DE10134347B4 - Process for the purification of an enzyme - Google Patents
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- C12Y304/22008—Clostripain (3.4.22.8)
Abstract
Verfahren
zur teilweisen oder vollständigen
Aufreinigung mindestens eines in einem Fermentationsüberstand
von Clostridium histolyticum enthaltenen Enzyms,
dadurch gekennzeichnet,
dass
die Enzyme des Fermentationsüberstandes
durch ein Chromatographieverfahren unter ausschließlicher
Verwendung erster Chromatographiematerialien auf Basis von keramischem
Hydroxylapatit und zweiter Chromatographiematerialien auf Styrol/Divinylbenzolbasis
aufgetrennt werden, wobei
a.) das Chromatographieverfahren
eine erste chromatographische Stufe an gesintertem Hydroxylapatitmaterial,
eine zweite chromatographische Stufe an einem Anionenaustauschermaterial
auf Styrol/Divinylbenzolbasis und ggf. eine dritte chromatographische
Stufe an einem Kationenaustauschermaterial auf Styrol/Divinylbenzolbasis
umfasst, wobei die Elution an dem gesinterten Hydroxylapatitmaterial
bei Flussraten von mindestens 200 cm/h und insbesondere von mindestens
300 cm/h, die Elution an dem Styrol/Divinylbenzolmaterial bei Flussraten
von mindestens 500 cm/h, insbesondere von mindestens 1000 cm/h,
durchgeführt
wird,
b.) die erste chromatographische Stufe in mindestens
zwei Elutionsstufen durchgeführt
wird, wobei neutrale Protease (Caseinase) von Typ I und Typ II Kollagenase
und Clostripain abgetrennt wird,
c.) eine im wesentlichen von
Caseinase befreite...Process for the partial or complete purification of at least one enzyme contained in a fermentation supernatant of Clostridium histolyticum,
characterized,
that the enzymes of the fermentation supernatant are separated by a chromatographic process using only the first chromatographic materials based on ceramic hydroxyapatite and second styrene / divinylbenzene-based chromatography materials, wherein
a.) the chromatography process comprises a first chromatographic step on sintered hydroxyapatite material, a second chromatographic step on a styrene / divinylbenzene based anion exchange material, and optionally a third chromatographic step on a styrene / divinylbenzene based cation exchange material, wherein the elution on the sintered hydroxyapatite material at flow rates of at least 200 cm / h and in particular of at least 300 cm / h, the elution being carried out on the styrene / divinylbenzene material at flow rates of at least 500 cm / h, in particular of at least 1000 cm / h,
b.) the first chromatographic step is carried out in at least two elution steps, whereby neutral protease (caseinase) of type I and type II collagenase and clostripain is separated off,
c.) a substantially free of caseinase ...
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung mindestens eines in einem Fermentationsüberstand von Clostridium histolyticum enthaltenen Enzyms.The The invention relates to a process for the purification of at least one in a fermentation supernatant of Clostridium histolyticum enzyme.
Das Bakterium Closfridium histolyticum bildet bei Kultivierung in peptonhaltigem Nährmedium extrazellular ein komplexes Enzymgemisch, das Kollagenasen, verschiedene proteolytische Enzyme sowie niedermolekulare Bestandteile enthält. Als Hauptbestandteile wurden Typ I und Typ II Kollagenasen (Clostridiopeptidase A, EC 3.4.24.3) mit Molekulargewichten im Bereich von 65 bis 125 kD und isoelektrischen Punkten zwischen 5 und 6,5 beschrieben (Bond, van Wart; Biochemistry, 1984, 23, 3077-3085). Weitere Hauptbestandteile sind die als Heterodimer vorkommende SH-Protease Clostripain (Ciostridiopeptidase B, EC 3.4.22.8) mit einem Molekulargewicht von zirka 59 kD und die schlecht charakterisierte so genannte neutrale Protease (Caseinase) mit einem mittels MALDI-TOF bestimmten Molekulargewicht von 34,5 kD.The Bacterium Closfridium histolyticum forms in peptone-containing culture broth extracellular a complex enzyme mixture containing collagenases, various contains proteolytic enzymes and low molecular weight components. When Main constituents were type I and type II collagenases (clostridiopeptidase A, EC 3.4.24.3) with molecular weights in the range of 65 to 125 kD and isoelectric points between 5 and 6.5 (Bond, van Wart; Biochemistry, 1984, 23, 3077-3085). Other main components are the heterodimeric SH protease clostripain (ciostridiopeptidase B, EC 3.4.22.8) with a molecular weight of about 59 kD and the poorly characterized so-called neutral protease (caseinase) with a MALDI-TOF molecular weight of 34.5 kD.
