WO1990013630A1 - Retrovirus hautement cytopathogenique hiv-ndk, fragments d'adn de ce retrovirus, procede de preparation d'une proteine et/ou enzyme de ce virus et leurs utilisations - Google Patents

Retrovirus hautement cytopathogenique hiv-ndk, fragments d'adn de ce retrovirus, procede de preparation d'une proteine et/ou enzyme de ce virus et leurs utilisations Download PDF

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virus
dna fragment
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Jean-Claude Chermann
Christian Devaux
Françoise Rey
Joséphine SIRE
Bruno Spire
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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    • C12N2740/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences

Definitions

  • the present invention relates to a retrovirus HIV-NDK and its mutants.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • nucleotide sequences of prototypes of LAV 1 or HTLV IIIB revealed a complex organization including three structural genes and at least five regulatory genes.
  • CD4 + cells consisting of a massive degeneration of the cell population.
  • the present invention relates to a highly cytopathogenic HIV retrovirus known as NDK, characterized in that it is the virus having the structure corresponding to FIG. 2 as well as its mutants.
  • This HIV 1-NDK strain was isolated from a patient with
  • NDK HIV isolated from the chimpanzee induces a T4 depletion
  • the HIV 1-NDK strain is the only strain capable of developing such an effect in vivo.
  • the present invention relates, not only as has been said previously, to this new virus and its mutants, but also to DNA fragments of said virus which code for one of the proteins of the virus, in particular for antigenic proteins in primates.
  • HIV-NDK By mutants of the HIV-NDK virus, it is intended to denote the HIV viruses of the HIV 1 type which are not inhibited by OKT A.
  • HIV-NDK will be used to denote both the virus itself, represented in FIG. 2, that its mutants because the property of not being inhibited by OKT4A clearly distinguishes this class of virus from other HIV 1 viruses such as ROD or BRU.
  • sequences of interest in the context of detecting and combating HIV infections, mention should be made of the sequences coding for the nucleocapsid protein p18 as well as the protein itself and the sequence coding for the element of negative regulation. Indeed, the comparative study shows that these elements differ notably for the NDK virus and therefore present a very particular interest.
  • the prior art has already widely described the methods for cloning the DNA fragments coding for the genes in question and the description indicates how the genes in question can be localized and isolated by known technologies such as the cDNA method after localization with a probe, for example a radioactive probe.
  • the invention also relates to the methods making it possible to prepare these proteins and / or enzymes of the viruses in question, in particular by means of a method in which host cells transformed, transfected or infected with a vector are cultivated, on an appropriate culture medium. expression of said protein and / or enzyme comprising the DNA sequence coding for said protein and / or enzyme, under the control of a promoter of transcription of this sequence in the host, as well as the elements ensuring the translation of the protein and / or enzyme from the viruses, and said protein and / or enzyme is separated after culture.
  • the technologies allowing the expression of proteins from the gene are technologies which are currently known, which have already been used on numerous occasions for the expression of various genes of the viruses, both HIV-1 and HIV-2 and d still other viruses.
  • prokaryotic systems in particular bacteria, when the protein does not require glycosylation, or eukaryotic systems such as yeast, will be used as host, in order to ensure production. or more complex eukaryotic systems such as mammalian cells when it is desired to obtain a protein which is very close to the natural protein.
  • the proteins thus obtained can be used to make antibodies, in particular monoclonal antibodies corresponding to each of these proteins, by technologies which are also known to those skilled in the art and which have been widely developed since the work of Kohler and Millstein, again these antibodies exist for HIV-1 and HIV-2, the technology developed in this case can be transposed to the case of the virus according to the present invention.
  • the proteins and antibodies of the virus in question can be used in order to highlight certain diseases linked to immunodeficiencies, in particular induced by retroviruses such as the NDK virus but also related retroviruses.
  • the antigenic proteins in question may be used for the production of vaccines intended for the prevention, but also for the treatment, of diseases induced by NDK or related retroviruses.
  • the proteins corresponding in particular to gp120 can also be used as blocking and saturation agent for the corresponding receptor sites.
  • viruses comprising sequences coding for one or more of the proteins in question
  • the vector viruses preferably being viruses known for their safety or having already been tested for a long time, in in particular, they may be viruses of the poxvirus family such as vaccinia, the corresponding virus possibly being alive, attenuated or killed.
