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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von tuberkulinaktiven Einfachproteinen und Peptiden, welche folgende Peptidgruppierung
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als tuberkulinaktive funktionelle Gruppe aufweisen.
Es ist bekannt, dass gereinigtes Proteinderivat (PPD) aus extrazellulärem Alttuberkulin (OT) ausschliesslich für die Diagnose von Tuberkulose verwendet worden ist. Leider enthält PPD ausser den tuberkulinaktiven Proteinen andere inaktive Proteine, Nukleinsäuren, Polysaccharide und Fettsäuren. Im Zusammenhang mit der Herstellung von Tuberkulinantigenen ist eine Anzahl von Verfahren vorgeschlagen worden. Beispielsweise wird in der deutschen Offenlegungsschrift 2222092 ein Verfahren zur Herstellung von Tuberkulinantigenen durch fraktionierte Zellextraktion von Tuberkelbazillus beschrieben. In der deutschen Patentschrift Nr. 892047 ist ein Verfahren zur Herstellung von tuberkuloziden Substanzen durch Extraktion von Zellkörperflüssigkeiten oder Körperausscheidungsprodukten des Wirtsorganismus von E. coli und Fraktionierung des entstehenden Extraktes beschrieben. Aus der brit.
Patentschrift Nr. 860,305 ist ein Verfahren zur Herstellung eines tuberkulinaktiven Peptids durchExtraktion von Zellkörpern des TuberkelbazillusundFällung des extrahierten Tuberkulinpeptids mit Pikrin- säure bekannt. In der USA-Patentschrift Nr. 1, 586,937 wird ein Verfahren zur Herstellung von Vaccinmaterial durch Extraktion einer Kulturlösung von Tuberkelbazillus mit Alkohol und Abbau des erhaltenen Extraktes mit Pankreatin oder Trypsin beschrieben.
Auf Grund der unvollständigen Fraktionierungen oder der Unterschiede bezüglich ihrer Fraktionierung gegenüber jener gemäss der Erfindung war es bei den bekannten Verfahren nicht möglich, reine und starke tuberkulinaktive Einzelproteine und Peptide zu erhalten, die jenen, wie sie gemäss der Erfindung erhalten werden, ähnlich sind. Da tuberkulinaktive Einfachproteine und Peptide nicht erhalten wurden, sind auch deren phys. chem., chemische und biologische Eigenschaften nicht entdeckt worden.
Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von tuberkulinaktiven Einfachproteinen aus Zellen der Tuberkelbazillen gefunden und ferner gelang die Isolierung dieser Einfachproteine in kristalliner Form. Es wurden auch die Aminosäuresequenzen und Aminosäurezusammensetzungen der erhaltenen Proteine bestimmt. Ausserdem wurden tub erku linaktive Peptide durch Hydrolysieren der obigen erhaltenen Proteine und Fraktionieren der erhaltenen Hydrolysate hergestellt. Als Ergebnis dieser Untersuchungen wurde festgestellt, dass die Tuberkulinaktivität in enger Verbindung mit der tuberkulinfunktionellen Gruppe in Proteinen und Peptiden steht.
Die tuberkulinaktiven Einfachproteine werden gemäss der Erfindung aus Tuberkelbazilluszellen durch Behandlung dieser Bazillenzellen mit organischen Lösungsmitteln, Abbauen des erhaltenen Rückstandes mit Nucleasen, Dialysieren der erhaltenen wasserlöslichen Proteine und Fraktionieren der entstehenden Dialysate durch Chromatographie, Elektrophorese und/oder Gelfiltration hergestellt. Die im Rahmen der Erfindung verwendeten Tuberkelbazillen sind Menschen-, Rinder- oder Geflügeltuberkelbazillen einschliesslich Bacille de Calmette et Guérin (BCG) u. a. Die erhältlichen tuberkulinaktiven Einfachproteine sind von den Tuberkelbazillen und den Herstellungsbedingungen, die im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens angewendet werden, abhängig.
