UA85815C2 - Застосуваня імуногену для профілактики або лікування хвороби альцгеймера або інших захворювань, пов'язаних з відкладенням амілоїду - Google Patents

Abstract

Винахід належить до застосування імуногену, який являє собою поліамінокислоту, яка містить в одній і тій же молекулі істотну частину В-клітинних епітопів АРР і/або Аβ, так, що поліамінокислота у тій же мірі, що і АРР або Аβ, реагує з поліклональною сироваткою, одержаною проти АРР або Аβ, і щонайменше один чужорідний Т-хелперний епітоп (ТН-епітоп), і яка містить щонайменше один чужорідний ТН-епітоп і розбиту на частини послідовність АРР або Аβ, так, що поліамінокислота не включає в себе жодної підпослідовності SEQ ID NО:2, яка продуктивно зв'язується з молекулами МНС класу II, викликаючи Т-клітинну відповідь. Винахід також належить до імуногенної композиції, фрагмента нуклеїнової кислоти, вектора, трансформованої клітини, а також композиції для індукування продукції антитіл проти амілоїду.

Description

Вплив АО

Ар являє собою найбільш загальну причину деменції у людини у віці 65 років і старше. Вона являє собою велику проблему для здоров'я внаслідок її величезного впливу на індивідів, сім'ї, систему охорони здоров'я і суспільство загалом. Вчені підрахували, що у наш час понад 4 мільйони людей страждають від даного захворювання, і частота захворювання у тих індивідів, кому більше 65 років, подвоюється кожні 5 років. Також припускають, що кожного року виникне приблизно 360000 нових випадків (інцидент), хоча ця цифра буде збільшуватися в міру старіння населення |ВгооКтеуег еї а!., 1998).

АЮ накладає тяжкий економічний тягар на суспільство. В останньому дослідженні у Сполучених Штатах розрахували, що щорічна вартість лікування одного пацієнта з АО складає 518408 для пацієнта зі слабкою

АЮ, 530096 - для пацієнта з помірною АО і 536132 - для пацієнта з тяжкою АЮ. Підраховано, що щорічні державні витрати у США на лікування пацієнтів з АО складають трохи більше 550 мільярдів (Геоп еї аї., 1998).

Приблизно 4 мільйони американців знаходяться у віці 85 років або більше і в найбільш індустріалізованих країнах ця вікова група являє собою одну з найбільш швидко зростаючих частин населення. Розраховано, що дана група до 2030 року у США складатиме приблизно 8,5 мільйонів; деякі експерти, які вивчають зміни населення припускають, що дане число може навіть бути більшим. Оскільки все більше і більше людей живе довше, число людей, уражених захворюваннями, пов'язаними з віком, включаючи АО, буде продовжувати збільшуватися. Наприклад, деякі дослідження показують, що приблизно половина з усіх людей у віці 85 років і старше має яку-небудь форму недоумства (Маїйопаї! Іп5ійціе оп Адіпд

Ргодгезв ВНероїгі оп АІ2Пеїітегз Оівзеазе, 1999).

Основні характеристики АО

Ознаками АО є дві аномальні структури у головному мозку: амілоїдні бляшки і нейрофібрилярні клубки (МЕТ). Бляшки являють собою щільні, майже абсолютно нерозчинні накопичення білка і клітинної речовини поза і навколо нейронів головного мозку. Клубки являють собою нерозчинні переплетені волокна, що накопичуються всередині нейронів.

Існує дві форми АО: сімейна АЮ (БА), яка підпорядковується певному типу успадковування, і спорадична АС, для якої не спостерігається очевидного типу успадковування. Внаслідок відмінностей на початку захворювання АО додатково описують як захворювання з раннім початком (що виникає у людини молодше 65 років) і з пізнім початком (що виникає у людини 65 років і старше). АО з раннім початком трапляється рідко (приблизно 10 процентів випадків) і, як правило, уражує людей у віці від 30 до 60 років.

Деякі форми А з раннім початком є спадковими і уражують членів сімей. АО з раннім початком також часто прогресує швидше, ніж більш часта форма з пізнім початком.

Всі ГАО, відомі до цього часу, характеризуються раннім початком, а у наш час відомо, що до 50 процентів випадків РЕАО викликані дефектами у трьох генах, розташованих на трьох різних хромосомах.

Вони являють собою мутації у гені АРР на хромосомі 21; мутації у гені, що називається пресенілін-1, на хромосомі 14 і мутації у гені, що називається пресенілін-2, на хромосомі 1. Однак досі немає доказів того, що яка-небудь з цих мутацій грає основну роль у більш частій, спорадичній або несімейній формі АО з пізнім початком (Маїіопаї! Іпзійше оп Адіпд Ргодге55 Керогпі оп АІ2пеітегз Оізеазе, 19991.

Амілоїдні бляшки

При АО амілоїдні бляшки спочатку розвиваються у ділянках головного мозку, пов'язаних з пам'яттю та іншими когнітивними функціями. Вони складаються з майже абсолютно нерозчинних накопичень бета- амілоїду (який надалі позначається АД), що являє собою білкові фрагменти більшого білка, який називається білком-попередником амілоїду (АРР, амінокислотна послідовність якого приведена далі у ЗЕО

ІО МО:2), змішаного з частинами нейронів і клітин, що не є нейронами, таких як мікроглія і астроцити.

Невідомо, чи є амілоїдні бляшки як такі основною причиною АО або вони являють собою побічний продукт процесу АО. Безумовно, як показано для успадковуваної форми АО, що викликається мутаціями у гені АРР, зміни білка АРР можуть викликати АО, а формування бляшок Ар являється тісно асоційованим з прогресією захворювання у людини ГГірра С. Р. еї аї. 19981.

АРР

АРР являє собою один з багатьох білків, зв'язаних з клітинними мембранами. Після його утворення АРР вбудовується у мембрану нервової клітини, розташовуючись частково всередині і частково ззовні клітини.

Останні дослідження з використанням трансгенних мишей показали, що, очевидно, АРР грає важливу роль у рості і виживанні нейронів. Наприклад, визначені форми і кількості АРР можуть захистити нейрони і від короткочасного, і від тривалого пошкодження, а також можуть приводити пошкоджені нейрони у стан з кращою здатністю до самовідновлення і допомагають частинам нейронів рости після травми головного мозку.

Доки АРР вбудований у клітинну мембрану, на особливі ділянки АРР діють протеази, розщеплюючи його на білкові фрагменти. Одна протеаза допомагає розщепити АРР, з утворенням АД, а інша протеаза розщеплює АРР посередині амілоїдного фрагмента, так що АД не може сформуватися. Фрагмент Ар сформований з двох різних частин, більш короткого АД довжиною 40 (або 41) амінокислот, який є відносно розчинним і повільно агрегує, і небагато більш довгого "липкого" АД, довжиною 42 амінокислоти, який швидко утворює нерозчинні агрегати. Доки АД формується, ще точно невідомо, як він рухається через нервові клітини або навколо них. На фінальній стадії процесу "липкий" АД агрегує у довгі філаменти ззовні клітини і разом з фрагментами відмерлих або відмираючих нейронів і мікроглією з астроцитами формує бляшки, що характеризують АО у тканині головного мозку.

Існують деякі докази, що мутації в АРР стають більш вірогідними, коли від попередника АРР відріжеться АД, таким чином викликаючи утворення або великих кількостей загального АД, або відносно великих кількостей «липкої» форми. Також виявили, що мутації у генах пресеніліну можуть здійснювати внесок у дегенерацію нейронів щонайменше двома шляхами: за допомогою модифікації продукції АД або за допомогою запуску клітинної смерті більш безпосередньо. Інші дослідження наводять на думку, що мутовані пресеніліни 1 і 2 можуть бути залучені до зростаючої швидкості апоптозу.

Вважають, що Ар токсичний для нейронів. У дослідженнях на культурі тканини дослідники виявили збільшення смерті нейрональних клітин гіпокампу, сконструйованих для підвищеної експресії мутантних форм АРР людини у порівнянні з нейронами з підвищеною експресією нормальної АРР людини (оо еї аї.,

Крім того, підвищена експресія або експресія модифікованих форм білка АД, як показано на тваринних моделях, викликає симптоми, подібні до симптомів при хворобі Альцгеймера ІНзіао К. еї а!., 19981.

На основі даних про те, що збільшене утворення Ар, його агрегація у бляшки і результуюча нейротоксичність можуть вести до Аб0, дослідження станів, в яких агрегацію АД у бляшки можна знизити або навіть блокувати, представляє інтерес для лікування.

Пресеніліни

Мутації у пресеніліні-1 (5-180) відповідають майже за 5095 всіх випадків сімейної АО з раннім початком (РАБ). Ідентифіковано близько 30 мутацій, що приводять до АЮ. Початок АО варіює, в залежності від мутацій. Мутації у пресеніліні-2 відповідають за набагато меншу частину випадків РАЮ, але проте являють собою значимий фактор. Чи залучені пресеніліни до спорадичної несімейної АО, невідомо. Функція пресенілінів невідома, але вони виявляються залученими до процесингу АРР з одержанням Ар-42 (більш довга липка форма пептиду, ЗЕО ІЮ МО:2, залишки 673-714), оскільки пацієнти з АО з мутаціями у пресеніліні мають підвищені рівні даного пептиду. Чи виграють також пресеніліни роль при індукції утворення МТЕ, незрозуміло. Деякі дані дозволяють припустити, що пресеніліни також можуть мати більш безпосередню роль у дегенерації і смерті нейронів. Пресенілін-1 розташований на хромосомі 14, у той час як пресенілін-2 зчеплений з хромосомою 1. Якщо суб'єкт несе мутовану версію хоча б одного з даних генів, у нього або у неї майже достовірно розвинеться АО з раннім початком.

Дещо незрозуміло, чи є пресенілін-1 ідентичним гіпотетичній у-секретазі, залученій до процесингу АРР

ІМагиве еї а!., 1998).

Аполіпопротеїн Е

Аполіпопротеїн Е звичайно асоційований з холестерином, але його також знаходять у бляшках і клубках у головному мозку при АЮ. Незважаючи на те, що алелі 1-3 вважаються не залученими до Аб0, існує значима кореляція між присутністю алеля АРОБЕ-є4 і розвитком АО з пізнім початком І(Зігйтакцнег еї а!ї., 1993.

Однак це являє собою фактор ризику, а не пряму причину як у випадку мутацій пресеніліну і АРР, і це не обмежено сімейною АЮ.

Шляхи, при яких у зв'язку з білком АРОЕ «4 збільшується ймовірність розвитку АО0, достовірно не відомі, але одна можлива теорія полягає у тому, що він полегшує накопичення Ар, і це сприяє зменшенню віку початку АО, або присутність або відсутність конкретних алелів АРОЕ може впливати на спосіб, яким нейрони відповідають на пошкодження (Виціпі еї а!., 19991.

Показано, что Аро Ат також є амілоїдогенним. Інтактний Аро А1 іп міго самостійно може формувати фібрили, подібні до амілоїду, які забарвлюються конго червоним (Ат У. Райої. 147 (2): 238-244 (Аца. 1995),

Умізпіемузкі Т., сСоїарек А.А., Кіда Е., ММізпіемузКі К.Е., Ргапдіопе В.|.

Очевидно, існують суперечливі результати, які вказують на те, що мають місце позитивні ефекти алеля

АРОБ-є4 відносно зменшення симптомів ментальної втрати у порівнянні з іншими алелями І5Їет, Вгапаї, 1997, Аппаї5 ої МеигоЇоду 411.

Нейрофібрилярні клубки

Дана друга ознака АЮ полягає в аномальному накопиченні перекручених ниток, що виявляються всередині нервових клітин. Головний компонент клубків являє собою одну з форм білка, що називається тау (1). У центральній нервовій системі тау-білюи найбільш відомі своєю здатністю зв'язуватися з мікротрубочками, що являють собою одну зі складових внутрішньої підтримуючої структури клітини, або цитоскелет, і допомагати їм стабілізуватися. Однак при АО тау-білки змінені хімічно, і такі змінені тау-білки більше не здатні стабілізувати мікротрубочки, будучи причиною їх дезінтеграції. Таке руйнування транспортної системи може спочатку привести до порушення зв'язків між нервовими клітинами, а пізніше може привести до смерті нейронів.

При АО хімічно змінені тау-білки переплітаються у парні спіральні філаменти, що являють собою дві нитки тау-білків, накручених одна навколо іншої. Ці філаменти являють собою основну речовину, що виявляється у нейрофібрилярних клубках. В одному нещодавньому дослідженні були виявлені нейрофібрилярні зміни менш ніж у 6 процентах нейронів у визначеній частині гіпокампу у головному мозку здорових, більш ніж у 43 процентах цих нейронів у людей, які померли від помірної АОС, і у 71 проценті цих нейронів у людей, які померли від тяжкої АО. Коли вивчали загибель нейронів, виявили подібну прогресію.

Докази такого типу підтримують ідею про те, що формування клубків і загибель нейронів прогресують разом у процесі АО (Маїйопаї Іпзійше оп Адіпд Ргодгез55 Керогпі оп АІ2пеїітег5 Оізеазе, 19991.

Таупатії і клубки

Тяжкі нейродегенеративні захворювання, відмінні від АО, характеризуються агрегацією тау-білків у нерозчинні філаменти у нейронах і глії, що приводять до дисфункції та смерті. Зовсім нещодавно декілька груп дослідників, які вивчали сім'ї з різними видами успадковуваного недоумства, що відрізняється від АЮ, виявили першу мутацію у гені тау-білка на хромосомі 17 (Сіагк еї а!., 1998; Нийоп еї а!., 1998; Роогкаї еї аї., 1998; 5ріпапінпі еї а!., 19981). У цих сім'ях мутації в гені тау-білка викликають смерть нейронів і недоумство.

Такі розлади, що розділяють деякі з характеристик з АО, але відрізняються у деяких важливих аспектах, узагальнено називають «фронто-темпоральне недоумство і паркінсонізм, зчеплені з хромосомою 17» (ЕТОР-17). Вони являють собою захворювання, такі як хвороба Паркінсона, деякі форми аміотрофічного бічного склерозу (А! 5), кортикобазальна дегенерація, прогресуючі супрануклеарний параліч і хвороба Піка, всі з яких характеризуються аномальним накопиченням тау-білка.

Інші неврологічні захворювання, подібні до АЮ

Існують важливі паралелі між АО та іншими неврологічними захворюваннями, включаючи пріонні захворювання (такі як куру, хвороба Крейцфельдта-Якоба і бичачий губчатий енцефаліт), хворобу

Паркінсона, хворобу Гентінгтона і фронто-темпоральну деменцію. Всі вони пов'язані з накопиченням у головному мозку аномальних білків. І АО, і пріонні захворювання викликають недоумство і смерть, і асоційовані з формуванням нерозчинних фібрил амілоїду, але з мембранних білків, які відрізняються один від одного.

Вчені, що вивчають хворобу Паркінсона, другий найбільш частий розлад після АО, виявили перший ген, зчеплений з даним захворюванням. Даний ген кодує білок, що називається синуклеїн, який, що цікаво, також виявлений в амілоїдних бляшках головного мозку пацієнтів з АО (Гамедап С, 1998, Сепоте Кезв. 8 (9): 871-80). Дослідники також виявили, що генетичні дефекти при хворобі Гентінгтона, в іншому прогресуючому нейродегенеративному захворюванні, яке викликає недоумство, служать причиною того, що білок

Гентінгтона утворює нерозчинні фібрили, дуже подібні до фібрил АД при АО і білкових фібрил при прінному захворюванні І(зспеггіпдег Е, еї аІ, 1999, РМАБЗ Ц.5.А. 96 (8): 4604-9).

Вчені також виявили новий ген, який у мутантній формі відповідає за сімейне недоумство англійців (ЕВО), рідке спадкове захворювання, що викликає тяжкі рухові порушення і прогресуюче недоумство, подібне до того, що спостерігається при А. При біохімічному аналізі фібрил амілоїду, виявлених у бляшках при ЕВО, знайдений новий пептид, що називається Абгі (Міда! еї аї!., 1999). Мутація в особливій точці у даному гені приводить до продукції більш довгого, ніж звичайний, білка Вії. Пептид Абгі, який відрізається від мутантного кінця білка Вгі, відкладається у вигляді фібрил амілоїду. Вважають, що такі бляшки ведуть до нейрональної дисфункції та недоумства, що характеризує ЕВО.

Імунізація Ар

Імунна система звичайно бере участь в очищенні від чужорідних білків і білкових частинок в організмі, але накопичення, асоційовані з вказаними вище захворюваннями, головним чином складаються з власних білків, отже, інтерпретація ролі імунної системи у контролі даних захворювань менш очевидна. Крім того, накопичення розташовані у відділах (ЦНС), звичайно відділених від імунної системи, обидва цих факти дозволяють припустити, що будь-яка вакцина або імунотерапевтичний підхід виявляться безуспішними.

Проте, вчені нещодавно спробували імунізувати мишей вакциною, що складається з гетерологічного людського АД і речовини, відомої як стимулятор імунної системи (Зспепк еї аї!., 1999 і УМО 99/27944|.

Вакцину тестували у конкретній моделі АЮ у трансгенних мишей з мутантним геном АРР людини, вставленим у ДНК миші. У мишей в міру їх старіння продукувався модифікований білок АРР і розвивалися амілоїдні бляшки. Дану мишачу модель використовували для тестування можливого ефекту вакцинації проти модифікованого трансгенного АРР людини на формування бляшок. У першому експерименті одній групі трансгенних мишей щомісяця вводили ін'єкції вакцини, починаючи з віку у б тижнів і закінчуючи у віці 11 тижнів. Друга група мишей не одержувала ін'єкцій і служила контрольною групою. До віку 13 місяців у мишей в контрольній групі були наявні бляшки, що охоплюють від 2 до 6 процентів їх головного мозку.

Навпаки, у імунізованих мишей практично не було бляшок.

У другому експерименті вчені починали проводити ін'єкції на 11 місяці, коли деякі бляшки вже розвинулися. Через 7 місяців контрольні трансгенні миші мали у 17 разів більшу кількість бляшок у головному мозку, тоді як у мишей, що одержували вакцину, відбувалося 9995-е зменшення кількості бляшок у порівнянні з 18-місячними контрольними трансгенними мишами. Було виявлено, що у деяких мишей деякі з попередніх відкладень бляшок видалялися внаслідок лікування. Також виявили, що інші пошкодження, асоційовані з бляшками, такі як запалення і аномальні процеси у нервових клітинах, в результаті імунізації зменшувалися.

Таким чином, вказане вище являє собою попереднє дослідження на мишах, і, наприклад, вченим необхідно з'ясувати, чи залишаються вакциновані миші здоровими в інших аспектах і чи нормально зберігається пам'ять у вакцинованих мишей. Більш того оскільки мишача модель не повністю відображає

АР (у тварин не розвиваються нейрофібрилярні клубки, і при цьому велика кількість з їх нейронів не гине), необхідні додаткові дослідження для визначення того, чи володіє людина подібною до мишачої реакцією або реакцією, відмінною від мишачої. Інша проблема для розгляду полягає у тому, що спосіб, можливо, може «лікувати» накопичення амілоїду, але не зупиняти розвиток недоумства.

Технічні проблеми також являють собою великі складності. Наприклад, малоймовірно, якщо взагалі можливо, застосування даного способу для створення вакцини, що дає можливість підвищити у людини рівень антитіл проти її власних білків. Таким чином, перед тим як можна буде розглядати які-небудь випробування на людині, необхідно вирішити численні проблеми безпеки і ефективності.

Таким чином, робота бспепкК еї а. показує, що якщо можна викликати сильну імунну відповідь до власних білків у білкових відкладеннях у центральній нервовій системі, таких як бляшки, що формуються при АБ, можна і запобігти формуванню накопичень, і можна також усунути вже сформовані бляшки.

Останнім часом клінічні спроби із застосуванням вакцин АД, що обговорюються вище, обмежувалися внаслідок несприятливих ефектів: у ряду вакцинованих суб'єктів розвивався хронічний енцефаліт, який міг виникати внаслідок некерованого аутоіїмунітету проти АД у ЦНО.

Метою даного винаходу є надання нових способів лікування станів, таких як АО, що характеризуються накопиченням амілоїду. Додаткова мета являє собою розробку аутовакцини проти амілоїду для розробки нового способу лікування АО та інших патологічних розладів, асоційованих з відкладенням амілоїду.

Суть винаходу

Тут описане застосування способу аутовакцинації для вироблення сильних імунних відповідей проти інакше неімуногенних АРР і АД. Також описане одержання таких вакцин для профілактики, можливого лікування або ослаблення симптомів захворювань, асоційованих з відкладеннями амілоїду.

Таким чином, у своєму широкому і найбільш повному обсязі, даний винахід відноситься до способу знижувальної регуляції білка-попередника амілоїду (АРР) або бета-амілоїду (АД) іп мімо у тварин, включаючи людину, де спосіб включає в себе ефективну презентацію імунній системі тварини імуногенно ефективної кількості щонайменше одного аналога АРР або АД, який містить в одній молекулі щонайменше один В-клітинний епітоп АРР і/або Ар і щонайменше один чужорідний Т-хелперний епітоп (Тн-епітоп), так що імунізація тварини даним аналогом викликає продукцію антитіл проти аналогів АРР або АД тварини, де аналог а) являє собою поліамінокислоту, що складається щонайменше з однієї копії підпослідовності залишків 672-714 в ЗЕО ІО МО:2, де чужорідний Тн-епітоп вводять за допомогою додавання і/або вставки, і/або делеції, і/або заміни амінокислот, де підпослідовність вибрана з групи, що складається із залишків 1-42,

залишків 1-40, залишків 1-39, залишків 1-35, залишків 1-34, залишків 1-28, залишків 1-12, залишків 1-5, залишків 13-28, залишків 13-35, залишків 17-28, залишків 25-35, залишків 35-40, залишків 36-42 і залишків 35-42 амінокислотної послідовності, що складається з амінокислотних залишків 673-714 5ЕО ІЮ МО:2; і/або р) являє собою поліамінокислоту, що містить чужорідний Тн-епітоп і розірвану послідовність АРР або

АД, так, що аналог не містить жодної підпослідовності 5ЕО ОО МО:2, яка продуктивно зв'язується з молекулами МНС класу Ії, ініціюючи Т-клітинну відповідь; і/або с) являє собою поліамінокислоту, що включає в себе чужорідний Тн-епітоп і одержані з АРР або АД амінокислоти, і включає в себе 1 єдиний залишок метіоніну, розташований на С-кінці аналога, причому інші залишки метіоніну в АРР або Ар і в чужорідному Тн-епітопі заміщені або видалені і переважно заміщені лейцином або ізолейцином; і/або а) являє собою кон'югат, що включає в себе полігідроксиполімерний кістяк, до якого окремо приєднана поліамінокислота, як визначено в а), і/або поліамінокислота, як визначено у б), і/або поліамінокислота, як визначено у с); і/або е) являє собою кон'югат, що включає в себе полігідроксиполімерний кістяк, до якого окремо приєднані 1) чужорідний Тн-епітоп і 2) поліамінокислота, вибрана з групи, що складається з підпослідовностей, як визначено в а), розірваної послідовності АРР або Ар, як визначено в Б), і одержану з АРР або АД амінокислотну послідовність, що включає в себе 1 єдиний залишок метіоніну, розташований на С-кінці, причому інші залишки метіоніну в АРР або Ар і в чужорідному Тн-епітопі заміщені або видалені і переважно заміщені лейцином або ізолейцином.

Правонаступником даного винаходу раніше була подана міжнародна патентна заявка, що відноситься до безпечних стратегій вакцинації проти амілоїдогенних пептидів, таких як АРР або АВД, пор. (МО 01/622841).

Дана заявка не була опублікована на момент дати подачі даної заявки і, крім того, не містить деталей, що відносяться до вказаних вище придатних аналогів АРР і АД.

Винахід також відноситься до аналогів АРР і Ар, також як до фрагментів нуклеїнових кислот, що кодують їх підмножину. Також винахід відноситься до імуногенних композицій, що включають в себе аналоги або фрагменти нуклеїнових кислот.

Фігура 1: Схематичне зображення варіантів Ашомас, що дістали з білка- попередника амілоїду з метою виклику відповідей за допомогою антитіл проти білка АД Ар-43 (або С-100). АРР схематично показаний вгорі фігури, а схематичні конструкції, що залишилися, показують, що модельні епітопи Ра2 і РЗО заміщають різні укорочені продукти АРР або вставлені в них. На Фігурі чорний блок означає сигнальну послідовність АРР, коса штриховка у двох напрямах означає екстрацелюлярну ділянку АРР, темна вертикальна штриховка відповідає трансмембранному домену АРР, світла вертикальна штриховка відповідає внутрішньоклітинному домену АРР, жирна коса штриховка означає епітоп РЗО і тонка коса штриховка означає епітоп Р2. Рамка з суцільних ліній означає Ар-42/43, а рамка з суцільних ліній разом з рамкою з пунктирних ліній означають С-100. «Ареїа» означає Ар.

