WO1989010372A1 - Cold marking of molecules of peptidic or proteinic nature - Google Patents

Cold marking of molecules of peptidic or proteinic nature Download PDF

Info

Publication number
WO1989010372A1
WO1989010372A1 PCT/FR1989/000191 FR8900191W WO8910372A1 WO 1989010372 A1 WO1989010372 A1 WO 1989010372A1 FR 8900191 W FR8900191 W FR 8900191W WO 8910372 A1 WO8910372 A1 WO 8910372A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
carboxyl
function
peptide
group
amino
Prior art date
Application number
PCT/FR1989/000191
Other languages
French (fr)
Inventor
Gérard Jaouen
Monique Savignac
André SASAKI
Siden Top
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs
Publication of WO1989010372A1 publication Critical patent/WO1989010372A1/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F11/00—Compounds containing elements of Groups 6 or 16 of the Periodic Table
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table
    • C07F15/0006—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table compounds of the platinum group
    • C07F15/002—Osmium compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table
    • C07F15/0006—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table compounds of the platinum group
    • C07F15/0046—Ruthenium compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table
    • C07F15/06—Cobalt compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F19/00—Metal compounds according to more than one of main groups C07F1/00 - C07F17/00

Definitions

  • the present invention relates to a new type of cold labeling of peptides, proteins or more generally of molecules of peptide or protein nature, in particular for their assay.
  • the present invention in fact relates to labeling molecules and the conjugates obtained by covalent coupling of these labeling molecules with peptides or proteins or more generally molecules of peptide or protein nature.
  • the present invention likewise relates to the use as tracers in assay methods, of these peptides or proteins and other compounds of peptide or protein nature or as imaging agents in the case of in vivo diagnostics. In any biological association test, it is essential to determine the distribution between the free and bound fractions. For this purpose, a quantity of labeled ligands (or tracers) is incorporated into the system.
  • IR-FT Fourier transform infrared spectroscopy
  • the aim of the present invention is to propose other solutions for molecules of peptide or protein nature.
  • the substituted marker is larger than the iodine atom (itself comparable to benzene in this respect), and can lead to physiological changes in the tracer. . occasional problems of movement by unmarked material (due to the presence of populations of antibodies with high affinity for the connecting bridge) should not be overlooked. . iodotyrosine or iodohistamine can bind themselves to serum proteins and lead to artifacts.
  • the present invention therefore provides a new type of labeling of peptides and proteins with an organometallic compound of general formula M x L y
  • M x represents one or more possibly different metals
  • L y represents one or more ligands complexing the metal or metals.
  • these organometallic compounds and leaving the free or linked parts comprising them are advantageously detected and assayed by Fourier transform infrared spectroscopy when this compound has at least one free carbonyl ligand, but may also be detected by means of the metal with methods such as atomic absorption spectroscopy or electron microscopy visualization for heavy metals, such as osmium or ruthenium, for example in the context of peptide receptor assays or immunological assays of proteins .
  • the labeling molecule consists of a molecule of formula (I)
  • R ′ -H or a lower C 1 to C 7 alkyl such as -CH 3
  • This molecule also has a great capacity for peptide coupling in an aqueous medium and is therefore very advantageous for coupling peptides soluble in water.
  • the labeling molecule consists of a natural or unnatural amino acid of formula II
  • X represents H or an amino function protection group
  • Y represents H or a group for protecting or activating the carboxyl function
  • This type of labeling molecule has the additional advantage of being able to be coupled to a peptide or a protein via either the amino function or the carboxyl function of the amino acid with either the carboxyl function or the amino function of the peptide or the protein respectively.
  • acetylenic norleucine complexed with formula III may be mentioned.
  • acetyl and BOC groups for the protection of the amino function and lower C 1 to C 7 alkyl groups for the protection of the carboxyl function.
  • the carboxyl function can be activated in particular by the succinimidyl group or the nitrophenate group.
  • metals from groups VI, VII, VIII and IX of the periodic table, in particular chromium, molybdenum, tungsten, manganese, cobalt, nickel, technetium, rhenium, ruthenium, and osmium.
  • the ligands of these organometallic compounds can be very varied, in particular CO, CS, CSe, CNR1, phenyl, P (R 2 , R 3 , R 4 ), cyclopentadienyl (Cp), R 1 being in particular an alkyl radical or -COR 5 and R 2 , R 3 , R 4 and R 5 being especially substituted or unsubstituted phenyl or phenoxy radicals, substituted or unsubstituted C 1 to C 7 alkyl or alkoxy or else a halogen atom, R 5 possibly being -N ( CH 2 CH 2 Cl) 2 .
  • the compounds M x L y can contain several metals and up to 12 ligands.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a labeling molecule, characterized in that a molecule comprising:
  • an unsaturated organic site in particular with a carbon unsaturation, such as a triple bond or an aromatic nucleus
  • the complexation with the organometallic compound M x L y in the presence of THF will take place after protection of the amine and / or carboxyl functions, the molecule comprising at least one triple bond and at least one amine and / or carboxyl function.
  • the present invention also relates to conjugates comprising the labeling molecule, linked to a peptide or a protein via a peptide liaiso of the amide link type between an amino or carboxyl function, optionally protected or activated of the molecule. labeling and, respectively, a carboxyl or amino function of the peptide or protein.
  • the present invention therefore also relates to a process for the preparation of a conjugate according to the invention, characterized in that the labeling molecule and the peptide or protein are coupled via an amide link between the function amine or carboxyl optionally protected or activated of the labeling molecule and, respectively, a carboxyl or amine function of the peptide or protein.
  • the coupling with a peptide or a protein will advantageously take place with the amino function of the protected labeling molecule and its activated carboxyl function, this coupling being done for example in THF in the presence of DCC (dicyclohexylecarbodiimide).
  • the conjugates according to the invention can also be prepared by coupling a molecule comprising 1) at least one unsaturated organic site, in particular with a carbon unsaturation, such as a C ⁇ C triple bond or an aromatic nucleus and 2) at least one carboxyl and / or amino function coupling with a protein or a peptide, the complexation of the organometallic compound of formula M x L y on the C liaisonC triple bond, taking place after coupling.
  • a molecule comprising 1) at least one unsaturated organic site, in particular with a carbon unsaturation, such as a C ⁇ C triple bond or an aromatic nucleus and 2) at least one carboxyl and / or amino function coupling with a protein or a peptide, the complexation of the organometallic compound of formula M x L y on the C liaisonC triple bond, taking place after coupling.
  • the present invention also relates to the use of the conjugates according to the invention, as tracers in the context of assays for in vitro diagnostics or as imaging agents in the context of in vivo diagnostics.
  • R ' H and SO 3 Na.
  • the clusters are characterized by R.M.N., I.R. and mass spectrometry following.
  • Ru 3 (CO) 11 (CH 3 CN) and Os 3 (CO) 11 (CH 3 CN) were prepared according to the methods described in the literature (Ru 3 (CO) 1 1 (CH 3 CN): GA Fbulds, BFG Johnson and J. Lewis, J. Organometal. Chem., 1985, 296, 147. Os 3 (CO) 11 (CH 3 CN): BFG Johnson, J. Lewis and DA Pippard, J. chem. Soc, Dalton, 1981, 407). 2.1) Complexation by Ru 3 (CO) 11 (CH 3 CN):
  • Ru 3 (CO) 11 (CH 3 CN) is prepared from 300 mg of Ru 3 (CO) 12 (4.7.10 -4 mole), in 220 ml of dichloromethane, 15 ml of acetonitrile and 0.9 ml of a solution of trimethylamine oxide in methanol at 50 g / l (4.8. 10 -4 mole). The solvent is then removed by evaporation under reduced pressure and replaced with 10 ml of
  • Os 3 (CO) 11 (CH 3 CN) complexing To 200 mg of Os 3 (CO) 2 (2.2.10 -4 mole) dissolved in 100 ml of dichloromethane and 10 ml of acetonitrile are added 0, 8 ml of a solution of trimethylamine oxide in methanol at 40 g / 1 (4.3.10 mole). The progress of the reaction is monitored by TLC (eluent: THF / pentane: 1/3). When all the starting material has disappeared, the solvent is evaporated under reduced pressure.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

The invention relates to a molecule for marking a peptide or a protein, or more generally a compound of peptidic or proteinic nature, the invention being characterized in that said marking molecule comprises 1) at least one unsaturated organic site, particularly with a carbonaceous unsaturation, such as a triple bond C=C or a new aromatic nucleus complexed by an organometallic compound having the formula MxLy wherein Mx represents one or a plurality of optionally different metals and Ly represents one or a plurality of optionally different ligands, complexing the metal or metals, and 2) at least one carboxyl and/or amine function, the carboxyl function being optionally protected or activated and the amine function being optionally protected. The present invention also relates to conjugates comprising the marking molecule of the invention, linked to a peptide or a protein through a peptidic bond, as well as the utilization of conjugates as tracers in the field of dosages for in vitro diagnosis, and as imaging agents for in vivo diagnosis.

