WO1990006357A1 - Complements de milieux de culture de cellules animales a base de produits derives de l'industrie laitiere - Google Patents

Complements de milieux de culture de cellules animales a base de produits derives de l'industrie laitiere Download PDF

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WO1990006357A1
WO1990006357A1 PCT/FR1989/000621 FR8900621W WO9006357A1 WO 1990006357 A1 WO1990006357 A1 WO 1990006357A1 FR 8900621 W FR8900621 W FR 8900621W WO 9006357 A1 WO9006357 A1 WO 9006357A1
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fractions
whey
cells
culture
svf
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PCT/FR1989/000621
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Inventor
Guy Linden
Pierre Nabet
Jean-Michel Bour
Original Assignee
Universite De Nancy I
Bio-France Reactifs Developpement
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals

Definitions

  • the subject of the invention is supplements of cell culture media, particularly favoring the culture of animal cells, in particular fibroblasts, hybridomas or secreting cells.
  • fetal calf serum SVF
  • the inventors have now found that a product derived from the dairy industry, more readily available than milk fractions, can also be used as a partial substitute for SVF.
  • the invention therefore aims to provide additional culture media, usable as partial substitute for SVF, with the advantage of lower cost.
  • the culture medium supplements of the invention are characterized in that they are based on whey fractions essentially devoid of constituents with a molecular weight (MW) of less than 10,000. These fractions are as recovered during manufacture cheese in the industry dairy, after treatment of the milk with an acid, microorganisms and / or enzymes, followed by elimination of the constituents having a molecular weight
  • whey is meant the product recovered after enzymatic treatment of milk and / or with microorganisms (mild whey), or after coagulation of milk using an acid, such as hydrochloric acid (acid whey) .
  • milk denotes both whole milk and skimmed milk, and / or having undergone conservation treatments. It is milk most generally of animal origin, in particular cow's milk, or even other mammals such as goat, sheep, fluff, mare, yak or camel.
  • the whey fractions the chemical composition of which differs significantly from the milk fractions, in particular with regard to the protein fraction, however have a similar capacity for inducing the growth of animal cells in culture.
  • the work carried out has thus shown the capacity of whey fractions to stimulate DNA synthesis in cultures of animal cells, in particular fibroblasts, hybridomas or cells secreting, for example, hormones or growth factors.
  • whey fractions to stimulate DNA synthesis in cultures of animal cells, in particular fibroblasts, hybridomas or cells secreting, for example, hormones or growth factors.
  • such cultures can proliferate in the long term, using only low concentrations of SVF.
  • the protein content of the whey fractions is lower than that of the SVF, which makes it easier to separate the proteins secreted by the cells in culture.
  • This aspect of the invention is of great interest in particular for the recovery of monoclonal antibodies secreted by hybridomas.
  • the whey fractions of the invention contain many elements which are particularly suitable for the culture of hybridomas, such as transporters of hydrophobic substances such as ⁇ lactoglobulin, iron transporters, such as lactoferrin , compounds promoting the assimilation of glucose and
  • This application of the whey fractions as a complement to the culture medium also has the advantage of using a readily available product, - in particular, its manufacture does not require an ultracentrifugation stage - only partially developed to date and whose disposal of surpluses poses reprocessing problems.
  • the whey used as a complement to the culture medium is advantageously obtained from whole milk freed from the fatty matter and cellular debris which it contains, for example by centrifugation, or from skimmed milk, preferably heated to a temperature between the ambient and the boiling point, in particular above about 50 ° C.
  • the whey obtained is subjected, in accordance with the invention, to at least one ultrafiltration step carried out, in a favorable manner at room temperature, to remove the molecules having a PM less than about 10,000.
  • These are essentially inhibitory compounds.
  • the thus isolated whey fractions are preferably concentrated and sterilized before use 5 as culture media supplements.
  • the whey fractions are 0 thermized or as obtained from thermized whey.
  • the stage of heat treatment of the whey fractions is carried out during the stage of ultrafiltration or outside this stage.
  • the whey fractions are used for the preservation of cell cultures.
  • FIGS. 1 to 3 represent the incorporation of 3 H thymidine, into hybridomas (FIGS. 1 and 2) and into human fibroblasts (FIG. 3) in culture 5 in an unsupplemented medium or in a medium supplemented with FCS or in fractions whey of the invention.
  • FIG. 4 represents the number of viable cells of a hybridoma culture as a function of the 0 days of culture.
  • FIG. 5 represents the concentration of immunoglobulins secreted by hybridomas cultivated in media supplemented with SVF or increasing amounts of whey fractions. 5 EXAMPLE 1 Study of the biological activity of culture media supplemented with whey fractions. Whey fractions
  • Bovine whey fractions are prepared by operating according to one of the following three protocols: P - First protocol: After removal of the fat and cellular debris by centrifugation, proteins (mainly caseins) are precipitated from whole milk cow, either using enzymes (mixture of rennine and pepsin to 34 * C) or acid (concentrated HCl added to obtain a pH of 4.6, 34 * C).
  • P - First protocol After removal of the fat and cellular debris by centrifugation, proteins (mainly caseins) are precipitated from whole milk cow, either using enzymes (mixture of rennine and pepsin to 34 * C) or acid (concentrated HCl added to obtain a pH of 4.6, 34 * C).
