WO1979000993A1 - Procede de preparation d'hemoproteines et de proteines a partir d'une levure et substances ainsi obtenues - Google Patents

Procede de preparation d'hemoproteines et de proteines a partir d'une levure et substances ainsi obtenues Download PDF

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proteins
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yeast
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C Talbot
J Agenet
G Vinchon
O Thierry
P Ispenian
M Azzara
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Gervais Danone Co
C Talbot
J Agenet
G Vinchon
O Thierry
P Ispenian
M Azzara
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    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C12N1/063—Lysis of microorganisms of yeast

Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of hemoproteins and proteins from yeast; it also relates to hemorproteins and in particular cytochrome C and the proteins obtained using this process, and their application in the field of nutrition and pharmacy. According to the invention, it is proposed, by the same and only method, to prepare from a yeast, a proteinaceous substance on the one hand, and cytochrome C on the other hand.
  • the object of the present invention is to provide a process which results in the preparation of both excellent proteins and cytochrome C with practically double yields of the best yields obtained so far.
  • the subject of the present invention is a process for the preparation of hemoproteins, and in particular of cytochrome C, and of proteins from yeast, characterized in that, successively: a) the yeast is subjected to cell lysis in liquid medium, under pressure, b) the resulting liquid medium is purified by treatment with an agent which precipitates nucleic acids, such as manganese chloride and with an agent for salting out debris from bacterial cells, such as ammonium sulphate, c) it is adjusted the purified liquid phase at a pH between 8 and 8.5, then we pass over ion exchange resins which fix the cytochrome while the effluent is adjusted to a pH between 3.3 and 4 (pH close to the point isoelectric) and the proteins precipitated by means of ammonium sulphate, d) the resin to which the cytochrome
  • the solution containing the cytochrome is desalinated, which is then isolated by the usual techniques, such as dry evaporation, atomization or lyophilization.
  • the cytochrome can be obtained in a particularly pure form by completing the process with the following steps: e) the cytochrome contained in the eluate of the ion exchange resins is precipitated by means of an aqueous sulfate solution 4.5 M to 6 M ammonium; the mixture is left to settle for approximately 12 hours at a temperature below 10 ° C., then it is filtered, f) the cytochrome thus precipitated is redissolved in water and then it is precipitated using trichloroacetic acid, g) the precipitate of cytochrome in water and reprecipitate by means of an alcohol, such as ethyl alcohol, preferably.
  • an alcohol such as ethyl alcohol
  • yeasts which are suitable according to the invention, mention may in particular be made of the strains of Saccharomyces and of Torula, in particular, Saccharomyces cerivisiae, Kluyveromyces fragilis, Saccharomyces carlsbergensis and Saccharomyces uvarum.
  • the preferred yeast from the point of view of yield is Kluyveromyces fragilis, which has the particularity of having very high cellular respiration and, consequently, rapid growth (in particular, its cellular respiration is 5 times greater than that of Saccharo- myces cerevisiae).
  • Stage a) is advantageously carried out in the yeast culture medium.
  • stage a) begins with culture juices containing 10 to 400 g of yeast expressed as dry matter per 1 liter of juice. If we want to standardize, cell lysis will be carried out mechanically on a culture juice containing 10 and preferably 10 germs / cm, water with nutrients (a carbon source, a nitrogen source and, if necessary if necessary, trace elements).
  • Cell lysis is carried out mechanically under a pressure of between 300 and 760 bars and, preferably, between 300 and 500 bars, and is continued until at least 80% of the cells have their membrane ruptured.
  • Cell lysis is carried out in a slightly acidic or neutral medium at a pH advantageously between 6.5 and 7.
  • stage b manganese chloride and ammonium sulphate can be used at the same time or one after the other, for example MnCl 2 before (NH 4 ) 2 SO.
  • the precipitation of stage b) is carried out with 0.1 volume of a solution aqueous MnCl ⁇ 1 M for 1 volume of liquid medium resulting from stage a), then an aqueous solution of ammonium sulfate at 100-250 g / liter.