Description

MARQUAGE FROID DE MOLECULES DE NATURE PEPTIDIQUE OU PROTEIQUE. COLD MARKING OF MOLECULES OF PEPTIDE OR PROTEIN NATURE.
La présente invention concerne un nouveau type de marquage froid de peptides, protéines ou plus généralement de molécules de nature peptidique ou protéique, notamment en vue de leur dosage. La présente invention concerne en effet des molécules de marquage et les conjugués obtenus par couplage covalent de ces molécules de marquage avec des peptides ou protéines ou plus généralement des molécules de nature peptidique ou protéique. La présente invention concerne de même l'utilisation à titre de traceurs dans des procédés de dosages, de ces peptides ou protéines et autres composés de nature peptidique ou protéique ou à titre d'agents d'imagerie dans le cas de diagnostics in vivo. Dans tout test d'association biologique, il est essentiel de déterminer la distribution entre les fractions libres et liées. Dans ce but, on incorpore dans le système une quantité de ligands marqués (ou traceurs). Les marquages les plus communs font appel à des isotopes radioactifs (par exemple 3H, 131I, 125I) malgré les inconvénients connus de cette approche (instabilité des espèces, difficultés du marquage, coûts élevés, limitations légales, concentration des fournisseurs) dans la mesure où l'emploi des traceurs non radioactifs actuellement proposés présente encore des avantages par trop théoriques (défauts de précision et de sensibilité). Toutefois, ces inconvénients ont stimulé la recherche de méthodes d'analyses froides parmi lesquelles l'emploi de la fluorescence est le plus largement répandu. La Demanderesse a cependant envisagé une alternative organometallique totalement nouvelle. Elle repose sur un faisceau de constatations récentes : . il existe une fenêtre dans le spectre infrarouge de toutes les protéines centrée sur 2000 cmThe present invention relates to a new type of cold labeling of peptides, proteins or more generally of molecules of peptide or protein nature, in particular for their assay. The present invention in fact relates to labeling molecules and the conjugates obtained by covalent coupling of these labeling molecules with peptides or proteins or more generally molecules of peptide or protein nature. The present invention likewise relates to the use as tracers in assay methods, of these peptides or proteins and other compounds of peptide or protein nature or as imaging agents in the case of in vivo diagnostics. In any biological association test, it is essential to determine the distribution between the free and bound fractions. For this purpose, a quantity of labeled ligands (or tracers) is incorporated into the system. The most common markings use radioactive isotopes (for example 3 H, 131 I, 125 I) despite the known drawbacks of this approach (instability of the species, difficulties in marking, high costs, legal limitations, concentration of suppliers) in the extent to which the use of the non-radioactive tracers currently offered still has overly theoretical advantages (lack of precision and sensitivity). However, these drawbacks have stimulated the search for cold analysis methods among which the use of fluorescence is the most widely used. The Applicant has however considered a completely new organometallic alternative. It is based on a bundle of recent observations: . there is a window in the infrared spectrum of all proteins centered on 2000 cm
. les métaux carbonyles (Mx-COy) sont, parmi les espèces chimiques, les seuls à posséder des bandes de vibrations pures et intenses dans cette région.. carbonyl metals (M x -CO y ) are, among the chemical species, the only ones to have pure and intense vibration bands in this region.
. une nouvelle génération d'appareils de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (IR-FT), amène cette, technique dans la zone de détection de quelques picogrammes d marqueur Mx-COy. Cependant cette voie analytique, de portée générale, ne peut présenter tout son attrait que si les méthodes d'introduction des marqueurs Mx-COy sont simplifiées et généralisées.. a new generation of Fourier transform infrared spectroscopy (IR-FT) devices brings this technique to the detection zone of a few picograms of M x -CO y marker. However, this analytical approach, of general scope, can only be attractive if the methods of introducing Mx-COy markers are simplified and generalized.
Certaines solutions ont déjà été proposées par la Demanderesse dans les demandes de brevet françaisCertain solutions have already been proposed by the Applicant in French patent applications
FR 82 16 024, FR 87 00 914 et FR 87 04 698 dans lesquelles ont été décrits des traceurs consistant en des complexes entre différents bioréactifs et un composé organometallique. Le but de la présente invention est de proposer d'autres solutions pour des molécules de nature peptidique ou protéique.FR 82 16 024, FR 87 00 914 and FR 87 04 698 in which tracers have been described consisting of complexes between different bioreagents and an organometallic compound. The aim of the present invention is to propose other solutions for molecules of peptide or protein nature.
Dans le cas des peptides et des protéines, l'emploi de traceurs à marqueurs externes est d'usage commun en immxinologie, tandis que les exemples avec les haptènes (stéroïdes, drogues) se multiplient régulièrement. Les isotopes de l'iode (particulièrement 125I) sont presque universellement employés à cet effet en raison des hautes activités spécifiques ainsi atteintes 2000 - 4000 Ci/mmol pour un stéroide iodé contreIn the case of peptides and proteins, the use of tracers with external markers is of common use in immxinology, while the examples with haptens (steroids, drugs) are multiplying regularly. Iodine isotopes (particularly 125 I) are almost universally used for this purpose because of the high specific activities thus achieved 2000 - 4000 Ci / mmol for an iodinated steroid against
25-100 Ci/mmol pour son équivalent tritié. Les méthodes d'iodation courantes font appel à la chloramine T, la lactoperoxidase, l'iodogène sans oublier le marquage par conjugaison.25-100 Ci / mmol for its tritiate equivalent. The methods common iodization use chloramine T, lactoperoxidase, iodogen without forgetting labeling by conjugation.
Ce dernier procédé a été développé pour circonvenir les dommages de l'iodation parfois observés quand 125I est introduit par substitution directe dans les systèmes protéiques et peptidiques. Il fait appel à une iodation réalisée, dans une première étape sur une copule organique, en absence de la protéine sous examen. Puis, dans une opération ultérieure, ce réactif marqué forme un adduit covalent avec l'espèce biologique concernée. Cette approche est nommée marquage par conjugaison pour la différencier du procédé par substitution.The latter process has been developed to circumvent the damage to iodization sometimes observed when 125 I is introduced by direct substitution into protein and peptide systems. It uses iodization carried out, in a first step on an organic copula, in the absence of the protein under examination. Then, in a subsequent operation, this labeled reagent forms a covalent adduct with the biological species concerned. This approach is called labeling by conjugation to differentiate it from the substitution process.
En dépit de ses qualités, cette méthode d'introduction de marqueurs radioactifs n'est pas exempte de difficultés : . le marqueur substitué est plus volumineux que l'atome d'iode (lui-même comparable au benzène à cet égard), et peut conduire à des altérations physiologiques du traceur. . des problèmes occasionnels de déplacement par du matériel non marqué (en raison de la présence de populations d'anti-corps de haute affinité pour le pont de liaison) ne sont pas à négliger. . l'iodotyrosine ou l'iodohistamine peuvent se lier elles-mêmes à des protéines du sérum et conduire à des arterfacts.Despite its qualities, this method of introducing radioactive markers is not without its difficulties:. the substituted marker is larger than the iodine atom (itself comparable to benzene in this respect), and can lead to physiological changes in the tracer. . occasional problems of movement by unmarked material (due to the presence of populations of antibodies with high affinity for the connecting bridge) should not be overlooked. . iodotyrosine or iodohistamine can bind themselves to serum proteins and lead to artifacts.
Pour pallier à ces inconvénients, sans compter l'emploi de la radioactivité, la présente invention propose donc un nouveau type de marquage de peptides et protéines par un composé organometallique de formule générale Mx Ly To overcome these drawbacks, without counting the use of radioactivity, the present invention therefore provides a new type of labeling of peptides and proteins with an organometallic compound of general formula M x L y
dans laquellein which
Mx représente un ou plusieurs métaux éventuellement différents, et Ly représente un ou plusieurs ligands complexant le ou les métaux.M x represents one or more possibly different metals, and L y represents one or more ligands complexing the metal or metals.
Selon l'invention, ces composés organométalliques et partant les parties libres ou liées en comprenant, sont avantageusement détectés et dosés par spectroscopie Infrarouge à transformée de Fourier lorsque ce composé possède au moins un ligand carbonyle libre, mais pourront être également détectés par le biais du métal avec des méthodes telles que la spectroscopie d'absorption atomique ou une visualisation par microscopie électronique pour des métaux lourds, tels que l'osmium ou le ruthénium, ceci par exemple dans le cadre de dosages de récepteurs de peptides ou de dosages immunologiques de protéines.According to the invention, these organometallic compounds and leaving the free or linked parts comprising them, are advantageously detected and assayed by Fourier transform infrared spectroscopy when this compound has at least one free carbonyl ligand, but may also be detected by means of the metal with methods such as atomic absorption spectroscopy or electron microscopy visualization for heavy metals, such as osmium or ruthenium, for example in the context of peptide receptor assays or immunological assays of proteins .
Il était intéressant d'associer les potentialités analytiques liées à une chimie organometallique de façon à créer un type inusité de biosondes froides, sous réserve, bien sûr, que la modification structurale soit judicieusement introduite de façon à préserver les facultés de reconnaissance des peptides vis-à-vis de leurs récepteurs, par exemple. Le problème à résoudre est d'ordre essentiellement chimique et fait appel aux moyens d'introduction des biosondes froides organométalliques.It was interesting to combine the analytical potentials linked to organometallic chemistry so as to create an unusual type of cold bioprobes, provided, of course, that the structural modification is judiciously introduced so as to preserve the recognition faculties of the peptides vis- to their receptors, for example. The problem to be solved is essentially chemical and calls for the means of introducing organometallic cold bioprobes.