  • the present invention also relates to the monoclonal antibodies directed against the domain VI of the CD * protein, but which do not compete with the monoclonal antibody OKT-VA.
  • This type of monoclonal antibody has been tested and shown to inhibit the viral production of HIV in infected cells. These include the 13B8-2 monoclonal antibody.
  • monoclonal antibodies can be used in vitro or in vivo to inhibit viral production in the case of infected cells.
  • Figure 1 Restriction map of pNDK containing the full length of the HIV 1-NDK genome subcloned into the HindIII site of pUC18.
  • Figure 2 Complete nucleotide sequence of HIV 1-NDK.
  • FIG. 3 Multi-alignment of the envelope amino acid sequences of 4 viral isolates. HIV 1-NDK was used as the reference sequence.
  • Figure 4 Amino acid sequence of gp120 corresponding to the greatest variability between 6153 and 6215.
  • Figure 5 Alignment of the gag amino acid sequences of the HIV 1 prototype and of HIV 1-NDK.
  • HIV 1-NDK was isolated from peripheral blood lymphocytes as previously described (1). The virus was then propagated in a continuous permissive CEM cell line (2). Viral production was monitored by reverse transcriptase assays, immunofluorescence and electron microscopy. b) Determination of cytopathogenicity
  • the cytopatogenicity of the HIV viral strains was determined by superinfection of HTLV 1 positive MT4 cell lines. The number of surviving cells was determined by exclusion with Tryptan blue seven days after infection. c) Molecular cloning by a genomic library
  • the high molecular weight DNA extracted from CEM cells infected with HIV 1-NDK was partially digested with Hind III in order to obtain fragments between 10 and 15 kb in size which were then purified by a gradient of 10 % to 40% in sucrose (3).
  • the product of the partial digestion was bound in the phage L-.7 cleaved by HindIII.
  • the large molecules thus obtained were packaged with a Gigapack-Gold extract.
  • the library was screened by the pBTl probe corresponding to the large Sac I - Sac I fragment of the HIV 1 prototype.
  • COS-1 cells were seeded at a density of 4.10 6 per 75 cm 2 flask, 24 hours before transfection.
  • the transfection for subsequent DNA analyzes was carried out by the calcium phosphate co-precipitation technique (7), using 10 ⁇ g of plasmid DNA. After 12 hours, the cell culture was stirred with 10% DMSO for 1 minute before recovering it in DMEM with 10% FCS. CEM cells were added to COS-1 cells 16 hours after transfection and co-cultured for 21 days while reverse transcriptase activity was tested in the supernatant released from all cells.
  • EXAMPLE 1 EXAMPLE 1
  • Recombinant phages isolated from the L47 genomic libraries were subcloned using partial digestion with Hind III in the plasmid pUC 18.
  • the restriction map of one of the recombinant plasmids pNDK is presented in FIG. 1. Since the Sac 1 and Hind III sites have always been found in the LTR of all the isolates for the time being published, the digestion of pNDK with these enzymes has been carried out. The Sac 1 digestion allows the identification of an internal viral fragment of 9.1 kb and, the hybridization of the Hind III fragments with the pBTl probe clearly identifies the junction fragments with the cell genomes. Analysis of the restriction enzyme map indicates that the HIV 1-NDK genome is different from other known HIV 1 isolates.
  • HIV 1-NDK complete nucleotide sequence of HIV 1-NDK is presented in FIG. 2 with the amino acid sequence assumed for all the open reading frames.
  • the genomic organization of HIV 1-KDN is similar to that of the other sequenced strains of HIV 1.
  • the HIV 1-NDK genome is 9143 nucleotides long (in its RNA form) and has three structural genes GAG, POL and ENV , the two TAT and REV genes, each consisting of two coding exons.
  • the other regulatory genes VIF and NEF could also be detected, the HIV 1-NDK sequence contains the VPU gene which was recently identified as a functional gene. No additional open reading frame other than those presented on the other HIV 1 strains could be detected.