  • the purified liquid medium obtained in stage b) contains cytochrome C and other proteins. The latter will be separated in stage c), since they do not bind to the ion exchange resins.
  • the ion exchange resin of stage c) is an anionic resin, preferably a resin of the crosslinked polystyrene type having CO 2 H acid groups, for example an Amberlite IRC 50 resin. A volume of 10 to 15 liters of resin will be used. to fix 250 g of cytochrome C. Before use, the resin will be put into Na + form.
  • the liquid effluent collected after passage through resins, which contains the proteins, is adjusted to a pH of between 3.3 and 4, then the proteins are precipitated by means of (NH 4 ) 2 SO 4 : 4.5 to 6 M .
  • the precipitated proteins are redissolved in water and desalting is carried out, in particular by means of a resin constituted by a polymerized dextran gel (for example Sephadex G 25 resin). During this treatment, the proteins do not bind to the resin but remain in solution in water.
  • the proteins thus obtained have a purity of the order of 95 to 100%.
  • the proteins obtained according to the process are useful in the field of nutrition, both human and animal. They are electrophoretically pure: the electrophoresis shows only 5 bands, corresponding to 5 proteins.
  • Washing of the resins of stage d) is advantageously carried out with an aqueous ammonia solution (one volume of NH 4 OH for one volume of liquid phase of stage b); the elution is carried out with an aqueous solution containing (NH 2 ) 2 SO at approximately 150 g / liter and at a pH of between 8 and 8.50 (the pH being adjusted by means of NH 3 ).
  • a culture juice of Kluyveromyces fragilis containing 10 12 germs / cm3 (ie approximately 120 g of yeast by dry weight per liter of culture juice) is subjected to cell lysis using a homogenizer (of MANTON-GAULIN type; this device marketed by the
  • British company APV operates as a press by laminating the cells in an aqueous medium by subjecting these cells to a shock of 450 to 500 bars). After two passages in this device at 450-500 bars, cell lysis is 90%.
  • a viscous liquid is obtained which is then subjected to precipitation by means of two agents used at the same time: MnCl 2 1M and (NH 4 ) 2 SO 4 in aqueous solution at 100 g / liter. After a contact time of 30 minutes to 1 hour at 4-10 ° C, centrifugation is carried out. The precipitate, which contains cellular debris, nucleic acids and polysaccharides is eliminated. The supernatant which is collected is brought to pH 8.25 by means of an aqueous NH 4 OH solution at 100 g / liter. We fix the supernatant which contains the cytochrome
  • the aqueous solution thus obtained is precipitated using trichloroacetic acid to pH 3. After centrifugation, the centrifugation residue is taken up in water and then precipitated again using C 2 H 5 OH. It is again centrifuged, the precipitate is taken up with water at a weak alkaline pH (pH 7.5 approximately), then lyophilized.
  • the cytochrome C thus obtained has absorption peaks in an oxidized medium at 420, 520 and 550 nm, and in a reduced medium at 360, 410 and 530 nm. Its biological activity is verified on cytochrome C oxidase on the one hand, and on cellular tissue in a state of hypoxia according to the usual techniques.
  • the yield of cytochrome C is 250 g of electrophoretically pure product per tonne (by dry weight) of yeast.
  • Kluyveromyces fragilis The purified solution containing the proteins at the outlet of the columns of Amberlite IRC 50 (obtained as described in Example 1) is adjusted using 5N hydrochloric acid to a pH close to that of the isoelectric point, c that is, in the present case, 3.5 to 4. Precipitation is then carried out by means of an aqueous solution of ammonium sulphate 4.5 M - 6 M. The precipitate is collected and then taken up with water and subjected to a desalting operation on a crosslinked dextran gel (Sephadex G 25), with one volume of dextran gel for 0.3 volume of proteins.
  • a crosslinked dextran gel Sephadex G 25
  • the protein substance obtained electrophoretically pure, consists mainly of five different proteins whose molecular weights range from 50,000 (for the first) to 120,000 (for the fifth).