Pour ce faire, la présente invention a donc pour objet une molécule de marquage permettant le marquage d'un peptide ou;d'une protéine ou plus généralement d'un composé de nature peptidique ou protéique, caractérisée en ce que ladite molécule de marquage comporteTo do this, the subject of the present invention is therefore a labeling molecule allowing the labeling of a peptide or; of a protein or more generally of a compound of peptide or protein nature, characterized in that said labeling molecule comprises
1) au moins un site organique insaturé, notamment avec une insaturation carbonée, tel qu'une triple liaison C≡C ou un noyau aromatique complexé (e) par un composé organometallique de formule MxLy et1) at least one unsaturated organic site, in particular with a carbon unsaturation, such as a C≡C triple bond or an aromatic nucleus complexed with an organometallic compound of formula M x L y and
2) au moins une fonction carboxyle et/ou aminé, la fonction carboxyle étant éventuellement protégée ou activée et la fonction aminé étant éventuellement protégée. Ces groupes protecteurs des fonctions aminé et carboxyle, ainsi que le groupe d'activation des fonctions carboxyles sont bien connus dans la chimie des peptides.2) at least one carboxyl and / or amine function, the carboxyl function being optionally protected or activated and the amine function being optionally protected. These protective groups for the amino and carboxyl functions, as well as the activation group for the carboxyl functions are well known in peptide chemistry.
Selon un premier mode de réalisation de la présente invention, la molécule de marquage consiste en une molécule de formule (I)According to a first embodiment of the present invention, the labeling molecule consists of a molecule of formula (I)
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000007_0001
formule dans laquelle n est un nombre entier compris entre 1 et 6, de préférence n = 2 MxLy représente le composé organometallique tel que défini ci-dessus Z représente H ou un groupe de protection ou d'activation de la fonction COOH.formula in which n is an integer between 1 and 6, preferably n = 2 M x L y represents the organometallic compound as defined above Z represents H or a group for protecting or activating the COOH function.
On peut citer notamment les molécules pour les¬Mention may in particular be made of the molecules for
quelles
Figure imgf000007_0002
R' est choisi en fonction du peptide à marquer, notamment pour des peptides solubles dans l'eau, on aura de préférence R' = -SO3Na. pour des peptides solubles dans le THF ou le DMF, on aura de préférence R' = -H ou un alkyl inférieur en C1 à C7 tel que -CH3 what
Figure imgf000007_0002
R 'is chosen as a function of the peptide to be labeled, in particular for water-soluble peptides, there will preferably be R' = -SO 3 Na. for peptides soluble in THF or DMF, there will preferably be R ′ = -H or a lower C 1 to C 7 alkyl such as -CH 3
R est un alkyl inférieur en C1 à C7, de préférence R = -CH3.R is C 1 to C 7 lower alkyl, preferably R = -CH 3 .
L'intérêt de cette molécule outre le fait qu'elle soit très stable et facilement synthétisable,est sa grande faculté de réaction avec un peptide en vertu du groupe d'activation du type N-hydroxysuccinimidyle qu'elle comporte.The interest of this molecule besides the fact that it is very stable and easily synthesizable, is its great faculty of reaction with a peptide by virtue of the activating group of the N-hydroxysuccinimidyle type which it comprises.
On peut également citer le cas oùWe can also cite the case where
que l'on prépare à partir de
Figure imgf000008_0001
d'une molécule de formule (I) avec Z = H en présence de de paradiméthylsulfoniophénolméthylsulfonatethat we prepare from
Figure imgf000008_0001
of a molecule of formula (I) with Z = H in the presence of paradimethylsulfoniophenolmethylsulfonate
Figure imgf000008_0002
Figure imgf000008_0002
Cette molécule présente également une grande faculté de couplage peptidique en milieu aqueux et est donc très intéressante pour coupler les peptides solubles dans l'eau.This molecule also has a great capacity for peptide coupling in an aqueous medium and is therefore very advantageous for coupling peptides soluble in water.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, la molécule de marquage consiste en un acide aminé naturel ou non naturel de formule IIAccording to another embodiment of the present invention, the labeling molecule consists of a natural or unnatural amino acid of formula II
Figure imgf000008_0003
formule dans laquelle
Figure imgf000008_0003
formula in which
X représente H ou un groupe de protection de la fonction aminé etX represents H or an amino function protection group and
Y représente H ou un groupe de protection ou d'activa- tion de la fonction carboxyle etY represents H or a group for protecting or activating the carboxyl function and
R1 représente une chaîne de dérivation d'un acide aminé naturel ou non naturel comportant une triple liaisonR 1 represents a branch chain of a natural or unnatural amino acid comprising a triple bond
CΞC complexée par un composé organometallique du type MxLy. Ce type de molécule de marquage présente l'avantage supplémentaire de pouvoir être couplé à un peptide ou une protéine par l'intermédiaire, soit de la fonction aminé, soit de la fonction carboxyle de l'acide aminé avec, soit la fonction carboxyle, soit la fonction aminé respectivement du peptide ou de la protéine.CΞC complexed by an organometallic compound of the M x L y type . This type of labeling molecule has the additional advantage of being able to be coupled to a peptide or a protein via either the amino function or the carboxyl function of the amino acid with either the carboxyl function or the amino function of the peptide or the protein respectively.
On peut citer à titre d'exemple de molécule de marquage selon ce type de réalisation de l'invention la norleucine acétylénique complexée de formule IIIAs an example of a labeling molecule according to this type of embodiment of the invention, acetylenic norleucine complexed with formula III may be mentioned.
Figure imgf000009_0001
formule dans laquelle X et Y ont les significations données précédemment.
Figure imgf000009_0001
formula in which X and Y have the meanings given above.
On peut citer notamment les groupes acétyleet BOC pour la protection de la fonction aminé et les groupes alkyles inférieurs en C1 à C7 pour la protection de la fonction carboxyle. La fonction carboxyle peut être acti- vée notamment par le groupe succinimidyle ou le groupe nitrophénate. Dans les composés organométalliques selon la présente invention, il est possible d'utiliser des métaux des groupes VI, VII, VIII et IX de la classification périodique, notamment le chrome, le molybdène, le tungstène, le manganèse, le cobalt, le nickel, le technétium, le rhénium, le ruthénium, et l'osmium.Mention may in particular be made of acetyl and BOC groups for the protection of the amino function and lower C 1 to C 7 alkyl groups for the protection of the carboxyl function. The carboxyl function can be activated in particular by the succinimidyl group or the nitrophenate group. In the organometallic compounds according to the present invention, it is possible to use metals from groups VI, VII, VIII and IX of the periodic table, in particular chromium, molybdenum, tungsten, manganese, cobalt, nickel, technetium, rhenium, ruthenium, and osmium.
Les ligands de ces composés organométalliques peuvent être très variés, notamment CO, CS, CSe, CNR1, phényle, P(R2,R3,R4), cyclopentadiényle (Cp), R1 étant notamment un radical alkyle ou -COR5 et R2, R3, R4 et R5 étant notamment des radicaux phényle ou phénoxy substitué ou non, alkyle ou alcoxy en C1 à C7 substitué ou non ou bien un atome d'halogène, R5 pouvant être -N(CH2CH2Cl)2. Les composés MxLy peuvent comporter plusieurs métaux et jusqu'à 12 ligands.The ligands of these organometallic compounds can be very varied, in particular CO, CS, CSe, CNR1, phenyl, P (R 2 , R 3 , R 4 ), cyclopentadienyl (Cp), R 1 being in particular an alkyl radical or -COR 5 and R 2 , R 3 , R 4 and R 5 being especially substituted or unsubstituted phenyl or phenoxy radicals, substituted or unsubstituted C 1 to C 7 alkyl or alkoxy or else a halogen atom, R 5 possibly being -N ( CH 2 CH 2 Cl) 2 . The compounds M x L y can contain several metals and up to 12 ligands.
Parmi les composés organométalliques, on peut citer par exemple Co2(CO)6, M3(CO)10 avec M = Ru ou Os ou encore Mo2Cp2(CO)4, W2Cp2(GO)4.Among the organometallic compounds that may be mentioned, for example, Co 2 (CO) 6 , M 3 (CO) 10 with M = Ru or Os or alternatively Mo 2 Cp 2 (CO) 4 , W 2 Cp 2 (GO) 4 .
La présente invention a aussi pour objet un procédé de préparation d'une molécule de marquage, caractérisé en ce qu'on fait réagir une molécule comportant :The present invention also relates to a process for the preparation of a labeling molecule, characterized in that a molecule comprising:
1) un site organique insaturé, notamment avec une insaturation carbonée, tel qu 'une triple liaison ou un noyau aromatique , et1) an unsaturated organic site, in particular with a carbon unsaturation, such as a triple bond or an aromatic nucleus, and
2 ) au moins une fonction carboxyle et/ou aminé éventuellement protégée ou activée , que l ' on complexe notaπirent dans le THF ou un mélange méthanol/acide acétiαue. avec un composé organometallique du type MxLy. On utilise donc le site organique insaturé , tel que la triple liaison , pour former des petits clusters qui présentent comme avantage déterminant de doter la molécule de marquage obtenue d ' une grande stabilité , ce ce qui la rend aisément manipulable .2) at least one carboxyl and / or amino function which is optionally protected or activated, which is noticeably complexed in THF or a methanol / acetic acid mixture. with an organometallic compound of the type M x L y . The unsaturated organic site, such as the triple bond, is therefore used to form small clusters which have the decisive advantage of providing the labeling molecule obtained with great stability, which makes it easy to handle.
Avantageusement , la complexation par le composé organometallique MxLy en présence de THF se fera après protection des fonctions aminé et/ou carboxyle, la molécule comportant au moins une triple liaison et au moins une fonction amine et/ou carboxyle.Advantageously, the complexation with the organometallic compound M x L y in the presence of THF will take place after protection of the amine and / or carboxyl functions, the molecule comprising at least one triple bond and at least one amine and / or carboxyl function.
La présente invention a également pour objet des conjugués comportant la molécule de marquage, liée à un peptide ou une protéine par l'intermédiaire d'une liaiso peptidique du type lien amide entre une fonction aminé ou carboxyle, éventuellement protégée ou activée de la molécule de marquage et, respectivement, une fonction carboxyle ou aminé du peptide ou de la protéine.The present invention also relates to conjugates comprising the labeling molecule, linked to a peptide or a protein via a peptide liaiso of the amide link type between an amino or carboxyl function, optionally protected or activated of the molecule. labeling and, respectively, a carboxyl or amino function of the peptide or protein.