  • the supernatants of the fractions of the sweet whey (F ⁇ and of the acid whey (F *) are subjected to ultra-filtration using a membrane with a cutoff threshold of 10,000, at a temperature of 15 to 20 ° C.
  • Each retentate is concentrated 6 times (F 2 : sweet whey retentate, and F 5 : acid whey retentate), or washed 2 times with ⁇ distilled water and concentrated 12 times (respectively F 3 and
  • skimmed milk was heated from 15 to 20 seconds at 67 e C. precipitates proteins using a mixture of enzymes.
  • Part of the supernatant (F 7 ) is subjected to ultrafiltration at 15 to 20 ° C and concentrated 6 times.
  • Another part of (F 7 ) is subjected to an ultrafiltration at 50 ° C. and concentrated 6 times (F 9 ) or washed 2 times and concentrated 12 times (F 10 ).
  • a third part of (F 7 ) is heated at 65 ° C. for 60 min and subjected to ultrafiltration at 50 ° C.
  • the retentate is concentrated 6 times (F) or washed 2 times and concentrated 12 times (F 2 ) • All the fractions are sterilized by filtration at 0.22 ⁇ m before use in the culture media.
  • 5 - Third protocol Whey is used as obtained during the manufacture of the cheese (first molding serum) and it is subjected to ultrafiltration using a membrane with a cutoff threshold of 10,000 daltons. 0 CELL CULTURES
  • a cell line of F34 hybridomas secreting IgG monoclonal antibodies is used against human gonadotropin and a cell line of A 49 hybridomas secreting IgM monoclonal antibodies against blood group A.
  • the cells are cultivated in the usual way in a culture medium RPMI 1640 (Boehringer Mannhei) supplemented with 3 g / 1 of glucose, 0.1 g / 1 of pyruvate and 300 mg / 1 of glutamine.
  • Human skin fibroblasts are obtained by trypsinization of the knee skin of a young woman and successive passages in cell culture.
  • the fibroblasts which have undergone 6 to 9 passages after the primary culture are used in these experiments.
  • Chicken embryo fibroblast cultures were established from cartilage of 11-day-old chicken embryos treated with trypsin and collagenase. They were used between the third and tenth passages.
  • Fibroblasts from swiss 3T3 mouse embryos are from Gibco (ref. H4018).
  • the fibroblast culture is carried out in RPMI 1640 medium supplemented with 1300 mg / 1 of glutamine and 10 microliters / ml of mercaptoethanol.
  • the hybridoma and fibroblast culture media are supplemented with 10,000 u / l of penicillin, 100 mg / l of streptoc ycine and 10% FCS.
  • A) SYNTHESIS OF DNA The biological activity of the whey fractions was studied by measuring the incorporation of tritiated thymidine into DNA during its replication. The results obtained are reported below with: a) cultures of murine hybridomas, b) cultures of fibroblasts, a) cultures of hybridoma
  • FIGS. 1 and 2 The results obtained with the cultures of hybridomas F34 are reported in FIGS. 1 and 2 which indicate the radioactivity measured (cpm ⁇ 10 4 ) in hybridomas cultivated in media not supplemented (M), in media supplemented by SVF or by the fractions of the invention (F ⁇ to (F 6 ) prepared according to the first protocol ( Figure 1) or (F 8 ) to (F 12 ) prepared according to the second protocol.
  • the tests were carried out at different concentrations, namely at 5 % v / vl ⁇ ⁇ , 10% v / v ______ and 20% v / v _Z_2_1 *
  • fractions tested stimulate DNA synthesis, generally in a concentration-dependent manner.
  • the fractions having undergone a heat treatment (F t1 and F 12 ) or the fractions having undergone an ultrafiltration at 50 ° C. (F 9 and F 0 ) have been found to be more effective than the fractions obtained in the same way but not heated (F 2 and F 3 ).
  • Whey fractions of the invention have been tested in human fibroblast cultures.
  • the fibroblasts are applied to microtiter plates containing 96 wells at a concentration of 4 ⁇ 10 4 / well. They are synchronized in Go / G t per culture for 24 h in RPMI 1640 medium, washed twice and incubated with 200 ⁇ l of fractions of diluted whey to be tested, for 48 h. 50 ⁇ l of 3 H thymidine (1 ⁇ Ci / ml) are added for a period of 18 to 20 h. The cells are collected and the radioactivity counted.
  • Sub-cultures of these hybridomas are carried out twice a week. On each pass, viable cells are counted using a hemacytometer after staining the cells with 0.5% trypan blue. The cell suspension is diluted to a concentration of 7 ⁇ 10 4 cells / ml and re-seeded (100 microliters) in 96-well microtiter plates in a medium containing increasing amounts of whey fractions to be tested. Control cultures are supplemented with 10% FCS.
  • the hybridoma cell passages are carried out directly in a medium containing 9.5% of whey fractions and 0.5% of FCS.
  • hybridoma cells are subjected twice a week to subcultures as indicated below. above. On each pass, viable cells are counted and seeded again at a concentration of 7 x 10 4 cells / ml.
  • the variation of the immunoglobulin concentration (in ⁇ g / ml) is represented as a function of the days of culture in media supplemented with 10% of FCS (* - *) or quantities
  • the F34 hybridomas can be directly transferred from a medium supplemented with 10% of FCS to a medium supplemented with 9.5% of whey fractions and 0.5% of FCS without progressive adaptation. From the 5th
  • the whey fractions of the invention are as suitable as calf serum as regards: the proliferation of hybridomas (the number of cells was measured by counting in a hemacytometer); the production of monoclonal antibodies (the concentration of monoclonal antibodies in the medium was measured by ELISA test).
