WO1991006868A1 - Bilirubin assay using electrochemical oxidation - Google Patents

Bilirubin assay using electrochemical oxidation Download PDF

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WO1991006868A1
WO1991006868A1 PCT/FR1990/000782 FR9000782W WO9106868A1 WO 1991006868 A1 WO1991006868 A1 WO 1991006868A1 FR 9000782 W FR9000782 W FR 9000782W WO 9106868 A1 WO9106868 A1 WO 9106868A1
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conjugated
oxidized
potential
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Fathi Moussa
François TRIVIN
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Fathi Moussa
Trivin Francois
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    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
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    • GPHYSICS
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Definitions

  • the present invention relates to the assay of bilirubins present in biological samples such as blood serum samples.
  • the methods using diazoreaetion are very interesting because they allow the separate determination of the conjugated forms of bilirubin; but they are not very standardizable because the reagents are unstable.
  • the most recent enzymatic oxidation assays pose certain problems associated with the use of enzymes and do not exhibit sufficient sensitivity at low concentrations.
  • the subject of the present invention is precisely a method for assaying bilirubins based on electrochemical oxidation, which is easy and quick to implement, can be standardized easily and has good sensitivity.
  • a reagent capable of breaking the bonds of bilirubin with albumin and / or of dissolving the bilirubins to make them oxidizable by electrochemical route.
  • the aqueous solution may for example be an aqueous solution containing an electrolyte such as a 9% sodium chloride solution. 1000 or a buffer solution, for example a phosphate buffer having a pH of 5 to 8, a glycoeolle or lactate buffer having a pH less than 5.
  • an electrolyte such as a 9% sodium chloride solution. 1000 or a buffer solution, for example a phosphate buffer having a pH of 5 to 8, a glycoeolle or lactate buffer having a pH less than 5.
  • the reagents added can be chosen from diazoreaction accelerators, anionic and cationic surfactants, and organic solvents.
  • diazoreaction accelerators By way of example of diazoreaction accelerators, mention may be made of compounds such as caffeine, for example in solution in benzoic acid, diphylline, aniline derivatives such as dichloroaniline, and their mixtures.
  • an anionic action mention may be made of sodium dodecyl sulphate and sodium cholate.
  • sodium dodecyl sulphate and sodium cholate As exe mp lesd 'ag in ttensi oa ctif cationic likely to be used, there may be mentioned hexadecyl trimethylammonium chloride.
  • the reagent used must be in excess relative to the bilirubin, for example in an amount such that there is at least 5 to 10 mol of reagent per mol of bilirubin present in the sample.
  • the pH of the solution is chosen.
  • the reagent possibly added and the oxidation potential so as to carry out the oxidation of the desired form or forms of bilirubin.
  • BRC conjugated bilirubin
  • pH greater than 7.5 the electrooxidation of BRnC is obtained for BRnC / Alb ratios less than 0.8 but not quantitatively.
  • a reagent such as caféirç associated with a benzoate
  • all forms of bilirubin are oxidized at potentials of +0.25 and +0.45 V compared to DHW.
  • the method is implemented so as to dose the total bilirubin present in the sample.
  • it is possible to operate at a pH of 7.4 + 0.05 with a reagent constituted by a cationic surfactant or by a diazoreaction accelerator, and carry out step b) at a potential such that one oxidizes the conjugated bilirubin and the unconjugated bilirubin, which makes it possible to assay the total bilirubin.
  • Total bilirubin can also be determined by operating at a pH of around 5, with a potential such that unconjugated bilirubin and conjugated bilirubin are oxidized.
  • the operation is carried out at a pH of approximately 5 and at a potential such that only the conjugated bilirubin is oxidized.
  • the conjugated bilirubin can be determined by operating at a pH of 7.4 + 0.5 with a reagent consisting of an anionic surfactant, choosing a potential such that only the conjugated bilirubin is oxidized.
  • the conjugated bilirubin is first removed from the sample by using a solution at a pH of about 5 and performing a electrochemical oxidation at a potential such that all of the conjugated bilirubin is oxidized, the pH of the solution is then adjusted to approximately 7.4, electrochemical oxidation is carried out at a potential such that only non-bilirubin is oxidized conjugate not linked to albumin, and the amount of unconjugated, unbound bilirubin thus oxidized is determined, for example by spectrophotometry or by differential spectrofluorescence.
  • the assay can be specific because the oxidation is a function of the pH of the reagent and of the imposed potential.
  • the measurement can be made directly by amperometry or coulometry after an appropriate calibration.
  • the bilirubins bound to albumin are not rooxidizable and the contents of unbound bilirubin are generally low compared to those of the other oxidizable constituents.
  • the specificity of the assay can be obtained by combining electrochemical oxidation with another differential measurement technique such as spectrophotometry, reflectometry, spectrofluorometry or amperometry.
  • the assay is very sensitive because the various methods which can be used to determine the amount of oxidized bilirubin all have good sensitivity of the order of nmol / l. The process does not require the use of expensive reagents such as enzymes.
  • the quantity of oxidized bilirubin can be determined by amperometric measurements, coulometric measurements, and spectrophotometric measurements.
  • Amperometric and coulometric measurements can be carried out using existing conventional microdosing devices.
  • the quantity of oxidized bilirubin can also be determined by spectophotometric or spectrofluorometric measurements. In fact, during oxidation, bilirubin is transformed into biliverdin and then into other products with natural fluorescence. However, bilirubin absorbs with a maximum at 450nm while the maximum absorption of bi li ve rd i does not sit at 380nm. Also if, by measuring the increase in optical density at 380nm or the decrease in optical density at 450nm, one can determine the amount of bilirubin oxidized to biliverdin.
  • the apparatuses used can be conventional spectrophotometers or spectrofluorimeters, this measurement can also be carried out by reflectometry.
  • the method of the invention can also be combined with conventional techniques for assaying bilirubin, for example with assay techniques by enzymatic oxidation.
  • the enzymatic oxidation is carried out and the quantities of bilirubin in the medium are determined by the method of the invention by means of amperometric or coulometric measurements with electrochemical oxidation.
  • the invention also relates to a measurement cell for implementing this method, which comprises:
  • a parallelipipedic tank provided with two parallel faces forming an optical window for the passage of a light beam in order to measure the optical density of a solution present in the tank
  • auxiliary electrode and a reference electrode arranged so as to be in electrolytic contact with a solution present in the tank
  • This intensity is proportional to the concentration of conjugated bilirubin, the constant also depending on the material and the solutions used.
  • FIG. 1 shows the results obtained with this solution.
  • curves 61 and 62 relate respectively to the buffer at pH 8 and to the buffer at pH 8 containing albumin.
  • Curve 63 relates to the buffer at pH 8 to which 100 ⁇ l of a sample containing 400 ⁇ mol / l of bilirubin and 36 g / l of albumin is added, ie a BrnC / albumin ratio of 0.77.
  • Curve 64 refers to the results obtained when 100 ⁇ l of a sample containing only 400 ⁇ mol / l of bilirubin are added to the aqueous solution.
  • Example 4 Coulometric determination of unconjugated bilirubin, not linked to albumin.
  • a total electrolysis of the aqueous solution containing the sample to be assayed is carried out in a buffer at pH 5 as before at a potential of + 0.06 V to permanently rid the sample of the bilirubin in the form conjugate.
  • the pH of the medium is reduced to 7.4 by adding concentrated sodium hydroxide 2 to 10N.
  • the fractions of unconjugated bilirubin, not linked to albumin are oxidized, as indicated above, the oxidation reaction taking place in two stages at potentials of -0.03V and + 0.19V.
  • curve 101 relates glycoeolle buffer containing bilirubin unconjugated to 427umol / l bilirubin and albumin with a BRnC / albumin ratio of 0.77.
  • Curve 102 relates to the glycoeolle buffer containing unconjugated biliverdin alone (500 ⁇ mol / l)
  • a mobile phase constituted by phosphate buffer at pH 7.4 containing benzoic acid (50 g / l) and caffeine (30 g / l) and by injecting 100 ⁇ l of a serum sample containing 5.1 ⁇ mol / l of bilirubin for a BRnC / Alb ratio of 0.35, at a flow rate of 0.8ml / min by applying variable potentials to the electrode.
  • the optical density of the medium is measured continuously at the cell outlet at 440 nm.
  • a potential of 0.7V is necessary to oxidize 90% of the BR present in the blood sample.
  • the surface of the cell electrode (3) of FIG. 4 and the passage time of the sample are not sufficient to obtain total electrolysis.
  • the specificity of the assay is nevertheless obtained by highlighting the drop in optical density to 440nm.
  • FIG 15 there is shown a cell of this type.
  • This comprises a parallelepiped tank (121) into which the sample solution (123) to be assayed can be introduced.
  • a magnetic stirrer (125) is arranged at the bottom of the tank and a working electrode (127) is pressed against the side wall of the tank.
  • the tank (121) comprises two parallel optical faces forming an optical window for the passage of a light beam in order to be able to directly determine the optical density of the solution (123) present in the tank.
  • the three electrodes are connected to an electric generator not shown in the drawing in order to apply to the working electrode (127) a controlled potential with respect to the reference electrode.
  • the plated electrode (127) could be replaced by a wire immersed in the solution, as long as it is arranged so as not to interfere with the light beam which passes through the container to measure the optical density.
  • the method of the invention can be implemented for carrying out different assays and the results obtained by coulometry with potential imposed at + 0.65V (Coulochem, ESA) on icteric serum will be described below. Determination of bilirubin in icteric serum.
  • Curve 152 relates to the solution
  • Curve 154 refers to the solution
  • Curve 155 refers to solution 12 after 30 minutes of coulometry at + 0.65V.

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Abstract

A method for assaying bilirubin present in a biological medium in a conjugated and/or unconjugated form. A sample of the medium is placed in an electrochemical cell (121) containing a conductive aqueous solution (123) with a pH of between 3 and 10, then a suitable potential is applied to an active electrode (127), with respect to a reference electrode, to oxidize at least some of the bilirubin present in the sample, and the amount of bilirubin thereby oxidized is determined. Furthermore, a reagent, such as a diazoreaction accelerator, a surface active agent or an organic solvent, is added. It acts to break the BR-Alb bonds and/or to solubilize the bilirubin in the solution. However, this reagent is not necessary in some cases.

Description

Dosage des bilirubines par oxydation electrochimique Determination of bilirubins by electrochemical oxidation
La présente invention concerne le dosage des bilirubines présentes dans des échantillons biologiques tels que des échantillons de sérum sanguin. The present invention relates to the assay of bilirubins present in biological samples such as blood serum samples.
La mesure des diverses formes de bilirubine dans le sérum humain est d'une grande importance pour le diagnostic et le traitement de certaines maladies chez l'enfant et chez l'adulte, en particulier pour apprécier le risque d'encéphalopathie hyperbilirubinémique chez le nouveau né.  The measurement of the various forms of bilirubin in human serum is of great importance for the diagnosis and treatment of certain diseases in children and in adults, in particular for assessing the risk of hyperbilirubinemic encephalopathy in newborns. .
On connaît différents procédés de dosage de la bilirubine dans des échantillons de sang qui font appel à une oxydation chimique, une oxydation enzymatique ou une diazoréaetion, comme il est décrit par W. J. Cashore et al dans Journal cf Pediatrics, vol. 93, n° 5, p. 827 à 833, novembre 1978 ; par P. Fossati et al, dans Clin. Chem. 35/1, 173-176 (1989), et par B. T. Doumas et al dans Clin. Chem. 33/8, 1349-1353 (1987).  Various methods of assaying bilirubin are known in blood samples which use chemical oxidation, enzymatic oxidation or diazoreeaetion, as described by W. J. Cashore et al in Journal cf Pediatrics, vol. 93, n ° 5, p. 827-833, November 1978; by P. Fossati et al, in Clin. Chem. 35/1, 173-176 (1989), and by B. T. Doumas et al in Clin. Chem. 33/8, 1349-1353 (1987).
Parmi ces procédés, les procédés faisant appel à une diazoréaetion sent très intéressants car ils permettent le dosage séparé des formes conjuguées de la bilirubine ; mais ils sont peu standardisables car les réactifs sont instables. Les dosages par oxydation enzymatique qui sont les plus récents, posent certains problèmes liés à l'utilisation d'enzymes et ne présentent pas une sensibilité suffisante aux faibles concentrations.  Among these methods, the methods using diazoreaetion are very interesting because they allow the separate determination of the conjugated forms of bilirubin; but they are not very standardizable because the reagents are unstable. The most recent enzymatic oxidation assays pose certain problems associated with the use of enzymes and do not exhibit sufficient sensitivity at low concentrations.
Ainsi, aucun des procédés connus actuel lement ne permet de réaliser le dosage rapidement avec une bonne sensibilité, et de façon standardisée. So, none of the known processes today Lement does not allow to perform the assay quickly with good sensitivity, and in a standardized manner.