Kollagenasen sind Enzyme, die Peptidbindungen des Faserproteins Kollagen spalten. Sie finden biochemische und medizinische Anwendung, beispielsweise um Zellen oder Zellverbände von Geweben zu isolieren. Typ I und Typ II Kollagenasen unterscheiden sich in ihrer Aktivität hinsichtlich hochmolekularem Kollagen und kleinen synthetischencollagenases are enzymes that cleave peptide bonds of the fiber protein collagen. You will find biochemical and medical application, for example around cells or cell aggregates to isolate from tissues. Type I and type II collagenases differ in their activity in terms of high molecular weight collagen and small synthetic
Substraten. Während Typ I Kollagenasen bevorzugt hochmolekulares Kollagen spalten, reagieren Typ II Kollagenasen vorwiegend mit synthetischen Substraten, wie zum Beispiel PZ-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (Wunsch, Heidrich; Z. Physiol. Chem. 333, 1963, 149-151), His-Pro (Nordwig, Wunsch; Z. Physiol. Chem. 316, 1959, 287) oder Phe-Ala-Leu-GTy-Pro-Ala (van Wart, Steinbrink; Anal. Biochem. 113, 1981, 356-365). Beide Kollagenasetypen lassen sich auch mittels reversed phase Chromatographie (RPC) eindeutig unterscheiden.Substrates. While Type I collagenases prefer to cleave high molecular weight collagen, react Type II collagenases predominantly with synthetic substrates, such as for example PZ-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (Wunsch, Heidrich, Z. Physiol. Chem. 333, 1963, 149-151), His-Pro (Nordwig, Wish, Z. Physiol. Chem. 316, 1959, 287) or Phe-Ala-Leu-GTy-Pro-Ala (van Wart, Steinbrink, Anal. Biochem. 113, 1981, 356-365). Both collagenase types can be also clearly distinguish by means of reversed phase chromatography (RPC).
Die
Ferner ist die Abtrennung der neutralen Protease aus einem Kolloagenase-haltigen Enzymgemisch mittels schneller Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) unter Verwendung von keramischen Hydroxylapatit bekannt (Klöck C. et al.: Fractions from Commercial Collagenase Preparations: Use in Enzymic Isolation of the Islets of Langerhans from Porcine Pancreas; Cell Transplant (5) 1996, 543-551). Eine Methode zur weitergehenden Aufreinigung von Kollagenase wird nicht offenbart.Further is the separation of the neutral protease from a colloagenase-containing Enzyme mixture by means of rapid protein liquid chromatography (FPLC) known using ceramic hydroxyapatite (Klöck C. et al .: Fractions from Commercial Collagenase Preparations: Use in Enzymic Isolation of the Islets of Langerhans from Porcine Pancreas; Cell Transplant (5) 1996, 543-551). A method for the more advanced Purification of collagenase is not disclosed.
Nach
der
Das dabei zu verwendende stark basische Anionenaustauscherharz vom hochporösen Typ, das zu den Harzen vom Typ mit hochvernetzter Struktur gehört, soll die doppelte oder noch höhere Enzymadsorptionsrate und 1 bis 3fach stärkere Erhöhung eines spezifischen Enzymaktivität bieten, verglichen mit den stark basischen Anionenaustauscherharzen vom Typ mit hochvernetzter Struktur, die dafür bekannt sind, zur Adsorption und Elution bestimmter Enzyme anwendbar zu sein. Andererseits soll das zu verwendende stark saure Kationenaustauscherharz vom hochporösen Typ, das zu den Harzen vom Typ mit hochvernetzter Struktur gehört, die doppelte bis dreifache Enzymadsorptionsrate bieten, verglichen mit den stark sauren Kationenaustauscherharzen vorn Typ mit hochvernetzter Struktur.The thereby to be used strongly basic anion exchange resin of highly porous type, which belongs to the resins of the type with highly networked structure the double or even higher Enzyme adsorption rate and 1 to 3 times greater increase in specific enzyme activity, compared with the strongly basic anion exchange resins of Type with highly cross-linked structure, which are known for adsorption and elution of certain enzymes to be applicable. On the other hand should the strongly acidic cation exchange resin of the highly porous type to be used, which belongs to the resins of the type with highly cross-linked structure, the offer double to triple enzyme adsorption rates compared to the strongly acidic cation exchange resins of the type with highly cross-linked Structure.
Das eingesetzte Ionenaustauscherharz mit hochvernetzter Struktur, das verwendet wird, kann beispielsweise ein Ionenaustauscherharz mit einer Struktur sein, in der eine quaternäre Ammoniumgruppe oder eine Sulfo-Gruppe als Austauschergruppen in eine Styrol-Divinylbenzen-Polymermatrix mich hochvernetzter Struktur eingeführt wurden.The high-crosslinked-structure ion exchange resin used may be, for example, an ion exchange resin having a structure in which a quaternary ammonium group or a sulfo group as exchanger groups were introduced into a styrene-divinylbenzene polymer matrix of highly crosslinked structure.
Danach ist ein Verfahren zur Reinigung von Enzymen aller Enzymklassen unter ausschließlicher Verwendung eines Anionenaustauschers mit Styrol/Divinylbenzolpolymermatrix, vorgesehen, wobei eine Vielzahl von Bakterienstämmen benannt sind, aus denen die verschiedensten Enzyme isoliert wurden.After that is a method for the purification of enzymes of all classes of enzymes exclusive Use of an anion exchanger with styrene / divinylbenzene polymer matrix, provided, wherein a plurality of bacterial strains are named, from which the most diverse enzymes were isolated.