La présente invention a donc également pour objet un procédé de préparation d'un conjugué selon l'invention, caractérisé en ce qu'on couple la molécule de marquage et le peptide ou la protéine par l'intermédiaire d'un lien amide entre la fonction aminé ou carboxyle éventuellement protégée ou activée de la molécule de marquage et, respectivement, une fonction carboxyle ou aminé du peptide ou de la protéine.The present invention therefore also relates to a process for the preparation of a conjugate according to the invention, characterized in that the labeling molecule and the peptide or protein are coupled via an amide link between the function amine or carboxyl optionally protected or activated of the labeling molecule and, respectively, a carboxyl or amine function of the peptide or protein.
Lorsque la molécule de marquage comporte une fonction aminé et une fonction carboxyle, le couplage avec un peptide ou une protéine se fera avantageusement avec la fonction aminé de la molécule de marquage^'protégée et sa fonction carboxyle activée, ce couplage se faisant par exemple dans le THF en présence de DCC (dicyclohexylecarbodiimide).When the labeling molecule comprises an amino function and a carboxyl function, the coupling with a peptide or a protein will advantageously take place with the amino function of the protected labeling molecule and its activated carboxyl function, this coupling being done for example in THF in the presence of DCC (dicyclohexylecarbodiimide).
Les conjugués selon l'invention peuvent également être préparés par couplage d'une molécule comportant 1) au moins un site organique insaturé, notamment avec une insaturation carbonée, tel qu'une triple liaison C≡C ou un noyau aromatique et 2) au moins une fonction carboxyle et/ou aminé couplage avec une protéine ou un peptide, la complexation du composé organometallique de formule MxLy sur la triple liaison C≡C, se faisant après le couplage.The conjugates according to the invention can also be prepared by coupling a molecule comprising 1) at least one unsaturated organic site, in particular with a carbon unsaturation, such as a C≡C triple bond or an aromatic nucleus and 2) at least one carboxyl and / or amino function coupling with a protein or a peptide, the complexation of the organometallic compound of formula M x L y on the C liaisonC triple bond, taking place after coupling.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des conjugués selon l'invention, à titre de traceurs dans le cadre de dosages pour diagnostics in vitro ou à titre d'agents d"' imagerie dans le cadre de diagnostics in vivo.The present invention also relates to the use of the conjugates according to the invention, as tracers in the context of assays for in vitro diagnostics or as imaging agents in the context of in vivo diagnostics.
La présente invention sera maintenant explicitée à l'aide des exemples détaillés qui vont suivre.The present invention will now be explained with the aid of the detailed examples which follow.
EXEMPLE I - MARQUEUR FROID DU TYPEEXAMPLE I - COLD TYPE MARKER
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000012_0001
1 ) Synthèse1) Summary
Un tel complexe a été synthétisé avec R' = H et [M1] = Co(CO)3, Mo(CO)2Cp, W(CO)2Cp, c'est-à-dire à partir de complexe M2L2(CO)4, selon le schémaSuch a complex was synthesized with R '= H and [M 1 ] = Co (CO) 3 , Mo (CO) 2 Cp, W (CO) 2 Cp, that is to say from complex M 2 L 2 (CO) 4 , according to the diagram
Figure imgf000012_0002
Un tel complexe a été synthétisé avec
Figure imgf000012_0002
Such a complex has been synthesized with
R' = H et SO3Na.R '= H and SO 3 Na.
Mode opératoire : Synthèse deProcedure: Synthesis of
Figure imgf000013_0001
a)[M1] = Co(CO)3 , R' = H
Figure imgf000013_0001
a) [M 1 ] = Co (CO) 3 , R '= H
A une solution de 0,5.10 -3 mole de Co2(CO)8 (0,188 g) dans 10 cm3 de THF distillé est ajoutée goutte à goutte une solution de 0,5.10 mole d'hexyne-4 oate de N-succinimidyle (0,104 g) dans le THF (6 cm3).To a solution of 0.5.10 -3 mole of Co 2 (CO) 8 (0.188 g) in 10 cm 3 of distilled THF is added dropwise a solution of 0.5.10 mole of 4-hydroxyne-N-succinimidylate (0.104 g) in THF (6 cm 3 ).
On laisse agiter 4 heures. Le solvant est évaporé et le résidu est repris dans 2 cm3 de CH2Cl2 puis purifié sur plaque de silice (éluant : CH2Cl2). On isole des cristaux rouges : m = 0,132 g. b) [ M1 ] = Mo(CO)2Cp R' = HThe mixture is left to stir for 4 hours. The solvent is evaporated off and the residue is taken up in 2 cm 3 of CH 2 Cl 2 and then purified on a silica plate (eluent: CH 2 Cl 2 ). Red crystals are isolated: m = 0.132 g. b) [M 1 ] = Mo (CO) 2 Cp R '= H
A une solution de 0,5; 10 mole de Cp2Mo2(CO)4 Has a solution of 0.5; 10 mole of Cp 2 Mo 2 (CO) 4
(0,217 g) dans 10 cm3 de THF distillé est ajoutée goutte à goutte une solution de 0,5.10-3 mole d'hexyne-4 oate de N-succinimidyle (0,104 g) dans le(0.217 g) in 10 cm 3 of distilled THF is added dropwise a solution of 0.5.10 -3 mole of N-succinimidyl 4-hydroxyne (0.104 g) in the
THF (6 cm3). Après evaporation du solvant, le résidu est repris par CH2Cl2 (3 cm3 ) et purifié sur plaque de silice (éluant : CH2Cl2). On obtient des cristaux rouges m = 0,150 g. c) [M1] = W(CO)2Cp R' = HTHF (6 cm 3 ). After evaporation of the solvent, the residue is taken up in CH 2 Cl 2 (3 cm 3 ) and purified on a silica plate (eluent: CH 2 Cl 2 ). Red crystals are obtained m = 0.150 g. c) [M 1 ] = W (CO) 2 Cp R '= H
Même mode opératoire avecSame operating mode with
0,5.10-3 mole de Cp2W2(CO)4 (0,305) 0,5.10 mole d'hexyne-4 oate de N-succinimidyle (0,104 g)0.5.10 -3 mole of Cp 2 W 2 (CO) 4 (0.305) 0.5.10 mole of N-succinimidyl 4-hydroxyne (0.104 g)
Après purification, on isole un solide rouge m = 0,14 g.After purification, a red solid is isolated m = 0.14 g.
2) Couplage peptidigue2) Peptide coupling
Le couplage avec un aminoacide HPheOMe (Phe = phénylalanine) a été réalisé selon le schémaThe coupling with an amino acid HPheOMe (Phe = phenylalanine) was carried out according to the scheme
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000014_0001
Ce produit a été caractérisé en RMN.This product was characterized by NMR.
RMN 'H (CD2Cl2, Brucker 250, δ ppm) : δ :1 H NMR (CD 2 Cl 2 , Brucker 250, δ ppm): δ:
2,0 (CH2 m), 2,66 (CH3-C≡C, s), 3,03 (CH2, m),2.0 (CH 2 m), 2.66 (CH 3 -C≡C, s), 3.03 (CH 2 , m),
3,15 (CH2, m), 3,71 (O-CH3, s), 4,83 (CH, m), 5,24 (2 Cp,3.15 (CH 2 , m), 3.71 (O-CH 3 , s), 4.83 (CH, m), 5.24 (2 Cp,
2 si, 5,88 (HN, d), 7,11 ( (5) , m), 7,26 ( (5) , m) .2 if, 5.88 (HN, d), 7.11 ((5), m), 7.26 ((5), m).
IR (KBr) v C≡O = 1973, 1895, 1823 cm-1 masse. (Spectrometre quadrupole Riber-Maf R 10-10 en DCI-NH3) : 708 (M + 1). Ce complexe permet donc de coupler et partant de marquer des peptides solubles dans le THF ou le DMF.IR (KBr) v C≡O = 1973, 1895, 1823 cm -1 mass. (Riber-Maf R 10-10 quadrupole spectrometer in DCI-NH 3 ): 708 (M + 1). This complex therefore makes it possible to couple and hence to mark peptides soluble in THF or DMF.
Lorsque R' = SO3Na, on peut en outre marquer les peptides solubles dans l'eau.When R '= SO 3 Na, it is also possible to label the water-soluble peptides.
Mode opératoire Une solution de 0,5.10-3 mole de chlorhydrate de l'ester methylique de la phenylalanine (HpheOCH3,HCl)Procedure A solution of 0.5.10 -3 mole of hydrochloride of the methyl ester of phenylalanine (HpheOCH 3 , HCl)
(0,107 g) dans 5 cm3 de DMF est neutralisée par la quantité équivalente de triethylamine (0,5.10-3 mole). Cette solution est ajoutée à une solution de0,5.10 mole dans le THF (10 cm3) du complexe préparé précédemment avec : a) [M1] = Co(CO)6 R' = H.(0.107 g) in 5 cm 3 of DMF is neutralized by the equivalent amount of triethylamine (0.5.10 -3 mole). This solution is added to a solution of 0.5.10 mole in THF (10 cm 3 ) of the complex prepared above with: a) [M 1 ] = Co (CO) 6 R '= H.
Après agitation pendant 4 heures, le solvant est évaporé, le résidu est repris par CH2Cl2 et purifié sur plaque de silice (éluant CH2Cl2 + Acétate d'éthyle 5 %). On isole des cristaux rouges m = 0,197 g. b) [M1] = Cp Mo(CO)2 · R' = H.After stirring for 4 hours, the solvent is evaporated, the residue is taken up in CH 2 Cl 2 and purified on a silica plate (eluent CH 2 Cl 2 + 5% ethyl acetate). Red crystals are isolated m = 0.197 g. b) [M 1 ] = Cp Mo (CO) 2 · R '= H.
Après agitation pendant 6 heures, le solvant est évaporé, le résidu est repris par CH2Cl2 et purifié sur plaque de silice (éluant CH2Cl2 + Acétate d'éthyle 5 %). On isole des cristaux rouges m = 0,15 g. c) [M1] = Cp W(CO)2 R' = HAfter stirring for 6 hours, the solvent is evaporated, the residue is taken up in CH 2 Cl 2 and purified on a silica plate (eluent CH 2 Cl 2 + 5% ethyl acetate). Red crystals are isolated m = 0.15 g. c) [M 1 ] = Cp W (CO) 2 R '= H
Même mode opératoire que précédemment.Same procedure as before.
Après purification, on isole des cristaux rouges m = 0 , 14 g. EXEMPLE II - MARQUEUR DU TYPE
Figure imgf000016_0002
L'acide hexyne-4 oique(10-2mole ; 1,12 g) et le paradiméthylsulfoniophénolméthylsulfonate (10-2mole ;After purification, red crystals are isolated m = 0.14 g. EXAMPLE II - TYPE MARKER
Figure imgf000016_0002
Hexyne-4 oic acid (10 -2 mole; 1.12 g) and paradimethylsulfoniophenolmethylsulfonate (10 -2 mole;
2,66 g) sont dissous dans CH3CN et le D.C.C. (2,66 g ; 10-2 mole) est ajouté à la solution. Le mélange est agité, pendant 12 heures à une température en dessous de2.66 g) are dissolved in CH 3 CN and DCC (2.66 g; 10 -2 mole) is added to the solution. The mixture is stirred for 12 hours at a temperature below
0°C. Le dicyclohexyluree est filtré, le solvant évaporé. On obtient une huile.0 ° C. The dicyclohexyluree is filtered, the solvent evaporated. An oil is obtained.
L'huile est reprise dans 10 cm3 de THF distillé. On ajoute une solution de 10-2. mole de Co2(CO)8 (3,42 g).The oil is taken up in 10 cm 3 of distilled THF. A solution of 10 -2 is added . mole of Co 2 (CO) 8 (3.42 g).
Le mélange est agité 2 heures, puis le solvant est évaporé. On obtient une huile : M = 2 g.The mixture is stirred for 2 hours, then the solvent is evaporated. An oil is obtained: M = 2 g.
EXEMPLE III - MARQUEUR DU TYPE ACIDE AMINE COMPLEXEEXAMPLE III MARKER OF THE COMPLEX AMINO ACID TYPE
Figure imgf000016_0001
1) Complexation par le cobalt et le molybdène a) Synthèse
Figure imgf000016_0001
1) Complexation with cobalt and molybdenum a) Synthesis
Ce marqueur a été synthétisé avec M1 = Co(CO)3 , Mo(CO)2Cp c'est-à-dire à partir de composés organométalliques M2L2(CO)4 avec X = CH3-CO pour M = Mo et L = Cp et Y = C2H5 pour M = Co et L = COThis marker was synthesized with M 1 = Co (CO) 3 , Mo (CO) 2 Cp, that is to say from organometallic compounds M 2 L 2 (CO) 4 with X = CH 3 -CO for M = Mo and L = Cp and Y = C 2 H 5 for M = Co and L = CO
avec des rendements de 66 % et de 75 % et X = BOC(1) pour M = Co et L = CO Y = CH3 avec rendements de 44 %.with yields of 66% and 75% and X = BOC (1) for M = Co and L = CO Y = CH 3 with yields of 44%.
La première réaction sur 1 diversement protégé (schéma 1 ) (par exemple N-acétyl et ester éthylique) conduit sans aucune altération structurale au cluster attendu.The first reaction on 1 variously protected (scheme 1) (for example N-acetyl and ethyl ester) leads without any structural alteration to the expected cluster.