Beispielsweise ist das tuberkulinaktive Einfachprotein vom Menschentypus Mycobacterium tuberculosis-Stamm Aoyama B aus 89 Aminosäureresten je Molekül zusammengesetzt. Anderseits ist das aktive Protein aus BCG aus 135 Aminosäureresten je Molekül aufgebaut.
Die obigen Tuberkelbazillen werden mit organischen Lösungsmitteln, wie Ketonen, Alkoholen oder Carbonsäuren, zur Entfernung fettlöslicher Komponenten aus den Bazillenzellen behandelt. Vorzugsweise wird Aceton, Methanol oder Essigsäure angewendet. Diese organischen Lösungsmittel können auch gemeinsam mit Wasser benützt werden. Die lösungsmittelextrahierten Rückstände werden mit Nucleasen, wie Ribonucleasen, Desoxyribonucleasen u. dgl., abgebaut. Von den beim Abbau erhaltenen Mischungen werden wasserlösliche Proteine abgetrennt und gegen Puffer mit pH-Werten von 5,5 bis 7,8, wie tris- (Hydroxymethyl)-aminomethan-
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0,phat-Monokaliumhydrogenphosphat-Puffer vom pH 7, 2, der Äthylendiamintetraessigsäure enthält, u. dgl. dialysiert.
Die entstehenden Dialysate werden durch Chromatographie, Elektrophorese und/oder Gelfiltration fraktioniert. Insbesondere werden Säulenchromatographie unter Verwendung von Ionenaustauschercellulosen oder Gelfiltrationunter Verwendung von Dextranpolymeren mit Brückenbindungen besonders bevorzugt angewendet. Die Ionenaustauschercellulosen, die zur Fraktionierung der obigen Dialysate angewendet werden können, können beispielsweise Aminoäthylcellulose, Diäthylaminoäthylcellulose, Triäthylaminoäthylcellulose oder Epichlorhydrintriäthanolamincellulose sein. Zur Verwendung bei der Gelfiltration werden Dextranpolymeren mit Brückenbindung, Carboxymethyldextranpolymeren mit Brückenbindung oder Sulfoäthyldextranpolymeren mit Brückenbindung bevorzugt verwendet. Die dialysierten Proteine werden mit den oben erwähnten Puffern eluiert.
Die tuberkulinaktiven Einzelproteine, die erfindungsgemäss erhältlich sind, sind in Wasser löslich und ihre Molekulargewichte von 3000 bis 35000 hängen vonden für deren Herstellung verwendeten Tuberkelbazillen und den Herstellungsbedingungen derselben ab.
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Tuberkulinhauttests ergeben, dass die tuberkulinaktiven Einzelproteine, wie sie erfindungsgemäss erhältlich sind, gegenüber Meerschweinchen, die mit hitzeabgetötetem Mycobacterium tuberculosis-Stamm Aoyama B oder BCG sensitiviert worden sind, Tuberkulinaktivitäten aufweisen, die 10- bis 100-mal stärker sind als jene von PPD.
Die erfindungsgemäss erhältlichen tuberkulinaktiven Peptide werden durch Hydrolysieren der oben erwähnten kristallinen Tuberkulinproteine hergestellt und durch Fraktionierung der entstehenden Hydrolysate durch Chromatographie, Elektrophorese und/oder Gelfiltration erhalten. Die tuberkulinaktiven Einfachproteine werden durch chemische oder enzymatische Methoden hydrolysiert. Die chemische Hydrolyse wird mit einer Mineralsäure ausgeführt. Die enzymatische Hydrolyse führt man mit einem proteolytischen Enzym, wie Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Papain, bakteriellen Proteinasen, Carboxypeptidase A oder B u. dgl., aus. Die Gelfil - tration wird durch Eluieren mit Ammoniumacetatpuffern oder Pyridinacetatpuffern durch Säulen mit Gelfiltrationsmitteln vorgenommen.