Die
Aus
den Dokumenten
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Trennung und Aufreinigung mindestens eines extrazellulären Hauptenzyms von Clostridium histolyticum bereitzustellen, das die beschriebenen Nachteile des Standes der Technik überwindet.Of the The invention is therefore based on the object, a method for separation and purifying at least one major Clostridium extracellular enzyme histolyticum, which has the described disadvantages of The state of the art overcomes.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den im Anspruch 1 genannten Merkmalen gelöst. Dadurch, dass die Enzyme des Fermentationsüberstandes von Clostridium histolyticum durch ein einstufiges oder bevorzugterweise mehrstufiges Chromatographieverfahren unter ausschließlicher Verwendung von Chromatographiematerialien auf Styrol/Divinylbenzolbasis und/oder auf Basis von keramischem Hydroxylapatit aufgetrennt werden, lässt sich eine sehr schnelle und kostengünstige Enzymaufreinigung realisieren, wobei Enzyme mit hoher Reinheit erhalten werden, die aufgrund einer Abwesenheit toxikologisch bedenklicher Substanzen insbesondere für den Einsatz in der Pharmazie und/oder Biochemie geeignet sind. Dieses Verfahren kommt ohne produktberührende Schritte aus, was den Einsatz im Pharmaziebereich besonders vorteilhaft macht. Es kann zur Herstellung von sterilen Kollagenaseenzymen genutzt werden. Dabei wird unter Styrol/Divinylbenzol ein Copolymerisat verstanden, das aus mit Divinylbenzol quervernetztem Polystyrol besteht. Durch Substitution dieser Basismatrix mit unterschiedlichsten funktionellen Gruppen wird eine Bindung von Proteinen an das Material und somit ihre Trennung ermöglicht. Abhängig von der Wahl der funktionellen Gruppe können unterschiedliche Bindungs- und Trennungsmechanismen, beispielsweise Kationen- oder Anionenaustauschmechanismen, genutzt werden. Hingegen handelt es sich bei Hydroxylapatit um ein Kalziumphosphat der Summenformel Ca10(PO4)6(OH)2, das eine Proteinbindung aufgrund ionischer elektrostatischer Wechselwirkungen sowie einer stärkeren ionischen Komplexbindung gestattet. Im Detail ist der Bindungsmechanismus von Proteinen an Hydroxylapatit bislang jedoch noch nicht verstanden.This object is achieved by a method having the features mentioned in claim 1. Characterized in that the enzymes of the fermentation supernatant of Clostridium histolyticum by a one-stage or preferably multi-step chromatography process using only chromatography on styrene / divinylbenzene and / or based on ceramic hydroxyapatite are separated, can be a very fast and inexpensive enzyme purification realize using enzymes with high purity are obtained, which are particularly suitable for use in pharmacy and / or biochemistry due to the absence of toxicologically harmful substances. This process does not require any product-contacting steps, which makes use in the pharmaceutical sector particularly advantageous. It can be used to produce sterile collagenase enzymes. In this case, styrene / divinylbenzene is understood as meaning a copolymer which consists of polystyrene cross-linked with divinylbenzene. By substitution of this basic matrix with a wide variety of functional groups, a binding of proteins to the material and thus their separation is made possible. Depending on the choice of functional group, different binding and separation mechanisms, such as cation or anion exchange mechanisms, may be utilized. By contrast, hydroxyapatite is a calcium phosphate of the molecular formula Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 , which allows protein binding due to ionic electrostatic interactions and stronger ionic complex binding. However, the binding mechanism of proteins to hydroxyapatite has not yet been understood in detail.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht somit darin, dass die Enzyme des Fermentationsüberstandes durch ein Chromatographieverfahren unter ausschließlicher Verwendung erster Chromatographiematerialien auf Basis von, keramischem, Hydroxylapatit und zweiter Chromatographiematenahen auf Styrol/Divinylbenzolbasis aufgetrennt werden, wobei
- a.) das Chromatographieverfahren eine erste chromatographische Stufe an gesintertem Hydroxylapatitmaterial, eine zweite chromatographische Stufe an einem Anionenaustau schermaterial auf Styrol/Divinylbenzolbasis und ggf. eine dritte chromatographische Stufe an einem Kationenaustauschermaterial auf Styrol/Divinylbenzolbasis umfasst, wobei die Elution an dem gesinderten Hydroxylapatitmaterial bei Flussraten von mindestens 200 cm/h und insbesondere von mindestens 300 cm/h, die Elution an dem Styrol/Divinylbenzolmaterial bei Flussraten von mindestens 500 cm/h, insbesondere von mindestens 1000 cm/h, durchgeführt wird,
- b.) die erste chromatographische Stufe in mindestens zwei Elutionsstufen durchgeführt wird, wobei neutrale Protease (Caseinase) von Typ I und Typ II Kollagenase und Clostripain abgetrennt wird,
- c.) eine im wesentlichen von Caseinase befreite Fraktion aus der ersten chromatographischen Stufe der zweiten chromatographischen Stufe mit mindestens zwei Elutionsstufen unterzogen wird, wobei Typ I Kollagenase und Typ II Kollagenase voneinander getrennt werden,
- d.) eine Typ I Kollagenase enthaltene Fraktion aus der zweiten chromatographischen Stufe der dritten chromatographischen Stufe mit mindestens zwei Elutionsstufen unterworfen wird, wobei Typ I Kollagenase von Clostripain abgetrennt wird,
- e.) eine Typ II Kollagenase enthaltene Fraktion aus der zweiten chromatographischen Stufe der dritten chromatographischen Stufe mit mindestens zwei Elutionsstufen unterworfen wird, wobei Typ II Kollagenase von Clostripain abgetrennt wird,
- f.) die chromatographischen Stufen bei Temperaturen zwischen 4 °C und 25 °C durchgeführt werden.