  • the percentage of amino acid homologs was calculated for all open reading frames for HIV 1-NDK and the HIV prototype. As hoped, the greatest genetic variability was observed for the open reading frame coding for gp! 20. A comparison was also made with another Zairian strain previously sequenced HIV 1- ELI (4). This indicated a closer relationship from HIV 1-NDK to HIV 1-ELI than to the HIV 1 prototype in all reading frames. In order to match these similarities with the biological function, HIV 1-ELI strains were tested in the MT4 assay. The results showed that HIV 1 -ELI is 200 times less infectious and cytopathic than HIV 1-NDK and that it corresponds to an intermediate strain in terms of cytopathogenicity.
  • the molecular basis of the important virulence of HIV 1-NDK can be derived from the genetic change existing in several open reading frames. In order to locate the specific genetic differences between HIV 1-NDK and the other sequenced strains, the alignments of all the reading frames were carried out. The hypervariable regions of HIV 1-NDK env gene products were localized as in other isolates. The hypervariability clusters are detected at the same position both for the prototype of HIV 1, HIV 1-ELI and other Zairean strains HIV-Z6 ( Figure 3).
  • Another deletion located in the 3 'end of the GAG gene is not specific for HIV I-NDK and has been found in other strains.
  • HIV 1-NDK and HIV prototype LTR In order to determine whether the important cytopathogenic effect could be expressed by changes in the regulatory genes, comparisons of these regions were made between HIV 1-NDK and the prototype. The alignment of REV, VIF, NEF and TAT did not show any major difference since the mutation points were generally observed in all the regions already known. However, the biological role of such variations cannot be excluded. In the case of the TAT gene, all the cysteine residues which play an important role in its function have been preserved in the two strains. HIV 1-NDK and HIV prototype LTR
  • the TAR region (nucleotides -17 to +54) which is necessary for the transactivation of the TAT gene product is completely conserved with 68 of the 71 homologous nucleotides.
  • the other regions involved in the key sequence of the cellular factor Spl (nucleotides -43 to -85) (17) are also very similar.
  • the improved nucleotide region (-80 to -105) which is the key sequence for the transcription factor NF-KB is exactly the same for HIV 1-NDK and the prototype HIV 1. All the differences were found upstream of nucleotide -160 where the cis-acting element responding for the NEF could be located.
  • the HIV 1-NDK strain was deposited on May 3, 1989 at the National Collection of Cultures of Microorganisms - 28, rue du Dondel Roux - 75015 PARIS, under the number: I-857.

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Abstract

la présente invention se rapporte à un rétrovirus hautement cytopathogénique HIV-NDK et aux fragments d'ADN de ce rétrovirus. La présente invention se rapporte également à un procédé de préparation d'une proteine et/ou d'une enzyme de ce virus, à la protéine et/ou enzyme ainsi obtenues, aux anticorps dressés contre cette protéine antigénique et à leurs utilisations.

Description

RETROVIRUS HAUTEMENT CYTOPATHOGENIQUE HIV-NDK, FRAGMENTS D ' ADN DE CE RETROVIRUS PROCEDE DE PREPARATION D ' UNE PROTEINE ET/OU ENZYME DE CE VIRUS ET LEURS UTILISATIONS.
La présente invention se rapporte à un rétrovirus le HIV-NDK et ses mutants.
La structure génomique du virus SIDA, le virus d'immunodé- ficience humaine (HIV) a été bien établie.
Ainsi, les séquences nucléotides de prototypes du LAV 1 ou du HTLVIIIB ont révélés une organisation complexe incluant trois gènes structuraux et au moins cinq gènes régulateurs.
Cependant, la même organisation génomique quoique conservée dans plusieurs variants de l'Amérique du Nord, de l'Europe et de l'Afrique a été néanmoins accompagnée d'une grande hétérogénéité génétique plus particulièrement dans l'extrémité 5' du gène env codant pour la glycoprotéine externe gp120.
Parallèlement à cette variation génomique, tous les isolats sont caractérisés par l'effet cytopathique (C.P.E.) sur les cellules CD4+ consistant en une dégénérescence massive de la population cellulaire.