La présente invention a précisément pour objet un procédé de dosage des bilirubines basé sur l'oxydation électrochimique, qui est facile et rapide à mettre en oeuvre, peut être standardisé aisément et présente une bonne sensibilité.  The subject of the present invention is precisely a method for assaying bilirubins based on electrochemical oxidation, which is easy and quick to implement, can be standardized easily and has good sensitivity.
On sait que la bilirubine peut être oxydée éleetrochimiquement lorsqu'elle est dans un solvant organique tel que le sulfoxyde de diméthyle contenant un électrolyte comme le perchlorate de tétraéthylammonium, comme il est décrit par F. Moussa et al dans Analytical Chemistry, vol. 60, 11, It is known that bilirubin can be electrochemically oxidized when it is in an organic solvent such as dimethyl sulfoxide containing an electrolyte such as tetraethylammonium perchlorate, as described by F. Moussa et al in Analytical Chemistry, vol. 60, 11,
1179-1185 (1988). Cependant, cette oxydation é lect rochi mi que ne peut être réalisée en milieu biologique car la bilirubine n'est pas électro-oxydable dans ces milieux lorsque le rapport molaire bilirubine/albumine est inférieur à environ 0,7-0,8. 1179-1185 (1988). However, this rock electro oxidation cannot be carried out in a biological medium because bilirubin is not electro-oxidizable in these media when the bilirubin / albumin molar ratio is less than about 0.7-0.8.
La présente invention a précisément pour objet un procédé qui permet de doser les bilirubines présentes dans un échantillon biologique sous forme conjuguée et/ou sous forme non conjuguée par oxydation électrochimique.  The subject of the present invention is precisely a process which makes it possible to assay the bilirubins present in a biological sample in conjugated form and / or in non-conjugated form by electrochemical oxidation.
Ce procédé comprend les étapes successives suivantes :  This process includes the following successive steps:
a) introduire un échantillon du milieu biologique dans une solution aqueuse, conductrice de l'électricité ayant un pH de 3 à 10,  a) introducing a sample of the biological medium into an aqueous, electrically conductive solution having a pH of 3 to 10,
b) soumettre la solution ainsi obtenue à une oxydation électrochimique à un potentiel tel qu'on oxyde au moins une partie de la bilirubine présente dans l'échantillon, et  b) subjecting the solution thus obtained to electrochemical oxidation at a potential such that at least part of the bilirubin present in the sample is oxidized, and
c) déterminer la quantité de bilirubine ainsi oxydée. Selon l'invention, on réussit à oxyder éleetrochimiquement la bilirubine présente dans un échantillon biologique en diluant cet échantillon dans une solution aqueuse ayant un pH approprié. c) determine the quantity of bilirubin thus oxidized. According to the invention, it is successful to oxidize the bilirubin eletrochemically present in a biological sample by diluting this sample in an aqueous solution having an appropriate pH.
En effet, on a découvert que le choix du pH de la solution permettait d'oxyder électrochimiquement certaines formes ou toutes les formes de bilirubine à des potentiels appropriés, et ainsi de les doser.  Indeed, it has been discovered that the choice of the pH of the solution makes it possible to electrochemically oxidize certain forms or all forms of bilirubin at appropriate potentials, and thus to dose them.
Dans certains cas, il est toutefois préférable d'ajouter à la solution aqueuse un réactif capable de rompre les liaisons de la bilirubine avec l'albumine et/ou de solubiliser les bilirubines pour les rendre oxydables par voie électrochimique.  In certain cases, it is however preferable to add to the aqueous solution a reagent capable of breaking the bonds of bilirubin with albumin and / or of dissolving the bilirubins to make them oxidizable by electrochemical route.
La solution aqueuse peut être par exemple une solution aqueuse contenant un électrolyte comme une solution de chlorure de sodium à 9 p. 1000 ou une solution tampon, par exemple un tampon phosphate ayant un pH de 5 à 8, un tampon glycoeolle ou lactate ayant un pH inférieur à 5.  The aqueous solution may for example be an aqueous solution containing an electrolyte such as a 9% sodium chloride solution. 1000 or a buffer solution, for example a phosphate buffer having a pH of 5 to 8, a glycoeolle or lactate buffer having a pH less than 5.
A titre d'exemple, les réactifs ajoutés peuvent être choisis parmi les accélérateurs de diazoréaction, les agents tensioactifs anioniques et cat ioniques, et les solvants organiques.  By way of example, the reagents added can be chosen from diazoreaction accelerators, anionic and cationic surfactants, and organic solvents.
A titre d'exemple d'accélérateurs de diazoréaction, on peut citer les composés tels que la caféine, par exemple en solution dans de l'acide benzoîque, la diphylline, les dérivés de l'aniline comme la dichloroaniline, et leurs mélanges.  By way of example of diazoreaction accelerators, mention may be made of compounds such as caffeine, for example in solution in benzoic acid, diphylline, aniline derivatives such as dichloroaniline, and their mixtures.
A t i t r e d ' e x e m p l e s d ' a ge n t t e n s i oa c t i f anionique, on peut citer le dodécylsulfate de sodium et le cholate de sodium. A t i t re d ' e x e mp l e s d ' a g en t t e n s i oa c t i f cationique susceptible d'être utilisé, on peut citer le chlorure d'hexadécyl trimethylammonium. By way of examples of an anionic action, mention may be made of sodium dodecyl sulphate and sodium cholate. As exe mp lesd 'ag in ttensi oa ctif cationic likely to be used, there may be mentioned hexadecyl trimethylammonium chloride.
A titre de solvant organique utilisable, on peut citer le sulfoxyde de diméthyle. On peut utiliser bien entendu d'autres solvants organiques, mais les quantités utilisées doivent être telles qu'il n'y ait pas de précipitation des protéines de l'échantilIon.  As organic solvent which can be used, mention may be made of dimethyl sulfoxide. It is of course possible to use other organic solvents, but the amounts used must be such that there is no precipitation of the proteins in the sample.
Les quantités de solution aqueuse et de réactif ajoutées sont respectivement telles que l'on obtienne un degré de dilution suffisant du milieu biologique en vue de rendre oxydables la bilirubine et que le réactif puisse remplir sa fonction, c'est-à-dire rompre toutes les liaisons de la bilirubine avec l'albumine et/ou de solubiliser les bilirubines pour les rendre oxydables.  The quantities of aqueous solution and of reagent added are respectively such that a sufficient degree of dilution of the biological medium is obtained in order to render the bilirubin oxidizable and that the reagent can fulfill its function, that is to say break all the connections of bilirubin with albumin and / or to dissolve the bilirubins to make them oxidizable.
Généralement, on utilise 100μl à 1ml de solution pour 5 à 50μl d'échantillon.  Generally, 100 μl to 1 ml of solution is used for 5 to 50 μl of sample.
Le réactif utilisé doit être en excès par rapport à la bilirubine, par exemple en quantité telle que l'on ait au moins 5 à 10 mol de réactif par mol de bilirubine présente dans l'échantillon.  The reagent used must be in excess relative to the bilirubin, for example in an amount such that there is at least 5 to 10 mol of reagent per mol of bilirubin present in the sample.
Dans le procédé de l'invention, on choisit le pH de la solution. le réactif éventuellement ajouté et le potentiel d'oxydation de façon à réaliser l'oxydation de la ou des formes voulues de bilirubine.  In the process of the invention, the pH of the solution is chosen. the reagent possibly added and the oxidation potential so as to carry out the oxidation of the desired form or forms of bilirubin.
En effet, dans le sang, la bilirubine (BR) est présente sous diverses formes qui sont principalement  Indeed, in the blood, bilirubin (BR) is present in various forms which are mainly
- la bilirubine non conjuguée (BRnC),  - unconjugated bilirubin (BRnC),
- la bilirubine non conjuguée liée à des protéines telles que l'albumine,  - unconjugated bilirubin linked to proteins such as albumin,
- la bilirubine conjuguée (BRC), par exemple les monoglucuronides et diglucuronides de bilirubine, plus ou moins liées à des protéines comme l'albumine, et - conjugated bilirubin (BRC), for example monoglucuronides and diglucuronides bilirubin, more or less linked to proteins like albumin, and
- la bilirubine conjuguée liée de façon covalente à des protéines telles que l'albumine. (Cette éventualité est rencontrée dans certaines circonstances pathologiques).  - conjugated bilirubin covalently linked to proteins such as albumin. (This possibility is encountered in certain pathological circumstances).
Aussi, étant donné que toutes ces formes des bilirubine ne sont pas éleetrooxydables dans les mêmes conditions, on peut selon l'invention choisir les conditions de pH et le réactif ajouté si nécessaire de façon à doser la (les) forme (s) voulue (s) de bilirubine.  Also, given that all of these forms of bilirubin are not eletrooxidizable under the same conditions, it is possible according to the invention to choose the pH conditions and the reagent added if necessary so as to dose the desired form (s) ( s) bilirubin.
Ainsi, à un pH neutre (7 + 0,5) et pour un rapport (BR/Alb<0,7), la bilirubine conjuguée en présence d'albumine n'est pas électroactive. Aux pH alcalins le rapport BRC/Alb pour lequel la BRC n'est pas électrooxydable baisse (aux alentours de 0,3 à 0,2). En revanche, en milieu acide (pH 2,6 à 3,8) et en présence d'albumine, la bilirubine conjuguée est oxydée à des potentiels de +0,4 V et + 0,6 V par rapport à ecs (électrode au calomel saturée).  Thus, at a neutral pH (7 + 0.5) and for a ratio (BR / Alb <0.7), the bilirubin conjugated in the presence of albumin is not electroactive. At alkaline pH the BRC / Alb ratio for which the BRC is not electrooxidizable decreases (around 0.3 to 0.2). On the other hand, in an acid medium (pH 2.6 to 3.8) and in the presence of albumin, the conjugated bilirubin is oxidized at potentials of +0.4 V and + 0.6 V compared to DHW (electrode at saturated calomel).
La bilirubine non conjuguée n'est pas électroactive en présence d'albumine pour un rapport Unconjugated bilirubin is not electroactive in the presence of albumin for report
BRnC/Alb<0,8 dans le domaine de pH allant de 2,6 à 7,56. Pour les pH supérieurs à 7,5, l'électrooxydation de la BRnC est obtenue pour des rapports BRnC/Alb inférieurs à 0,8 mais de façon non quantitative. En revanche, en présence d'un réactif tel que la caféirç associée à un benzoate toutes les formes de bilirubine sont oxydées à des potentiels de +0,25 et +0,45 V par rapport à ecs. BRnC / Alb <0.8 in the pH range from 2.6 to 7.56. For pH greater than 7.5, the electrooxidation of BRnC is obtained for BRnC / Alb ratios less than 0.8 but not quantitatively. On the other hand, in the presence of a reagent such as caféirç associated with a benzoate, all forms of bilirubin are oxidized at potentials of +0.25 and +0.45 V compared to DHW.
Ainsi, selon un premier mode de réalisation de l'invention, on met en oeuvre le procédé de façon à doser la bilirubine totale présente dans l'échantillon. Dans ce cas, on peut opérer à un pH de 7,4 + 0,05 avec un réactif constitué par un agent tensioactif cationique ou par un accélérateur de diazoréaction, et réaliser l'étape b) à un potentiel tel que l'on oxyde la bilirubine conjuguée et la bilirubine non conjuguée, ce qui permet de doser la bilirubine totale. Thus, according to a first embodiment of the invention, the method is implemented so as to dose the total bilirubin present in the sample. In this case, it is possible to operate at a pH of 7.4 + 0.05 with a reagent constituted by a cationic surfactant or by a diazoreaction accelerator, and carry out step b) at a potential such that one oxidizes the conjugated bilirubin and the unconjugated bilirubin, which makes it possible to assay the total bilirubin.
On peut aussi déterminer la bilirubine totale en opérant à un pH d'environ 5, avec un potentiel tel que l'on oxyde la bilirubine non conjuguée et la bilirubine conjuguée.  Total bilirubin can also be determined by operating at a pH of around 5, with a potential such that unconjugated bilirubin and conjugated bilirubin are oxidized.
On peut encore doser la bilirubine totale en opérant à un pH de 8 avec un agent tensioactif anionique à un potentiel tel que l'on oxyde la bilirubine conjuguée et la bilirubine non conjuguée.  It is also possible to assay the total bilirubin by operating at a pH of 8 with an anionic surfactant at a potential such that the conjugated bilirubin and the unconjugated bilirubin are oxidized.
Selon un second mode de réalisation de l'invention, adapté au dosage de la bilirubine conjuguée, on opère à un pH d'environ 5 et à un potentiel tel que l'on oxyde uniquement la bilirubine conjuguée.  According to a second embodiment of the invention, suitable for assaying the conjugated bilirubin, the operation is carried out at a pH of approximately 5 and at a potential such that only the conjugated bilirubin is oxidized.