- a.) The chromatography process, a first chromatographic stage of sintered hydroxyapatite material, a second chromatographic stage on a styrene / divinylbenzene-based Anionaustau shear material and optionally a third chromatographic stage on a cation exchange material on Sty wherein the elution on the reduced hydroxyapatite material at flow rates of at least 200 cm / h and in particular at least 300 cm / h, the elution of the styrene / divinylbenzene material at flow rates of at least 500 cm / h, in particular of at least 1000 cm / h, is carried out
- b.) the first chromatographic step is carried out in at least two elution steps, whereby neutral protease (caseinase) of type I and type II collagenase and clostripain is separated off,
- c.) a fraction substantially free of caseinase from the first chromatographic stage of the second chromatographic stage is subjected to at least two elution stages, whereby Type I collagenase and Type II collagenase are separated from one another,
- d.) subjecting a fraction containing type I collagenase from the second chromatographic step of the third chromatographic step to at least two elution steps, whereby type I collagenase is separated from clostripain,
- e.) subjecting a second-stage chromatographic stage fraction containing type II collagenase to the third chromatographic stage with at least two elution stages, whereby type II collagenase is separated from clostripain,
- f.) the chromatographic stages are carried out at temperatures between 4 ° C and 25 ° C.
Die verwendeten Chromatographiematerialien gestatten die Einstellung von hohen Flussraten bei guten Trenneigenschaften, so dass sich sehr kurze Aufreinigungszeiten ergeben. Dies gilt insbesondere, wenn gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung gesintertes, also keramisches Hydroxylapatit verwendet wird. Die Verwendung von keramischem Hydroxylapatit besitzt gegenüber nichtgesintertem (kristallinem) Hydroxylapatit den Vorteil, dass das Material reproduzierbar hergestellt werden kann und aufgrund seiner porösen Struktur nur sehr geringe Rückdrucke erzeugt, wodurch die Gefahr von Säulenbeschädigungen minimiert wird und hohe lineare Flussraten ermöglicht werden. Die Elution an gesintertem Hydroxylapatitmaterial wird vorzugsweise bei Flussraten von mindestens 200 cm/h, insbesondere von mindestens 300 cm/h, durchgeführt. Im Falle des polymeren Styrol/Divinylbenzolmaterials werden bevorzugt sogar Flussraten von mindestens 500 cm/h, insbesondere von mindestens 1000 cm/h, eingestellt. Die Prozesszeiten können auf diese Weise gegenüber bekannten Verfahren erheblich verkürzt werden.The used chromatography materials allow the adjustment of high flow rates with good release properties, so that result in very short purification times. This is especially true if according to one preferred embodiment of the invention sintered, ie ceramic Hydroxylapatite is used. The use of ceramic hydroxyapatite owns opposite non-sintered (crystalline) hydroxyapatite has the advantage that the material can be produced reproducibly and due its porous Structure only very low back pressures generated, whereby the risk of column damage is minimized and allows high linear flow rates become. Elution on sintered hydroxyapatite material is preferred at flow rates of at least 200 cm / h, in particular of at least 300 cm / h. In the case of the polymeric styrene / divinylbenzene material, preference is given even flow rates of at least 500 cm / h, in particular of at least 1000 cm / h, adjusted. The process times can be known in this way Procedure considerably shortened become.
Eine weitere Prozesszeitverkürzung sowie eine Vereinfachung des Prozessaufwandes wird erreicht, indem mindestens eine Chromatographiestufe, vorzugsweise alle Chromatographiestufen, in Form einer Stufenelution durchgeführt wird. Gegenüber einer Gradientenelution kann hierdurch ferner eine Einsparung des Elutionsmittels und damit teurer Puffersubstanzen erzielt werden. Die Generierung eines Gradienten ist im Prozessmaßstab außerdem problematisch.A further process time reduction and a simplification of the process effort is achieved by at least one chromatography step, preferably all chromatography steps, is carried out in the form of a step elution. Opposite one Gradient elution can thereby also save the eluent and thus more expensive buffer substances can be achieved. The generation a gradient is also problematic on a process scale.
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden die Chromatographiematerialien derart ausgewählt, dass die einzelnen chromatographischen Schritte ausschließlich auf elektrostatischen Wechselwirkungen und/oder auf Ionenbindung und/oder ionischer Komplexbindung beruhen. Besonders vorteilhaft umfasst das Verfahren mindestens eine anionenaustauschchromatische Stufe, und/oder mindestens eine kationenaustauschchromatische Stufe, und/oder mindestens eine hydoxylapatitchromatische Stufe. Besonders gute Ergebnisse wurden in einem dreistufigen Chromatographieverfahren erzielt, wobei eine erste Stufe an gesintertem Hydroxylapatitmaterial, eine zweite Stufe an einem Anionenaustauschermaterial auf Styrol/Divinylbenzolbasis und eine dritte chromatographische Stufe an einem Kationenaustauschermaterial auf Styrol/Divinylbenzolbasis durchgeführt wird, vorzugsweise in der genannten Reihenfolge, jedoch auch andere Reihenfolgen sind möglich; auch die Stufenanzahl kann variieren.According to one advantageous embodiment of the invention are the chromatography materials so selected that the individual chromatographic steps exclusively on electrostatic interactions and / or ionic bonding and / or based ionic complex binding. Particularly advantageous the process comprises at least one anion-exchange-chromatic step, and / or at least one cation-exchange-chromatic step, and / or at least one hydroxyapatichromatic step. Especially good Results were in a three-step chromatography method achieved with a first stage of sintered hydroxyapatite material, a second step on a styrene / divinylbenzene-based anion exchange material and a third chromatographic step on a cation exchange material is carried out on styrene / divinylbenzene basis, preferably in the named order, but also other orders are possible; also the number of steps can vary.
Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren somit keine zeitaufwendigen und kostenintensiven Gelfiltrationsschritte, wodurch die Gefahr eines Selbstverdaus der zu trennenden Enzyme minimiert wird. Der Verzicht auf Gelfiltrationen ermöglicht ferner die Durchführung der chromatographischen Stufen in einem weiten Temperaturbereich zwischen 4 und 25 °C, also auch bei Raumtemperatur. Ferner umfasst das Verfahren auch keine affinitätschromatographischen Stufen, so dass die Gefahr des Ausblutens, also des Auswaschens der Affinitätsliganden des Chromatographiematerials nicht besteht. Schließlich sieht das erfindungsgemäße Verfahren auch keine Proteinfällungsschritte vor, die unerwünschte Strukturveränderungen der Proteine bewirken können. Hierdurch ergibt sich ferner der Vorteil, dass keine Detergenzien oder chaotrope Substanzen (Ammoniumsulfat, Polyethylenglycol, etc.) eingesetzt werden, deren nachträgliche Entfernung stets mit einem hohen Prozessaufwand verbunden ist.Preferably includes the method according to the invention thus no time-consuming and costly gel filtration steps, thus reducing the risk of self-digestion of the enzymes to be separated is minimized. The waiver of gel filtration also allows the implementation the chromatographic stages in a wide temperature range between 4 and 25 ° C, also at room temperature. Furthermore, the method also includes no affinity chromatographic Stages, so the risk of bleeding, so washing out the affinity ligands of the chromatography material does not exist. Finally sees the inventive method also no protein precipitation steps before, the unwanted structural changes can cause the proteins. This also results in the advantage that no detergents or chaotropic substances (ammonium sulfate, polyethylene glycol, etc.) be used, the subsequent Distance is always associated with a high process cost.
Die verwendeten Chromatographiematerialien haben ferner den Vorteil, chemisch weitgehend inert zu sein und mit verhältnismäßig hoch konzentrierten Alkalilaugen, beispielsweise mit 3 molarer Natronlauge, gereinigt werden zu können. Dies gewährleistet eine sehr effektive Reinigung und somit einen Funktionserhalt der Materialien sowie eine gute Reproduzierbarkeit des Verfahrens. Die hohe Druckstabilität der Chromatographiematerialien gestattet zudem den Einsatz in Hochdruck-Flüssigchromatographie-Verfahren (HPLC). Aufgrund der Abwesenheit von toxikologisch bedenklichen, verfahrensbedingten Substanzen, wie zum Beispiel Affinitätsliganden oder Detergenzien, können die erfindungsgemäß aufgereinigten Proteine, insbesondere Typ I und/oder Typ II Kollagenase und/oder Clostripain und/oder neutrale Protease (Caseinase) besonders vorteilhaft für pharmazeutische oder biochemische Zwecke eingesetzt werden.The chromatographic materials used also have the advantage of being chemically largely inert and being able to be purified with relatively highly concentrated alkali liquors, for example with 3 molar sodium hydroxide solution. This ensures a very effective cleaning and thus a functional integrity the materials and a good reproducibility of the process. The high pressure stability of the chromatography materials also allows use in high-pressure liquid chromatography (HPLC). Due to the absence of toxicologically questionable, process-related substances, such as affinity ligands or detergents, the proteins purified according to the invention, in particular type I and / or type II collagenase and / or clostripain and / or neutral protease (caseinase) can be particularly advantageous for pharmaceutical or biochemical Purposes are used.
Weitere bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den übrigen, in den Unteransprüchen genannten Merkmalen.Further preferred embodiments of the invention will become apparent from the others, in the subclaims mentioned features.
Das Verfahren wird nachfolgend anhand der einzigen zugehörigen Zeichnung, die einen bevorzugten Ablauf des Verfahrens darstellt, näher erläutert.The The method is described below with reference to the only associated drawing, which illustrates a preferred sequence of the method, explained in more detail.
Nach erfolgter Kultivierung von Clostridium histolyticum in einem Fermentationsmedium tierischen oder pflanzlichen Ursprungs werden die Zellen und sonstige nichtlösliche Bestandteile beispielsweise durch Zentrifugation oder Filtration vom Fermentationsüberstand abgetrennt. Der Fermentationsüberstand, der als Hauptbestandteile Typ I und Typ II Kollagenasen, Clostripain und Caseinase enthält, kann vor der chromatographischen Trennung dieser Proteine in üblicher Weise aufkonzentriert werden.To successful cultivation of Clostridium histolyticum in a fermentation medium of animal or plant origin are the cells and others insoluble Ingredients for example by centrifugation or filtration from the fermentation supernatant separated. The fermentation supernatant, the main constituents type I and type II collagenases, clostripain and contains caseinase, can before the chromatographic separation of these proteins in common Be concentrated.
