WO1990010642A1 - PROCESS FOR ISOLATING AND PURIFYING hPSTI AND hPSTI VARIANTS - Google Patents

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Helmut Hustedt
Karl Heinz Kroner
Jens Paulsen
Horst Schütte
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GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8135—Kazal type inhibitors, e.g. pancreatic secretory inhibitor, ovomucoid

Definitions

  • h-PSTi is an inhibitor of the protease trypsin and is produced in the human pancreas.
  • Coilins et al. (1,2) By substituting some of the 56 amino acids, Coilins et al. (1,2) to prepare h-PSTi variants that act as potent and specific elastase inhibitors. Elastase is jointly responsible for acute and chronic inflammation processes, especially the septic "shock" syndrome (3).
  • centrifugation for biomass separation is carried out first and then perchloric acid precipitation with renewed centrifugation.
  • the chromatographic fine purification is carried out using affinity chromatography on matrix-bound trypsin / chymotrypsin.
  • Fig. 1 shows a schematic of the processing of h-PSTi according to the invention.
  • the decisive step here is ultrafiltration, preferably with a cut-off of 10,000.
  • the cells can be separated and pre-cleaned in one step by means of ultrafiltration (eg cut off 10,000), a rotating shear filter (bio pressure filter) giving very good results. If the ultrafiltration is carried out in tangential flow mode, a prior biomass separation by crossflow microfiltration (pore size preferably 0.2-0.45 ⁇ m) is recommended (both filtrations can be carried out simultaneously) or flocculation. Overall, the method according to the invention results in considerable pre-cleaning.
  • ultrafiltration eg cut off 10,000
  • a rotating shear filter bio pressure filter
  • the fine purification is carried out in both ways via three chromatography steps (cation exchange, reversed phase and cation exchange chromatography or anion exchange, cation exchange and reversed phase chromatography). in both cases you get a homogeneous product.
  • Three chromatography steps are necessary to separate all medium components, some of which show the same binding properties as the PSTi.
  • E. coli JM 103 which carries the h-PSTi gene on the p MAMPF plasmid (5).
  • the cell separation and pre-purification of the h-PSTi from a 70-liter fermenter alternatively takes place in three ways:
  • the h-PSTi was separated from the cells and larger proteins directly by an ultrafiltration step.
  • the Millipore Pellicon system with 8 ⁇ 0.46 m 2 PTGC cassettes with an exclusion limit of 10,000 was used on a 70 I scale.
  • the 70 l were first concentrated to 10 l and then mixed with 10 l 10 mM K-phosphate buffer pH 6.8 and again to 10 l concentrated. This process was repeated 4 times in order to transfer the PSTi to the filtrate side by more than 90%. Over 95% of the protein (measured according to Bradford (6)) was retained, which corresponded to a 20-fold enrichment.
  • the cells (E 578 15) were separated by crossflow microfltration with the Sartocon II system from Sartorius (2 ⁇ 0.2 ⁇ m PP wide-gap cassettes with 0.6 m 2 each): inlet pressure: 1.6 bar, outlet pressure: 1.2 bar , Retentate flow: 650 l / hm 2 , ritrate flow: - 25 l / hm 2 Following the crossflow microfiltration, the ultrafiltration described under 1.1 was carried out, the ritrate output was - 30 l / hm 2 (yield and enrichment see Tab. 1 and 2).
  • the cells were separated by adding 5 l of a 0.1% solution of the sedative Rockipur (strongly cationic polyacrylamide). After stirring for 10 s at a speed of 1000 rpm, the mixture was stirred for 20 min. ditched. Alternatively, was for 10 min. Centrifuged at 8,000 xg. The supernatant was subjected to the ultrafiltration described in 1.1. The filter capacity was also 30 l / hm 2 . In the rockulation, no product was lost through precipitation. The enrichment and product yield was the same as in 1.1.1 (neglecting the losses in the sediment, which could be avoided by washing).
  • the sedative Rockipur strongly cationic polyacrylamide
  • the pH of the ultrafilitrate was adjusted to 2.7 with 10 M HCl and the solution was applied to an S-Sepharose Fast Row column (11.8 x 9.2 cm) with a carbon black of 25 l / h, previously with 10 mM Citric acid pH 2.7 was equilibrated.