Dieerfindungsgemäss erhältlichen tuberkulinaktiven Peptide sind weisse, kristalline Festkörper, die in Wasser löslich sind und ein Molekulargewicht von etwa 500 bis 3000 aufweisen. Tuberkulin-Hauttests zeigen, dass die erfindungsgemäss erhältlichen tuberkulinaktiven Peptide Tuberkulinaktivitäten aufweisen, die mit jenen von PPD bei Meerschweinchen, die mit wärmeabgetötetem Macobacterium tuberculosis-Stamm Aoyama B oder BCG sensitiviert worden sind, vergleichbar oder wesentlich stärker als diese sind.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Herstellung und Isolierung der tuberkulinaktiven Einfachproteine und Peptide nach dem erfindungsgemässen Verfahren.
Beispiel l : Eine Zellkultur (100 g) vom Mycobacterium tuberculosis-Stamm Aoyama B wurde durch 30 min dauerndes Erhitzen auf 1200C abgetötet. Die Zellen wurden vom Kulturmedium durch Filtration abgetrennt, dann unter Schalleinwirkung zerkleinert und mit Aceton behandelt, um fettlösliche Komponenten von den Zellen zu entfernen. Der acetonbehandelte Rückstand wird mit Ribonuclease und Desoxyribonuclease abgebautund die abgebaute Mischung wird zentrifugiert, um wasserlösliche Proteine abzutrennen. Die so erhaltenen wasserlöslichen Proteine werden gegen 0, 001-molaren tris- (Hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäurepuffer vom PH 7, 0, der 0, 0001 Mol Äthylendiamintetraessigsäure enthält, dialysiert.
Das entstehende Dialysat wird über eine Diäthylaminoäthylcellulosesäule chromatographiert. Die Eluierung wurde in einem Natriumchloridgradienten vorgenommen. Praktisch die gesamte Tuberkulinaktivität wurde in der zweiten Proteinfraktion gefunden. Weiteres Fraktionieren über eine Säule aus Dextranpolymeren mit Brückenbindung wurde im gleichen Puffer wie oben vorgenommen und führte zu drei Fraktionen. Nahezu das gesamte aktive Material findet sich in der grösseren Proteinfraktion. Das tuberkulinaktive Material kristallisierte spontan, wenn die Lösung bei 40C in eine Mischung des gleichen Puffers mit gereinigtem Aceton gebracht wurde. Aus 100 g Zellen (Nassgewicht) des Mycobacterium tuberculosis-Stammes Aoyama B wurden 25 mg kristallines tuberkulinaktives Protein erhalten.
Das so erhaltene tuberkulinaktive Einfachprotein mit einem Molekulargewicht von 9500 war aus 89 Amino-
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ist, wurde aus BCG nach der gleichen Methode, wie in Beispiel 1 angegeben ist, hergestellt. Die Aminosäuresequenz und die Aminosäurezusammensetzung/Molekül dieses Proteins wurde ermittelt, wobei festgestellt wurde, dass Ähnlichkeit mit dem tuberkulinaktiven Protein, wie es gemäss Beispiel l erhalten wird, besteht.
Beim Tuberkulin-Hauttest zeigte sich, dass dieses tuberkulinaktive Protein eine Tuberkulinaktivität aufweist, die nahezu gleich ist jener des tuberkulinaktiven Proteins, wie es nach Beispiel 1 erhalten wird, wobei die Ermittlung bei Meerschweinchen durchgeführt wurde, die mit einem wärmeabgetöteten Mycobacterium tuberculosis Aoyama B-Stamm oder BCG sensitiviert worden sind.
Beispiel 3 : Das tuberkulinaktive Einfachprotein, das gemäss Beispiel 1 erhalten worden ist, wurde bei
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spannungspapierelektrophorese des entstehenden Hydrolysats auf Whatman-Papier bei 75 V/cm in Pyridin-acetatpuffer vom pH 4, 5 und anschliessend eine Papierchromatographie in einem Gemisch aus Butanol/Essigsäure/ Wasser (Vol. - Verhältnis 4 : 1 : 4) ausgeführt.
