WO1982003330A1 - Method for the preparation of antigens of the viral hepatitis nanb,and application to the preparation of a reaction agent allowing the diagnostic and pronostic of infections caused by the viruses of viral hepatitis - Google Patents

Method for the preparation of antigens of the viral hepatitis nanb,and application to the preparation of a reaction agent allowing the diagnostic and pronostic of infections caused by the viruses of viral hepatitis Download PDF

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    • C12N2770/24234Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the subject of the present invention is a process for the preparation of antigens for viral hepatitis NANB, and the application of these antigens to the production of a reagent allowing the diagnosis and prognosis of infections, symptomatic or not, caused by viral hepatitis virus.
  • - HB means: hepatitis B
  • - HBV means: hepatitis B virus
  • - NANB means: non-A non-B
  • virus A The virus responsible for human viral hepatitis has been identified.
  • virus B The virus responsible for human viral hepatitis has been identified.
  • hepatitis which is also precisely but not exclusively associated with blood transfusion, which illustrates well their transmissible viral nature, is not due to either virus A or virus B (see for example SM FEINSTONE et al, The New England Journal of Medicine, April 10, 1975, pages 707-710). In all countries, including France, these hepatitis are frequent and often asymptomatic.
  • NANB non-A non-B hepatitis
  • NANB viral hepatitis is only considered when the role of toxic and medicinal agents as well as that of HB and HA viruses can be eliminated by noting the absence of antigens, and / or of antibodies signifying the presence of these viruses, according to the known methods described for example in the following publications: - World Health Organization, Progress in viral hepatitis, Ser. Rapp. Techn., 1977, No. 602, 1-68; AJ Zuckermann, The Three types of human viral hepatitis, Bull OMS, 1977, 56, 1-20; R. SOHIER, Diagnosis of virus diseases, Flammarion, Médecine Sciences Edition, Paris, 1964, and updates until 1979.
  • the Ag NANB described appeared to have cross-reactivity with the HBe system, and more precisely with Ag HBe / 3 and not with the other specificities HBe / 1 and 2 (Vitvitski et al, J. Virol. Methods, 1: 149-156, 1980).
  • This demonstration suggested that the NANB Ag described was the equivalent for the NANB virus of HBeAg / 3 the physicochemical properties of Ag NANB (HANTZ et al, J. Med Virology 5: 73-86 (1980 ) and its location in the nucleus of hepatocytes reinforced this observation.
  • the Ag NANB has therefore been redesignated NANBe, and it is assumed that the Ag described by SHIRACHI corresponds to this Ag NANBe, taking into account the reaction observed.
  • the ultracentrifugation of the sera thus selected made it possible to find in the centrifugation pellets, the antigenic activity responsible for this second line of precipitation whereas the NANB / e antigenic activity is not found in the pellets after ultracentrifugation and remains in the supernatant.
  • the new antigen thus isolated then had difficulty in selecting, by immuno-diffusion reaction for example, sera containing the corresponding antibody.
  • Ag NANBs the new antigen discovered, hereinafter called Ag NANBs, is detected in the sera from approximately 10 to 20% of the patients with post-transfusion hepatitis, as well as in asymptomatic subjects with elevated transaminases, especially TGP, greater than or equal to twice the normal value.
  • Anti-NANBs (or anti-NANBs) antibodies are detected in a significant proportion, in convalescents, generally 1 to 12 months after normalization of the level of transaminases. They are also very common in polytransfused subjects or exposed by their activity to repeated contact with the virus.
  • Ag NANBc an antigen associated with the nucleocapsid of the NANB virus
  • a surface Ag or Ag NANBs therefore forms the envelope of the complete virus and is also synthesized in excess in the form of small particles very variable in size in the serum.
  • this Ag is produced by the cytoplasm of infected hepatocytes and also expressed on the cell membrane.
  • Anti-NANBs are the Acs which agglutinate these excess synthesized viral particles as well as the complete virus. These are therefore the protective Acs. Their presence in an individual protects him from infection as has been shown by the administration of convalescent gamma globulins.
  • Ag NANBs can serve as a marker of infection and allow the diagnosis of NANB viremia.
  • the frequent presence of Ag in low quantity, or the association of this Ag and Ac in the form of complex immunities explains that, very often, it is difficult to demonstrate by insensitive techniques the Ag NANBs .
  • the carrying out of a radioimmunological or immunoenzymatic test or a hemagglutination test makes it possible, thanks to the gain in sensitivity, to more easily detect the carriers of virus by demonstrating small quantities of Ag NANBs.
  • NANBc antigenic system corresponds to the nucleocapsid of the complete NANB virus which, in the serum, is enveloped. NANBc Ag is therefore not free in serum. It is only revealed after purification of the virions and bursting of the envelope with mild detergents (for example Tween 80 or Triton X100). NANBc Ag is synthesized in the nucleus of infected hepatocytes where it is easily detected by immunofluorescence and also by electron microscopy, where characteristic particles can be detected which have the ultrastructural appearance of nucleocapsides being formed in the nuclei.
  • the essential interest of the Ag / Ac NANBc system is therefore the diagnosis of NANB virus infections either acute or chronic and the possibility of distinguishing between current infections and past infections (depending on the presence or absence of IgM).
  • NANBc Ag of the various strains of NANB virus obtained from livers infected with these different strains It is therefore advantageous to use for the reagent of the invention several NANBc antigens of these different strains in order to have the most versatile test possible in particular for the detection of dangerous blood donors, these various NANBc antigens preferably being fixed on (or used with) the same reagent unit. Similarly, it is possible to use, for the same reagent, both an Ag NANBc and an Ag HBc.
  • the third Ag and Ac system linked to the NANB virus is the Ag / Ac NANBe system.
  • This system is the one that was initially discovered and first called Ag NANB before being redesignated Ag NANBe.
  • This antigenic system has an important diagnostic interest because the detection of the NANBe Ag or the corresponding Ac makes it possible to identify carriers of virus or to recognize that the NANB virus is responsible for an acute or chronic hepatitis.
  • Ag NANBe appears to be a group Ag common to several viruses of the same family.
  • Ag NANBe appears to be the Ag for which there is the most significant cross-reactivity between the various viruses of this family.
  • HBV Ag e3 NANBe Ag and also the Age of the groundhog hepatitis virus, cross-reactivity is considerable.
  • This Ag / e is also found in other species such as the underground squirrel.
  • NANBe Ag Another important characteristic of NANBe Ag is to be synthesized in NANB infections, in large excess, often in a higher capacity than Ag NANBs, which allows a gain of sensitivity.
  • the Ag NANBs and HBs have very little cross-reactivity exclusively demonstrable by very sensitive tests, while the Ag NANBc and NANBe have a greater cross-reactivity with the Ag HBc and HBe / 3 respectively.
  • the 3 Ag / Ac systems described above can be used as a basis for carrying out diagnostic tests for subjects infected with the NANB virus, whether symptomatic or not.
  • Several types of reagents have been produced. Their interests are distinct and often complementary.
  • the subject of the present invention is in particular a process for preparing purified antigens of viral hepatitis NANB, characterized in that serums or extracts of liver are selected in which the presence of NANB virus has been recognized, that ultracentrifugation is carried out to concentrate said viruses in the centrifugation pellet, which is collected and treated with a non-ionic detergent, which is left to incubate for 1 to 24 hours at a temperature between 0 and 37 ° C., that a fractionation is carried out to isolate the fractions containing purified NANBc Ag, then that, if desired, the said fractions are subjected to the action of an ionic detergent, incubated for 1 hour at around 24 hours at a temperature of 0 to 37oC, and isolates Ag NANBe.
  • nonionic detergents in particular aryl polyethers of alkylated glycol such as Triton X100, polyoxyethylene sorbitan monooleates such as Tween 80, or even NP 40.
  • anionic detergents such as SDS (sodium dodecyl sulfate) will be mentioned.
  • this process can also be used to purify Ag NANBs, by selecting as starting materials sera positive for Ag NANBs. It is possible, for example, to chromatograph on an agarose gel to which heparin is fixed (heparinogel) and to collect the eluates corresponding to a CINa concentration of 0.3 to 0.7M. The salts (mainly ClNa) are removed, for example by dialysis.
  • the subject of the invention is also to obtain purified NANB antigens, taking advantage of the notable cross-antigenicity between the NANB and HB viruses.
  • This process is characterized by the fact that animals are hyperimmunized with a fraction purified into a hepatitis B antigen, that the gamma globulins produced by hyperimmune animals are used to obtain the precipitation lines with sera containing a corresponding NANB antigen and free of HB antigens, and that the gamma globulins which have given precipitation lines are used to produce affinity chromatography supports which will make it possible to fix and purify the NANB antigens.
  • the antibodies obtained can be directly used in affinity chromatography to fix the NANB antigens.
  • the present invention also relates to a reagent for the diagnosis of viral hepatitis NANB or for revealing the stage of the course of the disease, including healing, characterized in that it comprises a support (or substrate) solid on which is fixed at least one NANBc, NANBe or NANBs antigen and / or at least one anti-NANBc, anti-NANBe or anti-NANBs antibody.
  • the antigen or the antibody can be fixed on the solid support by any known means for fixing the antigens and. antibodies, for example by adsorption, by covalent bond or not, for example by chemical coupling with a bifunctional coupling agent, by immunochemical affinity, etc.
  • the support can be made with any solid biological material (red blood cells) or synthetic endowed with adsorbent properties or capable of fixing a coupling agent.
  • solid biological material red blood cells
  • synthetic endowed with adsorbent properties or capable of fixing a coupling agent These materials are known and described in the literature.
  • solids capable of fixing Ag or Ac by adsorption include, for example, polystyrene, polypropylene, latex, etc.
  • the materials that can be used to fix Ag or Ac covalently using a coupling agent particular mention is made of dextran, cellulose, their amino derivatives such as diethylaminocellulose or diethylamino-dextran.
  • the support is for example in the form of a disc, tube, rod or ball.
  • Coupling agents making it possible to covalently fix the Ag or the Ac on the solid support are known; these are, for example, carboxylic derivatives, biofunctional derivatives such as dialdehydes (glutaraldehyde), diisocyanates (toluenediisocyanate), quinones (benzoquinone), etc.
  • the Ac or Ag can also be fixed on solid supports according to the methods described for example in French patents n ° 7623176, 7728161 and 7728163.
  • polystyrene beads or tubes use is made of polystyrene beads or tubes.
  • Such beads for example 1 to 5 mm in diameter, can be obtained commercially, as indicated in the experimental part below.
  • the reagent of the invention contains specific antibody fixed on the solid support.
  • the antibody is an Ag specific antibody to be detected (anti-NANB / c, / e or / s).
  • This reagent makes it possible in particular to detect the presence of the corresponding antigen, according to the so-called "sandwich” method, by contacting with a serum to be tested. After washing to remove the unbound molecules then subsequent contact with a preparation of the same antibody coupled to a tracer (also called conjugated antibody), washing is carried out to remove the excess of unbound conjugated antibody and then it is examined whether the antibody coupled to the tracer is fixed or not on the support. This is the so-called revelation stage. It is thus possible to determine whether the serum tested contained the antigen to be detected. In fact, if the antibody coupled to the tracer agent is attached to the support, it is because on the support the antibody-antigen-antibody conjugate complex has formed, and the desired antigen was therefore present. Otherwise, it can be concluded that the desired antigen is not present in the test serum.
  • This reagent also allows the detection of the corresponding Ag according to a method called "competition". For this, the reagent is brought into contact with the serum to be tested. After washing to remove the unbound molecules, the reagent is brought into contact with a preparation of Ag coupled to a tracer, the Ag being that against which the Ac fixed to the support is directed. Wash again and then examine the reagent to find the presence or absence of the conjugate antigen. If the conjugated Ag is fixed on the reagent, it is because the antibody sites were free and that the serum to be tested therefore did not contain Ag against the Ac fixed to the support.
  • the conjugated Ag does not bind or only binds in a small proportion, for example if the fixed quantity is more than 50% lower than the fixed quantity in the case of a control serum not containing the Ag sought, it is that the serum studied contained the same Ag as that coupled to the tracer, and that the Ac-Ag complex formed masked the antibody sites and prevented the binding of the conjugated Ag on the fixed Ac to the support.
  • the reagent of the invention contains fixed antigen on the solid support.
  • the antigen attached to the support is Ag NANB / c, / e, or / s.
  • This reagent makes it possible to detect the presence of antibodies corresponding to the antigen fixed according to the principle of the method "sandwich" already described above, by replacing of course the conjugated antibody with an Ag coupled to a tracer, this Ag being the one against which the Ac sought is directed. Depending on whether the conjugate Ag is fixed or not, we will conclude that the desired Ac is present or absent.
  • the reagent of this second embodiment can be used to detect the presence of anti-NANBs, antiNANBc or anti-NANBe antibodies according to the competition method already described, the conjugate being this time the corresponding antibody coupled to a tracer.
  • the conjugated Ac is fixed or is only fixed in a small proportion, we will conclude that the desired Ac is absent or present.
  • the antibodies used for the production or application of the reagents of the invention must be preparations of specific antibodies obtained either by hyperimmunization according to known methods using highly purified antigens either by affinity chromatography or by production of monoclonal Ab. It has in fact been found that, contrary to what was observed for HBV, the natural antibodies taken from humans did not make it possible to obtain a sufficiently sensitive reagent.
  • the Ag NANB of the reagent intended for the search for the corresponding antibody can be fixed on the support via the antibodies of the serum to be tested, according to a "reverse sandwich” method.
  • the reagent constituted by anti-antibody (human gamma globulin M or G) fixed on the support is used as an intermediate product.
  • This intermediate reagent brought into contact with the serum to be tested, fixes the gamma globulin M or G of the serum.
  • the support coated with gamma-globulins M or G of the serum to be tested, is brought into contact with the human anti-gamma globulins M or G, with a purified preparation of NANB hepatitis antigen, for example a purified preparation of Ag NANBc.
  • the support is then brought into contact with an antibody preparation corresponding to said purified antigen, said antibody being coupled to a tracer. It is then observed by revelation according to the usual methods if the antibody coupled to the tracer is fixed on the support. If it is fixed, it is because the serum studied contained antibodies against said purified antigen, and if it is not fixed, the serum studied did not contain said antibody.
  • the incubation of the reagent with the serum to be tested and with the preparations of Ag or of antibody coupled to the tracer is preferably carried out at alkaline pH (for example at pH 7 to 9), leaving to incubate for 1 at 48 hours, at a temperature between 5 and 50 ° C approximately.
  • a reagent unit for example a polystyrene bead
  • antibodies from 1 to 20 ⁇ g, for example approximately 10 ⁇ g;
  • the tracer is a radioactive or enzymatic tracer.
  • the tracer may be a radioactive tracer obtained for example by isotopic exchange with a radioactive isotope such as I 125.
  • radioactivity possibly present on the reagent of the invention after carrying out the test is evaluated according to the usual methods using an appropriate counter (gamma counter, or scintillation counter).
  • the coupling of antibodies or Ag with an enzymatic tracer is known per se and can be carried out for example according to a method analogous to that described by NAKANE, Journal Histochemistry Cytochemistry, 22: 1984-1991 (1974) which consists in fixing the enzyme on molecules of IgG which support the Ac function.
  • the enzyme is for example a peroxidase or an alkaline phosphatase.
  • the enzymatic activity possibly present on the reagent after carrying out a test can be determined according to known methods with an appropriate substrate allowing for example a revelation by colorimetry, by fluorescence, by luminescence, by potentiometry, etc.
  • This Ag is specific to the envelope of the NANB virus.
  • the more frequent NANB virus is designated by NANB1, and the description which follows relates more particularly to this virus, for simplicity. It is understood that the surface antigen of any related virus giving a cross-immunity reaction with the NANB1 virus can also be used.
  • This surface Ag appears in the serum of subjects infected with the NANB virus 2 to 4 weeks after a transfusion or an accidental injection. It precedes the elevation of transaminases when it occurs from 1 to 8 weeks sometimes more. It persists for the duration of their elevation and often after they have returned to normal. Its presence is a sign of NANB viremia and therefore of infectivity.
  • This Ag can be masked under certain conditions in the form of antigen-antibody complexes, and anti-NANBs antibodies can be detected in certain sick subjects. Their appearance is a sign of clinical improvement, but may not be an immediate sign of recovery.
  • Certain subjects can be carriers of Ag / Ac NANBs / anti-NANBs complexes in excess of Ac, which alone are then detected. These subjects are still infectious.
  • This purification can be carried out using for example at least one of the following methods:
  • a precipitating agent such as polyols, for example polyethylene glycol, or such as ammonium sulphate,
  • NANBs antigen is sometimes present in the form of immunocomplexes, it is then advantageous to dissociate said complexes either before the purification operation or by purifying under conditions ensuring this dissociation (for example at a sufficiently acidic or sufficiently alkaline pH).
  • a chromatography on a support, preferably porous, the surface of which is coated with a coating of anti-NANBs antibody molecules linked to the support by means of 'a coupling agent.
  • Support is by example consisting of Sepharose.
  • the coupling agent is for example a cyanogen halide.
  • the immunoabsorbent is placed in a column, a solution of the antigen to be purified is applied to this column, washed with a buffer.
  • the antigen is then eluted, an agent dissociating the antigen-antibody bond, for example with a buffer solution at acidic or on the contrary alkaline pH, because these extreme pH results in dissociation of the bond between Ag and Ac.
  • Fractions are collected in which the presence of proteins is identified by measuring the optical density at 280 nm, and the presence of the NANBs antigen is detected in the fractions, by the serological reactions with the anti-NANBs Ab: CEP (against -electrophoresis), and / or inhibition of immunofluorescence and radioimmunoprecipitation.
  • a gradient of a solution of an agent such as sucrose or cesium chloride is prepared, the solution to be purified is deposited on said gradient and an ultracentrifugation is carried out.
  • the fractions are collected in those corresponding to a density of 1.20 to 1.30 in CsCl and 1.15-1.25 in sucrose, the Ag NANBs are found in serology.
  • a gel of porous hydrophilic material is placed in a column, a fraction containing the antigen to be purified is applied to the column and the antigen is eluted. It is preferably carried out in an alkaline medium, which has a dissociating effect and which therefore makes it possible to recover the Ag NANBs present in the form of immunocomplexes.
  • a serum or a product is used as starting material.
  • defibrinated and concentrated plasma for example from 2 to 10 times.
  • the concentration can be carried out for example by precipitation of the proteins, in particular with polyethylene glycol or with ammonium sulphate and redissolution in an aqueous buffered solution.
  • the quantity of precipitating agent required for example 60% ammonium sulphate, is simply determined.
  • the purified Ag obtained in the previous paragraph is used to immunize animals which make it possible to obtain specific anti-NANBs antibodies.
  • a purified NANBs antigen preparation as described above is administered to an animal in combination with complete FREUND adjuvant or with any other adjuvant. At least one administration is carried out and preferably several.
  • the blood of the animal is taken at the time of the optimum desired level of Ac, after 1 to 4 months for example, and the blood is taken from which the serum is collected. We make sure that this serum does not contain normal human anti-protein antibodies. In immunodiffusion, the serum obtained will give a precipitation line with a serum of human origin containing the NANBs antigen.
  • the anti-NANBs Ac can be purified and isolated, according to known methods of purification and isolation of gamma globulins such as ethanol fractionation with ammonium sulphate or with Rivanol.
  • NANBs antibodies contained in the specific gamma globulin prepared are capable of aggregating NANB viral particles, including complete virions associated with DNA polymerase activity as can be demonstrated by precipitating complete virions marked with nucleotides radioactive.
  • anti-NANBs antibodies are coupled either with a radioactive tracer, for example with iodine 125 to obtain a radioimmunoassay, or with an enzymatic tracer, for example with peroxidase to obtain an immunoenzymatic test .
  • a radioactive tracer for example with iodine 125 to obtain a radioimmunoassay
  • an enzymatic tracer for example with peroxidase to obtain an immunoenzymatic test .
  • NANBc Ag can be purified from the liver or serum.
  • the purified NANBc Ag will make it possible to serve as a basis for carrying out a test for the anti-NANBc, for example by a DRI according to a competition method.
  • the indirect immunofluorescence test using various substrates from various patients and testing cases of NANB hepatitis of various origins has shown that there are variations of NANBc Ag depending on the strain of NANB virus involved.
  • NANBc Ag Two main types of NANBc Ag have so far been identified. They behave in an analogous manner and the extraction methods are identical for the 2 main types of NANB virus identified to date, designated by convention NANB1 and NANB2.
  • Anti-NANBc antibodies appear in the acute phase of the disease from the start of the rise in transaminases (at the same time as the NANBe antigen appears) and they persist throughout the duration of the disease and also during convalescence and remain present several years after illness. There is therefore no doubt, given the frequency of exposure to the NANB virus over the course of life, that a relatively large proportion of the population has antibodies.
  • the titer of the antibodies is maximum in the acute phase of the disease and if it cures their rate decreases.
  • anti-NANBc antibodies of the IgM class therefore takes on essential diagnostic interest since these will translate an infection in progress. If we just look for anti-NANBc IgM, they are only present in about 4 to 5% of blood donors. In acute hepatitis, anti-NAKBc IgM does not persist after normalization of transaminases in the majority of cases. On the other hand, in chronic hepatitis, the anti-NANBc IgM persists. The diagnostic value is therefore considerable.
  • a quantitative relationship has also been found between the presence of anti-NANBc at a high titer greater than 200 in DRI and an acute or chronic infection that is still evolving.
  • a titer greater than or equal to 40th always indicates that the virus replicates and therefore that the patient will be contagious.
  • radioimmunoassay a titer greater than 500th translates the current or persistent NANB viral replication and is always accompanied by anti-NANBc IgM.
  • the ultimate goal is to have a single test for tracking immediately of all potentially infectious blood vials, we can perform a test where on a solid support will be fixed on the one hand the HBc Ag allowing to detect anti-HBc and thus infectious subjects for the HB virus and other share of Ag NANBc 1 and 2 to identify the 2 main classes of NANBc virus.
  • the amount of anti-NANBc tracer is calculated to obtain the desired sensitivity corresponding to the desired threshold.
  • We thus have a versatile test which in 1st intention identifies all the viruses of the hepatitis family responsible for post transfusion hepatitis.
  • we can make a more detailed analysis by separating the anti-HBc-positive cases which are due to HBV from the other cases. Nor should we ignore the existence of double infections.
  • anti-human IgM antibodies of animal origin are fixed on the solid support, for example a polystyrene ball. (e.g. sheep, rabbit or others). This ball will therefore represent a trap for all IgM in human sera. If such a bead is incubated with a serum, it fixes the circulating IgM. In a second step, after washing, a fixed quantity of antigen is added, in this case either Ag NANBc1, NANBc2 or HBc or one of their mixtures, all in dilution in normal human serum. After incubation for 16 to 24 hours at room temperature, washing is carried out.
  • a polystyrene ball e.g. sheep, rabbit or others. This ball will therefore represent a trap for all IgM in human sera. If such a bead is incubated with a serum, it fixes the circulating IgM.
  • a fixed quantity of antigen is added, in this case either Ag NANBc1, NANBc2 or HBc or one of their mixtures,
  • an appropriate marker that is to say an anti-NANBc 1, anti-NANBc2, or anti-HBc antibody, or a mixture of these antibodies, coupled to a radioactive tracer or to an enzymatic tracer (for example peroxidase, which then gives a colored reaction when it is oxidized with the periodate) and according to the case one counts the radioactivity in a counter of radiation or one appreciates the positivity by the colored reaction with the using a photometer which quantifies it.
  • Anti-NANBc Ab can also be detected, with a support to which purified NANBc Ag is attached, according to the methods (sandwich or competition) described above.
  • NANBcl and NANBc2 Ags it is possible to carry out specific tests for each of the NANBcl and NANBc2 Ags, but it seems more logical to envisage carrying out a single test for the two most frequent NANB virus infections.
  • a mixture of the two Ag (NANBc1 + NANBc2) is used, fixed on a solid support by contacting in a phosphate buffer overnight at 4 ° C. After drying and washing, the sites possibly available on the support are then saturated with a protein solution such as hemoglobulin or bovine albumin.
  • the reagent constituted by the support thus coated with Ag will be used to carry out a test, for example according to the competition method. It is incubated for example with 200 ⁇ l of serum to be tested for 1 h at 37 ° C.
  • the corresponding Ac coupled to the tracer are made to act, for example the radioactive anti-NANBc Ac.
  • the maximum binding of these Ac translates the freedom of the NANBc sites on the support and therefore that the serum studied did not contain anti-NANBc Ac.
  • the serum studied contains the anti-NANBc Ab which is fixed on the support, provided antigen by making it inaccessible to radioactive antibodies subsequently brought into contact with it.
  • NANBe is the deepest Ag of viruses. It is a group Ag common to members of the hepatitis virus family, whether they are B or NANBe.
  • NANB hepatitis viruses do not cause cross-immunity has led to the belief that their envelope antigens are different but may belong to the same family of viruses that share the same NANBe Ag. This phenomenon has been demonstrated for the NANB virus, the HB virus as well as for a hepatitis virus from another animal species, that of the marmot since for the 3 viruses, HBeAg 3 or a cross-reaction can be demonstrated.
  • NANB serology The difficulties of NANB serology are linked to the frequent existence during NANB hepatitis of antigens which are not of viral origin but linked to the host and which are present in the acute phase of the disease and induce antibodies. .
  • These Ag can be found in a pathology and in conditions distinct from NANB hepatitis and are the source of many false reactions because they are normal constituents which can be observed in very many clinical circumstances with liver damage. 'very diverse origins,
  • Carrying out a specific test for Ag NANBe therefore requires 1) the purification of Ag NANBe, 2) the immunization of animals in order to obtain specific Acs of high titer and high affinity, 3) selection of monospecific monoclonal or polyclonal Ab. Thanks to these antibodies it is possible to carry out tests of increasing variable sensitivity and speci such as immunodiffusion, counterelectrophoresis and above all radio immunological assay (DRI) and immunoenzymatic (ELIZA).
  • DRI radio immunological assay
  • ELIZA immunoenzymatic
  • NANBe Ag is first prepared and purified from liver infected with a NANB virus.
  • a strong detergent agent that is to say an ionic detergent, in particular anionic detergent, such as SDS, is made to act.
  • a strong detergent agent that is to say an ionic detergent, in particular anionic detergent, such as SDS
  • This Ag is then used to immunize animals, for example rabbits to obtain anti-NANBe Ab which react in immunofluorescence to detect Ag NANBe in the nucleus of infected hepatocytes, which confirms their specificity.
  • These specific Ab can be used to detect NANBe Ag in serum by immunodiffusion and counterelectrophoresis.
  • This purified Ac also serves as a basis for producing the reagent according to the invention, making it possible to carry out a so-called sandwich DRI test or else an immunoenzymatic test which will be detailed below.
  • Serum Ag NANBe can also be purified by absorption chromatography. It was discovered that Ag NANBe in particular had an elective affinity for heparinogel. This served as the basis for the development of a purification according to this principle: in a first step, the serum containing Ag NANBe is applied to a heparinogel column, where it is fixed and it is found that the Ag NANBe is retained on the column; in one 2nd time, elution is carried out and the positive NANBe fractions are collected.
  • the immune sera obtained are incubated for 2 h at 37 ° C. (or 24h at + 4 ° C.) obtained on normal human serum, polymerized by treatment with glutaraldehyde and on normal human liver shredded also insolubilized with glutaraldehyde. The operation is repeated until all reactivity against normal sera or extracts of liver has disappeared. Only the anti-NANBe activity then remains.
  • a fourth possibility consists in carrying out a selective absorption of the anti-NANBe Ab by affinity chromatography on a support coated with purified Ag NANBe, according to known methods.
  • This precipitating system can be detected in particular for:
  • CEP counterelectrophoresis
  • DRI radio immunological assay
  • One of the characteristics of the invention is to have specified the possibility of detecting asymptomatic infectious donors by several specific serological tests allowing the detection of Ag NANBs, Ag NANBe, and antiNANBc / 1 and 2 Ab , each of the tests having its own interest.
  • a second characteristic of this discovery is the characterization of the biology and virology of viruses NANB, and the demonstration of very variable differences in the behavior of the viral markers NANB s, e and c, and a very different evolution compared to the HB virus.
  • Ag NANBs is much less abundant than in HBV infections, on the other hand, Ag NANBe is produced in it in quantities equal if not more important than in hepatitis B, and often higher than those of Ag NANBs. A test based on Ag NANBe will therefore be more sensitive in certain cases.
  • NANBe and NANBs evolve in a similar way and disappear by episodes of the serum:
  • the reagent thus produced will be incubated with the serum to be tested. If there are Ag NANBs or NANBe these will settle. Wash and incubate with a mixture of anti-NANB / s + e Ac, labeled with a tracer (enzymatic in the case of an ELISA test).
  • anti-NANBc Ab As follows. To the reagent which carries the anti-NANBc / 1 + 2 Ab, a determined amount of Ag NANBc / 1 + 2 diluted in normal human serum is added. We then add the serum where we want to detect anti-NANBc / 1 + 2 Ab, and anti-NANBc / 1 + 2 Ab coupled to a tracer radioactive, for example I 125. After incubation, if the serum to be tested contains anti-NANBc / 1 + 2 Ab, these will decrease the binding of the marked Ab of the tracer to the reagent to which the NANBc Ag / 1 + 2.
  • the proposed test is a two-step test or a double test, one being an immunoenzymatic test, the other a radioimmunological test.
  • the proposed test is a two-step test or a double test, one being an immunoenzymatic test, the other a radioimmunological test.
  • the first phase is an immunoenzymatic test looking for both NANB / e and s according to the sandwich method
  • the second phase is a radioimmunological test looking for anti-NANBc / 1 + 2 according to a principle of competition between the Ab to be tested and the Ab attached to the tracer.