Une perte ou un gain dans cette cytopathogénicité des isolats HIV a récemment été mis en évidence par plusieurs groupes de chercheurs qui tend à indiquer qu'une variation biologique du HIV 1 peut exister à l'intérieur d'un seul patient. Ainsi des chercheurs ont décrit l'existence naturelle de variants d'isolats HIV 1 obtenus à diverses étapes de l'infection dans les individus : ces variants révèlent un effet cytopathique accru in vitro qui correspond à la progression de la maladie. D'autre part, un effet cytopathique réduit à été démontré après l'introduction de délétion à l'intérieur de l'extrémité 3' du génome viral couvrant les gènes env et nef. Ainsi, des mutants résultants de délétions dans diverses parties du gène env ont mis en évidence une importance critique de quelques acides aminés pour l'infection virale et/ou la cytopathogénicité, suggérant ainsi des "distortions" entre la répiication virale et l'induction de syncitia. Plus précisément la présente invention se rapporte à un rétrovirus HIV dit NDK, hautement cytopathogène, caractérisé en ce qu'il s'agit du virus ayant la structure correspondant à la figure 2 ainsi que de ses mutants.
Cette souche HIV 1-NDK a été isolée d'un patient porteur de
SIDA. L'inoculation de ce HIV dit NDK isolé au chimpanzé induit une déplétion T4, la souche HIV 1-NDK est la seule souche capable de développer un tel effet in vivo.
C'est pourquoi la présente invention concerne, non seulement comme cela a été dit précédemment, ce nouveau virus ainsi que ses mutants, mais également des fragments d'ADN dudit virus qui codent pour l'une des protéines du virus, en particulier pour les protéines antigeniques chez les primates.
Par mutants du virus HIV-NDK, on entend désigner les virus HIV de type HIV 1 qui ne sont pas inhibés par OKT A. Dans ce qui suit, on utilisera la terminologie HIV-NDK pour désigner aussi bien le virus lui-même, représenté à la figure 2, que ses mutants car la propriété de ne pas être inhibé par OKT4A distingue clairement cette classe de virus des autres virus HIV 1 tels que ROD ou BRU.
Bien entendu, parmi les protéines antigeniques en cause, il faut citer, plus particulièrement, les protéines correspondant à des composants structuraux du virion, en particulier les protéines antigeniques ou les fragments antigeniques des produits d'expression des gènes gai, pol ou env.
Comme cela sera décrit plus en détail dans les exemples, parmi les séquences d'amino-acides présentant un intérêt tout particulier, il faut citer certaines séquenc es de la protéine d'enveloppe gp120 entre les amino-acides 397 et 439 , c omme cela est décrit dans la figure 4, et en particulier la séquence :
Gly - Asn - Gly - Lys et la séquence
Ser - Lys - Gly - Asn - Gly - Lys - Val - Glu ainsi que les séquences d'ADN correspondant, notamment celles figurant dans le génome du virus NDK.
Parmi les séquences présentant un intérêt dans le cadre de la détection et de la lutte contres les infections à HIV, il faut citer les séquences codant pour la protéine de nucléocapside p18 ainsi que la protéine elle-même et la séquence codant pour l'élément de régulation négative. En effet, l'étude comparative montre que ces éléments diffèrent notablement pour le virus NDK et présentent donc un intérêt tout particulier.
La technique antérieure a déjà largement décrit les procédés permettant de cloner les fragments d'ADN codant pour les gènes en cause et la description indique comment les gènes en question peuvent être localisés et isolés par des technologies connues telles que la méthode des cADN après localisation avec une sonde, par exemple une sonde radioactive.
L'invention concerne également les procédés permettant de préparer ces protéines et/ou enzymes des virus en cause, notamment grâce à un procédé dans lequel on cultive, sur un milieu de culture approprié, des cellules hôtes transformées, transfectees ou infectées par un vecteur d'expression de ladite protéine et/ou enzyme comportant la séquence d'ADN codant pour ladite protéine et/ou enzyme, sous le contrôle d'un promoteur de la transcription de cette séquence dans l'hôte, ainsi que les éléments assurant la traduction de la protéine et/ou enzyme des virus, et on sépare ladite protéine et/ou enzyme après culture.
Les technologies permettant l'expression des protéines à partir du gène sont des technologies qui sont connues actuellement, qui ont déjà été utilisées à de nombreuses reprises pour l'expression des différents gènes des virus, aussi bien HIV-1 que HIV-2 et d'autres virus encore. Suivant la nature de la protéine en cause, on utilisera à titre d'hôte, afin d'assurer la production, des systèmes procaryotes, notamment les bactéries, lorsque la protéine ne nécessite pas de glycosylation, ou bien des systèmes eucaryotes tels que la levure ou des systèmes eucaryotes plus complexes tels que les cellules de mammifère lorsque l'on souhaitera obtenir une protéine qui soit très voisine de la protéine naturelle.