Der Fermentationsüberstand wird in einem ersten Schritt des Verfahrens auf eine mit keramischem Hydroxylapatitmaterial Typ I oder Typ II (CHT) gefüllte Chromatographiesäule gepumpt, wobei die genannten Enzyme neben verschiedenen anderen Komponenten an dem Hydroxylapatit binden. Bei Temperaturen von 4 bis 25 °C und einem pH-Wert von 6 bis 9 wird mittels Stufenelution bei linearen Flussraten > 300 cm/h eluiert. Dabei eignet sich ein Phosphatpuffer, der 0 bis 1000 mmol/l eines Alkalihalogenides enthält, wobei die Phosphatkonzentration stufenweise von 10 bis 350 mmol/l Phosphat erhöht wird. Alternativ oder zusätzlich kann der pH-Wert des Puffers schrittweise von 6 bis 9 erhöht werden. Es werden vorzugsweise drei Elutionsstufen durchgeführt. Die in der ersten Elutionsstufe erhaltene Fraktion 1 enthält ausschließlich niedermolekulare Bestandteile.Of the Fermentation supernatant in a first step of the process, one is on ceramic hydroxyapatite material Type I or Type II (CHT) filled chromatography column pumped, said enzymes in addition to various others Bind components to the hydroxyapatite. At temperatures from 4 to 25 ° C and a pH of 6 to 9 is achieved by means of step elution at linear Flow rates> 300 cm / h eluted. In this case, a phosphate buffer, which is 0 to 1000 mmol / l contains an alkali halide, wherein the phosphate concentration gradually from 10 to 350 mmol / l Phosphate increases becomes. Alternatively or in addition the pH of the buffer can be increased gradually from 6 to 9. There are preferably carried out three elution stages. The fraction 1 obtained in the first elution stage contains only low molecular weight Ingredients.
Fraktion 2 der zweiten Elutionsstufe enthält neben niedermolekularen Komponenten neutrale Protease (Caseinase). Fraktion 3 der dritten Elutionsstufe enthält ebenfalls niedermolekulare Komponenten, das gesamte Clostripain sowie sämtliche Typ I und Typ II Kollagenasen.fraction 2 of the second elution step in addition to low molecular weight components neutral protease (caseinase). Fraction 3 of the third elution step also contains low molecular weight Components, the entire clostripain and all type I and type II collagenases.
Fraktion 3 wird beispielsweise mittels Ultrafiltration/Diafiltration oder Nanofiltration oder Dialyse entsalzt und gegebenenfalls aufkonzentriert. Anschließend wird die entsalzte Lösung in einem zweiten chromatographischen Schritt einer Anionenaustauschchromatographie unterzogen. Hierfür wird ein Chromatographiematerial auf Styrol/Divinylbenzolbasis verwendet, das beispielsweise mit einer quartären Ammoniumgruppe funktionalisiert ist. Dabei kann auf kommerziell erhältliche Materialien zurückgegriffen werden (zum Beispiel Source der Firma Pharmacia, POROS der Firma PerSeptive, Makroprep der Firma Biorad). Bereits bei der Beladung des Anionenaustauschers mit Fraktion 3 erfolgt eine Abtrennung kationischer oder nichtionischer, niedermolekularer Bestandteile. Die Elution der gebundenen Bestandteile erfolgt bei 4 bis 25 °C in einem gepufferten System im pH-Bereich von 7 bis 9,5 mittels Stufenelution bei einer linearen Flussrate oberhalb von 500 cm/h, wobei eine Alkali- oder Erdalkalihalogenidkonzentration von 1 bis 1000 mmol/l und/oder der pH-Wert von 9,5 bis 6 schrittweise variiert wird. Vorzugsweise werden zwei Fraktionen getrennt, wobei Fraktion 4 der ersten Elutionsstufe Clostripain und Typ II Kollagenase und Fraktion 5 der zweiten Elutionsstufe ebenfalls Clostripain sowie Typ I Kollagenase enthält.fraction 3 is for example by ultrafiltration / diafiltration or Desalted nanofiltration or dialysis and optionally concentrated. Subsequently becomes the desalted solution in a second chromatographic step of anion exchange chromatography subjected. Therefor if a styrene / divinylbenzene-based chromatography material is used, for example, functionalized with a quaternary ammonium group is. It can be used on commercially available materials become (for example Source of the company Pharmacia, POROS of the company PerSeptive, macroprep from Biorad). Already at the loading of the anion exchanger with fraction 3, a separation of cationic takes place or nonionic, low molecular weight components. The elution the bound components are carried out at 4 to 25 ° C in one buffered system in the pH range of 7 to 9.5 by means of step elution at a linear flow rate above 500 cm / h, with an alkali or alkaline earth halide concentration of 1 to 1000 mmol / l and / or the pH is varied gradually from 9.5 to 6. Preferably two fractions are separated, with fraction 4 of the first elution step Clostripain and type II collagenase and fraction 5 of the second elution step also contains clostripain and type I collagenase.