  • Another important aspect of the invention is therefore the demonstration of a cross reactivity between the Ags of viruses B and NANB maximum for HBe / 3 and NANBe, intermediate HBc and NANBc / 1 and 2, and very weak but not zero for HBs and NANBs (in immunodiffusion with highly purified Ab).
  • the tracer is also a mixture of the 3 Ab coupled to either I 125 in DRI or to an enzyme (alkaline phosphatase or peroxidase) in Elisa.
  • the reagent is then brought into contact with a preparation of anti-HBs, anti-NANBs and anti-NANBe antibodies coupled to a tracer different from that chosen for the 1st step, therefore here enzymatic, peroxidase for example.
  • Polystyrene beads sold by the company PRECISION PLASTIC BALL (U.S.A.) are used.
  • the beads are washed in pure ethanol with vigorous stirring overnight at room temperature. They are then washed with distilled water and dried in an oven at 37 ° C.
  • the IgGs are precipitated by the addition of a 33% ammonium sulphate solution.
  • the gammaglobulins are then purified precipitated by DEAE Cellulose gel chromatography according to known methods for the purification of gamma globulins.
  • the fractions containing the IgGs are diluted in a 0.01M tris buffer of pH 7.2 to a concentration of 50 ⁇ g / ml.
  • the beads are incubated in the diluted solution, with gentle agitation, for 18 hours at room temperature.
  • the beads thus incubated are separated and then they are incubated in a solution of bovine albumin at 5% in 0.02M phosphate buffer, 0.3M glygocolle of pH 7.5.
  • the beads After incubation for 4 hours at room temperature, shaking gently from time to time, the beads are separated, washed with distilled water and dried at 37 ° C. They can then be stored at a temperature of 4 ° C.
  • the reagent constituted by the beads thus obtained can be used for the detection of the antigen corresponding to the fixed antibody, according to a method called "sandwich" which is described below.
  • the bead is then incubated in 200 ⁇ l of a radioactive tracer for 4 hours at 37oC.
  • the ball is washed and then a radioactivity count is carried out for one minute with a PACKARD type gamma radiation spectrometer for example. This is done by comparison with control sera recognized to be negative with NANBe Ag. Sera for which a number of counts per minute twice the number of counts per minute observed for negative control sera are observed, are considered to be positive.
  • the radioactive tracer is prepared as follows:
  • the diluent has the following formula:
  • the labeling according to the method described by GREENWOOD is carried out for example as follows: 1.5 mCi of sodium iodide labeled with radioactive iodine is used, which is added to 50 ⁇ l of IgG (anti- Purified NANBe) at 1 g / l in solution in 0.05M phosphate buffer pH 7.5. Chloramine T and metabisulfite are then added according to the GREENWOOD method.
  • the solution obtained is then passed through a DOWEX 2X 8000 column with a gel diameter of 100-200 mesh.
  • a DOWEX 2X 8000 column with a gel diameter of 100-200 mesh.
  • 3 ml of eluate are collected and passed over a column of SEPHADEX G25% (10 ml of gel).
  • the first five milliliters eluted after the dead volume of the column are recovered. They contain the antibody labeled with radioactive iodine.
  • a liver homogenate is prepared by grinding from an autopsy liver of a patient who has died of NANB hepatitis and whose liver has been found positive in direct immunofluorescence with an antiNANBc conjugated for the corresponding Ag NANBcl or 2.
  • the raw ground material is filtered.
  • the homogenate is centrifuged for 20 minutes at 4000g (+ 4oC).
  • the pellet is resuspended in the same buffer, homogenized and centrifuged for 20 minutes at 4000 g. This operation is repeated 2 times.
  • the final pellet is resuspended in a Tris -HCl buffer pH 7.6 0.05M + 0.15 M NaCl + non-ionic detergent NP 40 0.1% + ⁇ mercaptoethanol 0.02% + pronase E (70,000 PUK / g MERCK ) at a final concentration of 0.1%.
  • the gradient is collected by the bottom of the tube in fractions of 1.2 ml which are dialyzed after reading the index on a reparometer.
  • the positive fractions are collected and centrifuged on a 10-20% sucrose cushion.
  • NANBc1 and 2 (or HBc) capsid antigens from serum.
  • a very positive NANBe serum from blood donors or patients and if possible from immunocompromised subjects such as hemodialysis patients and leukemia patients who are reputed to have large quantities of circulating virus, having a very high titer of Ag NANBe for example 1/8 in CEP as well as Ag NANBs, and especially for which, by making the DNA polymerase reaction on a pellet of ultracentrifugation of the serum thus identified, there is DNA polymerase activity. Having thus identified the subjects which may represent interesting sources of complete virus, a large quantity of plasma or serum is obtained from them either during a blood donation or during a plasmapheresis followed by recalcification of the plasma. An ultracentrifugation is then carried out.
  • fractions are collected from the bottom of the tube which is perforated. 0.5 ml fractions are collected on which the refractive index will be measured in the ABBE refractometer the DNA polymerase activity and the Ag NANBs. We will select the positive fractions for the DNA polymerase activity if we make sure in electron microscopy that they contain the complete double membrane viral particle corresponding to the complete virion.
  • this fraction is taken up and the recentrifuge, after having mixed it with 2 volumes of solution rich in complete viral particles with 1 volume of detergent Nonitet P40 10% (Shell Company), on a 15-55% sucrose entampon TSA gradient as described above for purification from the liver.
  • the fractions are tested for DNA polymerase activity and NANBc capsid Ag by CEP.
  • the positive Ag fractions are collected and treated as described above. They will be used to prepare the reagent.
  • a serum is positive if the number of counts / minute is less than 50% of that obtained for the average of the negative control sera, ie an inhibition of more than 50% of the radioactivity.
  • an enzymatic tracer represented by labeling of antibodies to peroxidase (HRP), RZ30 Boehringer Manheim bH West Germany, can be used. This coupling is made according to the method of Nakane, Journal Histochemistry Cytochemistry, 22: 1084-1091 (1974).
  • a polystyrene bead is initially coupled with the anti-human IgM, sheep or rabbit antibodies, these are the same ball coupling conditions as for the anti-NANBe antibodies (see example 1).
  • the tracer is not simply produced by labeling the complete antibodies with radioactive iodine, they are partially cut antibodies which are called fragments F (ab ′) 2 this in order to avoid a nonspecific reaction with rheumatoid factor which is a nonspecific anti-IgM for hepatitis. Therefore anti-NANBc antibodies of class IgG are transformed into F (ab ') 2 fragments by the Rossi method (Nature 223: 837, 1969).
  • the small peptides and the F fragments (c ') are removed by gel filtration on Sephadex G50. IgGs not digested by the action of pepsin are eliminated by absorption on an immunoabsorbent column coupled to an anti-human Gamma F (c) antibody coupled to Sepharose 4B by cyanogen bromide.
  • Very high titer anti-NANBc 1 and 2 antibodies can either be obtained from patients whose serum appears in immunofluorescence to have titers higher than 1 / 100th in indirect IF, or from animals immunized with NANBc 1 and 2 Ag. These antibodies can either be directly conjugated to the radioactive or enzymatic tracer, or can be used for the preparation of the F (ab ') 2 fragments. Conversely, the purified NANBc1 NANBc2 Ag can be used and immunize rabbits or guinea pigs with these antigens as described for the preparation of anti-NANBe from purified NANBe Ag. EXAMPLE 3 - Purification of Ag NANBs
  • Ag NANBs can be purified for example as follows.
  • transaminase disturbances in particular TGP
  • gammas glutamyl transpeptidases in more or less symptomatic consultants
  • a chromatography column is equilibrated with 0.05 M 0.15 M HCl buffer, pH 7.6.
  • a seric fraction enriched with NANBs antigen is applied to the column (by prior precipitation with 60% ammonium sulfate followed by dialysis against the same buffer), such a fraction of 5 ml reacting strongly for the NANBs antigen is placed on the column.
  • the elution is carried out with the same buffer and the flow rate is adjusted to 25 ml per hour. 5ml fractions are collected and tested for the NANBs antigen and for the NANBe antigen in immunodiffusion and CEP (counterelectrophoresis).
  • NANBs antigen is detected in the first fractions, immediately after the column exclusion volume. It is in these first fractions that the highest titer of NANBs antigen is observed, reaching 1/32 in C.E.P. Subsequent fractions have a lower title. And they are also positive for the NANBe antigen. The very positive NANBs fractions are combined and ironed again on the column to increase the quality of the separation.
  • NANBs fractions are combined again and concentrated to optionally subject them to subsequent purification steps.
  • the NANBs antigen can also be isolated by ultracentrifugation in a density gradient of sucrose or cesium chloride.
  • the anti-NANBs gamma globulins are coupled to Sepanose 4B activated with cyanogen bromide (4B CNBR-Pharmacia - UPSALA- Sweden), according to the method described by CUATRECASAS and AFINSEN in Ann. Rev. Biochem.
  • a MAGNOGEL immunosorbent was used, activated with glutaraldehyde and coupled with anti-NANBs immunoglobulins.
  • a 2 ⁇ 11 cm Sepharose column coupled to the anti-NANBs is used.
  • the column is equilibrated with the buffer at room temperature. 25ml of the concentrated solution containing high titer NANBs antigen is added. This solution is diluted half with the buffer and left for 1 hour at 37oC. to promote adsorption. The column is then placed at + 4oC and washed with borate buffer until the optical density of the fractions becomes zero.
  • the NANBs antigen is eluted from the column with a 0.1M phosphate buffer, pH 10.8.
  • the 5ml fractions are collected and the optical density at 280nm measured. Immediately brought to a physiological pH by adding NANBs and all the positive fractions are combined and concentrated by ultrafiltration on an AMICON filter retaining all the proteins having a molecular weight greater than 30,000.
  • Ag NANBe positive sera in ID and CEP are selected. After filtration through a millipore (pore diameter 0.45 microns) for clarification, it is subjected to ultracentrifugation for 2 hours at 300,000 g. The supernatants are collected (the pellets can be used to isolate the NANB viruses sought by the activity of DNA polymerase).
  • a 33% solution of ammonium sulfate (SA) is added to the supernatant in an amount of 0.5 vol. of ammonium sulphate solution for 1 volume of supernatant for an SA concentration of 33% in order to precipitate in particular the gamma globulins. The precipitate is eliminated by centrifugation (it is possible to search in this precipitate for the presence of antiNANB antibodies).
  • the fraction thus obtained is chromatographed on a column filled with 200 ml of Ultragel IBF heparin (heparin fixed on agarose gel) balanced in Tl buffer (Tris 0.05M, 0.15 M NaCl, 0.02% NaN 3 , 0.025M CaCl 2 , pH 7.6), depositing 5 ml of said fraction.
  • Ultragel IBF heparin heparin fixed on agarose gel
  • Tl buffer Tris 0.05M, 0.15 M NaCl, 0.02% NaN 3 , 0.025M CaCl 2 , pH 7.6
  • the Ag NANBe is then eluted with a gradient of aqueous sodium chloride solution in the T2 buffer obtained by gradually adding (0.5 ml / minute) a 0.05M Tris solution 0.01M EDTA 0.01 M 2.5 M NaCl in a bottle, fitted with an agitator, containing 300 ml of T2 buffer. 10 ml fractions are collected (approximately 50 fractions), by evaluating the Nacl concentration in the ABBE refractor. The gradients ranged from 0.15 M to 1.2 M NaCl. The fractions are dialyzed against TSA buffer, then reconcentrated by ultrafiltration (limit 10,000 daltons) to approximately lml.
  • the positive Ag NANBc fraction obtained in Example 2 a) is used as the starting product after ultracentrifugation in a sucrose gradient to 4 ml of this fraction, 1.33 ml of 0.5% ⁇ -mercaptoethanol and 1 are added, 33 ml of 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS), i.e. a final concentration of 0.1% in ⁇ -mercaptoethanol and 0.1% in SDS, incubated for 2 1/2 hours at 37 ° C, then dialyzed for 20 hours at + 4 ° C against PBS buffer.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • a fraction rich in Ag NANBe is obtained which can be used for example to immunize rabbits. For this, it is filtered on a 0.22 micron sterile raillipore membrane previously saturated with normal rabbit serum.
  • This Ag NANBs, anti-HBs / anti-a rabbit Ac mixture will be used to immunize rabbits which will react against Ag NANBs alone because the rabbits do not react against their own gamma globulins. After adequate simulation of the rabbits, we succeed in obtaining in some of them an anti-NANBs response which is no longer anti HBs.
  • These Acs are taken up after purification on DEAE cellulose of the IgGs to carry out an affinity chromatography and this makes it possible, from Ag NANBs fractions, to purify this Ag according to the methods already described.
  • the new Ag of NANBs of increased purity thus prepared is again used to immunize rabbits which will serve as a source of anti-NANBs of higher purity and high affinity, including through the selection of fractions of class IgM Ac which are particularly useful in carrying out sensitive tests aimed at detecting Ag NANBs in DRI.
  • the most purified Ag NANBs can also be used to prepare anti-NANBs monoclonal Ab by immunization of mice then fusion of splenic lymphocytes with myeloma lymphocytes according to the hybridoma technique described by MILSTEIN and his collaborators.
  • the ability to produce the anti-NANBs Ab by the cell clones which will be selected is made by the indirect immunofluorescence tests on Ag NANBs substrates or by counter-electrophoresis or DRI precipitation (with Ag NANBs and beads anti-NANBs).
  • the method described here for Ag NANBs can also be used for the purification of Ag NANBe starting from the cross reactivity with Ag HBe / 3 and also for Ag NANBc starting from the cross reaction with HBC. In these 2 cases, it is already possible directly from Ac-anti HBe / 3, for example to make a first affinity chromatography, on a support coupled to anti HBe / 3, making it possible to obtain concentrated fractions of Ag NANBe.
  • the anti-HBe / 3 rabbit CAs are used to prepare precipitation lines with Ag NANBe, with which new rabbits are immunized and anti-HBe / 3 rabbits are restimulated.
  • the anti-a / Ag NANBs precipitation lines (or any other preparation of purified Ag NANBs) are used to stimulate the animal.
  • Anti-NANBs Ac are thus obtained.
  • the chimpanzee it can be restimulated with Ag NANBs of chimpanzee obtained by transmitting NANB virus to an animal or by using any plasma of chimpanzee Ag NANBs detected in animals naturally or experimentally infected with the NANB virus.
  • Marmots are hyperimmune to anti-WHs or anti-WHe Ab with Ag WHs and WHe purified from marmot serum.
  • the formation of Ac is then stimulated against the common determinant between the WHV and NANB virus by the devices described above for Ag e, s or c.
  • a subject of the invention is also the preparation of monoclonal Ab against the determinants common to the surface Ag of the NANB and HB viruses, by using the property of cross-antigenicity with the corresponding Ag of HBV.
  • An animal is successively stimulated with the Ags of the hepatitis B and NANB viruses, it is checked that the animal has well developed antibodies against HBV and VHNANB, the said animal is again stimulated for injection of one of said Ags (for example Ag NANBs), then, after the time necessary for the development of the antibody response, lymphocytes are collected from said animal, merged with a myeloma lymphocyte line, cultures of the hybrids obtained, and cloning the hybrids producing antibodies are obtained. both anti-HBs and anti-NANBs.
  • Ags for example Ag NANBs
  • a mouse is immunized with for example 5-15 micrograms of partially purified Ag NANBs. 10 to 20 days later, stimulation is carried out with 5-15 micrograms of purified HBsAg. It is checked 7-15 days later that the mouse has well developed anti-NANBs Ab (verification made by immunofluorescence on a liver biopsy with cytoplasmic or membrane Ag NANBs or by DRI as described) but also that it has makes anti-HBs Ab (verification made using commercial reagents).
  • a third injection of Ag NANBs is then made. 48 hours later the spleen of the mice is removed and the lymphocytes are collected. These are fused with a myeloma lymphocyte line of mice, and hybrids are obtained, in a known manner. Cultures are carried out in microplates in a known manner, of these hybrids. When the cultures are well established, the supernatants of each microplate well are tested for the presence of anti-HBs Ab (by commercial reagent) and anti-NANBs Ab by immunofluorescence and / or DRI. The lymphocytes from the wells producing both anti-HBs and anti-NANBs Ab are then cloned in a known manner.
  • the Ac are directed against the determinants common to HBV and NANB virus.
  • the antibodies thus obtained are then fixed by coupling on polystyrene beads, as described above.
  • the unique reagent thus obtained makes it possible to detect both Ags of HB virus and Ags of NANB virus, as well as the corresponding antibodies.
  • Ag NANBs positive sera are selected and concentrated by precipitation with 60% ammonium sulfate. After dialysis, the concentrated preparation is chromatographed on a column containing 200 ml of Ultragel IBF heparin balanced in buffer T 1 (see example 4), with a slow flow of 0.2 ml / minute. The column is then washed with 200 ml of T 1 and then with 100 ml of T 2 (in accordance with example 4). The Ag NANBs are then eluted with a NaCl gradient in the buffer T 2 obtained by gradually adding (0.5 ml / minute) a 0.05M Tris solution 0.01M EDTA 0.01 M 2.5M NaCl in a 300 ml flask of T 2 .
  • the purification of Ag NANBs can also be carried out as described by KAPLAN, Vox Sanguinis, 1978, Vol. 35, p. 224-233.

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Abstract

Method for the preparation of purified antigens of viral hepatitis NANB and application. This method is particularly characterized by the selection of serums or liver extracts wherein the presence of NANB virus has been recognized, the ultracentrifugation to concentrate said viruses in the centrifugation base, the collection and treatment of said base by means of a non ionic detergent that is allowed to incubate during 1 to 24 hours at a temperature comprised between 0 and 37?oC, a fractionning to isolate the fractions containing purified the Ag NANBc, and then, if desired, said fractions are subjected to the action of an ionic detergent, incubation during 1 to 24 hours approximately at a temperature comprised between 0 and 37?oC, and the Ag NANBe is isolated. Application to the obtention of a reaction agent allowing particularly the diagnostic of viral hepatitis NANB.

Description

Procédé de préparation d'antigènes de l'hépatite virale NANB, et application à la réalisation d'un réactif permettant le diagnostic et le pronostic des infections provoquées par les virus des hépatites virales. Method for preparing NANB viral hepatitis antigens, and application to the production of a reagent for the diagnosis and prognosis of infections caused by viral hepatitis viruses.
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'antigènes de l'hépatite virale NANB, et l'application de ces antigènes â la réalisation d'un réactif permettant le diagnostic et le pronostic des infections, symptomatiques ou non, provoquées par les virus des hépatites virales.The subject of the present invention is a process for the preparation of antigens for viral hepatitis NANB, and the application of these antigens to the production of a reagent allowing the diagnosis and prognosis of infections, symptomatic or not, caused by viral hepatitis virus.
Dans ce qui suit, on utilisera les abréviations suivantes:In the following, the following abbreviations will be used:
- Ag signifie : antigène- Ag means: antigen
- Ac signifie : anticorps- Ac means: antibody
- HB signifie : hépatite B- HB means: hepatitis B
- VHB signifie : virus de l'hépatite B- HBV means: hepatitis B virus
- NANB signifie : non-A non-B- NANB means: non-A non-B
- IgM signifie : immuno-globulines M- IgM means: immunoglobulins M
- IgG signifie : immuno-globulines G- IgG means: immunoglobulins G
- ID signifie : immunodiffusion- ID means: immunodiffusion
- CEP signifie : contre-électrophorèse- CEP means: counter-electrophoresis
- DRI signifie : dosage radio-immunologique- DRI means: radioimmunoassay
- ELISA désigne un test immunoenzymatique (Enzyme linked immunosorbent assay)- ELISA designates an enzyme linked immunosorbent assay
- WH : hépatite de la marmotte. Trois système Ag - Ac ont été découverts en relation avec le virus de l'hépatite NANB.- WH: groundhog hepatitis. Three Ag - Ac systems have been discovered in relation to the hepatitis NANB virus.
On sait que deux virus responsables de l'hépatite virale humaine ont été identifiés, le virus A et le virus B.It is known that two viruses responsible for human viral hepatitis have been identified, virus A and virus B.
L'hépatite à virus A, volontiers ëpidémique, d'incubation courte (environ 30 jours) est transmise par voie "fécale-orale" et pratiquement jamais par transfusion.Hepatitis A virus, readily epidemic, short incubation (about 30 days) is transmitted by "fecal-oral" and almost never by transfusion.
L'hépatite due au virus B au contraire est observée volontiers mais non exclusivement chez les patients ayant subi des transfusions sanguines.On the contrary, hepatitis due to virus B is observed willingly but not exclusively in patients who have undergone blood transfusions.
D'autres hépatites qui sont également précisément mais non exclusivement associées à la transfusion sanguine, ce qui illustre bien leur nature virale transmissible, ne sont dues ni au virus A ni au virus B (voir par exemple S.M FEINSTONE et al, The New England Journal of Medicine, 10 Avril 1975, pages 707-710). Dans tous les pays, y compris la France, ces hépatites sont fréquentes et souvent asymptomatiques.Other hepatitis which is also precisely but not exclusively associated with blood transfusion, which illustrates well their transmissible viral nature, is not due to either virus A or virus B (see for example SM FEINSTONE et al, The New England Journal of Medicine, April 10, 1975, pages 707-710). In all countries, including France, these hepatitis are frequent and often asymptomatic.
Leur incubation est variable, de 2 â 20 semaines, avec une fréquence maximale de 6 à 14 semaines. Leur aspect clinique ne permet pas de les distinguer des autres hépatites virales, toxiques ou médicamenteuses. Leur tendance à évoluer vers la chronicité est redoutable. Leur épidémiologie est voisine de celle des hépatites B. On les désigne par le terme "hépatite non-A non-B" (ou NANB).Their incubation is variable, from 2 to 20 weeks, with a maximum frequency of 6 to 14 weeks. Their clinical appearance does not allow them to be distinguished from other viral, toxic or medicinal hepatitis. Their tendency to evolve towards chronicity is formidable. Their epidemiology is similar to that of hepatitis B. They are designated by the term "non-A non-B hepatitis" (or NANB).
Il existe une infectiosité prolongée du sang traduisant un partage chronique du virus avec une virémie persistante qui peut être complètement latente. 3% au moins des donneurs de sang bénévoles et jusqu'à 30% des donneurs payés aux U.S.A paraissent ainsi infectés à leur insu et sont susceptibles de transmettre l'hépatite par la transfusion. Malgré l'importance de ce problême on ne disposait jusqu'à présent d'aucune méthode, en dehors de la transmission au chimpanzé permettant de diagnostiquer qu'une hépatite était due à un virus non-A non-B ou qu'un donneur de sang pouvait être infectieux et transmettre la maladie au receveur de son sang ou des produits qui en sont dérivés. Les tests de dysfonctionnement hépatique les plus sensibles tels que l'élévation des transaminases SGPT ne sont susceptibles de reconnaître que 50% de ces donneurs de sang infectieux. De plus le test des transaminases n'est pas spécifique car leur taux élevé est observé dans d'autres circonstances pathologiques hépatiques (lithiase bilaire alcoolisme etc...) n'ayant rien à voir avec l'hépatite virale NANB.There is a prolonged infectivity of the blood reflecting a chronic sharing of the virus with a persistent viremia which can be completely latent. At least 3% of voluntary blood donors and up to 30% of donors paid in the USA thus appear to be infected without their knowledge and are likely to transmit hepatitis by transfusion. Despite the importance of this problem, no method has yet been available, apart from transmission to the chimpanzee, making it possible to diagnose that hepatitis was due to a non-A non-B virus or that a donor of blood could be infectious and transmit the disease to the recipient of his blood or blood products. The most sensitive liver dysfunction tests such as elevated SGPT transaminases are only likely to recognize 50% of these infectious blood donors. In addition, the transaminase test is not specific because their high level is observed in other hepatic pathological circumstances (bilious lithiasis alcoholism, etc.) having nothing to do with NANB viral hepatitis.
En 1978 SHIRACHI décrivit pour la première fois la détection en ID d'un Ag sérique présumé associé aux hépatites NANB. Le test en ID décrit ne paraissait cependant pas strictement spécifique des hépatites NANB puisqu'il se retrouvait positif dans 10% des hépatites B. Au cours du symposium international, tenu en Juin 1980 à Vienne, consacré aux hépatites NANB plusieurs tests d'ID décrits par divers auteurs y compris SHIRACHI se sont avérés non reproductibles et non spécifiques puisqu'ils ont conduit à considérer comme positif un sérum témoin (voir aussi SUH, Lancet 1:178-180, 1981) le réactif de l'invention permet d'éviter ces inconvénients.In 1978 SHIRACHI described for the first time the detection in ID of a suspected serum Ag associated with hepatitis NANB. The ID test described did not, however, appear to be strictly specific for NANB hepatitis since it was found to be positive in 10% of hepatitis B. During the international symposium, held in June 1980 in Vienna, devoted to NANB hepatitis, several ID tests described by various authors including SHIRACHI have proven to be non-reproducible and non-specific since they have led to consider as positive a control serum (see also SUH, Lancet 1: 178-180, 1981) the reagent of the invention makes it possible to avoid these disadvantages.
Les tests ou dosages radio-imraunologique décrits par d'autres auteurs se sont également avérés non spécifiques; voir NEURATH, Journal Gen. Virol., 48 285-295 (1980). On va décrire ci-après les travaux qui ont conduit à la mise au point du réactif de l'invention.The radioimmunological tests or assays described by other authors have also been found to be non-specific; see NEURATH, Journal Gen. Virol., 48 285-295 (1980). The work which led to the development of the reagent of the invention will be described below.
En faisant réagir des sérums de polytransfusés ou de convalescents d'hépatite NANB avec des sérums prélevés à la phase précoce de la maladie, il a été possible de mettre en évidence, grâce â 1 'immuno-diffusion, des lignes de précipitation entre des sérums de convalescents ou de polytransfusés, et les sérums d'hépatite NANB à la phase aigϋe. Ces lignes de précipitation identifiant des Ag nouveaux spécifiques des hépatites NANB ont servi de marqueurs pour l'identification du virus en cause.By reacting polytransfused or convalescent hepatitis NANB sera with sera collected at the early stage of the disease, it was possible to demonstrate, thanks to immuno-diffusion, precipitation lines between sera from convalescents or polytransfused patients, and NANB hepatitis sera in the acute phase. These precipitation lines identifying new Ag specific for hepatitis NANB served as markers for the identification of the virus in question.
Les résultats de ces travaux ont permis d'identifier ainsi un virus responsable d'hépatites NANB présentant une similitude morphologique avec le virus de l'hépatite B, y compris des réactions sérologiques croisées.The results of this work made it possible to identify a virus responsible for hepatitis NANB with morphological similarity to the hepatitis B virus, including serological cross-reactions.
Les mêmes travaux ont permis d'identifier 2 systèmes Ag/Ac associés à ce virus désignés antigène NANB/e et NANB/c par analogie avec les antigènes homologues de l'hépatite B; voir C. TREPO et al, C.R. Acad. Sc. Paris, t.290, pages 343-346 (1980).The same work made it possible to identify 2 Ag / Ac systems associated with this virus designated antigen NANB / e and NANB / c by analogy with the antigens homologous to hepatitis B; see C. TREPO et al, C.R. Acad. Sc. Paris, t.290, pages 343-346 (1980).
L'Ag NANB/e réagissait en identité en ID avec un Ag présent dans le sérum de référence de SHIRACHI et est donc supposé analogue à cet Ag désigné par cet auteur HC comme nous y reviendrons un Ag NANB/s caractéristique de l'enveloppe du virus a été également mis en évidence.The Ag NANB / e reacted in identity in ID with an Ag present in the reference serum of SHIRACHI and is therefore supposed to be analogous to this Ag designated by this author HC as we will return there an Ag NANB / s characteristic of the envelope of the virus has also been highlighted.
On sait que les hépatites virales ou non sont accompagnées d'une augmentation caractéristique du taux des transaminases TGO (transaminases glutamique oxalacétique) et TGP (transaminases glutamique pyruvique).We know that viral hepatitis or not is accompanied by a characteristic increase in the level of transaminases TGO (glutamic oxalacetic transaminases) and TGP (glutamic pyruvic transaminases).
Cette augmentation plus ou moins importante des transaminases est le test admis par les spécialistes pour diagnostiquer les hépatites qu'elles soient virales ou non.This more or less significant increase in transaminases is the test accepted by specialists to diagnose hepatitis whether viral or not.
On ne considère comme hépatite virale NANB que les cas où l'on peut éliminer le rôle d'agents toxiques et médicamenteux ainsi que celui des virus HB et HA en constatant l'absence des antigènes, et/ou d'anticorps signant la présence de ces virus, selon les méthodes connues décrites par exemple dans les publications suivantes: - Organisation Mondiale de la Santé, Progrès en matière d'hépatite virale, Sér. Rapp. Techn., 1977, n°602, 1-68; A.J. Zuckermann, The Three types of human viral hepatitis, Bull O.M.S, 1977, 56, 1-20; R. SOHIER, Diagnostic des maladies à virus, Flammarion, Médecine Sciences Edition, Paris, 1964, et mises à jour jusqu'à 1979.NANB viral hepatitis is only considered when the role of toxic and medicinal agents as well as that of HB and HA viruses can be eliminated by noting the absence of antigens, and / or of antibodies signifying the presence of these viruses, according to the known methods described for example in the following publications: - World Health Organization, Progress in viral hepatitis, Ser. Rapp. Techn., 1977, No. 602, 1-68; AJ Zuckermann, The Three types of human viral hepatitis, Bull OMS, 1977, 56, 1-20; R. SOHIER, Diagnosis of virus diseases, Flammarion, Médecine Sciences Edition, Paris, 1964, and updates until 1979.