Die obige Entwicklung führte zur Trennung der verschiedenen tuberkulinaktiven Peptide. Eines davon war
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ein Pentapeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz :
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<tb>
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP>
<tb> HN-Asn-Gly-Ser-Gln-Met-COOH
<tb>
Ein anderes war ein Nonapeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 950.
Tuberkulin-Hauttests zeigten, dass diese tuberkulinaktiven Peptide eine Aktivität von 1 bis 10% des Ausgangstuberkulinproteins aufwiesen.
Beispiel 4 : Das gemäss Beispiel 1 erhaltene tuberkulinaktive Protein wurde in o, 5% iger Chymotrypsinlösung hydrolysiert. Das entstehende Hydrolysat wurde auf einer Säule aus Dextranpolymeren mit Brückenbindung chromatographiert, wobei die Eluierung mit einem Ammoniumacetatpuffer vom pH 5, 9 vorgenommen wurde. Diese erhaltenen tuberkulinaktiven Peptide wurden mit Pyridinacetatpuffer vom pH 3, 1 auf einer Ionenaustauscherharzsäule weiter fraktioniert. Das so erhaltene tuberkulinaktive Pentapeptid war das gleiche wie in Beispiel 3.
Beispiel 5: Das tuberkulinaktive Protein des Beispiels 2 wurde in der gleichen Weise wie oben behandelt. Es wurde das gleiche tuberkulinaktive Pentapeptid wie im Beispiel 3 erhalten.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von tuberkulinaktiven Einfachproteinen und Peptiden mit der folgenden Peptidbindung
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behandelt, (c) den lösungsmittelbehandelten Rückstand gegen einen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 5, 5 bis 7, 8 dialysiert, (d) das Dialysat durch Säulenchromatographie, Papierchromatographie, Papierelektrophorese und/oder Gelfiltration fraktioniert und gegebenenfalls (e) das tuberkulinaktive Protein hydrolysiert und dasentstehendeHydrolysatdurch Säulenchromatographie, Papierchromatographie, Papierelektrophorese und/oder Gelfiltration fraktioniert.
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bacterium tuberculosis-Stamm Aoyama B verwendet.
3. Verfahren nachAnspruchl, dadurch gekennzeichnet, dassmanalsTuberkelbazillusBacille de Calmette et Guérin (BCG) verwendet.
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The invention relates to a process for the production of tuberculin-active single proteins and peptides which have the following peptide grouping
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as a tuberculin active functional group.
It is known that purified protein derivative (PPD) from extracellular old tuberculin (OT) has been used exclusively for the diagnosis of tuberculosis. Unfortunately, in addition to tuberculin-active proteins, PPD contains other inactive proteins, nucleic acids, polysaccharides and fatty acids. A number of methods have been proposed in connection with the production of tuberculin antigens. For example, the German Offenlegungsschrift 2222092 describes a method for the production of tuberculin antigens by fractional cell extraction of tubercle bacillus. German patent specification No. 892047 describes a process for the production of tuberculocidal substances by extracting cell body fluids or body waste products of the host organism of E. coli and fractionating the resulting extract. From the brit.
Patent specification No. 860,305 discloses a process for producing a tuberculin-active peptide by extracting cell bodies of the tubercle bacillus and precipitating the extracted tuberculin peptide with picric acid. US Pat. No. 1, 586,937 describes a process for the production of vaccine material by extraction of a culture solution of tubercle bacillus with alcohol and degradation of the extract obtained with pancreatin or trypsin.
Due to the incomplete fractionations or the differences in their fractionation compared to that according to the invention, it was not possible with the known methods to obtain pure and strong tuberculin-active individual proteins and peptides which are similar to those obtained according to the invention. Since tuberculin-active single proteins and peptides were not obtained, their physical, chemical, chemical and biological properties were also not discovered.