Fraktion 4 und Fraktion 5 werden getrennt voneinander in einer dritten chromatographischen Stufe einer Kationenaustauschchromatographie unterzogen. Dabei wird ebenfalls eine auf Styrol/Divinylbenzolmaterial basierende Säulenfüllung verwendet, welche hier jedoch mit einer Kationen bindenden Gruppe, beispielsweise SO3H, funktionalisiert ist. Auch hier können die vorstehend genannten, kommerziellen Materialien verwendet werden. Die Elution des Kationenaustauschers wird bei 4 bis 25 °C in einem gepufferten System im pH-Bereich von 5,7 bis 7 bei linearen Flussraten von mindestens 500 cm/h mittels Stufenelution durchgeführt. Dabei wird im Elutionspuffer eine Alkalibeziehungsweise Erdalkalihalogenidkonzentration zwischen 0 und 300 mmol/l und/oder der pH-Wert zwischen 5 und 7 schrittweise eingestellt. Die Elution wird vorzugsweise in zwei Stufen durchgeführt, wobei in der ersten Elutionsstufe die jeweilige Kollagenase und in der zweiten Elutionsstufe Clostripain erhalten wird.Fraction 4 and Fraction 5 are separately subjected to cation exchange chromatography in a third chromatographic step. In this case, a styrene / divinylbenzene-based column filling is also used, which, however, is functionalized here with a cation-binding group, for example SO 3 H. Again, the above-mentioned commercial materials can be used. The elution of the cation exchanger is carried out at 4 to 25 ° C in a buffered system in the pH range of 5.7 to 7 at linear flow rates of at least 500 cm / h by means of step elution. In this case, in the elution buffer, an alkali-metal concentration of alkaline earth halide concentration between 0 and 300 mmol / l and / or the pH value between 5 and 7 is set stepwise. The elution is preferably carried out in two stages, the respective collagenase being obtained in the first elution stage and clostripain in the second elution stage.
Eine Kultur von Clostridium histolyticum wird unter Verwendung eines tierischen oder pflanzlichen Nährmediums in Flüssigkultur nach Standardmethoden bis zu einer gewünschten Zelldichte fermentiert. Nach Abtrennung der Zellen mit üblichen Methoden, beispielsweise durch Zentrifugation oder Filtration, werden 2000 ml des konzentrierten Fermentationsüberstandes mit einer linearen Flussrate von 300 cm/h auf eine mit 1700 ml keramischem Hydroxylapatit Typ I gefüllte Chromatographiesaule gepumpt. Die an die Hydoxylapatitsäule gebundenen Komponenten werden bei 20 bis 25 °C mit einer linearen Flussrate von 300 cm/h in drei Stufen mit Phosphatpuffer eluiert, wobei die Phosphatkonzentration schrittweise erhöht wird. In der ersten Elutionsstufe wird mit zirka 10 CV (Säulenvolumina) mit 10 mmol/l Phosphatpuffer/100 mmol/l NaCl eluiert, wobei die hauptsächlich niedermolekulare Bestandteile enthaltende Fraktion I erhalten wird. Anschließend wird mit etwa 3 CV 60 mmol/l Phosphatpuffer/100 mmol/l NaCl eluiert und Fraktion 2 erhalten, die Caseinase und ebenfalls niedermolekulare Komponenten enthält. Für die dritte Elutionsstufe wird mit zirka 5 CV 200 mmol/l Phosphatpuffer/100 mmol/l NaCl eluiert. Die hierbei gesammelte Fraktion 3 enthält die Enzyme Clostripain und sämtliche Typ I und Typ II Kollagenasen. Fraktion 2 wird entsalzt und lyophilisiert. Eine Abtrennung der niedermolekularen Bestandteile von Caseinase kann gegebenenfalls mit Standardmethoden erreicht werden.A Culture of Clostridium histolyticum is determined using a animal or vegetable nutrient medium in liquid culture fermented by standard methods to a desired cell density. After separation of the cells with usual Methods, for example by centrifugation or filtration, become 2000 ml of the concentrated fermentation supernatant with a linear Flow rate of 300 cm / h on a 1700 ml ceramic hydroxyapatite Type I filled Pumped chromatography column. The bound to the Hydoxylapatitsäule Components are at 20 to 25 ° C with a linear flow rate of 300 cm / h in three stages with phosphate buffer eluted, the phosphate concentration is gradually increased. In the first elution step, with about 10 CV (column volumes) with 10 mmol / l phosphate buffer / 100 mmol / l NaCl eluted, the mainly Low-molecular components containing fraction I is obtained. Subsequently is eluted with about 3 CV 60 mmol / l phosphate buffer / 100 mmol / l NaCl and fraction 2, the caseinase and also low molecular weight Contains components. For the third elution step is with about 5 CV 200 mmol / l phosphate buffer / 100 mmol / l NaCl eluted. The collected fraction 3 contains the enzymes Clostripain and all Type I and Type II collagenases. Fraction 2 is desalted and lyophilized. A separation of the low molecular weight components of caseinase can be achieved with standard methods if necessary.