En outre, on a vérifié que le virus EPSTEIN-BARR et le virus cytomégalique n'étaient pas en cause. Ces critères représentent la définition des hépatites NANB, qui se fait donc, en l'absence de test diagnostic spécifique disponible actuellement par exclusion des autres causes.In addition, it was verified that the EPSTEIN-BARR virus and the cytomegalic virus were not involved. These criteria represent the definition of NANB hepatitis, which is therefore done in the absence of a specific diagnostic test currently available by excluding other causes.
On peut donc selon ces critères sélectionner le sérum des sujets, symptomatiques ou non, soupçonnés d'être atteints d'hépatite NANB.It is therefore possible, according to these criteria, to select the serum of subjects, whether symptomatic or not, suspected of having NANB hepatitis.
En procédant à des essais d'immuno-diffusion en milieu approprié entre les sérums ou entre ces sérums et des homogénéisats de foie, on a observé des réactions de précipitation de complexes antigène-anticorps. Parfois, plus d'une ligne de précipitation étaient observées. La comparaison avec un échantillon authentique de l'antigène décrit par SHIRACHI a permis d'établir que la ligne de précipitation la plus fréquente en ID initialement désignée Ag NANB (Vitvitski et al, 1979 Lancet 2:1263-1267) présentait une réaction d'identité avec un Ag présent dans l'échantillon de SHIRACHI. L'Ac correspondant se trouvait présent dans le réactif. D'autres molécules réactives parasites semblaient cependant présentes dans cet échantillon Ag et Ac, comme c'est souvent le cas, ce qui explique la non spécificité des résultats de ces auteurs présentés au symposium de Vienne.By carrying out immunodiffusion tests in an appropriate medium between the sera or between these sera and liver homogenates, precipitation reactions of antigen-antibody complexes have been observed. Sometimes more than one precipitation line was observed. The comparison with an authentic sample of the antigen described by SHIRACHI made it possible to establish that the most frequent precipitation line in ID initially designated Ag NANB (Vitvitski et al, 1979 Lancet 2: 1263-1267) exhibited a reaction of identity with an Ag present in the SHIRACHI sample. The corresponding Ac was present in the reagent. Other parasitic reactive molecules however seemed to be present in this Ag and Ac sample, as is often the case, which explains the non-specificity of the results of these authors presented at the Vienna symposium.
Par ailleurs l'Ag NANB décrit est apparu avoir une réactivité croisée avec le système HBe, et plus précisément avec Ag HBe/3 et non avec les autres spécificités HBe/1 et 2 (Vitvitski et al, J. Virol. Methods, 1:149-156, 1980). Cette démonstration faisait supposer que l'Ag NANB décrit était l'équivalent pour le virus NANB de l'Ag HBe/3 les propriétés physico chimiques de l'Ag NANB (HANTZ et al, J. Med Virology 5: 73-86 (1980) et sa localisation dans le noyau des hépatocytes renforçaient cette observation.Furthermore, the Ag NANB described appeared to have cross-reactivity with the HBe system, and more precisely with Ag HBe / 3 and not with the other specificities HBe / 1 and 2 (Vitvitski et al, J. Virol. Methods, 1: 149-156, 1980). This demonstration suggested that the NANB Ag described was the equivalent for the NANB virus of HBeAg / 3 the physicochemical properties of Ag NANB (HANTZ et al, J. Med Virology 5: 73-86 (1980 ) and its location in the nucleus of hepatocytes reinforced this observation.
L'Ag NANB a donc été redésigné NANBe, et on suppose que l'Ag décrit par SHIRACHI correspond à cet Ag NANBe, compte-tenu de la réaction observée.The Ag NANB has therefore been redesignated NANBe, and it is assumed that the Ag described by SHIRACHI corresponds to this Ag NANBe, taking into account the reaction observed.
En vue de l'identification d'autres systèmes Ag/Ac spécifiques les couples de sérums donnant une double ligne de précipitation ont été sélectionnés. Une ligne de précipitation additionnelle, distincte de celle de l'Ag NANB/e, se trouvait reproductiblement située, par rapport à celle-ci, du côté du puits où on avait déposé le sérum à tester contenant l'antigène, la ligne de l'Ag NANB/e se trouvant, elle plus près du puits contenant le réactif anticorps.For the identification of other specific Ag / Ac systems, the pairs of sera giving a double precipitation line were selected. An additional precipitation line, distinct from that of Ag NANB / e, was reproducibly located, relative to this, on the side of the well where the test serum containing the antigen, the line of l, had been deposited. 'Ag NANB / e being located, it closer to the well containing the antibody reagent.
L'ultracentrifugation des sérums ainsi sélectionnés a permis de retrouver dans les culots de centrifugation, l'activité antigénique responsable de cette deuxième ligne de précipitation alors que l'activité antigênique NANB/e n'est pas retrouvée dans les culots après ultracentrifugation et reste dans le surnageant.The ultracentrifugation of the sera thus selected made it possible to find in the centrifugation pellets, the antigenic activity responsible for this second line of precipitation whereas the NANB / e antigenic activity is not found in the pellets after ultracentrifugation and remains in the supernatant.
Le nouvel antigêne ainsi isolé a peinais ensuite de sélectionner, par réaction d'immuno-diffusion par exemple, des sérums contenant l'anticorps correspondant.The new antigen thus isolated then had difficulty in selecting, by immuno-diffusion reaction for example, sera containing the corresponding antibody.
On sait que depuis l'examen systématique des sérums de donneurs de sang, dans la plupart des pays, pour la présence d'antigènes du virus de l'hépatite B, plus de 80% des hépatites posttransfusionnelles observées, sont des hépatites NANB.It is known that since the systematic examination of sera from blood donors, in most countries, for the presence of hepatitis B virus antigens, more than 80% of the posttransfusion hepatitis observed, are hepatitis NANB.
Généralement, le nouvel antigène découvert, appelé ci-après Ag NANBs, est détecté dans les sérums de 10 à 20% environ des patients souffrant d'hépatite post-transfusionnelle, ainsi que chez des sujets asymptomatiques présentant une élévation de transaminases, TGP surtout, supérieure ou égale à deux fois la valeur normale.Generally, the new antigen discovered, hereinafter called Ag NANBs, is detected in the sera from approximately 10 to 20% of the patients with post-transfusion hepatitis, as well as in asymptomatic subjects with elevated transaminases, especially TGP, greater than or equal to twice the normal value.
Les anticorps anti-NANBs (ou Ac anti-NANBs) sont détectés en proportion importante, chez les convalescents, généralement 1 à 12 mois après normalisation du taux des transaminases. Ils sont également très fréquents chez les sujets polytransfusés ou exposés de par leur activité à des contacts répétés avec le virus.Anti-NANBs (or anti-NANBs) antibodies are detected in a significant proportion, in convalescents, generally 1 to 12 months after normalization of the level of transaminases. They are also very common in polytransfused subjects or exposed by their activity to repeated contact with the virus.
La suite des essais décrits ci-dessus permet de détecter et d'isoler l'Ag NANBs et l'anticorps correspondant, même si on ne dispose pas d'un échantillon de référence. Une série de travaux a permis de démontrer que l'Ag NANBs est un Ag d'enveloppe du virus NANB.The continuation of the tests described above makes it possible to detect and isolate the Ag NANBs and the corresponding antibody, even if a reference sample is not available. A series of studies has demonstrated that the Ag NANBs is an envelope Ag of the NANB virus.
Des recherches supplémentaires ont encore permis la découverte d'un autre antigène, associé à la nucléocapside du virus NANB, désigné Ag NANBc (antigêne de "core"), qui sera décrit davantage ci-après.Additional research has further led to the discovery of another antigen, associated with the nucleocapsid of the NANB virus, designated Ag NANBc ("core" antigen), which will be described further below.
L'intérêt propre des 3 systèmes Ag-Ac définis ci-dessus pour la prévention, le pronostic, le diagnostic et le traitement des hépatites NANB est variable, les 3 réactions se complétant.The specific interest of the 3 Ag-Ac systems defined above for the prevention, prognosis, diagnosis and treatment of NANB hepatitis is variable, the 3 reactions complementing each other.
Ainsi, il existe pour le virus NANB comme pour le VHB 3 systèmes Ag/Ac distincts associés au virus:Thus, there exist for the NANB virus as for the HBV 3 distinct Ag / Ac systems associated with the virus:
1) un Ag de surface ou Ag NANBs forme donc l'enveloppe du virus complet et se trouve synthétisé également en excès sous forme de petites particules très variables en taille dans le sérum. Lors de l'infection, cet Ag est produit par le cytoplasme des hépatocytes infectés et également exprimé sur la membrane de la cellule. Les Ac anti-NANBs sont les Ac qui agglutinent ces particules virales synthétisées en excès ainsi que le virus complet. Ce sont donc les Ac protecteurs. Leur présence chez un individu le protège contre l'infection comme cela a été montré par l'administration des gammaglobulines de convalescents.1) a surface Ag or Ag NANBs therefore forms the envelope of the complete virus and is also synthesized in excess in the form of small particles very variable in size in the serum. During infection, this Ag is produced by the cytoplasm of infected hepatocytes and also expressed on the cell membrane. Anti-NANBs are the Acs which agglutinate these excess synthesized viral particles as well as the complete virus. These are therefore the protective Acs. Their presence in an individual protects him from infection as has been shown by the administration of convalescent gamma globulins.
Les Ag NANBs peuvent servir de marqueur de l'infection et permettre de faire le diagnostic d'une virémie NANB. Néanmoins la présence fréquente d'Ag en quantité faible, ou l'association de cet Ag et d'Ac sous forme d'immuns complexes explique que, bien souvent, il soit difficile de mettre en évidence par des techniques peu sensibles l'Ag NANBs. La réalisation d'un test radioimmunologique ou immunoenzymatique ou d'un test d'hémagglutination permet grâce au gain de sensibilité de détecter plus facilement les porteurs de virus par mise en évidence de faibles quantités d'Ag NANBs.Ag NANBs can serve as a marker of infection and allow the diagnosis of NANB viremia. However, the frequent presence of Ag in low quantity, or the association of this Ag and Ac in the form of complex immunities explains that, very often, it is difficult to demonstrate by insensitive techniques the Ag NANBs . The carrying out of a radioimmunological or immunoenzymatic test or a hemagglutination test makes it possible, thanks to the gain in sensitivity, to more easily detect the carriers of virus by demonstrating small quantities of Ag NANBs.
2) Le système antigënique NANBc correspond à la nucléocapside du virus NANB complet qui, dans le sérum, est enveloppé. L'Ag NANBc n'est donc pas libre dans le sérum. On ne le révèle qu'après purification des virions et éclatement de l'enveloppe par des détergents doux (par exemple Tween 80 ou Triton X100). L'Ag NANBc est synthétisé dans le noyau des hépatocytes infectés où il est facilement mis en évidence par immunofluorescence et également en microscopie électronique, où on peut détecter des particules caractéristiques qui ont l'aspect ultrastructural des nucléocapsides en voie de formation dans les noyaux. L'absence d'Ag NANBc libre dans le sérum (puisque les nucléocapsides sont enveloppées) ainsi que la multiplication des capsides NANBc dans le noyau des cellules infectées et leur libération lors de la destruction de celles-ci, réalisant une stimulation permanente, aboutit à la présence dans le sérum d'anticorps anti-NANBc dès le début de l'infection: ces anticorps anti-NANBc qui sont détectables par immunofluorescence indirecte mais aussi par d'autres tests, (contreélectrophorèse ou dosage radioimmunologique ou ELISA) témoignent d'une infection en cours d'évolution. Si les anticorps anti-NANBc contiennent des anticorps de la classe IgM, il s'agit d'une infection en cours ou qui date de moins de 8 semaines donc qui est toujours actuelle. S'il n'y a que des anticorps anti-NANBc de la classe IgG, ceci traduit une infection passée, avec arrêt de la multiplication du virus depuis un temps variable.2) The NANBc antigenic system corresponds to the nucleocapsid of the complete NANB virus which, in the serum, is enveloped. NANBc Ag is therefore not free in serum. It is only revealed after purification of the virions and bursting of the envelope with mild detergents (for example Tween 80 or Triton X100). NANBc Ag is synthesized in the nucleus of infected hepatocytes where it is easily detected by immunofluorescence and also by electron microscopy, where characteristic particles can be detected which have the ultrastructural appearance of nucleocapsides being formed in the nuclei. The absence of free NANBc Ag in the serum (since the nucleocapsides are enveloped) as well as the multiplication of the NANBc capsids in the nucleus of the infected cells and their release during the destruction of these, achieving permanent stimulation, results in the presence in the serum of anti-NANBc antibodies from the start of the infection: these anti-NANBc antibodies which are detectable by indirect immunofluorescence but also by other tests, (counterelectrophoresis or radioimmunoassay or ELISA) testify to a developing infection. If the anti-NANBc antibodies contain antibodies of the IgM class, it is an infection in progress or which dates from less than 8 weeks therefore which is still current. If there are only anti-NANBc antibodies of the IgG class, this translates to a past infection, with stopping the multiplication of the virus for a variable time.
L'intérêt essentiel du système Ag/Ac NANBc est donc le diagnostic des infections à virus NANB soit aiguës soit chroniques et la possibilité de distinguer les infections actuelles des infections passées (selon la présence ou l'absence d'IgM).The essential interest of the Ag / Ac NANBc system is therefore the diagnosis of NANB virus infections either acute or chronic and the possibility of distinguishing between current infections and past infections (depending on the presence or absence of IgM).
Il faut insister sur l'intérêt de ce système pour faire un réactif à visée diagnostique. En effet dans les infections à virus NANB les Ag NANBe et NANBs qui servent également au diagnostic peuvent être masqués sous forme d'immuns complexes à certains moments de l'évolution. Dans ces conditions, seul l'anticorps anti-NANBc permettra de préciser qu'un sujet est infecté et/ou infectieux. Ce système sera très important pour le diagnostic des porteurs de virus en particulier chez les donneurs de sang afin de reconnaître les donneurs infectieux et exclure leur sang de la transfusion.We must emphasize the interest of this system to make a diagnostic reagent. In fact, in NANB virus infections, the Ag NANBe and NANBs which are also used for diagnosis can be masked in the form of complex immune systems at certain stages of evolution. Under these conditions, only the anti-NANBc antibody will make it possible to specify that a subject is infected and / or infectious. This system will be very important for the diagnosis of virus carriers, particularly in blood donors, in order to recognize infectious donors and exclude their blood from transfusion.
On a également démontré qu'il existe des réactivités croisées entre les Ag NANBc des diverses souches de virus NANB obtenus à partir de foies infectés par ces différentes souches. Il est donc intéressant d'utiliser pour le réactif de l'invention plusieurs antigènes NANBc de ces différentes souches afin d'avoir le test le plus polyvalent possible en particulier pour la détection des donneurs de sang dangereux, ces divers antigênes NANBc étant de préférence fixés sur (ou utilisés avec) une même unité de réactif. De même on peut utiliser pour un même réactif à la fois un Ag NANBc et un Ag HBc.It has also been demonstrated that there are cross-reactivities between the NANBc Ag of the various strains of NANB virus obtained from livers infected with these different strains. It is therefore advantageous to use for the reagent of the invention several NANBc antigens of these different strains in order to have the most versatile test possible in particular for the detection of dangerous blood donors, these various NANBc antigens preferably being fixed on (or used with) the same reagent unit. Similarly, it is possible to use, for the same reagent, both an Ag NANBc and an Ag HBc.
Il a également été découvert qu'il y avait une faible réactivité croisëe entre les Ag NANBc et HBc. Dans certains cas, un sérum faiblement positif en dosage radio-immunologique. pour l'Ac anti-HBc révèle en fait une infection à virus NANB et vice versa.It was also discovered that there was a low reactivity cross between Ag NANBc and HBc. In some cases, a weak positive serum in radioimmunoassay. for anti-HBc Ac actually reveals an infection with NANB virus and vice versa.
3) Le troisième système d'Ag et d'Ac lié au virus NANB est le système Ag/Ac NANBe.3) The third Ag and Ac system linked to the NANB virus is the Ag / Ac NANBe system.
Ce système est celui qui a été découvert initialement et appelé d'abord Ag NANB avant d'être redésigné Ag NANBe.This system is the one that was initially discovered and first called Ag NANB before being redesignated Ag NANBe.
Il serait susceptible de correspondre au système décrit pair SHIRACHI. Ce système antigënique a un intérêt diagnostique important car la détection de l'Ag NANBe ou de l'Ac correspondant permet d'identifier des porteurs de virus ou de reconnaître que le virus NANB est responsable d'une hépatite aigüe ou chronique.It would likely correspond to the system described by SHIRACHI. This antigenic system has an important diagnostic interest because the detection of the NANBe Ag or the corresponding Ac makes it possible to identify carriers of virus or to recognize that the NANB virus is responsible for an acute or chronic hepatitis.
Les recherches du déposant ont montré que tant les sujets porteurs de l'Ag NANBe que ceux porteurs de l'Ac anti-NANBe semblent activement infectés par le virus comme en témoignent les tests d'immunofluorescence et la raicroscopie électronique effectués sur des biopsies hépatiques.The applicant's research has shown that both subjects carrying NANBe Ag and those carrying anti-NANBe Ac appear to be actively infected with the virus, as evidenced by immunofluorescence tests and electron microscopy carried out on liver biopsies.
Un des intérêts de l'Ag NANBe est qu'il apparaît être un Ag de groupe commun à plusieurs virus de la même famille. L'Ag NANBe parait être l'Ag pour lequel il existe la réactivité croisée la plus importante entre les divers virus de cette famille. Aussi, entre l'Ag e3 du VHB, l'Ag NANBe et aussi l'Age du virus de l'hépatite de la marmotte, la réactivité croisée est considérable. Cet Ag/e se retrouve également chez d'autres espèces comme l'écureuil souterrain.One of the interests of Ag NANBe is that it appears to be a group Ag common to several viruses of the same family. Ag NANBe appears to be the Ag for which there is the most significant cross-reactivity between the various viruses of this family. Also, between HBV Ag e3, NANBe Ag and also the Age of the groundhog hepatitis virus, cross-reactivity is considerable. This Ag / e is also found in other species such as the underground squirrel.
L'intérêt essentiel de cet Ag-e est donc qu'il apparaît être commun à toute une série de virus hépatitiques de l'homme et des animaux, formant une nouvelle famille de virus que certains suggèrent de désigner HEPA-DNA virus cela explique également que des infections par des souches de virus NANB distinctes du point de vue de leur immunité, en particulier chez le chimpanzé donnent une réaction positive pour l'Ag NANBe. Ceci confère donc à cet antigène une valeur diagnostique importante et complémentaire de celle des anti-NANBc.The essential interest of this Ag-e is therefore that it appears to be common to a whole series of hepatitis viruses in humans and animals, forming a new family of viruses that some suggest designating HEPA-DNA virus, which also explains that infections with NANB virus strains distinct from the point of view of their immunity, in particular in the chimpanzee give a positive reaction for Ag NANBe. This therefore gives this antigen an important diagnostic value and complementary to that of anti-NANBc.
Une autre caractéristique importante de l'Ag NANBe est d'être synthétisé dans les infections NANB, en grand excès, souvent à un titre supérieur à l'Ag NANBs, ce qui permet un gain de sensibilité.Another important characteristic of NANBe Ag is to be synthesized in NANB infections, in large excess, often in a higher capacity than Ag NANBs, which allows a gain of sensitivity.
Comme indiqué précédemment, il existe une réactivité croisée d'intensité croissante lorsqu'on passe des Ag les plus superficiels ou de surface des virus de l'hépatite aux Ag de nucléocapside core ou "e".As indicated above, there is a cross-reactivity of increasing intensity when one goes from the most superficial or surface Ag of hepatitis viruses to Ag of nucleocapsid core or "e".
Ainsi les Ag NANBs et HBs n'ont que très peu de réactivité croisée exclusivement démontrable par des tests très sensibles, alors que les Ag NANBc et NANBe ont une réactivité croisée plus importante avec les Ag HBc et HBe/3 respectivement.Thus, the Ag NANBs and HBs have very little cross-reactivity exclusively demonstrable by very sensitive tests, while the Ag NANBc and NANBe have a greater cross-reactivity with the Ag HBc and HBe / 3 respectively.
Compte-tenu du mode de réalisation pratique des tests commerciaux des Ag du VHB actuellement sur le marché la réactivité croisée n'est pas utilisable pour le diagnostic des hépatites NANB.Given the practical embodiment of commercial HBV Ag tests currently on the market, cross-reactivity cannot be used for the diagnosis of NANB hepatitis.
Les 3 systèmes Ag/Ac décrits ci-dessus peuvent servir de base à la réalisation de tests diagnostiques pour les sujets infectés par le virus NANB, qu'ils soient symptomatiques ou non. Plusieurs types de réactifs ont été réalisés. Leurs intérêts sont distincts et souvent complémentaires.The 3 Ag / Ac systems described above can be used as a basis for carrying out diagnostic tests for subjects infected with the NANB virus, whether symptomatic or not. Several types of reagents have been produced. Their interests are distinct and often complementary.
Il convient de noter que dans le cas des infections NANB, les Ac naturels obtenus dans le sérum des malades sont insuffisamment spécifiques et ne peuvent pas être utilisés tels quels pour construire des tests. Les Ac dont on a besoin pour les réactifs de l'invention et leur utilisation ne peuvent être obtenus qu'après purification des Ag par exemple selon les procédés qui seront décrits ci-après.It should be noted that in the case of NANB infections, the natural Ab obtained in the serum of the patients are insufficiently specific and cannot be used as such to construct tests. The AC we need for reagents of the invention and their use can only be obtained after purification of the Ag, for example according to the methods which will be described below.
La présente invention a notamment pour objet un procédé de préparation d'antigènes purifiés de l'hépatite virale NANB, caractérisée par le fait que l'on sélectionne des sérums ou des extraits de foie dans lesquels on a reconnu la présence de virus NANB, que l'on procède à une ultracentrifugation pour concentrer lesdits virus dans le culot de centrifugation, que l'on recueille ledit culot et le traite par un détergent non ionique, que l'on laisse incuber pendant 1 à 24 heures environ â température comprise entre 0 et 37°C, que l'on procède à un fractionnement pour isoler les fractions contenant de l'Ag NANBc purifié, puis que, si désiré, on soumet lesdites fractions à l'action d'un détergent ionique, laisse incuber pendant 1 heure à 24 heures environ à température de 0 à 37ºC, et isole l'Ag NANBe.The subject of the present invention is in particular a process for preparing purified antigens of viral hepatitis NANB, characterized in that serums or extracts of liver are selected in which the presence of NANB virus has been recognized, that ultracentrifugation is carried out to concentrate said viruses in the centrifugation pellet, which is collected and treated with a non-ionic detergent, which is left to incubate for 1 to 24 hours at a temperature between 0 and 37 ° C., that a fractionation is carried out to isolate the fractions containing purified NANBc Ag, then that, if desired, the said fractions are subjected to the action of an ionic detergent, incubated for 1 hour at around 24 hours at a temperature of 0 to 37ºC, and isolates Ag NANBe.
Pour détecter la présence de virus NANB, on utilise par exemple les méthodes mentionnées dans l'article de C.R Ac. Se. Paris, t-289 (17 décembre 1979) pages 1263-1266, et notamment le repérage d'une activité ADN polymérase.To detect the presence of NANB virus, the methods mentioned in the article by C.R Ac are used, for example. Se. Paris, t-289 (December 17, 1979) pages 1263-1266, and in particular the identification of DNA polymerase activity.
Parmi les détergents non ioniques on citera, notamment les aryl polyéthers de glycol alkylës tels que le Triton X100, les polyoxyéthylène sorbitan monooléates tels que le Tween 80, ou encore le NP 40.Among the nonionic detergents that may be mentioned, in particular aryl polyethers of alkylated glycol such as Triton X100, polyoxyethylene sorbitan monooleates such as Tween 80, or even NP 40.
Parmi les détergents ioniques on citera notamment les détergents anioniques tels que le SDS (dodécyl sulfate de sodium).Among the ionic detergents, anionic detergents such as SDS (sodium dodecyl sulfate) will be mentioned.
Pour purifier l'Ag NANBe, selon un procédé également objet de l'invention, on peut aussi opérer comme suit: on sélectionne des sérums positifs pour l'Ag NANBe, on élimine les particules virales éventuellement présentes, par exemple par ultracentri fugation, on élimine les gammaglobulines selon les méthodes connues, par exemple par précipitation au sulfate d'ammonium, on concentre les fractions contenant l'Ag NANBe, notamment par précipitation, par exemple à l'aide de sulfate d'ammonium ou de polyéthylèneglycol, puis on chromatographie les fractions concentrées contenant l'Ag NANBe sur un support sur lequel est fixée de l'héparine, on élue avec une solution aqueuse de chlorure de sodium de concentration croissante, recueille les éluats contenant l'Ag NANBe, et élimine les sels selon les méthodes usuelles. Il convient de noter que ce procédé est également utilisable pour purifier l'Ag NANBs, en sélectionnant comme produits de départ des sérums positifs pour l'Ag NANBs. On peut chromatographier par exemple sur gel d'agarose sur lequel est fixée de l'héparine (héparinogel) et recueillir les éluats correspondant à une concentration en CINa de 0,3 à 0,7M. On élimine les sels (principalement ClNa) par exemple par dialyse.To purify Ag NANBe, according to a process also subject of the invention, one can also operate as follows: one selects sera positive for Ag NANBe, one eliminates the viral particles possibly present, for example by ultracentri fugation, the gamma globulins are eliminated according to known methods, for example by precipitation with ammonium sulphate, the fractions containing the Ag NANBe are concentrated, in particular by precipitation, for example using ammonium sulphate or polyethylene glycol, then the concentrated fractions containing Ag NANBe are chromatographed on a support on which heparin is fixed, eluted with an aqueous solution of sodium chloride of increasing concentration, collecting the eluates containing Ag NANBe, and eliminating the salts according to the usual methods. It should be noted that this process can also be used to purify Ag NANBs, by selecting as starting materials sera positive for Ag NANBs. It is possible, for example, to chromatograph on an agarose gel to which heparin is fixed (heparinogel) and to collect the eluates corresponding to a CINa concentration of 0.3 to 0.7M. The salts (mainly ClNa) are removed, for example by dialysis.
L'invention a également pour objet l'obtention d'antigènes purifiés NANB, mettant à profit l'antigénicité croisée notable entre les virus NANB et HB. Ce procédé est caractérisé par le fait que l'on hyperimmunise des animaux avec une fraction purifiée en un antigêne de l'hépatite B, que l'on utilise les gammaglobulines produites par les animaux hyperimmunisés pour obtenir les lignes de précipitation avec des sérums contenant un antigène NANB correspondant et exempts d'antigènes HB, et que l'on utilise les gammaglobulines ayant donné des lignes de précipitation pour réaliser des supports de chromatographie d'affinité qui permettront de fixer et purifier les antigènes NANB.The subject of the invention is also to obtain purified NANB antigens, taking advantage of the notable cross-antigenicity between the NANB and HB viruses. This process is characterized by the fact that animals are hyperimmunized with a fraction purified into a hepatitis B antigen, that the gamma globulins produced by hyperimmune animals are used to obtain the precipitation lines with sera containing a corresponding NANB antigen and free of HB antigens, and that the gamma globulins which have given precipitation lines are used to produce affinity chromatography supports which will make it possible to fix and purify the NANB antigens.
Dans le cas où on a hyperiramunisé les animaux avec Ag HBc ou Ag HBe3, les anticorps obtenus sont directement utilisables en chromatographie d'affinité pour fixer les antigènes NANB.In the case where the animals have been hyperiramunized with Ag HBc or Ag HBe3, the antibodies obtained can be directly used in affinity chromatography to fix the NANB antigens.
Dans le cas où l'on cherche à obtenir des anticorps donnant une ligne de précipitation avec l'Ag NANBs, il est particulièrement utile d'hyperimmuniser les animaux avec de l'Ag HBs possédant le déterminant a, par exemple l'Ag HBs de sous-type ad et/ou ay. On peut notamment hyperimmuniser les animaux à l'aide de Ag HBs ad, puis de Ag HBs ay, (ou vice-versa) afin d'augmenter la proportion d'anticorps contre le déterminant a. On utilise les gammaglobulines des animaux ainsi hyperimmunisês pour obtenir des lignes de précipitation avec des Ag NANBs. On peut alors recueillir les lignes de précipitation obtenues et les administrer directement, après mélange avec un adjuvant, à des animaux du même genre, qui peuvent être soit des animaux neufs, soit les animaux ayant produit les anticorps donnant une ligne de précipitation avec les Ag NANBs.In the case where one seeks to obtain antibodies giving a precipitation line with Ag NANBs, it is particularly useful to hyperimmunize animals with HBsAg having the determinant a, for example the HBs Ag of the ad and / or ay subtype. One can in particular hyperimmunize animals using Ag HBs ad, then Ag HBs ay, (or vice-versa) in order to increase the proportion of antibodies against the determinant a. The gamma globulins of animals thus hyperimmune are used to obtain precipitation lines with Ag NANBs. It is then possible to collect the precipitation lines obtained and to administer them directly, after mixing with an adjuvant, to animals of the same genus, which can be either new animals or animals having produced the antibodies giving a precipitation line with Ag NANBs.
De même on peut procéder à une nouvelle hyperimmunisation avec les lignes de précipitation obtenues de façon analogue avec l'Ag NANBe ou NANBc.Likewise, a new hyperimmunization can be carried out with the precipitation lines obtained in a similar manner with Ag NANBe or NANBc.
La présente invention a également pour objet un réactif permettant le diagnostic de l'hépatite virale NANB ou permettant de révéler le stade d'évolution de la maladie, y compris la guerison, caractérisé par le fait qu'il comprend un support (ou substrat) solide sur lequel est fixé au moins un antigène NANBc, NANBe ou NANBs et/ou au moins un anticorps anti-NANBc, anti-NANBe ou anti-NANBs.The present invention also relates to a reagent for the diagnosis of viral hepatitis NANB or for revealing the stage of the course of the disease, including healing, characterized in that it comprises a support (or substrate) solid on which is fixed at least one NANBc, NANBe or NANBs antigen and / or at least one anti-NANBc, anti-NANBe or anti-NANBs antibody.