A process has now been found for the production of tuberculin-active single proteins from cells of the tubercle bacilli, and these single proteins have also been isolated in crystalline form. The amino acid sequences and amino acid compositions of the proteins obtained were also determined. In addition, tub-active peptides were prepared by hydrolyzing the above obtained proteins and fractionating the obtained hydrolysates. As a result of these investigations, it was found that tuberculin activity is closely related to the tuberculin functional group in proteins and peptides.
The tuberculin-active single proteins are produced according to the invention from tubercle bacillus cells by treating these bacillus cells with organic solvents, breaking down the residue obtained with nucleases, dialyzing the water-soluble proteins obtained and fractionating the dialysates formed by chromatography, electrophoresis and / or gel filtration. The tubercle bacilli used in the context of the invention are human, bovine or poultry tubercle bacilli including Bacille de Calmette et Guérin (BCG) and the like. a. The tuberculin-active single proteins obtainable are dependent on the tubercle bacilli and the production conditions used in the context of the process according to the invention.
For example, the tuberculin-active simple protein of the human type Mycobacterium tuberculosis strain Aoyama B is composed of 89 amino acid residues per molecule. On the other hand, the active protein from BCG is made up of 135 amino acid residues per molecule.
The above tubercle bacilli are treated with organic solvents such as ketones, alcohols or carboxylic acids to remove fat-soluble components from the bacilli cells. Preferably acetone, methanol or acetic acid is used. These organic solvents can also be used together with water. The solvent-extracted residues are treated with nucleases such as ribonucleases, deoxyribonucleases and the like. Like., dismantled. Water-soluble proteins are separated from the mixtures obtained during the breakdown and buffers with pH values of 5.5 to 7.8, such as tris (hydroxymethyl) aminomethane
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0, phat-monopotassium hydrogen phosphate buffer of pH 7.2, which contains ethylenediaminetetraacetic acid, u. dialyzed.
The resulting dialysates are fractionated by chromatography, electrophoresis and / or gel filtration. In particular, column chromatography using ion-exchange celluloses or gel filtration using dextran polymers having bridge bonds are particularly preferably used. The ion exchange celluloses which can be used to fractionate the above dialysates can be, for example, aminoethyl cellulose, diethylaminoethyl cellulose, triethylaminoethyl cellulose or epichlorohydrintriethanolamine cellulose. For use in gel filtration, dextran polymers with a bridge bond, carboxymethyldextran polymers with a bridge bond or sulfoethyldextran polymers with a bridge bond are preferably used. The dialyzed proteins are eluted with the above-mentioned buffers.
The tuberculin-active individual proteins obtainable according to the invention are soluble in water and their molecular weights from 3000 to 35000 depend on the tubercle bacilli used for their production and the production conditions of the same.
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Tuberculin skin tests show that the tuberculin-active individual proteins, as obtainable according to the invention, have tuberculin activities that are 10 to 100 times stronger than those of PPD compared to guinea pigs which have been sensitized with heat-killed Mycobacterium tuberculosis strain Aoyama B or BCG.
The tuberculin-active peptides obtainable according to the invention are produced by hydrolyzing the above-mentioned crystalline tuberculin proteins and obtained by fractionating the hydrolyzates formed by chromatography, electrophoresis and / or gel filtration. The tuberculin-active single proteins are hydrolyzed by chemical or enzymatic methods. The chemical hydrolysis is carried out with a mineral acid. The enzymatic hydrolysis is carried out with a proteolytic enzyme such as trypsin, chymotrypsin, pepsin, papain, bacterial proteinases, carboxypeptidase A or B and the like. like., off. Gel filtration is carried out by eluting with ammonium acetate buffers or pyridine acetate buffers through columns of gel filtration media.
The tuberculin-active peptides obtainable according to the invention are white, crystalline solids which are soluble in water and have a molecular weight of about 500 to 3000. Tuberculin skin tests show that the tuberculin-active peptides obtainable according to the invention have tuberculin activities which are comparable to or significantly stronger than those of PPD in guinea pigs which have been sensitized with the heat-killed Macobacterium tuberculosis strain Aoyama B or BCG.