  • This mixture of proteins which is obtained in an aqueous medium can be: i) subjected to cooking-extrusion according to a technique known per se for proteins with a linear structure and in expanded form; and if necessary, by grinding, a protein flour is obtained which can be directly assimilated by humans and animals: ii) spray-dried (spray-drying) in order to obtain a mixture of proteins in powder form.
  • EXAMPLE 3 Obtaining c ⁇ tochrome c and proteins from Saccharom ⁇ ces cerevisiae. The procedure is as indicated in Examples 1 and 2, replacing Kluyveromyces fragilis with Saccharomyces cerevisiae. We obtain end products with the same characteristics as those of Examples 1 and 2.

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Abstract

Procede de preparation d'hemoproteines et de proteines a partir d'une levure. Ce procede se caracterise en ce que: -on soumet la levure a une lyse cellulaire sous pression, -on purifie le milieu liquide resultant; on adsorbe les hemoproteines et notamment le cytochrome C sur resines, tandis que l'on extrait les proteines de l'effluent, -on elue le cytochrome C adsorbe et on le purifie. Application dans l'alimentation humaine et animale et en pharmacie.

Description

PROCEDE DE PREPARATION D'HEMOPROTEINES ET DE PROTEINES A PARTIR D'UNE LEVURE ET SUBSTANCES
AINSI OBTENUES
La présente invention est relative à un procédé de préparation d' hémoprotéines et de protéines à partir d'une levure ; elle concerne également les hémorprotéines et notamment le cytochrome C et les protéines obtenus à l'aide de ce procédé,et leur application dans le domaine de la nutrition et de la pharmacie. Selon l'invention, on se propose, par un même et seul procédé, de préparer à partir d'une levure, une substance proteinigue d'une part, et le cytochrome C d' autre part.
On sait que pour pallier la pénurie de viande, notamment dans les pays en voie de développement, on a envisagé de faire appel à des sources de protéines différentes des sources animales. On a ainsi préconisé d'utiliser des sources végétales (comme le soja et la luzerne, par exemple), et des sources biologiques comme l'extraction à partir de levure (cf., par exemple, le
Brevet français N°2 113 190 de HITACHI LTD.), ou à partir de champignons ou par culture de certaines souches microbiennes sur des hydrocarbures. On a également préconisé de nombreux procédés pour isoler le cytochrome C (hémoprotéine qui est directement liée aux réactions d'oxydo-réduction et qui est un élément essentiel dans la chaîne des transporteurs d'électrons), notamment à partir de la levure de boulangerie [cf. KEILIN, Proc.Roy. Soc. (Londres) Ser . B 106 , 418 ( 1930 ) et HAGIKARA et Co ll., Nature 178, 629 ( 1956 )] , du coeur de boeuf [cf . KIRBY et Coll . , Acta Chem. Scand. , 10 , 148 ( 1956 )] et du coeu de cheval [cf . NOZAKI et Coll . , J . Biochem. (Tokyo) 44 , 453 ( 1957)].