L'antigène ou l'anticorps peut être fixé sur le support solide par tout moyen connu pour la fixation des antigènes et des. anticorps, par exemple par adsorption, par liaison covalente ou non, par exemple par couplage chimique avec un agent de couplage bifonctionnel, par affinité immunochimique, etc...The antigen or the antibody can be fixed on the solid support by any known means for fixing the antigens and. antibodies, for example by adsorption, by covalent bond or not, for example by chemical coupling with a bifunctional coupling agent, by immunochemical affinity, etc.
Le support peut être réalisé avec tout matériau solide biologique (globules rouges) ou synthétique doué de propriétés adsorbantes ou capable de fixer un agent de couplage. Ces matériaux sont connus et décrits dans la littérature. Parmi les matériaux solides capables de fixer les Ag ou Ac par adsorption on citera par exemple le polystyrène, le polypropylène, les latex, etc... Parmi les matériaux utilisables pour fixer les Ag ou les Ac par covalence à l'aide d'un agent de couplage, on cite notamment le dextran, la cellulose, leurs dérivés aminés tels que diéthylaminocellulose ou diéthylamino-dextran.The support can be made with any solid biological material (red blood cells) or synthetic endowed with adsorbent properties or capable of fixing a coupling agent. These materials are known and described in the literature. Among the materials solids capable of fixing Ag or Ac by adsorption include, for example, polystyrene, polypropylene, latex, etc. Among the materials that can be used to fix Ag or Ac covalently using a coupling agent , particular mention is made of dextran, cellulose, their amino derivatives such as diethylaminocellulose or diethylamino-dextran.
Le support se présente par exemple sous forme de disque, de tube, de baguette ou de bille.The support is for example in the form of a disc, tube, rod or ball.
Les agents de couplage permettant de fixer par covalence les Ag ou les Ac sur le support solide sont connus; ce sont par exemple des dérivés carboxyliques, des dérivés biofonctionnels tels que les dialdéhydes (glutaraldéhyde), des diisocyanates (toluènediisocyanate), des quinones (benzoquinone), etc. Les Ac ou les Ag peuvent également être fixés sur des supports solides selon les méthodes décrites par exemple dans les brevets français nº7623176, 7728161 et 7728163.Coupling agents making it possible to covalently fix the Ag or the Ac on the solid support are known; these are, for example, carboxylic derivatives, biofunctional derivatives such as dialdehydes (glutaraldehyde), diisocyanates (toluenediisocyanate), quinones (benzoquinone), etc. The Ac or Ag can also be fixed on solid supports according to the methods described for example in French patents n ° 7623176, 7728161 and 7728163.
Selon un mode de réalisation préféré, on utilise comme support des billes ou des tubes de polystyrène. De telles billes ayant par exemple 1 à 5mm de diamètre, peuvent être obtenues dans le commerce, comme cela est indiqué dans la partie expérimentale ci-après.According to a preferred embodiment, use is made of polystyrene beads or tubes. Such beads, for example 1 to 5 mm in diameter, can be obtained commercially, as indicated in the experimental part below.
Selon un premier mode de réalisation, le réactif de l'invention contient de l'anticorps spécifique fixé sur le support solide.According to a first embodiment, the reagent of the invention contains specific antibody fixed on the solid support.
L'anticorps est un anticorps spécifique de l'Ag à détecter (anti-NANB/c, /e ou /s).The antibody is an Ag specific antibody to be detected (anti-NANB / c, / e or / s).
Ce réactif permet notamment de détecter la présence de l'antigène correspondant, selon la méthode dite "sandwich", par mise en contact avec un sérum à tester. Après lavage pour éliminer les molécules non fixées puis mise en contact ultérieure avec une préparation du même anticorps couplé à un agent traceur (encore appelé anticorps conjugué), on lave pour éliminer l'excès d'anticorps conjugué non fixé puis on examine si l'anticorps couplé au traceur s'est fixé ou non sur le support. C'est l'étape dite de révélation. Il est ainsi possible de déterminer si le sérum testé contenait l'antigène à détecter. En effet, si l'anticorps couplé à l'agent traceur se trouve fixé sur le support c'est que sur le support s'est formé le complexe anticorps-antigène-anticorps conjugué, et que l'antigène recherché était donc présent. Dans le cas contraire, on peut conclure à l'absence de l'antigène recherché dans le sérum testé.This reagent makes it possible in particular to detect the presence of the corresponding antigen, according to the so-called "sandwich" method, by contacting with a serum to be tested. After washing to remove the unbound molecules then subsequent contact with a preparation of the same antibody coupled to a tracer (also called conjugated antibody), washing is carried out to remove the excess of unbound conjugated antibody and then it is examined whether the antibody coupled to the tracer is fixed or not on the support. This is the so-called revelation stage. It is thus possible to determine whether the serum tested contained the antigen to be detected. In fact, if the antibody coupled to the tracer agent is attached to the support, it is because on the support the antibody-antigen-antibody conjugate complex has formed, and the desired antigen was therefore present. Otherwise, it can be concluded that the desired antigen is not present in the test serum.
Ce réactif permet également la détection des Ag correspondants selon une méthode dite de "compétition". Pour cela, on met en contact le réactif avec le sérum à tester. Après lavage pour éliminer les molécules non fixées, on met en contact le réactif avec une préparation d'Ag couplé à un traceur, l'Ag étant celui contre lequel est dirigé l'Ac fixé au support. On lave à nouveau puis on examine le réactif pour rechercher la présence ou l'absence de l'antigène conjugué. Si l'Ag conjugué s'est fixé sur le réactif, c'est que les sites anticorps étaient libres et que le sérum à tester ne contenait donc pas d'Ag contre l'Ac fixé au support. Si l'Ag conjugué ne se fixe pas ou ne se fixe qu'en faible proportion, par exemple si la quantité fixée est inférieure de plus de 50% à la quantité fixée dans le cas d'un sérum témoin ne contenant pas l'Ag recherché, c'est que le sérum étudié contenait le même Ag que celui couplé au traceur, et que le complexe Ac-Ag formé a masqué les sites anticorps et a empêché la fixation de l'Ag conjugué sur l'Ac fixe au support.This reagent also allows the detection of the corresponding Ag according to a method called "competition". For this, the reagent is brought into contact with the serum to be tested. After washing to remove the unbound molecules, the reagent is brought into contact with a preparation of Ag coupled to a tracer, the Ag being that against which the Ac fixed to the support is directed. Wash again and then examine the reagent to find the presence or absence of the conjugate antigen. If the conjugated Ag is fixed on the reagent, it is because the antibody sites were free and that the serum to be tested therefore did not contain Ag against the Ac fixed to the support. If the conjugated Ag does not bind or only binds in a small proportion, for example if the fixed quantity is more than 50% lower than the fixed quantity in the case of a control serum not containing the Ag sought, it is that the serum studied contained the same Ag as that coupled to the tracer, and that the Ac-Ag complex formed masked the antibody sites and prevented the binding of the conjugated Ag on the fixed Ac to the support.
Selon un deuxième mode de réalisation, le réactif de l'invention contient de l'antigène fixe sur le support solide. L'antigène fixé au support est l'Ag NANB/c, /e, ou /s.According to a second embodiment, the reagent of the invention contains fixed antigen on the solid support. The antigen attached to the support is Ag NANB / c, / e, or / s.
Ce réactif permet de détecter la présence des anticorps correspondant à l'antigène fixé selon le principe de la méthode "sandwich" déjà décrite ci-dessus, en remplaçant bien entendu l'anticorps conjugué par un Ag couplé à un traceur, cet Ag étant celui contre lequel est dirigé l'Ac recherché. Selon que l'Ag conjugue s'est fixé ou non, on conclura à la présence ou à l'absence de l'Ac recherché.This reagent makes it possible to detect the presence of antibodies corresponding to the antigen fixed according to the principle of the method "sandwich" already described above, by replacing of course the conjugated antibody with an Ag coupled to a tracer, this Ag being the one against which the Ac sought is directed. Depending on whether the conjugate Ag is fixed or not, we will conclude that the desired Ac is present or absent.
De même, le réactif de ce deuxième mode de réalisation peut servir à détecter la présence des anticorps anti-NANBs, antiNANBc ou anti-NANBe selon la méthode de compétition déjà décrite, le conjugué étant cette fois l'anticorps correspondant couplé à un traceur. Selon que l'Ac conjugué se fixe ou ne se fixe qu'en faible proportion, on conclura à l'absence ou à la présence de l'Ac recherché.Similarly, the reagent of this second embodiment can be used to detect the presence of anti-NANBs, antiNANBc or anti-NANBe antibodies according to the competition method already described, the conjugate being this time the corresponding antibody coupled to a tracer. Depending on whether the conjugated Ac is fixed or is only fixed in a small proportion, we will conclude that the desired Ac is absent or present.
Il convient d'insister sur le fait que les anticorps utilisés pour la réalisation ou l'application des réactifs de l'invention doivent être des préparations d'anticorps spécifiques obtenus soit par hyperimmunisation selon les méthodes connues à l'aide d'antigènes hautement purifiés soit par chromatographie d'affinité, soit par production d'Ac monoclonaux. On a en effet constaté que, contrairement à ce qui était observé pour l'HVB, les anticorps naturels prélevés chez l'homme ne permettaient pas d'obtenir un réactif suffisamment sensible.It should be emphasized that the antibodies used for the production or application of the reagents of the invention must be preparations of specific antibodies obtained either by hyperimmunization according to known methods using highly purified antigens either by affinity chromatography or by production of monoclonal Ab. It has in fact been found that, contrary to what was observed for HBV, the natural antibodies taken from humans did not make it possible to obtain a sufficiently sensitive reagent.
Bien entendu, les divers Ag utilisés pour la réalisation de l'application des réactifs de l'invention sont nécessairement des Ag hautement purifiés.Of course, the various Ag used for carrying out the application of the reagents of the invention are necessarily highly purified Ag.
Selon un mode de réalisation particulier, l'Ag NANB du réactif destiné à la recherche de l'anticorps correspondant peut être fixé sur le support par l'intermédiaire des anticorps du sérum à tester, selon une méthode "sandwich inverse". Dans ce cas on utilise à titre de produit intermédiaire le réactif constitué par de l'anticorps anti- (gammaglobulines M ou G humaines) fixé sur le support. Ce réactif intermédiaire, mis en contact avec le sérum à tester, fixe les gammaglobulines M ou G du sérum. Pour utiliser le réactif ainsi obtenu, on met en contact le support, revêtu de gammablogulines M ou G du sérum à tester par l'intermédiaire des anti-gammaglobulines M ou G humaines, avec une préparation purifiée d'antigène de l'hépatite NANB, par exemple une préparation purifiée d'Ag NANBc. On met ensuite en contact le support avec une préparation d'anticorps correspondant audit antigène purifié, ledit anticorps étant couplé à un traceur. On observe ensuite par révélation selon les méthodes usuelles si l'anticorps couplé au traceur s'est fixé sur le support. S'il est fixé, c'est que le sérum étudié contenait des anticorps contre ledit antigène purifié, et s'il n'est pas fixé, le sérum étudié ne contenait pas ledit anticorps. Il est en particulier intéressant d'utiliser le support intermédiaire décrit ci-dessus contenant des anticorps contre les différentes classes M ou G d'immunoglobulines anti-IgM humaines ou anti-IgG humaines, ce qui permet de distinguer les différents stades d'évolution de la maladie, comme cela a été indiqué ci-dessus. On peut également rechercher les anticorps NANB du sérum à tester par addition d'Ag correspondant couplé à un traceur. Si l'Ag conjugué se fixe, c'est que l'anticorps correspondant était présent dans le sérum.According to a particular embodiment, the Ag NANB of the reagent intended for the search for the corresponding antibody can be fixed on the support via the antibodies of the serum to be tested, according to a "reverse sandwich" method. In this case, the reagent constituted by anti-antibody (human gamma globulin M or G) fixed on the support is used as an intermediate product. This intermediate reagent, brought into contact with the serum to be tested, fixes the gamma globulin M or G of the serum. To use the reagent thus obtained, the support, coated with gamma-globulins M or G of the serum to be tested, is brought into contact with the human anti-gamma globulins M or G, with a purified preparation of NANB hepatitis antigen, for example a purified preparation of Ag NANBc. The support is then brought into contact with an antibody preparation corresponding to said purified antigen, said antibody being coupled to a tracer. It is then observed by revelation according to the usual methods if the antibody coupled to the tracer is fixed on the support. If it is fixed, it is because the serum studied contained antibodies against said purified antigen, and if it is not fixed, the serum studied did not contain said antibody. It is in particular advantageous to use the intermediate support described above containing antibodies against the different M or G classes of anti-human IgM or anti-human IgG immunoglobulins, which makes it possible to distinguish the different stages of evolution of the disease, as noted above. It is also possible to search for the NANB antibodies of the serum to be tested by adding corresponding Ag coupled to a tracer. If the conjugated Ag binds, it means that the corresponding antibody was present in the serum.
De préférence, l'incubation du réactif avec le sérum à tester et avec les préparations d'Ag ou d'anticorps couplé au traceur est effectuée de préférence à pH alcalin (par exemple à pH de 7 à 9), en laissant incuber pendant 1 à 48 heures, à température comprise entre 5 et 50°C environ.Preferably, the incubation of the reagent with the serum to be tested and with the preparations of Ag or of antibody coupled to the tracer is preferably carried out at alkaline pH (for example at pH 7 to 9), leaving to incubate for 1 at 48 hours, at a temperature between 5 and 50 ° C approximately.
Généralement la quantité d'antigène ou d'anticorps fixée sur une unité de réactif (par exemple une bille de polystyrène) est la suivante:Generally the amount of antigen or antibody attached to a reagent unit (for example a polystyrene bead) is as follows:
anticorps : de 1 à 20μg, par exemple 10μg environ;antibodies: from 1 to 20 μg, for example approximately 10 μg;
antigène : de 0,1 à 10μg, par exemple 1μg environ. Le traceur est un traceur radioactif ou enzymatique.antigen: from 0.1 to 10 μg, for example approximately 1 μg. The tracer is a radioactive or enzymatic tracer.
Le traceur peut être un traceur radioactif obtenu par exemple par échange isotopique avec un isotope radioactif tel que I 125.The tracer may be a radioactive tracer obtained for example by isotopic exchange with a radioactive isotope such as I 125.
Le couplage des anticorps ou des antigênes avec un agent traceur radioactif est connu en soi et peut être réalisé par exemple selon la méthode décrite par GREENWOOD.The coupling of antibodies or antigens with a radioactive tracer is known per se and can be carried out for example according to the method described by GREENWOOD.
La radioactivité éventuellement présente sur le réactif de l'invention après réalisation du test est évaluée selon les méthodes usuelles à l'aide d'un compteur approprié (compteur gamma, ou à scintillation).The radioactivity possibly present on the reagent of the invention after carrying out the test is evaluated according to the usual methods using an appropriate counter (gamma counter, or scintillation counter).
Le couplage des anticorps ou Ag avec un traceur enzymatique est connu en soi et peut être réalisé par exemple selon une méthode analogue à celle décrite par NAKANE, Journal Histochemistry Cytochemistry, 22: 1984-1991 (1974) qui consiste à fixer l'enzyme sur des molécules d'IgG supports de la fonction Ac. L'enzyme est par exemple une peroxydase ou une phosphatase alcaline. L'activité enzymatique éventuellement présente sur le réactif après réalisation d'un test peut être déterminée selon les méthodes connues avec un substrat approprié permettant par exemple une révélation par colorimétrie, par fluorescence, par luminescence, par potentiométrie, etc...The coupling of antibodies or Ag with an enzymatic tracer is known per se and can be carried out for example according to a method analogous to that described by NAKANE, Journal Histochemistry Cytochemistry, 22: 1984-1991 (1974) which consists in fixing the enzyme on molecules of IgG which support the Ac function. The enzyme is for example a peroxidase or an alkaline phosphatase. The enzymatic activity possibly present on the reagent after carrying out a test can be determined according to known methods with an appropriate substrate allowing for example a revelation by colorimetry, by fluorescence, by luminescence, by potentiometry, etc.
I. Réactifs utilisant le système Ag NANBs.I. Reagents using the Ag NANBs system.
1°. Intérêts:1 °. Interests:
Cet Ag est spécifique de l'enveloppe du virus NANB. Le virus NANB plus fréquent est désigné par NANBl, et la description qui suit concerne plus particulièrement ce virus, pour simplifier. Il est bien entendu que l'antigène de surface de tout virus apparenté donnant une réaction d'immunité croisée avec le virus NANBl est également utilisable. Cet Ag de surface apparaît dans le sérum des sujets infectés par le virus NANB 2 à 4 semaines après une transfusion ou une piqûre accidentelle. Il précède l'élévation des transaminases quand elle se produit de 1 à 8 semaines parfois plus. Il persiste pendant toute la durée de leur élévation et souvent après qu'elles soient revenues à la normale. Sa présence est un signe de virémie NANB et donc d'infectivité.This Ag is specific to the envelope of the NANB virus. The more frequent NANB virus is designated by NANB1, and the description which follows relates more particularly to this virus, for simplicity. It is understood that the surface antigen of any related virus giving a cross-immunity reaction with the NANB1 virus can also be used. This surface Ag appears in the serum of subjects infected with the NANB virus 2 to 4 weeks after a transfusion or an accidental injection. It precedes the elevation of transaminases when it occurs from 1 to 8 weeks sometimes more. It persists for the duration of their elevation and often after they have returned to normal. Its presence is a sign of NANB viremia and therefore of infectivity.
Sa mise en évidence traduit donc la présence du virus NANB dans le foie et le sérum, et l'infectivité du sang de la personne porteuse qui est donc capable soit de transmettre une hépatite en donnant son sang, soit de la communiquer lors de ses contacts intimes.Its highlighting therefore reflects the presence of the NANB virus in the liver and serum, and the infectivity of the blood of the carrier who is therefore able either to transmit hepatitis by donating blood, or to communicate it during his contacts. intimate.
Dans les hépatites chroniques, l'Ag NANBs est présent de façon persistante.In chronic hepatitis, Ag NANBs is present persistently.
Cet Ag peut être masqué dans certaines conditions sous forme de complexes antigène-anticorps, et l'on peut détecter les anticorps anti-NANBs chez certains sujets malades. Leur apparition est signe d'amélioration clinique, mais peut être pas de façon immédiate signe de guerison.This Ag can be masked under certain conditions in the form of antigen-antibody complexes, and anti-NANBs antibodies can be detected in certain sick subjects. Their appearance is a sign of clinical improvement, but may not be an immediate sign of recovery.
Certains sujets peuvent être porteurs de complexes Ag/Ac NANBs/anti-NANBs en excès d'Ac, qui seuls sont alors détectés. Ces sujets sont toujours infectieux.Certain subjects can be carriers of Ag / Ac NANBs / anti-NANBs complexes in excess of Ac, which alone are then detected. These subjects are still infectious.
L'administration d'Ag NANBs à des animaux y compris l'homme, provoque chez ceux-ci le développement d'une réponse anticorps. Une telle administration permet soit d'obtenir des anticorps correspondants, soit de réaliser une vaccination contre l'hépatite NANB.The administration of Ag NANBs to animals including humans, provokes in them the development of an antibody response. Such administration makes it possible either to obtain corresponding antibodies, or to carry out a vaccination against hepatitis NANB.
2º. Réalisation d'un dosage radioimmunologique en phase solide de type sandwich pour la détection de l'Ag NANBs. a) purification de l'Ag NANBs:2º. Carrying out a sandwich phase solid phase radioimmunoassay for the detection of Ag NANBs. a) purification of Ag NANBs:
On rappelle que l'Ag NANBs présente les caractéristiques suivantes:Remember that Ag NANBs has the following characteristics:
- Densité : entre 1,20 et 1,30g/ml en solution de chlorure de cesium, et entre 1,15 et 1,25g/ml en solution de saccharose;- Density: between 1.20 and 1.30 g / ml in cesium chloride solution, and between 1.15 and 1.25 g / ml in sucrose solution;
- migration êlectrophorétique dans la zone des α-β-globulines;- electrophoretic migration in the α-β-globulin area;
- il est associé en particulier à des particules d'allure virales dont les plus caractéristiques ont des tailles variant de 10 à 45nm de diamètre, le virion complet apparaissant comme une sphère à double enveloppe de 35 à 45nm;- It is associated in particular with viral-looking particles, the most characteristic of which have sizes varying from 10 to 45 nm in diameter, the complete virion appearing as a double-envelope sphere from 35 to 45 nm;
- lorsqu'il est administré à un animal ayant un système immunitaire, il provoque la formation d'anticorps avec lesquels il donne une réaction de précipitation, ledit anticorps étant en outre capable d'agréger et/ou de précipiter lesdites particules virales complètes à double enveloppe contenant une nucléocapside, ayant des dimensions de 35-45nm environ, ledit anticorps étant également capable de provoquer, lorsqu'il est couplé avec un agent de fluorescence, une fluorescence cytoplasmique et/ou membranaire dans des coupes de tissu de foie provenant de sujets atteints d'hépatite NANB; ledit anticorps n'étant capable ni d'agréger ou de précipiter les particules complètes du virus de l'hépatite B, ni de provoquer une fluorescence cytoplasmique et/ou membranaire dans des tissus de foie de sujets atteints d'hépatite B.- when administered to an animal having an immune system, it causes the formation of antibodies with which it gives a precipitation reaction, said antibody being moreover capable of aggregating and / or of precipitating said complete double viral particles envelope containing a nucleocapsid, having dimensions of approximately 35-45nm, said antibody being also capable of causing, when coupled with a fluorescent agent, cytoplasmic and / or membrane fluorescence in sections of liver tissue from subjects with NANB hepatitis; said antibody being neither capable of aggregating or precipitating complete particles of the hepatitis B virus, nor of causing cytoplasmic and / or membrane fluorescence in liver tissues of subjects suffering from hepatitis B.
L'utilisation d'un échantillon d'anticorps anti-NANBs permet de sélectionner facilement les sérums contenant l'Ag NANBs, ceuxci pouvant servir à leur tour à l'identification des sérums contenant l'Ac anti-NANBs.The use of a sample of anti-NANBs antibodies makes it easy to select the sera containing the Ag NANBs, which can in turn be used to identify the sera containing the anti-NANBs Ac.
Pour purifier l'Ag NANBs, on sélectionne des sérums ou des plasmas dans lesquels on a repéré, selon les méthodes classiques telles que les réactions d'immunodiffusion, de contre-électrophorêse, d'inhibition de l'immunofluorescence, ou de radioimmunologie, la présence d'antigène NANBs, et on purifie ledit antigène selon les méthodes classiques de purification des protéines.To purify Ag NANBs, select serums or Plasmas in which the presence of NANBs antigen has been identified, according to conventional methods such as immunodiffusion, counterelectrophoresis, immunofluorescence inhibition, or radioimmunology reactions, and said antigen is purified according to the conventional methods of protein purification.
Cette purification peut être effectuée en utilisant par exemple au moins une des méthodes suivantes:This purification can be carried out using for example at least one of the following methods:
- chromatographie d'affinité,- affinity chromatography,
- ultracentrifugation, par exemple en gradient de saccharose ou de cesium;- ultracentrifugation, for example with a sucrose or cesium gradient;
- chromatographie sur gel, en particulier sur héparinogel- gel chromatography, in particular on heparinogel
- précipitation fractionnée à l'aide d'un agent précipitant tel que les polyols, par exemple le polyéthylèneglycol, ou tel que le sulfate d'ammonium,- fractional precipitation using a precipitating agent such as polyols, for example polyethylene glycol, or such as ammonium sulphate,
- ultrafiltration à l'aide d'une membrane dont la dimension des pores est telle qu'elle retient les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à 30.000.- ultrafiltration using a membrane whose pore size is such that it retains molecules having a molecular weight greater than 30,000.
L'antigène NANBs étant parfois présent sous forme d'immunocomplexes, il est alors avantageux de dissocier lesdits complexes soit avant l'opération de purification soit en purifiant dans des conditions assurant cette dissociation (par exemple à pH suffisamment acide ou suffisamment alcalin).Since the NANBs antigen is sometimes present in the form of immunocomplexes, it is then advantageous to dissociate said complexes either before the purification operation or by purifying under conditions ensuring this dissociation (for example at a sufficiently acidic or sufficiently alkaline pH).
Pour purifier l'antigène par chromatographie d'affinité, on peut par exemple procéder à une chromatographie sur un support, de préférence poreux, dont la surface est tapissée d'un revêtement de molécules anticorps anti-NANBs reliées au support par l'intermédiaire d'un agent de couplage. Le support est par exemple constitué par du Sépharose. L'agent de couplage est par exemple un halogénure de cyanogène. On dispose l'immunoabsorbant dans une colonne, on applique à cette colonne une solution de l'antigène à purifier, on lave avec un tampon. On élue ensuite l'antigène, un agent dissociant la liaison antigène-anticorps par exemple avec une solution tampon à pH acide ou au contraire alcalin, car ces pH extrêmes entraînent une dissociation de la liaison entre Ag et Ac. On collecte des fractions dans lesquelles on repère la présence de protéines par mesure de la densité optique à 280nm, et la présence de l'antigène NANBs est détectée dans les fractions, par les réactions sérologiques avec l'Ac anti-NANBs:CEP (contre-électrophorèse), et/ou inhibition de l'immunofluorescence et de la radioimmunoprécipitation.To purify the antigen by affinity chromatography, one can for example carry out a chromatography on a support, preferably porous, the surface of which is coated with a coating of anti-NANBs antibody molecules linked to the support by means of 'a coupling agent. Support is by example consisting of Sepharose. The coupling agent is for example a cyanogen halide. The immunoabsorbent is placed in a column, a solution of the antigen to be purified is applied to this column, washed with a buffer. The antigen is then eluted, an agent dissociating the antigen-antibody bond, for example with a buffer solution at acidic or on the contrary alkaline pH, because these extreme pH results in dissociation of the bond between Ag and Ac. Fractions are collected in which the presence of proteins is identified by measuring the optical density at 280 nm, and the presence of the NANBs antigen is detected in the fractions, by the serological reactions with the anti-NANBs Ab: CEP (against -electrophoresis), and / or inhibition of immunofluorescence and radioimmunoprecipitation.
Pour mettre en oeuvre une purification par ultracentrifugation, on prépare un gradient d'une solution d'un agent tel que le sucrose ou le chlorure de césium, on dépose la solution à purifier sur ledit gradient et l'on procède à une ultracentrifugation. On recueille les fractions dans celles correspondant à une densité de 1,20 à 1,30 en CsCl et 1,15-1,25 en sucrose on retrouve en sérologie l'Ag NANBs.To carry out a purification by ultracentrifugation, a gradient of a solution of an agent such as sucrose or cesium chloride is prepared, the solution to be purified is deposited on said gradient and an ultracentrifugation is carried out. The fractions are collected in those corresponding to a density of 1.20 to 1.30 in CsCl and 1.15-1.25 in sucrose, the Ag NANBs are found in serology.
Pour réaliser une purification par chromatographie sur gel, on dispose dans une colonne un gel de matériau hydrophile poreux, on applique sur la colonne une fraction contenant l'antigène à purifier et l'on élue l'antigène. On opère de préférence en milieu alcalin, qui a un effet dissociant et qui permet donc de récupérer l'Ag NANBs présent sous forme d'immunocomplexes.To carry out a purification by gel chromatography, a gel of porous hydrophilic material is placed in a column, a fraction containing the antigen to be purified is applied to the column and the antigen is eluted. It is preferably carried out in an alkaline medium, which has a dissociating effect and which therefore makes it possible to recover the Ag NANBs present in the form of immunocomplexes.
On collecte des fractions dans lesquelles on repère la présence de protéines par mesure de la densité optique à 280nm. L'antigène NANBs est détecté dans ces fractions, par les réactions sérologiques indiquées précédemment.Fractions are collected in which the presence of proteins is identified by measuring the optical density at 280 nm. The NANBs antigen is detected in these fractions, by the serological reactions indicated above.
De préférence, pour mettre en oeuvre toutes les méthodes de purification, on utilise comme produit de départ un sérum ou un plasma défibriné et concentré, par exemple de 2 à 10 fois. La concentration peut être réalisée par exemple par précipitation des protéines, notamment au polyéthylèneglycol ou au sulfate d'ammonium et redissolution dans une solution aqueuse tamponnée. On détermine de façon simple la quantité d'agent précipitant nécessaire, par exemple sulfate d'ammonium à 60%.Preferably, to implement all the purification methods, a serum or a product is used as starting material. defibrinated and concentrated plasma, for example from 2 to 10 times. The concentration can be carried out for example by precipitation of the proteins, in particular with polyethylene glycol or with ammonium sulphate and redissolution in an aqueous buffered solution. The quantity of precipitating agent required, for example 60% ammonium sulphate, is simply determined.
Toutes les méthodes rappelées ci-dessus pour la purification de l'Ag NANBs peuvent être utilisées également pour la purification des Ag NANBc et NANBe, avec les adaptations nécessaires.All the methods mentioned above for the purification of Ag NANBs can also be used for the purification of Ag NANBc and NANBe, with the necessary adaptations.
b) préparation d'anticorps anti-NANBs.b) preparation of anti-NANBs antibodies.
L'Ag purifié obtenu au paragraphe précédent sert à immuniser des animaux qui permettent d'obtenir des anticorps anti-NANBs spécifiques.The purified Ag obtained in the previous paragraph is used to immunize animals which make it possible to obtain specific anti-NANBs antibodies.