Фігура 2: Схематичне зображення здійснення синтезу імуногенних кон'югатів, що застосовуються у більшості випадків. Синтезують і змішують пептид А (будь-яка антигенна послідовність, наприклад, послідовність АД, описана тут) і пептид В (амінокислотна послідовність, що включає в себе Т-хелперний епітоп). Після того, як вони приходять у контакт з відповідним активованим полігідроксиполімером, пептиди

А і В приєднуються за допомогою активної групи у співвідношенні, що відповідає вихідному співвідношенню між даними двома речовинами у суміші пептидів. Для подробиць див. приклад 4.

Визначення

Далі буде визначений і детально пояснений ряд термінів, що застосовуються у даному описі і формулі винаходу, для пояснення меж винаходу.

Терміни "амілоїд" і "амілоїдний білок", що застосовуються тут, є взаємозамінними і означають клас білкових нерозгалужених фібрил невизначеної довжини. Фібрили амілоїду виявляють здатність до забарвлення конго червоним і мають складчасту р-структуру, в якій поліпептидні ланцюги організовані у р- шари. Амілоїд, як правило, походить з амілоїдогенних білків, які володіють структурами попередників, що сильно відрізняються, але всі з яких можуть зазнавати структурної конверсії в аномально укладену форму, що являє собою будівельний блок протофіламенту спіралі Д-шару. Звичайно діаметр фібрил амілоїду змінюється приблизно від 70 до 120А.

Термін «амілоїдогенний білок» призначений для позначення поліпептиду, який залучений до утворення відкладень амілоїду, або, по суті, є частиною відкладень або є частиною біосинтетичного шляху, що приводить до утворення відкладень. Отже, прикладами амілоїдогенних білків є АРР і АД, але амілоїдогенними білками також можуть вважатися і білки, залучені до їх метаболізму. «Амілоїдний поліпептид» тут призначений для позначення поліпептидів, що включають в себе амінокислотну послідовність амілоїдогенних білків, які обговорюються вище, що походять від людини або інших ссавців (або їх укорочені варіанти, що розділяють з інтактним амілоїдогенним білком істотну кількість

В-клітинних епітопів), отже, амілоїдогенний поліпептид може, наприклад, включати в себе істотну ділянку попередника амілоїдогенного поліпептиду (у випадку АД один з можливих амілоїдних поліпептидів може походити з АРР). Також даний термін включає в себе неглікозильовані форми амілоїдогенних поліпептидів, що одержують у прокаріотичних системах, а також форми з різними профілями глікозилювання через застосування, наприклад, дріжджів або інших еукаріотичних систем, що експресують, які не належать до ссавців. Однак необхідно зазначити, що, коли застосовують термін "амілоїдогенний поліпептид", це означає, що поліпептид, який розглядається, при презентації тваринам, що піддаються впливу, звичайно є неімуногенним. Іншими словами, амілоїдогенний поліпептид являє собою власний білок або аналог такого власного білка, який звичайно не дає початку імунній відповіді проти амілоїдогенного білка тварини, що розглядається. «Аналог» являє собою молекулу, одержану з АРР або АД, що містить одну або декілька змін у своїй молекулярній структурі. Таку зміну, наприклад, можна здійснити при злитті поліамінокислот АРР або АД з відповідним для злиття партнером (тобто зміна у первинній структурі, яка виключно включає в себе С -і/або

М-кінцеві додавання амінокислотних залишків) і/або можна здійснювати у вигляді вставок і/або делецій і/або замін амінокислотної послідовності поліпептиду. Також у термін включені дериватизовані молекули, одержані з АРР або Ар, пор. обговорення модифікацій АРР або АД нижче. У деяких випадках аналог можна сконструювати з тим, щоб зменшити або навіть виключити здатність спричиняти появу антитіл проти нормального білка(ів)-попередника(ів) амілоїду, таким чином уникаючи небажаної взаємодії з (фізіологічно нормальною) неагрегованою формою поліпептиду, що є попередником амілоїдного білка.

Необхідно зазначити, що, як припускається, застосування як вакцини для людини чужорідного аналога (наприклад, собачого або свинячого аналога) АРР або АД людини створить бажаний імунітет проти АРР або

АД. Таке застосування чужорідного аналога також розглядається як частина винаходу.

Термін «поліпептид» у даному контексті призначений для позначення і коротких пептидів від 2 до 10 амінокислотних залишків, і олігопептидів від 11 до 100 амінокислотних залишків, і поліпептидів з більш ніж 100 амінокислотних залишків. Більш того, також припускається, що даний термін охоплює білки, тобто функціональні біологічні молекули, які включають в себе щонайменше один поліпептид; коли такі біологічні молекули містять щонайменше два поліпептиди, останні можуть формувати комплекси, бути ковалентно зв'язаними або можуть бути зв'язаними нековалентно. Поліпептид(и) у білку можуть бути глікозильованими іабо ліпоїльованими, і/або включати в себе простетичні групи. Термін «поліамінокислота» також еквівалентний терміну «поліпептид».

Терміни «Т-лімфоцит» і «Т-клітина» застосовують поперемінно для лімфоцитів, що походять з тимуса, які відповідають за різні види імунної відповіді, опосередкованої клітинами, а також за хелперну активність у гуморальній імунній відповіді. Подібним чином терміни "В-лімфоцит" і "В-клітина" застосовують поперемінно для лімфоцитів, які продукують антитіла.

Термін «підпослідовність» означає будь-який безперервний відрізок щонайменше з З амінокислот або, коли доречно щонайменше з 3 нуклеотидів, безпосередньо одержаної з природних амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнових кислот амілоїду, відповідно.

Термін «тварина» у даному контексті як правило, призначений для позначення виду тварини (переважно ссавця), такої як Ното 5аріеп5, Сапі5 дотезвіїсиз і т.п., а не тільки однієї-єдиної тварини. Однак цей термін також означає популяцію такого виду тварин, оскільки важливо, щоб всі індивіди, імунізовані способом відповідно до даного винаходу, володіли по суті однаковими АРР або АД, якщо брати до уваги імунізацію тварин одним і тим же імуногенним(и) засобом(ами). Фахівцям зрозуміло, що тварина у даному контексті являє собою живу істоту з імунною системою. Переважно, щоб тварина була хребетною, такою як ссавець.

Під терміном «знижувальна регуляція АРР або АД іп мімо» тут мають на увазі зменшення у живому організмі загальної кількості накопиченого амілоїдного білка (або амілоїду як такого) відповідного типу.

Знижувальну регуляцію можна одержати за допомогою декількох механізмів, з яких проста взаємодія з амілоїдом за допомогою зв'язування антитіл, так, щоб запобігти аномальній агрегації, являє собою найбільш простий. Однак в об'єм даного винаходу також входить те, що зв'язування антитіл приводить до видалення амілоїду поглинаючими клітинами (такими як макрофаги та інші клітини, що фагоцитують), і що антитіла взаємодіють з іншими амілоїдогенними поліпептидами, які приводять до утворення амілоїду.

Додатковою можливістю є те, що антитіла зв'язують АД поза ЦНС, таким чином видаляючи АД з ЦНС за допомогою простого принципу дії мас.

Вираз «ефективна презентація ... імунній системі» призначений для позначення того, що імунна система тварин у контрольованому режимі зазнає імуногенної провокації імунної відповіді. Як стане зрозуміло з опису нижче, таку провокацію відповіді імунної системи можна провести рядом способів, найбільш важливі з яких являють собою вакцинацію поліпептидом, що містить «фармацини» (тобто вакцину, яку вводять для лікування поточної хвороби або поліпшення стану при цій хворобі) або вакцинацію нуклеїновою кислотою, що містить «фармацини». Важливим результатом для досягнення є те, щоб імунокомпетентні клітини тварини протистояли антигену імунологічно ефективним способом, тоді як точний спосіб досягнення такого результату є менш важливим для ідеї відповідно до винаходу, що лежить в основі даного винаходу.

Термін «імуногенно ефективна кількість» має значення, звичайно прийняте у даній області, тобто він означає кількість імуногена, якої досить для індукції імунної відповіді, що значимо охоплює патогенні речовини, які розділяють загальні імунологічні властивості з імуногеном.

Коли кажуть, що АРР або АД «модифіковані», тут це означає, що проводили хімічну модифікацію поліпептиду АРР або Ар. Така модифікація може являти собою одержання похідних (наприклад, алкілування) визначених амінокислотних залишків у послідовності, але як можна буде зрозуміти з опису нижче, переважні модифікації включають в себе зміни первинної структури амінокислотної послідовності.

Коли обговорюють "аутотолерантність до АРР або АВ", зрозуміло, що оскільки поліпептид являє собою власний білок популяції, що підлягає вакцинації, у звичайних індивідів у популяції не виникає імунної відповіді проти поліпептиду; однак це не можна виключити, оскільки індивіди, що рідко зустрічаються у популяції тварин, можуть бути здатні продукувати антитіла до нативного поліпептиду, наприклад, як частина аутоїмунного розладу. Принаймні, тварина звичайно аутотолерантна тільки до свого власного АРР або АД, однак не можна виключати, що дана тварина також буде толерантною до аналогів, одержаних від іншого виду тварин або з популяції з іншим фенотипом. "Чужорідний Т-клітинний епітоп" (або: «Чужорідний Т-лімфоцитарний епітоп») являє собою пептид, що здатний зв'язуватися з молекулою МН і стимулює Т-клітини у виду тварин. Переважні чужорідні Т-клітинні епітопи являють собою "змішані" епітопи, тобто епітопи, що зв'язуються основною частиною молекул МНС конкретного класу у виду тварин або популяції. Відома тільки дуже обмежена кількість таких змішаних Т- клітинних епітопів, і вони детально обговорюються нижче. Змішані Т-клітинні епітопи також позначають як "універсальні" Т-клітинні епітопи. Необхідно зазначити, що для імуногенів, які застосовуються відповідно до даного винаходу, щоб бути ефективними якомога в більшій частині популяції тварин, можуть бути необхідні 1) вставка декількох чужорідних Т-клітинних епітопів в один і той же аналог або 2) одержання декількох аналогів, де кожний з аналогів володіє різним вставленим змішаним епітопом. Необхідно також зазначити,

що ідея про чужорідні Т-клітинні епітопи також включає в себе застосування прихованих Т-клітинних епітопів, тобто епітопів, що одержані з власних білків і викликають імунологічну реакцію тільки тоді, коли вони існують в ізольованій формі, не будучи частиною власного білка, що розглядається. «Чужорідний Т-хелперний лімфоцитарний епітоп» (чужорідний Тн-епітоп) являє собою чужорідний Т- клітинний епітоп, який зв'язується з молекулою МНС класу ІІ і який може бути представлений на поверхні клітини (АРС), що презентує епітоп, у зв'язаному з молекулою МН класу ІІ виді. «Функціональна ділянка» (біологічної) молекули у даному контексті означає ділянку молекули, яка відповідає щонайменше за один з біохімічних або фізіологічних ефектів, що викликаються молекулою. У даній області добре відомо, що багато ферментів та інших ефекторних молекул володіють активною ділянкою, що відповідає за ефекти, які викликаються молекулою, що розглядається. Інші ділянки молекули можуть служити для цілей стабілізації або поліпшення розчинності, і тому їх можна видалити, якщо дані цілі не мають значення у контексті визначеного здійснення даного винаходу. Наприклад, в АРР або Ар можливим є застосування визначених цитокінів як груп, що модифікують (пор. докладну дискусію нижче), і в такому випадку проблема стабільності може бути несуттєвою, оскільки зв'язування з АРР або АД може забезпечувати необхідну стабільність.

Термін «ад'ювант» має те ж значення, яке є загальноприйнятим в області технології вакцин, тобто речовина або композиція речовин, яка 1) не здатна самостійно викликати специфічну імунну відповідь проти імуногена вакцини, але яка, 2) проте, здатна посилити імунну відповідь проти імуногена. Або, іншими словами, вакцинація одним ад'ювантом не забезпечує імунну відповідь проти імуногена, вакцинація імуногеном може або не може дати початок імунній відповіді проти імуногена, але комбінована вакцинація імуногеном і ад'ювантом викликає імунну відповідь на імуноген, яка є більш сильною, ніж викликана одним імуногеном. «Позиціонування або націлювання» молекули у даному контексті призначене для позначення ситуації, коли молекула при введенні тварині переважно з'являється у визначеній(их) тканині(ах) або переважно асоційована з визначеними клітинами або клітинними типами. Ефекту можна досягти рядом способів, включаючи формування молекули у композицію, що полегшує позиціонування, або введення у молекулу груп, які полегшують позиціонування. Дані проблеми детально обговорюються нижче. "Стимуляція імунної системи" означає, що речовина або композиція речовин виявляє спільний, неспецифічний імуностимулювальний ефект. Ряд ад'ювантів і передбачувані ад'юванти (такі як визначені цитокіни) володіють здатністю стимулювати імунну систему. Результат застосування імуностимулювальних засобів являє собою підвищену «готовність» імунної системи, що означає, що спільна або подальша імунізація імуногеном викликає значно більш ефективну імунну відповідь у порівнянні з окремим застосуванням імуногена. «Продуктивне зв'язування» означає зв'язування пептиду з молекулою МНС (класу І або ІІ), щоб було можливо стимулювати Т-клітини, які зв'язуються з клітинами, які презентують пептид, зв'язаний з молекулою МНС. Наприклад, пептид, зв'язаний з молекулою МНС класу І! на поверхні АРС, є продуктивно зв'язаним, якщо дана АРС стимулює Тн-клітини, що зв'язуються з комплексом презентований пептид-МНО класу І.

Переважні здійснення знижувальної регуляції амілоїду Переважно, щоб аналог, який застосовується як імуноген у способі відповідно до винаходу, являв собою модифіковану молекулу АРР або АД, де присутня щонайменше одна зміна в амінокислотній послідовності АРР або АД, оскільки у цьому випадку шанси одержання дуже значного порушення аутотолерантності сильно полегшені, що очевидно, наприклад, з результатів, представлених тут у прикладі 2, де імунізацію диким типом Ар порівнюють з імунізацією варіантною молекулою АД. Показано (У Ват І! еї аї., 1996, 9. Іттипої. 157: 4796-4804), що потенційно аутоїмунні В-лімфоцити, які розпізнають власні білки, фізіологічно присутні у нормальних індивідів. Однак для індукції цих В-лімфоцитів для фактичної продукції антитіл, що реагують з відповідними власними білками, необхідне сприяння Т-хелперних лімфоцитів (Тн-клітини, або Тн-лімфоцити), що продукують цитокіни. Звичайно така допомога не забезпечується, оскільки Т-лімфоцити, як правило, не розпізнають Т- клітинні епітопи, одержані з власних білків, коли вони представлені клітинами (АРС), що презентують антиген. Однак якщо забезпечити елемент "чужорідності" у власному білку (тобто ввести імунологічно значиму модифікацію), Т-клітини, які розпізнають чужорідний елемент, активуються при розпізнаванні чужорідного епітопу на АРС (передусім, такий, як мононуклеарна клітина). Поліклональні В-лімфоцити (що також є АРС), здатні до розпізнавання власних епітопів на модифікованих власних білках, також інтерналізують антиген і згодом представляють чужорідний) Т-епітоп(и) з нього, а активовані Т-лімфоцити таким аутоїмунним поліклональним В-лімфоцитам згодом забезпечують допомогу цитокінами. Оскільки антитіла, що продукуються даними поліклональними В-лімфоцитами, реагують з різними епітопами на модифікованому поліпептиді, включаючи ті, які також представлені на нативному поліпептиді, індукується антитіло, що перехресно реагує з немодифікованим власним білком. На закінчення, Т-лімфоцити можуть бути приведені в дію так, як якби популяція поліклональних В-лімфоцитів розпізнавала б повністю чужорідний антиген, тоді як фактично тільки вбудований(і) епітоп(и) є чужорідним(и) для хазяїна. Таким чином, індукуються антитіла, здатні до перехресної реакції з немодифікованими власними антигенами.

У даній області відомо декілька шляхів модифікації власного антигену пептиду для досягнення порушення аутотолерантності. Але все-таки переважно, щоб аналог відповідно до даного винаходу включав в себе - щонайменше одну першу введену групу, яка націлює модифіковану молекулу на клітину (АРС), що презентує антиген, і/або - щонайменше одну другу введену групу, яка стимулює імунну систему, і/або - щонайменше одну третю введену групу, яка оптимізує представлення аналога імунній системі.

Однак всі ці модифікації потрібно проводити поки в АРР або АВ зберігається істотна частина вихідних

В-клітинних епітопів, оскільки розпізнавання В-лімфоцитами нативної молекули таким чином посилюється.

В одному з переважних здійснень ковалентно або нековалентно введені бічні групи (у вигляді чужорідних Т-клітинних епітопів або вказаних вище першої, другої і третьої груп). Це означає, що відгалуження з амінокислотних залишків, одержані з АРР або Ар, дериватизовані без зміни первинної амінокислотної послідовності або щонайменше без внесення змін у пептидних зв'язках між індивідуальними амінокислотами у ланцюгу.

В альтернативному і переважному здійсненні застосовують амінокислотну заміну і/або делецію, і/або вставку, і/або додавання (які можна провести за допомогою рекомбінантних способів або за допомогою пептидного синтезу; модифікації що включають в себе більш довгі ділянки з амінокислот, можуть приводити до утворення гібридних поліпептидів). Одну з особливо переважних версій даного здійснення являє собою технологія, описана у М/О 95/058491|, де описаний спосіб знижувальної регуляції власних білків шляхом імунізації аналогами власних білків, де ділянка амінокислотної послідовності (ряд послідовностей) замінена відповідною ділянкою амінокислотної послідовності(ей), кожна з яких містить чужорідний імунодомінантний Т-клітинний епітоп, тоді як одночасно в аналогу зберігається повна третинна структура власного білка. Однак для цілей даного винаходу істотно, якщо модифікація (чи то вона є вставкою, додаванням, делецією або заміною) приводить до утворення чужорідного Т-клітинного епітопу і одночасно зберігає значну кількість В-клітинних епітопів в АРР або АД. Однак для одержання максимальної ефективності в індукції імунної відповіді переважно, щоб у модифікованій молекулі зберігалася повна третинна структура АРР або АВ.

У деяких випадках переважно, щоб АРР або Ар, або їх фрагменти були мутантними. Особливо переважними є варіанти замін, де метіонін у положенні 35 в Ар-43 заміщений, переважно лізином або ізолейцином або просто делетований. Особливо переважні аналоги містять один-єдиний метіонін, розташований на С-кінці, або тому, що він зустрічається в амілоїдогенному поліпептиді або чужорідному Тн- епітопі від природи, або тому, що його туди вставили або додали. Отже, також переважно, щоб ділянка аналога, яка включає Тн-епітоп, також не містила метіоніну, виключаючи можливе С-кінцеве розташування метіоніну.

Основна причина для видалення всіх метіонінів, крім одного, полягає у тому, що стає можливим рекомбінантно одержувати полімерні аналоги, які можна послідовно відщеплювати бромціаном з виходом окремого аналога. Перевага полягає у тому, що рекомбінантна продукція полегшує даний шлях.

Фактично, як правило, переважно, щоб всі аналоги АРР або Ар, які застосовуються відповідно до даного винаходу, володіли характерною рисою простого включення в себе одного-єдиного метіоніну, розташованого в аналогу як С-кінцева амінокислота, і щоб всі інші метіоніни або в амілоїдогенному поліпептиді, або у чужорідному Тн-епітопі були видалені або заміщені іншою амінокислотою.

Додаткова цікава мутація являє собою делецію або заміщення фенілаланіну у положенні 19 Ар-43, а особливо переважно, щоб мутація являла собою заміну фенілаланінового залишку на пролін.

Інші цікаві поліамінокислоти для застосування в аналогах являють собою укорочені частини білка Ар- 43. їх можна застосовувати в імуногенних аналогах відповідно до даного винаходу. Особливо переважними є укорочені частини АД (1-42), АД (1-40), АД (1-39), АД (1-35), АД (1-34), Ар (1-28), Ар (1-12), А (1-5), АД (13- 28), АД (13-35), Ар (17-28), АВ (25-35), Ар (35-40), Ар (36-42) і Ар (35-42) (де числа у дужках означають відрізки амінокислот Ар -43, які складають відповідний фрагмент: наприклад, Ар (35-40) ідентичний амінокислотам 706-711 в БЕО ІЮ МО:2). Всі ці варіанти з укороченими частинами Ар-43 можна одержати з описаними тут фрагментами АД, конкретно з варіантами 9, 10, 11, 12, і 13, вказаними у прикладі 1.

Наступна формула описує молекулярні конструкції, що відносяться до винаходу: (МООБ))5і(амілоїдет)н(МОЮ»)зг(амілоїдег) по... () (МОВх»х)«хамілоїдех) пх де амілоїдеї - амілоїдех являють собою х В-клітинний епітоп, що містить підпослідовності АРР або Ар, які незалежно є ідентичними або неідентичними, і які можуть містити чужорідні бічні групи, х являє собою число 23, пі-пх являють собою х чисел 20 (щонайменше, одне х1), МО0БІ-МОЮОх являють собою х модифікацій, внесених між представленими В-клітинними епітопами, і 51-5х являють собою х чисел 20 (щонайменше одне»1!, якщо у послідовності амілоїдех не внесена жодна бічна група). Таким чином, враховуючи загальні функціональні обмеження на імуногенність конструкції, винахід допускає всі види перестановок оригінальної послідовності АРР або Ар і всі види модифікацій у ній. Таким чином, у винахід включені модифікований АРР або АД, одержані за допомогою пропускання частин послідовності, які, наприклад, виявляють іп мімо несприятливі ефекти, або пропускання частин, які звичайно є внутрішньоклітинними і, таким чином, можуть дати початок небажаним імунологічним реакціям.

Одна переважна версія конструкцій, окреслених вище, коли застосовна, являє собою конструкції, де підпослідовність, що містить В-клітинний епітоп амілоїдного білка, не експонована екстрацелюлярно у попередньому поліпептиді, з якого одержаний амілоїд. Такий вибір епітопів служить гарантією того, що не утворяться антитіла, які могли б реагувати з клітинами, що продукують попередник, і отже, імунна відповідь, що виробляється, стає обмежено направленою імунною відповіддю проти небажаних накопичень амілоїду.

Наприклад, у цьому випадку можна індукувати імунітет проти епітопів АРР або АД, експонованих в екстрацелюлярну фазу, тільки коли вони вільні від будь-якого зв'язку з клітинами, що їх продукують.

Збереження істотної частини В-клітинних епітопів або навіть всієї третинної структури білка, що піддається модифікації, як тут бажано, можна досягти декількома шляхами. Один з них являє собою просте одержання поліклональної антисироватки, направленої проти поліпептиду, що розглядається (наприклад, антисироватка, одержана від кролика), і застосування даної антисироватки згодом як тестового реагенту (наприклад, конкурентної ЕГІ5А) проти одержаних модифікованих білків. Модифіковані версії (аналоги), які реагують з антисироваткою у тому ж об'ємі, що і АРР або АД необхідно розглядати як такі, що володіють повністю однаковою третинною структурою, що і АРР або АД, тоді як аналоги, які виявляють обмежену (але все ще значну і специфічну) реактивність з такою антисироваткою розглядають як такі, що зберегли істотну частину вихідних В-клітинних епітопів.

Альтернативно, можна провести відбір моноклональних антитіл, що реагують з різними епітопами на

АРР або АД, і використати їх як тестову панель. Даний підхід має перевагу, що дозволяє 1) картування епітопів АРР або Ар і 2) картування епітопів, збережених в одержаних аналогах.

Звичайно, у третьому наближенні слід би визначити З-вимірну структуру АРР або АД, або їх біологічно активного укороченого продукту (пор. вище) і порівняти їх з визначеною тривимірною структурою одержаних аналогів. Тривимірну структуру можна розрізнити за допомогою вивчення дифракції рентгенівських променів і ЯМР-спектроскопії. Додаткову інформацію відносно третинної структури до деякої міри можна одержати при вивченні циркулярного дихроїзму, який має ту перевагу, що єдино необхідним для одержання корисної інформації про третинну структуру даної молекули є очищений поліпептид (тоді як при дифракції рентгенівських променів необхідно забезпечити кристалізований поліпептид, а для ЯМР необхідно забезпечити ізотопні варіанти поліпептиду). Однак зрештою дифракція рентгенівських променів і

ЯМР необхідні для одержання переконливих даних, оскільки циркулярний дихроїзм може надати тільки непрямі докази коректності З-вимірної структури за допомогою інформації про елементи вторинної структури.

В одному з переважних здійснень винаходу застосовують множинні представлення В-лімфоцитарних епітопів АРР або Ар (наприклад, формула |, де щонайменше один В-клітинний епітоп представлений у двох положеннях). Даного ефекту можна досягти різними шляхами, наприклад, шляхом простого одержання гібридних поліпептидів, що містять структуру (одержаний з АРР або АД поліпептид)т, де т являє собою число 22, і потім ввести модифікації, які обговорюються тут, щонайменше в одну з послідовностей АРР або

АД. Переважно, щоб модифікації, які вводяться, включали в себе щонайменше одну дуплікацію епітопу В- лімфоциту і/або введення гаптену. Дані здійснення, включаючи множинні представлення вибраних епітопів, особливо переважні у ситуаціях, де як компоненти засобів для вакцин придатні просто невеликі частини

АРР або АД.