  • the wash and button was carried out at a flow rate of 6 l / h.
  • the PSTi was buttoned using a NaCI gradient of 0.2-0.8 M, each in 10 mM citric acid pH 2.7.
  • the gradient volume was 61, PSTi eluted at - 0.5 M NaCI in a volume of 1 1.
  • the active buat of the S-Sepharose column whose pH was adjusted to 5.5 with NaOH, was at a rate of 20 ml / min. applied to a 250 ml Sperisorb C6 (5 ⁇ m) (phase separation), which had previously been equilibrated with 10 mM citrate pH 5.5.
  • the PSTi was eluted through an isopropanol gradient of 0-30% isopropanol (in each case in the equilibration buffer).
  • the gradient volume was 2.5 l, the flow rate 20 ml / min.
  • the h-PSTi eluted at 20% isopropanol in a volume of 100 ml ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY VIA S-SEPHAROSE-FAST-FLOW
  • the active build of the reversed-phase column was applied to a 20 ml S-Sepharose Fast Row column, which had previously been treated with 10 mM Citric acid pH 2.7 had been equilibrated. It was washed with 60 ml of equilibration buffer which contained 0.2 M NaCl. The PSTi is again eluted with a NaCI gradient of 0.2-0.8 M NaCI in equilibration buffer. The soot rate was 100 ml / h, the gradient volume 120 ml.
  • H-PSTi eluted at - 0.5 M NaCl in a total volume of 20 ml.
  • the PSTi-containing fractions were stored at -20 ° C. After this step, the h-PSTi was homogeneous after SDS-PAGE (silver staining).
  • the pH of the ultrafiltrate was adjusted to 8.5 with 10 M NaOH and the volume made up to 140 I with H 2 O.
  • the ritrate thus diluted was applied with a soot of 60 l / h to a 6 I-DEAE-Sepharose fast flow column which had previously been equilibrated with 10 mM Tris-HCl pH 8.5.
  • the h-PSTi did not adsorb on the column material, however, a large part of the medium components was adsorbed on the anion exchanger.

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Abstract

Processes for isolating and purifying hPSTI and hPSTI variants from fermentation liquors into which hPSTI or hPSTI variants are secreted through a micro-organism are characterised in that the fermentation liquors are subjected to ultra-filtration.

Description

Verfahren zur Isolierung und Reinigung von hPSTIund hPSTI-Varianten  Process for the isolation and purification of hPSTI and hPSTI variants
BESCHREIBUNG h-PSTi ist ein Inhibitor der Protease Trypsin und wird im Pancreas des Menschen produziert. Durch Klonierung des h-PSTi-Gens in E coli und Anfügung einer leader Sequenz konnten Coilins und Mitarbeiter zeigen, daß das h-PSTi-Gen in E coli exprimiert und das Genprodukt ins Medium sekretiert wird (1,2). DESCRIPTION h-PSTi is an inhibitor of the protease trypsin and is produced in the human pancreas. By cloning the h-PSTi gene in E coli and adding a leader sequence, Coilins and co-workers were able to show that the h-PSTi gene was expressed in E coli and that the gene product was secreted into the medium (1,2).
Durch Substitution einiger der 56 Aminosäuren gelang es Coilins et al. (1,2), h-PSTi Varianten zu präparieren, die als potente und spezifische Elastase-Inhibitoren wirken. Elastase ist mitverantwortlich für akute und chronische Entzü¬- dungsprozesse, insbesondere dem septischen "Schock"-Syndrom (3). By substituting some of the 56 amino acids, Coilins et al. (1,2) to prepare h-PSTi variants that act as potent and specific elastase inhibitors. Elastase is jointly responsible for acute and chronic inflammation processes, especially the septic "shock" syndrome (3).
Bei dem bisherigen Verfahren zur Aufreinigung des PSTϊ aus dem Kuiturüberstand eines rekombinanten Escherichia coli (1,4) wird zunächst eine Zentrifugation zur Biomasseabtrennung durchgeführt und anschließend eine Perchlorsäurefällung mit erneuter Zentrifugation. Die chromatographische Feinreinigung erfolgt über Affinitätschromatographie an Matrix-gebundenem Trypsin/Chymotrypsin. In the previous method for purifying the PSTϊ from the culture supernatant of a recombinant Escherichia coli (1,4), centrifugation for biomass separation is carried out first and then perchloric acid precipitation with renewed centrifugation. The chromatographic fine purification is carried out using affinity chromatography on matrix-bound trypsin / chymotrypsin.