(1) ( terbutyloxycarbonyl)(1) (terbutyloxycarbonyl)
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0001
Schéma 1 a) X = CH 3-CO Y = C2H5 M = Mo L = Cp Rd t = 66 % b) X = CH3CO Y = C2H5 M = Co L = CO Rdt 75 % c) X = BOC Y = CH M = Co L = CO Rdt = 44 % Mode opératoire 1°) X = CH3-CO, Y = C2H5, M = Co, L = CODiagram 1 a) X = CH 3 -CO Y = C 2 H 5 M = Mo L = Cp R dt = 66% b) X = CH 3 CO Y = C 2 H 5 M = Co L = CO R dt 75% c) X = BOC Y = CH M = Co L = CO R dt = 44% Procedure 1 °) X = CH 3 -CO, Y = C 2 H 5 , M = Co, L = CO
A une solution de Co2(CO)8 (0,155 g ; 0,45.10-3 mole) dans le THF (10 cm3) est ajoutée goutte à goutte une solution de norleucine acetylénique protégéeTo a solution of Co 2 (CO) 8 (0.155 g; 0.45.10 -3 mole) in THF (10 cm 3 ) is added dropwise a solution of protected acetylene norleucine
(X = CH3-CO, Y = C2H5) (0,089 g, 0 ,45.10-3mole) dans le THF (6 cm3). On laisse agiter 2 heures à température ambiante. Après evaporation du solvant, le résidu est repris par CH2Cl2· On purifie sur plaque de silice (éluanrt : Acétate d'éthyle). On isole des cristaux rouges: m = 0,169 g.(X = CH 3 -CO, Y = C 2 H 5 ) (0.089 g, 0.45.10 -3 mole) in THF (6 cm 3 ). The mixture is left to stir for 2 hours at room temperature. After evaporation of the solvent, the residue is taken up in CH 2 Cl 2 · Purification is carried out on a silica plate (eluanrt: Ethyl acetate). Red crystals are isolated: m = 0.169 g.
2°) X = CH3-CO, Y = C2H5 , M = Mo, L = Cp2 °) X = CH 3 -CO, Y = C 2 H 5 , M = Mo, L = Cp
Même mode opératoire que précédemment.Same procedure as before.
A une solution de Cp2Mo2(CO)4 (0,195 g ; 0,45.10-3mole) dans le THF (10 cm3) est ajoutée goutte à goutte une solution de norleucine acetylénique protégéeTo a solution of Cp 2 Mo 2 (CO) 4 (0.195 g; 0.45.10 -3 mole) in THF (10 cm 3 ) is added dropwise a solution of protected acetylene norleucine
(0,089 g ; 0,45.10-3mole) dans le THF (6 cm3). Le mélange est agité 2 heures à température ambiante. Le solvant est évaporé, le résidu est repris par CH2Cl2 et purifié sur plaque de silice (éluant : Acétate d'éthyle). On isole des cristaux rouges : m = 0,191 g.(0.089 g; 0.45.10 -3 mole) in THF (6 cm 3 ). The mixture is stirred for 2 hours at room temperature. The solvent is evaporated, the residue is taken up in CH 2 Cl 2 and purified on a silica plate (eluent: ethyl acetate). Red crystals are isolated: m = 0.191 g.
3°) X = Boc, Y = CH3, M = Co, L = CO3 °) X = Boc, Y = CH 3 , M = Co, L = CO
Même mode opératoire qu'en 1°).Same operating mode as in 1 °).
CO2(CO)8 : 0,45.10-3mole (0,155 g) : 0 ,45.10-3mole (0,108 g)CO 2 (CO) 8 : 0.45.10 -3 mole (0.155 g): 0.45.10 -3 mole (0.108 g)
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000018_0001
On obtient après purification des cristaux rouges m = 0,104 g. Les produits obtenus se purifient très aisément par chromatographie sur couche mince et avec des rendements convenables. Toutes les caractéristiques spectrales (R.M.N., I.R. masse) concordent avec la structure attendue.After purification, red crystals are obtained m = 0.104 g. The products obtained are very easily purified by thin layer chromatography and with suitable yields. All the spectral characteristics (NMR, mass IR) agree with the expected structure.
Résultats analytiques des composés obtenus.Analytical results of the compounds obtained.
2a Anal. Elem. : C 45,66, H 3,96 N 2,22 Mo 30,42 ; trouvé : C 45,38, H 4,07 N 2,23 Mo 29,562a Anal. Elem. : C 45.66, H 3.96 N 2.22 MB 30.42; found: C 45.38, H 4.07 N 2.23 MB 29.56
RMN -'H (CDCl3, Varian T60) TMS stand. (δ en ppm) δ = 1,45 (t, CH3-CH2), 2,06(CH3-CO,s), 2,8(CH3-C≡C,s) 5,2-5, 3(2Cp)RMN -'H (CDCl 3 , Varian T60) TMS stand. (δ in ppm) δ = 1.45 (t, CH 3 -CH 2 ), 2.06 (CH 3 -CO, s), 2.8 (CH 3 -C≡C, s) 5.2-5 , 3 (2Cp)
IR (KBr) = 1975, 1905, 1830 cm
Figure imgf000019_0004
IR (KBr) = 1975, 1905, 1830 cm
Figure imgf000019_0004
2b Anal. Elem. C 39,75, H 3,10 N 2,89, Co 24,43 trouvé 39,69 H 3,25 N 2,81 Co 24,662b Anal. Elem. C 39.75, H 3.10 N 2.89, Co 24.43 found 39.69 H 3.25 N 2.81 Co 24.66
RMN- H (CDCl3 Varian T 60, TMS stand . δ en ppm) 1,4 (CH3-CH2,t), 2,09(CH3-CO,s), 2,66(CH3-C≡C,s)1 H NMR (CDCl 3 Varian T 60, standard TMS δ in ppm) 1.4 (CH 3 -CH 2 , t), 2.09 (CH 3 -CO, s), 2.66 (CH 3 -C ≡C, s)
3,5(CH2,m) 4,4 (CH2,q) 4,8 (CH,m)3.5 (CH 2 , m) 4.4 (CH 2 , q) 4.8 (CH, m)
IR(KBr) : = 2080, 2040, 2010 cm-1
Figure imgf000019_0003
IR (KBr): = 2080, 2040, 2010 cm -1
Figure imgf000019_0003
2c R.M.N.1 H (CDCl3, Brucker 250, TMS stand, δppm) δ : 1,43(CH3)3-C,s), 2,63(CH3-C=C,s), 3,48(CH,m) 3,74 4,48(CH2,m), 5,29(NH,d)
Figure imgf000019_0001
IR(KBr) = 2090, 2049, 2020 cm-1
Figure imgf000019_0002
masse (spectrometre quadrupole Riber Mag R 10-10 en DCI - NH3) : 545 (M+NH4 +), 528 (M+1)527 (M)2c 1 H NMR (CDCl 3 , Brucker 250, TMS stand, δppm) δ: 1.43 (CH 3 ) 3 -C, s), 2.63 (CH 3 -C = C, s), 3.48 ( CH, m) 3.74 4.48 (CH 2 , m), 5.29 (NH, d)
Figure imgf000019_0001
IR (KBr) = 2090, 2049, 2020 cm -1
Figure imgf000019_0002
mass (Riber Mag R 10-10 quadrupole spectrometer in DCI - NH 3 ): 545 (M + NH 4 + ), 528 (M + 1) 527 (M)
b) Couplage peptidique On a réalisé le couplage avec HPheOCH3.b) Peptide coupling The coupling was carried out with HPheOCH 3 .
Il peut se faire par deux voies différentes qui sont représentées sur les schémas 2 et 3 ci-après et qui illustrent les deux possibilités : . soit couplage après complexation, . soit couplage avant complexation de la molécule de marquage avec le composé organometalliqueIt can be done by two different ways which are represented on diagrams 2 and 3 below and which illustrate the two possibilities: . either coupling after complexation,. either coupling before complexation of the labeling molecule with the organometallic compound
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000020_0001
avec les groupes d'activation suivantswith the following activation groups
Figure imgf000020_0002
ou
Figure imgf000020_0002
or
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0001
Nous obtenons par ces deux approches des rendements sensiblement voisins mais qui n ' ont pas été optimisés. Les clusters sont caractérisés par R.M.N., I.R. et spectrométrie de masse suivants.We obtain by these two approaches substantially similar yields but which have not been optimized. The clusters are characterized by R.M.N., I.R. and mass spectrometry following.
Mode opératoireProcedure
1°)
Figure imgf000021_0002
a) Comolexation1 °)
Figure imgf000021_0002
a) Comolexation
A une solution de Co2 (CO)8 (0,218 g ;To a solution of Co 2 (CO) 8 (0.218 g;
0,63.10 mole) dans le THF (10 cm3) est ajoutée goutte à goutte une solution de norleucine acetylénique activée (0,17 g ; 0,63.10 mole) dans le THF (6 cm3). Le mélange est agité 2 heures. b) Couplage avec HpheOCH3 0.63.10 mole) in THF (10 cm 3 ) is added dropwise a solution of activated acetylenic norleucine (0.17 g; 0.63.10 mole) in THF (6 cm 3 ). The mixture is stirred for 2 hours. b) Coupling with HpheOCH 3
Le chlorhydrate de l'ester methylique de la phenylalanine (HpheOCH3, HCl) (0,63.10-3mole ;The hydrochloride of the methyl ester of phenylalanine (HpheOCH 3 , HCl) (0.63.10 -3 mole;
0,13 g) mis en solution dans 3 cm3 de DMF est neutralisé par la quantité équivalente de triéthylamine (88 μl). Cette solution est ajoutée à la précédente. On laisse agiter 3 heures. Après filtration et evaporation du solvant, le résidu est repris par 3 cm3 de CH2CH2 et purifié sur plaque de silice (éluant : éther éthylique 95. Acétate d'éthyle : 5). On isole des cristaux rouges : m = 0,11 g.0.13 g) dissolved in 3 cm 3 of DMF is neutralized by the equivalent amount of triethylamine (88 μl). This solution is added to the previous one. Leave to stir for 3 hours. After filtration and evaporation of the solvent, the residue is taken up in 3 cm 3 of CH 2 CH 2 and purified on a silica plate (eluent: ethyl ether 95. Ethyl acetate: 5). Red crystals are isolated: m = 0.11 g.
2°)
Figure imgf000022_0001
O Même mode opératoire que précédemment avec :2 °)
Figure imgf000022_0001
O Same operating mode as above with:
Cp2 Mo2 (CO)4 : (0,63.10-3 mole ; 0,273 g) Norleucine : (0,63.10-3 mole ; 0,17 g)Cp 2 Mo 2 (CO) 4 : (0.63.10 -3 mole; 0.273 g) Norleucine: (0.63.10 -3 mole; 0.17 g)
HpheOCH3 HCl : (0,63.10-3 mole ; 0,13 g).HpheOCH 3 HCl: (0.63.10 -3 mole; 0.13 g).
Après purification, on isole des cristaux rouges : m = 0,14 g.After purification, red crystals are isolated: m = 0.14 g.
3°)
Figure imgf000022_0002
3 °)
Figure imgf000022_0002
Même mode opératoire que précédemment avec :Same operating mode as above with:
Co2(CO)8 : (0,63.10-3 mole, m = 0,218 g) Norleucine activé : (0,63.10 mole, m = 0,180 g)Co 2 (CO) 8 : (0.63.10 -3 mole, m = 0.218 g) Activated Norleucine: (0.63.10 mole, m = 0.180 g)
Après purification, on obtient des cristaux rouges : m = 0,15 g.After purification, red crystals are obtained: m = 0.15 g.
4°) Complexation d'un dipeptide protégé4 °) Complexation of a protected dipeptide
A une solution de (0,59.10-3mole ; 0,205 g) de Co2(CO)8 dans le THF (10 cm3) est ajoutée goutte à goutte une solution de dipeptide (0,59.10 mole ; 0,236 g) dans le THF (6 cm3). Le mélange est agité 4 heures. La solution est évaporée, le résidu est repris par CH2Cl2 et purifié sur plaque de silice (éluant : CH2Cl2). On isole des cristaux rouges : m = 0,11 g) .To a solution of (0.59.10 -3 mole; 0.205 g) of Co 2 (CO) 8 in THF (10 cm 3 ) is added dropwise a solution of dipeptide (0.59.10 mole; 0.236 g) in THF (6 cm 3 ). The mixture is stirred 4 hours. The solution is evaporated, the residue is taken up in CH 2 Cl 2 and purified on a silica plate (eluent: CH 2 Cl 2 ). Red crystals are isolated: m = 0.11 g).
3a : Anal. Elem. : C 46,77 H 3,59 N 4,54 trouvé 47,60 3,76 A, 723a: Anal. Elem. : C 46.77 H 3.59 N 4.54 found 47.60 3.76 A, 72
RMN H (CDCl3, Bruker 250, TMS stand, δppm) : δH NMR (CDCl 3 , Bruker 250, TMS stand, δppm): δ
1,94 (CH3-CO,s), 2,59(CH3-C≡C-,s), 3,25 (2CH2 ,m) ,1.94 (CH 3 -CO, s), 2.59 (CH 3 -C≡C-, s), 3.25 (2CH 2 , m),
4,54 (CH,m), 4,84(CH,m), 6,35(NH,d), 6,89(NH,d), 7,25(C6H5)4.54 (CH, m), 4.84 (CH, m), 6.35 (NH, d), 6.89 (NH, d), 7.25 (C 6 H 5 )
IR(KBr) ≈ 2090, 2048, 2017 cm -1
Figure imgf000023_0001
masse (spectrometre quadrupole Riber mag R-10-10 en DCI-NH3) : 617(M+1) 634(M+NH4 +)IR (KBr) ≈ 2090, 2048, 2017 cm -1
Figure imgf000023_0001
mass (Riber mag R-10-10 quadrupole spectrometer in DCI-NH 3 ): 617 (M + 1) 634 (M + NH 4 + )
3b RMN 1H(CDCl3, Bruker 250, TMS stand, δppm) : δ3b 1 H NMR (CDCl 3 , Bruker 250, TMS stand, δppm): δ
1,97(CH3-CO,s), 2,67(CH3-C≡C,s), 3,0(2CH2,m), 3,71 (CO2-CH3,s), 3,97(CH,m), 4,80(CH,m) 5, 18-5,24(2Cp),1.97 (CH 3 -CO, s), 2.67 (CH 3 -C≡C, s), 3.0 (2CH 2 , m), 3.71 (CO 2 -CH 3 , s), 3 , 97 (CH, m), 4.80 (CH, m) 5.18-5.24 (2Cp),
5,92 (NH,d), 6,55(NH,d), 7,25(C6H5)5.92 (NH, d), 6.55 (NH, d), 7.25 (C 6 H 5 )
IR(KBr) = 1977, 1905, 1827 cm-1
Figure imgf000023_0002
masse (spectrometre quadrupole Riber-Mag R-10-10 en DCI-NH3) :IR (KBr) = 1977, 1905, 1827 cm -1
Figure imgf000023_0002
mass (Riber-Mag R-10-10 quadrupole spectrometer in DCI-NH 3 ):
765 (M+1) 4 RMN 1H(CDCl3, Brucker 250, TMS stand., δppm) : δ 1,40((CH3)3C, s),2,53(CH3-C≡C,s), 3,45(2CH2,m), 3,76(-CO2-CH3, s), 4,40(CH,m), 4,64(CH,m), 5,01 (NH,d),765 (M + 1) 4 1 H NMR (CDCl 3 , Brucker 250, TMS stand., Δppm): δ 1.40 ((CH 3 ) 3 C, s), 2.53 (CH 3 -C≡C, s), 3.45 (2CH 2 , m), 3.76 (-CO 2 -CH 3 , s), 4.40 (CH, m), 4.64 (CH, m), 5.01 (NH , d),
