congélation de se différentier sans apport supplémentaire de forskoline lors de la décongélation et de protéger l'organisme tout entier des effets du stress refroidissant.
15. Les conséquences et les retombées de ces découvertes tant dans le domaine pharmacologique que dans le domaine de l'industrie chimique sont nombreuses et on peut, notamment, citer les applications suivantes parmi les plus importantes : a) Application du procédé à l'étude des relations fonctionnelles existant entre les conditions d'adhérence, la cytotoxicité cellulaire à médiation d'anticorps, les variations de température et du degré de salinité du milieu (impliquant notamment les récepteurs de l'acetylcholine, des endorphines et des glucocorticoïdes), et le vieillissement cellulaire. ιo b) Application du procédé à l'étude des conséquences du dysfonction¬ nement des cellules d'origine histio-monocytaire sur les relations qui existent entre l'affinité des récepteurs pour l'acetylcholine, les possibilités de concentration du virus HIV et la qualité de la préacti- vation des précurseurs des cellules T suppressives par l'interleukine 1. c) Application du procédé à l'étude des troubles engendrés par un excès ou un défaut de contre-suppression portant sur les lymphocytes T helper immatures et les macrophages stressés. d) Application du procédé à d'autres cellules cytotoxiques-suppressives notamment d'origine lymphocitaire. e) Application du procédé à l'étude du dysfonctionnement d'autres cel¬ lules de la lignée histio-monocytaire, notamment les cellules de Langerhans parce que l'acetylcholine active la prolifération des kératinocytes et les cellules microgliales du cerveau parce que l'acetylcholine est libérée dans le cerveau pendant l'orgasme et lors du passage à l'acte criminel. f) Application du procédé à l'étude de produits susceptibles d'inter¬ férer avec la durée de l'action de l'acetylcholine, notamment en inhibant l'action de l'acétylcholinestérase (comme le font les armes chimiques utilisées lors de la guerre Iran-Irak) et donc avec la sélection immuno- logique de différents retrovirus susceptibles d'altérer le système immunitaire ainsi que le fonctionnement de n'importe quel organe. g) Application du procédé à l'étude des perturbations du système immunitaire provoquées par un "neural mismatch", notamment lors des troubles de la thermorégulation ou engendrés par les stress associés à l'idée de mort et lors des troubles de l'adaptation à l'apesanteur ou au contraire aux accélérations subies lors des centrifugations. h) Application du procédé à la correction éventuelle des perturbations citées plus haut par les techniques de désensibilisation aux stress utilisées en médecine aérospatiale en préparation des vols habités dans l'espace.
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Title
Clinical and Experimental Immunology, vol. 40, 1980, Blackwell Scientific Publications, M. Kavai et al.: "Loss of monocyte membrane receptors in patients with SLE", pages 66-71 *

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AU6720790A (en) 1991-06-13
FR2654516A1 (fr) 1991-05-17

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