  • TSH FO 21D6 hybridomas proliferated and then maintained themselves, while continuing to produce monoclonal antibodies, for approximately 30 days.
  • the number of cells was estimated by the release of alkaline phosphatase and ⁇ glucuronidase activities.
  • the antibody concentration was measured by ELISA test.
  • the whey fractions of the invention do not modify cell metabolism.
  • a comparative study of glucose consumption, lactate production and of ammonia and consumption or production of amino acids (such as glutamine or alanine respectively) cells in culture in media supplemented with SVF or in whey fractions show similar cellular metabolisms in the two case.
  • a fraction of whey obtained 0 is used as follows:
  • skim milk is subjected to a centrifugation step to remove fat and cellular debris.
  • the skim milk is then heated from 15 to 20 seconds at 67 ° C and proteins are precipitated with 5 using a mixture of enzymes (chymosin and pepsin) at 34'C.
  • the supernatant is heated at 65 ° C. for 1 hour and concentrated 6 times by ultrafiltration at 50 ° C. using a membrane with a cutoff threshold of 10,000. 0 After centrifugation at 30 g for 1 hour, the whey fraction is sterilized recovered by filtration at 0.22 ⁇ m and it is stored at -20 ⁇ C. This fraction contains 40 g / 1 of proteins according to the Lo ry method.
  • 25 culture media are frozen and thawed as follows:
  • Medium A contains 20% DMSO, 80% whey fractions inactivated by heat treatment (at
  • a cell line of F34 hybridomas secreting IgG1 monoclonal antibodies is used.
  • the cells are cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 4mM glutamine, lOO ⁇ g / l penicillin. iOO ⁇ g / ml streptomycin and 10% FCS.
  • One day before freezing the cells are replenished using the same medium.
  • the cells having reached the logarithmic growth phase are collected by centrifugation (800g, 5 min) and resuspended in RPMI medium at a concentration of 2 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • a viability of approximately 95% is determined by the trypan blue exclusion test.
  • the cell suspension is placed in cryotubes
  • the desired number of tubes is recovered after storage ranging from 2 months to 2 years.
  • Frozen cells are thawed rapidly at 37 # C and transferred to sterile plastic tubes.
  • DMSO 0 is diluted slowly with 9 ml of RPMI.
  • the cells are sedimented (centrifugation at 400 g for 5 min), resuspended in 2 ml of RPMI medium.
  • the study of cell proliferation is carried out as follows: 5 Identical quantities of cells are distributed in plates containing 24 wells.
  • the cells frozen in medium A (4 replicates) are added with 2 ml of RPMI medium supplemented with 10% FCS.
  • the cells frozen in medium B are suspended in 2 ml of medium supplemented with 10% FCS or with 2 ml of RPMI medium supplemented with 1% of FCS and 9% of whey fractions.
  • the viable cells are counted and replenished with the same medium on the 2nd day (2 ml of medium), on the 4th day (2 ml of medium), on the 7th day after transfer to a 25 cm 2 bottle (8 ml of medium) and to the day after transfer to a 75 cm 2 bottle (30 ml of medium).
  • the cells proliferate rapidly when they are returned to culture in an RPMI medium containing a fraction of whey of the invention at a rate of, for example, 9% and of the SVF, at a rate of 1%, this result being advantageously similar to that obtained with 10% of SVF.
  • the antibody level is determined according to the Elisa method using goat antibodies to mouse antilgG and a second antibody conjugated to a peroxidase. It is found that after 2 years of storage in the whey fractions of the invention, the F34 hybridomas secrete as much antibody as after two months of storage and that the secretion kinetics are similar.
  • the above results demonstrate advantageous properties of the fractions of the invention for the conservation of cell cultures at low temperature.
  • the invention thus provides means for preserving cell cultures with an apparatus requiring only temperatures of -80 ° C. making it possible to avoid the use of devices with liquid nitrogen.

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Abstract

Les compléments de milieux de culture sont à base de fractions de lactosérum essentiellement dépourvues de constituants de poids moléculaires inférieurs à 10.000.

Description

COMPLEMENTS DE MILIEUX DE CULTURE DE CELLULES ANIMALES A BASE DE PRODUITS DERIVES DE L'INDUSTRIE LAITIERE
L'invention a pour objet des compléments de milieux de culture cellulaire, favorisant particulièrement la culture de cellules animales, notamment de fibroblastes, d•hybridomes ou de cellules sécrétantes.
L'un des compléments de milieux de culture le plus largement utilisé est constitué par le sérum de veau foetal (SVF) . Ce produit permet avantageusement d'augmenter la croissance cellulaire même à long terme.
Cependant son coût élevé a amené à rechercher des substituts. Certains des co-inventeurs de la présente demande ont décrit, dans le brevet FR 8512907 du 29.8.85, l'utilisation de fractions de lait pour complémenter les milieux de culture, en remplacement partiel de SVF. Ces fractions permettent de réaliser de manière économique des milieux aussi efficaces que SVF pour la croissance cellulaire.