Fraktion 3 wird mittels Ultrafiltration/Diafiltration oder Nanofiltration oder Dialyse entsalzt und gegebenenfalls aufkonzentriert. Anschließend wird Fraktion 3 mit einem geeigneten Puffer, beispielsweise 500 mmol/l Tris pH 9,0-9,3, auf pH 9,0-9,3 eingestellt. Die gepufferte Lösung wird bei 20-25 °C mit einer linearen Flussrate von zirka 1000 cm/h über eine als Anionenaustauscher funktionalisierte Styrol/Divinylbenzolsäule (POROS 50 Pl der Firma PerSeptive) gepumpt. Anschließend wird die Säule mit zirka 5 CV Tris-Puffer gewaschen. Die Elution erfolgt bei 20-25 °C und einer linearen Flussrate von zirka 1000 cm/h in zwei Elutionsstufen mit steigender Salzkonzentration. Fraktion 4 wird durch Elution mit 40 mmol/l Iris Puffer/6 mmol/l CaCl2/30 mmol/l NaCl pH 9,0-9,3 erhalten und enthält die Enzyme Clostripain und Typ II Kollagenase. Fraktion 5, die ebenfalls Clostripain sowie Typ I Kollagenase enthält, wird in der zweiten Elutionsstufe durch Elution mit 40 mmol/l Tris/6 mmol/l CaCl2/70 mmol/l NaCl pH 9,0-9,3 erhalten.Fraction 3 is desalted by ultrafiltration / diafiltration or nanofiltration or dialysis and optionally concentrated. Subsequently, fraction 3 is adjusted to pH 9.0-9.3 with a suitable buffer, for example 500 mmol / l Tris pH 9.0-9.3. The buffered solution is pumped at 20-25 ° C with a linear flow rate of about 1000 cm / h via an anion exchanger functionalized styrene / divinylbenzene column (POROS 50 Pl from PerSeptive). Subsequently, the column is washed with approximately 5 CV Tris buffer. The elution takes place at 20-25 ° C and a linear flow rate of about 1000 cm / h in two elution stages with increasing salt concentration. Fraction 4 is obtained by elution with 40 mmol / l iris buffer / 6 mmol / l CaCl 2/30 mmol / l NaCl pH 9.0-9.3 and contains the enzymes clostripain and type II collagenase. Fraction 5 which also contains clostripain and collagenase type I is obtained in the second elution eluting with 40 mmol / l Tris / 6 mmol / l CaCl2 / 70 mmol / l NaCl pH 9.0-9.3.
Fraktion 4 und Fraktion 5 werden beispielsweise durch Dialyse für 24 Stunden gegen 50 l H2O entsalzt und mit 50 mmol/l MES-Puffer auf pH 5,9-6,1 eingestellt. Beide Fraktionen werden getrennt voneinander an einer Kationenaustauschersäule auf Styrol/Divinylbenzolmaterial (zum Beispiel POROS 50 HS der Firma PerSeptive) chromatographiert. Dafür werden die Fraktionen mit einer linearen Flussrate von zirka 700 cm/h bei 20-25 °C auf die Säule geladen und unter gleichen Bedingungen eluiert. Die Elution von Typ II Kollagenase aus Fraktion 4 bzw. Typ I Kollagenase aus Fraktion 5 erfolgt jeweils in einer ersten Elutionsstufe mit 10 mmol/l MES-Puffer/20-40 mmol/l NaCl pH 5,9-6,1 bei 20-25 °C. Clostripain aus beiden Fraktionen wird jeweils anschließend mit 10 mmol/l MES- Puffer/90-110 mmol/l NaCl pH 5,9-6,1 eluiert. Die Clostripain enthaltenden Lösungen werden vereinigt. Alle Lösungen werden entsalzt, gegen 2 mmol/l CaAc2 dialysiert und anschließend lyophilisiert.Fraction 4 and fraction 5 are desalted for example by dialysis for 24 hours against 50 l H 2 O and adjusted to pH 5.9-6.1 with 50 mmol / l MES buffer. Both fractions are chromatographed separately on a cation exchange column on styrene / divinylbenzene material (for example POROS 50 HS from PerSeptive). For this purpose, the fractions are loaded onto the column at a linear flow rate of about 700 cm / h at 20-25 ° C and eluted under the same conditions. The elution of type II collagenase from fraction 4 or type I collagenase from fraction 5 is in each case carried out in a first elution stage with 10 mmol / l MES buffer / 20-40 mmol / l NaCl pH 5.9-6.1 at 20- 25 ° C. Clostripain from both fractions is then subsequently eluted with 10 mmol / l MES buffer / 90-110 mmol / l NaCl pH 5.9-6.1. The clostripain-containing solutions are combined. All solutions are desalted, dialyzed against 2 mmol / l CaAc 2 and then lyophilized.
Eine Bestimmung der jeweiligen Enzymaktivitäten der so erhaltenen Enzyme erfolgte nach bekannten Methoden (s. Tabelle). Ferner wurde die Reinheit der Enzyme Typ I Kollagenase, Typ II Kollagenase und Clostripain mittels reversed phase Chromatographie bestimmt. Die Ergebnisse sind nachfolgend in der Tabelle zusammengefasst: Tabelle:
- a bestimmt nach Wunsch E., Heidrich H.-G.; Z. Physiol. Chem. 333, 149-151, 1963; b bestimmt nach Doi, Shibata, Matoba; Anal. Biochem. 118, 173-184, 1981; c bestimmt nach Mitchel, Harrington; Methods EnzymoL, 19, 635-642, 1970; d bestimmt nach Moore, Stein; Blot. Chem. 176, 367, 1948; e bestimmt mit RPC.
- a determines as desired E., Heidrich H.-G .; Z. Physiol. Chem. 333, 149-151, 1963; b destined for Doi, Shibata, Matoba; Anal. Biochem. 118, 173-184, 1981; c determined by Mitchel, Harrington; Methods Enzymol, 19, 635-642, 1970; d determined to Moore, Stein; Blot. Chem. 176, 367, 1948; e determined with RPC.
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