Selon une variante, on peut doser la bilirubine conjuguée en opérant à un pH de 7,4 + 0,5 avec un réactif constitué par un agent tensioactif anionique en choisissant un potentiel tel que l'on oxyde uniquement la bilirubine conjuguée.  Alternatively, the conjugated bilirubin can be determined by operating at a pH of 7.4 + 0.5 with a reagent consisting of an anionic surfactant, choosing a potential such that only the conjugated bilirubin is oxidized.
Selon un troisième mode de réalisation de l'invention adapté au dosage de la bilirubine non conjuguée, non liée, on élimine tout d'abord la bilirubine conjuguée de l'échantillon en utilisant une solution à un pH d'environ 5 et en réalisant une oxydation électrochimique à un potentiel tel qu'on oxyde toute la bilirubine conjuguée, on ajuste ensuite le pH de la solution à environ 7,4, on réalise une oxydation électrochimique à un potentiel tel que l'on oxyde uniquement la bilirubine non conjuguée non liée à l'albumine, et on détermine la quantité de bilirubine non conjuguée, non liée ainsi oxydée, par exemple par spectrophotométrie ou par spectrofluorescence différentielle. According to a third embodiment of the invention suitable for assaying unconjugated, unbound bilirubin, the conjugated bilirubin is first removed from the sample by using a solution at a pH of about 5 and performing a electrochemical oxidation at a potential such that all of the conjugated bilirubin is oxidized, the pH of the solution is then adjusted to approximately 7.4, electrochemical oxidation is carried out at a potential such that only non-bilirubin is oxidized conjugate not linked to albumin, and the amount of unconjugated, unbound bilirubin thus oxidized is determined, for example by spectrophotometry or by differential spectrofluorescence.
Ainsi, le procédé de l'invention présente de nombreux avantages. En effet, le dosage peut être spécifique car l'oxydation est fonction du pH du réactif et du potentiel imposés.  Thus, the method of the invention has many advantages. In fact, the assay can be specific because the oxidation is a function of the pH of the reagent and of the imposed potential.
Toutefois, cette spécificité ne peut être obtenue directement que dans le cas où l'on réalise l'oxydation éleetrochimique en présence d'un réactif capable de rompre les liaisons bilirubine - albumine et/ou de solubiliser les bilirubines dans cette solution.  However, this specificity can only be obtained directly in the case where the electrochemical oxidation is carried out in the presence of a reagent capable of breaking the bilirubin-albumin bonds and / or of solubilizing the bilirubins in this solution.
Dans ce cas, on peut effectuer la mesure directement par ampérométrie ou coulométrie après un étalonnage approprié.  In this case, the measurement can be made directly by amperometry or coulometry after an appropriate calibration.
En revanche, dans le cas où l'on opère sans addition du réactif mentionné ci-dessus, l'oxydation éleetrochimique ne peut être spécifique car d'autres constituants de l'échantillon peuvent également être oxydés et interférer pour une large part dans le résultat.  On the other hand, in the case where one operates without addition of the reagent mentioned above, the electrochemical oxidation cannot be specific because other constituents of the sample can also be oxidized and interfere for a large part in the result. .
En effet, les bilirubines liées à l'albumine ne sont pas é lect rooxydab les et les teneurs en bilirubine non liées sont généralement faibles par rapport à celles des autres constituants oxydables.  In fact, the bilirubins bound to albumin are not rooxidizable and the contents of unbound bilirubin are generally low compared to those of the other oxidizable constituents.
Dans ce dernier cas, on peut toutefois obtenir la spécificité du dosage en combinant l'oxydation électrochimique à une autre technique de mesure différentielle telle que la spectrophotométrie, la réflectométrie, la spectrofluorométrie ou l'ampérométrie. Le dosage est très sensible car les diverses méthodes utilisables pour déterminer la quantité de bilirubine oxydée présentent toutes une bonne sensibilité de l'ordre de la nmole/l. Le procédé ne nécessite pas l'utilisation de réactifs coûteux tels que les enzymes. In the latter case, however, the specificity of the assay can be obtained by combining electrochemical oxidation with another differential measurement technique such as spectrophotometry, reflectometry, spectrofluorometry or amperometry. The assay is very sensitive because the various methods which can be used to determine the amount of oxidized bilirubin all have good sensitivity of the order of nmol / l. The process does not require the use of expensive reagents such as enzymes.
Par ailleurs, on peut utiliser moins de 10μl d'échantillon et réaliser le dosage en une à deux minutes de façon entièrement automatisée.  In addition, it is possible to use less than 10 μl of sample and carry out the assay in one to two minutes in a fully automated manner.
Selon l'invention, on peut déterminer la quantité de bilirubine oxydée par des mesures ampérométriques, des mesures coulométriques, et des mesures spectrophotométriques.  According to the invention, the quantity of oxidized bilirubin can be determined by amperometric measurements, coulometric measurements, and spectrophotometric measurements.
Les mesures ampérométriques et coulométriques peuvent être effectuées au moyen des appareillages classiques de microdosage existants.  Amperometric and coulometric measurements can be carried out using existing conventional microdosing devices.
On peut également déterminer la quantité de bilirubine oxydée par mesures spectophotométriques ou spectrofluorométriques. En effet, lors de l'oxydation, la bilirubine se transforme en biliverdine puis en d'autres produits possédant une fluorescence naturelle. Or, la bilirubine absorbe avec un maximum à 450nm alors que le maximum d'absorption de l a bi l i ve rd i ne se s i t ue à 380nm . Aus s i , en mesurant l'augmentation de la densité optique à 380nm ou la diminution de la densité optique à 450nm, on peut déterminer la quantité de bilirubine oxydée en biliverdine. Les appareillages utilisés peuvent être des spectrophotomét res ou spectrofluorimetres classiques, on peut aussi effectuer cette mesure par réflectométrie. Le procédé de l'invention peut aussi être combiné avec les techniques classiques de dosage de la bilirubine, par exemple avec les techniques de dosage par oxydation enzymatique. The quantity of oxidized bilirubin can also be determined by spectophotometric or spectrofluorometric measurements. In fact, during oxidation, bilirubin is transformed into biliverdin and then into other products with natural fluorescence. However, bilirubin absorbs with a maximum at 450nm while the maximum absorption of bi li ve rd i does not sit at 380nm. Also if, by measuring the increase in optical density at 380nm or the decrease in optical density at 450nm, one can determine the amount of bilirubin oxidized to biliverdin. The apparatuses used can be conventional spectrophotometers or spectrofluorimeters, this measurement can also be carried out by reflectometry. The method of the invention can also be combined with conventional techniques for assaying bilirubin, for example with assay techniques by enzymatic oxidation.
Dans ce cas, on effectue l'oxydation enzymatique et on détermine ensuite par le procédé de l'invention au moyen de mesures ampérométriques ou coulométriques avec oxydation électrochimique, les quantités de bilirubine du milieu.  In this case, the enzymatic oxidation is carried out and the quantities of bilirubin in the medium are determined by the method of the invention by means of amperometric or coulometric measurements with electrochemical oxidation.
L'enzyme (bilirubine oxydase)peut être soit en suspension dans la solution aqueuse utilisée, soit immobilisée sur l'électrode.  The enzyme (bilirubin oxidase) can either be in suspension in the aqueous solution used, or immobilized on the electrode.
L'invention concerne également une cellule de mesure pour la mise en oeuvre de ce procédé, qui comprend :  The invention also relates to a measurement cell for implementing this method, which comprises:
- une cuve parallélipipédique munie de deux faces parallèles formant une fenêtre optique pour le passage d'un faisceau lumineux en vue de mesurer la densité optique d'une solution présente dans la cuve,  - a parallelipipedic tank provided with two parallel faces forming an optical window for the passage of a light beam in order to measure the optical density of a solution present in the tank,
- une électrode de travail disposée dans la cuve de façon à ne pas être située sur le passage d'un faisceau lumineux traversant la fenêtre optique,  - a working electrode placed in the tank so as not to be located on the passage of a light beam passing through the optical window,
- une électrode auxiliaire et une électrode de référence disposées de manière à être en contact électrolytique avec une solution présente dans la cuve, et  an auxiliary electrode and a reference electrode arranged so as to be in electrolytic contact with a solution present in the tank, and
- des moyens pour relier les électrodes à un générateur électrique.  - Means for connecting the electrodes to an electric generator.
Selon une variante, on peut remplacer la cuve parallélépipédique utilisée pour la lecture photométrique par des fibres optiques disposées au voisinage de l'électrode de travail ou à l'intérieur de celle-ci et utiliser une cellule de forme quelconque. Alternatively, the parallelepiped tank used for photometric reading can be replaced by optical fibers placed in the vicinity of or inside the working electrode and a cell can be used. of any shape.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture de la description qui suit donnée bien entendu à titre illustratif et non limitatif en référence au dessin annexé sur lequel :  Other characteristics and advantages of the invention will appear better on reading the description which follows, given of course by way of illustration and not limitation, with reference to the appended drawing in which:
- les figures 1 à 3 sont des courbes représentant le comportement de bilirubine non conjuguée BRnC en présence d'albumine et de caféine (fig. 1), de bilirubine avec addition d'un détergent anionique (fig. 2), de bilirubine conjuguée en présence d'albumine (fig. 3).  - Figures 1 to 3 are curves representing the behavior of unconjugated bilirubin BRnC in the presence of albumin and caffeine (fig. 1), of bilirubin with addition of an anionic detergent (fig. 2), of conjugated bilirubin in presence of albumin (fig. 3).
- la figure 4 représente de façon schématique une installation de mesure des potentiels d'oxydation des bilirubine et/ou biliverdine,  FIG. 4 schematically represents an installation for measuring the oxidation potentials of bilirubin and / or biliverdin,
- la figure 5 représente de façon schématique une installation de mesure par réflectométrie.  - Figure 5 shows schematically a measurement installation by reflectometry.
les figures 6 à 13 sont des courbes représentant l'intensité qui traverse la cellule (3) de l'installation de la figure 4 en fonction du potentiel imposé à l'électrode pour diverses solutions contenant des échantillons de bilirubines et/ou biliverdinés.  Figures 6 to 13 are curves representing the intensity which passes through the cell (3) of the installation of Figure 4 as a function of the potential imposed on the electrode for various solutions containing samples of bilirubins and / or biliverdin.
La figure 14 représente l'évolution de la densité optique d'une solution en fonction du potentiel appliqué.  FIG. 14 represents the evolution of the optical density of a solution as a function of the potential applied.
La figure 15 représente de façon schématique une cellule de mesure convenant à la mise en oeuvre du procédé de l'invention.  FIG. 15 schematically represents a measurement cell suitable for implementing the method of the invention.
- La figure 16 représente les courbes spectrophotométriques obtenues lors du dosage de bilirubine par coulométrie.  - Figure 16 shows the spectrophotometric curves obtained during the dosing of bilirubin by coulometry.
En se reportant aux figures 1 à 3, on peut voir quels sont les comportements électrochimiques de la bilirubine conjuguée ou non conjuguée en présence de divers composés. Referring to Figures 1 to 3, we can see what the electrochemical behaviors of conjugated or unconjugated bilirubin are in the presence of various compounds.
Ces figures sont des courbes intensité-potentiel obtenues en utilisant une cellule électrochimique comprenant :  These figures are intensity-potential curves obtained using an electrochemical cell comprising:
- une électrode indicatrice constituée par une électrode de carbone vitreux à disque tournant, t ype EDI TACUSSEL (diamètre appa rent 2 mm, vitesse de rotation = 3000 trs/mn).  - an indicator electrode constituted by a glassy carbon electrode with a rotating disc, EDI TACUSSEL type (apparent diameter 2 mm, speed of rotation = 3000 rpm).
- une électrode auxiliaire constituée par un fil de Pt.  - an auxiliary electrode constituted by a Pt wire.
- une électrode de référence : Ag/AgCl type C10 TACUSSEL.  - a reference electrode: Ag / AgCl type C10 TACUSSEL.
Sur la figure 1 qui illustre le comportement de la BR non conjuguée en présence d'albumine et de caféine, on a représenté les courbes d'intensité (en μ A), en fonction du potentiel (en V) obtenues avec les solutions suivantes :  In FIG. 1, which illustrates the behavior of unconjugated BR in the presence of albumin and caffeine, the intensity curves (in μ A) are represented, as a function of the potential (in V) obtained with the following solutions:
- courbe A = Voltampérogramme d'une solution d'albumine bovine (A) à 139 μmol/l de tampon phosphates pH 7,4 (volume final = 55 ml).  - curve A = Voltammogram of a bovine albumin solution (A) at 139 μmol / l of phosphate buffer pH 7.4 (final volume = 55 ml).
- courbe B : solution 1 = solution A + 5,1 μmol/1 de BR non conjuguée (BR/AlB = 0,7).  - curve B: solution 1 = solution A + 5.1 μmol / 1 of unconjugated BR (BR / AlB = 0.7).