La présente invention s'est proposé comme but de pourvoir à un procédé qui aboutit à la préparation à la fois de protéines et de cytochrome C d'excellente qualité et ceci avec des rendements pratiquement doubles des meilleurs rendements obtenus jusqu'à maintenant. La présente invention a pour objet un procédé de préparation d' hémoprotéines, et notamment de cytochrome C,et de protéines à partir de levure, caractéris en ce que, successivement : a) on soumet la levure à une lyse cellulaire en milieu liquide, sous pression, b) on purifie le milieu liquide résultant par traitement par un agent précipitant les acides nucléiques, tel que le chlorure de manganèse et par un agent de relargage des débris de cellules bactériennes, tel que le sulfate d'ammonium, c) on ajuste la phase liquide purifiée à un pH compris entre 8 et 8,5, puis on passe sur résines échangeuses d'ions qui fixent le cytochrome tandis que l'effluent est ajusté à un pH compris entre 3,3 et 4 (pH proche du point isoêlectrique) et les protéines précipitées au moyen de sulfate d'ammonium, d) on lave la résine sur laquelle le cytochrome a été fixé, à l'aide d'une solution aqueuse alcaline à pH 8-8,25, puis on élue le cytochrome au moyen d'une solu tion aqueuse de sulfate d'ammonium.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'objet de l'invention, on procède au dessalage de la solution contenant le cytochrome, lequel est ensuite isolé par les techniques usuelles, comme l'évaporation à sec, 1' atomisation ou la lyophilisation. Si on le désire, le cytochrome peut être obtenu sous une forme particulièrement pure en complétant le procédé par les étapes suivantes : e) on précipite le cytochrome contenu dans l'éluat des résines échangeuses d'ions au moyen d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium de 4,5 M à 6 M ; on laisse décanter 12 heures environ à une température inférieure à 10 °C, puis on filtre, f) on redissout le cytochrome ainsi précipité, dans l'eau puis on le précipite à l'aide d'acide trichloracétique, g) on redissout le précipité de cytochrome dans l'eau et on reprécipite au moyen d'un alcool, tel que l'alcool éthylique, de préférence.
La succession d'opérations qui vient d'être décrite permet l'obtention de produits de qualité excellente avec un rendement qui dépasse 250 g de cytochrome C ëlectrophorètiquement pur et 340 kg de protéines pures par tonne de levure.
Ainsi, c'est grâce à la lyse cellulaire par voie mécanique sous pression, à l'exclusion des procédés classiques utilisant les acides, les sels ou les solvants (comme, par exemple, l'acétate d'ëthyle) que l'on peut obtenir une lyse très poussée des cellules : on a pu dénombrer (par la néphélométrie par exemple) au moins 80 % de cellules lysées par le processus préconisé conformément à la présente invention. Le pourcentage des cellules lysées ne dépasse guère 45 % par les voies classiques et, de plus, en prolongeant le traitement acide par exemple, on risque de dénaturer les protéines et d'altérer ainsi la qualité des produits obtenus. C'est grâce également aux différentes étapes de purification préconisées conformément à l'invention (traitement au MnCl2 pour éliminer les acides nucléiques, traitement au sulfate d'ammonium pour éliminer les débris cellulaires dans l'étape b) , double précipitation du cytochrome aux stades f) et g)) que l'on a pu non seulement obtenir les produits recherchés avec un excellent rendement et une excellente qualité, mais que l'on a également rendu ce procédé praticable à l'échelle industrielle sur de grandes quantités de matière première. Parmi les levures qui conviennent selon l'invention, on peut notamment citer les souches de Saccharo- myces et de Torula, en particulier, le Saccharomyces cerivisiae, le Kluyveromyces fragilis, le Saccharomyces carlsbergensis et le Saccharomyces uvarum. La levure préférée du point de vue du rendement est le Kluyveromyces fragilis qui offre la particularité de présenter une respiration cellulaire très importante et, par suite, une croissance rapide (en particulier, sa respiration cellulaire est 5 fois plus importante que celle du Saccharo- myces cerevisiae). Convient notamment la souche N°CBS-
397 du catalogue de la collection du Centraal Bureau voor Schimmelculture de Baarn.
Le stade a) est avantageusement mis en oeuvre dans le milieu de culture de la levure. En pratique, le stade a) débute sur des jus de culture renfermant de 10 à 400 g de levure exprimés en matière sèche pour 1 litre de jus. Si on veut standardiser, on effectuera la lyse cellulaire par voie mécanique sur un jus de culture renfermant 10 et de préférence 10 germes/cm , de l'eau des éléments nutritifs (une source de carbone, une source d'azote et, le cas échéant, des oligoéléments).
La lyse cellulaire est réalisée par voie mécanique sous une pression comprise entre 300 et 760 bars et, de préférence, entre 300 et 500 bars, et est poursuivie jusqu'à ce qu ' au moins 80 % des cellules aient leur membrane rompue. La lyse cellulaire est effectuée en milieu légèrement acide ou neutre à un pH compris avantageusement entre 6,5 et 7.