Die Nachteile des obigen Verfahrens sind: The disadvantages of the above procedure are:
- Die Biomasseabtrennung und die Vorreinigung sind aufwendig.  - The biomass separation and pre-cleaning are complex.
- Die Perchlorsäurefällung ist ökologisch unverträglich und wenig Scale-up-geeignet.  - Perchloric acid precipitation is ecologically incompatible and not very suitable for scale-up.
- Bei der Affinitätschromatographie entstehen ungewünschte Spaltprodukte. - In affinity chromatography, unwanted cleavage products arise.
- Es können nur PSTi-Varianten gereinigt werden, die an Trypsin oder Chymotrypsin binden. Interessant sind jedoch Elastase-hemmende Varianten. Die Vorteile des hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen vor allem in der effizienten Biomasseabtrennuπg und Vorreinigung durch Membranverfahren und der Möglichkeit, auch Elastase-hemmende PSTi-Varianten zu reinigen. In Abb. 1 ist ein Schema der erfindungsgemäßen Aufarbeitung von h-PSTi gezeigt. Der entscheidende Schritt ist hierbei die Ultrafϊitration vorzugsweise mit einem cut off von 10.000. Der Hauptteil der Fremdproteine einschließlich des von E . coli produzierten endogenen Trypsininhibitors (MW = 30 kDa) wird zurückgehalten, während hPSTi mit einem Molekulargewicht von 6.200 das Filter passiert . Die Abtrennung der Zellen und die Vorreinigung können in einem Schritt mittels Ultrafiltration (z.B. cut off 10.000) durchgeführt werden, wobei ein rotierendes Scherfilter (Biodruckfilter) sehr gute Leistungen ergibt. Führt man die Ultrafiltration in Tangentialfluß-Betrieb durch, empfiehlt sich eine vorherige Biomasseabtrennung durch Crossflow-Mikrofiltration (Porengröße bevorzugt 0.2-0.45 μm) (beide Filtrationen können gleichzeitig durchgeführt werden) oder Flockulation. Insgesamt erfolgt durch das erfindungsgemäße Verfahren eine erhebliche Vorreinigung. - Only PSTi variants that bind to trypsin or chymotrypsin can be cleaned. However, variants that inhibit elastase are interesting. The advantages of the method according to the invention described here consist above all in the efficient biomass separation and pre-cleaning by membrane methods and the possibility of also cleaning elastase-inhibiting PSTi variants. Fig. 1 shows a schematic of the processing of h-PSTi according to the invention. The decisive step here is ultrafiltration, preferably with a cut-off of 10,000. The majority of the foreign proteins, including that of E. coli-produced endogenous trypsin inhibitors (MW = 30 kDa) are retained while hPSTi with a molecular weight of 6,200 passes through the filter. The cells can be separated and pre-cleaned in one step by means of ultrafiltration (eg cut off 10,000), a rotating shear filter (bio pressure filter) giving very good results. If the ultrafiltration is carried out in tangential flow mode, a prior biomass separation by crossflow microfiltration (pore size preferably 0.2-0.45 μm) is recommended (both filtrations can be carried out simultaneously) or flocculation. Overall, the method according to the invention results in considerable pre-cleaning.
Vom Ultrafiltrat ausgehend erfolgt die Feinreinigung auf beiden Wegen jeweils über drei Chromatographie-Schritte (Kationenaustausch-, Reversed-Phase- und Kationenaustausch-Chromatographie oder Anionenaustausch-, Kationenaustausch und Reversed-Phase-Chromatographie). in beiden Fällen gelangt man zu einem homogenen Produkt. Drei Chromatographie-Schritte sind notwendig, um alle Mediumbestandteiie abzutrennen, die teilweise gleiche Bindungseigenschaften zeigen wie das PSTi. Starting from the ultrafiltrate, the fine purification is carried out in both ways via three chromatography steps (cation exchange, reversed phase and cation exchange chromatography or anion exchange, cation exchange and reversed phase chromatography). in both cases you get a homogeneous product. Three chromatography steps are necessary to separate all medium components, some of which show the same binding properties as the PSTi.