Як вказано вище, введення чужорідного Т-клітинного епітопу можна досягти щонайменше вставкою, додаванням, делецією або заміною однієї амінокислоти. Зрозуміло, у звичайній ситуації відбувається введення більш ніж однієї зміни в амінокислотну послідовність (наприклад, вставка або заміна цілого Т- клітинного епітопу), але важливою метою для досягнення є те, що аналог при процесуванні клітиною (АРС), яка представляє антиген, дасть початок такому чужорідному імунодомінантному Т-клітинному епітопу, представленому у зв'язку з молекулою МНС класу ІІ на поверхні АРС. Таким чином, якщо амінокислотна послідовність АРР або Ар у відповідних положеннях містить ряд амінокислотних залишків, які можна виявити у чужорідному Тн-епітопі, тоді введення чужорідного Тн-епітопу може бути досягнуте шляхом забезпечення амінокислот, що залишилися, чужорідного епітопу за допомогою вставки, додавання, делеції або заміни амінокислот. Іншими словами, введення повного Тн-епітопу за допомогою вставки або заміни для задоволення цілей даного винаходу не є необхідним.

Переважно, щоб число вставок, делецій, замін або додавань амінокислот являло собою щонайменше 2, наприклад, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, і 25 вставок, замін, додавань або делецій. Крім того, переважно, щоб число вставок, замін додавань або делецій амінокислот не перевищувало 150, наприклад, не більше 100, не більше 90, не більше 80 і не більше 70. Особливо переважно, щоб число замін, вставок, делецій або додавань не перевищувало 60, і зокрема, дане число не повинно перевищувати 50 або навіть 40. Найбільш переважно число не перевершує 30. По відношенню до додавань амінокислот необхідно відмітити, що коли одержувана конструкція знаходиться у формі гібридного поліпептиду, їх часто значно більше ніж 150.

Переважні здійснення даного винаходу включають в себе модифікацію за допомогою введення щонайменше одного чужорідного імунодомінантного Т-клітинного епітопу. Необхідно зрозуміти, що питання про імунодомінантність Т-клітинного епітопу залежить від виду тварини, що розглядається. Тут термін "Імунодомінування" буквально відноситься до епітопів, які у вакцинованих індивідів/популяції дають початок значній імунній відповіді, але добре відомим фактом є те, що Т-клітинний епітоп, який є імунодомінантним у одного індивіда/популяції не обов'язково є імунодомінантним у іншого індивіда того ж виду, навіть незважаючи на те, що він здатний до зв'язування з молекулами МНО-ЇЇ у останнього індивіда. Звідси для цілей даного винаходу імунодомінантний Т-клітинний епітоп являє собою Т-клітинний епітоп, який, коли представлений в антигені, ефективно забезпечить допомогу Т-клітин. Звичайно імунодомінантні Т-клітинні епітопи володіють такою природною здатністю, що вони по суті завжди представлені зв'язаними з молекулами МН класу ІІ, незалежно від поліпептиду, в якому вони знаходяться.

Іншим важливим питанням є проблема рестрикції МНС Т-клітинних епітопів. Як правило, природні Т- клітинні епітопи рестриційовані по МНС, тобто визначені пептиди, що складають Т-клітинний епітоп, будуть ефективно зв'язуватися тільки з підмножиною молекул МНС класу ІІ. Це, у свою чергу, має той ефект, що у більшості випадків застосування одного специфічного Т-клітинного епітопу приведе до компонента вакцини, ефективного тільки для частини популяції, і, в залежності від розміру цієї частини, може виявитися необхідним включати більше Т-клітинних епітопів в одну і ту ж молекулу або, альтернативно, готувати багатокомпонентну вакцину, де компоненти являють собою варіанти АРР або АД, відмінні один від одного природою введеного Т-клітинного епітопу.

Якщо МНеО-рестрикція Т-клітин, що застосовуються, невідома (наприклад, у ситуації, коли тварина, що вакцинується, володіє погано визначеним складом МНС), частину популяції, що охоплюється конкретною композицією вакцини, можна апроксимувати за допомогою наступної формули: п

Іпопул -1- ПО - рі) (1) і-1 де рі являє собою частоту реагуючих у популяції на і-ий чужорідний Т-клітинний епітоп, представлений у композиції вакцини, а п являє собою загальне число чужорідних Т-клітинних епітетів. Таким чином, композиція вакцини, що містить З чужорідних Т-клітинних епітопи, які володіють частотами відповіді у популяції у розмірі 0,8, 0,7 і 0,6, відповідно, повинна дати

1-0,2х0,3х0,4-0,976, тобто у 97,6 процентів популяції статистично буде підвищуватися опосередкована МНО-1І відповідь на вакцину.

Формулу вище не застосовують у ситуаціях, де більш або менш точно відомий профіль МНО-рестрикції пептидів, що застосовуються. Якщо, наприклад, визначений пептид зв'язується тільки з молекулами МНО-1Ї людини, що кодуються алелями ЮОКІ, ЮОКЗ, ОМ5 і ОК7 НГА-ОК, тоді застосування даного пептиду разом з іншим пептидом, що зв'язується з молекулами МНО-ЇІЇ, що залишилися, які кодуються алелями НІГ А-ОВ, завершить 10095 охоплення у популяції, що розглядається. Подібним чином, якщо другий пептид зв'язується тільки з ОЗ і ОК5, додавання даного пептиду абсолютно не збільшить охоплення. Якщо базувати розрахунок відповіді популяції тільки на МНСО-рестрикції Т-клітинних епітопів у вакцині, мінімальну частину популяції що охоплюється конкретною композицією вакцини, можна визначити за допомогою наступної формули:

З іпопул-1- Пр (т) - де Фі являє собою суму частот алельних гаплотипів, що кодуються молекулами МНС, які зв'язують будь-який з Т-клітинних епітопів у вакцині і належать |ї-ому з З відомих локусів НА (ОР, ОК і 0О) у популяції; на практиці спочатку визначають, які молекули МНС розпізнають кожний Т-клітинний епітоп у вакцині, а потім їх сортують за типом (ОР, ОК і 09); далі для кожного типу підсумовують індивідуальні частоти різних відсортованих алельних гаплотипів, таким чином, одержуючи (Фі, фг і Фз.

Може трапитися, що значення р; у формулі ІІ перевищить відповідне теоретичному значенню лі

З т -1- ПМ (М) і-й де у; являє собою суму частот алельного гаплотипу, що кодується молекулами МН, які зв'язують і-ий

Т-клітинний епітоп у вакцині і належать )-ому з З відомих локусів НГА (ОР, ОК і БО) у популяції. Це означає, що в 1-лі популяції частота відповідаючих складає Ізалишкова І:(рі-лі/(1-лі). Таким чином, формулу ЇЇ можна перетворити так, щоб одержати формулу М:

З п

Іпопул -1- по -ФіЇ тщ1- по -Валишова 1) (М) і-й і-й де член Ббалишкова ії ВСТановлюють в нуль, якщо він є негативним. Необхідно зазначити, що формула М вимагає, щоб все епітопи були картованими за ідентичними наборами гаплотипів.

Отже, при виборі Т-клітинних епітопів для введення в аналог важливо враховувати всю доступну інформацію про епітопи: 1) частоту відповідаючих у популяції на кожний епітоп, 2) дані про МНО-рестрикції і 3) частоту відповідних гаплотипів у популяції.

Існує ряд природних "змішаних" Т-клітинних епітопів, активних у великої частини індивідів виду тварин або популяції тварин, і їх переважно вводити у вакцину, таким чином зменшуючи необхідність великого числа різних аналогів в одній вакцині.

Змішаний епітоп відповідно до винаходу може являти собою природний Т-клітинний епітоп людини, такий як епітопи з анатоксину правця (наприклад, епітопи Р2 і РЗО), анатоксину дифтерії, гемаглютиніну вірусу грипу (НА) і С5-антигену Р. ГаІсірагат.

Протягом декількох років ідентифікували ряд інших змішаних Т-клітинних епітопів. Головним чином ідентифікували пептиди, здатні до зв'язування з великою частиною молекул НІ А-ОК, що кодуються різними алелями НІГА-ОК, і вони всі є Т-клітинними епітопами, допустимими для введення в аналоги, що застосовуються відповідно до даного винаходу. Пор. також епітопи, що розглядаються у наступних посиланнях, які, таким чином, всі включені сюди за допомогою посилання: (МО 98/23635 (Ргаег І.Н. еї аї., переданий Тпе Опімег5йу ої Оцеепзіапа); Бош пмооа 5. еї. а!., 1998, 9. Іттипої. 160: 3363-3373; біпідадіїа Р. еї аі., 1988, Майшиге 336: 778-780; Спісл: В.М. еї а!., 1993, 9. Ехр. Мей. 178: 27-47; Наттег" .. еї аї., 1993, Сеї 74: 197-203; апа гаїк К. еї аї., 1994, Іттиподепеїййсв 39: 230-242). Останнє посилання також стосується лігандів НГА-0О і ОР. Всі епітопи, перераховані у даних 5 посиланнях, є придатними як природні епітопи- кандидати для застосування відповідно до даного винаходу як епітопів, що розділяють спільні з ними мотиви.

Альтернативно, епітоп може являти собою будь-який штучний Т-клітинний епітоп, здатний зв'язуватися з великою частиною молекул МНС класу ІІ. У даному контексті пептиди, що являють собою спільні епітопи для всіх ОК ("РАОКЕ"), описані у (М/О 95/07707 та у відповідній статті АІехападег У. еї а!., 1994, Іттипку 1: 751-761 (обидва описи включені сюди за допомогою посилання)|, являють собою цікаві кандидати для епітопів для застосування відповідно до даного винаходу. Необхідно зазначити, що найбільш ефективні пептиди РАОКЕ, описані у даних документах, несуть Ю-амінокислоти на С- і М-кінцях для збільшення стабільності при введенні. Однак у даному винаході головним чином прагнуть до введення відповідних епітопів як частини аналога, який згодом ферментативно руйнується всередині лізосомного компартмента

АРС, щоб дозволити подальшу презентацію у зв'язку з молекулою МНО-1ІЇ, і отже, введення ЮО-амінокислот в епітопи, що застосовуються відповідно до винаходу, є недоцільним.

Один з особливо переважних пептидів РАОКЕ являє собою пептид, що має амінокислотну послідовність АКЕМААУМТІКААА (5ЕО ІО МО:17) або її імунологічно ефективну підпослідовність Даний та інші епітопи, що володіють такою ж відсутністю МНС -рестрикції, являють собою переважні Т-клітинні епітопи, які повинні бути присутніми в аналогах, що застосовуються у способі відповідно до винаходу. Такий понадзмішаний епітоп є припустимим для більшості простих здійснень винаходу, де вакцинованій імунній системі тварини представлений тільки один-єдиний аналог.

Як вказано вище, модифікація АРР або АД може також включати в себе введення першої групи, що націлює модифікований амілоїдогенний поліпептид на АРС або В-лімфоцит. Наприклад, перша група може являти собою партнер, що специфічно зв'язується, для специфічного антигену поверхні В-лімфоциту або для специфічного антигену поверхні АРС. У даній області відомо багато таких поверхнево-специфічних антигенів. Наприклад, група може являти собою вуглевод, для якого існує рецептор на В-лімфоциті або

АРС (наприклад, манан або маноза). Альтернативно, друга група може являти собою гаптен. Також як першу групу можна застосовувати фрагмент антитіла, що специфічно розпізнає поверхневу молекулу на

АРС або лімфоцитах (наприклад, поверхнева молекула може являти собою рецептор ЕСу макрофагів або моноцитів, такий як Есукі, або, альтернативно, будь-який інший поверхнево-специфічний маркер, такий як

СО40 або СТІ А-4). Необхідно зазначити, що всі ці приведені для прикладу молекули також можна застосовувати як частину ад'юванта, порівняння нижче.

Як альтернативу або додатково для націлювання аналога на визначений тип клітин для досягнення посиленої імунної відповіді можна збільшити рівень реактивності імунної системи за допомогою включення вказаної вище другої групи, яка стимулює імунну систему. Типові приклади таких других груп являють собою цитокіни і білки теплового шоку або молекули шаперонів, а також їх ефективні частини.

Придатні для застосування відповідно до даного винаходу цитокіни являють собою цитокіни, які будуть також нормально функціонувати у композиції вакцини як ад'юванти, тобто наприклад, інтерферон у (ІЕМ-у), інтерлейкін 1 (І--1), інтерлейкін 2 (І--2), інтерлейкін 4 (1--4), інтерлейкін 6 (1--6), інтерлейкін 12 (1-12), інтерлейкін 13 (І--13), інтерлейкін 15 (І--15) і гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулуючий фактор (СМ-С5РЕ); альтернативно, як другої групи може вистачити функціональної частини молекули цитокіну. Що стосується застосування таких цитокінів як засобів для ад'ювантів, порівняйте обговорення нижче.

Придатні відповідно до даного винаходу білки теплового шоку або молекулярні шаперони, що застосовуються як друга група, можуть являти собою НОР7О, Н5РО0, НЬСТО, СЕРОА |також відомий як 9р9об, пор. Ууеагзсп РА еї а. 1998, Віоспетівігу 37: 5709-19) і СКТ (калретикулін).

Альтернативно, друга група може являти собою токсин, такий як лістеріолізин (ГО), ліпід А і термолабільний ентеротоксин. Цікаві можливості також пов'язані з мікобактеріальними похідними, такими як МОР (мурамілдипептид), СЕРА (повний ад'ювант Фрейнду) і складні ефіри трегалози ТОМ і ТОБ.

Важливе здійснення даного винаходу являє собою також можливість введення третьої групи, що посилює презентацію аналога імунній системі. У даній області показано декілька прикладів даного принципу. Наприклад, відомо, що якір ліпоїлювання пальмітиновою кислотою у білку О5рА у Вогтеїїа ригддогегі можна застосовувати так, що надаються поліпептиди, які самі по собі є ад'ювантами (пор., наприклад, УУО 96/40718) - здається, що ліпоільовані білюи формують структури, подібні міцелам, з ядром, що складається з частин якорів ліполювання поліпептидів, а частини молекули, що залишилися, які виступають звідти, приводять до множинної презентації антигенних детермінант. Отже, застосування таких подібних підходів, пов'язаних із застосуванням різних якорів ліпоїлювання (наприклад, міристилової групи, фарнезилової групи, гераніл-геранілової групи, ОРіІ-якоря і М-ацилдигліцеридної групи), являє собою переважні здійснення даного винаходу, оскільки, як правило, забезпечення таких якорів ліпоїлювання в одержаному рекомбінантним способом білку є досить простим і лише потребує у випадку аналога застосування, наприклад, природної сигнальної послідовності як партнера злиття. Інша можливість являє собою застосування фрагмента Сза фактора СЗ комплементу або самого фактора СЗ (пор. Оетрзеу еї аї., 1996, 5сіеєпсе 271, 348-350 апа І оси 5 Копіег, 1998, Маште Віоїесппоіоду 16, 458-462.

Альтернативне здійснення винаходу, яке також приводить до переважної презентації імунній системі множинних (наприклад, щонайменше 2) копій важливих ділянок АРР або АД з епітопами, являє собою ковалентне зв'язування аналога з визначеними молекулами, тобто варіанти 4 і є, вказані вище. Наприклад, можна застосовувати полімери, наприклад, вуглеводи, такі як декстрин, (пор., наприклад, І ее5 А еї аї., 1994, Массіпе 12: 1160-1166; І еез А еї аї., 1990, 9 Іттипої. 145: 3594-3600), але маноза і манан також являють собою придатні альтернативи. Інтегральні мембранні білки, наприклад, з Е. соїЇ та інших бактерій, також є придатними для кон'югації партнерами. Традиційні молекули-носії, такі як гемоціанін морського блюдця (КІН), анатоксин правця, дифтерійний анатоксин і бичачий сироватковий альбумін (В5А) також є переважними і придатними для кон'югації партнерів.

Переважні здійснення ковалентного зв'язування речовини, одержаної з АРР або АД, з полігідроксиполімерами, такими як вуглеводи, включають в себе застосування щонайменше одного пептиду, одержаного з АРР або Ар, і щонайменше одного чужорідного Т-хелперного епітопу, які роздільно зв'язуються з полігідроксиполімером (тобто чужорідний Т-хелперний епітоп і одержана з АРР або АД амінокислотна послідовність не зливаються один з одним, але значною мірою зв'язуються з полігідроксиполімером, який служить як несучий каркас). З іншого боку, найбільш переважним є таке здійснення, коли відповідні ділянки одержаних з АРР або Ар пептидів, що несуть В-клітинний епітоп, складені за допомогою коротких відрізків пептидів, тому що даний підхід являє собою дуже зручний шлях для досягнення множинної презентації вибраних епітопів у кінцевому імуногені. Однак можна також просто зв'язувати аналоги, вже описані тут, з полігідроксиполімерним кістяком, тобто щоб речовина, одержана з

АРР або АД, не з'єднувалася з кістяком окремо від чужорідних Тн-епітопів.

Особливо переважно, щоб зв'язування чужорідного Т-хелперного епітопу і одержаного з АРР або Ар (полізупептиду відбувалося за допомогою амідного зв'язку, який можна розщепити пептидазою. Дана стратегія має той ефект, що АРС зможуть захоплювати кон'югат і згодом здійснювати презентацію чужорідного Т-клітинного епітопу у зв'язку з МНС класу ІІ.

Одним із шляхів досягнення зв'язування пептидів (і одержаних з АРР або Ар пептидів, що представляють інтерес, також як і чужорідного епітопу) є активація відповідного полігідроксиполімеру трезильними (трифторетилсульфонільними) групами або іншими відповідними активуючими групами,

такими як малеїімід, пара-нітрофенілхлороформ (для активації ОН-груп і формування пептидного зв'язку між пептидом і полігідроксиполімером) і тозил (пара-толуолсульфоніл). Наприклад, можна одержати активовані полісахариди, як описано у (МУО 00/05316 і 05 5874469 (обидва включені сюди за допомогою посилання))| і зв'язати їх з пептидами або поліамінокислотами, одержаними з АРР або АД, а також з Т-клітинними епітопами, одержаними за допомогою стандартних способів пептидного синтезу у рідкій або твердій фазі.

Одержаний продукт складається з полігідроксиполімерного кістяка (наприклад, декстранового кістяка), який своїми М-кінцями або іншими азотними групами зв'язаний з поліамінокислотами, одержаними з АРР або Ар і з чужорідних Т-клітинних епітопів. Якщо бажано, можна синтезувати пептиди АРР або АД так, щоб захистити всі доступні аміногрупи, крім однієї на М-кінці, згодом зв'язуючи одержані захищені пептиди з трезильованими групами декстрану і, на закінчення, знімаючи захист з одержаного кон'югата. Конкретний приклад такого підходу описаний у прикладах нижче.

Замість застосування водорозчинних молекул полісахариду, як викладено у МУМО 00/05316 і 05 5874469), в рівній мірі можна застосовувати молекули перехреснозв'язаних полісахаридів, одержуючи, таким чином, корпускулярні кон'югати між поліпептидами і полісахаридами, що, як вважають, веде до поліпшеної презентації поліпептидів імунній системі, оскільки досягаються дві мети, а саме: одержання ефекту локального накопичення при ін'єкції кон'югата і одержання частинок, що є більш привабливими мішенями для АРС. Даний підхід з використанням таких систем також детально розглядається у прикладах.

Міркування, що лежать в основі вибору ділянок для введення модифікацій в АРР або АД, мають на увазі а) збереження відомих і передбачених В-клітинних епітопів, Б) збереження третинної структури, с) уникнення презентації В-клітинних епітопів на "клітинах-продуцентах" і т.п. Принаймні, як обговорювалося вище, скринінг набору аналогів, всі з яких були піддані внесенню Т-клітинного епітопу у різні положення, є досить простим.

Оскільки найбільш переважні здійснення даного винаходу включають в себе знижувальну регуляцію Ар людини, отже, переважно, щоб поліпептид АРР або АД, що обговорюється вище, являв собою поліпептид

АД людини. У даному здійсненні особливо переважно, щоб поліпептиди АРР або АД були модифікованими шляхом заміни щонайменше однієї амінокислотної послідовності в ЗХЕО ІЮ МО:2, однією амінокислотною послідовністю з еквівалентною або відмінною довжиною, що містить чужорідний Тн-епітоп. Переважні приклади модифікованих амілоїдогенних АРР і Ар схематично показані на фігурі 1, із застосуванням як прикладів епітопів Р2 і РЗО. Логічне обгрунтування таких конструкцій детально обговорюється у прикладах.

Більш конкретно, амінокислотну послідовність, що містить Тн, яку вносять в 5ЕО ІЮ МО:2, можна вносити з будь-якої амінокислоти в ЗЕО ІЮ МО:2. Тобто внесення можливе після будь-якої з амінокислот у положеннях 1-770, але переважно після будь-якої з амінокислот у положеннях 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 і 714 в ЗЕО ІО МО:2. Це можна комбінувати з делецією будь-якої або всіх з амінокислот у положеннях 1-671 або будь-якою або всіх з амінокислот у положеннях 715-770. Крім того, при застосуванні способу заміни будь-яку з амінокислот у положеннях 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 і 714 у ЗЕО ІЮ МО:2 можна видалити разом з даним внесенням.

Інше здійснення даного винаходу пов'язане з представленням аналогів, що не містять жодної з підпослідовностей 5ЕО ІЮ МО:2, які продуктивно зв'язуються з молекулами МНС класу Ії, ініціюючи Т- клітинну відповідь.

Логічне обгрунтування такої стратегії для конструювання імуногена, що залучає імунну систему до індукції, наприклад, імунної відповіді проти Ар, полягає у наступному: зазначено, що при імунізації численними аутологічними білками, такими як АД, складеними з ад'ювантом, які досить сильні для порушення толерантності організму до аутологічних білків, існує небезпека, що у тих же вакцинованих індивідів індукована імунна відповідь не зможе припинитися просто внаслідок припинення імунізації. Це відбувається тому, що індукована імунна відповідь у таких індивідів найбільш ймовірно приводить у рух нативний Тн-епітоп аутологічного білка, а це має той несприятливий ефект, що власний білок вакцинованого індивіда буде здатний функціонувати як імуноген: таким чином, встановиться аутоїмунний стан.

У переважних способах, включаючи застосування чужорідних Тн-епітопів, що є кращими за відомостями авторів даного винаходу, ніколи не спостерігали одержання даного ефекту, оскільки імунна відповідь проти «свого» направляється чужорідним Тн-епітопом, а автори даного винаходу неодноразово показували, що індукована імунна відповідь, викликана шляхом застосування переважної технології, дійсно зменшувалася після припинення імунізації. Однак в теорії у небагатьох індивідів може статися так, що імунна відповідь також буде направлятися аутологічним Тн-епітопом відповідного власного білка, проти якого імунізували, що особливо значимо, коли розглядають власні білки, які є відносно численними, такими як АД, тоді як інші терапевтично значимі власні білки присутні в організмі тільки локально або у таких малих кількостях, що "ефект самоімунізації" неможливий. Одним з дуже простих шляхів уникнути цього є, отже, цілковита відмова від включення в імуноген пептидних послідовностей, які можуть служити як Тн-епітопи (і оскільки пептиди коротше приблизно 9 амінокислот не можуть служити Тн-епітопами, використання більш коротких фрагментів є одним з простих і прийнятних підходів). Отже, дане здійснення винаходу також служить для того, щоб переконатися, що імуноген не включає в себе пептидні послідовності цільових АРР або Ар, які можуть служити як "самостимулювальні Тн-епітопи", включаючи послідовності, які просто містять консервативні заміни у послідовності цільового білка, який інакше може функціонувати як Тн-епітоп.

Переважні здійснення презентації імунній системі аналогів АРР або АД включають в себе застосування химерного пептиду, який містить щонайменше один одержаний з АРР або АД пептид, що продуктивно не зв'язується з молекулами МНС класу ІІ, і щонайменше один чужорідний Т-хелперний епітоп. Більш того переважно, щоб одержаний з АРР або АД пептид ніс В-клітинний епітоп. Особливо переважно, якщо імуногенний аналог являє собою аналог, де амінокислотні послідовності включають в себе один або декілька В-клітинних епітопів, представлених або як безперервна послідовність, або як послідовність, що містить вставки, де вставки включають в себе чужорідні Т-хелперні епітопи.