- courbe C : solution 2 = solution A + acide benzoîque (AB) + caféine (C). Concentrations finales = 50 g/l de AB et 30 g/l de C.  - curve C: solution 2 = solution A + benzoic acid (AB) + caffeine (C). Final concentrations = 50 g / l AB and 30 g / l C.
- courbe D = solution 3 = solution 2 + 5,1 umol/l de BR pH final = 7,4.  - curve D = solution 3 = solution 2 + 5.1 umol / l of BR final pH = 7.4.
- courbe E = solution 3, pH final = 8,0. - curve E = solution 3, final pH = 8.0.
- courbe F = solution 3, pH final = 6,0. Ces courbes montrent que pour un rapport- curve F = solution 3, final pH = 6.0. These curves show that for a ratio
BR-Alb de 0,07, la BR n'est pas électrooxydableBR-Alb of 0.07, BR is not electro-stainless
(courbe B). Si l'on ajoute de la céféine dans le milieu, la BR devient électroaetive (courbe D). Cette électroaetivité est dépendante du pH (courbes E et F). (curve B). If cefine is added to the medium, the BR becomes electroaetive (curve D). This electroaetivity is dependent on the pH (curves E and F).
Sur la figure 2 qui illustre l'effet de l'addition d'un détergent anionique, on a représenté les courbes d'intensité (en μA) en fonction du potentiel (en V) obtenues avec les solutions suivantes :  In FIG. 2 which illustrates the effect of the addition of an anionic detergent, the intensity curves (in μA) as a function of the potential (in V) have been shown obtained with the following solutions:
- courbe G (solution 4) : voltampérogramme d'une solution de BR à 190 μmol/l dans le tampon phosphate pH 7,8 contenant de l'albumine bovine à 139 pmol/l (volume final = 54 ml, rapport BR/Alb = 1,4)  - curve G (solution 4): voltammogram of a BR solution at 190 μmol / l in the phosphate buffer pH 7.8 containing bovine albumin at 139 pmol / l (final volume = 54 ml, BR / Alb ratio = 1.4)
- courbe H : solution 5 = solution 4 + SDS (dodecyl sulfate de Na) ( concent rati on finale 5 mol/l, pH final = 7,8).  - curve H: solution 5 = solution 4 + SDS (Na dodecyl sulfate) (final concentration 5 mol / l, final pH = 7.8).
- courbe I : solution 6 = solution 5 à pH 7,4.  - curve I: solution 6 = solution 5 at pH 7.4.
Ces courbes montrent qu'à pH 7,8, la BR non conjuguée n'est pas électrooxydable dans le système électrochimique utilisé (courbe G). En présence de SDS en excès et à pH légèrement alcalin, la BRnC devient électrooxydable (courbe H). L'électroaetivité du pigment baisse considérablement à pH neutre (courbe I).  These curves show that at pH 7.8, the unconjugated BR is not electrooxidizable in the electrochemical system used (curve G). In the presence of excess SDS and at a slightly alkaline pH, the BRnC becomes electro-stainless (curve H). The electroaetivity of the pigment drops considerably at neutral pH (curve I).
Sur la figure 3 qui illustre l'électrooxydation d'une BR conjuguée (BR ditauro conjuguée, sel disodique, en présence d'albumine, on a représenté les courbes d'intensité (en uA) en fonction du potentiel Cen V) obtenues avec les solutions suivantes :  In FIG. 3 which illustrates the electrooxidation of a conjugated BR (conjugated ditauro BR, disodium salt, in the presence of albumin, the intensity curves (in uA) as a function of the Cen V potential) have been represented obtained with the following solutions:
- courbe J : solution 7 = solution de tampon phosphate pH 7,4 (volume = 50 ml).  - curve J: solution 7 = phosphate buffer solution pH 7.4 (volume = 50 ml).
- courbe K : solution 8 = solution 7 + 16,7 μmol/l de BR conjuguée. - curve K: solution 8 = solution 7 + 16.7 μmol / l of conjugated BR.
- courbe L : solution 9 = solution 8 + 0,5 g d'albumine (pH final 7,4, rapport BR/AlB =2,3).  - curve L: solution 9 = solution 8 + 0.5 g of albumin (final pH 7.4, BR / AlB ratio = 2.3).
- courbe M : solution 10 = solution 9 + - curve M: solution 10 = solution 9 +
SDS (pH final = 7,4). SDS (final pH = 7.4).
Ces courbes montrent qu'à la différence de la BR non conjuguée, la BR conjuguée est électrooxydable en tampon phosphate à pH neutre (courbe K). De la même manière que pour la BRnC, l'albumine ajoutée dans le milieu inhibe l'oxydation électrochimique de la BR conjuguée (courbe L). Le SDS agit sur le complexe BR-alb pour libérer la BR conjuguée qui redevient électrooxydable (courbe M).  These curves show that, unlike the unconjugated BR, the conjugated BR is electro-stainless in phosphate buffer at neutral pH (curve K). In the same way as for BRnC, albumin added in the medium inhibits the electrochemical oxidation of conjugated BR (curve L). The SDS acts on the BR-alb complex to release the conjugated BR which becomes electrooxidizable again (curve M).
Les figures 1 à 3 illustrent ainsi les principes du procédé objet de l'invention. Cependant, le système électrochimique utilisé, fonctionnant en macrométhode, n'est pas suffisamment sensible pour permettre de travailler sur des échantillons sanguins.  Figures 1 to 3 thus illustrate the principles of the process which is the subject of the invention. However, the electrochemical system used, operating in macromethod, is not sensitive enough to allow work on blood samples.
Aussi, on va décrire ci-après des modes de mise en oeuvre du procédé adaptés à des dosages sur échantillons sanguins.  Also, modes of implementation of the method suitable for assays on blood samples will be described below.
Comme on l'a vu précédemment. le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre de différentes façons selon que l'on veut doser la bilirubine totale, la bilirubine libre, la bilirubine conjuguée et la bilirubine non conjuguée. Ces différentes possibilités dépendent en particulier de la solution aqueuse utilisée pour diluer l'échantillon à mesurer, du pH de cette solution, du réactif ajouté et du potentiel imposé.  As we saw earlier. the method of the invention can be implemented in different ways depending on whether one wishes to assay total bilirubin, free bilirubin, conjugated bilirubin and unconjugated bilirubin. These different possibilities depend in particular on the aqueous solution used to dilute the sample to be measured, the pH of this solution, the reagent added and the potential imposed.
Le potentiel imposé dépend de la solution aqueuse et du réactif utilisés.  The potential imposed depends on the aqueous solution and the reagent used.
Aussi, pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention, on détermine au préalable les potentiels d'oxydation des diverses formes de bilirubine et de biliverdine dans le milieu utilisé, au moyen de l'appareillage utilisé. Also, to implement the method of the invention, the oxidation potentials of the various forms of bilirubin and biliverdin are determined beforehand in the medium used, by means of the apparatus used.
Sur la figure 4, on a représenté de façon schématique une installation permettant de mesurer ces potentiels d'oxydation.  In Figure 4, there is shown schematically an installation for measuring these oxidation potentials.
Cette installation comprend un récipient This installation includes a container
(1) contenant la solution aqueuse de dilution qui peut être introduite dans une cellule coulométrique(1) containing the aqueous dilution solution which can be introduced into a coulometric cell
(3) constituée par exemple d'une cellule coulométrique ESA 5011 pilotée par un module(3) consisting for example of an ESA 5011 coulometric cell controlled by a module
Coulochem 5100A commercialisés par la Société ESA, par l'intermédiaire de la conduite (5) munie de la pompe (7) du type Spectra - Physics 8700.Coulochem 5100A sold by the ESA Company, via the line (5) fitted with the pump (7) of the Spectra - Physics 8700 type.
L'échantillon est introduit dans cette solution par l'injecteur Rheodyne 7125 (9), puis la solution est traitée dans les filtres (11) et (13) ayant respectivement des ouvertures de 2um et 0,5um. The sample is introduced into this solution by the Rheodyne 7125 injector (9), then the solution is treated in the filters (11) and (13) having respectively openings of 2um and 0.5um.
La cellule coulométrique est suivie d'un détecteur speetrophotométrique Spectra - Physics The coulometric cell is followed by a Spectra speetrophotometric detector - Physics
8490 (15). La cellule (3) et le détecteur (15) sont associés respectivement aux enregistreurs8490 (15). The cell (3) and the detector (15) are respectively associated with the recorders
(17) et (19) constitués par des dispositifs Servo trace SEFRAH. (17) and (19) constituted by SEFRAH Servo trace devices.
La cellule comprend une électrode de travail sous forme d'un filtre poreux, une électrode de référence en contact électrolytique avec la solution présente dans la cellule et une électrode auxiliaire également en contact éleetrolytique avec la solution aqueuse. L'électrode de référence est une électrode au palladium . Pour effectuer les mesures, on procède de la façon suivante : The cell comprises a working electrode in the form of a porous filter, a reference electrode in electrolytic contact with the solution present in the cell and an auxiliary electrode also in electrolytic contact with the aqueous solution. The reference electrode is a palladium electrode. To carry out the measurements, proceed as follows:
- on règle la pompe pour obtenir un débit de 0,5 à 0,8ml/min. - the pump is adjusted to obtain a flow rate of 0.5 to 0.8 ml / min.
-L'échantillon sanguin (5 à 50ul) est préalablement dilué dans 0,5 à 1ml de la solution aqueuse de dilution et 100μl de cette solution sont injectés dans le circuit à l'aide de l'injecteur (9). Lorsque l'échantillon atteint la cellule (3), la pompe (7) est arrêtée. Les mesures peuvent alors être commencées. La mesure consiste à appliquer à la cellule (3) des potentiels croissants à l'aide du module Coulochem 5100A. Celui-ci sert par ailleurs à mesurer les variations d'intensité traversant la cellule (3) au cours du balayage de potentiels appliqué. Les courbes intensité-potentiel (voltamogrammes) ainsi obtenues, sont enregistrées à l'aide de l'enregistreur (17).  -The blood sample (5 to 50 μl) is previously diluted in 0.5 to 1 ml of the aqueous dilution solution and 100 μl of this solution are injected into the circuit using the injector (9). When the sample reaches the cell (3), the pump (7) is stopped. Measurements can then be started. The measurement consists in applying increasing potentials to the cell (3) using the Coulochem 5100A module. This is also used to measure the variations in intensity passing through the cell (3) during the applied potential scan. The intensity-potential curves (voltammograms) thus obtained are recorded using the recorder (17).
Les mesures speetrophotométriques, après oxydation coulométrique, sont réalisées à l'aide du détecteur spect rophotomét ri que (15). Dans ce cas, il n'y a pas arrêt de la pompe au cours des mesures qui sont effectuées en continu. Il s'agit de fixer la longueur d'onde de mesure du spectrophotométre (15), et de faire varier le potentiel appliqué à la cellule (3), avant chaque injection.  The speetrophotometric measurements, after coulometric oxidation, are carried out using the spectrophotometric detector (15). In this case, the pump does not stop during the measurements which are carried out continuously. This involves setting the measurement wavelength of the spectrophotometer (15), and varying the potential applied to the cell (3), before each injection.
L'augmentation et la baisse de densité optique au cours de l'analyse sont enregistrées par (19).  The increase and decrease in optical density during the analysis are recorded by (19).
Sur la figure 5, on a représenté schématiquement un dispositif permettant d'effectuer des dosages en utilisant la réf lectométrie pour déterminer la quantité de bilirubine oxydée.  In Figure 5, there is shown schematically a device for performing assays using ref lectometry to determine the amount of oxidized bilirubin.
Sur cette figuré, on voit que ce dispositif comprend une électrode de Travail (2) amovible ou sous forme de minigrille de métal optiquement transparente, une électrode auxiliaire (4) ayant la même suface que l'électrode de Travail (4) et une micro électrode de référence (6) reliées à un potentiostat (8). L'échantillon à doser est introduit entre les électrodes (2) et (4) par l'intermédiaire d'un support (10) à usage unique d'épaisseur très faible (quelques μm) ayant la même surface que les électrodes (2) et (4), par exemple une surface de 0,25 cm2. Ce support contient à l'état sec le réactif et le tampon voulus et on dépose sur ce support (10) avant son introduction dans la cellule, l'échantillon sanguin (12) qui a été préalablement dilué. In this figure, we see that this device comprises a working electrode (2) removable or in the form of an optically transparent metal minigrid, an auxiliary electrode (4) having the same surface as the working electrode (4) and a reference micro electrode (6) connected to a potentiostat (8). The sample to be dosed is introduced between the electrodes (2) and (4) via a support (10) for single use of very small thickness (a few μm) having the same surface as the electrodes (2) and (4), for example an area of 0.25 cm2. This support contains in the dry state the desired reagent and buffer and the blood sample (12) which has been previously diluted is deposited on this support (10) before its introduction into the cell.