Pour la purification pratiquée au stade b), le chlorure de manganèse et le sulfate d'ammonium peuvent être utilisés en même temps ou l'un après l'autre, par exemple MnCl2 avant (NH4)2SO.. De façon avantageuse, la précipitation du stade b) est mise en oeuvre avec 0,1 volume d'une solution aqueuse de MnCl^ 1 M pour 1 volume de milieu liquide résultant du stade a) , puis une solution aqueuse dé sulfate d'ammonium à 100-250 g/ litre.
Le milieu liquide purifié obtenu au stade b) renferme le cytochrome C et d'autres protéines. Ces dernières seront séparées au stade c) , car elles ne se fixent pas sur les résines échangeuses d'ions.
La résine échangeuse d'ions du stade c) est une résine anionique, de préférence une résine du type polystyrène réticulé présentant des groupes acides CO2H, par exemple une résine Amberlite IRC 50. On utilisera un volume de 10 à 15 litres de résine pour fixer 250 g de cytochrome C. Avant usage, la résine sera mise sous forme Na+.
L'effluent liquide recueilli après passage sur résines, lequel contient les protéines, est ajusté à un pH compris entre 3,3 et 4, puis les protéines sont précipitées au moyen de (NH4)2 SO4 : 4,5 à 6 M.
Suivant un mode de réalisation avantageux de l'objet de la présente invention, les protéines précipitëes sont redissoutes dans l'eau et l'on procède à un dessalage, notamment au moyen d'une résine constituée par un gel de dextrane polymérisé (par exemple la résine Séphadex G 25). Lors de ce traitement, les protéines ne se fixent pas sur la résine mais restent en solution dans l'eau. Les protéines ainsi obtenues ont une pureté de l'ordre de 95 à 100 %.
Les protéines obtenues conformément au procédé sont utiles dans le domaine de la nutrition tant humaine qu'animale. Elles sont électrophorètiquement pures : l'électrophorèse ne montre que 5 bandes, correspondant à 5 protéines.
Le lavage des résines du stade d) est réalisé de façon avantageuse avec une solution aqueuse ammoniaquée (un volume de NH4OH pour un volume de phase liquide du stade b) ; l'élution est mise en oeuvre avec une solution aqueuse renfermant (NH,)2 SO à environ 150 g/litre et à un pH compris entre 8 et 8,50 (le pH étant ajusté au moyen de NH3) .
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se rapporte à des exemples de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention.
Il doit δtre bien entendu, toutefois, que ces exemples et les parties descriptives correspondantes sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'obje de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLES EXEMPLE 1 - Obtention_du_cγtochrome C à partir de Kluyveromyces fragilis
Un jus de culture de Kluyveromyces fragilis renfermant 10 12 germes/cm3 (soit environ 120 g de levure en poids sec par litre de jus' de culture) est soumis à une lyse cellulaire au moyen d'un homogèneisateur (de type MANTON-GAULIN ; cet appareil commercialisé par la
Société britannique APV opère eh tant que presse en laminant les cellules en milieu aqueux en soumettant ces cellules à un choc de 450 à 500 bars). Après deux passages dans cet appareil à 450-500 bars, la lyse cellulaire est de 90 %.
On obtient un liquide visqueux qui est alors sou mis à une précipitation au moyen de deux agents utilisés en même temps : MnCl2 1M et (NH4)2 S04 en solution aqueuse à 100 g/litre. Après une durée de contact de 30 minutes à 1 heure à 4-10 °C, on procède à une centrifugation. Le précipité, qui contient des débris cellulaires, des acides nucléiques et des polysaccharides est éliminé. Le surnageant que l'on recueille est amené à pH 8,25 au moyen d'une solution aqueuse de NH4OH à 100 g/litre. On fixe le surnageant qui contient le cytochrome
C à extraire, sur une résine êchangeuse de cations Amberlite IRC 50 sous forme Na+, la fixation s 'effectuant jusqu'à saturation des deux tiers de la capacité de la résine. (L'extraction des protéines à partir de l'effluent sera décrite dans l'Exemple 2).