6,37 (NH,d), 7,24(C6H5)6.37 (NH, d), 7.24 (C 6 H 5 )
IR(KBr) = 2090, 2048, 2012 cm-1
Figure imgf000023_0003
masse (spectrometre quadrupole Riber mag R-10-10 en DCI - NHOIR (KBr) = 2090, 2048, 2012 cm -1
Figure imgf000023_0003
mass (Riber mag R-10-10 quadrupole spectrometer in DCI - NHO
691(M-1+NH4 +), 675 (M+1), 674(M) C ) Couplage avec un dipeptid691 (M-1 + NH 4 + ), 675 (M + 1), 674 (M) C) Coupling with a dipeptid
Enfin, le couplage peptidique d'un aminoacide complexé avec un dipeptide conduisant à un tripeptide complexé a été réalisé selon le schémaFinally, the peptide coupling of a complexed amino acid with a dipeptide leading to a complexed tripeptide was carried out according to the scheme
Figure imgf000024_0001
Mode opératoire
Figure imgf000024_0001
Procedure
a) Complexation de la norleucine acetylénique monoprotégé. A une solution de 0,67.10 -4 mole de Cp2 Mo2 (CO)4 (0,029 g) dans le THF (10 cm3) est ajoutée goutte à goutte une solution de 0,67.10 mole d'acétyl-norleucine acetylénique (0,011 g) dans lea) Complexation of monoprotected acetylenic norleucine. To a solution of 0.67.10 -4 mole of Cp 2 Mo 2 (CO) 4 (0.029 g) in THF (10 cm 3 ) is added dropwise a solution of 0.67.10 mole of acetylenyl acetylenleucine ( 0.011 g) in the
THF (6 cm3). Le mélange est agité 2 heures.THF (6 cm 3 ). The mixture is stirred for 2 hours.
b) A cette solution, on ajoute 0,67.10-4 mole de D.C.C. (0,0139 g). On laisse agiter 1 heure, puis on ajoute une solution du dipeptide Asp(OBz) CONH2 (0,67.10-4 mole , 0,024 g) dans le THF (2 cm3). Le mélange est agité 12 heures à température ambiante. Après evaporation, le résidu est repris par 2 cm3 de CH2Cl2 et purifié sur plaque de silice (éluant : acétate d'éthyle). On obtient des cristaux rouges : m = 0,016 g).b) To this solution is added 0.67.10 -4 mole of DCC (0.0139 g). The mixture is left to stir for 1 hour, then a solution of the dipeptide Asp (OBz) CONH 2 (0.67 × 10 -4 mole, 0.024 g) in THF (2 cm 3 ) is added. The mixture is stirred for 12 hours at room temperature. After evaporation, the residue is taken up in 2 cm 3 of CH 2 Cl 2 and purified on a silica plate (eluent: ethyl acetate). Red crystals are obtained: m = 0.016 g).
5 RMN 'H (acétone d6, Brucker 250, 5 ppm) : δ5 H NMR (acetone d 6 , Brucker 250, 5 ppm): δ
1,98 (CH3-CO, s), 2,85 (CH3-CΞC, s), 3,15 (CH2, m),1.98 (CH 3 -CO, s), 2.85 (CH 3 -CΞC, s), 3.15 (CH 2 , m),
4,16 (CH, m), 5,34 (2 Cp, 2L), 7,43 (NH, d) , 11 (COOH, s).4.16 (CH, m), 5.34 (2 Cp, 2L), 7.43 (NH, d), 11 (COOH, s).
IR (KBr)
Figure imgf000025_0003
CΞO = 1972, 1909, 1833. masse (Spectrometre quadrupole Riber-Mag R-10-10 enIR (KBr)
Figure imgf000025_0003
CΞO = 1972, 1909, 1833. mass (Riber-Mag quadrupole spectrometer R-10-10 in
DCI-NH3) : 604 (M + 1 ) .DCI-NH 3 ): 604 (M + 1).
6 RMN 'H (acétone d6, Brucker 250, δ ppm) : δ :6 'H NMR (acetone d 6 , Brucker 250, δ ppm): δ:
2,05 (CH3-CO, s), 2,87 (CH3-C≡C, s), 3,0 (CH2, m), 4 (CH, m), 4,64 (CH, m), 4,66 (CH, m), 5,098
Figure imgf000025_0001
s), 5,35 (2 Cp, 2 s), 6,57 (NH2, s), 6,86 (NH2, s), 7,25 m), 7,55 (NH, d), 7,7 (NH, d), 8,0 (NH, d)
Figure imgf000025_0002
IR (KBr) v C≡O = 1975, 1903, 1829. masse (Spectrometre quadrupole Riber-Mag R-10-10 en2.05 (CH 3 -CO, s), 2.87 (CH 3 -C≡C, s), 3.0 (CH 2 , m), 4 (CH, m), 4.64 (CH, m ), 4.66 (CH, m), 5.098
Figure imgf000025_0001
s), 5.35 (2 Cp, 2 s), 6.57 (NH 2 , s), 6.86 (NH 2 , s), 7.25 m), 7.55 (NH, d), 7 , 7 (NH, d), 8.0 (NH, d)
Figure imgf000025_0002
IR (KBr) v C≡O = 1975, 1903, 1829. mass (Riber-Mag quadrupole spectrometer R-10-10 in
DCI-NH3) : 955 (M + 1).DCI-NH 3 ): 955 (M + 1).
Ces résultats sont directement extrapolables au marquage de peptides d'intérêt biologique ; notamment le tuftsin Tyrs-Lys-Pro-Arg (inhibiteur de macrophage) puis des enképhalines : Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu, enfin de la substance P : Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Sar-Leu- Met-NH2. 2) Complexation par le ruthénium et l'osmiumThese results are directly extrapolable to the labeling of peptides of biological interest; in particular tuftsin Tyrs-Lys-Pro-Arg (macrophage inhibitor) then enkephalins: Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu, finally substance P: Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe -Sar-Leu- Met-NH 2 . 2) Complexing with ruthenium and osmium
On s'est attaché au marquage de la norleucine acetylénique protégée, en greffant un cluster d'osmium et de ruthénium sur la fonction acetylénique. La synthèse peut être schématisée ainsi :We focused on the labeling of protected acetylene norleucine, by grafting a cluster of osmium and ruthenium on the acetylene function. The synthesis can be schematized as follows:
Figure imgf000026_0001
Les réactifs Ru3 (CO)11 (CH3CN) et Os3(CO)11 (CH3CN) ont été préparés selon les méthodes décrites dans la littérature (Ru3 (CO) 1 1 (CH3CN) : G.A. Fbulds, B.F.G. Johnson et J. Lewis, J. Organometal. Chem., 1985, 296, 147. Os3(CO)11 (CH3CN) : B.F.G. Johnson, J. Lewis et D.A. Pippard, J. chem. Soc, Dalton, 1981, 407). 2.1) Complexation par Ru3(CO)11 (CH3CN) :
Figure imgf000026_0001
Reagents Ru 3 (CO) 11 (CH 3 CN) and Os 3 (CO) 11 (CH 3 CN) were prepared according to the methods described in the literature (Ru 3 (CO) 1 1 (CH 3 CN): GA Fbulds, BFG Johnson and J. Lewis, J. Organometal. Chem., 1985, 296, 147. Os 3 (CO) 11 (CH 3 CN): BFG Johnson, J. Lewis and DA Pippard, J. chem. Soc, Dalton, 1981, 407). 2.1) Complexation by Ru 3 (CO) 11 (CH 3 CN):
Ru3 (CO)11 (CH3CN) est préparé à partir de 300 mg de Ru3(CO)12 (4,7.10-4 mole), dans 220 ml de dichlorométhane, 15 ml d'acétonitrile et 0,9 ml d'une solution de triméthylamine oxyde dans le méthanol à 50 g/l (4,8. 10 -4 mole). Le solvant est ensuite éliminé par evaporation sous pression réduite et remplacé par 10 ml deRu 3 (CO) 11 (CH 3 CN) is prepared from 300 mg of Ru 3 (CO) 12 (4.7.10 -4 mole), in 220 ml of dichloromethane, 15 ml of acetonitrile and 0.9 ml of a solution of trimethylamine oxide in methanol at 50 g / l (4.8. 10 -4 mole). The solvent is then removed by evaporation under reduced pressure and replaced with 10 ml of
THF. 100 mg (5,46.10-4 mole) de norleucine acétylénique protégé 1 est ajouté à cette solution. Après deux, heures d'agitation, le produit est purifié par chromatographie sur plaques (éluant : CH2Cl /cyclohexane/CH3CN : 35/60/10). Après extraction du produit par THF et evaporation, on recueille 250 mg de complexe 7a (M = Ru) (rendement : 60 %). La recristallisation dans un mélange dichlorométhane/pentane fournit des cristaux oranges, F 100°C.THF. 100 mg (5.46.10 -4 mole) of protected acetylene norleucine 1 is added to this solution. After two hours of stirring, the product is purified by chromatography on plates (eluent: CH 2 Cl / cyclohexane / CH 3 CN: 35/60/10). After extraction of the product by THF and evaporation, 250 mg of complex 7a (M = Ru) are collected (yield: 60%). Recrystallization from a dichloromethane / pentane mixture gives orange crystals, at 100 ° C.
IR ( KBr ) vCO en cm-1= 2097 m, 2048 F, 2025 F, 1998 F, 1879 f.IR (KBr) v CO in cm -1 = 2097 m, 2048 F, 2025 F, 1998 F, 1879 f.
RMN 1H ( CDCI3, 250 MHz, TMS stand., δ ppm) : 2,04 (CH3CO, s ), 2,31 ( CH3CsC, s ), 2,50-3,00 ( CH2, massif large ), 3,78 1 H NMR (CDCI 3 , 250 MHz, TMS stand., Δ ppm): 2.04 (CH 3 CO, s), 2.31 (CH 3 CsC, s), 2.50-3.00 (CH 2 , broad massif), 3.78
( CH3COO, s ), 4,88 ( CH, m ), 6,02 (NH, massif ).(CH 3 COO, s), 4.88 (CH, m), 6.02 (NH, bulk).
Masse ( impact électronique ) : 766 ( M+ ), 738 ( M+-CO ), 710 ( M+-2CO ), 682 ( M+-3CO ), 654 ( M+-4CO ), 626 ( M+-5CO ), 598 (M+-6CO).Mass (electronic impact): 766 (M + ), 738 (M + -CO), 710 (M + -2CO), 682 (M + -3CO), 654 (M + -4CO), 626 (M + -5CO ), 598 (M + -6CO).
2.2) Complexation par Os3 (CO)11 (CH3CN) : A 200 mg de Os3 (CO) 2 (2,2.10-4 mole) dissous dans 100 ml de dichlorométhane et 10 ml d'acétonitrile sont additionnés 0,8 ml d'une solution de triméthylamine oxyde dans le méthanol à 40 g/1 (4,3.10 mole) . L'avancement de la réaction est suivi par CCM (éluant : THF/pentane : 1/3). Lorsque tout le produit de départ a disparu, le solvant est évaporé sous pression réduite.2.2) Os 3 (CO) 11 (CH 3 CN) complexing: To 200 mg of Os 3 (CO) 2 (2.2.10 -4 mole) dissolved in 100 ml of dichloromethane and 10 ml of acetonitrile are added 0, 8 ml of a solution of trimethylamine oxide in methanol at 40 g / 1 (4.3.10 mole). The progress of the reaction is monitored by TLC (eluent: THF / pentane: 1/3). When all the starting material has disappeared, the solvent is evaporated under reduced pressure.
Le solide jaune de Os3 (CO)11 (CH3CN) obtenu est redissous dans 7 ml de THF. 100 mg (5,46.10-4 mole) de la norleucine acetylénique protégé 1 est ajouté à cette solution. Après deux heures d'agitation, il reste encore de produit de départ mais la réaction n'évolue plus. Le composé formé est séparé par chromatographie sur plaques de gel de silice (éluant : THF/pentane : 1/3). Après extraction du produit par dichloromethane et evaporation, on recueille 50 mg de complexe 7b (M = Os) (rendement : 25 %). La recristallisation dans un mélange dichloromethane/ pentane fournit des cristaux oranges, F 114°C. Le spectre RMN 1H révèle la présence de deux complexes de la norleucine :The yellow solid of Os 3 (CO) 11 (CH 3 CN) obtained is redissolved in 7 ml of THF. 100 mg (5,46.10 -4 mole) of protected acetylenic norleucine 1 is added to this solution. After two hours of stirring, there is still some starting material but the reaction no longer progresses. The compound formed is separated by chromatography on silica gel plates (eluent: THF / pentane: 1/3). After extraction of the product by dichloromethane and evaporation, 50 mg of complex 7b (M = Os) are collected (yield: 25%). Recrystallization from a dichloromethane / pentane mixture provides orange crystals, mp 114 ° C. The 1 H NMR spectrum reveals the presence of two norleucine complexes:
RMN 1H ( CDCl3, 250 MHz, TMS stand., δ ppm ) : 1 H NMR (CDCl 3 , 250 MHz, TMS stand., Δ ppm):
-Complexe majoritaire ( 70% ) :- Majority complex (70%):
2,02 (CH3CO, s ), 2,46 ( CH3C≡C, s ), 2,59 et 2,82 ( CH2, m, m ), 3,772.02 (CH 3 CO, s), 2.46 (CH 3 C≡C, s), 2.59 and 2.82 (CH 2 , m, m), 3.77
( CH3COO, s ), 4,75 ( CH, m ), 6,05 (NH,. massif ).(CH 3 COO, s), 4.75 (CH, m), 6.05 (NH, solid).
-Complexe minoritaire ( 30% ) :- Minority complex (30%):
2,01 (CH3CO, s ), 2,54 ( CH3C=C, S ), 2,59 et 2,82 ( CH2, m, m ), 3,772.01 (CH 3 CO, s), 2.54 (CH 3 C = C, S), 2.59 and 2.82 (CH 2 , m, m), 3.77
( CH3COO, s ), 4,75 ( CH, m ), 5,90 (NH, massif ).(CH 3 COO, s), 4.75 (CH, m), 5.90 (NH, solid).
Ces deux complexes sont actuellement non séparables par chromatographie classique sur plaques .These two complexes are currently not separable by conventional plate chromatography.
IR ( KBr ) vCO en cm-1 = 2099 f, 2060 F, 2054 F, 2021 m, 2005 m, 1845 tf.IR (KBr) v CO in cm -1 = 2099 f, 2060 F, 2054 F, 2021 m, 2005 m, 1845 tf.
Masse ( impact électronique ) : 1033 ( M+), 1005 ( M+- CO ), 977 ( M+-2CO) ,949 ( M+-3CO ), 921 ( M+-4CO ), 893 ( M+-5CO ), 865 (M+-6CO), 837 ( M+-7CO ), 809 (M+-8CO). Mass (electronic impact): 1033 (M + ), 1005 (M + - CO), 977 (M + -2CO), 949 (M + -3CO), 921 (M + -4CO), 893 (M + -5CO ), 865 (M + -6CO), 837 (M + -7CO), 809 (M + -8CO).