Les mesures réflectométriques, après oxydation coulométrique, sont réalisées à l'aide d'une source lumineuse (14) dirigée sur l'échantillon. Le rayon réfléchi par l'échantillon est détecté par une cellule photoélectrique (16) couplée à un amplificateur (18) et un enregistreur (20).  The reflectometric measurements, after coulometric oxidation, are carried out using a light source (14) directed on the sample. The ray reflected by the sample is detected by a photoelectric cell (16) coupled to an amplifier (18) and a recorder (20).
On va examiner ci-après les résultats obtenus avec l'installation de la figure 4 sur différentes solutions utilisables dans l'invention.  We will examine below the results obtained with the installation of Figure 4 on different solutions used in the invention.
I. Solutions aqueuses à pH 7,4.  I. Aqueous solutions at pH 7.4.
Cette solution aqueuse est par exemple un tampon phosphate à pH 7,4.  This aqueous solution is for example a phosphate buffer at pH 7.4.
Sur la figure 6, on a représenté les courbes intensité (μ A) - potentiel (V) obtenues en injectant 100μl d'échantillon de bilirubine dans du tampon phosphate 0,066M. Sur cette figure, la courbe 21 concerne un échantillon contenant 401μmol/l de bilirubine conjuguée, exempt de protéine. Sur cette courbe 21, on voit 3 pics d'oxydation qui se situent respectivement aux potentiels d'environ +0,03 (EpD, d'environ +0,19V (Ep2) et d'environ +0,49V (Ep3). In FIG. 6, the intensity (μ A) - potential (V) curves are represented. by injecting 100 μl of bilirubin sample into 0.066M phosphate buffer. In this figure, curve 21 relates to a sample containing 401 μmol / l of conjugated bilirubin, free of protein. On this curve 21, we see 3 oxidation peaks which are located respectively at the potentials of approximately +0.03 (EpD, approximately + 0.19V (Ep2) and approximately + 0.49V (Ep3).
Le premier pic correspond à l'oxydation de la bilirubine en biliverdine, le deuxième pic correspond à l'oxydation de la biliverdine et le troisième pic correspond aux étapes d'oxydation ultérieures.  The first peak corresponds to the oxidation of bilirubin to biliverdin, the second peak corresponds to the oxidation of biliverdin and the third peak corresponds to the subsequent oxidation stages.
Ainsi, la bilirubine conjuguée est oxydable dans ce milieu en l'absence de protéines.  Thus, the conjugated bilirubin is oxidizable in this medium in the absence of proteins.
La courbe 22 représente les résultats obtenus lorsque l'on ajoute en plus de la biliverdine à l'échantillon (361μmol/l de bilirubine conjuguée et 76umol/l de biliverdine). Dans ce cas, on remarque que le pic d'oxydation (Ep2) de la biliverdine est beaucoup plus important que dans le cas de la courbe 21.  Curve 22 represents the results obtained when adding biliverdin to the sample in addition (361 μmol / l of conjugated bilirubin and 76umol / l of biliverdin). In this case, we note that the oxidation peak (Ep2) of biliverdin is much greater than in the case of curve 21.
Si l'on effectue la même expérience en utilisant un échantillon contenant de l'albumine avec un rapport molaire de la bilirubine conjuguée à l'albumine inférieur ou égal à 0,7, l'oxydation de la bilirubine conjuguée est inhibée et l'on observe seulement l'oxydation de la biliverdine conjuguée au potentiel Ep2 d'environ + 0,19V.  If the same experiment is carried out using a sample containing albumin with a molar ratio of conjugated bilirubin to albumin of 0.7 or less, the oxidation of conjugated bilirubin is inhibited and only observes the oxidation of biliverdin combined with the Ep2 potential of approximately + 0.19V.
Si l'on répète cette expérience en utilisant un échantillon contenant de la bilirubine non conjuguée, en présence d'albumine, avec un rapport molaire de la bilirubine non conjuguée à l'albumine inférieur ou égal à 0,8, la bilirubine non conjuguée n'est pas élect ro-oxydée. En revanche, si le rapport molaire de la bilirubine non conjuguée à l'albumine dépasse environ 0,8, on observe deux pics d'oxydation aux potentiels d'environ -0,05V et d'environ +0,19V respectivement. If this experiment is repeated using a sample containing unconjugated bilirubin, in the presence of albumin, with a molar ratio of unconjugated bilirubin to albumin of 0.8 or less, unconjugated bilirubin n is not electro-oxidized. In contrast, if the molar ratio of unconjugated bilirubin to albumin exceeds about 0.8, there are two oxidation peaks at potentials of approximately -0.05V and approximately + 0.19V respectively.
Ainsi, dans une soLution aqueuse ayant un pH de 7,4, la biLirubine conjuguée ne peut être oxydée qu'en l'absence de protéines et il en est de même pour la bilirubine non conjuguée. Aussi, pour effectuer des dosages dans une telle solution, il est préférable d'ajouter un réactif approprié, par exemple un agent tensioactif anionique, un agent tensioactif cationique ou un accélérateur de diazoréaction.  Thus, in an aqueous solution having a pH of 7.4, the conjugated biLirubin can only be oxidized in the absence of proteins and the same is true for unconjugated bilirubin. Also, to carry out assays in such a solution, it is preferable to add a suitable reagent, for example an anionic surfactant, a cationic surfactant or a diazoreaction accelerator.
Les résultats obtenus dans ce cas sont donnés sur la figure 7.  The results obtained in this case are given in FIG. 7.
Sur cette figure, la courbe 31 représente les résultats obtenus lorsque l'on utilise le tampon phosphate à pH 7,4, 0,066M, contenant 40g/l d'albumine auquel on ajoute du dodécyl sulfate de sodium (DSS) à raison de 10mmol/l. Sur cette courbe 31, il n'apparaît aucun pic d'oxydation aux potentiels inférieurs à 0,2V.  In this figure, curve 31 represents the results obtained when using the phosphate buffer at pH 7.4, 0.066M, containing 40 g / l of albumin to which sodium dodecyl sulfate (DSS) is added at a rate of 10 mmol / l. On this curve 31, there appears no oxidation peak at the potentials less than 0.2V.
La courbe 32 illustre les résultats obtenus lorsqu'on ajoute au tampon phosphate contenant le DSS 100μl d'un échantillon de bilirubine non conjuguée (401umol/l) avec 36g/l d'albumine, soit un rapport BRnC / albumine de 0,77. Sur cette courbe, il n'apparaît qu'un seμl pic d'oxydation à environ +0,1V. Ainsi, la bilirubine non conjuguée s'oxyde en une seule étape.  Curve 32 illustrates the results obtained when adding to the phosphate buffer containing DSS 100 μl of a sample of unconjugated bilirubin (401umol / l) with 36g / l of albumin, ie a BRnC / albumin ratio of 0.77. On this curve, only one seμl oxidation peak appears at around + 0.1V. Thus, unconjugated bilirubin oxidizes in a single step.
La courbe 33 représente les résultats obtenus lorsque l'échantillon contient uniquement de la bilirubine conjuguée à raison de 379umol/l et 39g/l d'albumine, soit un rapport bilirubine conjuguée / albumine de 0,67. Sur la courbe 33, on remarque deux pics d'oxydation, soit un premier pic à environ -0,05V et un deuxième pic à environ +0,16V. Ainsi, la bilirubine conjuguée s'oxyde en deux étapes distinctes, à des potentiels différents de ceux observés dans le cas de la bilirubine non conjuguée. Curve 33 represents the results obtained when the sample contains only conjugated bilirubin at the rate of 379umol / l and 39g / l of albumin, ie a conjugated bilirubin / albumin ratio of 0.67. On curve 33, there are two oxidation peaks, a first peak at around -0.05V and a second peak at around + 0.16V. Thus, conjugated bilirubin oxidizes in two separate stages, at potentials different from those observed in the case of unconjugated bilirubin.
Aussi, dans une solution contenant de l'albumine, de la bilirubine non conjuguée et de la bilirubine conjuguée, on pourra oxyder sélectivement la bilirubine conjuguée en opérant à un potentiel inférieur à -0,05V pour ne pas oxyder la bilirubine non conjuguée.  Also, in a solution containing albumin, unconjugated bilirubin and conjugated bilirubin, it will be possible to selectively oxidize the conjugated bilirubin by operating at a potential lower than -0.05V so as not to oxidize the unconjugated bilirubin.
Sur la figure 8, on a représenté les résultats obtenus lorsqu'on ajoute au tampon phosphate du chlorure d'hexadécyl trimethylammonium (HTHACl) à raison de 5mmol/l. Sur cette figure, la courbe 41 représente les résultats obtenus avec le tampon phosphate contenant uniquement HTMACl, la courbe 42 représente les résultats obtenus lorsqu'on introduit un échantillon de bilirubine non conjuguée contenant 379umol/l de bilirubine non conjuguée et 36g/l de protéines, soit un rapport BRnC / albumine de 0,73 ; et la courbe 43 illustre les résultats obtenus lorsque l'on introduit un échantillon contenant de la bilirubine conjuguée contenant 531μmol/l de bilirubine conjuguée et 36g/l de protéines, soit un rapport bilirubine conjuguée / albumine de 1,02. Dans ces conditions, les deux formes de bilirubines s'oxydent en deux étapes aux mêmes potentiels qui sont respectivement de +0,1V et de +0,22V.  In Figure 8, the results obtained are shown when adding to the phosphate buffer hexadecyl trimethylammonium chloride (HTHACl) at a rate of 5mmol / l. In this figure, curve 41 represents the results obtained with the phosphate buffer containing only HTMACl, curve 42 represents the results obtained when a sample of unconjugated bilirubin containing 379umol / l of unconjugated bilirubin and 36g / l of proteins is introduced , or a BRnC / albumin ratio of 0.73; and curve 43 illustrates the results obtained when a sample containing conjugated bilirubin containing 531 μmol / l of conjugated bilirubin and 36 g / l of proteins is introduced, ie a conjugated bilirubin / albumin ratio of 1.02. Under these conditions, the two forms of bilirubins are oxidized in two stages at the same potentials which are + 0.1V and + 0.22V respectively.
Sur la figure 9, on a représenté les résultats obtenus lorsque l'on utilise comme solution aqueuse un tampon phosphate à pH 7,4 auquel on ajoute 50g/l d'acide benzoîque puis 30g/l de caféine après solubilisation de l'acide benzoîque. Sur cette figure, la courbe 51 se rapporte aux résultats obtenus avec la solution aqueuse seule contenant la caféine et l'acide benzoîque ; la courbe 52 se rapporte aux résultats obtenus lorsqu'on ajoute à la solution aqueuse un échantillon contenant 313μmol/l de bilirubine non conjuguée et 35g/l d'albumine, soit un rapport BRnC / albumine de 0,62. La courbe 53 se réfère aux résultats obtenus lorsqu'on ajoute à la solution un échantillon contenant 313μmol/l de bilirubine conjuguée et 35g/l d'albumine, soit un rapport BRC / albumine de 0,62, et la courbe 54 se réfère aux résultats obtenus lorsqu'on ajoute à la solution aqueuse un échantillon contenant 313μmol/l de bilirubine conjuguée seule. En comparant ces courbes, on remarque que toutes les formes de la bilirubine s'oxydent en deux étapes aux potentiels respectifs de -0,02V, et +0,16V. FIG. 9 shows the results obtained when a phosphate buffer at pH 7.4 is used as the aqueous solution to which 50 g / l of benzoic acid and then 30 g / l of caffeine are added after the benzoic acid has been dissolved. . In this figure, curve 51 relates to the results obtained with the aqueous solution alone containing caffeine and benzoic acid; curve 52 relates to the results obtained when a sample containing the aqueous solution is added 313μmol / l of unconjugated bilirubin and 35g / l of albumin, i.e. a BRnC / albumin ratio of 0.62. Curve 53 refers to the results obtained when a sample containing 313 μmol / l of conjugated bilirubin and 35 g / l of albumin is added to the solution, i.e. a BRC / albumin ratio of 0.62, and curve 54 refers to results obtained when a sample containing 313 μmol / l of conjugated bilirubin alone is added to the aqueous solution. By comparing these curves, we note that all forms of bilirubin oxidize in two stages at the respective potentials of -0.02V, and + 0.16V.
Les exemples suivants illustrent l'emploi d'une solution aqueuse à pH 7,4 pour effectuer le dosage de la bilirubine totale et de la bilirubine conjuguée.  The following examples illustrate the use of an aqueous solution at pH 7.4 for the determination of total bilirubin and of conjugated bilirubin.
Exemple 1 : Dosage de la bilirubine totale dans une solution à pH 7,4.  Example 1: Determination of total bilirubin in a solution at pH 7.4.