Les inventeurs ont à présent constaté qu'un produit dérivé de l'industrie laitière, plus aisément disponible que les fractions de lait, est également utilisable comme substitut partiel de SVF.
L'invention a donc pour but de fournir des compléments de milieux de culture, utilisables comme substituts partiel du SVF, présentant l'avantage d'un moindre coût de revient. Les compléments de milieux de culture de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils sont à base de fractions de lactosérum essentiellement dépourvues de constituants de poids moléculaire (PM) inférieur à 10 000. Ces fractions sont telles que récupérées au cours de la fabrication des fromages dans 1'industrie laitière, après traitement du lait par un acide, des microorganismes et/ou des enzymes, suivi d'une élimination des constituants ayant un poids moléculaire
(PM) inférieur à environ 10.000, par exemple en effectuant au moins une étape d'ultrafiltration.
Par le terme lactosérum, on désigne le produit récupéré après traitement enzymatique du lait et/ou par des microorganismes (lactosérum doux) , ou après coagulation du lait à l'aide d'un acide, tel que 1'acide chlorhydrique (lactosérum acide) .
Le terme lait tel qu'utilisé dans la description et les revendications désigne aussi bien le lait entier que le lait écrémé, et/ou ayant subi des traitements de conservation. Il s'agit de lait le plus généralement d'origine animale, en particulier du lait de vache, ou encore d'autres mammifères tels que chèvre, brebis, buflonne, jument, yack ou chamelle.
D'une manière inattendue, les fractions de lactosérum, dont la composition chimique présente des différences importantes avec les fractions de lait, en particulier en ce qui concerne la fraction protéique, possèdent cependant une capacité similaire pour induire la croissance des cellules animales en culture.
Les travaux effectués ont ainsi montré la capacité des fractions de lactosérum pour stimuler la synthèse d'ADN dans les cultures de cellules animales, en particulier de fibroblastes, d'hybridomes ou de cellules sécrétant par exemple des hormones ou des facteurs de croissance. D'une manière avantageuse, en mettant en oeuvre les fractions de l'invention, de telles cultures peuvent proliférer à long terme, en n'utilisant que de faibles concentrations en SVF.
Une croissance cellulaire satisfaisante est obtenue même à de faibles niveaux d'ensemencement. En remplacement des 10% de SVF généralement utilisés, on mettra avantageusement en oeuvre jusqu'à environ 9% de fractions de lactosérum de l'invention et 1% de SVF. Ces proportions sont données à titre indicatif et seront adaptées selon la culture réalisée.
En outre, d'une manière générale, la teneur en protéines des fractions de lactosérums est plus faible que celle du SVF, ce qui rend plus aisée la séparation de protéines sécrétées par les cellules en culture. Cet aspect de l'invention revêt un grand intérêt notamment pour la récupération d'anticorps monoclonaux sécrétés par des hybridomes.
A cet égard, il s'avère que les fractions de lactosérum de l'invention contiennent de nombreux éléments particulièrement appropriés à la culture d'hybridomes, tels que des transporteurs de substances hydrophobes comme la β lactoglobuline, des transporteurs de fer, comme la lactoferrine, des composés favorisant l'assimilation du glucose et des
?o acides aminés comme l'insuline, ou encore des promoteurs de la croissance cellulaire comme le putrescine.
Cette application des fractions de lactosérum en tant que complément de milieu de culture présente également l'avantage d'utiliser un produit aisément disponible, - en particulier, sa fabrication ne nécessite pas d'étape d'ultracentrifugation - seulement partiellement valorisé à ce jour et dont l'élimination des excédents pose des problèmes de retraitement.
•?° Le lactosérum mis en oeuvre comme complément de milieu de culture est avantageusement obtenu à partir de lait entier débarassé des matières grasses et débris cellulaires qu'il renferme, par exemple par centrifugation, ou d'un lait écrémé, de préférence chauffé à une température entre l'ambiante et la température d'ébullition,en particulier supérieure à environ 50 *C. Le traitement enzy atique, par des microorganismes et/ou un acide, réalisé selon les techniques habituelles, conduit à la précipitation des protéines, la phase liquide correspondant au lactosérum étant alors récupérée.
Le lactosérum obtenu est soumis, conformément à l'invention, à au moins une étape d'ultrafiltration réalisée, d'une manière favorable à température ambiante, pour éliminer les molécules ayant un PM inférieur à environ 10 000. Il s'agit essentiellement de composés inhibiteurs.
Les fractions de lactosérum ainsi isolées sont avantageusement concentrées et stérilisées avant de les 5 utiliser comme compléments de milieux de culture.
Pour leur conservation, on les congèle à basse température, notamment de l'ordre de -20*C.
Selon une disposition supplémentaire de l'invention, les fractions de lactosérum sont 0 thermisées ou telles qu'obtenues à partir de lactosérum thermisé. L'étape de traitement thermique des fractions de lactosérum est réalisée pendant l'étape d'ultrafiltration ou en dehors de cette étape. On utilise avantageusement une température entre
25 l'ambiante et la température d'ébullition, plus spécialement une température supérieure à environ 50*C.
De telles fractions constituent des compléments de milieux de culture particulièrement intéressants en raison de leur efficacité égale ou même supérieure à
3.σ environ 10% de SVF.
Selon une autre diposition de l'invention, les fractions de lactosérum sont utilisées pour la conservation de cultures cellulaires.