З іншого боку, найбільш переважним є таке здійснення, коли відповідні ділянки, одержані з пептидів

АРР або АД, які несуть В-клітинний епітоп, складені за допомогою коротких пептидних відрізків, які ніяк не здатні продуктивно зв'язатися з молекулою МНС класу ІІ. Вибраний В-клітинний епітоп або епітопи амілоїдогенного поліпептиду повинні, отже, включати в себе не більше 9 послідовних амінокислот ЗЕО ІЮ

МО:2. Переважними є більш короткі пептиди, такі як пептиди, що мають не більше 8, 7, 6, 5, 4 або З послідовних амінокислот амінокислотної послідовності амілоїдогенного поліпептиду.

Переважно, щоб аналог включав в себе щонайменше одну підпослідовність ЗЕО ІЮ МО:2, так, щоб кожна з таких щонайменше однієї підпослідовностей незалежно складалася з амінокислотних відрізків АРР або АД, вибраних з групи, яка складається з 9 послідовних амінокислот, 8 послідовних амінокислот, 7 послідовних амінокислот, 6 послідовних амінокислот, 5 послідовних амінокислот, 4 послідовних амінокислот і З послідовних амінокислот.

Особливо переважно, щоб послідовні амінокислоти починалися з амінокислотного залишку, вибраного з групи, що складається із залишків 672, 673, 674, 675, 676,677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710,711, 712, 713 1 714 БЕО І МОС2.

Вакцинація білком/пептидом; препарати і введення аналогів

Коли здійснюють презентацію аналога імунній системі тварини за допомогою його введення тварині, препарати поліпептиду відповідають вимогам, загальноприйнятим у даній області.

Одержання вакцин, що містять як активні інгредієнти послідовності пептидів, у загальних рисах добре розроблені у даній області, як проілюстровано (патентами США 4608251, 4601903, 4599231, 4599230, 4596792 і 4578770, які всі включені сюди за допомогою посилання). Звичайно такі вакцини одержують як препарати для ін'єкцій або як рідкі розчини або суспензії; також можна одержати тверді форми, придатні для розчинення або суспендування у рідині перед ін'єкцією. Препарати також можна емульгувати. Активний імуногенний інгредієнт часто змішують з наповнювачами, що є фармацевтично допустимими і сумісними з активним інгредієнтом. Відповідні наповнювачі являють собою, наприклад, воду, фізіологічний розчин, декстрозу, гліцерин, етанол і т.п., та їх комбінації. Крім того, якщо бажано, вакцина може містити незначні кількості допоміжних речовин, таких як зволожувачі або емульгатори, буферні засоби для стабілізації рН або ад'юванти, що збільшують ефективність вакцин; пор. докладне обговорення ад'ювантів нижче.

Звичайно вакцини вводять парентерально, за допомогою ін'єкції наприклад, або підшкірно, або внутрішньовенно, або внутрішньом'язово. Додаткові препарати, які є придатними для інших способів введення, включають в себе супозиторії і, в деяких випадках, оральні, букальні, сублінгвальні, інтраперитонеальні, інтравагінальні, анальні, епідуральні, спінальні та інтракраніальні препарати. Для супозиторіїв стандартні в'яжучі засоби і носії можуть включати в себе, наприклад, поліалкіленгліколі або тригліцериди; такі супозиторії можна формувати з сумішей, що містять активний інгредієнт у діапазоні від 0,595 до 1095, переважно - 1-295. Оральні препарати включають в себе такі звичайно застосовувані наповнювачі як, наприклад, маніт, лактозу, крохмаль, стеарат магнію, сахаринат натрію, целюлозу, карбонат магнію фармацевтичних ступенів очищення і т.п. Дані композиції приймають форми розчинів, суспензій, таблеток, пілюль, капсул, препаратів з уповільненим вивільненням або порошків і містять 10-9595 активного інгредієнта, переважно - 20-7095. Для оральних препаратів відповідним компонентом для складання композиції (і також можливим компонентом для кон'югації) є холерний токсин.

Поліпептиди можна формувати у вакцини у вигляді нейтральних форм або у вигляді солей.

Фармацевтично допустимі солі включають в себе кислі адитивні солі (що утворюються з вільними аміногрупами пептиду) і ті солі, які утворюються з неорганічними кислотами, такими, наприклад, як соляна або фосфорна кислоти, або з такими органічними солями як оцтова, щавлева, винна, мигдалева і т.п. Солі, що утворюються з вільними карбоксильними групами, також можна одержати за допомогою неорганічних основ, наприклад, таких як гідроксиди натрію, калію, амонію, кальцію або заліза, і таких органічних основ як ізопропіламін, триметиламін, 2-етиламіноетанол, гістидин, прокаїн і т.п.

Вакцини вводять способом, сумісним з дозуванням препарату, і в такій кількості, яка терапевтично ефективна та імуногенна. Кількість для введення залежить від суб'єкта, який підлягає лікуванню, включаючи, наприклад, здатність імунної системи індивіда встановлювати імунну відповідь і ступінь необхідного захисту. Відповідні діапазони дозування знаходяться у межах приблизно декількох сотень мікрограмів активного інгредієнта на вакцинацію, з переважним діапазоном приблизно від 0,1мкг до 2000мкг (хоча розглядають і великі кількості у діапазоні 1-10мг), наприклад у діапазоні приблизно від 0,5мкг до 100Омкг, переважно у діапазоні від їмкг до 50Омкг і, особливо у діапазоні приблизно від 10мкг до 10Омкг.

Відповідні режими для початкового введення і підтримуючих доз також варіюють, але визначаються початковим введенням з подальшим щепленням або іншими видами введення.

Спосіб застосування може широко варіювати. Застосовним є будь-який з традиційних способів введення вакцини. Вони включають в себе оральне застосування на твердій фізіологічно прийнятній основі або у фізіологічно прийнятній дисперсії, парентерально, за допомогою ін'єкції і т.п. Дозування вакцини буде залежати від способу введення і буде варіювати в залежності від віку суб'єкта, що піддається вакцинації, і складу антигену.

Деякі з поліпептидів вакцини досить імуногенні у вакцині, але для деяких інших імунна відповідь посилиться, якщо вакцина буде додатково містити активуючу речовину.

Для вакцин відомі різні способи досягнення активуючого ефекту. Основні принципи і способи добре розроблені в | ТПне Тпеогу апа Ргасіїса! Арріїсайоп ої Адіимапів", 1995, ЮОипсап Е.5. 5ієжапй-Тиї (еа.), доп

ММієу опе ЦО, ІЗВМ 0-471-95170-6, а також у "Массіпе5: Мем/ Сепегайопп Іттипоіодіса! Адіимапів", 1995,

Стедогіадіє С єї аї. (ед5.), Рієпит Ргев5, Мем МХоїк, ІЗВМ 0-306-45283-9, включених сюди за допомогою посилання).

Особливо переважно застосовувати ад'ювант, який, як може бути показано, сприяє порушенню аутотолерантності до аутоантигенів; фактично це істотно у випадках, коли як активний інгредієнт в аутовакцині застосовують немодифікований амілоїдогенний поліпептид. Як необмежувальні приклади відповідні ад'юванти вибирають з групи, яка складається з ад'юванта, що націлює імунітет; імуномодулюючого ад'юванта, такого як токсин, цитокін і похідні мікобактерій; масляного складу; полімеру; ад'юванта, що формує міцели; сапоніну; імуностимулювального комплексного матриксу (матрикс ІЗСОМ); частинки; ОСА; ад'ювантів на основі алюмінію; ад'ювантів на основі ДНК; у-інуліну та інкапсулюючого ад'юванта. У загальних рисах необхідно зазначити, що описи вище, які відносилися до сполук і засобів, придатних як перша, друга і третя групи в аналогах, з відповідними змінами також відносяться до їх використання в ад'юванті вакцини відповідно до винаходу.

Можливе використання ад'ювантів включає в себе застосування таких засобів як гідроксид або фосфат алюмінію (галуни), що звичайно застосовується як 0,05-0,1-процентний розчин у забуференому сольовому розчині, домішка з синтетичними полімерами цукрів (наприклад, Сагроро!Ф), що застосовується як 0,25 процентний розчин, агрегацію білків у вакцині за допомогою впливу тепла з температурним діапазоном від 70 до 101"С протягом періоду від 30 секунд до 2 хвилин, відповідно, а також агрегацію за допомогою речовин, що структурують. Також можна застосовувати агрегацію альбуміну за допомогою реактивації оброблених пепсином антитіл (Бар-фрагментів), суміш з бактеріальними клітинами, такими як С раглит, або ендотоксинами, або компонентами ліпополісахаридів грамнегативних бактерій, емульсію у фізіологічно допустимих масляних носіях, таких як манідмоноолеат (Агасеї А) або емульсію з 20 процентним розчином перфторвуглецю (Рійо50І-ЮСА), що застосовується як замісник, що блокує. Суміш з маслами, такими як сквален та ІРА, також переважна.

Відповідно до даного винаходу, ОБА (бромід диметилдіоктадециламонію) є цікавлячим кандидатом для ад'юванта, як і ДНК, і у-інулін, але повний і неповний ад'юванти Фрейнда, а також сапоніни кілайї, такі як

ОМА ії 0521, також цікаві, як і КІВІ. Додатковими можливостями є монофосфоліпід А (МР), вказані вище

ССЗ і Сз3а, і мурамілдипептид (МОР).

Відомо, що препарати ліпосом дають ефекти ад'ювантів, і отже, ад'юванти у вигляді ліпосом переважні відповідно до винаходу.

Переважними альтернативами відповідно до винаходу також є адюванти у вигляді імуностимулювального комплексного матриксу (матрикс ІЄСОМФ)), особливо тому, що показано, що даний тип ад'ювантів здатний до підвищувальної регуляції експресії МНС класу І АРС. Матрикс ІЗСОМФ складається з (необов'язково фракціонованих) сапонінів (тритерпеноїди) з Оціа)а заропагіа, холестерину і фосфоліпіду. Коли це змішують з імуногенним білком, одержуваний препарат з частинок являє собою те, що відомо як частинка ІЗСОМ, де сапонін складає 60-7095 мас./мас., холестерин і фосфоліпід складають 10-1595 мас./мас., і білок складає 10-1595 мас./мас. Подробиці, що відносяться до композиції і застосування імуностимулювальних комплексів, можна знайти, наприклад, у вказаних вище підручниках, присвячених ад'ювантам, але у (Могеїп В еї аї., 1995, Сііп. ІттипоїНег. 3: 461-475, також як і у Вагтг ІС апа МіїспеїЇ СЕ, 1996, Іттипої, апа Сеї! Вісі. 74: 8-25 (включених сюди за допомогою посилання)| також надані придатні інструкції для одержання повних імуностимулювальних комплексів.

Інша дуже цікава (а значить, переважна) можливість досягнення ефекту ад'юванта пов'язана із застосуванням способу, описаного у |Соззеїїп еї аї!., 1992 (що, таким чином, включено сюди за допомогою посилання)). Коротко, презентацію відповідного антигену, такого як антиген відповідно до даного винаходу можна посилити за допомогою кон'югації антигену з антитілами (або антигензв'язувальними фрагментами антитіл) проти рецепторів Есу на моноцитах/макрофагах. Показано, що імуногенність для цілей вакцинації особливо посилюють кон'югати між антигеном і анти-ЕсуВі.

Інші можливості включають в себе застосування речовин, що націлюють та імуномодулюють (наприклад, цитокінів), вказаних вище як кандидати для першої і другої груп у модифікованих версіях амілоїдогенних поліпептидів. У зв'язку з цим можливостями також є синтетичні індуктори цитокінів, такі як полі І:С.

Придатні похідні мікобактерій вибрані з групи, що складається з мурамілдипептиду, повного ад'юванта

Фрейнда, КІВІ і складних діефірів трегалози, таких як ТОМ або ТОЕ.

Придатні ад'юванти, що націлюють імунітет, вибирають з групи, яка складається з ліганду СО40 та антитіл до СО40 або їх фрагментів, шо специфічно зв'язуються, (пор. обговорення вище), манози, Рар- фрагмента і СТІ А-4.

Придатні полімерні ад'юванти вибирають з групи, що складається з вуглеводів, таких як декстран, РЕС, крохмаль, манан і маноза; пластичних полімерів і латексу, такого як латексні гранули.

Ще один цікавий шлях модуляції імунної відповіді являє собою включення імуногена (необов'язково разом з ад'ювантами і фармацевтично допустимими носіями) у "віртуальний лімфатичний вузол" (МІ М) (патентований медичний пристрій розроблений в ІттипоТПегару, Іпс., 360 І ехіпдїоп Амепие, Мем/ МогкК, МУ 10017-6501). ММ (тонкий трубчастий пристрій) імітує структуру і функцію лімфатичного вузла. Внесення

ММ під шкіру створює ділянку стерильного запалення з підвищенням рівня цитокінів і хемокінів. Т- і В- клітини, також як і АРС, швидко відповідають на сигнали про пошкодження, направляються до ділянки запалення і нагромаджуються всередині пористого матриксу ММ. Показано, що необхідна доза антигену, якої потрібно для встановлення імунної відповіді на антиген при застосуванні МІМ, зменшена і, що імунопротекція, викликана імунізацією із застосуванням МІ М, перевищує стандартну імунізацію із застосуванням як ад'юванта КІВІ. Технологія коротко описана у |Сеїрег С еї аї!., 1998, "ЕЇсйайноп ої Нориві

Сеїїшаг апа Нитога! Іттипе НКезропзе5 Ю Зтаї! Атошпів ої Іттиподепе Овіпд а Моме! Меадаіса! Оємісе

Оезідпагейд те міпшаї! утри Моде", іп: "Егот (пе І арогайгу о Ше Сіїпіс, Воок ої Арвігасів, Осіорег 1217-1517 1998, беазсаре Везоїї, Аріов, Сай Погпіа"|.

Показано, що препарати вакцин у вигляді мікрочастинок у багатьох випадках збільшують імуногенність білкових антигенів, а отже, являють собою інше переважне здійснення винаходу. Мікрочастинки виготовляють або як композиції разом з полімером, ліпідом, вуглеводом або іншими молекулами, придатними для виготовлення частинок, або мікрочастинки можуть являти собою гомогенні частинки, що складаються тільки з самого антигену.

Приклади мікрочастинок, що базуються на полімерах, являють собою частинки, які базуються на РІ СА і

РМР ІСоиріа, К. К. еї. аІ. 1998), де полімер і антиген конденсують у тверду частинку. Частинки на основі ліпідів можна виготовити як міцели з ліпіду (так звані ліпосоми), захоплюючи антиген у міцелу |Рієїгороп, Р.

У. 1995). Частинки на основі вуглеводу, звичайно виготовляють з відповідного вуглеводу, що розпадається, такого як крохмаль або хітозан. Вуглевод і антиген змішують і конденсують у частинки у процесі, подібному до того, що застосовують для полімерних частинок |Кав, Н. 5. еї аї. 1997).

Частинки, що складаються тільки з антигену, можна виготовляти різними способами розпилення або сушіння виморожуванням. Для цілей даного винаходу особливо підходить спосіб надкритичної рідини, який застосовують для виготовлення дуже однорідних частинок контрольованого розміру |Могк, Р. 1999 5

Зпекипом, В. еї а. 1999).

Очікується, що вакцину потрібно вводити 1-6 разів на рік, тобто 1, 2, 3, 4, 5 або 6 разів на рік, індивіду, який потребує цього. Раніше показано, що імунологічна пам'ять, індукована застосуванням переважних аутовакцин відповідно до даного винаходу, не є постійною, і отже, імунна система потребує періодичної провокації імунної відповіді амілоїдогенним поліпептидом або модифікованими амілоїдогенними поліпептидами.

Внаслідок генетичної різноманітності різні індивіди можуть реагувати на один і той же поліпептид імунною відповіддю різної сили. Отже, вакцина відповідно до винаходу може містити декілька різних поліпептидів для збільшення імунної відповіді, пор. також обговорення вище, що стосується вибору введень чужорідного Т-клітинного епітопу. Вакцина може включати в себе два або декілька поліпептидів, де всі поліпептиди являють собою такі, як визначено вище.

Отже, вакцина може включати в себе 3-20 різних модифікованих або немодифікованих поліпептидів, наприклад, 3-10 різних пептидів.

Вакцинація нуклеїновою кислотою

Як альтернатива класичному введенню вакцини на основі білка технологія вакцинації нуклеїновою кислотою (також відома як "імунізація нуклеїновою кислотою", "генетична імунізація" і "генна імунізація") пропонує ряд привабливих особливостей.

Передусім, на противагу традиційному підходу до вакцинації, вакцинація нуклеїновою кислотою не потребує ресурсів, що вимагають широкомасштабного виробництва імуногена (наприклад, у промисловому масштабі ферментації мікроорганізмів, які продукують амілоїдогенні поліпептиди). Більш того немає необхідності у пристроях по очищенню і схемах рефолдингу імуногена. І, нарешті, оскільки при вакцинації нуклеїновою кислотою для продукту експресії внесеної нуклеїнової кислоти покладаються на біохімічний апарат індивіда, що вакцинується, очікується, що відбудеться оптимальний посттрансляційний процесинг продукту, що експресується; це особливо важливо у випадку аутовакцинації, оскільки, як вказано вище, у модифікованій молекулі необхідно зберегти значну частину вихідних В-клітинних епітопів і оскільки В- клітинні епітопи в принципі можна скласти з частин будь-якої (біологічної) молекули (наприклад, вуглеводу, ліпіду, білка і т.п.). Отже, природні профілі глікозилювання і ліполювання імуногена можуть бути дуже важливими для загальної імуногенності, а це краще всього забезпечити, якщо як продуцент імуногена використати хазяїна.

Отже, переважне здійснення варіантів а-с відповідно до винаходу включає в себе ефективну презентацію аналога імунній системі за допомогою внесення нуклеїнових(ої) кислот(и), що кодують(є) аналог, у клітини тварини і таким чином одержання експресії введених(ої) нуклеїнових(ої) кислот(и) клітинами іп мімо.

У даному здійсненні, введена нуклеїнова кислота переважно являє собою ДНК, яка може знаходитися у формі чистої ДНК, ДНК, об'єднаної із зарядженими або незарядженими ліпідами, ДНК, поміщеної у ліпосоми, ДНК, включеної у вірусний вектор, ДНК, об'єднаної з білюом або поліпептидом, що полегшує трансфекцію, ДНК, об'єднаної з білком або поліпептидом, що націлює, ДНК, об'єднаної з агентами, що осаджують кальцій, ДНК, зв'язаної з інертною молекулою-носієм, ДНК, інкапсульованої у полімер, наприклад, у РІ СА Іпорівняйте спосіб мікроінкапсуляції, описаний у М/О 98/313981І, або хітин, або хітозан і

ДНК, об'єднаної з ад'ювантом. У даному контексті потрібно зазначити, що практично всі розглянуті варіанти, які стосуються застосування ад'ювантів у препаратах традиційних вакцин, застосовуються і у препаратах вакцин з ДНК. Отже, всі описи, які тут відносяться до застосування ад'ювантів, у контексті вакцин на основі поліпептидів, з необхідними змінами застосовують для використання у способі вакцинації нуклеїновими кислотами.

Шляхи введення і схеми введення вакцин на основі поліпептидів, деталізовані вище, також застосовні для вакцин на основі нуклеїнових кислот відповідно до винаходу, і всі обговорення вище, що стосуються шляхів і схем введення поліпептидів, з відповідними змінами застосовують до нуклеїнових кислот. До цього необхідно додати, що вакцини на основі нуклеїнових кислот можна відповідним чином вводити внутрішньовенно і внутрішньоартеріально. Більш того у даній області добре відомо, що вакцини на основі нуклеїнових кислот можна вводити за допомогою застосування так званої генної гармати, і отже, даний і еквівалентні способи введення розглядають як частина даного винаходу. Нарешті, як повідомлялося, застосування для введення нуклеїнових кислот МІ М також дає хороші результати, і отже, даний конкретний спосіб введення є особливо переважним.

Крім того, нуклеїноваїйї) кислота(и), що застосовуються як засоби для імунізації, можуть містити ділянки, що кодують 1-у, 2-у і/або 3-ю групи, наприклад, у вигляді імуномодулюючих речовин, описаних вище, таких як цитокіни, розглянуті як придатні ад'юванти. Переважна версія даного здійснення пов'язана з кодувальною ділянкою для аналога і кодувальною ділянкою для імуномодулятора у різних рамках зчитування або щонайменше під контролем різних промоторів. Таким чином, уникають того, щоб аналог або епітоп продукувалися як партнери злиття з імуномодулятором. Альтернативно, можна використати два окремих нуклеотидних фрагменти, але це є менш переважним у зв'язку з перевагою, що забезпечується спільною експресією, коли обидві кодувальні ділянки включені в одну молекулу.

Таким чином, винахід також відноситься до композиції для індукування продукції антитіл проти АРР або

АД, де композиція включає в себе - фрагмент нуклеїнової кислоти або вектор відповідно до винаходу (пор. обговорення векторів нижче) і - фармацевтично та імунологічно допустимий носій і/або ад'ювант, як обговорювалося вище.

У нормальних умовах нуклеїнову кислоту, що кодує варіант, вносять у вигляді вектора, де експресія знаходиться під контролем вірусного промотору. Більш детальне обговорення векторів відповідно до винаходу див. обговорення нижче. Також докладні описи, що відносяться до формування і застосування вакцин на основі нуклеїнових кислот |див. Ооппейу 9. еї а!., 1997, Аппи. Кеу. Іттипої. 15: 617-648 і боппеПу 99. ега!., 1997, Ме бсієпсез 60: 163-172. Обидва даних посилання включені сюди за допомогою посилання).

Живі вакцини

Третя альтернатива для ефективної презентації аналогів імунній системі, як визначено у варіантах а-с, являє собою застосування способу живих вакцин. У вакцинації живими вакцинами презентацію імунній системі здійснюють за допомогою введення тварині непатогенних мікроорганізмів, які можна трансформувати фрагментом нуклеїнової кислоти, що кодує аналог, або вектором, що включає в себе такий фрагмент нуклеїнової кислоти. Непатогенний мікроорганізм може являти собою будь-який відповідний атенуйований бактеріальний штам (атенуйований за допомогою пасажів або шляхом видалення патогенних продуктів, що експресуються, за допомогою технології рекомбінантних ДНК), наприклад, ВСО. Мусобасіегішт бромі5, непатогенні Зігеріососси5 5рр., Б. соїї, ЗаІтопеййа 5рр., Міргіо споїегає, ЗПпідеїіа і т.п. Огляди, присвячені одержанню реальних живих вакцин, можна, наприклад, знайти у

ІЗаїїои Р, 1995, Кему. Ргаї. 45: 1492-1496 і УмаІкег РО, 1992, Массіпе 10: 977-990, обидва з яких включені сюди за допомогою посилання).

Для подробиць про фрагменти нуклеїнової кислоти і вектори, що застосовуються в таких живих вакцинах, порівняйте обговорення нижче.

У вигляді альтернативи бактеріальним живим вакцинам, фрагмент нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу, що обговорюється нижче, можна ввести у невірулентний вектор вірусної вакцини, такий як штам коров'ячої віспи або будь-який інший відповідний вірус віспи.

Звичайно непатогенний мікроорганізм або вірус тварині вводять тільки один раз, але у деяких випадках може бути необхідним введення мікроорганізму більше одного разу протягом життя для збереження захисного імунітету. Навіть припускають, що деталізовані вище схеми імунізації для вакцинації поліпептидами будуть придатні для застосування живих або вірусних вакцин.

Альтернативно, вакцинацію живими вакцинами або вірусами комбінують з попередньою або подальшою вакцинацією поліпептидами і/або нуклеїновими кислотами. Наприклад, можна здійснити первинну імунізацію живою або вірусною вакциною з подальшою підтримуючою |імунізацією із застосуванням підходу на основі поліпептиду або нуклеїнової кислоти.

Мікроорганізм або вірус можна трансформувати нуклеїновою(ими) кислотою(ами), що містять ділянки, які кодують 1-у, 2-у і/або 3-ю групи, наприклад, у вигляді імуномодулюючих речовин, описаних вище, таких як цитокіни, розглянуті як придатні ад'юванти. Переважна версія даного здійснення пов'язана з кодувальною ділянкою для аналога і кодувальною ділянкою для імуномодулятора у різних рамках зчитування або щонайменше під контролем різних промоторів. Таким чином, уникають того, щоб аналог або епітоп продукувався як партнер злиття з імуномодулятором. Альтернативно, як засоби, що трансформують, можна використовувати два окремих нуклеотидних фрагменти. Звичайно, наявність 1-ї і/або 2-ї, і/або 3-ї груп в одній і тій же рамці зчитування може забезпечити аналог відповідно до винаходу як продукт експресії, і таке здійснення особливо переважне у даному винаході.

Застосування способу відповідно до винаходу для лікування захворювання

Як можна зрозуміти з обговорення вище, надання способу відповідно до винаходу дозволяє контролювати захворювання, що характеризуються накопиченнями амілоїду. У даному контексті АО являє собою ключову ціль способу відповідно до винаходу, але інші захворювання, які характеризуються відкладеннями амілоїду, що містить АД, також є досяжними цілями. Отже, важливе здійснення способу відповідно до винаходу для знижувальної регуляції амілоїдної активності включає в себе лікування і/або профілактику і/або поліпшення стану АЮ або інших захворювань, що характеризуються накопиченням амілоїду, спосіб включає в себе знижувальну регуляцію АРР або АД способом відповідно до винаходу, до такої міри, щоб значно зменшувалася кількість амілоїду.