Dans cet exemple, on utilise un tampon phosphate 0,066M à pH 7,4 auquel on ajoute 50g/l d'acide benzoîque puis 30g/l de caféine, et une microcellule de mesure analogue à celle de la figure 1, et on choisit comme potentiel d'oxydation le potentiel Epi de -0,02V. On détermine tout d'abord l'intensité I1 obtenue avec ce potentiel lorsque la solution aqueuse est constituée uniquement du tampon phosphate, et l'intensité I2 obtenue à ce potentiel lorsque la solution aqueuse est le tampon phosphate contenant la caféine et l'acide benzoîque. In this example, use is made of a 0.066 M phosphate buffer at pH 7.4 to which 50 g / l of benzoic acid and then 30 g / l of caffeine are added, and a microcell of measurement similar to that of FIG. 1, and one chooses as oxidation potential the Epi potential of -0.02V. First of all, the intensity I 1 obtained with this potential is determined when the aqueous solution consists solely of the phosphate buffer, and the intensity I 2 obtained at this potential when the aqueous solution is the phosphate buffer containing caffeine and benzoic acid.
On mesure ensuite l'intensité X1 obtenue à ce même potentiel lorsque l'on ajoute 5μl de sérum à tester à 1ml de tampon phosphate seul, puis l'intensité X2 obtenue à ce potentiel lorsque l'on ajoute 5μl de sérum à 1ml de tampon phosphate contenant la caféine et l'acide benzoîque. The intensity X 1 obtained at this same potential is then measured when 5 μl of serum to be tested is added to 1 ml of phosphate buffer alone, then the intensity X 2 obtained at this potential when 5 μl of serum is added to 1 ml of phosphate buffer containing caffeine and benzoic acid.
On en déduit ainsi l'intensité d'oxydation de la bilirubine au potentiel appliqué, qui est de : lBRTOT= (X2-I2)-(X1-I1) We thus deduce the oxidation intensity bilirubin at the applied potential, which is: l BRTOT = (X 2 -I 2 ) - (X 1 -I 1 )
Etant donné que l'intensité (I) est proportionnelle à la concentration (C) en bilirubine, I=KC, on peut déterminer cette concentration en bilirubine après avoir étalonné l'appareil pour déterminer la constante K qui dépend du matériel, des réactifs et des conditions opératoires utilisés. Exemple 2 : Mesure de La bilirubine conjuguée dans une solution à pH 7,4 contenant un tensioactif anionique. Since the intensity (I) is proportional to the bilirubin concentration (C), I = KC, this bilirubin concentration can be determined after calibrating the device to determine the constant K which depends on the material, reagents and of the operating conditions used. Example 2: Measurement of the conjugated bilirubin in a solution at pH 7.4 containing an anionic surfactant.
Dans cet exemple, la solution aqueuse est constituée par le même tampon phosphate à pH 7,4 que dans l'exemple 1 auquel on ajoute 10mmol/l de dodécyl sulfate de sodium.  In this example, the aqueous solution consists of the same phosphate buffer at pH 7.4 as in Example 1 to which 10mmol / l of sodium dodecyl sulfate is added.
Dans ces conditions, comme il est représenté sur la figure 7, la bilirubine conjuguée et la bilirubine non conjuguée s'oxydent à -des potentiels différents. On peut donc déterminer la concentration en bilirubine conjuguée seule d'un échantillon en opérant à un potentiel inférieur à -0,02V.  Under these conditions, as shown in FIG. 7, the conjugated bilirubin and the unconjugated bilirubin oxidize at different potentials. We can therefore determine the concentration of conjugated bilirubin alone in a sample by operating at a potential below -0.02V.
Pour déterminer la concentration en bilirubine conjuguée d'un échantillon, on opère de la même façon que dans l'exemple 1 en déterminant tout d'abord les intensités I1 et l2 correspondant respectivement au tampon phosphate seul et au tampon phosphate additionné de dodécyl sulfate de sodium, puis l'intensité X1 correspondant au tampon phosphate seul contenant l'échantillon à tester et l'intensité X2 correspondant au tampon phosphate additionné de dodécyl sulfate de sodium et contenant l'échantil lon à tester. Dans ces conditions, l'intensité d'oxydation de la Br conjuguée est égale à To determine the concentration of conjugated bilirubin in a sample, the procedure is the same as in Example 1, first determining the intensities I 1 and l 2 corresponding respectively to the phosphate buffer alone and to the phosphate buffer supplemented with dodecyl. sodium sulfate, then the intensity X 1 corresponding to the phosphate buffer alone containing the test sample and the intensity X 2 corresponding to the phosphate buffer supplemented with sodium dodecyl sulfate and containing the sample lon to test. Under these conditions, the oxidation intensity of the conjugated Br is equal to
(X2-I2)-(X1-I1) (X 2 -I 2 ) - (X 1 -I 1 )
Cette intensité est proportionnelle à la concentration en bilirubine conjuguée, la constante dépendant également du matériel et des solutions utilisées. This intensity is proportional to the concentration of conjugated bilirubin, the constant also depending on the material and the solutions used.
Il.Utilisation d'une solution à pH 8.  Il.Use of a solution at pH 8.
La solution aqueuse utilisée peut être un tampon phosphate de Sorensen à pH 8. Dans ces conditions, lorsque les deux formes de bilirubines sont présentes dans un échantillon avec de l'albumine et un rapport molaire des bilirubines à l'albumine inférieur ou égal à 0,6 environ, l'intensité d'oxydation électrochimi que des bilirubines est 3 à 4 fois moindre qu'en l'absence d'albumine.  The aqueous solution used can be a Sorensen's phosphate buffer at pH 8. Under these conditions, when the two forms of bilirubins are present in a sample with albumin and a molar ratio of bilirubins to albumin less than or equal to 0 , Approximately 6, the electrochemical oxidation intensity of bilirubins is 3 to 4 times less than in the absence of albumin.
Lorsque le rapport molaire est supérieur à 0,6 environ, on obtient une oxydation de la bilirubine non conjuguée et de la bilirubine conjuguée en deux étapes.  When the molar ratio is greater than approximately 0.6, an oxidation of the unconjugated bilirubin and of the conjugated bilirubin is obtained in two stages.
Sur la figure 1, on a représenté les résultats obtenus avec cette solution. Sur cette figure, les courbes 61 et 62 se rapportent respectivement au tampon à pH 8 et au tampon à pH 8 contenant de l'albumine. La courbe 63 se rapporte au tampon à pH 8 auquel on ajoute 100μl d'un échantillon contenant 400μmol/l de bilirubine et 36g/l d'albumine, soit un rapport BrnC / albumine de 0,77. La courbe 64 se réfère aux résultats obtenus lorsqu'on ajoute à la solution aqueuse 100μl d'un échantillon contenant uniquement 400μmol/l de bilirubine. La courbe 65 se réfère aux résultats obtenus lorsqu'on ajoute au tampon à pH 8, 100ul d'une solution à 400μmol/l de bilirubine conjuguée. On remarque sur les courbes 63, 64 et 65 que la bilirubine non conjuguée et la bilirubine conjuguée s'oxydent en deux étapes qui ont respectivement les potentiels de +0,04V environ et +0, 19V environ. FIG. 1 shows the results obtained with this solution. In this figure, curves 61 and 62 relate respectively to the buffer at pH 8 and to the buffer at pH 8 containing albumin. Curve 63 relates to the buffer at pH 8 to which 100 μl of a sample containing 400 μmol / l of bilirubin and 36 g / l of albumin is added, ie a BrnC / albumin ratio of 0.77. Curve 64 refers to the results obtained when 100 μl of a sample containing only 400 μmol / l of bilirubin are added to the aqueous solution. Curve 65 refers to the results obtained when add to the buffer at pH 8, 100 μl of a 400 μmol / l solution of conjugated bilirubin. Note on curves 63, 64 and 65 that the unconjugated bilirubin and the conjugated bilirubin oxidize in two stages which have the potentials of approximately + 0.04V and +0.19V respectively.
Sur la figure 11, on a représenté les résultats obtenus avec ce même tampon à pH 8 lorsqu'on lui ajoute un agent tensioactif anionique constitué par du dodécyl sulfate de sodium (DSS) à raison de 10mmol/l.  FIG. 11 shows the results obtained with this same buffer at pH 8 when an anionic surfactant consisting of sodium dodecyl sulfate (DSS) is added to it at a rate of 10 mmol / l.
Sur cette figure, la courbe 71 se réfère au tampon seul contenant le dodécyl sulfate de sodium, la courbe 72 se réfère au tampon contenant le DSS auquel on ajoute 100μl d'un échantillon de bilirubine non conjuguée à 512μmol/l contenant 39g/l d'albumine, soit un rapport BrnC / albumine de 0,9. La courbe 73 se réfère aux résultats obtenus lorsque l'échantillon ajouté contient uniquement de la bilirubine non conjuguée. La courbe 74 se réfère aux résultats obtenus lorsque l'échantillon contient de l' albumine seule dans le tampon avec DSS.  In this figure, curve 71 refers to the buffer alone containing sodium dodecyl sulfate, curve 72 refers to the buffer containing DSS to which 100 μl of a sample of bilirubin unconjugated to 512 μmol / l containing 39 g / l d is added. albumin, i.e. a BrnC / albumin ratio of 0.9. Curve 73 refers to the results obtained when the added sample contains only unconjugated bilirubin. Curve 74 refers to the results obtained when the sample contains albumin alone in the buffer with DSS.
En comparant ces courbes, on remarque que les deux formes de bilirubines s'oxydent aux potentiels suivants : de -0,02V et de +0,16V.  By comparing these curves, we note that the two forms of bilirubins oxidize at the following potentials: from -0.02V and from + 0.16V.
III.Utilisation d'une solution à pH 5.  III.Use of a solution at pH 5.
Dans ce cas, on peut utiliser comme solution aqueuse, une solution tampon phosphate de Sorensen.  In this case, it is possible to use as aqueous solution, a phosphate buffer solution from Sorensen.
Sur la figure 12, on a représenté les résultats obtenus avec une telle solution. Sur cette figure, la courbe 81 se réfère à la solution aqueuse de tampon phosphate à pH 5 contenant 40g/l d'albumine. La courbe 82 se réfère à la même solution aqueuse contenant de plus 100μl d'un échantillon à 271μmol/l de bilirubine non conjuguée et 39g/l d'albumine, soit un rapport BRnC / albumine de 0,48, la courbe 83 se réfère à la même solution contenant 100μl d'un échantillon à 426μmol/l de bilirubine non conjuguée, soit un rapport BRnC / a lb de 0,77, et les courbes 84, 85 et 86 se réfèrent aux résultats obtenus lorsque l'échantillon est de la bilirubine conjuguée à 345μmol/l pour la courbe 84, 500μmol/l pour la courbe 85 et 1000μmol/l pour la courbe 86, avec 39g/l d'albumine, soit un rapport BRC / alb de 0,63 pour la courbe 84, 0,91 pour la courbe 85 et 1,81 pour la courbe 86. FIG. 12 shows the results obtained with such a solution. In this figure, curve 81 refers to the aqueous solution of phosphate buffer at pH 5 containing 40 g / l albumin. Curve 82 refers to the same aqueous solution additionally containing 100 μl of a sample containing 271 μmol / l of unconjugated bilirubin and 39 g / l of albumin, i.e. a BRnC / albumin ratio of 0.48, curve 83 refers to the same solution containing 100 μl of a sample at 426 μmol / l of unconjugated bilirubin, ie a BRnC / a lb ratio of 0.77, and curves 84, 85 and 86 refer to the results obtained when the sample is bilirubin conjugated to 345 μmol / l for curve 84, 500 μmol / l for curve 85 and 1000 μmol / l for curve 86, with 39 g / l of albumin, i.e. a BRC / alb ratio of 0.63 for curve 84 , 0.91 for curve 85 and 1.81 for curve 86.
En comparant toutes ces courbes, on remarque que la bilirubine non conjuguée s'oxyde en une seule étape à un potentiel de 0,16V environ avec une intensité limite très faible et que la bilirubine conjuguée s'oxyde en deux étapes à des potentiels respectifs de +0,1V et +0,22V. On peut ainsi utiliser une solution à pH 5 pour doser séparément la bilirubine conjuguée et la bilirubine non conjuguée non liée à l'albumine et la bilirubine non conjuguée totale.  By comparing all these curves, it is noted that the unconjugated bilirubin oxidizes in a single step at a potential of about 0.16 V with a very low limiting intensity and that the conjugated bilirubin oxidizes in two steps at respective potentials of + 0.1V and + 0.22V. It is thus possible to use a solution at pH 5 to assay separately the conjugated bilirubin and the unconjugated bilirubin not linked to albumin and the total unconjugated bilirubin.
Les exemples 3, 4 et 5 qui suivent illustrent de tels dosages.  Examples 3, 4 and 5 which follow illustrate such dosages.
Exemple 5 : Dosage coulométrique de la bilirubine conjuguée.  Example 5: Coulometric determination of conjugated bilirubin.
Dans cet exemple, on utilise comme solution aqueuse une solution acide à pH 5 constituée par un tampon phosphate 0,066M.  In this example, an acid solution at pH 5 consisting of a 0.066M phosphate buffer is used as the aqueous solution.