Les systèmes d'expression dans ces différents hôtes sont, par ailleurs, considérés comme connus, de même que les techniques de fermentation et les techniques de culture des cellules en cause.
Les protéines ainsi obtenues pourront être utilisées afin de réaliser des anticorps, notamment des anticorps monoclonaux correspondant à chacune de ces protéines, par des technologies qui sont là aussi connues de l'homme de métier et qui ont largement été développées depuis les travaux de Kohler et Millstein, là encore ces anticorps existent pour HIV-1 et HIV-2, la technologie développée dans ce cas est transposable au cas du virus selon la présente invention.
Les protéines et les anticorps du virus en cause peuvent être utilisés afin de mettre en évidence certaines maladies liées à des immunodéficiences, notamment induites par des rétrovirus tels que le virus NDK mais également les rétrovirus apparentés.
Les protéines antigeniques en cause pourront être utilisées pour la réalisation de vaccins destinés à la prévention, mais également au traitement, des maladies induites par les rétrovirus du type NDK ou apparentés.
Les protéines correspondant notamment à la gp120 peuvent également être utilisées à titre d'agent de blocage et de saturation des sites récepteurs correspondants.
Il est également possible d'utiliser à titre de vaccin des virus recombinants comportant des séquences codant pour une ou plusieurs des protéines en cause, les virus vecteurs étant, de préférence, des virus connus pour leur innocuité ou ayant déjà été testés depuis fort longtemps, en particulier il pourra s'agir de virus de la famille des poxvirus tels que la vaccine, le virus correspondant pouvant être vivant, atténué ou tué.
Là encore, il s'agit d'une technologie qui a été largement développée dans le cadre de HIV-1 et de HIV-2 et qui peut être transposée au cas du virus en cause.
La présente invention concerne également les anticorps monoclonaux dirigés contre le domaine VI de la protéine CD*, mais qui n'entrent pas en compétition avec l'anticorps monoclonal OKT-VA. Ce type d'anticorps monoclonal a été expérimenté et a montré qu'il inhibait la production virale de HIV sur des cellules infectées. Il s'agit notamment de l'anticorps monoclonal 13B8-2.
Ces anticorps monoclonaux peuvent être utilisés in vitro ou in vivo afin d'inhiber la production virale dans le cas de cellules infectées.
D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lecture des figures et des exemples suivants :
Figure 1 : Carte de restriction du pNDK contenant la longueur totale du génome HIV 1-NDK sous-cloné dans le site HindIII de pUC18.
Figure 2 : Séquence nucléotidique complète de HIV 1-NDK.
Figure 3 : Multi-alignement des séquences d'acides aminés d'enveloppe de 4 isolats viraux. HIV 1-NDK a été utilisé en tant que séquence de référence.
Figure 4 : Séquence d'acides aminés de la gp120 correspondant à la plus grande variabilité entre 6153 et 6215.
Figure 5 : Alignement des séquences d'acides aminés gag du prototype HIV 1 et de HIV 1-NDK.