Die sich entsprechend der vorliegenden Erfindung anschließende Feinreinigung vermeidet das Problem der teilweisen Produktspaltung, wie es bei der Verwendung von Matrix-gebundenem Trypsiπ/Chymotrypsin besteht. Alternativ könnte man letzteren Schritt jedoch auch nach der hier erfindungsgemäß beschriebenen Vorreinigung durchführen. I. AUSFÜHRUNGSBEISPIEL The subsequent fine cleaning according to the present invention avoids the problem of partial product splitting, as is the case when using matrix-bound Trypsiπ / Chymotrypsin. Alternatively, the latter step could also be carried out after the pre-cleaning described here according to the invention. I. EXAMPLE OF EXAMPLE
Stamm: E. coli JM 103, der das h-PSTi-Gen auf dem p MAMPF-Plasmid (5) trägt. Strain: E. coli JM 103, which carries the h-PSTi gene on the p MAMPF plasmid (5).
1. ZELLABTRENNUNG UND VORREINIGUNG 1. CELL SEPARATION AND PRE-CLEANING
Die Zellabtrennung und Vorreinigung des h-PSTi aus einem 70-l-Fermenter erfolgt alternativ über drei Wege: The cell separation and pre-purification of the h-PSTi from a 70-liter fermenter alternatively takes place in three ways:
1.1 Ultrafiltration: 1.1 Ultrafiltration:
1.1.1 Tangentialfluß-Ultrafiitration  1.1.1 Tangential flow ultrafiltration
Die Abtrennung des h-PSTi von den Zellen und größeren Proteinen erfolgte direkt durch einen Ultrafiltrationsschritt. Im 70 I-Maßstab wurde das Pellicon-System von Millipore mit 8 × 0.46 m2 PTGC-Kassetten mit einer Ausschlußgrenze von 10.000 verwendet. Eingangsdruck: 3bar, Ausgangsdruck: 2bar, Retentatfluß: 100 l/hm2. Der Filtratfluß lag bei 2-3 l/hm2 bei einer optischen Dichte der Ausgangskuitur von E^ = 30. Die 70 I wurden zunächst auf 10 I konzentriert und dann mit 10 1 10 mM K-Phosphatpuffer pH 6.8 versetzt und wieder auf 10 I konzentriert. Dieser Vorgang wurde 4 × wiederholt, um das PSTi zu über 90 % auf die Filtratseite zu überführen. Über 95 % des Proteins (gemessen nach Bradford (6)) wurden zurückgehalten, was einer 20fachen Anreicherung entsprach. The h-PSTi was separated from the cells and larger proteins directly by an ultrafiltration step. The Millipore Pellicon system with 8 × 0.46 m 2 PTGC cassettes with an exclusion limit of 10,000 was used on a 70 I scale. Inlet pressure: 3bar, outlet pressure: 2bar, retentate flow: 100 l / hm 2 . The filtrate flow was 2-3 l / hm 2 with an optical density of the starting mixture of E ^ = 30. The 70 l were first concentrated to 10 l and then mixed with 10 l 10 mM K-phosphate buffer pH 6.8 and again to 10 l concentrated. This process was repeated 4 times in order to transfer the PSTi to the filtrate side by more than 90%. Over 95% of the protein (measured according to Bradford (6)) was retained, which corresponded to a 20-fold enrichment.