D'après les courbes de la figure 12, on sait qu'à ce pH la bilirubine conjuguée s'oxyde en deux étapes à des potentiels de +0,1V et +0,2V, tandis que la bilirubine non conjuguée s'oxyde très faiblement à un potentiel différent (+0,16V). From the curves of Figure 12, we know that at this pH the conjugated bilirubin oxidizes in two stages at potentials of + 0.1V and + 0.2V, while unconjugated bilirubin oxidizes very weakly to a different potential (+ 0.16V).
On choisit donc pour le dosage un potentiel de +0,06V pour oxyder uniquement la bilirubine conjuguée.  A potential of + 0.06 V is therefore chosen for the assay to oxidize only the conjugated bilirubin.
On introduit dans la cellule coulométrique (voir figure 11) 5μl d'échantillon préalablement dilués dans 1ml de tampon pH5.  5 μl of sample previously diluted in 1 ml of pH5 buffer are introduced into the coulometric cell (see FIG. 11).
On effectue une première mesure photométrique à 450nm ( l 1 ) ou à 380nm (I'1). On applique ensuite un potentiel de +0,06V à l'électrode de travail 127 pendant une durée suffisante pour effectuer une électrolyse totale de l'échantillon. Après cette électrolyse on effectue une deuxième lecture photométrique à 450nm (I2) ou à 380nm ('l2) selon le cas. A first photometric measurement is carried out at 450nm (l 1 ) or 380nm (I ' 1 ). A potential of + 0.06V is then applied to the working electrode 127 for a time sufficient to carry out a total electrolysis of the sample. After this electrolysis, a second photometric reading is carried out at 450nm (I 2 ) or 380nm ('l 2 ) as the case may be.
La différence entre les deux mesures ( l'2-l'1) ou (l1-l2) est directement proportionnelle à la quantité de BRC électrolysée. Après un étalonnage approprié de l'appareil, on obtient la concentration en bilirubine conjuguée de l'échantillon de départ. The difference between the two measurements (l ' 2 -l' 1 ) or (l 1 -l 2 ) is directly proportional to the amount of BRC electrolyzed. After an appropriate calibration of the apparatus, the concentration of conjugated bilirubin is obtained from the initial sample.
On pourrait encore effectuer la mesure par spectrofluorescence différentielle après électrolyse à +0,22V.  We could also carry out the measurement by differential spectrofluorescence after electrolysis at + 0.22V.
Exemple 4 : Dosage coulométrique de la bilirubine non conjuguée, non liée à l'albumine.  Example 4: Coulometric determination of unconjugated bilirubin, not linked to albumin.
Dans cet exemple, on effectue tout d'abord une électrolyse totale de la solution aqueuse contenant l'échantillon à doser dans un tampon à pH 5 comme précédemment à un potentiel de +0,06V pour débarrasser définitivement l'échantillon de la bilirubine sous forme conjuguée. Après cette étape, on ramène le pH du milieu à 7,4 par addition de soude concentrée 2 à 10N. Dans un tel milieu, seules les fractions de b i l i r u b i n e non conjuguée, non liée à l'albumine sont oxydées, comme cela a été indiqué précédemment, la réaction d'oxydation ayant lieu en deux étapes à des potentiels de -0,03V et +0,19V. In this example, first of all a total electrolysis of the aqueous solution containing the sample to be assayed is carried out in a buffer at pH 5 as before at a potential of + 0.06 V to permanently rid the sample of the bilirubin in the form conjugate. After this step, the pH of the medium is reduced to 7.4 by adding concentrated sodium hydroxide 2 to 10N. In such a medium, only the fractions of unconjugated bilirubin, not linked to albumin are oxidized, as indicated above, the oxidation reaction taking place in two stages at potentials of -0.03V and + 0.19V.
Aussi, après avoir ramené le pH du milieu à 7,4 par addition de soude, on applique à l'électrode (9) un potentiel de 0,0V pour oxyder la bilirubine non conjuguée, non liée à l'albumine. On peut ainsi déterminer la concentration en bilirubine non conjuguée, non liée aux protéines (rapport BrnC / alb >0,8).  Also, after bringing the pH of the medium to 7.4 by adding sodium hydroxide, a potential of 0.0V is applied to the electrode (9) to oxidize the unconjugated bilirubin, not linked to albumin. It is thus possible to determine the concentration of unconjugated bilirubin, not linked to proteins (BrnC / alb ratio> 0.8).
Exemple 5 : Dosage de la bilirubine non conjuguée. Example 5: Determination of unconjugated bilirubin.
Dans cet exemple, on suit le même mode opératoire que dans l'exemple 4 pour débarrasser tout d'abord l'échantillon de la bilirubine sous forme conjuguée en réalisant l'électrolyse à un potentiel de 0,06V par exemple. Après cette opération, on amène le pH du milieu à 7,4 à l'aide de soude concentrée comme dans l'exemple 4, puis on introduit un agent capable de rompre les liaisons bilirubine-albumine, par exemple du dodécyl sulfate de sodium ou du chlorure d'hexadécyl triéthylammonium et on réalise ensuite l'oxydation électrochimique de la bilirubine conjuguée au potentiel voulu qui dépend du réactif ajouté.  In this example, the same procedure is followed as in Example 4 to first rid the sample of bilirubin in conjugated form by carrying out the electrolysis at a potential of 0.06 V for example. After this operation, the pH of the medium is brought to 7.4 using concentrated sodium hydroxide as in Example 4, then an agent capable of breaking the bilirubin-albumin bonds is introduced, for example sodium dodecyl sulfate or hexadecyl triethylammonium chloride and then performs the electrochemical oxidation of bilirubin conjugated to the desired potential which depends on the reagent added.
On détermine ensuite la concentration de bilirubine non conjuguée présente dans l'échantillon en utilisant l'une des méthodes de mesure citées précédemment.  The concentration of unconjugated bilirubin present in the sample is then determined using one of the measurement methods mentioned above.
IV. Utilisation d'une solution aqueuse ayant un pH de 3,7.  IV. Use of an aqueous solution with a pH of 3.7.
La solution aqueuse utilisée est un tampon glycoeolle à pH 3,7. On détermine comme précédemment les courbes intensité en fonction de la tension appliquée. Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 13.  The aqueous solution used is a glycoeolle buffer at pH 3.7. The intensity curves are determined as before as a function of the applied voltage. The results obtained are given in FIG. 13.
Sur cette figure, la courbe 101 se rapporte au tampon glycoeolle contenant de la bilirubine non conjuguée à 427umol/l de bilirubine et de l'albumine avec un rapport BRnC / albumine de 0,77. La courbe 102 se rapporte au tampon glycoeolle contenant de la biliverdine seule non conjuguée (500μmol/l), la courbe 103 se rapporte au tampon glycoeolLe contenant de l'albumine et 345μmol/l de bilirubine conjuguée (rapport BRC / Alb = 0,63), La courbe 104 se rapporte au tampon glycoeolLe contenant de l'albumine et 500μmol/l de bilirubine conjuguée (rapport BRC / alb = 0,91), la courbe 105 se rapporte au tampon glycoeolle contenant 1000μmol/l de bilirubine conjuguée en présence d'albumine (rapport BRC / Alb = 1,81). In this figure, curve 101 relates glycoeolle buffer containing bilirubin unconjugated to 427umol / l bilirubin and albumin with a BRnC / albumin ratio of 0.77. Curve 102 relates to the glycoeolle buffer containing unconjugated biliverdin alone (500 μmol / l), curve 103 relates to the glycoeol buffer containing albumin and 345 μmol / l of conjugated bilirubin (BRC / Alb ratio = 0.63 ), Curve 104 relates to the glycoeol buffer containing albumin and 500 μmol / l of conjugated bilirubin (BRC / alb ratio = 0.91), curve 105 relates to the glycoeolle buffer containing 1000 μmol / l of conjugated bilirubin albumin (BRC / Alb ratio = 1.81).
En comparant ces courbes, on remarque que seule la bilirubine conjuguée est oxydée en deux étapes (courbes 103, 104 et 105). Les potentiels d'oxydation sont respectivement de -0,02V et +0,13V.  By comparing these curves, it is noted that only the conjugated bilirubin is oxidized in two stages (curves 103, 104 and 105). The oxidation potentials are respectively -0.02V and + 0.13V.
Les résultats obtenus avec les différentes solutions décrites ci-dessus sont regroupés dans le tabLeau suivant qui donne les valeurs des potentiels d'oxydation observés.  The results obtained with the various solutions described above are grouped in the following table which gives the values of the oxidation potentials observed.
Bien que dans les exemples décrits cidessus, on ait pratiquement toujours effectué les mesures de concentration par coulométrie ou ampérométrie, on peut effectuer ces mesures par voie spectrophotométrique.  Although in the examples described above, the concentration measurements have almost always been made by coulometry or amperometry, these measurements can be carried out spectrophotometrically.
A titre d'exemple, on donne ci-après les résultats obtenus en faisant circuler dans une cellule analogue à celle de la figure 4 , une phase mobile constituée par du tampon phosphate à pH 7,4 contenant de l'acide benzoîque (50g/l) et de la caféine (30g/l) et en injectant 100μl d'un échantillon de sérum contenant 5,1μmol/l de bilirubine pour un rapport BRnC / Alb de 0,35, à un débit de 0,8ml/min en appliquant à l'électrode des potentiels variables. On mesure en continu à la sortie de la cellule, la densité optique du milieu à 440nm. By way of example, the results obtained by circulating in a cell similar to that of FIG. 4 are given below, a mobile phase constituted by phosphate buffer at pH 7.4 containing benzoic acid (50 g / l) and caffeine (30 g / l) and by injecting 100 μl of a serum sample containing 5.1 μmol / l of bilirubin for a BRnC / Alb ratio of 0.35, at a flow rate of 0.8ml / min by applying variable potentials to the electrode. The optical density of the medium is measured continuously at the cell outlet at 440 nm.
La figure 14 représente l'évolution de la densité optique de la solution traversant en continu l'installation de la figure 4 en fonction du potentiel appliqué. Sur cette figure, on remarque qu'à +0,7V, la baisse de densité optique à 440nm atteint 90% de la densité optique initiale.  FIG. 14 represents the evolution of the optical density of the solution continuously passing through the installation of FIG. 4 as a function of the potential applied. In this figure, we note that at + 0.7V, the drop in optical density at 440nm reaches 90% of the initial optical density.
Dans ce cas précis, un potentiel de 0,7V est nécessaire pour oxyder 90% de la BR présente dans l'échantillon sanguin. En effet à un voltage inférieur, la surface de l'électrode de la cellule (3) de la figure 4 et le temps de passage de l'échantillon (0,5ml/min) ne sont pas suffisants pour obtenir l'électrolyse totale. La spécificité du dosage est néanmoins obtenue par la mise en évidence de la baisse de la densité optique à 440nm.  In this specific case, a potential of 0.7V is necessary to oxidize 90% of the BR present in the blood sample. In fact, at a lower voltage, the surface of the cell electrode (3) of FIG. 4 and the passage time of the sample (0.5 ml / min) are not sufficient to obtain total electrolysis. The specificity of the assay is nevertheless obtained by highlighting the drop in optical density to 440nm.
Lorsqu'on veut réaliser la mesure par spectrophotométrie, on peut utiliser comme cellule de mesure, une cuve coulomét ri que à faces optiques pour effectuer directement dans la cellule d'électrolyse la mesure de densité optique.  When it is desired to carry out the measurement by spectrophotometry, it is possible to use as a measuring cell, a coulometric cell with optical faces to carry out the optical density measurement directly in the electrolysis cell.
Sur la figure 15 , on a représenté une cellule de ce type. Celle-ci comprend une cuve parallélépipédique (121) dans laquelle on peut introduire la solution d'échantillon (123) à doser. Un agitateur magnétique (125) est disposé au fond de la cuve et une électrode de travail (127) est plaquée sur la paroi latérale de la cuve.  In Figure 15, there is shown a cell of this type. This comprises a parallelepiped tank (121) into which the sample solution (123) to be assayed can be introduced. A magnetic stirrer (125) is arranged at the bottom of the tank and a working electrode (127) is pressed against the side wall of the tank.
Une microélectrode de référence (129) constituée par exemple par une électrode Ag/AgCl, est disposée dans une tubulure (130) en contact électrolytique avec la solution (123) par l'intermédiaire d'un verre fritte. Une électrode auxiliaire (131) constituée par exemple par un fil de platine, est disposée dans une tubulure (132) également en contact éleetrolytique a ve c la solution (123). A reference microelectrode (129) constituted for example by an Ag / AgCl electrode, is placed in a tube (130) in electrolytic contact with the solution (123) by through a sintered glass. An auxiliary electrode (131) constituted for example by a platinum wire, is arranged in a tube (132) also in electrolytic contact with the solution (123).