Особливо переважно, щоб зменшення амілоїду приводило до зміни балансу між формуванням і деградацією/видаленням амілоїду, тобто швидкість деградації/видалення амілоїду доведена до міри, коли вона перевищує швидкість формування амілоїду. За допомогою ретельного контролю кількості та імунологічного впливу імунізацій індивіда який потребує цього, можна згодом досягти балансу, що приводить до зменшення нетто накопичень амілоїду без надмірних несприятливих ефектів.

Альтернативно, якщо спосіб відповідно до винаходу не ефективний у видаленні або зменшенні існуючих відкладень амілоїду у індивіда, його можна застосовувати для одержання клінічно значимого зменшення формування нового амілоїду, таким чином значно подовжуючи період, до якого стан хвороби не погіршиться. Потрібно мати можливість контролювати швидкість накопичення амілоїду або шляхом вимірювання сироваткової концентрації амілоїду (яка, як вважають, знаходиться у рівновазі з речовиною у накопиченнях), або за допомогою позитронно-емісійного томографічного (РЕТ) сканування, (пор. Зтаї!

С.МУ., еї аі., 1996, Апп М.У. Асай 5сі 802: 70-78.

Інші захворювання і стани, де можна застосовувати дані засоби і способи для лікування або полегшення стану аналогічним способом згадані вище у "передумовах винаходу" або перераховані нижче у розділі, який називається "інші амілоїдні захворювання і білки, асоційовані з ними".

Пептиди, поліпептиди і композиції відповідно до винаходу

Як видно з вказаного вище, даний винахід базується на концепції імунізації індивідів проти антигену

АРР або АД для одержання зменшеної кількості зв'язаних з патологією накопичень амілоїду. Переважний шлях досягнення такої імунізації являє собою застосування описаних тут аналогів, з наданням, таким чином, молекул, раніше не описаних у даній області.

Вважають, що аналоги, які обговорюються тут, є об'єктом винаходу самі по собі, і отже, важлива частина винаходу відноситься до описаних вище аналогів. Отже, будь-який представлений тут опис, що відноситься до модифікованого АРР або Ар, є релевантним для цілей опису амілоїдогенних аналогів відповідно до винаходу, також як і будь-які такі описи, навпаки, застосовні до опису вказаних аналогів.

Необхідно зазначити, що переважні модифіковані молекули АРР або АД включають в себе модифікації,

які приводять до утворення поліпептиду, що володіє ступенем ідентичності послідовності з АРР або АД, що складає щонайменше 7095, або з їх підпослідовністю довжиною щонайменше у 10 амінокислот. Більш високий ступінь ідентичності послідовності, наприклад, щонайменше 75905 або навіть щонайменше 80, 85, 90 або 9595 є переважним. Ідентичність послідовності для білків і нуклеїнових кислот можна обчислити як (Мге-Мак): 100/Мре, де Мах являє собою загальне число неідентичних залишків у двох послідовностях при вирівнюванні і де Ме являє собою число всіх залишків в одній з послідовностей. Так, послідовність ДНК

АСТСАСТС має ступінь ідентичності з послідовністю ААТСААТС, що складає 7595 (Маке2 і Ме-8).

Винахід також відноситься до композицій, які можна використовувати при реалізації способу відповідно до винаходу. Отже, винахід також відноситься до імуногенної композиції, яка включає в себе імуногенно ефективну кількість описаного вище аналога, причому вказана композиція додатково включає в себе фармацевтично та імунологічно прийнятний розріджувач і/або носій, і/або наповнювач і, необов'язково, ад'ювант. юІншими словами, ця частина винаходу відноситься до композицій аналогів, в основному як описано вище. Таким чином, коли вибір ад'ювантів і носіїв відноситься до композиції модифікованого або немодифікованого амілоїдогенного поліпептиду для застосування у способі відповідно до винаходу для знижувальної регуляції АРР або Ар, він знаходиться відповідно до того, що обговорювалося вище.

Поліпептиди одержують відповідно до способів, добре відомих у даній області. Більш протяжні поліпептиди звичайно одержують за допомогою технології рекомбінантних генів, яка включає в себе введення послідовності амінокислот, що кодує аналог, у відповідний вектор, трансформацію даним вектором відповідної клітини-хазяїна, експресію даною клітиною-хазяїном послідовності нуклеїнових кислот, діставання продукту експресії з клітин-хазяїнів або їх супернатанту і подальше очищення, і, необов'язково, додаткову модифікацію, наприклад, рефолдинг або дериватизацію.

Більш короткі пептиди переважно одержують за допомогою добре відомих способів твердофазового або рідкофазового пептидного синтезу. Однак нещодавні досягнення у даній технології створили можливість одержання за допомогою даних способів повнорозмірних поліпептидів і білків, і отже, одержання довгих конструкцій за допомогою синтетичних способів також не виходить за межі даного винаходу.

Фрагменти нуклеїнової кислоти і вектори відповідно до винаходу

З попереднього опису зрозуміло, що аналоги поліамінокислот можна одержати за допомогою технології рекомбінантних генів, а також за допомогою хімічного синтезу або напівсинтезу; останні дві альтернативи особливо значимі, коли модифікація полягає у зв'язуванні з білковими носіями (такими як КІ-Н, дифтерійний анатоксин, анатоксин правця і В5А) і небілююовими молекулами, такими як вуглеводні полімери, а також, звичайно, коли модифікація включає в себе додавання бічних ланцюгів або бічних груп до пептидного ланцюга, одержаного з АРР або Ар.

Для цілі технології рекомбінантних генів, а також, звичайно, для цілі імунізації нуклеїновою кислотою фрагменти нуклеїнової кислоти, що кодують аналоги, являють собою важливі хімічні продукти. Отже, важлива частина винаходу відноситься до фрагментів нуклеїнової кислоти, що кодують аналог відповідно до винаходу, тобто поліпептид, одержаний з АРР або АД, що включає в себе або природну послідовність, до якої додають або в яку вставляють партнер злиття, або, переважно, одержаний з АРР або Ар поліпептид, в який за допомогою вставки і/або додавання, переважно за допомогою заміни і/або делеції, ввели чужорідний Т-клітинний епітоп. Фрагменти нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу являють собою фрагменти ДНК або РНК.

Фрагменти нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу звичайно вставляють у відповідні вектори для утворення векторів, які клонують або експресують, що несуть фрагменти нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу; такі нові вектори також являють собою частину винаходу. Подробиці, що відносяться до конструювання таких векторів відповідно до винаходу, будуть обговорюватися нижче у зв'язку з трансформованими клітинами і мікроорганізмами. Вектори, в залежності від мети і типу застосування, можуть існувати у вигляді плазмід, фагів, космід, мініхромосом або вірусу, але «оголена» ДНК, яка транзитно експресується тільки у визначених клітинах, також є важливим вектором. Переважні вектори, що клонують і експресують, відповідно до винаходу здатні до автономної реплікації, таким чином створюючи можливість одержання великого числа копій для цілей високорівневої експресії або високорівневої реплікації для подальшого клонування.

Основна схема вектора відповідно до винаходу включає в себе наступні елементи у напрямку 5-53 та у функціональному з'єднанні: промотор для керування експресією фрагмента нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу, необов'язково послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує лідерний пептид, що робить можливою секрецію (в екстрацелюлярну фазу або, коли застосовно, у периплазму) поліпептидного фрагмента або його інтеграцію у мембрану, фрагмент нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу і, необов'язково, послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує термінатор. При оперуванні векторами, що експресують, у штамах-продуцентах або клітинних лініях з метою генетичної стабільності трансформованої клітини переважно, щоб вектор при введенні в клітину-хазяїна інтегрувався у геном клітини-хазяїна.

Навпаки, при роботі з векторами, що застосовуються для здійснення експресії у тварини іп мімо (наприклад, при застосуванні вектора у вакцинації ДНК), з міркувань безпеки переважно, щоб вектор був нездатний до інтеграції у геном клітини-хазяїна; звичайно застосовують «оголену» ДНК або вектори, що не інтегруються, вибір яких добре відомий фахівцям у даній області.

Вектори відповідно до винаходу застосовують для трансформації клітин-хазяїнів для одержання аналога відповідно до винаходу. Такі трансформовані клітини можуть являти собою клітини, що культивуються або клітинні лінії, які застосовуються для розмноження фрагментів нуклеїнової кислоти і векторів відповідно до винаходу або застосовуються для рекомбінантного одержання аналогів відповідно до винаходу. Альтернативно, трансформовані клітини можуть являти собою штами живих вакцин, де фрагмент нуклеїнової кислоти (одна єдина або декілька копій) вставлений так, що здійснює секрецію або інтеграцію аналога у бактеріальну мембрану або клітинну стінку.

Переважні трансформовані клітини відповідно до винаходу являють собою мікроорганізми, такі як бактерії (такі як види Езспегіспіа (наприклад, Е. соїїЇ, Васіїйй5 (наприклад, Васіїйи5 з!ЄИБї5|, ЗаітопейПа або

Мусобрасіегійт Іпереважно непатогенні, наприклад, ВСОо М. ромі5|), дріжджі (наприклад, засспаготусе5 сегемізіаеє) і найпростіші тварини. Альтернативно, трансформовані клітини одержують з багатоклітинного організму, наприклад, гриба, клітини комахи, клітини рослини або клітини ссавця. Найбільш переважними є клітини, одержані від людини, порівняйте обговорення клітинних ліній і векторів нижче. Останні результати у лабораторії авторів свідчать про перспективи застосування для рекомбінантного одержання поліпептидів комерційно доступної лінії Огозорпйа теїІаподавіег (клітинна лінія і векторна система Зсппеїдег 2 (552), доступна в Іпмігодеп), і отже, дана система, що експресує, особливо переважна.

Для цілей клонування і/або оптимізованої експресії переважно, щоб трансформовані клітини були здатні реплікувати фрагмент нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу. Клітини, що експресують фрагмент нуклеїнової кислоти, є переважно корисними здійсненнями даного винаходу; їх можна використовувати для обмеженого або широкомасштабного одержання аналога відповідно до винаходу або, у випадку непатогенних бактерій, як вакцинних складових у живій вакцині.

При одержанні аналогів відповідно до винаходу за допомогою трансформованих клітин, зручно, хоча це і віддаляє від суті, щоб продукти експресії або експортувалися назовні у середовище культивування, або знаходилися на поверхні трансформованої клітини.

Коли ефективні клітини-продуценти ідентифіковані, на їх основі переважно створити стабільну клітинну лінію, яка несе вектор відповідно до винаходу і експресує фрагмент нуклеїнової кислоти, що кодує модифікований амілоїдогенний поліпептид. Переважно, щоб дана стабільна клітинна лінія секретувала або несла аналог відповідно до винаходу, таким чином полегшуючи його очищення.

Як правило, плазмідні вектори, що містять реплікон і контрольні послідовності, одержані з видів, сумісних з клітиною-хазяїном, застосовують у зв'язку з хазяїнами. Вектор звичайно несе сайт реплікації, а також маркерні послідовності, здатні забезпечити селекцію трансформованих клітин за фенотипом.

Наприклад, Е. соїї звичайно трансформують із застосуванням рвВК322, плазміди, одержаної з виду Е. сої

Інаприклад, див. Воїїмаг еї а!., 1977). Плазміда рвк.322 містить гени стійкості до ампіциліну і тетрацикліну і таким чином забезпечує прості засоби для ідентифікації трансформованих клітин. Плазміда рве або інша плазміда мікроорганізмів або фаг повинна також містити - або ж її необхідно модифікувати так, щоб вона містила - промотори, які прокаріотичний мікроорганізм може використати для експресії.

Такі промотори, що частіше за все застосовуються для конструювання рекомбінантної ДНК, включають в себе системи В-лактамазного і лактозного промоторів (Спапо еї аї., 1978; МКакига еї а!., 1977; соєдавї! еї аї., 1979| і систему триптофанового (ігр) промотору |Соедаеї! еї аї., 1979; ЕР-А-0036116)|. Хоча вони і є найчастіше застосовуваними, виявлені та застосовуються також й інші промотори мікроорганізмів, і опубліковані деталі, що відносяться до їх нуклеотидних послідовностей, дозволяючи фахівцям функціонально лігувати їх з плазмідними векторами (ІбЗіержепіїві еї аї!., 19801. Визначені гени прокаріот можуть ефективно експресуватися в Е. соїї з її власної промоторної послідовності, запобігаючи необхідності додавання іншого промотору штучними способами.

Крім прокаріотичних, можна застосовувати і еукаріотичні мікроорганізми, такі як дріжджові культури, і тут промотор повинен бути здатний направляти експресію. Засспаготусе5 сегемізіазе, або звичайні пекарські дріжджі, з еукаріотичних мікроорганізмів застосовують найчастіше, хоча також доступний і ряд інших штамів. Для експресії в Засспаготусе5 звичайно застосовують, наприклад, плазміду УКр7

ІЗііпспсоть еї а/!., 1979; Кіпдзтап єї а!., 1979; Теспетрег" еї а!., 1980). Дана плазміда вже містить ген ігрі, що є селективним маркером для мутантного штаму дріжджів, позбавлених здатності рости на триптофані, наприклад, АТС Мо44076 або РЕРА-1 |Чопез, 1977). Наявність пошкодження ігрі як характеристики геному дріжджової клітини-хазяїна, надає ефективну умову для виявлення трансформації за допомогою росту за відсутності триптофану.

Відповідні промоторні послідовності у дріжджових векторів включають в себе промотори для 3- фосфогліцераткінази (Ні тап еї аї., 1980) або інших гліколітичних ферментів І(Незз еї аї., 1968; НоПапа еї а!., 1978))| таких як енолаза, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа, гексокіназа, піруватдекарбоксилаза, фосфофруктокіназа, глюкозо-6-фосфатізомераза, З-фосфогліцератмутаза, піруваткіназа, триозофосфатізомераза, фосфоглюкозоізомераза і глюкокіназа. Для забезпечення поліаденілювання мРНК і термінації бажано, щоб при конструюванні відповідних плазмід, що експресують, експресувалися послідовності, що термінують, асоційовані з даними генами, також ліговані у 3'-кінець послідовності вектора, що експресує.

Інші промотори, що володіють додатковою перевагою транскрипції, контрольованої умовами росту, являють собою промоторні ділянки алкогольдегідрогенази 2, ізоцитохрому С, кислої фосфатази, ферментів деградації, асоційованих з метаболізмом азоту і вказаної вище гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази, і ферментів, що відповідають за утилізацію мальтози і галактози. Відповідним є будь-який плазмідний вектор, що містить промотор, придатний для дріжджів, ділянку початку реплікації і послідовності термінатора.

Крім мікроорганізмів, як хазяїни можна застосовувати культури клітин, одержаних з багатоклітинних організмів. В принципі будь-яка така клітинна культура є можливою, чи то є культура з хребетних або безхребетних. Однак найбільший інтерес представляють клітини хребетних, а розмноження клітин хребетних у культурі (тканинна культура) в останні роки стало звичайним способом |Тізвие Сишге, 1973).

Прикладами таких придатних ліній клітин-хазяїнів є клітини МЕКО і Не! а, лінії клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО) і УМ138, ВНК, СО5-7 293, клітини Зродоріега їадірегда (ЗЕ) (комерційно доступні як завершені системи, що експресують, крім іншого, у Ргоїеіп Зсіепсе5, 1000 Кезеагсп Рагкулау, Мегідеп, СТ 06450, ).5.А. та в Іпмігодеп) і клітинні лінії МОСК. Найбільш переважна клітинна лінія відповідно до даного винаходу являє собою лінію 52, доступну в Іпмігодеп, РО Вох 2312, 9704 СН Сгопіпдеп, Тпе Меїпепапав5.

Вектори, що експресують, для таких клітин звичайно включають в себе (якщо необхідно) ділянку початку реплікації, промотор, розташований перед геном для експресії, разом з будь-якими необхідними ділянками зв'язування рибосом, ділянками сплайсингу РНК, ділянкою поліаденілювання і послідовності термінатора транскрипції.

Для застосування у клітинах ссавців, функції керування на векторах, що експресують, часто забезпечуються матеріалом вірусу. Наприклад, звичайно застосовувані промотори одержують з вірусу поліоми, аденовірусу 2 і, найчастіше, мавпячого вірусу 40 (5М40). Ранні та пізні промотори вірусу 5М40 особливо корисні у зв'язку з тим, що їх легко одержати з вірусу як фрагмент, що також містить ділянку початку реплікації вірусу 5М40 (Ріег5 еї а!., 1978). Також можна використати менший і більший фрагменти 5М40, за умови, що туди включена послідовність довжиною приблизно 250п.н., що продовжується від ділянки розпізнавання Ніпаій до ділянки розпізнавання ВаїЇ, розташована у вірусній ділянці початку реплікації. Крім того, також можливо і часто бажано використовувати промотор або контрольні послідовності, звичайно асоційовані з бажаною генною послідовністю, за умови, що дані контрольні послідовності сумісні з системами клітин-хазяїнів.

Ділянку початку реплікації можна забезпечити або за допомогою конструювання такого вектора, щоб він включав в себе екзогенну ділянку початку реплікації, наприклад, яку можна одержати з 5М40 або інших вірусів (наприклад, вірусу поліоми, аденовірусів, М5М, ВРМ), або за допомогою механізму хромосомної реплікації клітини-хазяїна. Якщо вектор інтегрований у хромосому клітини-хазяїна, її часто достатньо.

Ідентифікація придатних аналогів

Фахівцям зрозуміло, що не всі можливі варіанти або модифікації природних АРР або Ар володіють здатністю викликати у тварини утворення антитіл, які є перехресно-реагуючими з природною формою.

Однак неважко зробити ефективний стандартний скринінг модифікованих амілоїдогенних молекул, що задовольняють мінімальним вимогам імунологічної реактивності, які обговорюються тут. Отже, можна застосовувати спосіб для ідентифікації модифікованих амілоїдогенних поліпептидів, здатних індукувати утворення антитіл проти немодифікованого амілоїдогенного поліпептиду у видів тварин, де немодифікований амілоїдогенний поліпептид являє собою (неімуногенний) власний білок, причому цей спосіб включає в себе - одержання за допомогою пептидного синтезу або способів генної інженерії набору взаємно простих аналогів відповідно до винаходу, де в амінокислотну послідовність АРР або АД виду тварин додані, в неї вставлені, з неї видалені або в ній заміщені амінокислоти, таким чином приводячи до амінокислотних послідовностей у наборі, які включають в себе Т-клітинні епітопи, чужорідні для виду тварин, або одержання набору фрагментів нуклеїнової кислоти, що кодують набір взаємно простих аналогів, - тестування елементів набору аналогів або фрагментів нуклеїнової кислоти на їх здатність викликати продукцію антитіл у виду тварин проти немодифікованого АРР або Ар, - та ідентифікацію і, необов'язково, виділення елементай(ів) набору аналогів, який(ї) значимо індукує у виду продукцію антитіл проти немодифікованих АРР і АД або ідентифікацію або, необов'язково, виділення продуктів, що експресують поліпептид, які кодуються елементами набору фрагментів нуклеїнової кислоти, що значимо індукують у виду тварин продукцію антитіл проти немодифікованих АРР і АД.

У даному контексті, "набір взаємнопростих модифікованих амілоїдогенних поліпептидів" являє собою колекцію неідентичних аналогів, вибраних на базі критеріїв, що обговорюються вище (наприклад, У комбінації з дослідженням циркулярного дихроїзму, спектрів ЯМР і/або профілів дифракції рентгенівських променів). Набір може складатися тільки з малої кількості елементів, але вважають, що набір може містити і декілька сотень елементів.

Тестування елементів набору, зрештою, можна провести іп мімо, але можна застосовувати ряд тестів іп міїго, які зменшують кількість модифікованих молекул, що служать метою даного винаходу.

Оскільки мета внесення чужорідних Т-клітинних епітопів являє собою підтримку В-клітинної відповіді за допомогою Т-клітин, необхідна умова полягає у тому, щоб аналог індукував проліферацію Т-клітин.

Проліферацію Т-клітин можна тестувати за допомогою стандартизованих аналізів проліферації іп міго.

Коротко, від суб'єкта одержують зразок, збагачений Т-клітинами, і згодом підтримують у культурі. Т-клітини, що культивуються, приводять у контакт з АРС суб'єкта, що раніше захопили модифіковану молекулу і перетворили її для презентації Т-клітинним епітопам. Спостерігають за проліферацією Т-клітин і порівнюють з відповідним контролем (наприклад, Т-клітини у культурі, що контактували з АРС, які перетворювали інтактний нативний амілоїдогенний поліпептид). Альтернативно проліферацію можна виміряти за допомогою вимірювання концентрації вивільнення відповідних цитокінів Т-клітинами у відповідь на розпізнавання ними чужорідних Т-клітин.

Уявляється вельми вірогідним, що, оскільки щонайменше один аналог кожного типу набору здатний викликати продукцію антитіл проти АРР або Ар, можна одержати імуногенну композицію, яка включає в себе щонайменше один аналог, здатний індукувати утворення антитіл проти немодифікованих АРР або Ар у виду тварин, де немодифіковані АРР або АД являють собою власні білки, способом, що включає в себе змішування елементаїй(ів) набору, який(ї) значимо індукує продукцію антитіл у виду тварин, що реагують з

АРР або Ар з фармацевтично та імунологічно прийнятними носіями і/або розчинниками, і/або розріджувачами, і/або наповнювачами, необов'язково у комбінації щонайменше з одним фармацевтично та імунологічно прийнятним ад'ювантом.

Обговорювані вище тести наборів поліпептидів легко виконати за допомогою початкового одержання ряду взаємно простих послідовностей нуклеїнової кислоти або векторів відповідно до винаходу, вставлянням їх у відповідні вектори, що експресують, трансформацією векторами відповідних клітин- хазяїнів (або тварин-хазяїнів) і здійсненням експресії послідовностей нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу. Після цих стадій може йти виділення продуктів експресії. Переважно, щоб послідовності нуклеїнової кислоти і/або вектори одержували способами, які включають в себе застосування способів молекулярної ампліфікації, такими як ПЛР або за допомогою синтезу нуклеїнової кислоти.

Специфічні амілоїдогенні мішені

Крім найчастіше асоційованих з хворобою Альцгеймера білків АРР, АроЕА4 і Тац, існує довгий список інших білків, так або інакше пов'язаних з АЮ або внаслідок їх безпосередньої присутності у бляшках і клубках у головному мозку при АО або внаслідок їх вираженої генетичної асоціації із збільшеним ризиком розвитку АО. Більшість з даних антигенів, якщо не всі, разом з обговорюваними вище АВ, АРР, пресеніліном і АроЕ4, у визначених здійсненнях даного винаходу являють собою можливі білки-мішені. Ці можливі мішені вже всебічно обговорювалися у (МО 01/62284|. Отже, ці можливі мішені тут будуть тільки коротко згадані, тоді як більш докладне грунтовне обговорення можна знайти у ММО 01/62282|, включеної сюди за допомогою посилання: альфа!1-антихімотрипсин (АСТ); альфа2-макроглобулін; АВАО (алкогольдегідрогеназа, що зв'язує Ар- пептид); АРІ РІ і -2 (білок, подібний до білка- попередника амілоїду 1 і 2); АМУ117; Вах; Всі-2; гідролаза блеоміцину; ВЕІ/АВЕЇІ; хромогранін А; кластерин/ароу; білок, що зв'язує СЕЕ (фактор вивільнення кортикотропіну); ЕОТЕ (токсичний фактор, що походить з ендотелію); гепарансульфатпротеоглікани; білок- медіатор відповіді на колапсин людини 2; гентінгтин (білок хвороби Гентінгтона); ІСАМ-1Ї; І--6; антиген СО68, асоційований з лізосомами; Р21 газ; Рі С-дельта 1 (ізофермент дельта 1 фосфоліпази С); компонент сироваткового амілоїду Р (ЗАР); синаптофізин; синуклеїн (альфа-синуклеїн або МАСР) і ТОБЕ-В1 (фактор росту р1, що трансформує).

Описані у цьому документі засоби і способи знижувальної регуляції АРР або АД можна комбінувати з лікуванням, наприклад, активною специфічною імунотерапією проти будь-якого з даних інших амілоїдогенних поліпептидів.

Крім хвороби Альцгеймера, церебральна амілоїдна ангіопатія також являє собою хворобу, яка може бути відповідною мішенню для наданого у даному документі способу.

Припускають, що більшість способів імунізації проти АРР або Ар потрібно обмежити імунізацією, що приводить до утворення антитіл, які перехресно реагують з нативними АРР або Ар. Проте, у деяких випадках представляє інтерес індукувати клітинний імунітет у формі СТІ -відповіді проти клітин, які презентують епітопи МНС класу І з амілоїдогенних поліпептидів - це може бути доцільним у тих випадках, коли зниження кількості клітин, що продукують АРР або Ар не приносить серйозного несприятливого ефекту. У тих випадках, коли бажана СТІ -відповідь, переважно використовувати рекомендації авторів публікації (МЛО 00/20027)|. Описи вказаних двох документів, таким чином, включені сюди за допомогою посилання.