L'étude, avant et après stockage des cultures cellulaires, de la viabilité des cellules, de la récupération de la croissance et, le cas échéant, de la sécrétion de produits par les cellules, notamment de la sécrétion d'anticorps, a montré les propriétés avantageuses des fractions de l'invention. Des cultures d'hybridomes ont pu être en effet conservées plus de deux ans, à -80'C, dans des milieux renfermant 30 à 50% environ de fractions de lactosérum, leur prolifération reprenant rapidement en les remettant en culture.
D'autres caractéristiques et avantages de 0 1'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent et en se référant aux figures 1 à 5.
Les figures 1 à 3 représentent 1*incorporation de thymidine 3H, dans des hybridomes (figures 1 et 2) et dans des fibroblastes humains (figure 3) en culture 5 dans un milieu non supplémenté ou dans un milieu supplémenté en SVF ou en fractions de lactosérum de l'invention.
La figure 4 représente le nombre de cellules viables d'une culture d'hybridomes en fonction des 0 jours de culture.
La figure 5 représente la concentration en immunoglobulines sécrétées par des hybridomes cultivés dans des milieux supplémentés avec SVF ou des quantités croissantes de fractions de lactosérum. 5 EXEMPLE 1 : Etude de l'activité biologique de milieux de culture supplémentés en fractions de lactosérum. FRACTIONS DE LACTOSERUM
On prépare des fractions de lactosérum bovin en opérant selon l'un des trois protocoles suivants : P - Premier protocole : Après élimination des matières grasses et des débris cellulaires par centrifugation, on effectue une précipitation des protéines (en majorité des caséines) du lait entier de vache, soit à l'aide d'enzymes (mélange de rennine et de pepsine à 34*C) ou d'acide (HC1 concentré ajouté pour l'obtention d'un pH de 4,6, 34*C) .
Les surnageants des fractions du lactosérum doux (F^ et du lactosérum acide (F*) sont soumis à une ultra iltration à l'aide d'une membrane à seuil de coupure de 10 000, à une température de 15 à 20*C.
Chaque rétentat est concentré 6 fois (F2 : rétentat du lactosérum doux, et F5 : rétentat du lactosérum acide) , ou lavé 2 fois avec de 1'eau Ω distillée et concentrée 12 fois (respectivement F3 et
- Deuxième protocole : On chauffe du lait écrémé 15 à 20 secondes à 67e C. On précipite les protéines à l'aide d'un mélange d'enzymes. Une partie du surnageant (F7) est soumise à une ultrafiltration à 15 à 20*C et concentrée 6 fois. Une autre partie de (F7) est soumise à une ultrafiltration à 50*C et concentrée 6 fois (F9) ou lavée 2 fois et concentrée 12 fois (F10) .
Une troisième partie de (F7) est chauffée à 65*C 0 pendant 60 min et soumise à ultrafiltration à 50*C. Le rétentat est concentré 6 fois (F ) ou lavé 2 fois et concentré 12 fois (F2) • Toutes les fractions sont stérilisées par filtration à 0,22μm avant utilisation dans les milieux de culture. 5 - Troisième protocole : On utilise du lactosérum tel qu'obtenu au cours de la fabrication du fromage (premier sérum de moulage) et on le soumet à une ultrafiltration à l'aide d'une membrane à seuil de coupure de 10 000 daltons. 0 CULTURES CELLULAIRES
On utilise une lignée cellulaire d'hybridomes F34 sécrétant des anticorps monoclonaux IgG, contre la gonadotrophine humaine et une lignée cellulaire d*hybridomes A 49 sécrétant des anticorps monoclonaux IgM contre le groupe sanguin A. Les cellules sont cultivées de manière habituelle dans un milieu de culture RPMI 1640 (Boehringer Mannhei ) supplémenté avec 3 g/1 de glucose, 0,1 g/1 de pyruvate et 300 mg/1 de glutamine.
Des fibroblastes de peau humaine sont obtenus par trypsinisation de peau de genou d'une femme jeune et des passages successifs en culture cellulaire.
Les fibroblastes ayant subi 6 à 9 passages après la culture primaire sont utilisés dans ces expériences. Des cultures de fibroblastes d'embryons de poulet ont été établies à partir de cartilages d'embryons de poulets âgés de 11 jours, traités avec de la trypsine et de la collagénase. Ils ont été utilisés entre les troisième et dixième passages. Des fibroblastes d'embryons de souris swiss 3T3 proviennent de Gibco (réf. H4018) .
La culture des fibroblastes est réalisée dans un milieu RPMI 1640 supplémenté à l'aide de 1300 mg/1 de glutamine et 10 microlitres/ml de mercaptoethanol. En outre, les milieux de culture d'hybridomes et de fibroblastes sont supplémentés à l'aide de 10 000 u/1 de pénicilline, de 100 mg/1 de streptoc ycine et de 10% de SVF. A) SYNTHESE D'ADN L'activité biologique des fractions de lactosérum a été étudiée en mesurant l'incorporation de thymidine tritiée à l'ADN lors de sa réplication. On rapporte ci-après les résultats obtenus avec : a) des cultures d'hybridomes murins, b) des cultures de fibroblastes, a) Cultures d'hybridome
Des aliquots (100 μl) de suspension cellulaire d' ybridomes sont appliqués à une concentration de 7 x 10A cellules/ml sur des plaques de microtitrage renfermant 96 puits (Falcon, Grenoble, France) . 100 microlitres de fractions de lactosérum diluées de manière appropriée sont ajoutés. Les cellules sont mises à incuber pour 48 h et 50 microlitres de thymidine -K 1 icroCi/ml (Amersham, Les Ulis, France) sont ajoutés pour 18 à 20 h. Les cellules sont recueillies, lavées et la radioactivité mesurée.