Pour cela on administre à un animal une préparation d'antigène NANBs purifiée telle que décrite ci-dessus en combinaison avec de l'adjuvant de FREUND complet ou avec tout autre adjuvant. On effectue au moins une administration et de préférence plusieurs. Le sang de l'animal est prélevé au moment du taux optimum des Ac voulus, au bout de 1 à 4 mois par exemple, et on prélève le sang dont on recueille le sérum. On s'assure que ce sérum ne contient pas d'anticorps anti-protéines humaines normales. En immunodiffusion le sérum obtenu donnera une ligne de précipitation avec un sérum d'origine humaine contenant de l'antigène NANBs.For this, a purified NANBs antigen preparation as described above is administered to an animal in combination with complete FREUND adjuvant or with any other adjuvant. At least one administration is carried out and preferably several. The blood of the animal is taken at the time of the optimum desired level of Ac, after 1 to 4 months for example, and the blood is taken from which the serum is collected. We make sure that this serum does not contain normal human anti-protein antibodies. In immunodiffusion, the serum obtained will give a precipitation line with a serum of human origin containing the NANBs antigen.
L'Ac anti-NANBs peut être purifié et isolé, selon les méthodes connues de purification et d'isolement des gammaglobulines telles que les fractionnements à l'éthanol au sulfate d'ammonium ou au Rivanol.The anti-NANBs Ac can be purified and isolated, according to known methods of purification and isolation of gamma globulins such as ethanol fractionation with ammonium sulphate or with Rivanol.
Les anticorps NANBs contenus dans les gammaglobulines spécifiques préparées, et dont la présence peut être confirmée par les différents tests d'immuno-fluorescence, de CEP ou de DRI, sont capables d'agréger les particules virales NANB, y compris les virions complets associées à une activité ADN polymérase comme on peut le démontrer en faisant précipiter les virions complets marqués par des nucléotides radioactifs.The NANBs antibodies contained in the specific gamma globulin prepared, the presence of which can be confirmed by various immunofluorescence tests, CEP or DRI, are capable of aggregating NANB viral particles, including complete virions associated with DNA polymerase activity as can be demonstrated by precipitating complete virions marked with nucleotides radioactive.
c) préparation du traceur.c) preparation of the tracer.
A partir des anticorps anti-NANBs, ceux-ci sont couplés soit avec un traceur radioactif, par exemple à l'iode 125 pour obtenir un dosage radioimmunologique, soit avec un traceur enzymatique, par exemple avec la peroxydase pour obtenir un test immuno-enzymatique.From anti-NANBs antibodies, these are coupled either with a radioactive tracer, for example with iodine 125 to obtain a radioimmunoassay, or with an enzymatic tracer, for example with peroxidase to obtain an immunoenzymatic test .
Réalisation du test.Performing the test.
Celui-ci est fait de manière analogue au test pour l'Ag NANBe.This is done analogously to the test for Ag NANBe.
II. Réalisation d'un test pour les Ac anti-NANBc.II. Carrying out a test for anti-NANBc antibodies.
L'Ag NANBc peut être purifié à partir du foie ou du sérum. L'Ag NANBc purifié va permettre de servir de base à la réalisation d'un test pour l'anti-NANBc par exemple par un DRI selon une méthode de compétition. Le test d'immunofluorescence indirecte en utilisant divers substrats provenant de divers malades et en testant des cas d'hépatite NANB de diverses origines a permis de montrer qu'il existe des variations d'Ag NANBc selon la souche du virus NANB en cause.NANBc Ag can be purified from the liver or serum. The purified NANBc Ag will make it possible to serve as a basis for carrying out a test for the anti-NANBc, for example by a DRI according to a competition method. The indirect immunofluorescence test using various substrates from various patients and testing cases of NANB hepatitis of various origins has shown that there are variations of NANBc Ag depending on the strain of NANB virus involved.
Deux principaux types d'Ag NANBc ont pu être à ce jour identifiés. Ils se comportent de manière analogue et les méthodes d'extraction sont identiques pour les 2 types principaux de virus NANB identifiés à ce jour, désignés par convention NANB1 et NANB2.Two main types of NANBc Ag have so far been identified. They behave in an analogous manner and the extraction methods are identical for the 2 main types of NANB virus identified to date, designated by convention NANB1 and NANB2.
En immunofluorescence indirecte, utilisant comme substrat des coupes de foies infectés par un virus NANB (par exemple par le" virus NANB1 ou NANB2), on détecte chez une population normale de donneurs de sang environ 10% d'anticorps anti-NANBcl et 5% d'anticorps anti-NANBc2.In indirect immunofluorescence, using as substrate sections of livers infected with a NANB virus (for example by the " NANB1 or NANB2 virus), approximately 10% of anti-NANBcl antibodies and 5% of anti-NANBc2 antibodies are detected in a normal population of blood donors.
Avec la sensibilité du dosage radio-immunologique pour les anti-NANBc, on obtient un grand nombre de sujets sains chez qui on trouve des anticorps anti-NANBc1 ou 2 traduisant qu'ils ont été un moment donné de leur vie en contact avec ce virus et se sont immunisés sans faire de maladie.With the sensitivity of the radioimmunoassay for anti-NANBc, a large number of healthy subjects are obtained in whom anti-NANBc1 or 2 antibodies are found, indicating that they have been in contact with this virus at some point in their lives. and immunized without getting sick.
Au total une minorité de tous ces donneurs de sang, soit 2 à 4%, présente des anomalies détectables de la biologie hépatique sous forme de transaminases et/ou gamma GT au dessus de 2 fois la valeur-seuil de la normale.In total, a minority of all these blood donors, ie 2 to 4%, have detectable abnormalities in liver biology in the form of transaminases and / or gamma GT above 2 times the threshold value for normal.
Les anticorps anti-NANBc apparaissent à la phase aiguë de la maladie dès le début de la montée des transaminases (en même temps qu'apparaît l'antigène NANBe) et ils persistent pendant toute la durée de la maladie et aussi pendant la convalescence et restent présents plusieurs années après la maladie. Il n'est donc pas douteux, vue la fréquence des expositions au virus NANB au cours de la vie, qu'une proportion relativement importante de la population ait des anticorps.Anti-NANBc antibodies appear in the acute phase of the disease from the start of the rise in transaminases (at the same time as the NANBe antigen appears) and they persist throughout the duration of the disease and also during convalescence and remain present several years after illness. There is therefore no doubt, given the frequency of exposure to the NANB virus over the course of life, that a relatively large proportion of the population has antibodies.
Le titre des anticorps est maximum à la phase aiguë de la maladie et si celle-ci guérit leur taux décroît.The titer of the antibodies is maximum in the acute phase of the disease and if it cures their rate decreases.
Avec une méthode peu sensible telle que l'immunofluorescence indirecte, on garde une bonne valeur diagnostique, la présence des anticorps anti-NANBc traduisant une maladie en cours d'évolution ou étant en train de s'améliorer.With an insensitive method such as indirect immunofluorescence, a good diagnostic value is retained, the presence of anti-NANBc antibodies reflecting a disease in progress or being improving.
Grâce à l'immunofluorescence indirecte, on a retrouvé pour les virus NANB ce qui est connu pour les autres virus c'est-à-dire que la classe d'immunoglobulines qui supporte l'activité anticorps au début de la maladie est représentée par des immunoglobulines IgM, puis lorsque la maladie s'arrête et que le virus n'est plus produit, les anticorps IgM sont remplacés par des anticorps exclusivement IgG.Thanks to indirect immunofluorescence, we have found for NANB viruses what is known for other viruses, that is to say that the class of immunoglobulins which supports the activity antibody at the start of the disease is represented by IgM immunoglobulins, then when the disease stops and the virus is no longer produced, the IgM antibodies are replaced by exclusively IgG antibodies.
La mise en évidence d'anticorps anti-NANBc de classe IgM prend donc un intérêt diagnostique essentiel puisque ceux-ci vont traduire une infection en cours d'évolution. Si on se contente de rechercher les anti-NANBc IgM ceux-ci ne sont plus présents que chez à peu près 4 à 5% des donneurs de sang. Au cours des hépatites aiguës, les anti-NAKBc IgM ne persistent pas après la normalisation des transaminases dans la majorité des cas. Au cours des hépatites chroniques par contre, l'anti-NANBc IgM persiste. La valeur diagnostique est donc considérable.The detection of anti-NANBc antibodies of the IgM class therefore takes on essential diagnostic interest since these will translate an infection in progress. If we just look for anti-NANBc IgM, they are only present in about 4 to 5% of blood donors. In acute hepatitis, anti-NAKBc IgM does not persist after normalization of transaminases in the majority of cases. On the other hand, in chronic hepatitis, the anti-NANBc IgM persists. The diagnostic value is therefore considerable.
On a également trouvé une relation quantitative entre la présence d'anti-NANBc à un titre élevé supérieur à 200 en DRI et une infection aiguë ou chronique toujours en évolution. En immunofluorescence indirecte, un titre supérieur ou égal au 40ème traduit toujours que le virus se réplique et donc que le malade sera contagieux. En dosage radio-immunologique un titre supérieur au 500ème traduit la rêplication virale NANB actuelle ou persistante et s'accompagne toujours d' anti-NANBc IgM.A quantitative relationship has also been found between the presence of anti-NANBc at a high titer greater than 200 in DRI and an acute or chronic infection that is still evolving. In indirect immunofluorescence, a titer greater than or equal to 40th always indicates that the virus replicates and therefore that the patient will be contagious. In radioimmunoassay a titer greater than 500th translates the current or persistent NANB viral replication and is always accompanied by anti-NANBc IgM.
Pour atteindre le but recherché dans le diagnostic qui est de démontrer soit la présence du virus, c'est-à-dire son rôle dans une hépatite aiguë ou chronique et aussi d'autres syndromes comme nous l'avons vu, soit l'infectivité d'un sujet, en particulier celle d'un donneur de sang risquant de transmettre une hépatite NANB, on a deux possibilités: soit mettre en évidence des anti-NANBc IgM, soit titrer les anti-NANBc totaux détectés et admettre que tous les titres supérieurs au 200ème et en tous cas à partir du 500ème correspondent à une rêplication du virus NANB.To achieve the goal sought in the diagnosis which is to demonstrate either the presence of the virus, that is to say its role in acute or chronic hepatitis and also other syndromes as we have seen, or infectivity of a subject, in particular that of a blood donor at risk of transmitting hepatitis NANB, there are two possibilities: either to demonstrate anti-NANBc IgM, or to titrate the total anti-NANBc detected and to admit that all the titers higher than the 200th and in any case from the 500th correspond to a replication of the NANB virus.
L'objectif final étant d'avoir un test unique pour le repérage immédiat de tous les flacons de sang potentiellement infectieux, on peut réaliser un test où sur un support solide seront fixés d'une part l'Ag HBc permettant de détecter des anti-HBc et ainsi des sujets infectieux pour le virus HB et d'autre part des Ag NANBc 1 et 2 pour repérer les 2 principales classes de virus NANBc. La quantité de traceur anti-NANBc est calculée pour obtenir la sensibilité voulue correspondant au seuil recherché. On a ainsi un test polyvalent qui en 1ère intention repère tous les virus de la famille de l'hépatite responsables d'hépatites post transfusionnelles. Dans un 2ème temps, on peut faire une analyse plus fine en séparant les cas anti-HBc-positifs qui sont dus au VHB des autres cas. Il ne faut pas non plus méconnaître l'existence d'infections doubles.The ultimate goal is to have a single test for tracking immediately of all potentially infectious blood vials, we can perform a test where on a solid support will be fixed on the one hand the HBc Ag allowing to detect anti-HBc and thus infectious subjects for the HB virus and other share of Ag NANBc 1 and 2 to identify the 2 main classes of NANBc virus. The amount of anti-NANBc tracer is calculated to obtain the desired sensitivity corresponding to the desired threshold. We thus have a versatile test which in 1st intention identifies all the viruses of the hepatitis family responsible for post transfusion hepatitis. In a second step, we can make a more detailed analysis by separating the anti-HBc-positive cases which are due to HBV from the other cases. Nor should we ignore the existence of double infections.
Pour la réalisation d'un test susceptible de repérer la classe IgM des anticorps anti-capsidiques du VHB et des virus NANB 1 et 2 on fixe sur le support solide, par exemple une bille de polystyrène des anticorps anti-IgM humaines d'origine animale (par exemple de mouton, lapin ou autres). Cette bille va donc représenter un piège pour toutes les IgM des sérums humains. Si on incube une telle bille avec un sérum, elle fixe les IgM circulants. Dans un 2ême temps, on rajoute après lavage une quantité fixée d'antigène en l'occurence soit de l'Ag NANBc1, NANBc2 ou HBc ou un de leurs mélanges le tout en dilution dans du sérum humain normal. Après incubation de 16 à 24 heures à la température ambiante on lave. S'il y avait des IgM qui ont une activité anticorps contre l'Ag considéré, il y a eu attachement de l'Ag que l'on avait rajouté. Il reste alors à le révêler par addition d'un marqueur approprié, c'est-à-dire un anticorps anti-NANBc 1, anti-NANBc2, ou anti-HBc, ou un mélange de ces anticorps, couplé à un traceur radioactif ou à un traceur enzymatique (par exemple le peroxydase, qui ensuite donne une réaction colorée lorsqu'elle est oxydée avec le periodate) et selon le cas on compte la radioactivité dans un compteur de radiation ou on apprécie la positivité par la réaction colorée à l'aide d'un photomètre qui la quantifie. On peut également détecter des Ac anti-NANBc, avec un support sur lequel est fixé de l'Ag NANBc purifié, selon les méthodes (sandwich ou compétition) décrites ci-dessus.To carry out a test capable of identifying the IgM class of anti-HBV antibodies and of NANB viruses 1 and 2, anti-human IgM antibodies of animal origin are fixed on the solid support, for example a polystyrene ball. (e.g. sheep, rabbit or others). This ball will therefore represent a trap for all IgM in human sera. If such a bead is incubated with a serum, it fixes the circulating IgM. In a second step, after washing, a fixed quantity of antigen is added, in this case either Ag NANBc1, NANBc2 or HBc or one of their mixtures, all in dilution in normal human serum. After incubation for 16 to 24 hours at room temperature, washing is carried out. If there were IgMs which have antibody activity against the Ag in question, there was attachment of the Ag which was added. It then remains to be revealed by adding an appropriate marker, that is to say an anti-NANBc 1, anti-NANBc2, or anti-HBc antibody, or a mixture of these antibodies, coupled to a radioactive tracer or to an enzymatic tracer (for example peroxidase, which then gives a colored reaction when it is oxidized with the periodate) and according to the case one counts the radioactivity in a counter of radiation or one appreciates the positivity by the colored reaction with the using a photometer which quantifies it. Anti-NANBc Ab can also be detected, with a support to which purified NANBc Ag is attached, according to the methods (sandwich or competition) described above.
Il est possible de réaliser des tests spécifiques pour chacun des Ag NANBcl et NANBc2 mais il paraît plus logique d'envisager la réalisation d'un test unique pour les deux plus fréquentes infections à virus NANB. Pour cela on utilise un mélange des deux Ag (NANBc1 + NANBc2), fixé sur un support solide par mise en contact dans un tampon phosphate pendant une nuit à 4°C. Après séchage et lavage, les sites éventuellement disponibles sur le support sont ensuite saturés avec une solution proteique telle que l'hémoglobuline ou l'albumine bovine. Le réactif constitué par le support ainsi enduit d'Ag va servir à la réalisation d'un test, par exemple selon la méthode de compétition. Il est incubé par exemple avec 200μl de sérum à tester pendant lh à 37°C. Après lavage on fait agir les Ac correspondants couplés au traceur, par exemple les Ac anti-NANBc radioactifs. La fixation maximum de ces Ac traduit la liberté des sites NANBc sur le support et donc que le sérum étudié ne contenait pas d'Ac anti-NANBc. Inversement, si on observe une réduction de plus de 50% du nombre de coups/minute de radioactivité par rapport à un témoin, c'est que le sérum étudié contenait l'Ac anti-NANBc qui s'est fixé sur le support, muni d'antigène en rendant celui-ci inaccessible aux anticorps radioactifs ultérieurement mis à son contact.It is possible to carry out specific tests for each of the NANBcl and NANBc2 Ags, but it seems more logical to envisage carrying out a single test for the two most frequent NANB virus infections. For this, a mixture of the two Ag (NANBc1 + NANBc2) is used, fixed on a solid support by contacting in a phosphate buffer overnight at 4 ° C. After drying and washing, the sites possibly available on the support are then saturated with a protein solution such as hemoglobulin or bovine albumin. The reagent constituted by the support thus coated with Ag will be used to carry out a test, for example according to the competition method. It is incubated for example with 200 μl of serum to be tested for 1 h at 37 ° C. After washing, the corresponding Ac coupled to the tracer are made to act, for example the radioactive anti-NANBc Ac. The maximum binding of these Ac translates the freedom of the NANBc sites on the support and therefore that the serum studied did not contain anti-NANBc Ac. Conversely, if there is a reduction of more than 50% in the number of counts / minute of radioactivity compared to a control, it is because the serum studied contains the anti-NANBc Ab which is fixed on the support, provided antigen by making it inaccessible to radioactive antibodies subsequently brought into contact with it.
III. Détection des infections hépatiques à virus NANB ou analogues à l'aide de l'Ag NANBe ou de l'Ac anti-NANBe.III. Detection of liver infections with NANB virus or the like using NANBe Ag or anti-NANBe Ac.
L'intérêt d'un tel système provient du fait que l'Ag NANBe est l'Ag le plus profond des virus. C'est un Ag de groupe commun aux membres de la famille des virus d'hépatite qu'ils soient B ou NANBe. Une étude des hépatites post transfusionnelles, dans 6. centres différents : Lyon, Paris, Londres, Hannovre, Kiel, New-York, a révélé que la fréquence de la détection de l'Ag NANBe au cours des hépatites post transfusionnelles variait de 60 à 100 % des cas avec une moyenne autour de 80 %. Compte tenu que la méthode utilisée était peu sensible (iramunodiffusion) cela signifie que le système Ag/Ac NANBe utilisé est quasi constant dans les hépatites NANB post transfusionnelles. Ceci était d'autant plus surprenant que l'on pouvait s'attendre à des variations épidémiologiques dans des souches de virus NANB distinctes vu les régions très différentes. Il est en effet quasi démontré qu'il existe plusieurs types d'hépatites NANB.The interest of such a system comes from the fact that Ag NANBe is the deepest Ag of viruses. It is a group Ag common to members of the hepatitis virus family, whether they are B or NANBe. A study of post transfusion hepatitis, in six different centers: Lyon, Paris, London, Hannover, Kiel, New York, revealed that the frequency of detection of Ag NANBe in post transfusion hepatitis varied from 60 to 100% of cases with an average of around 80%. Given that the method used was not very sensitive (iramunodiffusion), this means that the NANBe Ag / Ac system used is almost constant in post transfusion NANB hepatitis. This was all the more surprising since epidemiological variations in distinct NANB virus strains could be expected given the very different regions. It is indeed almost demonstrated that there are several types of NANB hepatitis.
Le fait que des virus de l'hépatite NANB distincts n'entraînent pas d'immunité croisée a conduit à penser que leurs antigênes d'enveloppe étaient différents mais pouvaient appartenir à la même famille de virus ayant en commun le même Ag NANBe. Ce phénomène a été démontré pour le virus NANB, le virus HB ainsi que pour un virus de l'hépatite d'une autre espèce animale, celui de la marmotte puisque pour les 3 virus on peut mettre en évidence Ag HBe3 ou une réaction croisée avec HBe3 Cette hypothèse de l'existence de plusieurs virus NANB possédant un même antigêne de groupe NANBe a été confirmée lorsque des inoculums entraînant des hépatites NANB d'incubations très différentes et s'accompagnant de lésions ultrastructurales et de particules distinctes en microscopie électronique (souches H et F de SHIMIZU) ont été inoculées chez les chimpanzés (SHIMIZU, SCIENCE, 1980). L'étude des sérums des chimpanzés ainsi inoculés avec ces 2 souches de virus NANB distinctes a montré que l'Ag NANBe était détectable chez les chimpanzés infectés avec la souche F comme avec la souche H. La conclusion que l'Ag NANBe était un Ag de groupe de famille des virus de l'hépatite regroupant des virus de l'homme tel que le VHB, ou les virus NANB de souches différentes H et F et même le virus de la marmotte paraît donc bien établie.The fact that distinct NANB hepatitis viruses do not cause cross-immunity has led to the belief that their envelope antigens are different but may belong to the same family of viruses that share the same NANBe Ag. This phenomenon has been demonstrated for the NANB virus, the HB virus as well as for a hepatitis virus from another animal species, that of the marmot since for the 3 viruses, HBeAg 3 or a cross-reaction can be demonstrated. with HBe 3 This hypothesis of the existence of several NANB viruses possessing the same antigen of the NANBe group has been confirmed when inoculums causing NANB hepatitis with very different incubations and accompanied by ultrastructural lesions and distinct particles by electron microscopy ( strains H and F of SHIMIZU) have been inoculated in chimpanzees (SHIMIZU, SCIENCE, 1980). The study of the sera of chimpanzees thus inoculated with these 2 distinct strains of NANB virus showed that Ag NANBe was detectable in chimpanzees infected with strain F as with strain H. The conclusion that Ag NANBe was an Ag of family group of hepatitis viruses grouping together human viruses such as HBV, or NANB viruses of different strains H and F and even the groundhog virus therefore appears to be well established.
Ceci confère donc un intérêt exceptionnel à cet Ag NANBe puisqu'il permet donc à priori de diagnostiquer tous les virus appartenant-à ce même groupe, même des virus NANB ou autres Hépa DNA virus non encore découverts ou non encore apparus. L'intérêt de l'antigénicitê croisée entre le virus HBe/3 du VHB et l'Ag NANBe du virus NANB n'est pas majeur pour le diagnostic des hépatites B puisqu'on dispose de très bons réactifs spécifiques pour la reconnaissance des hépatites à VHB. Par contre il n'en va pas de même dans le cas des hépatites NANB pour lesquelles aucun test diagnostique n'existait à ce jour.This therefore gives exceptional interest to this Ag NANBe since it therefore a priori makes it possible to diagnose all the viruses belonging to this same group, even NANB viruses or other Hepa DNA virus not yet discovered or not yet appeared. The value of cross antigenicity between HBe / 3 HBV virus and NANBe Ag of NANB virus is not major for the diagnosis of hepatitis B since there are very good specific reagents for the recognition of hepatitis B HBV. On the other hand, it is not the same in the case of NANB hepatitis for which no diagnostic test existed to date.
Les difficultés de la sérologie NANB sont liées à l'existence fréquente au cours des hépatites NANB d'antigènes qui ne sont pas d'origine virale mais liés à l'hôte et qui sont présents à la phase aiguë de la maladie et induisent des anticorps. Ces Ag peuvent se rencontrer dans une pathologie et dans des conditions distinctes de l'hépatite NANB et sont à l'origine de nombreuses fausses réactions car ce sont des constituants normaux qui peuvent s'observer dans de très nombreuses circonstances cliniques avec atteintes du foie d'origines très diverses,The difficulties of NANB serology are linked to the frequent existence during NANB hepatitis of antigens which are not of viral origin but linked to the host and which are present in the acute phase of the disease and induce antibodies. . These Ag can be found in a pathology and in conditions distinct from NANB hepatitis and are the source of many false reactions because they are normal constituents which can be observed in very many clinical circumstances with liver damage. 'very diverse origins,
Ces phénomènes parasites expliquent qu'aucun test diagnostique reposant sur l'utilisation d'Ac naturels sélectionnés chez l'homme n'a pu constituer le point de départ d'un test satisfaisant jusqu'à ce jour. C'est donc une caractéristique essentielle de l'invention que de reposer sur l'utilisation d'Ag purifiés et d'Ac animaux spécifiques ou d'Ac humains monoclonaux ou polyclonaux de spécificité satisfaisante préparés par chromatographie d'affinité avec de l'Ag purifié.These parasitic phenomena explain why no diagnostic test based on the use of natural Ab selected in humans could constitute the starting point of a satisfactory test to date. It is therefore an essential characteristic of the invention to rely on the use of purified Ags and specific animal Acs or monoclonal or polyclonal human Acs of satisfactory specificity prepared by affinity chromatography with Ag purified.
Obtention des réactifs : Ag NANBe et Ac anti-NANBe nécessaires pour réaliser le test.Obtaining reagents: Ag NANBe and Ac anti-NANBe necessary to carry out the test.
La réalisation d'un test spécifique pour l'Ag NANBe exige donc 1) la purification de l'Ag NANBe, 2) l'immunisation d'animaux afin d'obtenir des Ac spécifiques de titre élevé et d'affinité élevée, 3) sélection d'Ac monoclonaux ou polyclonaux monospécifiques. Grâce à ces anticorps il est possible de réaliser des tests de sensibilité variable croissante et spéci fique tels que l'immunodiffusion, la contreélectrophorèse et surtout le dosage radio immunologique (DRI) et immunoenzymatique (ELIZA).Carrying out a specific test for Ag NANBe therefore requires 1) the purification of Ag NANBe, 2) the immunization of animals in order to obtain specific Acs of high titer and high affinity, 3) selection of monospecific monoclonal or polyclonal Ab. Thanks to these antibodies it is possible to carry out tests of increasing variable sensitivity and speci such as immunodiffusion, counterelectrophoresis and above all radio immunological assay (DRI) and immunoenzymatic (ELIZA).
Purification de l'Ag NANBePurification of Ag NANBe
Deux méthodes on été mises au point pour la purification de l'Ag NANBe :Two methods have been developed for the purification of Ag NANBe:
Première méthodeFirst method
On prépare et purifie d'abord l'Ag NANBe à partir de foie infecté par un virus NANB. Sur l'Ag NANBc ainsi purifié on fait agir un agent détergent fort, c'est-à-dire un détergent ionique, en particulier anionique, tel que le SDS. On opère généralement en présence d'un réducteur tel que le dimorcaptoethanol pour libérer l'Ag NANBe. Cet Ag est alors utilisé pour immuniser des animaux, par exemple des lapins pour obtenir des Ac anti-NANBe qui réagissent en immunofluorescence pour détecter l'Ag NANBe dans le noyau des hépatocytes infectés, ce qui confirme leur spécificité. Ces Ac spécifiques peuvent être utilisés pour détecter l'Ag NANBe dans le sérum par immunodiffusion et contreélectrophorèse. Cet Ac purifié sert également de base à la réalisation du réactif selon l'invention permettant d'effectuer un test de DRI dit en sandwich ou bien un test immunoenzymatique qui sera détaillé plus loin.NANBe Ag is first prepared and purified from liver infected with a NANB virus. On the NANBc Ag thus purified, a strong detergent agent, that is to say an ionic detergent, in particular anionic detergent, such as SDS, is made to act. One generally operates in the presence of a reducing agent such as dimorcaptoethanol to release the Ag NANBe. This Ag is then used to immunize animals, for example rabbits to obtain anti-NANBe Ab which react in immunofluorescence to detect Ag NANBe in the nucleus of infected hepatocytes, which confirms their specificity. These specific Ab can be used to detect NANBe Ag in serum by immunodiffusion and counterelectrophoresis. This purified Ac also serves as a basis for producing the reagent according to the invention, making it possible to carry out a so-called sandwich DRI test or else an immunoenzymatic test which will be detailed below.
Deuxième méthodeSecond method
L'Ag NANBe sérique peut également être purifié par chromatographie d'absorption. On a découvert que l'Ag NANBe avait en particulier une affinité élective pour l'hëparinogel. Cela a servi de base à la mise au point d'une purification selon ce principe : dans un 1er temps, le sérum contenant l'Ag NANBe est appliqué sur une colonne d'hëparinogel, où il se fixe et on constate que l'Ag NANBe est retenu sur la colonne ; dans un 2ème temps on réalise l'élution et on recueille les fractions NANBe positives.Serum Ag NANBe can also be purified by absorption chromatography. It was discovered that Ag NANBe in particular had an elective affinity for heparinogel. This served as the basis for the development of a purification according to this principle: in a first step, the serum containing Ag NANBe is applied to a heparinogel column, where it is fixed and it is found that the Ag NANBe is retained on the column; in one 2nd time, elution is carried out and the positive NANBe fractions are collected.
Immunisation des animaux (lapins, cobayes)Immunization of animals (rabbits, guinea pigs)
On opère par exemple par injections, faites en de multiples sites à chaque lapin de 300 μg de solution antigenique titrant 1/16 en CEP, après mélange avec de l'adjuvant complet de FREDND pour les 2èmes injections et pour les suivantes, à 1 mois d'intervalle, avec de l'adjuvant incomplet.One operates for example by injections, made in multiple sites to each rabbit of 300 μg of antigenic solution titrating 1/16 in CEP, after mixing with complete adjuvant of FREDND for the 2nd injections and for the following, at 1 month apart, with incomplete adjuvant.
Obtention d'immuns sérums monospécifiquesObtaining monospecific immune sera
Selon une première technique, on laisse incuber 2h à 37°C (ou 24h à +4°C) les immuns sérums obtenus sur du sérum humain normal, polymérisé par traitement à la glutaraldéhyde et sur du broyat de foie humain normal également insolubilisé par la glutaraldéhyde. On répète l'opération jusqu'à disparition de toute réactivité contre des sérums ou extraits de foie normaux. Seule subsiste alors l'activité anti-NANBe.According to a first technique, the immune sera obtained are incubated for 2 h at 37 ° C. (or 24h at + 4 ° C.) obtained on normal human serum, polymerized by treatment with glutaraldehyde and on normal human liver shredded also insolubilized with glutaraldehyde. The operation is repeated until all reactivity against normal sera or extracts of liver has disappeared. Only the anti-NANBe activity then remains.
une autre voie d'obtention d'Ac monospécifique sera la préparation d'Ac monoclonaux selon la technique des hybridomes.another way of obtaining monospecific Ac will be the preparation of monoclonal Ac according to the hybridoma technique.