Імуногенні носії

Можна одержати молекули, які включають в себе Т-хелперний епітоп і пептиди АРР або АД, що являють собою або включають В-клітинні епітопи, ковалентно зв'язані з неїмуногенною полімерною молекулою, що діє як носій, наприклад, полівалентний активований полігідроксиполімер, які будуть, як вказано вище, функціонувати як молекули вакцини, що містять тільки імунологічно значимі частини, і вони являють собою здійснення, що цікавлять, у варіантах 4 і є, які обговорюються вище. Можна застосовувати змішані або так звані універсальні Т-хелперні епітопи, наприклад, якщо мішень для вакцини являє собою власний білок АРР або АД. Крім того, елементи, що посилюють імунологічну відповідь, можна також зв'язати разом з носієм і таким чином вони будуть діяти як ад'ювант. Такі елементи можуть являти собою манозу, тафтсин, мурамілдипептид, мотиви Сро і т.п. В цьому випадку подальша ад'ювантна композиція вакцинного продукту може не бути необхідною, і продукт можна вводити у чистій воді або фізіологічному розчині.

Шляхом зв'язування епітопів цитотоксичних Т-клітин (СТІ) з Т-хелперними епітопами можна генерувати

СТІ, специфічні у відношенні антигену, з якого одержаний СТІ -епітоп. Елементи, що полегшують захоплення продукту у цитозоль АРС, наприклад, макрофагів, такі як маноза, також можна зв'язувати з носієм, разом з СТІ - і Т-хелперними епітопами, і посилити відповідь СТІ.

Співвідношення В-клітинних і Т-хелперних епітопів (Р2 і РЗО) у кінцевому продукті можна варіювати шляхом зміни концентрації даних пептидів на стадії синтезу. Як вказано вище, імуногенну молекулу можна помітити, наприклад, манозою, тафтсином, Сро-мотивами або іншими імуностимулювальними речовинами (описаними тут) шляхом їх додавання, якщо необхідно, за допомогою, наприклад, амінованих похідних цих речовин, до карбонатного буфера на стадії синтезу.

Якщо для комбінування пептидів, які містять В-клітинні і Т-хелперні епітопи АРР або АД, застосовують нерозчинний активований полігідроксиполімер, то це можна, як вказано вище, провести у вигляді твердофазового синтезу, а кінцеві продукти можна зібрати і очистити шляхом промивання і фільтрації.

Елементи для зв'язування з активованим трезилом полігідроксиполімером (пептиди, мітки і т.п.) можна додавати до полігідроксиполімеру при низьких рН, наприклад, при рН 4-5, і дозволяючи їм рівномірно перерозподілитися у "гелі" за допомогою пасивної дифузії. Далі, рН можна підняти до рН 9-10 для запуску реакції основних аміногруп на пептидах і міток з трезильними групами на полігідроксиполімері. Після зв'язування пептидів і, наприклад, імуностимулювальних елементів гель подрібнюють з формуванням частинок відповідного для імунізації розміру. Такий імуноген, таким чином, включає в себе: а) щонайменше одну першу амінокислотну послідовність, одержану з АРР або АД, де щонайменше одна перша амінокислотна послідовність містить у собі щонайменше один В-клітинний і/або щонайменше один СТі--епітоп, і

Б) щонайменше одну другу амінокислотну послідовність, що включає в себе чужорідний епітоп Т- хелперних клітин, де кожна з щонайменше першої і щонайменше другої амінокислотних послідовностей зв'язані з фармацевтично прийнятним активованим гідроксиполімерним носієм.

Для зв'язування амінокислотних послідовностей з полігідроксиполімером звичайно необхідно "активувати" полігідроксиполімер, відповідною реакційною групою, яка може формувати необхідний зв'язок з амінокислотними послідовностями.

Мається на увазі, що термін "полігідроксиполімер" має те ж значення, що і у (МО 00/053161|, тобто полігідроксиполімер може мати точно такі ж характеристики, які конкретно вказані у даній заявці. Отже, полігідроксиполімер може бути водорозчинним або водонерозчинним (таким чином, потребуючи різних стадій синтезу у процесі одержання імуногена). Полігідроксиполімер можна вибрати з природних полігідроксисполук і синтетичних полігідроксисполук.

Конкретні і переважні полігідроксиполімери являють собою полісахариди, вибрані з ацетану, амілопектину, камеді агар-агару, агарози, альгінатів, гуміарабіку, карагенану, целюлози, циклодекстринів, декстрану, фурцеларану, галактоманану, желатину, дпайі, глюкану, глікогену, гуару, Кагауа, копіас/А, смоли плодів ріжкового дерева, манану, пектину, рзуїїйшт, риїшіап, крохмалю, іатагіпе, трагаканту, ксантану, ксилану і ксилоглюкану. Особливо переважним є декстран.

Однак полігідроксиполімер можна також вибрати з сильнорозгалуженого полі(етиленіміну) (РЕЇ), тетратієніленвінілену, кевлару (довгі ланцюги поліпарафенілтерефталаміду), полі(уретанів), полі(силоксанів), полідиметил-силоксану, силікону, полі(метилметакрилату) (РММА), полівінілового спирту), полі(вінілпіролідону), полі(2-гідроксіетилметакрилату), полі(М-вінілпіролідону), полівінілового спирту), полі(акрилової кислоти), політетрафторетилену (РТЕЕ), поліакриламіду, полі(етиленковінілацетату), полі(етиленгліколю) і похідних, полі(метакрилової кислоти), полілактидів (РІГА), полігліколідів (РА), полі(лактидкогліколідів) (РІ. СА), поліангідридів і складних поліортоефірів.

Середня молекулярна маса полігідроксиполімеру, що розглядається (наприклад, перед активацією), звичайно складає щонайменше 1000, наприклад, щонайменше 2000, переважно - у діапазоні 2500-2000000, більш переважно - у діапазоні 3000-1000000, особливо - 5000-500000. У прикладах показано, що полігідроксиполімери із середньою масою у діапазоні 10000-200000 є особливо вигідними.

Полігідроксиполімер переважно є розчинним у воді у концентрації щонайменше 1Омг/мл, переважно, щонайменше 25мг/мл, наприклад, щонайменше 5О0мг/мл, особливо щонайменше 10Омг/мл, наприклад, щонайменше 150мг/мл при кімнатній температурі. Відомо, що декстран, навіть коли активований, як тут описано, задовольняє вимогам розчинності у воді.

Для деяких з найбільш цікавих полігідроксиполімерів співвідношення між групами С (атоми вуглецю) та

ОН (гідроксильні групи) неактивованих полігідроксиполімерів (тобто нативні полігідроксиполімери до активації) знаходиться у діапазоні від 1,3 до 2,5, наприклад, 1,5-2,3, переважно - 1,6-2,1, особливо - 1,85- 2,05. Поза зв'язком з якою-небудь конкретною теорією вважають, що таке співвідношення С/ОН неактивованого полігідроксиполімеру являє собою найбільш вигідний рівень гідрофільності. Полівініловий спирт і полісахариди являють собою приклади полігідроксиполімерів, що задовольняють даній вимозі.

Вважають, що вказане вище співвідношення повинно залишатися приблизно таким же для активованого полігідроксиполімеру, тоді як співвідношення активації повинно бути істотно більш низьким.

Термін "полігідроксиполімерний носій" призначений для позначення ділянки імуногена, яка несе амінокислотні послідовності. Як загальне правило, полігідроксиполімерний носій має свої зовнішні межі, де амінокислотні послідовності можуть розщеплюватися пептидазами, наприклад, у клітині, що представляє антиген, яка процесує імуноген. Отже, полігідроксиполімерний носій може являти собою полігідроксиполімер з активаційною групою, де зв'язок між активаційною групою і амінокислотною послідовністю розщеплюється пептидазами в АРС або гідроксиполімерний носій може являти собою гідроксиполімер з активаційною групою і, наприклад, містком, таким як одиночна І -амінокислота або ряд О- амінокислот, де остання частина містка може зв'язувати амінокислотні послідовності і розщеплюватися пептидазами в АРС.

Як вказано вище, полігідроксиполімери несуть функціональні групи (активаційні групи), що полегшують закріплення пептидів на носії. У даній області відома величезна кількість застосовних функціональних груп, наприклад, трезилова (трифторетилсульфонілова), малеїімідна, пара-нітрофенілхлороформна, бромціанова, тозилова (пара-толуолсульфонілова), трифлілова (трифторметан-сульфонілова), пентафторбензолсульфонілова і вінілсульфонова групи. Переважні приклади функціональних груп відповідно до даного винаходу являють собою трезилові, малеїімідні, тозилові, трифлілові, пентафторбензолсульфонільні, пара-нітрофенілхлороформні та вінілсульфонові групи, серед яких трезилові, малеїмідні і тозилові групи є особливо значимими.

Активовані трезилом полігідроксиполімери можна одержувати із застосуванням трезилхлориду, як описано для активації декстрану у прикладі 1 і МО 00/05316 або як описано у сгедогічцч5 еї аї., 9. Іттипої.

Мей. 181 (1995) 65-73).

Активовані малеіїмідом полігідроксиполімери можна одержувати із застосуванням /пара- малеїімідофенілізоціанату, як описано для активації декстрану у (прикладі З в М/О 00/05316).

Альтернативно, малеїмідні групи можна ввести у полігідроксиполімер, наприклад, декстран, за допомогою дериватизації активованого трезилом полігідроксиполімеру (наприклад, активованого трезилом декстрану (ТАО)) надлишком діамінової сполуки (як правило, НаМ-СаоНоп-МНо, де п складає 1-20, переважно 1-8), наприклад, 1,3-діамінопропану, і, згодом, реакцією введених у ТАЮО аміногруп з реагентами, такими як сукцинімідил-4-(М-малеімідометил)циклогексан-1-карбокислат (5МСОС), сульфосукцинімідил-4-(М- малеїімідометил)циклогексан-1-карбокислат (сульфо5МСС), сукцинімідил-4-(пара-малеімідофеніл)бутират (5МРВ), сульфосукцинімідил-4-(пара-малеімідо-феніл)бутират (сульфоб5МРВ), МІ-у- малеімідобутирилоксисукцинімідні складні ефіри (СМВ5) або М-у-малеімідобутирилоксисульфосукцинімідні складні ефіри. Незважаючи на те, що різні реагенти і шляхи активації формально приводять до продуктів, які дещо відрізняються, активованих малеіїмідом відносно зв'язку між функціональністю малеїіміду і залишковою вихідною гідроксильною групою, на якій проводили активацію, всі їх разом і окремо можна розглядати як "активовані малеїмідом полігідроксиполімери".

Активовані тозилом полігідроксиполімери можна одержувати із застосуванням тозилхлориду, як описано для активації декстрану у (прикладі 2 у УМО 00/05316). Полігідроксиполімери, активовані трифлілом і пентафторбензолсульфонілом, одержують як аналоги, активовані тозилом або трезилом, наприклад, із застосуванням відповідних кислих хлоридів.

Активовані бромціаном полігідроксиполімери можна одержувати шляхом реакції полігідроксиполімеру з бромціаном із застосуванням традиційних способів. Одержувані функціональні групи звичайно являють собою складні ефіри ціанової кислоти з двома гідроксильними групами полігідроксиполімеру.

Ступінь активації можна виразити як співвідношення між вільними гідроксильними групами і активаційними групами (тобто гідроксильними групами, що стали функціональними). Вважають, що співвідношення між вільними гідроксильними групами полігідроксиполімеру і активаційними групами для одержання вигідного балансу між гідрофільністю і реактивністю полігідроксиполімеру повинно складати від 250:1 до 4:1. Переважно співвідношення складає від 100:1 до 61, більш переважно - від 60:1 до 871, особливо - від 40:1 до 10:1.

Особливо цікаві активовані полігідроксиполімери для застосування у способі для одержання застосовного у більшості випадків імуногена відповідно до винаходу являють собою активовані трезилом,

тозилом і малеїмідо полісахариди, особливо активований трезилом декстран (ТА), активований тозилом декстран (То5АО) і активований малеїімідо декстран (МАБ).

Переважно, щоб зв'язок між полігідроксиполімерним носієм і зв'язаними з ним амінокислотними послідовностями розщеплювався пептидазами, наприклад, такими як пептидази, активні при процесингу антигенів в АРС. Отже, переважно, щоб щонайменше перша і щонайменше друга амінокислотні послідовності зв'язувалися з активованим полігідроксиполімерним носієм за допомогою амідного або пептидного зв'язку. Особливо переважно, щоб кожна з щонайменше першої і щонайменше другої амінокислотних послідовностей надавала азотну групу для амідного зв'язку, що відповідає їй.

Полігідроксиполімерний носій може не містити амінокислотних залишків, якщо потрібно, щоб активаційна група надавала частину зв'язку, що розщеплюється пептидазою, але, як вказано вище, носій може просто включати в себе спейсер, включаючи в себе щонайменше одну І-амінокислоту. Проте щонайменше перша і щонайменше друга амінокислотні послідовності звичайно зв'язуються з активованим варіантом полігідроксиполімеру за допомогою азоту на М-кінці амінокислотної послідовності.

Описаний вище імуноген, який застосовується у більшості випадків, відповідно до даного винаходу можна застосовувати у способах імунізації, по суті, як тут описано, для поліпептидних вакцин. Тобто всі описи, які обговорюються тут, що відносяться до доз, способів введення і складу поліпептидних вакцин для знижувальної регуляції амілоїдогенних поліпептидів з відповідними змінами використовують для звичайно застосовуваних імуногенів.

Звичайно застосовуваний безпечний спосіб вакцинації

Як обговорювалося вище, одне з переважних здійснень даного винаходу спричиняє застосування варіантів амілоїдогенних пептидів, нездатних надати власні Тн-епітопи, здатні керувати імунною відповіддю проти амілоїдогенного поліпептиду.

Однак автори даного винаходу вважають, що ця стратегія для розробки аутовакцин і для виклику аутоїмунітету являє собою застосовну у більшості випадків технологію, яка є об'єктом винаходу сама по собі. Потрібно вважати особливо зручним випадки, коли шуканий для знижувальної регуляції аутоантиген знаходиться в організмі в істотному надлишку, так що можливо, що може відбутися аутостимуляція імунної відповіді. Отже, всі наведені вище описи даного здійснення, оскільки це відноситься до забезпечення аутоїмунної відповіді проти АРР або АВ, з відповідними змінами, застосовні до імунізації проти власних поліпептидів, особливо тих, які представлені в істотних кількостях, щоб підтримувати імунну відповідь у формі неконтрольованого аутоїмунного стану внаслідок того, що Тн-епітопи відповідних власних білків направляють імунну відповідь.

Приклад 1

Підхід аутовакцинації для імунізації проти АЮ

Той факт, що миші, які характеризуються нокаутом гена білка АД, не виявляють ніяких відхилень або несприятливих побічних ефектів, вказує на те, що усунення або зменшення кількостей АД є безпечним, (Апепо Н. (1996)).

Опубліковані експериментальні дані, де трансгенних тварин імунізували проти трансгенного білка Ар людини, вказують на те, що якщо можливо порушити аутотолерантність, то знижувальну регуляцію Ар можна одержати за допомогою аутореактивних антитіл. Дані експерименти, крім того, вказують на те, що така знижувальна регуляція АД потенційно могла б як запобігати формуванню бляшок, так і очищати головний мозок від Ар-бляшок, що вже сформувалися, |пор. ЗспепкК еї аї. (19991). Однак звичайно неможливо одержати антитіла проти власних білків.

Таким чином, опубліковані дані не надають способів порушення істинної аутотолерантності по відношенню до істинних власних білків. Дані не дають також інформації про те, як можна переконатися у випадку необхідності, що імунна реакція направлена виключно або переважно проти відкладень Ар, а не проти зв'язаного з клітинною мембраною білка-попередника АД (АРР). Імунна відповідь, яку одержують за допомогою існуючої технології, буде переважно викликати імунну відповідь по відношенню до власних білків нерегульованим чином, так що можна одержати небажану або надмірну аутореактивність по відношенню до ділянок білка АД. Отже, із застосуванням існуючих стратегій імунізації, швидше всього, неможливо одержати сильні імунні відповіді по відношенню до власних білків; більш того це небезпечно через потенційну сильну перехресну реактивність по відношенню до зв'язаного з клітинною мембраною

АРР, який присутній у великій кількості клітин ЦНО.

У даному винаході надані способи ефективного вироблення сильної імунної відповіді по відношенню до істинних власних білків, які потенційно можуть формувати бляшки і викликати серйозне захворювання ЦНС або інших частин організму. Із застосуванням даної технології буде розроблена безпечна і ефективна терапевтична вакцина на основі білка АД для лікування АЮ.

У світлі цього, можна очікувати, що АбО, захворювання, яке за прогнозами могло завдати шкоди системі охорони здоров'я у наступному сторіччі, можна вилікувати; або такі описані вакцини можуть щонайменше створювати ефективний терапевтичний підхід до лікування симптомів і прогресії даного захворювання.

Даний спосіб являє собою абсолютно новий імунологічний підхід до блокування накопичення амілоїду при

АВ, а також при інших неврологічних захворюваннях.

У таблиці нижче вказано 35 конструкцій, що розглядаються. Всі позиції подані у таблиці відносно стартового метіоніну АРР (перша амінокислота у 5ЗЕО ІЮ МО:2) і включають як стартову, так і кінцеву амінокислоти, наприклад, фрагмент 672-714 включає як амінокислоту 672, так і 714. Стартові і кінцеві положення для Р2 і РЗО показують, що епітоп заміщає частину фрагмента АРР у вказаних положеннях (обидва положення включені у заміну), у більшості конструкцій введені епітопи заміщають фрагмент, що дорівнює по довжині епітопу. Зірочки у таблиці означають наступне: 5) Тільки одне положення для Ра і РЗО вказує на те, що у даному положенні епітоп вставляли у похідне

АРР (епітоп починається з амінокислоти, що примикає до вказаного положення з боку С-кінця). 5) Конструкція 34 містить три ідентичних фрагменти АРР, розділених за допомогою РЗО і Рг, відповідно. яю) Конструкція 35 містить дев'ять ідентичних фрагментів АРР, розділених за допомогою епітопів РЗО і

Р2, що чергуються.

Конструкції АРР Ашо Мас

Початок фрагмента | Кінець фрагмента Я Положення епітопу

АРР АРР АРР

3 | .юЮюКМ,вб/2 | 77рюрюИюИюию | 735749, | 714728. | 99 4 | .Ююрюп6вл | |1111111717171717171С1С1С1С1 4728799 | щЦщРб/2 | 77/71 ро 7-78 |77777171717171111111111111р99 6 | .щюЮщКХ бла | 7777/7770 | 7777/7231 |11717171ста3 | 135 7 | 77717672 | 77770 | 77777777 .рДИДИДЮИЮИСста3 | го 8 | юЮющ 6/2 | .-.ЮюЮюЮИи |та |1117|1ф ма 9 | юЮющ 6/2 | -ХБ 4 |. 777777777С7С7С7С7С7С7С7С7|77717ДДс6ує рова | 77777672 | 777774 |77777777777777777171717171177171711 ле 1 ших ши т и пи С ПО: Р НЯ ПО ПО с ХНН 712 | вл |. |про 14 | 62 | 74 | 680-694 | -::К ...//О| 43 14 | 672 | 714 | 685-799,.474Й | 2 .ЮЙ.К.:./км6ни/ | 43 716 | ЮК, 6/2 | 7/4 | 690704 | .....СьКк | 4 17 | ...юрю6/2 | ри | 695-709. | .ЙЮЙЮЙЮюЮюЮюиИ7| аз 18 | ..ЮюЮю«Й6бл2 | 7777/7477 675-695..ЮДЦ(| 43 19 | ЮК 62 | 77/74 | 777777И7ИЮИюИюИЮИЮИЮИЮИД1С117116во-700 |з | ЮК, 6/2 | р/р |177777717171717171ИСИСИюИюЮСНСНСН111685-705..ЙЮДГЦ( | 43 21 | ЮК 6/2... | ..ДЮДЮДЮИсплла 17 7777777171717171717171717СДСДСДС1С11116оо-ио |з 26 | - бла | о 774 | 777777ЮюЮю/7/7Юм7 6111714 27 | «672 | 74 | 777777Ю7Ю7ЮС71|Е.рДИДИ1 во |в 28 | щющЦХ, 6/2 | 77/74 |17717111717171717111111111111т7ои1111 рова 29 | Б 6/2 | 74 |; 77777771 рова | .-.ХГУ(бл2 | 77/74 | 7777 68717711 ших шт и пох СЕ ПО С ЕТНО ОПО ПО с ЗНН 32 | - 6/2 | 77/41 11111111111111111ровв 33 | бл | 7/4 77711111 11111111

Ділянка АРР, проти якої найбільш цікаво одержати відповідь, складає 43 амінокислоти корового пептиду АД (АД-43, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:2, залишки 672-714), який є основною складової амілоїдних бляшок у головному мозку при АЮ. Даний фрагмент АРР є частиною всіх перерахованих вище конструкцій.

Варіанти 1 і 2 містять ділянку АРР проти ходу транскрипції від Ар-43, де помістили модельні епітопи Ра і

РЗО. Всі варіанти 1 і 3-8 містять фрагмент С-100, що є, як показано, нейротоксичним - фрагмент С-100 відповідає амінокислотним залишкам 714-770 з 5ЗЕО ІЮО МО:2. У варіантах 3-5 епітопи заміщають частину фрагмента С-100, у той час як у варіантах 6-8 епітопи вставляли у С-100.

Варіанти 9-35 містять тільки коровий білок Ар-43. У варіантах 9-13 Р2 і РЗО злиті з тим або іншим кінцем

Ар-43; у 14-21 Р2 і РЗО заміщають частину Ар-43; у 22-33 Р2 і РЗО вставляли в Ар-43; 34 містить три ідентичних фрагменти Ар-43, розділених РЗО і Рг, відповідно; 35 містить 9 повторів Ар-43, розділених епітопами Ра і РЗО, що чергуються.

Відповідно до даного винаходу, в імуногенних аналогах можна також застосовувати укорочені частини білка АД-43, що обговорюється вище. Особливо переважними є укорочені частини АД(1-42), АДР(1-40), АД(1- 39), Ар(1-35), АД(1-34), Ар(1-28), Ар(1-12), Ар(1-5), АД(13-28), Ар(13-35), Ар(17-28), Ар(25-35), Ар(35-40),

Ар(36-42), і Ар(35-42) (де номери у дужках вказують амінокислотні ділянки Ар-43, які складають відповідний фрагмент, наприклад, Ар(35-40) ідентичний амінокислотам 706-711 у 5ЕО ІЮ МО:2). Всі дані варіанти з укороченими частинами АрД-43 можна одержати з фрагментами АД, описаними тут, особливо з варіантами 9, 10,11,12, і 13.

У деяких випадках переважно, щоб Ар-43 або його фрагменти були мутантними. Особливо переважними є варіанти заміни, в яких метіонін у положенні 35 Ар-43 заміщений переважно на лейцин або ізолейцин або просто видалений. Особливо переважні аналоги містять одиночний метіонін, розташований на С-кінці, або у зв'язку з тим, що він є природним в амілоїдогенному поліпептиді або чужорідному епітопі

Тн, або у зв'язку з тим, що його вставили або додали. Отже, також переважно, щоб та ділянка аналога, яка включає в себе чужорідний епітоп Тн, була вільною від метіоніну, за винятком можливого С-кінцевого розташування метіоніну.

Фактично, як правило, переважно, щоб всі аналоги АРР або Ар, які застосовують відповідно до даного винаходу, володіли загальною характеристикою простого включення одного-єдиного метіоніну, розташованого в аналогу як С-кінцева амінокислота, а всі інші метіоніни як в амілоїдогенному поліпептиді, так і в чужорідному епітопі Тн, були видалені або заміщені іншою амінокислотою.

Цікавою додатковою мутацією є делеція або заміщення фенілаланіну у положенні 19 в АРД-43, і особливо переважно, щоб дана мутація являла собою заміну цього залишку фенілаланіну на пролін.

Наступна таблиця визначає групу особливо переважних конструкцій, що функціонують з укороченими формами або мутаціями Ар-43: мене ве Хе | МЕШКО ДЕ

Ме варіанта| застосовується у молекулі, АР відносно 1 ак Р2 відносно 1 ак РЗО відносно 1 ак довжина відносно 1 ак АД (1-42/43) молекули молекули молекули молекули (ак)

У даній таблиці сегмент АД, що використовується у молекулі, вказаний за допомогою номерів амінокислот відносно 1 ак молекули АД (1-42/43), тобто 1-28 означає, що у молекулі використали фрагмент

АВ (1-42/43) 1-28. Якщо використали два або більше різних фрагментів, у таблиці вказані обидва, тобто 1- 12 (а)-13-28 (р) означає, що у молекулі використаний як фрагмент Ар (1-42/43) 1-12, так і фрагмент 13-28.