Les résultats obtenus avec les cultures d'hybridomes F34 sont rapportés sur les figures 1 et 2 qui indiquent la radioactivité mesurée (cpm x 104) dans des hybridomes cultivés en milieux non supplémentés (M) , en milieux supplémentés par SVF ou par les fractions de l'invention (F^ à (F6) préparées selon le premier protocle (figure 1) ou (F8) à (F12) préparées selon le deuxième protocole. Les essais ont été effectués à différentes concentrations, à savoir à 5% v/v l~ ~~ , 10% v/v ______ et 20% v/v _Z_2_1 *
On constate que toutes les fractions testées stimulent la synthèse d'ADN, généralement d'une manière fonction de la concentration. Les fractions ayant subi un traitement thermique (Ft1 et F12) ou les fractions ayant subi une ultrafiltration à 50'C (F9 et F0) se sont révélées plus efficaces que les fractions obtenues de la même manière mais non chauffées (F2 et F3) .
L'examen de ces résultats montre également qu'avec (F^) et (F12) , les cellules d'hybridomes ont une vitesse de croissance équivalente à celle observée avec SVF seul. b) Cultures de fibroblastes
Des fractions de lactosérum de l'invention ont été testées dans des cultures de fibroblastes humains.
Les fibroblastes sont appliqués sur des plaques de microtitrage renfermant 96 puits à la concentration de 4 x 104/puits. Ils sont synchronisés en Go/Gt par culture pendant 24 h dans un milieu RPMI 1640, lavés 2 fois et mis à incuber avec 200 μl de fractions de lactosérum diluées à tester, pendant 48 h. On ajoute 50 μl de thymidine 3H (1 μCi/ml) pour une durée de 18 à 20 h. Les cellules sont recueillies et la radioactivité comptée.
Les résultats obtenus avec des concentrations de 5% m v/v et de 10% v/v β_B sont rapportés sur la figure 3 . Comme pour les cultures d'hybridomes, les fractions thermisées (F1 ) se sont révélées plus efficaces que les fractions similaires non chauffées
L'activité mitogène des fractions (F,,) a été également testée sur des cultures de fibroblastes 3T3. Les résultats obtenus ont montré que ces fractions stimulent la synthèse d'ADN des cellules 3T3 B) PROLIFERATION DES CELLULES A LONG TERME
On indique ci-après 1'effet des fractions de l'invention sur la prolifération d'hybridomes F34.
Des sous-cultures de ces hybridomes sont effectuées 2 fois par semaine. A chaque passage, les cellules viables sont comptées en utilisant un hémacytometre après coloration des cellules avec 0,5% de bleu trypan. La suspension cellulaire est diluée à une concentration de 7 x 104 cellules/ml et ensemencée à nouveau (100 microlitres) dans des plaques de microtitrage à 96 puits dans un milieu contenant des quantités croissantes de fractions de lactosérum à tester. Les cultures témoins sont supplémentées avec 10% de SVF.
Dans une autre série d'expériences, les passages des cellules d'hybridomes sont effectués directement dans un milieu contenant 9,5% de fractions de lactosérum et 0,5% de SVF.
Les cellules d'hybridomes sont soumises deux fois par semaine à des sous-cultures comme indiqué ci- dessus. A chaque passage, les cellules viables sont comptées et ensemencées à nouveau à une concentration de 7 x 104 cellules/ml.
On rapporte ci-après les résultats obtenus avec les fractions de lactosérum F7, F11# F12 utilisées selon des quantités croissantes à chaque passage d'hybridomes F34 :
2,5 de FL (fraction de lactosérum) + 7,5 de SVF au 4e jour ;
Figure imgf000012_0001
7,5 FL + 2,5 SVF au 10e jour ; 9 FL + l SVF au 14e jour ,* 9,5 FL + 0,5 SVF au 18e jour.
On a représenté, sur la figure 4, le nombre de
15 cellules d*hybridomes viables par ml en fonction du nombre de jours de culture. La ligne pleine représente le nombre de cellules ensemencées à chaque passage. Les symboles utilisés présentent les significations suivantes : 20 ~~~- témoin SVF 10% ;
Figure imgf000012_0002
Il ressort des résultats obtenus que les hybridomes F34 cultivés en milieux supplémentés avec
25 des fractions de lactosérum montrent une vitesse de croissance supérieure à celle des cellules cultivées en milieux suppplémentés avec du SVF. Il a cependant été nécessaire d'ajouter 0.5% du SVF aux fractions de lactosérum afin d'éviter un dépérissement rapide des
3.σ cellules. Cette expérience montre que les fractions F^ et F12 (thermisées et ultrafiltrées) sont plus efficaces que les fractions F7 (uniquement thermisées) . A l'arrêt de l'expérimentation, au 18e jour, 97% des cellules étaient viables. La concentration en immunoglobulines sécrétées par les hybridomes a été déterminée selon la méthode Elisa en utilisant des anticorps de chèvre anti-IgG ou anti- IgM de souris et un deuxième anticorps conjugué à la peroxydase.