The following examples illustrate the production and isolation of the tuberculin-active single proteins and peptides by the method according to the invention.
Example 1: A cell culture (100 g) of the Mycobacterium tuberculosis strain Aoyama B was killed by heating to 1200 ° C. for 30 minutes. The cells were separated from the culture medium by filtration, then chopped up under the action of noise and treated with acetone to remove lipid-soluble components from the cells. The acetone-treated residue is digested with ribonuclease and deoxyribonuclease, and the digested mixture is centrifuged to separate water-soluble proteins. The water-soluble proteins thus obtained are dialyzed against 0.001 molar tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloric acid buffer of pH 7.0, which contains 0.001 mol of ethylenediaminetetraacetic acid.
The resulting dialysate is chromatographed on a diethylaminoethyl cellulose column. The elution was carried out in a sodium chloride gradient. Virtually all of the tuberculin activity was found in the second protein fraction. Further fractionation through a column of dextran polymers with bridge binding was done in the same buffer as above and resulted in three fractions. Almost all of the active material is found in the larger protein fraction. The tuberculin-active material crystallized spontaneously when the solution was placed in a mixture of the same buffer with purified acetone at 40C. 25 mg of crystalline tuberculin-active protein were obtained from 100 g of cells (wet weight) of the Mycobacterium tuberculosis strain Aoyama B.
The resulting tuberculin-active single protein with a molecular weight of 9500 was composed of 89 amino
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was prepared from BCG by the same method as given in Example 1. The amino acid sequence and the amino acid composition / molecule of this protein were determined, and it was found that there is a similarity to the tuberculin-active protein as obtained according to Example 1.
In the tuberculin skin test, it was found that this tuberculin-active protein has a tuberculin activity which is almost the same as that of the tuberculin-active protein as obtained according to Example 1, the determination being carried out in guinea pigs which were killed with a heat-killed Mycobacterium tuberculosis Aoyama B strain or BCG have been sensitized.
Example 3: The tuberculin-active single protein which was obtained according to Example 1 was used in
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Voltage paper electrophoresis of the resulting hydrolyzate on Whatman paper at 75 V / cm in pyridine acetate buffer of pH 4.5 and then paper chromatography in a mixture of butanol / acetic acid / water (volume ratio 4: 1: 4).
The above development led to the separation of the various tuberculin-active peptides. One of them was
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a pentapeptide with the following amino acid sequence:
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<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP>
<tb> HN-Asn-Gly-Ser-Gln-Met-COOH
<tb>
Another was a nonapeptide with a molecular weight of about 950.
Tuberculin skin tests showed that these tuberculin active peptides had an activity of 1 to 10% of the parent tuberculin protein.
Example 4: The tuberculin-active protein obtained according to Example 1 was hydrolyzed in 0.5% strength chymotrypsin solution. The resulting hydrolyzate was chromatographed on a column of dextran polymers with a bridge bond, eluting with an ammonium acetate buffer of pH 5.9. These tuberculin-active peptides obtained were further fractionated with pyridine acetate buffer of pH 3.1 on an ion exchange resin column. The tuberculin active pentapeptide thus obtained was the same as in Example 3.
Example 5: The tuberculin active protein of Example 2 was treated in the same manner as above. The same tuberculin-active pentapeptide as in Example 3 was obtained.
PATENT CLAIMS:
1. Process for the production of tuberculin-active single proteins and peptides with the following peptide bond
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treated, (c) the solvent-treated residue dialyzed against a buffer with a pH in the range from 5.5 to 7.8, (d) the dialysate fractionated by column chromatography, paper chromatography, paper electrophoresis and / or gel filtration and optionally (e) the tuberculin active protein is hydrolyzed and the resulting hydrolyzate is fractionated by column chromatography, paper chromatography, paper electrophoresis and / or gel filtration.
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bacterium tuberculosis strain Aoyama B was used.
3. The method according to claim, characterized in that one uses Bacille de Calmette et Guérin (BCG) as the tubercle bacillus.