La cuve (121) comprend deux faces optiques parallèles formant une fenêtre optique pour le passage d'un faisceau lumineux afin de pouvoir déterminer directement la densité optique de la solution (123) présente dans la cuve. Les trois électrodes sont reliées à un générateur électrique non représenté sur le dessin en vue d'appliquer à l'électrode de travail (127) un potentiel contrôlé par rapport à l'électrode de référence.  The tank (121) comprises two parallel optical faces forming an optical window for the passage of a light beam in order to be able to directly determine the optical density of the solution (123) present in the tank. The three electrodes are connected to an electric generator not shown in the drawing in order to apply to the working electrode (127) a controlled potential with respect to the reference electrode.
Dans cette cellule, on pourrait remplacer l'électrode plaquée (127) par un fil immergé dans la solution, du moment qu'il soit disposé de façon à ne pas interférer avec le faisceau lumineux qui traverse le récipient pour mesurer la densité optique.  In this cell, the plated electrode (127) could be replaced by a wire immersed in the solution, as long as it is arranged so as not to interfere with the light beam which passes through the container to measure the optical density.
Comme on l'a vu ci-dessus. le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre pour effectuer différents dosages et on va décrire ci-après les résultats obtenus par coulométrie à potentiel imposé à + 0,65V (Coulochem, ESA) sur du sérum ictérique. Dosage de la bilirubine dans du sérum ictérique.  As seen above. the method of the invention can be implemented for carrying out different assays and the results obtained by coulometry with potential imposed at + 0.65V (Coulochem, ESA) on icteric serum will be described below. Determination of bilirubin in icteric serum.
Pour ce dosage, on utilise la cellule représentée sur la figure 15 que l'on dispose dans le portoir d'un spect rophotomét re UVIKON 810 (KONTRON Instruments) et on pilote le potentiel appliqué à l'électrode de Travail par un module 5 100 A (Coulochem ESA).  For this assay, the cell shown in FIG. 15 is used which is placed in the rack with a photophotometric spectrometer UVIKON 810 (KONTRON Instruments) and the potential applied to the working electrode is controlled by a module 5 100 A (Coulochem ESA).
Dans la cuve 121 installée dans le spectrophotométre, on délivre 5 ml de solution conductrice et 200 μl de sérum ictérique. La solution étant agitée en continu, on impose le potentiel à + 0,65V et on suit l'évolution spectrale de la solution au cours du temps. In the tank 121 installed in the spectrophotometer, 5 ml of solution are delivered conductive and 200 μl of icteric serum. The solution being continuously agitated, the potential is imposed at + 0.65V and the spectral evolution of the solution is monitored over time.
Sur la figure 16, on a représenté les courbes obtenues avec différentes solutions, avant et après coulométrie, qui illustrent les densités optiques des solutions en fonction des longueurs d'onde (en nm).  FIG. 16 shows the curves obtained with different solutions, before and after coulometry, which illustrate the optical densities of the solutions as a function of wavelengths (in nm).
Sur cette figure, la courbe 151 se réfère aux résultats obtenus avec 4,8 ml de tampon phosphate (pH = 7,4).  In this figure, curve 151 refers to the results obtained with 4.8 ml of phosphate buffer (pH = 7.4).
La courbe 152 se rapporte à la solution Curve 152 relates to the solution
11 qui est obtenue en ajoutant 200 μl de sérum ictérique à 4,8 ml du tampon phosphate utilisé précédemment, le sérum contenant 200 μmol/l de BR totale déterminés par diazoréaction et 37 g/l d'albumine déterminés par néphélométrie. 11 which is obtained by adding 200 μl of icteric serum to 4.8 ml of the phosphate buffer used previously, the serum containing 200 μmol / l of total BR determined by diazoreaction and 37 g / l of albumin determined by nephelometry.
La courbe 153 se réfère à la solution 11 après 30 minutes de coulométrie à + 0,65V.  Curve 153 refers to solution 11 after 30 minutes of coulometry at + 0.65V.
La courbe 154 se réfère à la solution Curve 154 refers to the solution
12 qui est obtenue en ajoutant 50 g/l d'acide benzoîque et 30 g/l de caféine à la solution 11. 12 which is obtained by adding 50 g / l of benzoic acid and 30 g / l of caffeine to solution 11.
La courbe 155 se réfère à la solution 12 après 30 minutes de coulométrie à + 0,65V.  Curve 155 refers to solution 12 after 30 minutes of coulometry at + 0.65V.
Ces courbes montrent que la BR n'est pas électrooxydable en présence d'albumine sérique dans les conditions opératoires utilisées (courbe 153). En présence de caféine, la BR s'oxyde rapidement comme en témoigne la baisse de la DO de la solution au maximum d'absorption du pigment (courbe 155).  These curves show that the BR is not electro-stainless in the presence of serum albumin under the operating conditions used (curve 153). In the presence of caffeine, the BR oxidizes rapidly as evidenced by the drop in the OD of the solution at the maximum absorption of the pigment (curve 155).
Dans les exemples décrits ci-dessus, on a utilisé les potentiels mesurés correspondant aux figures pour choisir le potentiel à appliquer.In the examples described above, the corresponding measured potentials were used to the figures to choose the potential to be applied.
Etant donné que la valeur de ce potentiel dépend de l'appareillage, de la solution et des réactifs utilisés, il convient dans chaque cas de déterminer préalablement les potentiels qui correspondent aux pics d'oxydation avec l'appareillage et la solution utilisée. Since the value of this potential depends on the apparatus, the solution and the reagents used, it is advisable in each case to determine beforehand the potentials which correspond to the oxidation peaks with the apparatus and the solution used.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de dosage de la bilirubine présente dans un milieu biologique sous forme conjuguée et/ou sous forme non conjuguée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : 1. Method for assaying bilirubin present in a biological medium in conjugated form and / or in non-conjugated form, characterized in that it comprises the following successive stages:
a) introduire un échantillon du milieu biologique dans une solution aqueuse, conductrice de l'électricité ayant un pH de 3 à 10,  a) introducing a sample of the biological medium into an aqueous, electrically conductive solution having a pH of 3 to 10,
b) soumettre la solution ainsi obtenue à une oxydation électrochimique à un potentiel tel qu'on oxyde au moins une partie de la bilirubine présente dans l'échantillon, et  b) subjecting the solution thus obtained to electrochemical oxidation at a potential such that at least part of the bilirubin present in the sample is oxidized, and
c) déterminer la quantité de bilirubine ainsi oxydée.  c) determine the quantity of bilirubin thus oxidized.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution aqueuse conductrice de l'électricité est une solution de chlorure de sodium.  2. Method according to claim 1, characterized in that the aqueous electrically conductive solution is a sodium chloride solution.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution aqueuse conductrice de l'électricité est une solution tampon choisie parmi les tampons phosphate ayant un pH de 5 à 8 et les tampons glycoeolle ou lactate ayant un pH inférieur à 5.  3. Method according to claim 1, characterized in that the electrically conductive aqueous solution is a buffer solution chosen from phosphate buffers having a pH of 5 to 8 and glycoeolle or lactate buffers having a pH of less than 5.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la solution comprend de plus un réactif capable de rompre les liaisons bilirubine-albumine et/ou de solubiliser les bilirubines dans cette solution.  4. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the solution further comprises a reagent capable of breaking the bilirubin-albumin bonds and / or of dissolving the bilirubins in this solution.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit réactif est choisi parmi les accélérateurs de diazoréaction, les agents tensioactifs anioniques et cationiques, et les solvants organiques. 5. Method according to claim 4, characterized in that said reagent is chosen from diazoreaction accelerators, agents anionic and cationic surfactants, and organic solvents.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'accélérateur de diazoréaction est constitué par au moins un composé choisi parmi la caféine et la diphylline.  6. Method according to claim 5, characterized in that the diazoreaction accelerator consists of at least one compound chosen from caffeine and diphylline.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que, dans l'étape c), on détermine la quantité de bilirubine oxydée par ampérométrie différentielle et en ce que l'on déduit de cette mesure la quantité de bilirubine oxydable dans ces conditions, présente initialement dans le milieu biologique.  7. Method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that, in step c), the amount of bilirubin oxidized is determined by differential amperometry and in that the amount of bilirubin oxidizable under these conditions, initially present in the biological medium.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que, dans l'étape c), on détermine la quantité de bilirubine oxydée par coulométrie différentielle.  8. Method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that, in step c), the amount of bilirubin oxidized is determined by differential coulometry.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que, dans l'étape c), on détermine la quantité de bilirubine oxydée par speetrophotométrie différentielle.  9. Method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that, in step c), the amount of bilirubin oxidized is determined by differential speetrophotometry.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la solution aqueuse a un pH de 7,4 + 0,5, en ce qu'elle contient un réactif constitué par un agent tensioactif anionique, et en ce que l'on opère dans l'étape b) à un potentiel tel que l'on oxyde uniquement la bilirubine conjuguée.  10. Method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the aqueous solution has a pH of 7.4 + 0.5, in that it contains a reagent consisting of an anionic surfactant, and in what is done in step b) at a potential such that only the conjugated bilirubin is oxidized.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la solution aqueuse a un pH d'environ 8, en ce qu'elle contient un réactif constitué par un agent tensioactif anionique et en ce que l'on opère dans l'étape b) à un potentiel tel que l'on oxyde la bilirubine conjuguée et la bilirubine non conjuguée. 11. Method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the aqueous solution has a pH of approximately 8, in that it contains a reagent consisting of an anionic surfactant and in that one operates in stage b) at a potential such that the conjugated bilirubin and the unconjugated bilirubin are oxidized.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé en ce que l'agent tensioactif anionique est le dodécylsulfate de sodium ou le cholate de sodium.  12. Method according to any one of claims 10 and 11, characterized in that the anionic surfactant is sodium dodecylsulfate or sodium cholate.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la solution aqueuse a un pH de 7,4 + 0,5, en ce qu'elle contient un réactif constitué par un agent tensioactif cationique ou par un accélérateur de diazoréaction, et en ce que l'on opère dans l'étape b) à un potentiel tel que l'on oxyde la bilirubine conjuguée et la bilirubine non conjuguée.  13. Method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the aqueous solution has a pH of 7.4 + 0.5, in that it contains a reagent consisting of a cationic surfactant or by a diazoreaction accelerator, and in that one operates in step b) at a potential such that the conjugated bilirubin and the unconjugated bilirubin are oxidized.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la solution aqueuse a un pH d'environ 5 et en ce que l'on opère à un potentiel tel que l'on oxyde soit la bilirubine conjuguée seule, soit la bilirubine non conjuguée et la bilirubine conjuguée.  14. Method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the aqueous solution has a pH of approximately 5 and in that one operates at a potential such that one oxidizes is the conjugated bilirubin alone , i.e. unconjugated bilirubin and conjugated bilirubin.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la solution aqueuse a un pH d'environ 3 et en ce que l'on opère à un potentiel tel que l'on oxyde unique- ment la bilirubine conjuguée.  15. Method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the aqueous solution has a pH of approximately 3 and in that one operates at a potential such that only bilirubin is oxidized conjugate.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'on élimine tout d'abord la bilirubine conjuguée de l'échantillon en utilisant une solution à un pH d'environ 5 et en réalisant une oxydation électrochimique à un potentiel tel que l'on oxyde toute la bilirubine conjuguée, on ajuste ensuite le pH de la solution à environ 7,4, on réalise une oxydation électrochimique à un potentiel tel que l'on oxyde uniquement la bilirubine non conjuguée, non liée à l'albumine, et on détermine la quantité de bilirubine non conjuguée, non liée ainsi oxydée par speetrophotométrie ou par spectrofluorescencedifférentielle. 16. Method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the conjugated bilirubin is first removed from the sample by using a solution at a pH of approximately 5 and by carrying out an electrochemical oxidation at a potential such that all of the conjugated bilirubin is oxidized, the pH of the solution is then adjusted to approximately 7.4, an electrochemical oxidation is carried out at a potential such that one oxidizes only the unconjugated bilirubin, not linked to albumin, and the amount of unconjugated, unbound bilirubin is determined, thus oxidized by speetrophotometry or by differential spectrofluorescence.
17. Cellule de mesure pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle comprend :  17. Measuring cell for implementing the method according to claim 9, characterized in that it comprises:
une cuve parallélipipédique munie de deux faces parallèles formant une fenêtre optique pour le passage d'un faisceau lumineux en vue de mesurer la densité optique d'une solution présente dans la cuve,  a parallelipipedic tank provided with two parallel faces forming an optical window for the passage of a light beam in order to measure the optical density of a solution present in the tank,
- une électrode de travail disposée dans la cuve de façon à ne pas être située sur le passage d'un faisceau lumineux traversant la fenêtre optique,  - a working electrode placed in the tank so as not to be located on the passage of a light beam passing through the optical window,
- une électrode auxiliaire et une électrode de référence disposées de manière à être en contact éleetrolytique avec une solution présente dans la cuve, et  an auxiliary electrode and a reference electrode arranged so as to be in electrolytic contact with a solution present in the tank, and
- des moyens pour relier les électrodes à un générateur électrique.  - Means for connecting the electrodes to an electric generator.
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