1.1.2 Scherfiitration/Biodruckfilter 1.1.2 Shear filtration / bio pressure filter
Im 5 I-Maßstab wurde die Ultrafiltration mit dem Biodruckfilter BDF 01 (Sulzer) mit dem Riter WG 10 K (Polysulfon) durchgeführt, das ebenfalls eine Ausschiußgrenze von 10.000 besitzt. Transmembraner Druck: 0.7 bar. Feedfluß: - 10 l/h- Rotordrehzahl: 3.000 rpm. Der Filtratfluß lag bei 45 l/hm2 bei einer optischen Dichte der Ausgangskultur von E578 = 7. Die 5 I wurden zunächst auf 1 I konzentriert und wie oben mit 2 × 1 I 10 mM K-Phosphatpuffer pH 6.8 nachgewaschen. 90 % des PSTi wurden auf die Ritratseite überführt, über 90 % des Proteins wurden vom Riter zurückgehalten. 1.2 Mikrofiltration und Urtrafötration Ultrafiltration was carried out on a 5 l scale using the BDF 01 (Sulzer) biological pressure filter with the Riter WG 10 K (polysulfone), which also has a rejection limit of 10,000. Transmembrane pressure: 0.7 bar. Feed flow: - 10 l / h - rotor speed: 3,000 rpm. The filtrate flow was 45 l / hm 2 with an optical density of the starting culture of E 578 = 7. The 5 l were first concentrated to 1 l and as above with 2 × 1 I washed 10 mM K-phosphate buffer pH 6.8. 90% of the PSTi was transferred to the ritrate side, over 90% of the protein was retained by the riter. 1.2 Microfiltration and primary transformation
Die Abtrennung der Zellen (E578 = 15) erfolgte durch Crossflow-Mikro- Fltration mit dem Sartocon Il-System von Sartorius (2 × 0.2 μm PP Weitspalt-Kassetten mit je 0.6 m2): Eingangsdruck: 1.6 bar, Ausgangsdruck: 1.2 bar, Retentatfluß: 650 l/hm2, Ritratfluß: - 25 l/hm2 Im Anschluß an die Crossflow-Mikro-Filtration wurde die unter 1.1 beschriebene Ultrafiltration durchgeführt, die Ritratleistung lag hier bei - 30 l/hm2 (Ausbeute und Anreicherung s. Tab. 1 und 2). The cells (E 578 = 15) were separated by crossflow microfltration with the Sartocon II system from Sartorius (2 × 0.2 μm PP wide-gap cassettes with 0.6 m 2 each): inlet pressure: 1.6 bar, outlet pressure: 1.2 bar , Retentate flow: 650 l / hm 2 , ritrate flow: - 25 l / hm 2 Following the crossflow microfiltration, the ultrafiltration described under 1.1 was carried out, the ritrate output was - 30 l / hm 2 (yield and enrichment see Tab. 1 and 2).
1.3 Rockulation und Urtrafiltration 1.3 Rockulation and Urtrafiltration
Die Abtrennung der Zellen erfolgte durch Zugabe von 5 I einer 0.1%igen Lösung des Rockungsmittels Sedipur (stark kationisches Polyacrylamid). Nachdem für 10 s mit einer Geschwindigkeit von 1000 rpm gerührt wurde, wurde der Ansatz für 20 min. stehen gelassen. Alternativ wurde für 10 min. bei 8.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde der unter 1.1 beschriebenen Ultrafiltration unterzogen. Die Fiitratleistung lag ebenfalls bei 30 l/hm2. Bei der Rockulation wurde kein Produkt durch Präzipitation verioren. Die Anreicherung und Produktausbeute war wie bei 1.1.1 (unter Vernachlässigung der Verluste im Sediment, die durch Waschen vermieden werden könnten). The cells were separated by adding 5 l of a 0.1% solution of the sedative Rockipur (strongly cationic polyacrylamide). After stirring for 10 s at a speed of 1000 rpm, the mixture was stirred for 20 min. ditched. Alternatively, was for 10 min. Centrifuged at 8,000 xg. The supernatant was subjected to the ultrafiltration described in 1.1. The filter capacity was also 30 l / hm 2 . In the rockulation, no product was lost through precipitation. The enrichment and product yield was the same as in 1.1.1 (neglecting the losses in the sediment, which could be avoided by washing).
2. lONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE ÜBER S-SEPHAROSE-FAST-FLOW2. ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY VIA S-SEPHAROSE-FAST-FLOW
Der pH-Wert des Ultrafiitrat.es wurde mit 10 M HCI auf 2.7 gestellt und die Lösung mit einem Ruß von 25 l/h auf eine S-Sepharose Fast-Row-Säule (11.8 x 9.2 cm) aufgetragen, die zuvor mit 10 mM Citronensäure pH 2.7 äquilibriert wurde. Waschen und Button erfolgte mit einer Flußrate von 6 l/h. Gewaschen wurde mit 5 I des Äquilibrierpuffers, der 0.2 M NaCI enthielt. Die Button des PSTi erfolgte durch einen NaCI-Gradienten von 0.2 - 0.8 M, jeweils in 10 mM Citronen-Säure pH 2.7. Das Gradientenvolumen betrug 61, PSTi eluierte bei - 0.5 M NaCI in einem Volumen von 1 1. The pH of the ultrafilitrate was adjusted to 2.7 with 10 M HCl and the solution was applied to an S-Sepharose Fast Row column (11.8 x 9.2 cm) with a carbon black of 25 l / h, previously with 10 mM Citric acid pH 2.7 was equilibrated. The wash and button was carried out at a flow rate of 6 l / h. Was washed with 5 l of the equilibration buffer, which contained 0.2 M NaCl. The PSTi was buttoned using a NaCI gradient of 0.2-0.8 M, each in 10 mM citric acid pH 2.7. The gradient volume was 61, PSTi eluted at - 0.5 M NaCI in a volume of 1 1.
3. REVERSED-PHASE CHROMATOGRAPHIE 3. REVERSED-PHASE CHROMATOGRAPHY
Das aktive Buat der S-Sepharose-Säuie, dessen pH mit NaOH auf 5.5 gestellt wurde, wurde mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/min. auf eine 250 ml Sperisorb C6 (5μm) (Phase Separation) aufgetragen, die zuvor mit 10 mM Citrat pH 5.5 äquilibriert wurde. Nach dem Waschen mit 300 ml des Äquilibrierpuffers wurde das PSTi durch einen Isopropanol-Gradienten von 0-30 % Isopropanol (jeweils im Äquilibrierpuffer) eluiert. Das Gradienten- volumen betrug 2.5 I, die Flußgeschwindigkeit 20 ml/min. Das h-PSTi eluierte bei 20 % Isopropanol in einem Volumen von 100 ml lONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE ÜBER S-SEPHAROSE-FAST-FLOWThe active buat of the S-Sepharose column, whose pH was adjusted to 5.5 with NaOH, was at a rate of 20 ml / min. applied to a 250 ml Sperisorb C6 (5μm) (phase separation), which had previously been equilibrated with 10 mM citrate pH 5.5. After washing with 300 ml of the equilibration buffer, the PSTi was eluted through an isopropanol gradient of 0-30% isopropanol (in each case in the equilibration buffer). The gradient volume was 2.5 l, the flow rate 20 ml / min. The h-PSTi eluted at 20% isopropanol in a volume of 100 ml ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY VIA S-SEPHAROSE-FAST-FLOW
Nachdem das Isopropanol durch Evaporation entfernt und der pH-Wert mit 2.5 M HCI auf 2.7 gestellt wurde, wurde das aktive Buat der Reversed- Phase-Säule auf eine 20 ml S-Sepharose-Fast-Row-Säule aufgetragen, die zuvor mit 10 mM Citronensäure pH 2.7 äquilibriert worden war. Gewaschen wurde mit 60 ml Äquilibrierpuffer, der 0.2 M NaCI enthielt. Das PSTi wird wiederum mit einem NaCI-Gradienten von 0.2 - 0.8 M NaCI in Äquilibrierpuffer eluiert. Die Rußrate betrug 100 ml/h, das Gradientenvolumen 120 ml. h-PSTi eluierte bei - 0.5 M NaCI in einem Gesamtvolumen von 20 ml. Die PSTi-haltigen Fraktionen wurden bei -20° C gelagert. Nach diesem Schritt war das h-PSTi nach der SDS-PAGE (Silberfärbung) homogen. After the isopropanol was removed by evaporation and the pH was adjusted to 2.7 with 2.5 M HCl, the active build of the reversed-phase column was applied to a 20 ml S-Sepharose Fast Row column, which had previously been treated with 10 mM Citric acid pH 2.7 had been equilibrated. It was washed with 60 ml of equilibration buffer which contained 0.2 M NaCl. The PSTi is again eluted with a NaCI gradient of 0.2-0.8 M NaCI in equilibration buffer. The soot rate was 100 ml / h, the gradient volume 120 ml. H-PSTi eluted at - 0.5 M NaCl in a total volume of 20 ml. The PSTi-containing fractions were stored at -20 ° C. After this step, the h-PSTi was homogeneous after SDS-PAGE (silver staining).