Також якщо один і той же сегмент присутній у конструкції більш ніж в одній копії, це вказано у таблиці, тобто 1-12 (х3) вказує на те, що фрагмент АД (1-42/43) 1-12 присутній у конструкції у трьох копіях.

Далі, положення сегмента АД у молекулі вказане за допомогою позицій амінокислот відносно першої амінокислоти у молекулі, тобто 22-49 вказує на те, що фрагмент АД, який розглядається, розташований у молекулі від 22 амінокислоти до 49 амінокислоти, включаючи обидва положення. Положення епітопів Р2 і

РЗО позначені таким же чином. Якщо у молекулі використали два або більше різних фрагментів АД, всі їх положення вказані, тобто 1-12 (а)-49-64 (р) означає, що фрагмент (а) розташовується у молекулі від ак 1 до ак 12, і фрагмент (Б) - від ак 49 до 64.

Більш того якщо у молекулі присутня більш ніж одна копія одного і того ж фрагмента, вказані положення всіх копій, тобто 1-12, 34-45, 61-72 показує, що три копії фрагмента АД розміщуються у молекулі у положеннях 1-12, 34-45 і 61-72, відповідно.

Нарешті, зазначення сумарної довжини кожної молекули включає і фрагмент(и) АД, і епітопи Р2 і РЗО.

Варіант 42 містить дві амінокислотні заміни у положеннях 19 (рпе на рго) і 35 (теї на уз), як це вказано у стовпці, що представляє фрагменти Ар.

Див. Фігуру 1 і таблиці вище відносно деталей конкретних точок введення чужорідних Т-клітинних епітопів.

Один з додаткових типів конструкцій є особливо переважним. Оскільки однією із задач даного винаходу є уникнення руйнування клітин, що продукують АРР, в той час як усунення Ар є бажаним, вважається придатним одержати конструкції аутовакцин, що включають в себе тільки ті частини Ар, які, коли присутні в

АРР, не експонуються у позаклітинній фазі. Таким чином, подібні конструкції повинні містити щонайменше один В-клітинний епітоп, одержаний з амінокислотного фрагмента, що визначається амінокислотами 700- 714 в 5ЕО ІЮ МО:2. Оскільки передбачено, що такий короткий поліпептидний фрагмент буде тільки слабо імуногенним, переважно, щоб така конструкція аутовакцини складалася з декількох копій В-клітинного епітопу, наприклад, у вигляді конструкції, що має структуру, показану у формулі 1 в докладному описі даного винаходу, пор. вище. У даній версії формули 1 терміни амілоїдеї-амілоїдех являють собою х В- клітинний епітоп, що містить послідовність амінокислот, одержану з амінокислот 700-714 5ЕО ІЮ МО:2.

Переважна альтернатива являє собою детально описану вище можливість зв'язування амілоїдогенного (полізупептиду з вибраним Т-хелперним епітопом за допомогою амідного зв'язку з полісахаридною молекулою-носієм, таким способом стають можливими множинні презентації "слабкого" епітопу, сконструйованого амінокислотами 700-714 5ЕО ІЮ МО:2, а також стає можливим вибір оптимального співвідношення між В-клітинними і Т-клітинними епітопами.

Приклад 2

Імунізація трансгенних мишей Ар і модифікованими білками відповідно до винаходу.

Конструювання ДНК, що кодує ПАВ43--34. Ген пПАВ43--34 конструювали у декілька стадій. Спочатку одержували фрагмент ПЛР з праймерами МЕМе801 (5ЕБЕО 0 МО:10) і МЕМ»802 (5ЕО 10 МО-:11), застосовуючи як матрицю праймер МЕМе800 (ЗЕО 10 МО:9). МЕМе800 кодує фрагмент ареїа-43 людини з оптимізованими для Е. соїї ко донами. МЕМе801 і 802 додають до фрагмента відповідні ділянки рестрикції.

Фрагмент ПЛР очищали, розщеплювали Мсої! і Ніпаїїї, знову очищали і клонували у розщепленому Меоі1-

Ніпа ії очищеному векторі для експресії в Е. соїї РЕТ28рь. Одержану плазміду, що кодує АрД-43 дикого типу людини, назвали рАВ'1.

На наступній стадії до С-кінця молекули додавали Т-хелперний епітоп Р2. Праймер МЕМе806 (5ЕО ІЮ

МО:12) містить послідовність, що кодує епітоп Р2, таким чином, продукт злиття Ра і ареба-43 одержують за допомогою реакції ПЛР.

Клонування проводили за допомогою одержання фрагмента ПЛР з праймерами МЕМе178 (5ЕО ІЮ

МО:8) і МЕМо806, застосовуючи як матрицю рАВІ1. Фрагмент очищали, розщеплювали Місої і Ніпа, знову очищали і клонували у розщепленому Мео1І-Ніпа!й і очищеному векторі рЕТ28р. Одержану плазміду назвали рАВ2.

Аналогічним способом одержували іншу плазміду, яка несе кодувальну послідовність Ар-43 з іншим Т-

хелперним епітопом, РЗО, доданим до М-кінця. Це виконували за допомогою одержання фрагмента ПЛР з праймерами МЕМе105 (ЗЕО ІЮ МО:7) і МЕМо807 (5ЕО ІО МО:13), застосовуючи як матрицю рАВІ1.

Фрагмент очищали, розщеплювали Месої і Ніпаїї, знову очищали і клонували у розщепленому Меоі1-

Ніпа ї очищеному векторі рЕТ28р. Одержану плазміду назвали рАВ3З.

На третій стадії другий повтор Ар-43 з С-кінця додавали до епітопу Р2 плазміди рАВ2 за допомогою праймера МЕМо809 (5ЕО 10 МО:14). У той же час МЕМо809 створює сайт Ватні безпосередньо після повтору Ар-43. Фрагмент ПЛР одержували з праймерами МЕМе178 і МЕМе809, застосовуючи як матрицю рАВ2. Фрагмент розщеплювали МІсої і Ніпа|І, очищали і клонували у розщепленому Месо1-Ніпа!й їі очищеному векторі рЕТ28р. Дану плазміду назвали рАВаА.

Нарешті, послідовність епітоп РЗО - повтор Ар-43 з рАВЗ клонували у плазміду рАВ4. Це виконували за допомогою одержання фрагмента ПЛР з праймерами МЕМе811 (ЗЕО ІЮ МО:16) і МЕМе105, застосовуючи як матрицю рАВЗ. Фрагмент очищали і використовували як праймер у подальшій ПЛР з МЕМе810 (ЗЕО І

МО:15), застосовуючи як матрицю рАВЗ. Одержаний фрагмент очищали, розщеплювали Ватні і Ніпай! і клонували у розщеплену Ватні-Ніпа| ії очищену плазміду рАВ4. Одержана плазміда, рАВ5, кодує молекулу

БАВ4З3-34.

Всі способи ПЛР і клонування по суті виконували, як описано в (Затогоок, ., Егіїзсп, Е.Е. «5 Мапіаї5, Т. 1989 "МоіІесшаг сіопіпд: а Іарогаюгу тапиаї!". 2па. Ед. Соїа Зріїпд Нагбог І арогаюгу, М.М).

Для всіх способів клонування застосовували клітини Е. соїї К-12, штам Тор-10 ЕЕ" (Зігаїадепе, ОА).

Вектор рЕТ28р- одержували в Момадеп, О5А. Всі праймери синтезували у ОМА Тесппоіоду, Оептагк.

Експресія і очищення ПАВ43--34. Білок ПАВ43--34, що кодується рАВ5, експресували у клітинах Е. соїї

ВІ 21-Соїд (Момадеп) як описано виробниками системи рЕТ28р-- (Момадеп).

Експресований білок БАВ43--34 очищали до більш ніж 8595 чистоти за допомогою промивання тілець включення з подальшою катіонообмінною хроматографією у присутності 6М сечовини із застосуванням автоматизованого робочого місця для очищення ВіоСай (РегЗеріїме Віозузіет5, БА). Потім сечовину видаляли за допомогою ступінчатого діалізу проти розчину, що містить кількості сечовини, які зменшуються.

Кінцевий буфер являв собою 10мМ Ттгіз, рн 8,5.

Дослідження імунізації. Для дослідження використовували мишей, трансгенних по АРР (білок- попередник хвороби Алидгеймера) людини. Дані миші, які називаються ТОАЕМОд8», експресують мутантну форму АРР, що приводить до високих концентрацій Ар-40 і Ар-42 у головному мозку мишей Юапив, С. еї а/.|.

Мишей (8-10 мишей у групі) імунізували або Ареїа-42 (5ЕО ІЮ МО:2, залишки 673-714, синтезованим за допомогою стандартного способу з Етос), або варіантом ПАВ4А43---34 (конструкція 34 у таблиці в прикладі 1, одержана рекомбінантним способом) чотири рази з двотижневими інтервалами. Дози складали 100мг для

Ар або 50мг для ПАВ43--34. У мишей брали кров на 43 добу (після трьох ін'єкцій) і після 52 діб (після чотирьох ін'єкцій), і для визначення рівня специфічних титрів антитіл проти Ар-42 із застосуванням прямого

БСІЗА АД-42 використовували сироватку.

Наступна таблиця показує середні відносні титри антитіл проти Абеїа-42.

Як стає зрозуміло, титри антитіл, одержані при імунізації варіантом АД пАВ43--34, вище приблизно у 4 рази і в 7,5 разів після З і 4 імунізацій, відповідно, ніж титри, одержані із застосуванням як імуногена незміненого АД-42 дикого типу. Даний факт у перспективі можна оцінити додатково, якщо брати до уваги той факт, що кількість варіанта, який застосовується для імунізації, складає тільки 50905 від кількості послідовності дикого типу, що застосовується для імунізації.

Приклад З

Синтез АД співполімерної пептидної вакцини із застосуванням активованого полігідроксиполімеру як агента, що структурує.

Вступ. Традиційна кон'югована вакцина складається з (полі)пептиду, ковалентно зв'язаного з білком- носієм. Пептид містить В-клітинний(і) епітоп(и), а білок-носій надає Т-хелперні епітопи. Однак більшість білків-носіїв у нормі є непридатними як джерела Т-хелперних епітопів, оскільки тільки незначна частина всієї послідовності містить придатні Т-хелперні епітопи. Такі епітопи можна визначити і синтезувати як пептиди, наприклад, по 12-15 амінокислот. Якщо дані пептиди ковалентно зв'язані з пептидами, які містять

В-клітинні епітопи, наприклад, за допомогою полівалентного активованого полігідроксиполімеру, можна одержати молекулу вакцини, яка містить тільки значимі ділянки. Надалі можна одержати вакцинний кон'югат, який містить оптимізоване співвідношення між В-клітинними і Т-клітинними епітопами.

Синтез активованого полігідроксиполімеру. Полігідроксиполімери, такі як декстран, крохмаль, агароза і т.д. можна активувати 2,2,2-трифторетансульфоніл-хлоридом (трезилхлоридом) або за допомогою гомогенного синтезу (декстран), розчиненим у М-метилпіролідоні (ММР) або способом гетерогенного синтезу (крохмаль, агароза, структурований декстран), наприклад, в ацетоні.

У сухих умовах в 500мл круглодонну колбу, обладнану магнітом для перемішування, до висушеного виморожуванням, водорозчинного декстрану (4,5г, 8З3моль, очищений до ступеня, придатного для клінічного застосування, Му" (середи.) 78000) додавали 225мл сухого М-метилпіролідону (ММР). Колбу поміщали у масляну баню з температурою 60"С з магнітним перемішуванням. Температуру підіймали до 92"С на період більше 20хв. При розчиненні декстрану колбу зразу ж видаляли з масляної бані, і температуру у бані знижували до 40"С. Колбу знову поміщали у масляну баню, все ще з магнітним перемішуванням, і по краплях додавали трезилхлорид (2,7б4мл, 25моль). Через 15хв. по краплях додавали сухий піридин (безводний, 2,020мл, 25моль). Колбу видаляли з масляної бані і проводили перемішування протягом 1 години при кімнатній температурі. Продукт (декстран, активований трезилом, ТАЮ) осаджували в 1200мл холодного етанолу (99,995). Супернатант зливали і осад збирали в 50Омл поліпропіленові пробірки. у центрифузі при 2000об./хв. Осад розчиняли в 50мл 0,595 оцтовій кислоті, 2 рази діалізували проти 5000мл

0,595 оцтової кислоти і сушили виморожуванням. ТАЮО можна зберігати при -20"С у вигляді висушеного виморожуванням порошку.

Нерозчинний полігідроксиполімер, такий як агароза або структурований декстран, можна активувати трезилом за допомогою приготування суспензії полігідроксиполімеру, наприклад, в ацетоні, і проведення синтезу у вигляді твердофазового синтезу. Активований полігідроксиполімер можна зібрати за допомогою фільтрації. Відповідні способи опубліковані, наприклад, у (Міїз5оп К апа Мозрасп К (1987), Мешпоаз іп

Еплутоїіоду 135, р.67, і в Неппапезоп СТ еї аї. (1992), іп "Іттобіїїгеа Айіпйу Гідапа Тесппідце5", Асадетіс

Ргезв, Іпс., р.87|.

Синтез співполімерних пептидньїх вакцин А Веїа. ТАЮО (10мг) розчиняли в 1ОО0мкл НгО і 1000Омкл карбонатного буфера, рН 9,6, що містить 5мг АД-42 (5БЕО ІЮ МО:2, залишки 673-714), 2,5мг Р2 (ЗЕО ІЮ

МО:4) і додавали 2,5мг РЗО (ЗЕО ІЮО МО:6). Всі пептиди, Ар-42, Р2 і РЗО, містили захищені лізинові групи: вони знаходилися у формі лізинових груп, захищених 1-(4,4-диметил-2,6б-діоксоциклогекс-1-іліден)етилом (рає). Пептиди одержували стандартним способом з Гтос, де стандартний Етос-І уз(Вос)-ОН заміщали на

Етос-І ув(Оає)-ОН (одержано в Момабіоспет, кат. Ме04-12-1121), тобто є-аміногрупу лізину захищали Оае замість Вос.

Вимірювали величину рН і доводили до 9,6 за допомогою 1М НС. Через 2,5 години при кімнатній температурі додавали гідразин з 8095 розчину до кінцевої концентрації гідразину 895, інкубували розчин ще

ЗОхв. при кімнатній температурі, і зразу ж після цього сушили виморожуванням. Висушений виморожуванням продукт розчиняли в Нео і діалізували значною мірою проти НгО перед кінцевим сушінням виморожуванням.

Співвідношення між В-клітинними епітопами (АД) і Т-хелперними епітопами (Р2 і РЗО) у кінцевому продукті можна варіювати, застосовуючи різні концентрації цих пептидів на стадії синтезу. Більш того у кінцевий продукт можна ввести мітку, наприклад, манозу (як мішень для кон'югації з АРС) за допомогою додавання амінованої манози до карбонатного буфера на стадії синтезу.

Якщо застосовують нерозчинний активований полігідроксиполімер, щоб зв'язувати пептиди, які містять

В-клітинний епітоп і Т-хелперні епітопи, зв'язування з полімером можна проводити як твердофазовий синтез, а кінцевий продукт збирають і очищають шляхом промивання і фільтрації.

Як вказано в основному описі, описаний у даному документі підхід для одержання вакцини на основі пептидів можна застосовувати для будь-якого іншого поліпептидного антигену, де буде зручно одержувати чисту синтетичну пептидну вакцину, і де поліпептидний антиген, що розглядається, забезпечує достатню імуногенність в одному окремому пептиді.

Приклад 4

Синтетичні співполімерні пептидні вакцини

ТАО (10мг) розчиняли в 100мкл НгО і 1000О0мкл карбонатного буфера, рН 9,6, що містить 1-5мг пептиду

А (будь-якого імуногенного пептиду, що представляє інтерес!), додавали 1-5мг Р2 (епітопу Р2 дифтерійного анатоксину) і 1-5мг РЗО (епітопу РЗО дифтерійного анатоксину). Вимірювали величину рн і доводили до 9,6, використовуючи 0,1М НОСІ.

Після 2,5 годин при кімнатній температурі розчин потім зразу ж висушували виморожуванням.

Висушений виморожуванням продукт розчиняли в НгО, і перед кінцевим сушінням виморожуванням значною мірою діалізували проти НгО або видаляли солі гель-фільтрацією на колонці. У випадку наявності лізину у послідовності пептидів, є-амін у бічному ланцюгу лізину потрібно захистити за допомогою БОаєе із застосуванням у синтезі похідного Етос-І ув(Оае)-ОН (запропонований Сгедогіи5 апа Тпеізеп 2001). Після зв'язування додавали гідразин з 8095 розчину до кінцевої концентрації гідразину у межах 1-2095, та інкубували розчин ще ЗОхв. при кімнатній температурі, після цього зразу ж проводили сушіння виморожуванням, і перед кінцевим сушінням виморожуванням значною мірою діалізували проти НгО або видаляли солі шляхом гель-фільтрації на колонці. Принцип у схематичній формі викладений на Фігурі 2.

Як "пептид А" автори даного винаходу використовували такі імуногени як імуногени з коротким С- кінцевим фрагментом білка О5рс з Вогтеїїа ригддопегі, а як "пептид В" - з епітопом дифтерійного анатоксину (Р2 або РЗ0). Результати досліджень імунізації цим антигеном виявили, що тільки імуноген відповідно до винаходу, який включає в себе фрагмент О5рс і чужорідний дифтерійний епітоп, що відповідає гаплотипу

МНС вакцинованих мишей, був здатний індукувати у цих мишей антитіла, які реагують з О5рс. Навпаки, молекула, що містить тільки пептид О5рсС, була нездатна індукувати продукцію антитіл, і те ж саме було справедливим для суміші 2 імуногенів, де один містив О5рс, а інший - епітоп. Тому зроблений висновок, що включення в один і той же полігідроксиполімерний носій є кращим, якщо не невід'ємним, для індукції продукції антитіл проти короткого пептидного гаптену, подібного до О5рс.

Список посилань 1. ВгооКтеуег, К.; огау, 5.; Каула5, С. (1998). Ргоздесіоп5 ої АІ27пеітег5 Оібзеазе іп Ше Опілей 5іагез апа те

Рибіїс Неайй Ітрасі ої ОєїЇауіпуд Оізеазе Опгеї. Атегісап уоигтпаї ої Рибріїс Неайй, 88(9), 1337-1342. 2. Вийціпі, МІ; Оп, М.; Веїовгіа, 5.; АКееїє, Н.; Ріїаз, В.Е.; МУузв-Согау, Т.; Миске, Г.; Мапйіеу, Б.МУ. (1999).

Ехргезвіоп ої Нитап Ароїїроргоїєїп ЕЗ ог Е4 іп Ше Вгаїпе ої Арое-/- Місе: Ізотопт-Зресійс ЕНесів оп

Меигодедепегайоп. Ууоитаї ої Меигозсіепсе, 19, 4867-4880.

З. Сак, І.М.; Роогкаї, Р.; Му520іек, 7.; Сезспуліпа, О.Н.; Мазгедаїіпе, 2.5.; МіШег, В.; і, О.; Рауаті, Н.; Аухеїї,

Е.; Магкороціои, К; Апагеаді5, А.; 0'Зоцила, І.; Гее, М.М.; Кееа, Г.; Тгодапомув5кі, 9.0. 2пиКагема, М.; Віга, Т.;

ЗспеїПепрего, сх.; УМІНеітвеп, К.С. (1998). Раїйодепіс Ітріїсайопе ої Мшиїанйопз т Ше Тай Сепе іп Раїїїдо-

Ропіо-Мідга! Оедепегайоп апа ВРеїаїєа Меигодедепегаїйме Оізогаєгз І іпкеа ю Спготозоте 17. Ргосеєадіпдв ої

Ше Маїйопаї! Асадету ої Зсіепсез ).5.А., 95(22), 13103-13107. 4. сиріа, В. К. єї а. (1998), Оєм Віо! бгапа. 92: 63-78. 5. Нзіао К. еї аї. (1998) «Тгапздепіс тісе ехргез5іпд АІ2пеїтег ату!оїа ргесигзог ргоїеіп5», Ехр. Сегопіої. 33(7 - 8). 883-889. 6. Ницоп, М.; І епдоп, С.І..; Віг7и, Р.; Вакег, М.; Еговїїсн, 5.; Ноцідеп, Н.; Ріскегіпд-Вгомп, 5.; СпаКгамепу, 5.;

Ізаас5, А.; огомег, А.; НаскКей, .; Адатвзоп, 9.; Сіпсо!п, 5.; Юіскзоп, О.; ЮОаміев, Р.; Реїегзеп, К.С.; Біемеп5, М.; де Стаай, Е.; Машегв, Е.; мап Вагеп, 4.; НіПебгапа, М.; доовве, М.; Кмоп, У.М.; Момоїпу, Р.; Спе, Г.К.; Мопоп,

У.; Могттів, 9У.0.; Неєд, .Е.; Тго)дапомузкі, 9У.; Вазип, Н.; І аппієїй, Г.; Меузіаї, М.; Рапп, 5.; Оагк, Е.; Таппепрего,

Т.; Осда, Р.; Наужмага, М.; Кж'ок, У.В.9У.; Зспопйеїй, Р.К.; Апагеадів, А.; Зпом/деп, 9. Стацштига, О.; Меагу, 0.;

Омеп, Е.; Оо5іга, В.А.; Нагау, .; соаге, А.; мап Зулеїеп, 9.; Мапп, 0.; СГупси, Т.; Нешіпк, Р. (1998). Аз5зосіайоп ої Міззепве апа 5'-5ріїсе-5Не Миїайопвз іп Тай мн Ше Іппепеа ОЮОетепіїа ЕТОР-17. Маштге, 393, 702-705. 7. Учапив, С еї а. (2000), Маїиге 408: 979-982. 8. Кав, Н.5. (1997) У Містоепсарвзи! 14: 689-711. 9. І еоп, у).; Спепо, С.К.; Меитапп, Ру. (1998). АІ2пеїтегз Оізєазе Саге:Совзів апа Роїепіа! Заміпд5. Неаїт

АнНаїгв, 17(6), 206-216. 10. Прра С. Р. єї а. (1998) Ар-42 аерозійоп ргеседез5 оїшйег спапдев іп РБ-1 АІ2Неітегз аїзеазе. І апсеї 352, 1117-1118. 11. (по, 9.-).; МмаПасе, МУ.; Кіссіопі, Т.; Іпдгат, О.К. Коїп, 05.5.; Кивіак, УМ. (1999). Оеан ої РС 12 СеїІ5 апа

Нірросатра! Мецйгоп5 Іпдисеа Бу Адепо-міга!-Медіаїа БА Нитап Атуюій Ргесигзог Ргоїєїп Сепе

Ехргезвіоп. Чоштпаї ої Меигозсієпсе Незеагсп, 55(5), 629-642. 12. Магизе, 5.; Тпіпакагап, (х.; І 00, 9.-у.; Кивіак, УМ; Тотйа, Т.; Імаїзибро, Т.; Оіап, Х.; сіпу, 0.0.; Ргісе, О.Ї...;

Вогепеїї, О.А.; УМопод, Р.С.; бізодіа, 5.5. (1998). ЕмКесів ої РОТ Оєйсієпсу оп Метбгапе Ргоїєїп Тганіскіпд іп

Мешйгопв. Мешгоп, 21(5), 1213-1231. 13. Маїййопаї Іп5ійше оп Адіпд Ргодгез5 Керогі оп АІ27пеітегз Оізеазе, 1999, МІН Рибіїсайоп Мо 99-4664. 14. Ріекороп, РУ). (1995), Рнагт Віоїгесппої. 6: 347-61 Роогкаї, Р.; Віга, Т.0.; УМі)зтап, Е.; Метепв, Е.; Схатию,

А.М.; Апаегзоп, 1.; Апагеадіз, А.; ММедегпоїа, УММ.С.; Казкіпа, М.; зспеПепрего, 5.0. (1998). Та Із а Сапаідасе

Сепе г Спготозоте 17 Егопіоїетрога! Оетепіа. Аппаїз ої Мепгоіоду, 43, 815-825. 15. 5спепк, О0.; Вагрошг, К.; Оипп, МУ. согаоп, о.; сга)еда, Н.; сицідо, Т.; Ни, К.; Ниапо, .; дуоппзоп-ЖМоса, К.;

Кпнап, К.; Кпоісдепко, 0О.; Геє, М.; Пас, 2.; Перегриго, І.; Мойег, А.; Мибег, І.; Зопапо, Е.; Зпорр, О.; Маздие?,

М.; Мапаемент, С; УМаїкег, 5.; Муодиїї5, М.; Медпоск, Т.; зЗатезв, О.; зеибенті, Р. (1999). Іттипігайноп м/йп А-реїа

АцЦеппцагезв АІ2пеїтегз Оізеазе-І їіке Рашйоіоду іп Ше РОАРР Моизе. Маїиге, 400 (6740), 173-177. 16. ЗпеКипом, В. еї аї. (1999), 9. Стувіа! Сиоули 198/199: 1345-1351. 17. Зрійапііпі, М.О.; Миттеїї, У..; Соедеті, М.; Рапом, М.К.; Кіцд, А.; спеці, В. (1998). Митайоп іп (пе Там Сепе іп Ратіїа! Мийіріє Зузієт Тапораїшу мйй Ргезепіїє Оетепійа. Ргосеєдіпов ої те Майопа! Асадету ої Зсієпсе5

ЦО.5.А., 95(13), 7737-7741. 18. ЗІНіштацег, М/.).; Заипаегв, А.М.; Зсптеснеї, О.; Репйсак-Мапсе, М.; Епоніа, 9.; Заімезеп, С.5.; Нозев, А.О. (1993). Ароїїроргоїєїп Е:Нідп-Аміайу Віпаїпд ю Ар апа Іпсгеазей Егедиепсу ої Туре 4 АЇїеїйе іп І аге-Опзвеї

Еатіїа! АІ2пеїтег Оізеазе. Ргосеєдіпоз ої (пе Майопаї! Асадету ої бсіеєпсев Ш.5.А., 90, 1977-1981. 19. Мідаї, А.; Егапдіопе, В.; Ковзіадпо, А.; Меай, 5.; Кеме57, Т.; Ріапі, 0.; ОПпізо, 9. (1999). А Біор-Содоп

Мшаїйоп іп Ше ВА Сепе Авзосіаїед мий Ратіїїа! Вийізп Оетепійа. Майшиге, 399: 776-781. 20. 7пепа Н. (1996). Місе дейсієпі юг Те атуїоїа ргесигзог ргоївїп депе. Апп. МУ Асад. 5сі., 777, 421-426. 21. Хоїк, Р. (1999), РБОТТ 11: 430-440.

СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ ер Резвтеха ДВ «1202» Новий спосіб знижувальної регуляції амілоїху «1302 Р1014ВСІ «ІА «1діх «160516 «Ло» Ралі Ме «аІ1 «112 2313 «о» ДНК «РІЗ» Ното зарієну: «220» «1 СО ау» (У. (2313) «0 «РР» різні властивості «2222 42098).(2159) хоо3» нуклеотиди, що кодують трансмембранну ділянку ча «2212» різні властивості ко (2015).А2313) «роз» нуклеотиди, о кодують с-190 «гу» «2217 різні властивості «Зх» (2016) (2144) «о» Арега 42/43 220» «2212 різні властивості «ах» (2014).42142) кг232 Абе 42/43 «оо» вшоска сс Че Є дсе скд сек ску сб дес де кош зсу осо св В

Меї реа руо С1у 18» Аа 12й ісю Гей рез іх Аза їхр Тх Аїя ду 3 В 30 15 цс ос 989 Як осо ас дає дує азк дет Ядо сБо сф доє дай шоб 96 діа їй бій УА) Бто Тих Авробіу Взп йів БХУ без їво дія Б1» Буо 7 25 зо св аКЕ дос Бу То ОБ 992 808 сед вхо з сзб айу лаб це св 1244 іп 132 мів Мої Яне сув бі йду рез авл Меї із Меї дви чаї СІ1п

З: 49 25 вас фуд ку буд От боса дак ссож ссо зва васс заз кос сао вк фа І вза іу ув Тхройхр бот Бар біо бах 5ху ЗБх був Уж Сх» З» Авр 5е У «0 асс зап сза с ст ся сову се жде ска цех бро бос сек дю» ся 355 тьх вуз біз бім ї3е реа Зій Тук Суз б» іх УА Тут уко ЗА шва

БЕ 7 78 за сов яко зво ко о зіЗ па дюх бос зас соя Бо ко асо абс кха хоп ЗОВ сі» ді тот Ах» Уві УЖ) Бій Лі» дяк бію Жуо Уюї Унг хів біо дей т: 59 ЗБ кой ца ау с дес сус ав са о Зац вус саф суч кис сх бу 05

Ткр Суг му Вк 3 Вт Був БІЙ Су» Б Їх бів Ро йів ре її 395 105 аа айс сег їас су до ста ДСК сФує паю 85 їз ж дає об ств орхе ЗБЕ

Хе бло Туя Бку бут рей ча) 03у бім че Мед бех Жах Аа рес бею ке зх 153 ас осЕ бас »зу бус аж бе ста пес сз5 ву збо вбу зав ус б ЯМ

Уві Шу жен був бух був Бук дао Вів БУ Мо Ккц ві Хар очах сСух

ЕЗО 232 КОСУ

Зав зок се с сов бо Сай йсо ос пох внз са хо с вок феу «ЩО

Зію ТЕТ віх зно Міх тхр віх тмт ую) Віж Му 232 ТІ Суз бетг ЗЕ ак 335 155 худ жо зо; во срок зас їмо ус зт жа сто сос сву суя ау кт вує жк: ТВУ Ахо» Бех Міо Же» Тус Фіу Моб їхої дез гхо Щуз Біу їїв 555 їлЕ 375 аг ект їх юофа Фі; діа паб СУ Яке КОХ бує сез се их два саз 575

Ахо муз ре Аго ЗУ хі бХхм Бе бай Су бує Жко бо іа ів а 385 8х 95 звук дис зну аб дек ес ус дає бе щаФф азо ЗаК За босу дев ско 0

Хо хр дян УЗА Хар Зак А) Азр Віа о35 ій бар АБ йах вар чай зв З 29х

УоІ г Зас ук дав две зс» лад ТК да вс опо ЗУ пов час коза 12

Зхр Хур З1У хіх Але дво ТВх Кер тух Аіо Хар обу Бех Я» Дер бо з г35 225 сх діа охо діа доз 923 жд дах цей Зк сх ще усу дея бхо пай ТО

У тої Піо та: лів іч Чіо іх бїх Ух) Біз Зі» Уві Змі іо ІМ

Же5 239 ря за

Зо сг ЗУк дах же ср) бас бяї и док ЗО дек ка ом дед дви ТБб із Ата азв Бер Ав бі Ах лев ЗЛ йвробіу Ар оо У») біо» 3 245 та 255 що5 ЩО ди дек сс їх шва дез дос аа зу зу вос зсс жав аж 6

ЗЕ Ой по ЗіМ о їхо Тух бі» с Ві5 Зх 235 Але тах ТЗ зас їі зе 252 275 дог все ес хело асо ос косо вада цец БУЄ бу ше феу ду 5 сухо й

Вік ТМ ЖХкк Три ТнгоїТвх ЗВж Тбх б)5 ех Ужі З) іх Ха3 Уа) ка мя 259 ІВ5

89 555 Сус Кс дай сзе дос до ас дод сс бус са дося збу збо 819 біз уві був баг бій бів Аза бі» тТвт б)у Ргс Сує Ах Аїд Мет їїв 230 295: 995. се сес да Бас ЖЕ дай ду дст дза 9оу зад Буг десосся фа БЕ 950

Зеї Акт Ттр Тук Ріє Авр Уаї Уйт бі» б3у Буз Сує Віз тго ке Рра 05 з 315 329 таз дос па сце дос пує яас суд вас зво ЕХ дає всз дев дад жво 3003 тук бій ЗУ був С31у БУХ зо Бхо зе Аз Ра Азр Тис бі Фо Тук 325 з 335 їе асд цес то Кос дуб адс псс ако Кос осаз зу та осо азу ас 1056

Суб Меб Аїа Узі Сук біу Бехї дія Ме Беї біп бет ей фем Бує Ток

КТ 335 350 всі сау два сек сек пасе боз дат сої Чех аяз сус сек жсв ясе зез 103

Ту З)по5іМ Рхо їв Аіа Ме Авр о Біє Мі Буз Бем вто Тік ХвВх дів з55 3650 Зе5 дсо збі зсо соб бас дос 455 дає язо Каї сбо дад о васз ссь бо а 1152

Ві5 бек Ту Рто Азр Аїа Узі Агро буяє Тух Без бій Хлк Бго сіуУ дар 310 275 350

Чат хаб цей сх дес саб кс сад айа дос звз бза абу ск джу дес 1200 бій Азл бі» нів Азж йія Ріє біб Бує Дів бує бі» ВхФ Бей біз діа 95 зво 385. 409 ват сас сода зад ада абс їес осад збоку ази бай бос дез вно уся 1218

Бух Ніз Агу біб Ат Меб бву б1п Ух) Ме дку Сім Тер обі: біо діа 495 но 5 даз сеї саа да зад азс ту сої аза Усь ув азу задуса УББ зе 1295

Зіх Ак бір Аза бух Аз ве РКО бує Віз дер бує Буз Дік Ух ї16 420 395 430 сад саб кс сху дад ааа 559 б3е су со дав сад аз дсе сс ває 1349 біл Ні різ бів біз Буш Уві сіз бат ев спіїш бі» бі3 Аї5 діз Ав 435 145 345 зо ацз ся се са чу ча асз сеє аї; вео аз 359 зав дов агу 1392 біх Ат Зах сіп рей Май бій тп Ніз Мої Аіа Аке Узі біо Дів Мак 250 455 460 скс аз свас сус бос содс сво со сб уз) вас їхс або всо уст су 14:10

Тею ляп ляр дху Ак йха їли Аїа Тюм СІК Аз» Тут Зію Твого Аїя о бею 655 410 ат 480 сзу цеї Як сес сек суд соб сок сас Зб се зво ат обз зад яз 1486 21й Міо Уві) ко Рхо Аха Рто Аху Ніз Уа3і Ре Аза Моб їви уз зуб ч85 «59 «ва таб дис бою ца Ява хау зад зас ада су сис аст ста заб са со 1535 тух Уаї йху ма Бім 125 Був АБр лто біб Мів Хнх Ббец Буд бів Ре: 590 5О5 ло йо паб ко бос су За Зх со жо ак дос шок жу збу суд оз ЗМ йо» Ба Уа гу Мет Узі Др Еки хуя Був Ал дах яз» їхо ду ЯК хіх - БІК -5 тка це хіт все око піп ос ЗК КЕ їЖо оку см хе охі сзу й Зо

Біо Укі Мей їїмс біс їох йхе Уа ї11ю Тус іх Ксу Мей дай цію сс

БК 5 сус сет ск пох со зя; ув зсУу Зож з5а Зоо дар пз вк се дух 1559 їжи бех Блш йо» тТул Яах ХА Су йХа Чаї йіз 535 55» 232 хх у. ів КРУ реж Зо «ев вух ах щей Суб сБЕ се йш» зЗяФф сах язс їхь уса Зуб дат ма ОХ718

Ко Ухкі бли За їз Бе ЗАВ Був ЗАМ дій дз» Тух бЗех Або яр ХМ

КУ зо ЗВ

Уха дос зас ЗЕ ЯК ЗО; два со» збе Бкс ад бас туя язо ща ше 2175 їго 53» За: Мес Хіт бах 52м Ку Бк 318 ох Тух САУ Дух Дев Кх зо 553 ха сут збу оо БУС Бо зо фвя йсу заз зи йсе до два пух збу пес 338 йо» кі хо Мох рзю Тис ща Жльх Бу Т»х Тх ЧМжь Бай бохо мо хе 55 о зах

ВУе і ух пе; кс ха; Св дис де біс сзб соу Худ оз обох ЖЖ 0 Х872 які Бе ЗУ Зію ме Зох йо» Бхю бар іст о руз Тло Жія Бех би

М ЗЕ У

Зу3 2 дах ЩО бдкб оз шо вас сх за охо дах ух дв се шт І

Фі Кі» дор бох кА Ткт йта Боз ВУ та хо З3о Ха) Що ку ха 8 «5 ща дак дес суп ис зсе що Бас сов фах см асо 2су пух суж ук жо 235

АР із» Али Уго» Міо хіх Ар ВУ ЗУ іа ЖКх їпх ло бБко ЗДУ Бех 5 БК БиЗ я Кіа яси аЖу Зйс охо со чиФ Чоб5 ую КК Фах їмо оку Зі ШУ ІІ»

ЗМУ їй Жук ба» їїє буй ТРК Бай бі: д3ю З: Мік Уа фуб Мої 8» чи хв 5о див дя кре ох се хо Ко пуа аб о» КУ пах сах ск хах з ШЩМА діх йпіх рн» луу Каз ахр ех Біт дух Зію Жяї іх й3» ЗХ пря і)

КУ во 85

КІ Кіл ост бо Зах ЗК ЗКУ ук пся яко охо без і» обу хіх мо БІ

Які Ук ро» Ліз хи ар І Су дохо й» Щжо Лу Аза тіс щі Бу о 55 то ск; уз ЗУ уд ух ах ке ха 5 сь уко зи БУ Зб жох «ха 0 ЗХ бом Же: УхХ ЩІу ЗТу Ух: У»х Зре 31іо Тих Хе5 Зля Щі 335 У5Х їмо) з ха 733 вен збу ста зад яд жен суд йо збо їюх хе: пеї сах фах юка зу ФІ

Зах Мем їх Му» Гу» ЗУ хів сус би ех дію й» Бах бу ху Ук 725 732 ТЗ 55 КУ дес ос от усу ясо осо яю Фет са вхо ба йо »ху оку ОТ з Же Ялр Ва До то Тк йо 535 БА дл Бі» ій ех Му Миї т 745 БУ зу сай зо дус тес два й пох вус бас зах Ко БУХ дах газу су ТОЖ 0 Зап вл» у Тех ПРО Ухо Сх ТУдД Тут уз Щі3ую Ме» 035 і» Ме 535 790 Чаї та зло ки з313 о» как те «з 5 «Зах го «ід Б «ВРХ Воюои заріжов «ее х цех феи ко ЗУ Бех Дій їз бе йзя йео Аза Аза ХтроТв: Дія луу 1 з з їх іх бе» іх Уєї го їо бер З1у дхо із ЗІу їй іо дів Бі БтЗ

ХО 25 25 піп о лую А же Роз Хе Сіу Вс сисо Бзс НО Віз М д»з УЗА Зх 35 а 35 Й йвпочіу вуз си дор ЗЕ хан Рів Бк ФАУ РТОх Мую ТТ оСуУх 30 Вои

За 5 55

ЗБжЕ Буг С1и Біу її їз 52й Зул Суб ЗіБ йра За тує бло о їв "пт «та о ша Дів ТВх Аза бхі т85 51 Діе бу Зп бгх УЗА ТС 318 3 дай вк жо 35

ЗхрСух зу» Ато бів Вс) бух біо Суз уз Зрх Ні» ко бла бе улі мо ї95 зх

ЇХхео бхи ух Ака Суб бої 33 ЛИ січ рю хі бхх йор лів деу їм 215 та і58

ТВі ка Зхр Був Суз фбуя Ге ржи БА іх біо АхУ Мої лзро ай бух 4 ІЗ ї-5 сх Звх Ніо бе Мі хр обі Тах Хаф Вів муз 34 ЗУк Су» Бех бі» їч8 155 І55 І55

Бух Зеу Тс йзо Без Жіо Ахр Тух Ху НУК бе пе Бк Су» ау ХІж 155 ЕЖУУ зт ер луе Бко ле піу МИХ ЗХ бок зі Су Сух Бхо бо Ага Зім 229 зе ї85 153

Зак ху Ля 5аї Вхр бек Кіз жо Віа біб іш Коб ляр Же Взю Чкі 855 53 8 тки Їхе пу бху ліз Клео ЖВх Ахо Тух й) хр йіу Зох бі» дз бу хі? а 385

Чаї Уаї Зіб Узі ів Зі» 51» Б1з біо Узі дів бух Маї Із бів біс 2725 250 239 240 із Аяр дар оАжр Зі» Авр Аве бів Ар біу Аяр бі Узі біш шуй 2415 250 255 і» Аза З3іч 510 РКО Тух біо біб дів Твх біз дхо 7х ТВх бак 1165 260 255 270

Віа тах Тех Твх Твл о ТНк Зх Тнж біз бл Уві 51» бів Уві Уаї вто 275 286 285 пло укяі Суз чек біз бі» Аіїа біз Тк біу го Суа вл дія Мах І1ї6 259 235 зо

Бек дхц Ткр тТук РБе Азр чаї Твк бій біу буз Суз Ліз го ББе о Бре 05 316 315 320 бук му іу суз біу біу Ап ху Аз Аза Рпе Авровх Ба піч Тух 325 зза 2335 сСуз Мей Аза чаї Суз сіу бек Аза МеєЄ бвх сів Заг Геи їва Буз ТАх 3410 345 З5о

Тш Бій бів Бгто Бей Аза лЛхд лзр руо Уаї Муз без Рто Та Та Вів з5О зах лів бек ТМг ро Авр Аза узі лзр був Тух їй біз Тпх хо ау Я»р 376 378 зво пі Ав бід Ні дію Вію Ме З1іп Був й)а Був бів Ако бом Бім дій зв зо 3955 900

Був нів Вха бій Ах Ме Бех бів Узі Меї Аку 51 тир бій алю Аїа 125 410 415 бій вка Біп о ліз Тух Аап ей го Муз дів Азр цуз був дія Уаї її8 420 225 ч30 бів» із Ре бів о бІч буз чаї бій Зек дей ба біо бій вія Віш Дей 435 440 325 сів Ак біп сій Бе» Маї 81 Тах Нів Ме ліз Ауо Уві біг іх мет 450 455 4ба ізо Азп о Азр аку Ага Ак фФа лів йеа ім йо Тух зе ТЕ Віз ей ч85 7 475 480 зо дів Ухі Рко Ргю ге ко Вху ів Уві рРапе ази Меб Бей буз мух за 859 485

Тух Чаї йхе Віз іш йіп Муз Азр Агу бів Вій Твк беш Був вія Р» 500 5 510

Фін Ніз уаї Ак Має Уаї лярорро Буй Муз йія їв біл 115 Ага бах

ЗА зга 55 сіл Узі Ме Три Ні Її Аг Ма3 Іде тує бін вхо Беб Азп о біп Яех зо 335 з40 ву бву бай із Туг дп Узі хо Афа Уві діа бі б) 138 бій Дер 515 550 ЗБЕ 540 біз уві Ар біз Бей бе» біп був сію бів Айва Тух Бег Авр Ахр Уа

З65 У 53175

Бе АХа Авип Меї ї1« Чек й319 РКО Вуч 115 Зес тую б1У Ав Азр о Аїа

ЗВО 585 ЗО

Бей Мет руло Зек реп ТПЖ б) Тих Туз бвх о тпк уві бій Без фей хо 85 ОО ох

Уаї йео Зі» Бім РМе Зеї йву дар дар пе бі), Рко ТЕр Віз Зеух тре 510 535 620 піу Аза АБр бЗех Уві Ехо Аза ба Твпх бій бзз бім Узі бію бро У81 віх 520 635 640

Азр йіз вгу Рто дів Аїа дор то сіу рен Ту ТвкЕ Аг хо біу Бех 83х 580 855

Ф1у цем пк Аза Іі цув Твх біз бів ї19 бек б3ш Ма) Буз Меб дер хво 855 7й ліз бін Рв Яке Ні Авр бек б3у тТук бі» Уві Ніз Кіз сбіп бух Бен 575 ва 555 ах ме БРре Ат бій лЛер Уві СХу Бех лов Буз СТУ Аіз ї1є Тв 01у во 555 7ой їли Мет Майї бО1у б3іу аз Узі Ле Аза Тр: уві Хфо Уаї Х31о ТЕ ва 705 7іо 715 тео хаї Меї ем уз дує пуз бів Тук ТНе бек їйе Ніз Ніз біу чаї чаї 725 750 735 шара Уза Азр Аїа діа маї ту Бо бій біз АхУ Ніа Без Зед бул Мої тай 745 155 дію іа вва зіу Тух ЗРО Ап вхо ТВ: Тук пуб Ре Рне б15 бів Меї 755 7во 765 біз дви

У хо «лі» «5 . «2125 ДНК «2135 СіовзсхіЗіцв сехапі сх

СО

(45) 2232» ДНК, що кодує енітоп Р «або» З сь бас абс заз осі зас кос вав БФ во цу кіс оЗес 5 СЯ 45 пі» Туг її» Буз Аїа Ап бех Буз рне її8 йіу із Тйт б)и за 1 З 10 15 «рід» й «5312 18 «212» ВЕТ «9139 Сіовткідішез тега»і сеоо 4 зів Тух Ліз пул Жіа Яай Бех Бує Рі ї1е Сіу їіїю Тих бу» їви 1 в то 15 «2162 5 «2ізх ба «2122 ДЕ «ВІЗ» Сіаяттійик бзЕвої «я» «з2ї2 сов «2» (1)..4533 «25» ДОК, що копук сяітем КІ «Фвоаз х кс взс зап Ес вс дея го сте сор ста ся тт сс зва СЕТ зуп 046

ЕП Жойп лев Бе Тих уві бах Бе тур Бей Айхо Маї бо бух ха) Бах ї 5 І 15 хи аде све со дав «3

Лів Бех Ні хе» Піх о «210 5 «21132 21 «212» ЕЕ «213» Сіозкуййіня кебаві «ай й

Бе ла еп Евйе трх чі Зеу Рпе Тхро Го» Зх Меї Бо Муз Ух 5ех х 5 ІН 15 йіх Бех БІБ йо 3 «ліс» т «Ії» ті «2і2» ДНК їБ Сентститна

Синтетичний прайменп для ПЛ. ково» з паасссацює тостктсуво т «поз В

«ех» ЗУ «аа» Вк

У Симуетичка 77 дввсуючини козамер для МІК кас 8 хозсотодах серерутюне у З хро З квіт» 358 хіт ДНК зма» синя

ЗАЗ» пдууєифявй зпайяке див СІ тмюх а зкцахецово Загекодісьо сокіІКсВУЄ фходзивео мохолацоя встудкекех 5а тесукоцава зсскоисо сазсокиаоє Зсзакозкоу Зсствхецак Кфасозуве а спукессасвв собой ї3а «ох хо «Ах о Зі «аіхх ДЕ зкІух уюмкснана

ТАЗУ Уутцакочаий похо для ЛЕ ху: 50

Месуазохоо побусханех поконсеюх х З «Мох «м» З «355» ДЖ «ду» Симітчюх хЕДОи диУківий яряймер зла (ПЕ «ода сссуззяусх букмууєсах дохозснаса осулижосе 59 «ках «діїх 06 сл ДК 3» Скітеімона ій Септтхннй празвках аця ТЛ «аВах 15 кефцехацсх кскзуааси папок нссу зіукасккоуУ зостаоКЕВ дод за зксузуакох хомслсомес хохо же ах 45 ех 5 «сш ЦЕ

ФІЗ» ЄСхвемкака

СИВУ фути праймер дня ПЛ ха» 33 чсудусоко уоуктюмиою оссксвсуди боецзвксувш сСоухцвикх саваеуевха 55 «сахахасснс споролувув охухоктцу кошсавскох 1055 «ві За «іх» 177 «ай» ВН

ТІ» Схоусують

УВК зоціутчнив праімно ля ПІДЕ ех дя «рауссовсих ау тиоуєЄ сок хрсо мхоМмідкоКкОо окоссиесо Явка ву

ОМИКоКтуд зесихлгю СЕскооцент хни сохУйЕ ство Ку вкстоівх і2х3 сеудхохої земного флюс бофрубакіко сазконь 53 їх «ЕВ» ЗХ «832 ЗУ «8125 ДИ

ІП Кознтетечва «Я» сууюпний слой для ПЛ сафах 35 окудзацкню сефжукусов кезоувстос Зо кЕзпх її хиЩї2 85 «Піх» ДЖ

ЗАЗ» фаюхтечих «І3Х еутумнамов пий ха ПЕ смютеммий пуавмер ля СЕ «ба» 18 дхрмовусві» стіроксхех сКохомукіх их 5 хизше 3 хшдза У «ЩІб» ЕК «ЗАй» Сип нама дя : . «ел» смиссув че пхаснцювкість, о» за зуух НКА ЖК «захи 17 лі жЖуз вн чої дія Лі Тхр ТИХ Уой бух йїА Мі» лі» 3 5 Ех а (кі 8у2 лю тт т інфскеи А КИ КИ КИ ОКО номен ке

Дімеха-с2М3 слой

М си КВ ї сиза ЛИ з 3

В гЗ ? 2

Бе км о ООН и а ох ох дн ання ат півня), Заміни я різних:

ЗИ КОМИ ЕЕИНИУ І положеннях синь З ехейнвно З СТИ ВОМНИХ зо Не ВИ й положеннях

Зоо позов

За ци

Сушесх КщіїлУ хм: пом сон

Шасі Ода, й «ллє -з лк а ли 5 сії ай ним в; ій й

Як фо . деку «жало ня Бонн ШИ ек сію ем дич В соди нн - и зам здох сх расу

Й секту і сайт ко т ї » « оон Я я хе ск мож ока. г «левай т перу й і Кі 5 Зо ий Й туенцених

У - ме сам: жк

Б. й м дехифек; кою имой У Ей

Х єхзико. ТА ї «й

Фк