Une quatrième possibilité consiste à réaliser une absorption sélective des Ac anti-NANBe par chromatographie d'affinité sur un support revêtu d'Ag NANBe purifié, selon les méthodes connues.A fourth possibility consists in carrying out a selective absorption of the anti-NANBe Ab by affinity chromatography on a support coated with purified Ag NANBe, according to known methods.
Réalisation du test pour l'Ag et l'Ac NANBeRealization of the test for Ag and Ac NANBe
Ce système précipitant peut être détecté notamment pour :This precipitating system can be detected in particular for:
- immunodiffusion (ID)- immunodiffusion (ID)
- contreélectrophorèse (CEP) - dosage radio immunologique (DRI)- counterelectrophoresis (CEP) - radio immunological assay (DRI)
D'autres méthodes classiques de sérologie peuvent être employées grâce aux Ag purifiés et Ac monospécifiques qui ont été préparés, en particulier les tests d'hémagglutination, ou bien les dosages immunoenzymatiques.Other conventional methods of serology can be used thanks to the purified Ag and monospecific Ac which have been prepared, in particular the hemagglutination tests, or alternatively the immunoenzymatic assays.
Avec le réactif de l'invention, en fixant sur un support de l'Ag NANBe (ou de l'anticorps-anti-NANBe) il sera possible de détecter l'Ac anti-NANBe (ou de l'Ag NANBe) selon les méthodes de sandwich ou de compétition décrites ci-dessus.With the reagent of the invention, by fixing Ag NANBe (or anti-NANBe antibody) on a support, it will be possible to detect anti-NANBe Ac (or Ag NANBe) according to the sandwich or competition methods described above.
IV. Cas particulier de la détection des donneurs de sang susceptibles de transmettre un virus de l'hépatite NANB, mais aussi tout autre virus apparenté Hepa-DNA virus.IV. Special case of the detection of blood donors capable of transmitting a hepatitis NANB virus, but also any other related virus Hepa-DNA virus.
A. Comme indiqué ci-dessus dans les généralités il s'agit d'un problème majeur par ses conséquences en raison:A. As indicated above in the general information, this is a major problem due to its consequences due to:
1) de la fréquence du portage de ces virus par environ 3 à 10% des donneurs de sang bénévoles, et une proportion allant jusqu'à 35% pour les donneurs rémunérés et en pays d'endémie.1) the frequency of the carrying of these viruses by approximately 3 to 10% of voluntary blood donors, and a proportion of up to 35% for paid donors and in endemic countries.
2) de la gravité potentielle des hépatites NANB post transfusionnelles dont 50% évoluent vers la chronicité avec finalement cirrhose du foie possible, et qui au total ont une morbidité et mortalité considérables.2) the potential severity of post transfusion NANB hepatitis, 50% of which progresses to chronicity with possible cirrhosis of the liver, and which in total have considerable morbidity and mortality.
B. Une des caractéristiques de l'invention est d'avoir précisé la possibilité de dépister les donneurs infectieux asymptomatiques par plusieurs tests sêrologiques spécifiques permettant la détection de l'Ag NANBs, de l'Ag NANBe, et des Ac antiNANBc/1 et 2, chacun des tests ayant son intérêt propre.B. One of the characteristics of the invention is to have specified the possibility of detecting asymptomatic infectious donors by several specific serological tests allowing the detection of Ag NANBs, Ag NANBe, and antiNANBc / 1 and 2 Ab , each of the tests having its own interest.
C. Une deuxième caractéristique de cette découverte est la caractérisation de la biologie et de la virologie des virus NANB, et la mise en évidence des différences très variables du comportement des marqueurs viraux NANB s, e et c, et une évolution très différente par rapport au virus HB.C. A second characteristic of this discovery is the characterization of the biology and virology of viruses NANB, and the demonstration of very variable differences in the behavior of the viral markers NANB s, e and c, and a very different evolution compared to the HB virus.
a) L'Ag NANBs est beaucoup moins abondant que dans les infections à VHB par contre l'Ag NANBe lui est produit en quantités égales sinon plus importantes que dans l'hépatite B, et souvent supérieures à celles de l'Ag NANBs. Un test reposant sur l'Ag NANBe sera donc plus sensible dans certains cas.a) Ag NANBs is much less abundant than in HBV infections, on the other hand, Ag NANBe is produced in it in quantities equal if not more important than in hepatitis B, and often higher than those of Ag NANBs. A test based on Ag NANBe will therefore be more sensitive in certain cases.
b) Une autre caractéristique est le caractère fluctuant et récurrent mais hélas chronique des infections NANB avec épisodes de normalisation plus ou moins parfaite y compris des SGPT. On croit le sujet guéri puis il y a rechute. Les marqueurs NANBe et NANBs évoluent de façon semblable et disparaissent par épisodes du sérum:b) Another characteristic is the fluctuating and recurrent but unfortunately chronic nature of NANB infections with more or less perfect normalization episodes including SGPT. We believe the subject has healed and then there is a relapse. The markers NANBe and NANBs evolve in a similar way and disappear by episodes of the serum:
α) en partie parce qu'il y a des cycles de synthèse avec des recrudescences et phases de quiescenceα) partly because there are cycles of synthesis with upsurges and quiescence phases
ß) en partie car les Ag sont masqués par les Ac anti-NANBe et anti-NANBs sous forme de complexes Ag/Ac, ceux-ci pouvant être infectieux. Dans le cas de complexes immuns masquant les Ag NANB/s et e, ou d'une brusque baisse de synthèse, les Ac antiNANBc à titre élevé gardent toute leur valeur pour repérer un donneur dangereux. C'est même un de leurs intérêts essentiels.ß) in part because the Ag are masked by the anti-NANBe and anti-NANBs Ab in the form of Ag / Ac complexes, these can be infectious. In the case of immune complexes masking Ag NANB / s and e, or of a sudden drop in synthesis, high-titer antiNANBc Ab keep all their value for identifying a dangerous donor. It is even one of their essential interests.
γ) Il semble qu'inversement au virus HB il y ait aussi des cas avec de grsuides quantités d'Ag NANBe, et NANBs accessoirement, où les anti-NANBc/1-2 sont à un titre très faible.γ) It seems that conversely to the HB virus there are also cases with large amounts of Ag NANBe, and NANBs incidentally, where the anti-NANBc / 1-2 are very weak.
Au total les constatations conduisent à penser que le test le plus performant pour la détection du plus grand nombre de porteurs de virus serait un test qui permettrait à la fois la détection des différents marqueurs NANBs, NANBe et anti-NANBc. Un tel test est possible et nous allons en donner le principe. Réalisation d'un test mixte ELTSA et DRI en phase solide selon le principe du sandwich pour la détection simultanée des Ag NANB/s et e et du principe de la compétition pour les Ac anti-NANBc.In total, the findings lead us to believe that the most effective test for detecting the largest number of virus carriers would be a test that would allow the detection of the different markers NANBs, NANBe and anti-NANBc. Such a test is possible and we will give the principle. Realization of a mixed ELTSA and DRI test in solid phase according to the sandwich principle for the simultaneous detection of Ag NANB / s and e and the principle of competition for anti-NANBc Ab.
On fixe d'abord les Ac anti-NANBe et anti-NANBs sur la bille qui piégera donc Ag NANBs et NANBe, on y rajoute en vue d'une phase ultérieure des Ac anti-NANBc/1-2, on veille à ce que les Ac anti-NANBe soient aussi fortement anti-NANBc et on peut même rajouter ceux-ci.We first fix the anti-NANBe and anti-NANBs Ab on the ball which will therefore trap Ag NANBs and NANBe, we add it for a later phase of anti-NANBc / 1-2 Ac, we ensure that the anti-NANBe Ab are also strongly anti-NANBc and we can even add these.
Le réactif ainsi réalisé va être mis à incuber avec le sérum à tester. S'il y a des Ag NANBs ou NANBe ceux-ci vont se fixer. On lave et on incube avec un mélange d'Ac anti-NANB/s+e, marqués à un traceur (enzymatique dans le cas d'un test ELISA).The reagent thus produced will be incubated with the serum to be tested. If there are Ag NANBs or NANBe these will settle. Wash and incubate with a mixture of anti-NANB / s + e Ac, labeled with a tracer (enzymatic in the case of an ELISA test).
On révèle les cas positifs par photométrie.Positive cases are revealed by photometry.
Si le sérum est positif, il est infectieux et ne peut être transfusé. On pourra analyser ultérieurement quel est l'Ag en cause.If the serum is positive, it is infectious and cannot be transfused. We can analyze later what is the Ag in question.
Si le sérum est négatif, ce n'est pas une preuve absolue qu'il n'est pas infectieux, simplement il est possible que les Ag NANBe et s ne soient pas détectables au seuil de sensibilité du test Elisa tel qu'il est construit.If the serum is negative, this is not absolute proof that it is not infectious, simply it is possible that the Ag NANBe and s are not detectable at the sensitivity threshold of the Elisa test as it is constructed .
Nous avons vu que ces Ag peuvent être moins abondants en phase de quiescence ou bien être masqués, mais le sang et le sérum restent infectieux.We have seen that these Ag may be less abundant in the quiescent phase or be masked, but the blood and serum remain infectious.
On recherche alors les Ac anti-NANBc de la façon suivante. Au rëac-tif qui porte les Ac anti-NANBc/1+2, on rajoute une quantité déterminée d'Ag NANBc/1+2 dilué dans du sérum humain normal. On rajoute ensuite le sérum où l'on veut détecter les Ac anti-NANBc/1+2, et des Ac anti-NANBc/1+2 couplés à un traceur radioactif, par exemple I 125. Après incubation, si le sérum à tester contient des Ac anti-NANBc/1+2, ceux-ci vont diminuer la fixation des Ac marqués du traceur sur le réactif auquel on a ajouté l'Ag NANBc/1+2.We then look for anti-NANBc Ab as follows. To the reagent which carries the anti-NANBc / 1 + 2 Ab, a determined amount of Ag NANBc / 1 + 2 diluted in normal human serum is added. We then add the serum where we want to detect anti-NANBc / 1 + 2 Ab, and anti-NANBc / 1 + 2 Ab coupled to a tracer radioactive, for example I 125. After incubation, if the serum to be tested contains anti-NANBc / 1 + 2 Ab, these will decrease the binding of the marked Ab of the tracer to the reagent to which the NANBc Ag / 1 + 2.
Une réduction de plus de 50% au nombre de coups comptés par spectromètre Gamma permet de conclure que le sérum testé est positif aux Ac anti-NANBc.A reduction of more than 50% in the number of counts counted by Gamma spectrometer makes it possible to conclude that the serum tested is positive for anti-NANBc Ab.
On va ainsi à nouveau retrouver un certain nombre de sérums infectieux marqués par la première phase du test, car le test sera calibré pour repérer les cas avec l'anti-NANBc/ 1+2 de titre supérieur à 1/500 signant l'existence d'un virus en rêplication active.We will thus again find a certain number of infectious sera marked by the first phase of the test, because the test will be calibrated to identify cases with anti-NANBc / 1 + 2 with a titer greater than 1/500 signifying the existence of an actively replicating virus.
Au total le test proposé est un test en deux temps ou un double test, l'un étant un test immunoenzymatique, l'autre un test radioimmunologique. Dans le cas particulier décrit ici,In total, the proposed test is a two-step test or a double test, one being an immunoenzymatic test, the other a radioimmunological test. In the particular case described here,
la première phase est un test immunoenzymatique recherchant à la fois NANB/e et s selon la méthode du sandwich, etthe first phase is an immunoenzymatic test looking for both NANB / e and s according to the sandwich method, and
la deuxième phase est un test radioimmunologique recherchant les anti-NANBc/1+2 selon un principe de compétition entre l'Ac à tester et l'Ac fixé au traceur.the second phase is a radioimmunological test looking for anti-NANBc / 1 + 2 according to a principle of competition between the Ab to be tested and the Ab attached to the tracer.
D. Construction d'un réactif pour la détection du VHB et NANB.D. Construction of a reagent for the detection of HBV and NANB.
Un autre aspect important de l'invention est donc la démonstration d'une réactivité croisée entre les Ag des virus B et NANB maximum pour HBe/3 et NANBe, intermédiaire HBc et NANBc/1 et 2, et très faible mais non nulle pour HBs et NANBs (en immunodiffusion avec Ac très purifiés).Another important aspect of the invention is therefore the demonstration of a cross reactivity between the Ags of viruses B and NANB maximum for HBe / 3 and NANBe, intermediate HBc and NANBc / 1 and 2, and very weak but not zero for HBs and NANBs (in immunodiffusion with highly purified Ab).
Ces réactivités croisées ne sont pas suffisantes avec les réactifs commerciaux disponibles actuellement pour le VHB (sauf exception) pour détecter le virus NANB. En particulier en ce qui concerne la réactivité croisée maximum elle existe entre HBe/3 NANBe, mais pas avec HBe/1-2 qui représentent la base des tests DRI commercialisés jusqu'à ce jour.These cross-reactivities are not sufficient with the commercial reagents currently available for HBV (except exception) to detect the NANB virus. In particular with regard to maximum cross-reactivity, it exists between HBe / 3 NANBe, but not with HBe / 1-2 which represent the basis of the DRI tests marketed to date.
Plusieurs tests pour le dépistage simultané des virus B et NANB peuvent être conçus.Several tests for the simultaneous detection of viruses B and NANB can be designed.
1º/ Dépistage simultané des Ag HBs NANBs et NANBe (test sandwich)1º / Simultaneous screening of HBs Ag NANBs and NANBe (sandwich test)
a) On fixe sur le support solide les trois Ac anti-HBs, antiNANBs, et anti-NANBe, en mélange.a) The three anti-HBs, antiNANBs, and anti-NANBe Ab are fixed on the solid support, in a mixture.
On peut utiliser soit des Ac spécifiques d'animaux hyperimmunisés avec haute constante d'affinité, soit des Ac monoclonaux obtenus par la technique des hybridomes, soit des Ac humains polyclonaux rendus monospécifiques pour l'Ag voulu.It is possible to use either specific antibodies from hyperimmunized animals with a high affinity constant, or monoclonal Ab obtained by the hybridoma technique, or polyclonal human Ab made monospecific for the desired Ag.
Si on a soin de sélectionner les Ac de classe IgM on peut augmenter la sensibilité du test.If care is taken to select the IgM class Ig we can increase the sensitivity of the test.
b) L'incubation du sérum à tester se fait de façon standard.b) The incubation of the serum to be tested is carried out as standard.
c) Le traceur est également un mélange des 3 Ac couplés soit à I125 en DRI soit â une enzyme (phosphatase alcaline ou peroxydase) en Elisa.c) The tracer is also a mixture of the 3 Ab coupled to either I 125 in DRI or to an enzyme (alkaline phosphatase or peroxidase) in Elisa.
Là encore, l'utilisation d'IgM monoclonaux de haute avidité et de spécificité voulue peut augmenter les performances du test.Again, the use of monoclonal IgM of high avidity and desired specificity can increase the performance of the test.
On effectue la révélation selon les techniques classiques.The revelation is carried out according to conventional techniques.
2º/ Autre réactif pour la détection simultanée des Ag NANBs, HBs', NANBe et de l'Ac anti-NANBc. On fixe sur le support solide quatre Ac: anti-NANBs, anti-HBs, anti-NANBe et anti-NANBc/1 et 2. On met en contact avec une solution contenant de l'Ag NANBc dans du sérum humain normal puis avec le sérum à tester et on ajoute des Ac anti-NANBc/1-2 marqués par exemple à un traceur radioactif (I125). Après lavage et révélation, si plus de 50% de l'Ac anti-NANBc radioactif est fixé au support c'est que le sérum était négatif pour les Ac anti-NANBc/ 1-2.2º / Other reagent for the simultaneous detection of Ag NANBs, HBs', NANBe and anti-NANBc Ac. Four Ac are fixed on the solid support: anti-NANBs, anti-HBs, anti-NANBe and anti-NANBc / 1 and 2. It is brought into contact with a solution containing Ag NANBc in normal human serum and then with serum to be tested and anti-NANBc / 1-2 Ac labeled, for example, are added to a radioactive tracer (I 125 ). After washing and revelation, if more than 50% of the radioactive anti-NANBc Ab is attached to the support, it means that the serum was negative for anti-NANBc / 1-2 Ab.
On met ensuite le réactif au contact d'une préparation d'anticorps anti-HBs, anti-NANBs et anti-NANBe couplés à un traceur différent de celui choisi pour la 1ère étape, donc ici enzymatique, peroxydase par exemple.The reagent is then brought into contact with a preparation of anti-HBs, anti-NANBs and anti-NANBe antibodies coupled to a tracer different from that chosen for the 1st step, therefore here enzymatic, peroxidase for example.
Après lavage et révélation, si les Ac marqués sont fixés sur le support c'est que le sérum à tester était positif pour l'un des Ag et donc infectieux.After washing and revelation, if the labeled Abs are fixed on the support, it means that the serum to be tested was positive for one of the Ags and therefore infectious.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.The following examples illustrate the invention without, however, limiting it.
EXEMPLE 1EXAMPLE 1
Réalisation d'un réactif avec l'Ac anti-NANBe.Realization of a reagent with anti-NANBe Ac.
On utilise des billes de polystyrène commercialisées par la Société PRECISION PLASTIC BALL (U.S.A.).Polystyrene beads sold by the company PRECISION PLASTIC BALL (U.S.A.) are used.
Les billes sont lavées dans l'éthanol pur avec agitation énergique pendant une nuit à température ambiante. Elles sont ensuite lavées à l'eau distillée et séchées en étuve à 37°C.The beads are washed in pure ethanol with vigorous stirring overnight at room temperature. They are then washed with distilled water and dried in an oven at 37 ° C.
Au départ d'un sérum reconnu positif à l'Ac anti-NANBe, on précipite les IgG par addition d'une solution de sulfate d'ammonium à 33%. On purifie ensuite les gammaglobulines précipitées par chromatographie sur gel de DEAE Cellulose selon les méthodes connues de purification des gammaglobulines. Les fractions contenant les IgG sont diluées dans un tampon tris 0,01M de pH 7,2 jusqu'à une concentration de 50 μg/ml. On laisse incuber les billes dans la solution diluée, en agitant doucement, pendant 18 heures à température ambiante.Starting from a serum recognized as positive for anti-NANBe Ab, the IgGs are precipitated by the addition of a 33% ammonium sulphate solution. The gammaglobulins are then purified precipitated by DEAE Cellulose gel chromatography according to known methods for the purification of gamma globulins. The fractions containing the IgGs are diluted in a 0.01M tris buffer of pH 7.2 to a concentration of 50 μg / ml. The beads are incubated in the diluted solution, with gentle agitation, for 18 hours at room temperature.
On sépare les billes ainsi incubées puis on les fait incuber dans une solution d'albumine bovine à 5% en tampon phosphate 0,02M glygocolle 0,3M de pH 7,5.The beads thus incubated are separated and then they are incubated in a solution of bovine albumin at 5% in 0.02M phosphate buffer, 0.3M glygocolle of pH 7.5.
Après incubation pendant.4 heures à température ambiante, en agitant doucement de temps en temps, on sépare les billes, les lave à l'eau distillée et les sèche à 37°C. On peut ensuite les conserver à température de 4°C.After incubation for 4 hours at room temperature, shaking gently from time to time, the beads are separated, washed with distilled water and dried at 37 ° C. They can then be stored at a temperature of 4 ° C.
Le réactif constitué par les billes ainsi obtenues peut servir à la détection de l'antigène correspondant à l'anticorps fixé, selon une méthode dite "sandwich" qui est décrite ci-après.The reagent constituted by the beads thus obtained can be used for the detection of the antigen corresponding to the fixed antibody, according to a method called "sandwich" which is described below.
Réalisation du test "sandwich" pour la détection d'un antigène.Realization of the "sandwich" test for the detection of an antigen.
Le principe du test est le suivant :The principle of the test is as follows:
On incube 200 μl de sérum à tester avec une bille revêtue comme précédemment, pendant 18 heures à température ambiante.200 μl of serum to be tested are incubated with a coated bead as above, for 18 hours at room temperature.
Ensuite on lave la bille à l'eau distillée.Then wash the ball with distilled water.
On incube alors la bille dans 200 μl d'un traceur radioactif pendant 4 heures à 37ºC. On lave la bille puis on effectue un comptage de radioactivité pendant une minute avec un spectromètre de radiations gamma type PACKARD par exemple. On procède par comparaison avec des sérums témoins reconnus négatifs à l'Ag NANBe. Les sérums pour lesquels on observe un nombre de coups par minute deux fois supérieur au nombre de coups par minute observé pour les sérums témoins négatifs, sont considérés comme posititifs.The bead is then incubated in 200 μl of a radioactive tracer for 4 hours at 37ºC. The ball is washed and then a radioactivity count is carried out for one minute with a PACKARD type gamma radiation spectrometer for example. This is done by comparison with control sera recognized to be negative with NANBe Ag. Sera for which a number of counts per minute twice the number of counts per minute observed for negative control sera are observed, are considered to be positive.
Le traceur radioactif est préparé de la façon suivante :The radioactive tracer is prepared as follows:
- des Ac anti-NANBe purifiés sont marqués avec l'iode radioactif par la chloramine T qu'on dilue ensuite de façon à obtenir entre 5.10 et 106 CPM/200 μl (soit la quantité que l'on applique sur une bille pendant la deuxième incubation).- purified anti-NANBe Ab are marked with radioactive iodine by chloramine T which is then diluted so as to obtain between 5.10 and 10 6 CPM / 200 μl (i.e. the quantity which is applied to a bead during the second incubation).
Le diluant a la formule suivante :The diluent has the following formula:
- Tris HCl 0,01M pH 7,5- Tris HCl 0,01M pH 7,5
- NaN3 0,1%- NaN 3 0.1%
- sérum humain normal (SHN) 10%- normal human serum (NHS) 10%
- sérum de veau Foetal (SVF) 50%.- Fetal calf serum (SVF) 50%.
Le marquage selon la méthode décrite par GREENWOOD est réalisé par exemple de la façon suivante : On utilise 1,5 mCi d'iodure de sodium marqué à l'iode radioactif, que l'on ajoute à 50 μl d'IgG (anticorps anti-NANBe purifié) à 1 g/l en solution dans un tampon phosphate 0,05M pH 7,5. On ajoute ensuite la chloramine T et le mëtabisulfite selon la méthode de GREENWOOD.The labeling according to the method described by GREENWOOD is carried out for example as follows: 1.5 mCi of sodium iodide labeled with radioactive iodine is used, which is added to 50 μl of IgG (anti- Purified NANBe) at 1 g / l in solution in 0.05M phosphate buffer pH 7.5. Chloramine T and metabisulfite are then added according to the GREENWOOD method.
On passe ensuite la solution obtenue sur une colonne DOWEX 2X 8000 de diamètre de gel 100-200 mesh. On utilise 3ml de gel. On recueille 3ml d'éluat que l'on passe sur une colonne de SEPHADEX G25% (10ml de gel). On récupère les cinq premiers millilitres élues après le volume mort de la colonne. Ils contiennent l ' anticorps marqué à l ' iode radioactif .The solution obtained is then passed through a DOWEX 2X 8000 column with a gel diameter of 100-200 mesh. We use 3ml of gel. 3 ml of eluate are collected and passed over a column of SEPHADEX G25% (10 ml of gel). The first five milliliters eluted after the dead volume of the column are recovered. They contain the antibody labeled with radioactive iodine.
EXEMPLE 2EXAMPLE 2
Réalisation d'un réactif pour les Ac anti-NANBcRealization of a reagent for anti-NANBc Ab
Purification des Ag NANBc1 et NANBc2. (et HBc)Purification of Ag NANBc1 and NANBc2. (and HBc)
a) purification à partir du foiea) purification from the liver
Un homogénat de foie est préparé par broyage à partir d'un foie d'autopsie d'un malade décédé d'hépatite NANB et dont le foie a été trouvé positif en immunofluorescence directe avec un antiNANBc conjugué pour l'Ag correspondant NANBcl ou 2.A liver homogenate is prepared by grinding from an autopsy liver of a patient who has died of NANB hepatitis and whose liver has been found positive in direct immunofluorescence with an antiNANBc conjugated for the corresponding Ag NANBcl or 2.
Le broyage est effectué en présente d'un tampon Tris HCl 0,05 M, pH = 7,6 + 0,25 M Sucrose + 0,006 M Mg Cl2, + 0,025 M KCl. Le broyât brut est filtré. L'homogénat est centrifugé 20 minutes à 4000g (+4ºC). Le culot est resuspendu dans le même tampon, homogénéise et centrifugé 20 minutes à 4000g. Cette opération est recommencée 2 fois. Le culot final est resuspendu dans un tampon Tris -HCl pH 7,6 0,05M + NaCl 0,15 M + détergent non ionique NP 40 0,1% + β mercaptoéthanol 0,02% + pronase E (70000 PUK/g MERCK) à concentration finale de 0,1%.The grinding is carried out in the presence of a 0.05 M Tris HCl buffer, pH = 7.6 + 0.25 M Sucrose + 0.006 M Mg Cl 2 , + 0.025 M KCl. The raw ground material is filtered. The homogenate is centrifuged for 20 minutes at 4000g (+ 4ºC). The pellet is resuspended in the same buffer, homogenized and centrifuged for 20 minutes at 4000 g. This operation is repeated 2 times. The final pellet is resuspended in a Tris -HCl buffer pH 7.6 0.05M + 0.15 M NaCl + non-ionic detergent NP 40 0.1% + β mercaptoethanol 0.02% + pronase E (70,000 PUK / g MERCK ) at a final concentration of 0.1%.
Après 1 heure à 37ºC et 1 nuit à +4° C, on soumet à une centrifugation pendant 20 minutes à 10000 RPM. On élimine le culot. Le surnageant est centrifugé 16 heures à 27000 RPM sur 10 ml d'un gradient de sucrose 10-20% en tampon Tris-EDTA 10 mM + NaCl 1M. Les culots sont repris dams CsCl (d=1,22g/cm ) en tampon Tris EDTA 10mM + BSA 0,1% (volume final : 5ml ) et on dépose sur 28 ml d'un gradient de Cs Cl 1,28 - 1,43 g/cm , le tube est complété avec Cs Cl (1,18 g/cm3) et centrifugé 40 heures à +4°C et 25000 RPM.After 1 hour at 37ºC and 1 night at + 4 ° C, it is subjected to centrifugation for 20 minutes at 10,000 RPM. The pellet is eliminated. The supernatant is centrifuged for 16 hours at 27,000 RPM on 10 ml of a 10-20% sucrose gradient in 10 mM Tris-EDTA buffer + 1M NaCl. The pellets are taken up in CsCl (d = 1.22 g / cm) in Tris EDTA 10 mM buffer + 0.1% BSA (final volume: 5 ml) and a gradient of Cs Cl 1.28 - 1 is deposited on 28 ml. , 43 g / cm, the tube is completed with Cs Cl (1.18 g / cm 3 ) and centrifuged for 40 hours at + 4 ° C and 25,000 RPM.
Le gradient est récolté par le fond du tube en fractions de 1,2ml qui sont dialysées après lecture de l'index sur répaσtomètre. Les fractions positives sont rassemblées et centrifugées sur coussin de sucrose 10-20%.The gradient is collected by the bottom of the tube in fractions of 1.2 ml which are dialyzed after reading the index on a reparometer. The positive fractions are collected and centrifuged on a 10-20% sucrose cushion.
On peut procéder ensuite à une nouvelle ultracentrifugation en gradient de sucrose. Les fractions concentrées sont mises sur un gradient continu de 15 à 55% de sucrose préparé en tampon TSA (tampon Tris 0,05 Hcl pH 7,6 0,15M NaCl et 0,02% Na3) et ultracentrifugées pendant 18 heures à 24000 t/mn à 4º dans le rotor SW27.We can then proceed to a new ultracentrifugation in sucrose gradient. The concentrated fractions are placed on a continuous gradient of 15 to 55% of sucrose prepared in TSA buffer (Tris buffer 0.05 Hcl pH 7.6 0.15 M NaCl and 0.02% Na3) and ultracentrifuged for 18 hours at 24,000 t / min at 4º in the rotor SW27.
Des fractions d'1,5ml sont ensuite collectées à partir du bas du tube puis testées pour la DNA polymérase et pour les Ag NANBc. La densité de chaque fraction est déterminée par l'index de réfraction dans un rëfractomètre ABBE. Toutes les fractions sont conservées à 4º.1.5 ml fractions are then collected from the bottom of the tube and then tested for DNA polymerase and for NANBc Ag. The density of each fraction is determined by the index of refraction in an ABBE refractometer. All fractions are kept at 4º.
C'est ce corps purifié et/ou plutôt le mélange des fractions ainsi obtenues pour NANBc1 et NANBc2 (ainsi que pour l'Ag HBc éventuellement), qui pourra être utilisé soit pour être fixé directement sur une bille pour détecter les anticorps antiNANBc, soit pour être rajouté dans un 2ème temps si on réalise le test IgM.It is this purified body and / or rather the mixture of the fractions thus obtained for NANBc1 and NANBc2 (as well as for HBc Ag possibly), which can be used either to be fixed directly on a bead to detect antiNANBc antibodies, or to be added in a second step if the IgM test is carried out.
Purification des antigènes capsidiques NANBc1 et 2 (ou HBc) à partir du sérum.Purification of NANBc1 and 2 (or HBc) capsid antigens from serum.