In Tab. 1 ist die gesamte Reinigung zusammengefaßt. The entire cleaning is summarized in Tab. 1.
II. AUSFÜHRUNGSBEISPIEL II. EXAMPLE OF EXAMPLE
1. Stamm, Zellabtrennung und Vorreinigung entsprechend Beispiel I 1. Strain, cell separation and pre-cleaning according to Example I
2. DEAE-FILTRATION 2. DEAE FILTRATION
Der pH des Ultrafiltrates wurde mit 10 M NaOH auf 8.5 gestellt und das Volumen mit H2O auf 140 I aufgefüllt. Das so verdünnte Ritrat wurde mit einem Ruß von 60 l/h auf eine 6 I-DEAE-Sepharose-Fast-Flow-Säule aufgetragen, die zuvor mit 10 mM Tris-HCI pH 8.5 äquilibriert worden war. The pH of the ultrafiltrate was adjusted to 8.5 with 10 M NaOH and the volume made up to 140 I with H 2 O. The ritrate thus diluted was applied with a soot of 60 l / h to a 6 I-DEAE-Sepharose fast flow column which had previously been equilibrated with 10 mM Tris-HCl pH 8.5.
Das h-PSTi adsorbierte nicht an das Säulenmaterial, ein Großteil der Mediumbestandteile wurde dagegen an den Anionaustauscher adsorbiert. The h-PSTi did not adsorb on the column material, however, a large part of the medium components was adsorbed on the anion exchanger.
lONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE ÜBER S-SEPHAROSE-FAST-FLOWION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY VIA S-SEPHAROSE-FAST-FLOW
Der pH-Wert des DEAE-Durchlaufs wurde mit 10 M NaOH auf 2.7 gestelit. Das wertere Vorgehen ist mit 2. im I. Ausführungsbeispiel identisch. REVERSED PHASE CHROMATOGRAPHIE The pH of the DEAE run was adjusted to 2.7 with 10 M NaOH. The further procedure is identical to the second in the first embodiment. REVERSED PHASE CHROMATOGRAPHY
Identisch wie 3. im I. Ausführungsbeispiel, nur αaι3 eine 8ö ml Sperisorb C6 (5 μm) verwendet wurde und die  Identical to 3rd in the 1st embodiment, only αaι3 an 8ö ml Sperisorb C6 (5 μm) was used and the
Flußgeschwindigkeit und Volumina entsprechend reduziert wurden. Das h-PSTi eluierte in einem Gesamtvolumen von 35 ml. Nach diesem Schritt war das h-PSTi nach der SDS-Page (Silberfärbung) homogen. Die Reinigung ist in Tab. 2  Flow rate and volumes were reduced accordingly. The h-PSTi eluted in a total volume of 35 ml. After this step, the h-PSTi was homogeneous after the SDS page (silver staining). The cleaning is in Tab. 2
zusammengefaßt.  summarized.
LITERATUR LITERATURE
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(5) Szardenings: Unveröffentlichte Ergebnisse  (5) Szardenings: Unpublished results
(6) Bradford (1976): A Rapid and Sensitive Metnod for the  (6) Bradford (1976): A Rapid and Sensitive Metnod for the
Quantitation of Microgram Quantities of Proteins Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72. 248-254. Quantitation of Microgram Quantities of Proteins Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72. 248-254.
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0001
**Die PSTi-Bestimmung erfolgte durch den Chymotrypsin-Hemmtest.  ** The PSTi was determined by the chymotrypsin inhibition test.
100 ng Chymotrypsin wurden in 0.9 ml 0.2 M Triε HC1 pH 8.0 mit PSTi IV bei 30 ° für 3 min. vorinkubiert und dann die Um setzung von N-Suc- L-Ala-L-Ala-L- Pro-L-Phe pNa anhand der Extinktionsänderung bei 400 nm (30 °C) gemessen. Aus dem Hem mungsgrad wurde unter der Voraussetzung, daß pro Chymotrypsinmolekül ein PSTi-Molekül bindet und unter Berücksichtigung des Molekulargewichtes der PSTi-Gehalt bestimmt. 100 ng chymotrypsin were in 0.9 ml 0.2 M Triε HC1 pH 8.0 with PSTi IV at 30 ° for 3 min. preincubated and then the implementation of N-Suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe pNa measured using the change in absorbance at 400 nm (30 ° C). The degree of inhibition was determined on the assumption that one PSTi molecule binds per chymotrypsin molecule and the PSTi content was determined taking into account the molecular weight.