On lave avec 0,1 volume de NH4OH (à pH 8,25) pour 1 volume de surnageant initial, puis on élue avec une solution aqueuse de (NH4)2 SO4 diluée (150 g/litre, pH réglé à 8,5 au moyen de NH3) . Si l'on désire pousser la purification à fond, on précipite l'éluat pbtenu avec une solution aqueuse de (NH4)H2 SO4 4,5 M. On laisse une nuit à une température comprise entre 0 et 10 °C (de préférence à 4°C), on filtre pour récupérer le cytochrome précipité et on le redissout dans l'eau.
La solution aqueuse ainsi obtenue est précipitée au moyen d'acide trichloracétique jusqu'à pH 3. Après centrifugation, le culot de centrifugation est repris à l'eau puis à nouveau précipité au moyen de C2H5OH. On centrifuge à nouveau, on reprend le précipité avec de l'eau à pH faiblement alcalin (pH 7,5 environ), puis on lyophilise.
Le cytochrome C ainsi obtenu présente des pics d'absorption en milieu oxydé à 420, 520 et 550 nm, et en milieu réduit à 360, 410 et 530 nm. Son activité biologique est vérifiée sur la cytochrome C oxydase d'une part, et sur un tissu cellulaire en état d'hypoxie selon les techniques usuelles. Le rendement en cytochrome C est de 250 g de produit électrophorètiquement pur pour une tonne (en poids sec) de levure. EXEMPLE 2 - Obtention de protéines à partir de
Kluyveromyces fragilis La solution purifiée renfermant les protéines à la sortie des colonnes d'Amberlite IRC 50 (obtenue comme décrit dans l'Exemple 1) est ajustée à l'aide d'acide chlorhydrique 5N à un pH voisin de celui du point isoélectrique, c'est-à-dire, dans le cas présent, 3,5 à 4. On procède ensuite à une précipitation au moyen d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium 4,5 M - 6 M. Le précipité est recueilli puis repris par de l'eau et soumis à une opération de dessalage sur un gel de dextrane réticulé ( Sephadex G 25), avec un volume de gel de dextrane pour 0,3 volume de protéines. On obtient 40 ml d'une solution contenant 1 g de protéines par ml, soit un rendement de 66 % par rapport à la quantité de protéines présente dans la levure de départ. La substance protéinique obtenue, electrophoretiquement pure, est constituée principalement de cinq protéines différentes dont les poids moléculaires vont de 50 000 (pour la première) à 120 000 (pour la cinquième).
Ce mélange de protéines qui est obtenu en milieu aqueux, peut être : i) soumis à une cuisson-extrusion selon une technique connue en soi pour des protéines à structure linéaire et sous forme expansée ; et si nécessaire,par broyage, on obtient une farine de protéines directement assimilable par l'homme et l'animal : ii) séché par nébulisation (séchage par projection) afin d'obtenir un mélange de protéines sous forme pulvérulente.
EXEMPLE 3 - Obtention du cγtochrome c et des protéines à partir de Saccharomγces cerevisiae. On procède comme indiqué aux Exemples 1 et 2, en remplaçant le Kluyveromyces fragilis par le Saccharomyces cerevisiae. On obtient des produits finaux ayant les mêmes caractéristiques que ceux des Exemples 1 et 2.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'hémoprotéines, et notamment de cytochrome C, et de protéines à partir de levure, caractérisé en ce que, successivement : a) on soumet la levure à une lyse cellulaire en milieu liquide, sous pression, b) on purifie le milieu liquide résultant par traitement par un agent précipitant les acides nucléiques, tel que le chlorure de manganèse et par un agent de relar gage des débris de cellules bactériennes, tel que le sulfate d'ammonium, c) on ajuste la phase liquide purifiée à un pH compris entre 8 et 8,5, puis on passe sur résines échangeuses d'ions qui fixent le cytochrome tandis que l'effluent est ajusté à un pH compris entre 3,3 et 4 (pH proche du point isoélectrique) et les protéines précipitées au moyen de sulfate d'ammonium, d) on lave la résine sur laquelle le cytochrome a été fixé, à l'aide d'une solution aqueuse alcaline à pH 8-8,25, puis on élue le cytochrome au moyen d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium.
2. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la solution de cytochrome obtenue au stade d) est dessalée, puis le cytochrome est isolé par les techniques usuelles, telles,notamment, que 1 ' évaporation à sec, l'atomisation ou la lyophilisation.
3. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'on obtient une purification très poussée du cytochrome à l'aide des étapes complémentaires suivantes : e) on précipite le cytochrome contenu dans l'éluat des résines échangeuses d'ions au moyen d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium de 4,5 M à 6 M ; on lais se décanter 12 heures environ à une températeure infé rieure à 10°C, puis on filtre, f) on redissoύt le cytochrome ainsi précipité, dans l'eau puis on le précipite à l'aide d'acide trichloracétique, g) on redissout le précipité de cytochrome dans l'eau et on reprécipite au moyen d'un alcool, tel que l'alcool éthylique, de préférence.
4. Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la levure est choisie parmi les Saccharomyces et les Torula.
5. Procédé selon la Revendication 4, caractérisé en ce que la levure est choisie dans le groupe qui comprend le Saccharomyces cerevisiae, le. Kluyveromyces fragilis, le Saccharomyces carlsbergensis et le Saccharomyces uvarum.
6. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la lyse cellulaire du stade a) est effectuée sous une pression de 300 à 760 bars, et de préférence sous une pression de 300 à 500 bars.
7. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la purification effectuée au stade b) est réalisée au moyen de 0,1 volume de MnCl2 1 M et d'une solution aqueuse de (NH4)2 SO4 à 100-250 g/litre pour un volume de solution obtenue au stade a) .
8. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que les protéines précipitées au stade c) sont redissoutes dans l'eau et dessalées par passage sur une colonne de résines (résines échangeuses d'ions ou gels d'exclusion).
9. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la solution de lavage alcaline mise en oeuvre au stade d) est une solution ammoniacale.
10. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'élution du stade d) est réalisée au moyen d'une solution aqueuse de pH compris entre 8 et 8,5 et renfermant 150 g/litre environ de SO4(NH4)2.
11. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la précipitation du cytochrome C au stade g) par l'acide trichloracétique est effectuée jusqu'à un pH voisin de 3.
12. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la précipitation du cytochrome C réalisée au stade g) par un alcool, est effectuée à un pH faiblement alcalin (7,3-7,6).
13. Substance protëinique caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 8.
14. Substance protëinique selon la Revendication
13, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée par un mélange de cinq protéines dont les poids moléculaires vont de 50 000 à 120 000.
15. Hémoprotéine, et notamment le cytochrome C, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé selon les Revendications 1 et 2.
16. Cytochrome purifié caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé selon les Revendications 1 et 3.
17. Application des hémoprotéines et des protéines selon les Revendications 13 à 16, dans l'alimentation humaine et animale et/ou la pharmacie.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3371081A (en) * 1963-08-29 1968-02-27 Sankyo Co Process for the purification of cytochrome c
JPS4818825B1 (fr) * 1970-03-27 1973-06-08

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEMICAL ABSTRACTS, Vol. 65, no. 7, publié le 26 septembre 1966, Columbus, Ohio, (USA) & JP-B-41 007 827, publié le 26 avril 1964, Sankyo Co. Ltd., voir colonne à gauche, abrégé no. 11307f *
CHEMICAL ABSTRACTS, Vol. 79, no. 15, publié le 15 octobre 1973, Columbus, Ohio, (USA) & JP-B-48 018 825, publié le 8 juin 1973, Nakamura, Tokuro-Kojin, voir page 304, abrégé no. 90524g *

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