Pour cela, on choisit un sérum NANBe très positif provenant de donneurs de sang ou de malades et si possible de sujets immunodéprimés tels que les hémodialysés et des leucémiques qui sont réputés pour avoir de grandes quantités de virus circulant, ayant un titre très élevé d'Ag NANBe par exemple 1/8 en CEP ainsi que d'Ag NANBs, et surtout pour lesquels en faisant la réaction d'ADN polymérase sur un culot d'ultracentrifugation du sérum ainsi repéré, on trouve une activité ADN polymérase. Après avoir ainsi identifié les sujets qui peuvent représenter des sources intéressantes de virus complet, on obtient chez eux une quantité importante de plasma ou sérum prélevé soit lors d'un don de sang, soit lors d'une plasmaphérèse suivie de recalcification du plasma. On procède ensuite à une ultracentrifugation.For this, we choose a very positive NANBe serum from blood donors or patients and if possible from immunocompromised subjects such as hemodialysis patients and leukemia patients who are reputed to have large quantities of circulating virus, having a very high titer of Ag NANBe for example 1/8 in CEP as well as Ag NANBs, and especially for which, by making the DNA polymerase reaction on a pellet of ultracentrifugation of the serum thus identified, there is DNA polymerase activity. Having thus identified the subjects which may represent interesting sources of complete virus, a large quantity of plasma or serum is obtained from them either during a blood donation or during a plasmapheresis followed by recalcification of the plasma. An ultracentrifugation is then carried out.
On commence en partant de 18,5ml de sérum qui sont clarifiés puis qui sont centrifugés à travers 20ml d'un gradient continu de sucrose 10-20% sur rotor SW27, 20 heures à 25000 RPM puis le culot obtenu est repris dans du chlorure de césium.We start by starting from 18.5 ml of serum which are clarified and which are then centrifuged through 20 ml of a continuous gradient of sucrose 10-20% on rotor SW27, 20 hours at 25000 RPM then the pellet obtained is taken up in chloride of cesium.
Les fractions sont récupérées à partir du bas du tube qui est perforé. On recueille des fractions de 0,5ml sur lesquelles on va mesurer l'index de réfraction dans le réfractomètre ABBE l'activité ADN polymérase et l'Ag NANBs. On va sélectionner les fractions positives pour l'activité ADN polymérase si on s'assure en microscopie électronique qu'elles contiennent bien la particule virale complète à double membrane correspondant au virion complet.The fractions are collected from the bottom of the tube which is perforated. 0.5 ml fractions are collected on which the refractive index will be measured in the ABBE refractometer the DNA polymerase activity and the Ag NANBs. We will select the positive fractions for the DNA polymerase activity if we make sure in electron microscopy that they contain the complete double membrane viral particle corresponding to the complete virion.
Pour obtenir l'Ag NANBc qui est représenté par le centre de ces virus complets on reprend cette fraction et la recentrifuge, après l'avoir mélangée à 2 volumes de solution riche en particules virales complètes avec 1 volume de détergent Nonitet P40 10% (Shell Company), sur un gradient 15-55% de sucrose entampon TSA comme décrit plus haut pour la purification à partir du foie. Les fractions sont testées pour l'activité ADN polymérase et les Ag capsidiques NANBc par CEP. Les fractions positives en Ag sont récupérées et traitées comme décrit cidessus. Elles serviront à la préparation du réactif.To obtain the Ag NANBc which is represented by the center of these complete viruses, this fraction is taken up and the recentrifuge, after having mixed it with 2 volumes of solution rich in complete viral particles with 1 volume of detergent Nonitet P40 10% (Shell Company), on a 15-55% sucrose entampon TSA gradient as described above for purification from the liver. The fractions are tested for DNA polymerase activity and NANBc capsid Ag by CEP. The positive Ag fractions are collected and treated as described above. They will be used to prepare the reagent.
Réalisation du réactifReagent realization
a) test anti-NANBc simplea) simple anti-NANBc test
Lavage des billes de polystyrène-vierges (cf test HBC ci-dessus) b) couplage par adsorption de l'Ag NANBc sur les billes. Une solution en proportions convenables soit d'Ag NANBc1 et 2 soit mélangée à de l'Ag HBc est fixée sur les billes par incubation dans l'Ag par agitation 12 à 18 heures à température ambiante.Washing of virgin polystyrene beads (see HBC test above) b) coupling by adsorption of Ag NANBc on the beads. A solution in suitable proportions either of Ag NANBc1 and 2 or mixed with HBc Ag is fixed on the beads by incubation in Ag by stirring 12 to 18 hours at room temperature.
c) saturation des billes, l'excès d'Ag après couplage est éliminé et sans lavage préalable on ajoute aux billes une solution tampon pH 7.5 phosphate 0,02M glycocolle 0,3M albumine bovine 5%. On incube 4 heures à température ambiante, on agite doucement à intervalles réguliers.c) saturation of the beads, the excess of Ag after coupling is removed and without prior washing, a buffer solution pH 7.5 0.02M phosphate 0.3M glycine 5% bovine albumin is added to the beads. Incubate 4 hours at room temperature, stir gently at regular intervals.
d) Les billes sont lavées à l'eau distillée, elles sont séchées à 37° et conservées à 4°. Ces billes couplées à l'Ag sont prêtes à être utilisées pour la détection de l'anti-NANBc correspondant ou bien des différents anticorps anti-capsides.d) The beads are washed with distilled water, they are dried at 37 ° and stored at 4 °. These Ag-coupled beads are ready to be used for the detection of the corresponding anti-NANBc or of the various anti-capsid antibodies.
e) préparation du traceur : il s'agit d'anticorps anti-NANBcl, 2 et/ou anti-HBc. On prend 50 yl d'IgG avec l'activité anticorps choisie à 1 μg/μl dans du tampon phosphate à 0,05M pH 7.5, soit 50 μg de protéines. On dispose de 1,5 mCi de iodure de sodium contenant I 125.e) preparation of the tracer: these are anti-NANBcl, 2 and / or anti-HBc antibodies. We take 50 μl of IgG with the antibody activity chosen at 1 μg / μl in 0.05M phosphate buffer pH 7.5, ie 50 μg of proteins. 1.5 mCi of sodium iodide containing I 125 is available.
50 1 de phosphate 0,5M pH 7.5 sont mélangés avec la chloramine T et du métabisulfite selon la technique de Greenwood.50 l of 0.5M phosphate pH 7.5 are mixed with chloramine T and metabisulfite according to the Greenwood technique.
A la fin du marquage, passage immédiat sur colonne Dowex 2 × 8 cm 0 100 à 200 mesh (3ml de gel). On récupère 3ml puis on passe sur colonne Sephadex G 25 soit 10ml de gel. Les 5 premiers ml après le volume mort de la colonne sont récupérés et contiennent l'anticorps marqué à l'iode radioactif séparé de l'iode libre. Le traceur est dilué dans un diluant traceur (cf test HBe ci-dessus) pour l'analyse d'une dilution dans ce milieu de façon à obtenir entre 500.000 et 1.000.000 de coups par minute pour 200 μl.At the end of the marking, immediate passage through a Dowex column 2 × 8 cm 0 100 to 200 mesh (3 ml of gel). 3 ml are recovered and then passed through a Sephadex G 25 column, ie 10 ml of gel. The first 5 ml after the dead volume of the column are recovered and contain the antibody labeled with radioactive iodine separated from the free iodine. The tracer is diluted in a tracer diluent (see HBe test above) for the analysis of a dilution in this medium so as to obtain between 500,000 and 1,000,000 counts per minute for 200 μl.
Réalisation du test proprement dit La bille recouverte d'Ag NANBc est incubée avec 200 yl de sérum à tester pendant 18 heures à température ambiante.Realization of the test itself The ball covered with Ag NANBc is incubated with 200 μl of test serum for 18 hours at room temperature.
Ensuite on lave à l'eau distillée abondamment.Then wash with abundant distilled water.
On incube avec 200 μl de traceur radioactif contenant donc 500.000 à 1.000.000 de CPM, l'incubation a lieu pendant 4 heures 37° au bain-marie.Incubate with 200 μl of radioactive tracer thus containing 500,000 to 1,000,000 CPM, the incubation takes place for 4 hours 37 ° in a water bath.
On lave à nouveau comme précédemment décrit et on compte 1 minute dans un spectromètre de radiation gamma Packard.Wash again as previously described and count for 1 minute in a Packard gamma radiation spectrometer.
Calcul des positifs; il se fait par comparaison avec les résultats obtenus dans des sérums négatifs. Un sérum est positif si le nombre de coups/minute est inférieur à 50% de celui obtenu pour la moyenne des sérums témoins négatifs soit une inhibition de plus de 50% de la radioactivité. Au lieu d'utiliser un traceur radioactif, on peut utiliser un traceur enzymatique représenté par un marquage des anticorps à la peroxydase (HRP), RZ30 Boehringer Manheim bH West Germany. Ce couplage est fait selon la méthode de Nakane, Journal Histochemistry Cytochemistry, 22 : 1084-1091 (1974).Calculation of positives; it is done by comparison with the results obtained in negative sera. A serum is positive if the number of counts / minute is less than 50% of that obtained for the average of the negative control sera, ie an inhibition of more than 50% of the radioactivity. Instead of using a radioactive tracer, an enzymatic tracer represented by labeling of antibodies to peroxidase (HRP), RZ30 Boehringer Manheim bH West Germany, can be used. This coupling is made according to the method of Nakane, Journal Histochemistry Cytochemistry, 22: 1084-1091 (1974).
Test pour la détermination des anti NANBc IgM Une bille de polystyrène est couplée initialement avec l'anticorps anti-IgM humaines, de mouton ou de lapin, ce sont les mêmes conditions de couplage de la bille que pour les anticorps anti-NANBe (voir exemple 1).Test for the determination of anti NANBc IgM A polystyrene bead is initially coupled with the anti-human IgM, sheep or rabbit antibodies, these are the same ball coupling conditions as for the anti-NANBe antibodies (see example 1).
Ensuite avec 200 μl de sérum dilués au 500ème dans un tampon 0,01 PBS pH 7.2 0,05 Tween-20 (PBS TW)on lave la bille.Then with 200 μl of serum diluted to 500th in a buffer 0.01 PBS pH 7.2 0.05 Tween-20 (PBS TW) the ball is washed.
On rajoute 200 μl d'une solution de sérum humain normal contenant des antigènes NANBc1, 2 et HBc séparément ou ensemble. On incube à nouveau 16 à 24 heures à la température ambiante. Nouveau lavage, nouvelle incubation avec le traceur dilué convenablement, incubation 4 heures à 37°. Lavage.200 μl of a normal human serum solution containing NANBc1, 2 and HBc antigens are added separately or together. Incubate again 16 to 24 hours at room temperature. New washing, new incubation with the tracer suitably diluted, incubation for 4 hours at 37 °. Washing.
Dans ce cas le traceur n'est pas simplement réalisé par le marquage des anticorps complets à l'iode radioactif, il s'agit d'anticorps partiellement coupés que l'on appelle fragments F (ab') 2 ceci afin d'éviter une réaction non spécifique avec le facteur rhumatoïde qui est une anti-IgM non spécifique de l'hépatite. Donc les anticorps anti-NANBc de classe IgG sont transformés en fragments F (ab') 2 par la méthode de Rossi (Nature 223:837, 1969).In this case, the tracer is not simply produced by labeling the complete antibodies with radioactive iodine, they are partially cut antibodies which are called fragments F (ab ′) 2 this in order to avoid a nonspecific reaction with rheumatoid factor which is a nonspecific anti-IgM for hepatitis. Therefore anti-NANBc antibodies of class IgG are transformed into F (ab ') 2 fragments by the Rossi method (Nature 223: 837, 1969).
Pour cela simplement les IgG sont digérés avec la pepsine (2700ug/mg à pH 4.3 pendant 20h) l'action est stoppée en ajoutant du Tris hydroxyméthyl aminoêthane à pH8.For that simply the IgG are digested with pepsin (2700ug / mg at pH 4.3 for 20h) the action is stopped by adding Tris hydroxymethyl aminoethane at pH8.
Les petits peptides et les fragments F (c') sont enlevés par filtration sur gel sur Sephadex G50. Les IgG non digérés par l'action de la pepsine sont éliminés par absorption sur une colonne immunoabsorbante couplée à un anticorps anti-Gamma F (c) humain couplé à du Sepharose 4B par du bromure de cyanogène.The small peptides and the F fragments (c ') are removed by gel filtration on Sephadex G50. IgGs not digested by the action of pepsin are eliminated by absorption on an immunoabsorbent column coupled to an anti-human Gamma F (c) antibody coupled to Sepharose 4B by cyanogen bromide.
Préparation des anticorps anti-NANBcPreparation of anti-NANBc antibodies
Les anticorps anti-NANBc 1 et 2 de titre très élevé peuvent être soit obtenus chez des malades dont le sérum apparaît en immunofluorescence avoir des titres supérieurs au 1/100ème en IF indirecte, soit chez des animaux immunisés avec les Ag NANBc 1 et 2. Ces anticorps peuvent soit être directement conjugés au traceur radioactif ou enzymatique, soit être utilisés pour la préparation des fragments F (ab') 2. Inversement, on peut utiliser les Ag NANBc1 NANBc2 purifiés et immuniser des lapins ou cobayes avec ces antigènes comme décrit pour la préparation des anti-NANBe à partir des Ag NANBe purifiés. EXEMPLE 3 - Purification de l'Ag NANBsVery high titer anti-NANBc 1 and 2 antibodies can either be obtained from patients whose serum appears in immunofluorescence to have titers higher than 1 / 100th in indirect IF, or from animals immunized with NANBc 1 and 2 Ag. These antibodies can either be directly conjugated to the radioactive or enzymatic tracer, or can be used for the preparation of the F (ab ') 2 fragments. Conversely, the purified NANBc1 NANBc2 Ag can be used and immunize rabbits or guinea pigs with these antigens as described for the preparation of anti-NANBe from purified NANBe Ag. EXAMPLE 3 - Purification of Ag NANBs
L'Ag NANBs peut être purifié par exemple de la façon suivante.Ag NANBs can be purified for example as follows.
a) Choix des plasmas positifs pour l'antigène NANBsa) Choice of positive plasmas for the NANBs antigen
Les sujets ayant été trouvés porteurs d'antigène NANBe au cours de programmes de détection systématique de cet antigène et de transaminases chez des donneurs de sang, ou bien à l'occasion de perturbations clinique et/ou biologiques, hépatiques, en particulier, des transaminases (notamment TGP) ou des gammas glutamyl transpeptidases chez des consultants plus ou moins symptomatiques, sont également testés pour l'antigène NANBs en immuno-diffusion et contre-électrophorèse.Subjects who have been found to be carrying the NANBe antigen during systematic detection programs for this antigen and transaminases in blood donors, or during clinical and / or biological, liver, in particular, transaminase disturbances (in particular TGP) or gammas glutamyl transpeptidases in more or less symptomatic consultants, are also tested for the NANBs antigen in immunodiffusion and counterelectrophoresis.
Nous avons observé que 5% des donneurs de sang environ ont des TGP 2 fois supérieure à la normale, 80% de ces mêmes individus sont positifs pour l'Ag NANBe et plus de 15% pour l'Ag NANBs. Les sujets trouvés porteurs d'un titre suffisant d'antigène NANBs 1/4 ou 1/8 par contre-électrophorèse si possible, font l'objet d'un prélèvement de sang ou de plasma. Pour la préparation du vaccin on s'adressera de préférence à des sujets apparemment sains, les perturbations hépatiques modérées signalées ci-dessus n'étant pas rédhibitoires en elles-mêmes.We observed that approximately 5% of blood donors have TGP 2 times higher than normal, 80% of these same individuals are positive for Ag NANBe and more than 15% for Ag NANBs. The subjects found carrying a sufficient NANBs 1/4 or 1/8 antigen titer by counter-electrophoresis if possible, are subject to a blood or plasma sample. For the preparation of the vaccine, preference should be given to apparently healthy subjects, the moderate hepatic disturbances indicated above not being prohibitive in themselves.
b) Purification de l'antigène NANBs par chromatographie sur gel de sepharose CL 4-B (Pharmacia, UPSALA, Suède)b) Purification of the NANBs Antigen by Chromatography on Sepharose CL 4-B Gel (Pharmacia, UPSALA, Sweden)
Une colonne de chromatographie est équilibrée avec du tampon tris 0,05M HCl 0,15M, pH 7,6. On applique sur la colonne une fraction sêrique enrichie d'antigène NANBs (par une précipitation préalable au sulfate d'ammonium à 60% suivie de dialyse contre le même tampon), une telle fraction de 5ml réagissant fortement pour l'antigène NANBs est posée sur la colonne. L'élution se fait avec le même tampon et le débit est réglé à 25ml par heure. Des fractions de 5ml sont collectées et testées pour l'antigène NANBs et pour l'antigène NANBe en immunodiffusion et C.E.P. (contre-électrophorèse).A chromatography column is equilibrated with 0.05 M 0.15 M HCl buffer, pH 7.6. A seric fraction enriched with NANBs antigen is applied to the column (by prior precipitation with 60% ammonium sulfate followed by dialysis against the same buffer), such a fraction of 5 ml reacting strongly for the NANBs antigen is placed on the column. The elution is carried out with the same buffer and the flow rate is adjusted to 25 ml per hour. 5ml fractions are collected and tested for the NANBs antigen and for the NANBe antigen in immunodiffusion and CEP (counterelectrophoresis).
L'analyse des fractions recueillies fait apparaître 5 pics de protéines par mesure de la densité optique à 280nm, L'antigène NANBs est détecté dans les premières fractions, immédiatement après le volume d'exclusion de la colonne. C'est dans ces premières fractions que l'on observe le titre le plus élevé d'antigène NANBs, atteignant 1/32 en C.E.P. Les fractions ultérieures, ont un titre plus bas. Et elles sont également positives pour l'antigène NANBe. Les fractions NANBs très positives sont réunies et repassées une nouvelle fois sur la colonne pour augmenter la qualité de la séparation.Analysis of the fractions collected reveals 5 protein peaks by measuring the optical density at 280 nm. The NANBs antigen is detected in the first fractions, immediately after the column exclusion volume. It is in these first fractions that the highest titer of NANBs antigen is observed, reaching 1/32 in C.E.P. Subsequent fractions have a lower title. And they are also positive for the NANBe antigen. The very positive NANBs fractions are combined and ironed again on the column to increase the quality of the separation.
On réunit à nouveau les fractions NANBs et on les concentre pour les soumettre éventuellement à des étapes de purification ultérieures. On peut également faire suivre plusieurs séries de colonnes différentes, en particulier avec le Sepharose 6200 SUPERFINE (Pharmacia) ou l'Ag NANBs sort essentiellement dans les 2ème et 3ème pics de protéines des fractions éluées.The NANBs fractions are combined again and concentrated to optionally subject them to subsequent purification steps. We can also follow several different series of columns, in particular with Sepharose 6200 SUPERFINE (Pharmacia) or Ag NANBs comes out essentially in the 2nd and 3rd protein peaks of the eluted fractions.
L'antigène NANBs peut également être isolé par ultracentrifugation en gradient de densité de sucrose ou de chlorure de césium.The NANBs antigen can also be isolated by ultracentrifugation in a density gradient of sucrose or cesium chloride.
Il peut également être purifié par chromatographie d'affinité. Pour cela on peut utiliser divers supports tels que le Sepharose, ou un support permettant une utilisation en "batch" au lieu de colonne comme la MAGNOGEL de l'Industrie Biologique Française ; dans ce cas on incube les Ag anti-NANBs après activation du gel avec la glutaraldéhyde pour réaliser l'immunoabsorbant.It can also be purified by affinity chromatography. For this one can use various supports such as Sepharose, or a support allowing a use in "batch" instead of column like the MAGNOGEL of the French Biological Industry; in this case, the anti-NANBs Ag are incubated after activation of the gel with glutaraldehyde to produce the immunoabsorbent.
a) Préparation d'un immuno absorbant Sepharose, anti-NANBs: La fraction gammaglobulinique d'un sérum trouvé fortement positif en anticorps anti-NANBs est préparé par précipitation avec du sultate d'ammonium pH=7 à 33% de concentration finale. Le précipité est redissous en tampon 0,1M NaHCO3 et dialysé vis-à-vis d'une solution 0,5M NaCl-0,1M NaHCO3. La concentration par rapport au sérum de départ est de 3 fois. Les gammaglobulines anti-NANBs sont couplées à du Sepharose 4B activé au bromure de cyanogène (4B CNBR-Pharmacia - UPSALA- Suède), selon le procédé décrit par CUATRECASAS et AFINSEN dans Ann. Rev. Biochem.40 : 259,1971. 7g de Sepharose 4B activé au CNBr sont mis à gonfler et sont lavés sur un filtre en verre avec une solution 0,001M HCl pendant 30 minutes. Immédiatement après lavage, le gel est mélangé avec 200mg de gammaglobulines antiNANBs en solution bicarbonatée et on agite pendant 2 heures à température ambiante.a) Preparation of an Sepharose immunosorbent, anti-NANBs: The gamma globulin fraction of a serum found to be highly positive for anti-NANBs antibodies is prepared by precipitation with ammonium sultate pH = 7 at 33% final concentration. The precipitate is redissolved in 0.1M NaHCO 3 buffer and dialyzed against a 0.5M NaCl-0.1M NaHCO 3 solution. The concentration compared to the starting serum is 3 times. The anti-NANBs gamma globulins are coupled to Sepanose 4B activated with cyanogen bromide (4B CNBR-Pharmacia - UPSALA- Sweden), according to the method described by CUATRECASAS and AFINSEN in Ann. Rev. Biochem. 40: 259,1971. 7 g of CNBr-activated Sepharose 4B are swollen and are washed on a glass filter with a 0.001 M HCl solution for 30 minutes. Immediately after washing, the gel is mixed with 200 mg of antiNANBs gamma globulin in bicarbonate solution and the mixture is stirred for 2 hours at room temperature.
Le gel est ensuite lavé avec 600 ml de la solution 0,1M NaHCO3 contenant 0,5M NaCl, et traité avec 50ml d'une solution d'éthanolamine 1M pH=8 pendant 2 heures à 25°CThe gel is then washed with 600 ml of the 0.1M NaHCO 3 solution containing 0.5M NaCl, and treated with 50 ml of a 1M ethanolamine solution pH = 8 for 2 hours at 25 ° C.
Le Sepharose ainsi couplé est ultérieurement lavé alternativement avec un tampon IM NaCl, 0,1M acétate, pH=4 et un tampon 1M NaCl, 0,1M borate, pH=8,4. Le dernier lavage est fait en tampon 0,1M borate, pH=8,4 contenant 0,5M de NaCl et 0,005M d'EDTA.The Sepharose thus coupled is subsequently washed alternately with an IM NaCl buffer, 0.1M acetate, pH = 4 and a 1M NaCl buffer, 0.1M borate, pH = 8.4. The last washing is done in 0.1M borate buffer, pH = 8.4 containing 0.5M NaCl and 0.005M EDTA.
b) Dans un autre mode d'exécution du procédé on a utilisé un immuno absorbant MAGNOGEL, activé à la glutaraldéhyde et couplé avec les immunoglobulines anti-NANBs.b) In another embodiment of the process, a MAGNOGEL immunosorbent was used, activated with glutaraldehyde and coupled with anti-NANBs immunoglobulins.
c) Isolement de l'antigène NANBs:c) Isolation of the NANBs antigen:
Une colonne de 2 × 11 cm de Sepharose couplée à l'anti-NANBs est utilisée. La colonne est équilibrée avec le tampon à température ambiante. On ajoute 25ml de la solution concentrée contenant de l'antigène NANBs de titre élevé. Cette solution est diluée au demi avec le tampon et on laisse 1 heure à 37ºC pour favoriser l'adsorption. La colonne est ensuite placée à +4ºC et lavée avec le tampon borate jusqu'à ce que la densité optique des fractions devienne nulle. L'antigène NANBs est élué de 1a colonne par un tampon phosphate 0,1M, pH 10,8. Les fractions de 5ml sont recueillies et la densité optique à 280nm mesurée. On ramène immédiatement à un pH physiologique par addition NANBs et toutes les fractions positives sont réunies et concentrées par ultrafiltration sur filtre AMICON retenant toutes les protéines ayant un poids moléculaire supérieure à 30.000.A 2 × 11 cm Sepharose column coupled to the anti-NANBs is used. The column is equilibrated with the buffer at room temperature. 25ml of the concentrated solution containing high titer NANBs antigen is added. This solution is diluted half with the buffer and left for 1 hour at 37ºC. to promote adsorption. The column is then placed at + 4ºC and washed with borate buffer until the optical density of the fractions becomes zero. The NANBs antigen is eluted from the column with a 0.1M phosphate buffer, pH 10.8. The 5ml fractions are collected and the optical density at 280nm measured. Immediately brought to a physiological pH by adding NANBs and all the positive fractions are combined and concentrated by ultrafiltration on an AMICON filter retaining all the proteins having a molecular weight greater than 30,000.
Toutes autres conditions de couplage et d'élution en particulier celles préconisées par le fabricant du Sepharose 4B CNBR peuvent être utilisées pour cette méthode de purification.All other coupling and elution conditions, in particular those recommended by the manufacturer of Sepharose 4B CNBR, can be used for this purification method.
EXEMPLE 4EXAMPLE 4
Purification de l'Ag NANBe par la méthode à l'héparinogelPurification of Ag NANBe by the heparinogel method
On sélectionne des sérums positifs en Ag NANBe en ID et en CEP. Après filtration sur millipore (diamètre des pores 0,45 microns) pour clarification, on soumet à une ultracentrifugation pendant 2 heures à 300.000g. On recueille les surnageants (les culots peuvent être utilisés pour isoler les virus NANB recherchés par l'activité de DNA polymérase). On ajoute au surnageant une solution à 33% de sulfate d'ammonium (SA) à raison de 0,5 vol. de solution de sulfate d'ammonium pour 1 volume de surnageant pour une concentration en S.A. de 33% afin de précipiter notamment les gammaglobulines. On élimine le précipité par centrifugation (on peut rechercher éventuellement dans ce précipité la présence d'anticorps antiNANB). Au surnageant on ajoute du S.A. jusqu'à concentration de 70% (en ajoutant du S.A.cristallisé à la solution à 33%). On centrifuge, élimine le surnageant, et reprend le culot par le TSA. On élimine le sulfate d'ammonium par dialyse contre le TSA. On vérifie par CEP et ID que le produit obtenu a un titre satisfaisant en Ag NANBe.Ag NANBe positive sera in ID and CEP are selected. After filtration through a millipore (pore diameter 0.45 microns) for clarification, it is subjected to ultracentrifugation for 2 hours at 300,000 g. The supernatants are collected (the pellets can be used to isolate the NANB viruses sought by the activity of DNA polymerase). A 33% solution of ammonium sulfate (SA) is added to the supernatant in an amount of 0.5 vol. of ammonium sulphate solution for 1 volume of supernatant for an SA concentration of 33% in order to precipitate in particular the gamma globulins. The precipitate is eliminated by centrifugation (it is possible to search in this precipitate for the presence of antiNANB antibodies). To the supernatant is added SA to a concentration of 70% (by adding crystallized SA to the 33% solution). Centrifuge, remove the supernatant, and take the pellet with TSA. The ammonium sulphate is removed by dialysis against the ASD. It is checked by CEP and ID that the product obtained has a satisfactory titer in Ag NANBe.
On chromatographie la fraction ainsi obtenue sur une colonne remplie par 200 ml d'héparine Ultragel IBF (héparine fixée sur gel d'agarose) équilibrée en tampon Tl (Tris 0,05M,NaCl 0,15 M, NaN30,02%, CaCl2 0,025M, pH 7,6), en déposant 5ml de ladite fraction. On élue par le tampon Tl (100ml environ) à faible débit (0,2ml/minute) puis on lave (débit 1ml/minute) avec 200 ml de Tl puis 100 ml de tampon T2 (Tris 0,05 M, NaCl 0,15 M, NaN3 0,02%, EDTA 0,01M, PH7.6), et élimine l'éluat. On élue ensuite l'Ag NANBe par un gradient de solution aqueuse de chlorure de sodium dans le tampon T2 obtenu en ajoutant progressivement (0,5ml/minute) une solution Tris 0,05M EDTA 0,01 M NaCl 2,5 M dans un flacon, muni d'un agitateur, contenant 300 ml de tampon T2. On collecte des fractions de 10 ml (50 fractions environ), en évaluant la concentration en Nacl au rëfractαmêtre d'ABBE. Les gradients allaient de 0,15 M à 1,2 M NaCl. Les fractions sont dialysées contre du tampon TSA, puis reconcentrées par ultrafiltration (limite 10 000 daltons) à environ lml. On recherche la présence d'Ag NANBe par ID et CEP, qui est observée principalement dans les fractions correspondant à 0,3-0,7 M NaCl.On réunit ces fractions et obtient ainsi une fraction purifiée d'Ag NANBe pouvant être utilisée par exemple pour réaliser un réactif selon l'invention destiné à détecter la présence d'Ac anti-NANBe.The fraction thus obtained is chromatographed on a column filled with 200 ml of Ultragel IBF heparin (heparin fixed on agarose gel) balanced in Tl buffer (Tris 0.05M, 0.15 M NaCl, 0.02% NaN 3 , 0.025M CaCl 2 , pH 7.6), depositing 5 ml of said fraction. Eluted with the Tl buffer (approximately 100 ml) at low flow rate (0.2 ml / minute) then washed (flow rate 1 ml / minute) with 200 ml of Tl then 100 ml of T2 buffer (Tris 0.05 M, NaCl 0, 15 M, 0.02% NaN 3 , 0.01M EDTA, PH7.6), and eliminates the eluate. The Ag NANBe is then eluted with a gradient of aqueous sodium chloride solution in the T2 buffer obtained by gradually adding (0.5 ml / minute) a 0.05M Tris solution 0.01M EDTA 0.01 M 2.5 M NaCl in a bottle, fitted with an agitator, containing 300 ml of T2 buffer. 10 ml fractions are collected (approximately 50 fractions), by evaluating the Nacl concentration in the ABBE refractor. The gradients ranged from 0.15 M to 1.2 M NaCl. The fractions are dialyzed against TSA buffer, then reconcentrated by ultrafiltration (limit 10,000 daltons) to approximately lml. We search for the presence of Ag NANBe by ID and CEP, which is observed mainly in the fractions corresponding to 0.3-0.7 M NaCl. We combine these fractions and thus obtain a purified fraction of Ag NANBe which can be used by example for producing a reagent according to the invention intended to detect the presence of anti-NANBe Ac.