Matériels et méthodes a) Isolement du virus
HIV 1-NDK a été isolé à partir de lymphocytes du sang périphérique comme décrit précédemment (1). Le virus a été ensuite propagé dans une lignée cellulaire CEM permissive continuelle (2). La production virale a été contrôlée par les dosages de réverse transcriptase, par immunofluorescence et par microscopie électronique. b) Détermination de la cytopathogénicité
La cytopatogénicité des souches virales HIV a été déterminée par superinfection des lignées cellulaires MT4 positives au HTLV 1. Le nombre des cellules survivantes a été déterminée par exclusion au bleu Tryptan sept jours après l'infection. c) Clonage moléculaire par une banque génomique
L'ADN de haut poids moléculaire extrait de cellules CEM infectées par du HIV 1-NDK a été digéré partiellement avec de Hind III afin d'obtenir des fragments compris entre 10 et 15 kb en taille qui ont ensuite été purifiés par un gradient de 10 % à 40 % en sucrose (3). Le produit de la digestion partielle a été lié dans le phage L-.7 clivé par HindIII. Les molécules importantes ainsi obtenues ont été conditionnées avec un extrait Gigapack-Gold. La banque a été criblée par la sonde pBTl correspondant à l'important fragment Sac I - Sac I du prototype du HIV 1
(4) selon la méthode "annealing plaque-filter" (8). Des phages positifs ont été purifiés, amplifiés et la localisation a été réalisée par la méthode double digestion (3) et par l'hybridation Southern Blot avec plusieurs sous clones dérivés du génome de pBTl. d) Séquençage nucléotidique
5 microgrammes d'ADN correspondant aux parties virales du phage recombinant HIV 1-NDK ont subit une sonication afin d'obtenir des fragments de 500 pb. Après réparation des extrémités avec l'enzyme Klenow, les fragments ont été sous clones dans le site Sma I du vecteur M13 mp18 (5). Le séquençage a été réalisé selon la méthode de terminaison de chaîne dideoxy avec "universal primer" (6). e) Transfection des cellules Eukariotiques
Les cellules COS-1 ont été ensemencées à une densité de 4 .106 par flacon de 75 cm2, 24 heures avant la transfection. La tranfection pour les analyses d'ADN ultérieures a été réalisée par la technique de coprécipitation au phosphate de calcium (7), en utilisant 10 μg d'ADN plasmidique. Après 12 heures, la culture cellulaire a été agitée avec 10 % de DMSO durant 1 minute avant de la récupérer dans du DMEM avec 10 % FCS. Les cellules CEM ont été additionnées aux cellules COS-1 16 heures après la transfection et co-cultivées pendant 21 jours pendant que l'activité réverse transcriptase était testée dans le surnageant libéré de toutes cellules. EXEMPLE 1
Cytopathogénicité de la souche HIV 1-NDK Afin de comparer la cytopathogénicité de l'isolât HIV 1-BRU
(prototype HIV 1) et HIV 1 -NDK, une série de dilution du surnageant du virus libéré de toutes cellules contenant du virus a été utilisée pour infecter les cellules MT4 . La présence de syncitia a été déterminée dans la culture cellulaire 7 jours après l'infection. Les résultats montrent que des stocks de HIV 1-NDK di lues à 10-7 sont capables d'induire la formation de syncitia alors que le prototy pe HIV 1 dilué au dessous de 10-3 ne conduit a aucun effet cytopathique. M in de démontrer que le syncitia est dû à une replication virale, une miect ion des lymphocytes du sang périphérique a été réalisée avec une série de dilutions des deux souches. Les résultats indiquent que les mêmes di lutions qui induisent une formation de syncitia sur MT4 sont capables d'infecter PBL suggérant que le HIV 1-NDK est 10 4 fois plus cytopathique et infectueux que le prototype. Le niveau de l'activité réverse transcriptase et le pourcentage de cellules infectées sont les mêmes dans les lignées cellulaires continues infectées avec le prototype HIV 1 ou HIV 1-NDK, suggérant ainsi que la production virale est quantitativement équivalente pour les deux souches. De plus, des études au microscope électronique ont montré plus de bourgeonnement à la surface des cellules infectées par le HIV 1-NDK. Ces données suggèrent que la plus importante infection et cytotoxicité de l'isolât HIV 1-NDK pourraient être attribuées à des propriétés qualitatives du virus et non à une replication virale plus importante.
EXEMPLE 2 :
Cartographie moléculaire du génome HIV 1-NDK
Des phages recombinants isolés à partir des banques génomiques L47 ont été sous clones en utilisant la digestion partielle par Hind III dans le plasmid pUC 18. La carte de restriction de l'un des plasmides recombinants pNDK est présentée à la figure 1. En prenant en compte que les sites Sac 1 et Hind III ont toujours été trouvés dans le LTR de tous les isolats pour l'instant publié, la digestion du pNDK avec ces enzymes a été réalisée. La digestion Sac 1 permet l'identification d'un fragment viral interne de 9,1 kb et, l'hybridation des fragments Hind III avec la sonde pBTl identifie clairement les fragments de jonction avec les génomes cellulaires. L'analyse de la carte de l'enzyme de restriction indique que le génome HIV 1-NDK est différent des autres isolats HIV 1 connus.