Claims

REVENDICATIONS
1. Molécule de ma'rquage permettant le marquage d'un peptide ou d'une protéine, ou plus généralement d'un composé de nature peptidique ou protéique, caractérisée en ce que ladite molécule de marquage comporte 1 ) au moins un site organique insaturé, notamment avec une insaturation carbonée, tel qu'une triple liaison C≡C ou un noyau aromatique complexé (e) par un composé organometallique de formule MxLy dans laquelle Mx représente un ou plusieurs métaux éventuellement différents et1. Marking molecule allowing the labeling of a peptide or a protein, or more generally of a compound of peptide or protein nature, characterized in that said labeling molecule comprises 1) at least one unsaturated organic site , in particular with carbon unsaturation, such as a C≡C triple bond or an aromatic nucleus complexed by an organometallic compound of formula M x L y in which Mx represents one or more metals which may be different and
Ly représente un ou plusieurs ligands éventuellement différents, complexant le ou les métaux, et,L y represents one or more ligands which may be different, complexing the metal or metals, and,
2) au moins une fonction carboxyle et/ou aminé, la fonction carboxyle étant éventuellement protégée ou activée et la fonction aminé étant éventuellement protégée.2) at least one carboxyl and / or amine function, the carboxyl function being optionally protected or activated and the amine function being optionally protected.
2. Molécule de marquage selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle répond à la formule générale (I)2. Marking molecule according to claim 1, characterized in that it corresponds to the general formula (I)
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0001
formule dans laquelle n est un nombre entier compris entre 1 et 6, de préférence n = 2 MxLy représente le composé organometallique tel que défini précédemmentformula in which n is an integer between 1 and 6, preferably n = 2 M x L y represents the organometallic compound as defined above
Z représente H ou un groupe de protection ou d'activation de la fonction carboxyle. Z represents H or a group for protecting or activating the carboxyl function.
3. Molécule de marquage selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle répond à la, formule :3. Marking molecule according to claim 1 or 2, characterized in that it corresponds to the, formula:
Figure imgf000030_0001
formule dans laquelle n. est un nombre entier compris entre 1 et 6, de préférence n = 2 MxLy représente le composé organometallique tel que défini précédemment R' est choisi notamment parmi -H, -SO3Na, les alkyls inférieurs en C1 à C7, et
Figure imgf000030_0001
formula in which n. is an integer between 1 and 6, preferably n = 2 M x L y represents the organometallic compound as defined above R 'is chosen in particular from -H, -SO 3 Na, lower C 1 to C 7 alkyls , and
R est choisi parmi les alkyls inférieurs en C1 à C 7.R is chosen from lower C 1 to C 7 alkyls.
4. Molécule de marquage selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle répond à la formule générale :4. Marking molecule according to claim 1 or 2, characterized in that it corresponds to the general formula:
Figure imgf000030_0002
Figure imgf000030_0002
5. Molécule selon, la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle répond à la formule générale5. Molecule according to claim 1, characterized in that it corresponds to the general formula
Figure imgf000030_0003
formule dans laquelle
Figure imgf000030_0003
formula in which
X représente H ou un groupe de protection de la fonction aminéX represents H or an amino function protection group
Y représente H ou un groupe de protection ou d'activation de la fonction carboxyle R1 représente une chaîne de dérivation d'un acide aminé naturel ou non naturel et comporte une triple liaison C≡C complexéepar un organometallique du type MxLy. Y represents H or a group for protecting or activating the carboxyl function R 1 represents a derivation chain of a natural or unnatural amino acid and comprises a triple bond C tripleC complexed by an organometallic of the type M x L y .
6. Molécule de marquage selon la revendi cation 5 , caractérisée en ce qu'elle répond à la formule générale III6. Marking molecule according to claim 5, characterized in that it corresponds to general formula III
Figure imgf000031_0001
dans laquelle
Figure imgf000031_0001
in which
X, Y et MxLy ont les significations données précédemment. X, Y and M x L y have the meanings given above.
7 . Molécule de marquage selon l'une des revendications 5 ou 6 , caractérisée en ce que le groupe de protection de la fonction aminé est choisi parmi le groupe acétyl et le groupe BOC, le groupe de protection de la fonction carboxyle est un alkyl inférieur en C1 à C7, le groupe d'activation de la fonction carboxyle étant choisi parmi le groupe succinimidyle et le groupe nitrophénate.7. Labeling molecule according to one of Claims 5 or 6, characterized in that the amino group protection group is chosen from the acetyl group and the BOC group, the carboxyl group protection group is a lower C alkyl 1 to C 7 , the activation group of the carboxyl function being chosen from the succinimidyl group and the nitrophenate group.
8. Molécule de marquage selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que les métaux du composé organométalliques sont choisis parmi les métaux des groupes VI, VII, VIII et IX de la classification périodique, notamment le chrome, le molybdène, le tungstène, le manganèse, le cobalt, le nickel, le technétium, le rhénium, le ruthénium et l'osmium. 8. Marking molecule according to one of the preceding claims, characterized in that the metals of the organometallic compound are chosen from the metals of groups VI, VII, VIII and IX of the periodic table, in particular chromium, molybdenum, tungsten , manganese, cobalt, nickel, technetium, rhenium, ruthenium and osmium.
9. Molécule de marquage selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que les ligands L du composé organometallique sont choisis parmi CO, CS, CSe, CNR1 , P(R2,R3,R4) cyclopentadiényle (Cp) , pbényle R1 étant notamment un radical alkyle ou -COR5 et R2, R3 , R4 et R5 étant notamment des radicaux phényle ou phénoxy substitué ou non, alkyle ou alcoxy en C1 à C7 substitué ou non ou bien un atome d'halogène, Rς pouvant être -N(CH2CH2Cl)2. 9. Labeling molecule according to one of the preceding claims, characterized in that the ligands L of the organometallic compound are chosen from CO, CS, CSe, CNR 1 , P (R 2 , R 3 , R 4 ) cyclopentadienyl (Cp) pbenyl R 1 being in particular an alkyl radical or -COR 5 and R 2 , R 3 , R 4 and R 5 being in particular phenyl or phenoxy radicals substituted or not, alkyl or C 1 to C 7 alkoxy substituted or not or alternatively a halogen atom, R ς possibly being -N (CH 2 CH 2 Cl) 2 .
10. Procédé de préparation d'une molécule de marquage selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on fait réagir une molécule comportant10. Method for preparing a labeling molecule according to one of the preceding claims, characterized in that a molecule comprising
1) au moins un site organique insaturé, notamment avec une insaturation carbonée, tel qu'une triple liaison ou un noyau aromatique, et1) at least one unsaturated organic site, in particular with a carbon unsaturation, such as a triple bond or an aromatic nucleus, and
2) au moins une fonction carboxyle et/ou aminé, éventuellement protégée ou activée qui se complexe sur le site insaturé, notamment dans le THF ou un mélange méthanol/acide acétique, avec un composé organometallique du type MxLy .2) at least one carboxyl and / or amino function, optionally protected or activated which complexes on the unsaturated site, in particular in THF or a methanol / acetic acid mixture, with an organometallic compound of the M x L y type .
11. Conjugué comportant la molécule de marquage selon l'une des revendications précédentes, liée à un peptide ou une protéine par l'intermédiaire d'une liaison peptidique du type lien amide entre la fonction aminé ou carboxyle éventuellement protégée ou activée de la molécule de marquage et respectivement une fonction carboxyle ou aminé du peptide ou de la protéine.11. Conjugate comprising the labeling molecule according to one of the preceding claims, linked to a peptide or a protein via a peptide bond of the amide link type between the amino or carboxyl function optionally protected or activated of the molecule. labeling and respectively a carboxyl or amino function of the peptide or the protein.
12. Procédé de préparation d'un conjugué selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on couple la fonction aminé ou carboxyle éventuellement protégée ou activéede la molécule de marquage avec une fonction carboxyle ou aminé respectivement du peptide ou de la protéine.12. A method of preparing a conjugate according to claim 9, characterized in that the amine or carboxyl function optionally protected or activated by the labeling molecule is coupled with a function carboxyl or amino respectively of the peptide or the protein.
13. Procédé de préparation d'un conjugué selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on couple une molécule comportant au moins un site organique insaturé, tel qu'une triple liaison CΞC et au moins une fonction carboxyle et/ou aminé par l'intermédiaire de ladite fonction carboxyle et/ou aminé à un peptide ou une protéine par l'intermédiaire respectivement d'une de ses fonctions aminé ou carboxyle, le site organique insaturé étant complexé par un composé organometallique de formule MxLy après ledit couplage.13. A method of preparing a conjugate according to claim 9, characterized in that one couples a molecule comprising at least one unsaturated organic site, such as a CΞC triple bond and at least one carboxyl and / or amino functional group. the intermediary of said carboxyl and / or amino function to a peptide or a protein respectively via one of its amino or carboxyl functions, the unsaturated organic site being complexed by an organometallic compound of formula M x L y after said coupling.
14. Utilisation des conjugués selon les revendications 11 et 12, à titre de traceur dans le cadre de dosages pour des diagnostics in vitro, et à titre d'agents d'imagerie pour des diagnostics in vitro, et à titre d'agents d'imagerie pour des diagnostics in vivo. 14. Use of the conjugates according to claims 11 and 12, as a tracer in the context of assays for in vitro diagnostics, and as imaging agents for in vitro diagnostics, and as agents imaging for in vivo diagnostics.
PCT/FR1989/000191 1988-04-22 1989-04-21 Cold marking of molecules of peptidic or proteinic nature WO1989010372A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8805361A FR2630547A1 (en) 1988-04-22 1988-04-22 COLD MARKING OF MOLECULES OF PEPTIDE OR PROTEIN NATURE
FR88/05361 1988-04-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1989010372A1 true WO1989010372A1 (en) 1989-11-02