Sur la figure 5, on a représenté la variation de la concentration en immunoglobulines (en μg/ml) en fonction des jours de culture dans des milieux supplémentés avec 10% de SVF (* -*) ou des quantités
10 croissantes de fractions (F^) (c—*) et (F12 (-——») .
La sécrétion d'immunoglobulines s'est révélée aussi importante avec des cellules cultivées tant en milieux supplémentés avec des fractions de lactosérum qu'en SVF. Ces résultats ont été corroborés par les
15 expériences utilisant des hybridomes A49.
Les hybridomes F34 peuvent directement être transférés d'un milieu supplémenté avec 10% de SVF à un milieu supplémenté avec 9,5% de fractions de lactosérum et 0,5% de SVF sans adaptation progressive. Dès le 5e
20 jour, la vitesse de croissance est apparue, en milieu supplémenté avec les fractions F^ supérieure à celle obtenue en milieu supplémenté avec du SVF seul (figure 6). La sécrétion d'immunoglobulines, mesurée au 12e jour de culture, indiquait 27μg/ml et 14 μg/ml
25 respectivement.
Des séries d'expériences réalisées en flacon spinner de 250 ml selon le mode récolte recharge avec les souches d'hybridomes A49, TSH FO 21D6, F34 et 3C2 corroborent les résultats ci-dessus.
3.° Le milieu utilisé pour ces expériences est du RPMI 1640 complémenté
- soit par 10% de SVF,
- soit par 9% de lactosérum et 1% de SVF. Ces expériences montrent que les fractions de lactosérum de l'invention sont aussi appropriées que le sérum de veau pour ce qui est de : la prolifération des hybridomes (le nombre de cellules a été mesuré par comptage dans un hémacytometre) ; la production d'anticorps monoclonaux (la concentration des anticorps monoclonaux dans le milieu a été mesurée par test ELISA) . De plus, lors de deux expériences en bioréacteur, des hybridomes TSH FO 21D6 ont proliféré puis se sont maintenus, tout en continuant à produire des anticorps monoclonaux, pendant environ 30 jours. Le nombre de cellules a été estimé par la libération d'activités phosphatase alcaline et β glucuronidase. La concentration d'anticorps a été mesurée par test ELISA. On mesurera également l'intérêt du faible taux en protéine des fractions de lactosérum de l'invention qui facilite la récupération des produits sécrétés par les cellules en culture.
On indique ci-après, à titre comparatif, les résultats relatifs à la purification d'IgGl et d'IgM produites par les souches d*hybridomes F34 et A49 respectivement dans un milieu RPMI supplémenté : 1/ par des fractions de l'invention, 2/ par du SVF. PURIFICATION D'ICTGT (TSH FO 21D6)
1/ RPMI supplémenté par 9% de fractions de lactosérum + 1% de SVF : Surnageant 0,049 g/ml
Produit purifié 1,2 mg/ml Pureté approximative 100% Taux récupéré 83% 2/ RPMI supplémenté par 10% de SVF : Surnageant 0,039 mg/ml Produit purifié 0,84 mg/ml
Pureté approximative 100%
Taux récupéré 57% PURIFICATION D'IqM (A49) 1/ RPMI supplémenté par 9% de fractions de lactosérum + 1% SVF :
Surnageant 0,029 mg/ml
Produit purifié 0,840 mg/ml
Pureté approximative 100% Taux récupéré 62,5% 2/ RPMI supplémenté par 10% SVF
Surnageant 0,044 mg/ml
Produit purifié 0,900 mg/ml
Pureté approximative 100% Taux récupéré 44,4%
Ces résultats montrent l'avantage des fractions de lactosérum par rapport au SVF seul lorsqu'on souhaite récupérer d'un milieu de culture des produits sécrétés par les cellules.
L'intérêt de ces fractions de lactosérum pour la culture de cellules animales ressort également de résultats avantageux obtenus avec des cellules dites support-dépendantes. Des expériences ont été ainsi réalisées avec des souches de CHOK1 en milieu HAMF12 et des souches de BHK21 en milieu RPMI 1640 adaptées progressivement à des quantités croissantes de SVF ou de fractions de lactosérum. Les résultats obtenus montrent que le taux de cellules viables reste, d'une manière favorable, élevé dans les milieux de culture.
D'une manière avantageuse, les fractions de lactosérum de l'invention ne modifient pas le métabolisme cellulaire. Une étude comparée des taux de consommation de glucose, de production de lactate et d'ammoniac et de consommation ou de production d'acides aminés (tels que respectivement la glutamine ou 1'alanine) , des cellules en culture dans des milieux complémentés en SVF ou en fractions de lactosérum met en évidence des métabolismes cellulaires similaires dans les deux cas.
EXEMPLE 2 : Utilisation de fractions de lactosérum pour la conservation d'hybridomes
On utilise une fraction de lactosérum obtenue 0 comme suit :
On soumet du lait à une étape de centrifugation pour éliminer les matières grasses et les débris cellulaires. Le lait écrémé est ensuite chauffé 15 à 20 secondes à 67*C et les protéines sont précipitées à 5 l'aide d'un mélange d'enzymes (chymosine et pepsine) à 34'C.