EXEMPLE 3 :
Analyse des séquences du génome HIV 1-NDK La séquence complète nucléotidique du HIV 1-NDK est présentée en figure 2 avec la séquence d'acide aminé supposée pour tous les cadres de lecture ouverts. L'organisation génomique du HIV 1-KDN est similaire à celle des des autres souches séquencées du HIV 1. Le génome HIV 1-NDK est long de 9143 nucléotides (dans sa forme ARN) et possède trois gènes de structure GAG, POL et ENV, les deux gènes TAT et REV, chacun étant constitué de deux exons codant. Les autres gènes de régulation VIF et NEF ont pu également être détectés, la séquence du HIV 1-NDK contient le gène VPU qui a été récemment identifié en tant que gène fonctionnel. Aucun cadre de lecture ouvert supplémentaire autres que ceux présentés sur les autres souches HIV 1, n'a pu être détecté.
Le pourcentage des homologues d'acides aminés a été calculé pour tous les cadres de lecture ouverts du HIV 1-NDK et du prototype VIH. Comme espéré, la plus grande variabilité génétique a été observée pour le cadre de lecture ouvert codant pour le gp!20. Une comparaison a été également réalisée avec une autre souche Zairoise précédemment séquencée HIV 1- ELI (4). Ceci a indiqué une parenté plus proche du HIV 1-NDK au HIV 1-ELI qu'au prototype HIV 1 dans tous les cadres de lecture. Afin de faire correspondre ces ressemblances avec la fonction biologique, des souches HIV 1-ELI ont été testées dans le dosage MT4. Les résultats ont montré que le HIV 1 -ELI est 200 fois moins infectueux et cytopathique que le HIV 1-NDK et qu'il correspond à une souche intermédiaire en terme de cytopathogénicité.
La base moléculaire de l'importante virulence du HIV 1-NDK peut être issue du changement génétique existant dans plusieurs cadres de lecture ouverts. Afin de localiser les différences génétiques spécifiques entre le HIV 1-NDK et les autres souches séquencées, les alignements de tous les cadres de lecture ont été réalisés. Les régions hypervariables du produit gène env du HIV 1-NDK ont été localisées comme dans les autres isolats. Les clusters d'hypervariabilité sont détectées au même position tant pour le prototype du HIV 1, le HIV 1-ELI et d'autres souches Zairoises HIV-Z6 (Figure 3).
La région du gpl20 localisée entre les acides aminés 397 et
439 responsables de la fixation avec la molécule CD4 et un étirement de 12 acides aminés (410-421) joue un rôle crucial dans cette interaction (figure 4).
Une petite déiétion de 3 acides aminés a été détectée à partir de l'acide aminé 122 des protéines GAG du HIV 1-NDK (figure 5). Cette observation plutôt inhabituelle n'a jamais été observée dans les séquences analysées précédemment de la protéine P18.
Une autre déiétion localisée dans l'extrémité 3' du gène GAG n'est pas spécifique du HIV I-NDK et a été trouvée dans d'autres souches.
L'analyse des protéines POL n'a permis de mettre en évidence aucune différence spécifique.
Afin de déterminer si l'important effet cytopathogénique pouvait être exprimé par des changements dans les gènes de régulation, des comparaisons de ces régions ont été réalisées entre le HIV 1-NDK et le prototype. L'alignement de REV, VIF, NEF et TAT n'a montré aucune différence majeure puisque les points de mutation ont généralement été observés dans toutes les régions déjà connues. Néanmoins, le rôle biologique de telles variations ne peut être exclu. Dans le cas du gène TAT, tous les résidus cystéine qui jouent un rôle important dans sa fonction ont étéconservé dans les deux souches. LTR du HIV 1-NDK et du prototype HIV
1 partage 90 % d'homologues nucleotides. La région TAR (nucleotides -17 à +54) qui est nécessaire pour la transactivation du produit de gène TAT est complètement conservé avec 68 des 71 nucleotides homologues. Les autres régions impliquées dans la séquence clef du facteur cellulaire Spl (nucleotides -43 to -85) (17) sont également très similaires. La région améliorée nucleotides (-80 to -105) qui est la séquence clef pour le facteur de transcription NF-KB est exactement la même pour le HIV 1-NDK et le prototype HIV 1. Toutes les différences ont été trouvées en amont du nucleotide -160 où l'élément cis-acting répondant pour le NEF pourrait être localisé.