Family

ID=9365577

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1989/000191 WO1989010372A1 (en) 1988-04-22 1989-04-21 Cold marking of molecules of peptidic or proteinic nature

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP0412104A1 (en)
FR (1) FR2630547A1 (en)
WO (1) WO1989010372A1 (en)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991014460A1 (en) * 1990-03-28 1991-10-03 Cockbain, Julian, Roderick, Michaelson Contrast media
WO1992017215A1 (en) * 1990-03-28 1992-10-15 Nycomed Salutar, Inc. Contrast media
WO1992019968A1 (en) * 1991-05-09 1992-11-12 British Technology Group Ltd. Spectroscopic investigation using organometallic compounds
WO1993002713A1 (en) 1991-08-05 1993-02-18 Mallinckrodt Medical, Inc. Heavy metal clusters for use as imaging agents
US5932190A (en) * 1991-03-27 1999-08-03 Nycomed Salutar, Inc. Multinuclear complexes for X-ray imaging

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2349084A1 (en) * 1973-09-29 1975-04-24 Basf Ag Peptide prepn. using metal carbene protective gp. - for amine function, which is easily incorporated and removed
FR2353854A1 (en) * 1976-05-31 1977-12-30 Technion Res & Dev Foundation SPECIFIC LINK ANALYSIS METHOD AND REAGENT
WO1988007684A2 (en) * 1987-04-03 1988-10-06 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs Infrared immunological dosing

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2349084A1 (en) * 1973-09-29 1975-04-24 Basf Ag Peptide prepn. using metal carbene protective gp. - for amine function, which is easily incorporated and removed
FR2353854A1 (en) * 1976-05-31 1977-12-30 Technion Res & Dev Foundation SPECIFIC LINK ANALYSIS METHOD AND REAGENT
WO1988007684A2 (en) * 1987-04-03 1988-10-06 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs Infrared immunological dosing

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bulletin of the Academy of Sciences of the USSR, Division of Chemical Science, Vol. 37, No. 2, partie 2, Fevrier 1988, Plenum Publishing Corporation, N.E. KOLOBOVA et al.: "Reactions of Propargylamines with Derivatives of Group VII and VIII Metal Carbonyls", pages 353-356 *
Chemische Berichte, Vol. 94, 1961 Weinheim, DE), U. KRUERKE et al.: "Reaktionen von Kobaltcarbonyl-Verbindungen mit Alkinen", pages 2829-2856 *
J. Org. Chem., Vol. 25, Mai 1960 (Washington, D.C., US), M.R. TIRPAK et al.: "Reaction of Dicobalt Octacarbonyl with some Acetylenic Compounds", pages 687-690 *
J. Org. Chem., Vol. 46, No. 26, 1981, American Chemical Society (Washington, D.C., US), M.C. CROUDACE et al.: "General Synthesis of Omega-Acetylenic Vinyl Esters and Ethers", pages 5357-5363 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991014460A1 (en) * 1990-03-28 1991-10-03 Cockbain, Julian, Roderick, Michaelson Contrast media
WO1992017215A1 (en) * 1990-03-28 1992-10-15 Nycomed Salutar, Inc. Contrast media
EP0645146A1 (en) * 1990-03-28 1995-03-29 Nycomed Imaging As Contrast media
US5932190A (en) * 1991-03-27 1999-08-03 Nycomed Salutar, Inc. Multinuclear complexes for X-ray imaging
WO1992019968A1 (en) * 1991-05-09 1992-11-12 British Technology Group Ltd. Spectroscopic investigation using organometallic compounds
WO1993002713A1 (en) 1991-08-05 1993-02-18 Mallinckrodt Medical, Inc. Heavy metal clusters for use as imaging agents
AU670029B2 (en) * 1991-08-05 1996-07-04 Mallinckrodt Medical, Inc. Heavy metal clusters for use as imaging agents

Also Published As

Publication number Publication date
FR2630547A1 (en) 1989-10-27
EP0412104A1 (en) 1991-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0180492B1 (en) Macropolycyclic complexes of rare earth metals and application as fluorescent labels
EP1848725B1 (en) Unsaturated dipyrromethene-boron borocarbons
JPH09136964A (en) Fulleren derivative as radical trapping agent
EP0541467A2 (en) Alkyldiamides with two sugar groups as amphiphilic compounds
FR2619382A1 (en) VANADYL ORGANO-MINERAL COMPOUND, PROCESS FOR OBTAINING SUCH A COMPOUND, PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THE ORGANO-MINERAL COMPOUND
TW591033B (en) Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
EP0038735B1 (en) Method for the preparation of compounds having a perfluoroalkyl group, in acid media containing zinc
DE69332349T2 (en) Water soluble tetraazaporphins and fluorochromes for labeling
EP2006276B1 (en) Process for the preparation of fullerene derivatives
EP0394126B1 (en) Compounds and complexes especially useful in medical imaging
WO1989010372A1 (en) Cold marking of molecules of peptidic or proteinic nature
US20030134824A1 (en) Beta-cyclodextrin dimers and phthalocyanines and uses thereof
FR2533570A1 (en) ORGANOMETALLIC COMPLEXES OF ESTROGENES AND THEIR APPLICATION TO THE ASSAY OF HORMONE RECEPTORS
Epstein et al. The synthesis of a photolabile detergent and its use in the isolation and characterization of protein
JPH0912605A (en) Cyclodextrin derivative, its preparation and use of cyclodextrin derivative for incorporating hydrophobic molecule into organic surface active system
CA2093896C (en) Hormone labelling with rhenium and technetium
EP2758391A1 (en) Luminescent probes for biological marking and imagery, and preparation method thereof
EP0565607B1 (en) Protection group, compoud protected by this group and device for grafting the protection group onto the compound being protected
FR2882055A1 (en) DIBENZOPYRROMETHENES-BORON BOROCARBONES UNSATURATED
FR2631965A1 (en) STEROID HORMONE RECEPTOR AFFINITY MARKERS, HORMONORADIOTHERAPY APPLICATION AND IMAGING AGENCIES FOR HORMONE-PENDING CANCERS
JP2629375B2 (en) Method for producing amino-protected dopa or dopa derivative
EP0338898B1 (en) Process for the preparation of an ortho-substituted mono-brominated derivative of phenol
CA1235064A (en) Antigen made up of oestradienic compositions and human and bovine albumin and method for obtaining antibodies
WO2013054046A1 (en) Luminescent probe for biological labelling and imaging, method for preparing same
FR2508905A1 (en)

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE

AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE

CR1 Correction of entry in section i

Free format text: IN PAT.BUL.26/89,UNDER INID (51) "IPC" REPLACE "C07F 15/00" BY "C07F 15/06"

XX Miscellaneous:

Free format text: IN PCT GAZETTE 27/89,PAGE 6986,UNDER "ANNOUNCEMENT OF THE LATER PUBLICATION OF INTERNATIONAL SEARCHREPORTS":DELETE"PCT/FR89/00191-WO89/10372"

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1989905418

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1989905418

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1989905418

Country of ref document: EP