Le surnageant est chauffé à 65*C pendant 1 heure et concentré 6 fois par ultrafiltration à 50*C en utilisant une membrane à seuil de coupure de 10 000. 0 Après une centrifugation à 30 100g pendant 1 heure, on stérilise la fraction de lactosérum récupérée par filtration à 0,22μm et on la conserve à -20βC. Cette fraction renferme 40 g/1 de protéines selon la méthode de Lo ry.
25 Des milieux de culture sont congelés et décongelés comme suit :
Deux milieux de culture stériles sont préparés à 4'C. Le milieu A contient 20% de DMSO, 80% de fractions de lactosérum inactivées par traitement thermique (à
3.° 56*C pendant 45 min) et un milieu B contenant 20% de DMSO et 80% de SVF inactivé par traitement thermique.
On utilise une lignée cellulaire d'hybridomes F34 sécrétant des anticorps monoclonaux IgGl. Les cellules sont cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémentées à l'aide de 4mM de glutamine, lOOμg/ l de pénicilline. iOOμg/ml de streptomycine et 10% de SVF. Un jour avant la congélation, les cellules sont réalimentées à l'aide du même milieu. Les cellules ayant atteint la phase de croissance logarithmique sont recueillies par centrifugation (800g, 5 min) et remises en suspension dans un milieu RPMI à la concentration de 2 x 106cellules/ml. On détermine une viabilité d'environ 95% par le test d'exclusion au bleu trypan. La suspension cellulaire est placée dans des cryotubes
1 ~Ωv (0,5 ml/tube) sur de la glace fondante. On ajoute progressivement un volume égal de milieux froids (4βC, A ou B) à tous les tubes. L'osmolarité finale de ces milieux de 2,194 OSmoles (A) et 2,185 OSmoles (B) . Les cryotubes sont conservés à -20"C deux heures et stockés 5 à -80βC.
On récupère le nombre désiré de tubes après un stockage allant de 2 mois à 2 ans. Les cellules congelées sont décongelées rapidement à 37#C et transférées dans des tubes stériles plastiques. Le DMSO 0 est dilué lentement avec 9 ml de RPMI. Les cellules sont sédimentées (centrifugation à 400g pendant 5 min) , remises en suspension dans 2 ml de milieu RPMI.
L'étude de la prolifération cellulaire est effectuée comme suit : 5 On distribue des quantités identiques de cellules dans des plaques renfermant 24 puits. Les cellules congelées dans le milieu A (4 réplicats) sont additionnées de 2 ml de milieu RPMI supplémenté à l'aide de 10% de SVF. Les cellules congelées dans le 0 milieu B sont mises en suspension dans 2 ml de milieu supplémentés à l'aide de 10% de SVF ou avec 2 ml de milieux RPMI supplémentés avec 1% de SVF et 9% de fractions de lactosérum. Les cellules viables sont comptées et réalimentées avec le même milieu au 2e jour (2 ml de milieu) , au 4e jour (2 ml de milieu) , au 7e jour après tranfert dans un flacon de 25 cm2 (8 ml de milieu) et au lie jour après transfert dans un flacon de 75 cm2 (30 ml de milieu) .
On constate qu'après 2 ans de stockage à -80*C dans une fraction de lactosérum, environ 75% des hybridomes . sont récupérés en ce qui concerne leur viabilité, alors que seulement environ 20% d' ybridomes conservés dans le SVF sont viables.
Les cellules prolifèrent rapidement lorsqu'elles sont remises en culture dans un milieu RPMI renfermant une fraction de lactosérum de l'invention à raison, par exemple, de 9% et du SVF, à raison de 1%, ce résultat étant avantageusement similaire à celui obtenu avec 10% de SVF. On détermine selon la méthode Elisa le taux d'anticorps en utilisant des anticorps de chèvre antilgG de souris et un deuxième anticorps conjugué à une peroxydase. On constate qu'après 2 ans de conservation dans les fractions de lactosérum de l'invention, les hybridomes F34 sécrètent une quantité d'anticorps aussi importante qu'après deux mois de conservation et que les cinétiques de sécrétion sont similaires.
Les résultats qui précèdent mettent en évidence des propriétés avantageuses des fractions de l'invention pour la conservation des cultures cellulaires à basse température. L'invention fournit ainsi des moyens pour conserver les cultures cellulaires avec un appareillage ne nécessitant que des températures de -80*C permettant d'éviter l'utilisation de dispositifs avec azote liquide.

Claims

REVENDICATIONS
51. Compléments de milieux de culture cellulaire caractérisés en ce qu'ils sont à base de fractions de lactosérum essentiellement dépourvues de constituants de poids moléculaire inférieur à 10 000.
2. Compléments selon la revendication 1, caractérisés 10 en ce qu'il s'agit de fractions de lactosérum telles que récupérées au cours de la fabrication des fromages dans l'industrie laitière, après traitement du lait par un acide, des microorganismes et/ou des enzymes, suivi d'une élimination des constituants ayant un poids 15 moléculaire (PM) inférieur à environ 10 000, par exemple en effectuant au moins une étape d'ultrafiltration.
3. Compléments selon la revendication 2, caractérisés en ce qu'il s'agit de fractions de lactosérum
20 thermisées.
4. Compléments selon l'une quelconque des revendication 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils sont utilisés pour la culture d•hybridomes, de fibroblastes et de cellules support-dépendantes. 55. Compléments selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils sont utilisés pour la conservation de cultures cellulaires.
30
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