EXEMPLE 5EXAMPLE 5
Obtention d'Ag NANBe au départ de l'Aq NANBcObtaining of Ag NANBe from Aq NANBc
On utilise comme produit de départ la fraction positive en Ag NANBc obtenue à l'exemple 2 a) après ultracentrifugation en gradient de sucrose à 4 ml de cette fraction on ajoute 1,33 ml de β-mercaptoëthanol à 0,5% et 1,33 ml de dodécyl sulfate de sodium (SDS) à 0,5%, soit une concentration finale de 0,1% en β-mercaptoéthanol et 0,1% en SDS, on laisse incuber pendant 2h1/2 à 37°C, puis on dialyse pendant 20 heures à +4°C contre du tampon PBS.The positive Ag NANBc fraction obtained in Example 2 a) is used as the starting product after ultracentrifugation in a sucrose gradient to 4 ml of this fraction, 1.33 ml of 0.5% β-mercaptoethanol and 1 are added, 33 ml of 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS), i.e. a final concentration of 0.1% in β-mercaptoethanol and 0.1% in SDS, incubated for 2 1/2 hours at 37 ° C, then dialyzed for 20 hours at + 4 ° C against PBS buffer.
On obtient une fraction riche en Ag NANBe qui peut être utilisée par exemple pour immuniser des lapins. Pour cela on le filtre sur membrane raillipore stérile 0,22 micron préalablement saturée par le sérum de lapin normal.A fraction rich in Ag NANBe is obtained which can be used for example to immunize rabbits. For this, it is filtered on a 0.22 micron sterile raillipore membrane previously saturated with normal rabbit serum.
EXEMPLE 6EXAMPLE 6
Procédé de purification de l'antigène NANBs en partant de la propriété antigenique croisée faible avec L'Ag HBs.Method for purifying the NANBs antigen starting from the weak cross-antigenic property with HBsAg.
Comme indiqué ci-dessus, il existe une antigënicité croisée notable entre les virus NANB et HB en ce qui concerne les Ag profonds : e et c. Il existe également une faible antigénicité croisée non détectable par les réactifs commerciaux y compris les DRI au niveau des Ag d'enveloppe des virus. Cette règle qui s'observe pour les virus de l'hépatite de la marmotte et le VHB est également vraie pour les virus NANB. Bien que faible, la réactivité croisée peut servir à une méthode de préparation de l'Ag NANBs.As indicated above, there is a notable cross-antigenicity between the NANB and HB viruses with regard to deep Ag: e and c. There is also a low cross-antigenicity not detectable by commercial reagents including DRIs at the level of virus envelope Ags. This rule, which is observed for groundhog hepatitis viruses and HBV, is also true for NANB viruses. Although low, cross-reactivity can be used for a method of preparing Ag NANBs.
On part de plasmas d'Ag HBs de titre très élevé supérieur ou égal à 107 en DRI de sous-types ay et ad et positifs à l'Ag etWe start from HBsAg plasmas of very high titer greater than or equal to 10 7 in DRI of ay and ad subtypes and positive to Ag and
HBe. Ensuite, on purifie ces 2 types d'Ag HBs par les méthodes classiques telles que décrites en particulier dans Am.J.Dis. Children, 1972, p.304. L'Ag HBs purifié de sous-type ay est utilisé pour immuniser des lapins selon le schéma d'immunisation classique déjà précité. Dans un 2ème temps, on va stimuler les lapins qui auront développé des Ac anti-HBs (anti-ay) avec de l'HBs purifié ad. Le résultat est l'obtention d'Ac anti-a de titre élevé. On s'est aperçu qu'un certain nombre de ces Ac anti HBs anti-a de très haut titre étaient capables de réagir, vis-à-vis des Ag NANBs en identité partielle avec des Ac anti NANBs cf schéma. Ceci montre qu'il y a une parenté entre la spécificité a de l'Ag HBs et l'Ag NANBs. Les anticorps anti-a, ainsi sélectionnés, vont être utilisés pour réaliser un grand nombre d'arcs de précipitation en contre-électrophorèse classique sur plaque avec des Ag NANBs sélectionnés comme précédemment indiqué, et bien sûr négatifs pour l'Ag HBs. Les plaques de gélose de la contre-électrophorèse sont lavées en tampon PBS puis dans de l'eau distillée en finale. Les lignes de précipitation sont découpées au scapel et un grand nombre sont réunies, homogénéïsées et mélangées à de l'adjuvant de FREUND. Ce mélange Ag NANBs, Ac de lapin anti-HBs/anti-a va être utilisé pour immuniser les lapins qui réagiront contre le seul Ag NANBs car les lapins ne réagissent pas contre leurs propres gammaglobulines, Après simulation adéquate des lapins, on réussit à obtenir chez certains d'entre eux une réponse anti-NANBs qui n'est plus anti HBs. Ces Ac sont repris après purification sur DEAE cellulose des IgG pour réaliser une chromatographie d'affinité et celleci permet à partir de fractions Ag NANBs de purifier cet Ag selon les procédés déjà décrits. Le nouvel Ag NANBs de pureté accrue ainsi préparé est à nouveau utilisé pour immuniser les lapins qui serviront de source d'Ac anti-NANBs de plus grande pureté et de haute affinité y compris grâce à la sélection de fractions Ac de classe IgM qui sont particulièrement utiles dans la réalisation de tests sensibles visant à détecter l'Ag NANBs en DRI.HBe. Then, these 2 types of HBsAg are purified by the conventional methods as described in particular in Am.J.Dis. Children, 1972, p.304. Purified Ay HBsg of the ay subtype is used to immunize rabbits according to the conventional immunization scheme already mentioned above. In a second step, we will stimulate the rabbits which will have developed anti-HBs Ab (anti-ay) with ad purified HBs. The result is obtaining high titer anti-a Ac. It has been found that a certain number of these very high anti-α anti HBs Abs are capable of reacting, vis-à-vis Ag NANBs in partial identity with anti Abs NANBs see diagram. This shows that there is a relationship between the specificity of Ag HBs and Ag NANBs. The anti-a antibodies, thus selected, will be used to produce a large number of precipitation arcs in conventional counter-electrophoresis on a plate with Ag NANBs selected as previously indicated, and of course negative for Ag HBs. The agar plates of the counter-electrophoresis are washed in PBS buffer and then in distilled water at the end. The precipitation lines are cut with a scapel and a large number are combined, homogenized and mixed with FREUND adjuvant. This Ag NANBs, anti-HBs / anti-a rabbit Ac mixture will be used to immunize rabbits which will react against Ag NANBs alone because the rabbits do not react against their own gamma globulins. After adequate simulation of the rabbits, we succeed in obtaining in some of them an anti-NANBs response which is no longer anti HBs. These Acs are taken up after purification on DEAE cellulose of the IgGs to carry out an affinity chromatography and this makes it possible, from Ag NANBs fractions, to purify this Ag according to the methods already described. The new Ag of NANBs of increased purity thus prepared is again used to immunize rabbits which will serve as a source of anti-NANBs of higher purity and high affinity, including through the selection of fractions of class IgM Ac which are particularly useful in carrying out sensitive tests aimed at detecting Ag NANBs in DRI.
L'Ag NANBs le plus purifié peut également être utilisé pour préparer des Ac monoclonaux anti-NANBs par immunisation de souris puis fusion des lymphocytes splëniques avec des lymphocytes myélomateux selon la technique des hybridomes décrite par MILSTEIN et ses collaborateurs. La faculté de produire les Ac anti-NANBs par les clones cellulaires qui seront sélectionnés est faite par les tests d'immuno-fluorescence indirecte sur des substrats de foie Ag NANBs ou bien par contre-électrophorese ou précipitation DRI (avec des Ag NANBs et billes à l'Ag anti-NANBs). La méthode décrite ici pour l'Ag NANBs peut être également utilisée pour la purification des Ag NANBe en partant de la réactivité croisée avec l'Ag HBe/3 et aussi pour l'Ag NANBc en partant de la réaction croisée avec HBC. Dans ces 2 cas on peut déjà directement partir d'Ac-anti HBe/3par exemple pour faire une première chromatographie d'affinité, sur un support couplé aux anti HBe/3, permettant d'obtenir des fractions concentrées d'Ag NANBe.The most purified Ag NANBs can also be used to prepare anti-NANBs monoclonal Ab by immunization of mice then fusion of splenic lymphocytes with myeloma lymphocytes according to the hybridoma technique described by MILSTEIN and his collaborators. The ability to produce the anti-NANBs Ab by the cell clones which will be selected is made by the indirect immunofluorescence tests on Ag NANBs substrates or by counter-electrophoresis or DRI precipitation (with Ag NANBs and beads anti-NANBs). The method described here for Ag NANBs can also be used for the purification of Ag NANBe starting from the cross reactivity with Ag HBe / 3 and also for Ag NANBc starting from the cross reaction with HBC. In these 2 cases, it is already possible directly from Ac-anti HBe / 3, for example to make a first affinity chromatography, on a support coupled to anti HBe / 3, making it possible to obtain concentrated fractions of Ag NANBe.
En immunisant des lapins avec de l'Ag HBe/3 les AC de lapins anti HBe/3 servent à préparer des lignes de précipitation avec Ag NANBe, avec lesquelles on immunisera des lapins neufs et restimulera des lapins anti-HBe/3.By immunizing rabbits with HBe / 3 Ag the anti-HBe / 3 rabbit CAs are used to prepare precipitation lines with Ag NANBe, with which new rabbits are immunized and anti-HBe / 3 rabbits are restimulated.
On peut aussi utiliser ces modèles naturels d'hépatite virale tels que ceux du chimpanzé et de la marmotte en simplifiant les purifications car on travaille en système homologué.One can also use these natural models of viral hepatitis such as those of the chimpanzee and the groundhog by simplifying the purifications because one works in approved system.
1) On part de sérum Ag HBs de chimpanzé ay et ad.Le sérum non purifié sert à hyperimmuniser de l'adjuvant l'animal qui fera des Ac anti HBs/anti-a.1) We start from Ag HBs serum of chimpanzee ay and ad. The unpurified serum is used to hyperimmunize the animal adjuvant which will make anti HBs / anti-a Ab.
2) Les lignes de précipitation anti-a/Ag NANBs (ou toute autre préparation d'Ag NANBs purifié) servent à stimuler l'animal. On obtient ainsi des Ac anti-NANBs. Pour le chimpanzé on peut restimuler avec de l'Ag NANBs de chimpanzé obtenu en transmettant du virus NANB à un animal ou en utilisant tout plasma de chimpanzé Ag NANBs détecté chez des animaux naturellement ou expérimentalement infectés par le virus NANB.2) The anti-a / Ag NANBs precipitation lines (or any other preparation of purified Ag NANBs) are used to stimulate the animal. Anti-NANBs Ac are thus obtained. For the chimpanzee, it can be restimulated with Ag NANBs of chimpanzee obtained by transmitting NANB virus to an animal or by using any plasma of chimpanzee Ag NANBs detected in animals naturally or experimentally infected with the NANB virus.
On peut faire la même opération avec l'Ag HBE/3 pour aboutir à des Ac anti-NANBe.We can do the same operation with HBE / 3 Ag to lead to anti-NANBe Ab.
Enfin au lieu d'utiliser le chimpanzé on peut utiliser la marmotte, également naturellement infectée avec un virus WHV apparenté aux virus B et NANB et ayant aussi des Ag e,c,s qui croisent dans les mêmes proportions.Finally instead of using the chimpanzee we can use the groundhog, also naturally infected with a WHV virus related to viruses B and NANB and also having Ag e, c, s which cross in the same proportions.
Des marmottes sont hyperimmunisées en Ac anti-WHs ou Ac anti-WHe avec des Ag WHs et WHe purifiés à partir de sérum de marmottes. On stimule ensuite la formation d'Ac contre le déterminant commun entre le virus WHV et NANB par les artifices décrits ci-dessus pour les Ag e, s ou c.Marmots are hyperimmune to anti-WHs or anti-WHe Ab with Ag WHs and WHe purified from marmot serum. The formation of Ac is then stimulated against the common determinant between the WHV and NANB virus by the devices described above for Ag e, s or c.
EXEMPLE 7EXAMPLE 7
L'invention a également pour objet la préparation d'Ac monoclonaux contre les déterminants communs aux Ag de surface des virus NANB et HB, en utilisant la propriété d'antigénicité croisée avec les Ag correspondants du VHB.A subject of the invention is also the preparation of monoclonal Ab against the determinants common to the surface Ag of the NANB and HB viruses, by using the property of cross-antigenicity with the corresponding Ag of HBV.
Le protocole général suivi peut être celui de la préparation de tous les Ac monoclonaux ; voir par exemple "Monoclonal antibodies, Hybridomas : New dimension of biological analysis", Kenneth Robert, MAC-KEARN Thomas, BOCH Tol. K., Plénum Press, New York, London, 1980, p. 3 à 30.The general protocol followed can be that of the preparation of all the monoclonal Ab; see for example "Monoclonal antibodies, Hybridomas: New dimension of biological analysis", Kenneth Robert, MAC-KEARN Thomas, BOCH Tol. K., Plenum Press, New York, London, 1980, p. 3 to 30.
On stimule un animal successivement avec les Ags des virus de l'hépatite B et NANB, on vérifie que l'animal a bien développé des anticorps contre VHB et VHNANB, on stimule à nouveau ledit animal pour injection d'un desdits Ags (par exemple Ag NANBs), puis, après le temps nécessaire pour l'élaboration de la réponse anticorps, on recueille des lymphocytes dudit animal, les fusionne avec une lignée lymphocytaire myélomateuse, réalise des cultures des hybrides obtenus, et sélectionne par clonage les hybrides produisant des anticorps à la fois anti-HBs et anti-NANBs.An animal is successively stimulated with the Ags of the hepatitis B and NANB viruses, it is checked that the animal has well developed antibodies against HBV and VHNANB, the said animal is again stimulated for injection of one of said Ags (for example Ag NANBs), then, after the time necessary for the development of the antibody response, lymphocytes are collected from said animal, merged with a myeloma lymphocyte line, cultures of the hybrids obtained, and cloning the hybrids producing antibodies are obtained. both anti-HBs and anti-NANBs.
On immunise une souris avec par exemple 5-15 microgrammes d'Ag NANBs partiellement purifié. 10 à 20 jours plus tard on stimule avec 5-15 microgrammes d'Ag HBs purifié. On s'assure 7-15 jours plus tard que la souris a bien développé des Ac anti-NANBs (vérification faite par immunofluorescence sur une biopsie de foie avec Ag NANBs cytoplasmique ou membranaire ou bien par DRI comme décrit) mais aussi qu'elle a fait des Ac anti-HBs (vérification faite en utilisant les réactifs commerciaux).A mouse is immunized with for example 5-15 micrograms of partially purified Ag NANBs. 10 to 20 days later, stimulation is carried out with 5-15 micrograms of purified HBsAg. It is checked 7-15 days later that the mouse has well developed anti-NANBs Ab (verification made by immunofluorescence on a liver biopsy with cytoplasmic or membrane Ag NANBs or by DRI as described) but also that it has makes anti-HBs Ab (verification made using commercial reagents).
Une formation d'anti-HBs accélérée confirme bien qu'il y a eu un effet de stimulation anamnestique vis-à-vis de déterminants Ags communs aux Ag de surface des virus HB et NANB.An accelerated anti-HBs formation confirms well that there was an anamnestic stimulation effect with respect to Ag determinants common to the surface Ag of HB and NANB viruses.
On fait alors une troisième injection d'Ag NANBs. 48 heures plus tard on prélève la rate des souris et recueille les lymphocytes. Ceux-ci sont fusionnés avec une lignée lymphocytaire myélomateuse des souris, et des hybrides sont obtenus, de façon connue. On réalise des cultures dans des microplaques de façon connue, de ces hybrides. Quand les cultures se sont bien établies, on teste les surnageants de chaque puits de microplaque pour la présence d'Ac anti-HBs (par réactif commercial) et d'Ac anti-NANBs par immunofluorescence et/ou DRI. Les lymphocytes des puits produisant des Ac à la fois anti-HBs et anti-NANBs sont alors clones de façon connue.A third injection of Ag NANBs is then made. 48 hours later the spleen of the mice is removed and the lymphocytes are collected. These are fused with a myeloma lymphocyte line of mice, and hybrids are obtained, in a known manner. Cultures are carried out in microplates in a known manner, of these hybrids. When the cultures are well established, the supernatants of each microplate well are tested for the presence of anti-HBs Ab (by commercial reagent) and anti-NANBs Ab by immunofluorescence and / or DRI. The lymphocytes from the wells producing both anti-HBs and anti-NANBs Ab are then cloned in a known manner.
Les cultures sont a nouveau propagées.Cultures are propagated again.
On s'assure, après plusieurs repiquages si nécessaire, que l'on a bien obtenu :We make sure, after several subcultures if necessary, that we have obtained:
a) des Ac monoclonaux provenant d'un seul clone de cellule par exemple exclusivement de la même classe d'immunoglobuline IgG ou IgM,a) monoclonal Ab originating from a single cell clone, for example exclusively from the same class of immunoglobulin IgG or IgM,
b) que ce clone produit bien des Ac à la fois anti-NANBs et anti-HBs.b) that this clone produces many Acs that are both anti-NANBs and anti-HBs.
Les Ac sont dirigés contre les déterminants communs au VHB et au virus NANB .The Ac are directed against the determinants common to HBV and NANB virus.
Les anticorps ainsi obtenus sont alors fixés par couplage sur des billes de polystyrène, comme décrit ci-dessus.The antibodies thus obtained are then fixed by coupling on polystyrene beads, as described above.
Le réactif unique ainsi obtenu permet de détecter aussi bien les Ags de virus HB que les Ags de virus NANB, de même que les anticorps correspondants.The unique reagent thus obtained makes it possible to detect both Ags of HB virus and Ags of NANB virus, as well as the corresponding antibodies.
EXEMPLE 8EXAMPLE 8
Purification de l'Ag NANBs, par chromatographie d'adsorption sur héparinogel.Purification of Ag NANBs, by adsorption chromatography on heparinogel.
On sélectionne des sérums positifs en Ag NANBs que l'on concentre par précipitation au sulfate d'ammonium à 60%. Après dialyse, la préparation concentrée est chromatographiée sur une colonne contenant 200 ml d'héparine Ultragel IBF équilibrée en tampon T1 (voir exemple 4), avec un écoulement lent de 0,2 ml/minute. La colonne est alors lavée avec 200 ml de T1 puis par 100 ml de T2 (conforme exemple 4). On élue ensuite l'Ag NANBs avec un gradient de NaCl dans le tampon T2 obtenu en ajoutant progressivement (0,5 ml/minute) une solution Tris 0,05M EDTA 0,01 M NaCl 2,5M dans un flacon de 300 ml de T2.Ag NANBs positive sera are selected and concentrated by precipitation with 60% ammonium sulfate. After dialysis, the concentrated preparation is chromatographed on a column containing 200 ml of Ultragel IBF heparin balanced in buffer T 1 (see example 4), with a slow flow of 0.2 ml / minute. The column is then washed with 200 ml of T 1 and then with 100 ml of T 2 (in accordance with example 4). The Ag NANBs are then eluted with a NaCl gradient in the buffer T 2 obtained by gradually adding (0.5 ml / minute) a 0.05M Tris solution 0.01M EDTA 0.01 M 2.5M NaCl in a 300 ml flask of T 2 .
On recueille des fractions de 10 ml, les gradients en NaCl, allant de U,15M à 1,2M étant mesurés au rêfractomètre d'ABBE. Les fractions sont dialysées contre du tampon TSA puis concentrées à 1 ml par ultrafiltration (limite 10.000 daltons). On recueille les fractions positives en Ag NANBs, correspondant aux fractions 0,25-0,40M et 0,60-0,80M. Ces fractions à haute teneur en Ag NANBs sont suffisamment concentrées pour devenir réactives dans le test de DRI pour l'Ag HBs, en raison de la faible réaction croisée mentionnée ci-dessus.10 ml fractions are collected, the NaCl gradients ranging from U, 15M to 1.2M being measured with the ABBE refractometer. The fractions are dialyzed against TSA buffer and then concentrated to 1 ml by ultrafiltration (limit 10,000 daltons). The positive fractions of Ag NANBs are collected, corresponding to the 0.25-0.40M and 0.60-0.80M fractions. These high Ag NANBs fractions are sufficiently concentrated to become reactive in the DRI test for HBsAg, due to the weak cross-reaction mentioned above.
La purification de l'Ag NANBs peut aussi être effectuée comme décrit par KAPLAN, Vox Sanguinis, 1978, Vol. 35, p. 224-233. The purification of Ag NANBs can also be carried out as described by KAPLAN, Vox Sanguinis, 1978, Vol. 35, p. 224-233.

Claims

Revendications de brevet Patent claims
1. Procédé de préparation d'antigènes purifiés de l'hépatite virale NANB, caractérisé par le fait que l'on sélectionne des sérums ou des extraits de foie dans lesquels on a reconnu la présence de virus NANB, que l'on procède à une ultracentrifugation pour concentrer lesdits virus dans le culot de centrifugation, que l'on recueille ledit culot et le traite par un détergent non ionique, que l'on laisse incuber pendant 1 à 24 heures environ à température comprise entre 0 et 37°C, que l'on procède à un fractionnement pour isoler les fractions contenant de l'Ag NANBc purifié, puis que, si désiré, on soumet lesdites fractions à l'action d'un détergent ionique, laisse incuber pendant 1 heure à 24 heures environ à température de 0 à 37°C, et isole l'Ag NANBe.1. Process for the preparation of purified antigens of viral hepatitis NANB, characterized in that serums or extracts of liver are selected in which the presence of NANB virus has been recognized, and that a ultracentrifugation to concentrate said viruses in the centrifugation pellet, which is collected by said pellet and treated with a non-ionic detergent, which is left to incubate for 1 to 24 hours at a temperature between 0 and 37 ° C., fractionation is carried out to isolate the fractions containing purified NANBc Ag, then, if desired, the said fractions are subjected to the action of an ionic detergent, incubated for 1 hour to approximately 24 hours at temperature from 0 to 37 ° C, and isolates Ag NANBe.
2. Procédé de préparation d'un antigène purifié de l'hépatite virale NANB, caractérisé par le fait que l'on sélectionne des sérums positifs pour l'Ag NANB désiré (NANBe ou NANBs), on élimine les particules virales éventuellement présentes, par exemple par ultracentrifugation, on élimine les gammaglobulines selon les méthodes connues, on concentre ledit Ag NANB, notamment par précipitation puis on chromatographie les fractions concentrées contenant l'Ag NANB désiré sur un support sur lequel est fixée de l'héparine, on élue avec une solution aqueuse de chlorure de sodium de concentration croissante, recueille les éluats contenant l'Ag NANB désiré, et élimine les sels selon les méthodes usuelles.2. Process for the preparation of a purified antigen of the viral hepatitis NANB, characterized in that one selects sera positive for the desired NANB Ag (NANBe or NANBs), the viral particles possibly present are eliminated, by example by ultracentrifugation, the gamma globulins are eliminated according to known methods, said Ag NANB is concentrated, in particular by precipitation and then the concentrated fractions containing the desired Ag NANB are chromatographed on a support on which heparin is fixed, eluted with a aqueous sodium chloride solution of increasing concentration, collects the eluates containing the desired Ag NANB, and eliminates the salts according to the usual methods.
3. Procédé de préparation d'antigènes purifiés de l'hépatite virale NANB, caractérisé par le fait que l'on hyperimmunise des animaux avec une fraction purifiée en un antigène de l'hépatite B, que l'on utilise les gammaglobulines produites par les animaux hyperimmunisés pour obtenir des lignes de précipitation avec des sérums contenant un antigène NANB correspondant et exempts d'antigène HB, et que l'on utilise les gammaglobulines ayant donné des lignes de précipitation pour réaliser les supports de chromatographie d'affinité qui permettront de fixer et purifier ledit antigène NANB.3. Process for the preparation of purified antigens of viral hepatitis NANB, characterized in that animals are hyperimmunized with a purified fraction of a hepatitis B antigen, that the gamma globulin produced by them are used hyperimmune animals to obtain precipitation lines with sera containing a corresponding NANB antigen and free of HB antigen, and that gamma globulin is used having given precipitation lines for producing the affinity chromatography supports which will make it possible to fix and purify said NANB antigen.
4. Réactif permettant le diagnostic de l'hépatite virale NANB ou permettant de révéler le stade d'évolution de la maladie, caractérisé par le fait qu'il comprend un support solide sur lequel est fixé au moins un antigène NANBc, NANBe ou NANBs et/ou au moins un anticorps spécifique anti-NANBc, anti-NANBe ou anti-NANBs.4. Reagent allowing the diagnosis of viral hepatitis NANB or making it possible to reveal the stage of evolution of the disease, characterized in that it comprises a solid support on which is fixed at least one NANBc, NANBe or NANBs antigen and / or at least one specific anti-NANBc, anti-NANBe or anti-NANBs antibody.
5. Réactif selon la revendication 4, caractérisé par le fait qu'il est constitué par un support solide sur lequel est fixé au moins un antigène NANBc, NANBe ou NANBs.5. Reagent according to claim 4, characterized in that it consists of a solid support on which is fixed at least one NANBc, NANBe or NANBs antigen.
6. Réactif selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'il contient, fixé sur le support solide, de l'antigène NANBc.6. Reagent according to claim 5, characterized in that it contains, fixed on the solid support, of the NANBc antigen.
7. Réactif selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé par le fait qu'il contient, fixé sur le support solide, de l'antigène NANBs.7. Reagent according to any one of claims 4 to 6, characterized in that it contains, fixed on the solid support, of the NANBs antigen.
8. Réactif selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé par le fait qu'il contient, fixé sur le support solide, de l'antigène NANBe.8. Reagent according to any one of claims 4 to 7, characterized in that it contains, fixed on the solid support, of the NANBe antigen.
9. Réactif selon la revendication 5, caractérisé par le fait que sur ledit support sont fixés des anticorps-anti-(gammaglobulines humaines) et que ledit antigène est présenté séparément et peut être fixé par l'intermédiaire des anticorps correspondants du sérum à tester s'ils sont présents.9. Reagent according to claim 5, characterized in that on said support are fixed anti-antibodies (human gamma globulins) and that said antigen is presented separately and can be fixed by means of the corresponding antibodies of the serum to be tested. 'they are present.
10. Réactif selon la revendication 9, caractérisé par le fait que les anticorps anti-(gammaglobulines humaines) sont des anticorps anti-IgM humaines. 10. Reagent according to claim 9, characterized in that the anti-antibodies (human gamma globulin) are anti-human IgM antibodies.
11. Réactif selon la revendication 9, caractérisé par le fait que les anticorps anti-(gammaglobulines humaines) sont des anticorps anti-IgG humaines.11. Reagent according to claim 9, characterized in that the anti-antibodies (human gamma globulin) are anti-human IgG antibodies.
12. Réactif selon la revendication 4, caractérisé par le fait qu'il est constitué par un support solide sur lequel est fixé au moins un anticorps spécifique anti-NANBc, anti-NANBe ou anti-NANBs.12. Reagent according to claim 4, characterized in that it consists of a solid support on which is fixed at least one specific anti-NANBc, anti-NANBe or anti-NANBs antibody.
13. Réactif selon la revendication 4, caractérisé par le fait qu'il contient, fixé sur le support, de l'anticorps anti-NANBe, anti-NANBs, et de l'antigène NANBc.13. Reagent according to claim 4, characterized in that it contains, fixed on the support, anti-NANBe antibody, anti-NANBs, and NANBc antigen.
14. Application du réactif selon l'une quelconque des revendications 4 à 8 et 12, caractérisée par le fait que l'on recherche selon le cas, la présence d'un ou plusieurs antigènes ou d'un ou plusieurs anticorps dans un sérum à tester, à l'aide de ce réactif, selon les techniques de "sandwich" et/ou selon les techniques de "compétition".14. Application of the reagent according to any one of claims 4 to 8 and 12, characterized in that one searches, as the case may be, for the presence of one or more antigens or of one or more antibodies in a serum with test, using this reagent, according to "sandwich" techniques and / or according to "competition" techniques.
15. Application du réactif selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée par le fait que l'on met en contact ledit réactif avec un anticorps anti-NANB couplé à un traceur et que l'on détermine, par une réaction de révélation, si l'anticorps couplé à un traceur s'est fixé sur le support, auquel cas les gammaglobulines du sérum à tester contenaient des anticorps contre le même antigène que ledit anticorps couplé au traceur.15. Application of the reagent according to any one of claims 9 to 11, characterized in that said reagent is brought into contact with an anti-NANB antibody coupled to a tracer and that is determined by a reaction of revelation, if the antibody coupled to a tracer is fixed on the support, in which case the gamma globulins of the serum to be tested contained antibodies against the same antigen as said antibody coupled to the tracer.
16. Application du réactif selon la revendication 13, caractérisée par le fait que l'on recherche la présence des antigènes NANBs et NANBe, et que l'on recherche en outre la présence de l'anticorps anti-NANBc, selon la technique sandwich ou la technique de compétition, ces recherches étant effectuées l'une à l'aide d'un traceur radioactif, l'autre à l'aide d'un traceur enzymatique. 16. Application of the reagent according to claim 13, characterized in that the presence of the NANBs and NANBe antigens is sought, and that the presence of the anti-NANBc antibody is also sought, according to the sandwich technique or the competition technique, this research being carried out one using a radioactive tracer, the other using an enzymatic tracer.
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