La souche HIV 1-NDK a été déposée le 3 mai 1989 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes - 28, rue du Docteur Roux - 75015 PARIS, sous le numéro : I-857.
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Claims

REVENDICATIONS
1) Rétrovirus HIV dit NDK, caractérisé en ce qu'il s'agit du virus ayant la structrure correspondant à la figure 2 ainsi que de ses mutants.
2) Fragment d'ADN de HIV-NDK selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine antigénique chez les primates.
3) Fragment d'ADN de HIV-NDK selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il code pour un composant strutural de virion.
4) Fragment d'ADN de HIV-NDK selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il s'agit du gène gai, pol ou env ou des fragments de ces gènes codant pour des produits antigeniques.
5) Fragment d'ADN codant pour le peptide ou une protéine comportant la séquence d'acides aminés Gly-Asn-Gly-Lys ou une séquence équivalente.
6) Fragment d'ADN selon la revendication 5, caractérisé en ce que la séquence d'acides aminés est Ser-Lys-Gly-Asn-Gly-Lys-Val-Glu.
7) Fragment d'ADN selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence codant pour la séquence d'acides aminés de la figure 2.
8) Fragment d'ADN codant pour tout ou partie de la protéine de nucléocapside p18 du virus HIV-NDK.
9) Fragment d'ADN codant pour l'élément de régulation négative du virus HIV-NDK.
10) Procédé de préparation d'une protéine et/ou d'une enzyme du virus selon la revendication 1 ou correspondant au fragment d'ADN selon l'une des revendications 2 à 9, caractérisé en ce qu'on cultive, sur un milieu de cuiture approprié, de cellules hôtes transformées, transfectees ou infectées par un vecteur d'expression de ladite protéine et/ou enzyme comportant la séquence d'ADN codant pour ladite protéine et/ou enzyme ou fragment d'ADN sous le contrôle d'un promoteur de la transcription de cette séquence dans l'hôte ainsi que les éléments assurant la traduction de la protéine et/ou enzyme du virus, et en ce que l'on sépare ladite protéine et/ou enzyme après culture. 11) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la cellule hôte est une cellule eucaryote.
12) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la cellule hôte est une levure ou une cellule animale ou d'insecte.
13) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la cellule hôte est une cellule de mammifère.
14) Protéine et/ou enzyme du virus HIV-NDK selon la revendication 1 pouvant être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 8 à 13.
15) Protéine selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle comporte la séquence Gly-Asn-Gly-Lys ou une séquence équivalente.
16) Protéine selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle comporte la séquence Ser-Lys-Gly-Asn-GIy-Lys-Val-Glu.
17) Protéine selon l'une des revendications 15 et 16, caractérisée en ce qu'elle comporte une séquence d'acides aminés correspondant à la figure 2.
18) Protéine selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisée en ce qu'elle est glycosylée.
19) Anticorps dressés contre les protéines antigeniques selon l'une des revendications 14 à 17.
20) Kit de diagnostic de la présence d'un virus HIV-NDK, caractérisé en ce qu'il comporte une protéine et/ou un anticorps selon l'une des revendications 14 à 19.
21) Agent vaccinant pour le traitement et/ou la prévention des maladies liées à des immunodéficits, caractérisé en ce qu'il comporte une ou plusieurs protéines selon l'une des revendications 14 à 19 et/ou un virus recombinant comportant le gène codant pour ladite protéine sous le contrôle d'éléments assurant son expression dans l'hôte.
22) A titre de médicaments destinés au traitement ou à la prévention des maladies liées à une infection virale, une protéine selon l'une des revendications 14 à 18 ou un anticorps bloquant selon la revendication 19.
23) Anticorps monoclonaux dirigés contre le domaine VI de la molécule CD4 mais n'étant pas en compétition avec OKT4A. 24) Anticorps monoclonaux, caractérisés en ce qu'il s'agit de
13B8-2.
25) Composition destinée à l'inhibition in vitro et in vivo de la production de virus HIV, caractérisée en ce qu'elle comporte un anticorps monoclonal selon l'une des revendications 21 et 22.
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