Figure imgf000010_0001
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**Dιe PSTi-Bestimmung erfolgte durch den Trypsin-Hemmtest.  ** The PSTi was determined by the trypsin inhibition test.
20 ng Trypsin wurden in 0.9 ml 0.2 M/Triε HCl pH 8.0 mit PSTi Ogawa bei 30 °C für 12 min. vorinkubiert und dann die Umsetzung von N-Suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe pNa anhand der Extinktionsänderung bei 400 nm (30 °C) gemessen. Aus dem Hem mungsgrad wurde unter der Voraussetzung, daß pro Trypsin- molekül ein PSTi-Molekül bindet und unter Berücksichtigung des Molekulargewichtes der PSTi-Gehalt bestimmt.  20 ng trypsin were in 0.9 ml 0.2 M / Triε HCl pH 8.0 with PSTi Ogawa at 30 ° C for 12 min. preincubated and then the conversion of N-Suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe pNa measured using the change in absorbance at 400 nm (30 ° C). The degree of inhibition was determined on the assumption that one PSTi molecule binds per trypsin molecule and the PSTi content was determined taking into account the molecular weight.

Claims

Patentansprüche Claims
1. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von hPSTI und hPSTI-Varianten aus Fermentationsbrühen, in die hPSTI oder hPSTI-Varianten durch einen Mikroorganismus sekretiert worden sind, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentationsbrühe 1. Process for the isolation and purification of hPSTI and hPSTI variants from fermentation broths in which hPSTI or hPSTI variants have been secreted by a microorganism, characterized in that the fermentation broth
(a) einer Ultrafiltration oder  (a) ultrafiltration or
(b) einer Kombination von Mikrofiltration und Ultrafiltration oder  (b) a combination of microfiltration and ultrafiltration, or
(c) einer Kombination von Flockulation und Ultrafiltraton unterwirft und ggf. eine weitere Reinigung folgen läßt.  (c) subject to a combination of flocculation and ultrafiltratone and possibly followed by further cleaning.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei den Maßnahmen gemäß (a), (b) oder (c) bei der 2. The method according to claim 1, characterized in that in the measures according to (a), (b) or (c) in the
Ultrafiltration mit einer Trenngrenze von etwa 10000 arbeitet. Ultrafiltration works with a cut-off of about 10,000.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man bei der Mikrofiltration und/oder Ultrafiltration Tan- gentialfluß-Systeme und/oder Scherfilter verwendet. 3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that one uses in the microfiltration and / or ultrafiltration tanential flow systems and / or shear filters.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Ultrafiltration Scherfilter, beispielsweise rotierende Scherfilter verwendet. 4. The method according to claim 3, characterized in that shear filters, for example rotating shear filters, are used in the ultrafiltration.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man bei der Maßnahme gemäß Anspruch 1 (b) eine Cross-Flow-Mikrofiltration vorzugsweise mit einem Poren-größenbereich von 0,2 bis 0,45 μm durchführt. 5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that in the measure according to claim 1 (b) a cross-flow microfiltration is preferably carried out with a pore size range of 0.2 to 0.45 microns.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Maßnahme gemäß Anspruch 1 (c) eine Polyelektrolyt-Flockulation durchführt. 6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that a polyelectrolyte flocculation is carried out in the measure according to claim 1 (c).
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man auf die Maßnahmen gemäß Anspruch 1 (a), (b) oder (c) 7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the measures according to claim 1 (a), (b) or (c)
(d) eine Kationenaustausch-, Umkehrphasen- und Kationenaustausch-Chromatographie oder  (d) cation exchange, reverse phase and cation exchange chromatography or
(e) eine Filtration über Anionenaustauscher (negative  (e) filtration through anion exchangers (negative
Adsorption) und danach eine Kationenaustausch- und eine Adsorption) and then a cation exchange and one
Umkehrphasen-Chromatographie folgen läßt. Reverse phase chromatography follows.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine E.-coli-Fermentationsbrühe einsetzt. 8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that one uses an E. coli fermentation broth.
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