UA77385C2 - Use of anti-hbp monoclonal antibody for therapeutic agent intended for treating or preventing disorders resulting from release of bradykinin in mammals, method for assaying monoclonal antibody, assay kit, method for assaying hbp production in mammalian cells and tissues - Google Patents

Use of anti-hbp monoclonal antibody for therapeutic agent intended for treating or preventing disorders resulting from release of bradykinin in mammals, method for assaying monoclonal antibody, assay kit, method for assaying hbp production in mammalian cells and tissues Download PDF

Info

Publication number
UA77385C2
UA77385C2 UA2001107327A UA2001107327A UA77385C2 UA 77385 C2 UA77385 C2 UA 77385C2 UA 2001107327 A UA2001107327 A UA 2001107327A UA 2001107327 A UA2001107327 A UA 2001107327A UA 77385 C2 UA77385 C2 UA 77385C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
hbp
hvr
nvr
antibody
monoclonal antibody
Prior art date
Application number
UA2001107327A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk As filed Critical Novo Nordisk As
Priority claimed from PCT/DK2000/000213 external-priority patent/WO2000066151A1/en
Publication of UA77385C2 publication Critical patent/UA77385C2/uk

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Опис винаходу
Винахід стосується способу лікування або профілактики захворювань, які спричинені вивільненням 2 брадикініну у ссавців, зокрема ссавців, які виробляють гепарин-зв'язаний білок, причому цей білок зв'язується з антагоністом гепарин-зв'язаного білка, даний спосіб полягає у введенні вищезгаданому ссавцю відповідної дози антагоніста гепарин-зв'язаного білка з метою зниження вивільнення брадикініну у ссавців. Крім того, винахід стосується способів та комплектів для визначення здатності ссавця виробляти гепарин-зв'язаний білок, який зв'язується з антагоністом гепарин-зв'язаного білка, та способу виявлення антагоніста гепарин-зв'язаного 70 білка.
Запалення
Гостра запальна реакція має певні особливості, що включають в себе зміни діаметра та тонусу судин, а саме порушення функції проникності судин, яке в результаті призводить до утворення багатого на білок ексудату (Сем, Меадіаюгв ої ІпПйаттаїйоп, МУУгідні, ВгізіоІї, О.К., 1986Ї. Отже, щойно нейтрофіли (РММ) приймають 72 Хемотаксичні сигнали, вони облямовуються й прилипають до судинних ендотеліальних клітин через специфічні адгезивні молекули, які синтезуються як на ендотеліальній поверхні, так і на поверхні нейтрофілів. Після прикріплення нейтрофілів до ендотеліальних клітин відбувається відкривання ендотеліальних зазорів, які спричинюють порушення функції проникності судин і допускають міграцію нейтрофілів у міжвузля інтерстицію.
Система контактної фази охоплює три ферментні фактори, фактор ХІ (Е ХІ), фактор ХІ! (Е ХІЇ) та прокалікреїн плазми (прекалікреїн) (РК) і неферментний кофактор, Н-кініноген (НК), який утворює еквімолярні комплекси з Е
ХІ та РК відповідно. Наявність контактної фази спостерігається у моноцитах, фібробластах та нейтрофілах.
Сайти специфічного зв'язування залишаються відкритими з боку ендотеліальних клітин та неклітинних негативно заряджених поверхонь, таких як каолін, що мають загальну назву "контактна фаза" і дозволяють локалізацію збору головних компонентів. Перетворення зимогену, Е ХІЇ, на активний фермент, Е ХіІІа, активує саму систему с контактної фази ІСоїтап еї аї., 1986, (сг. Кем. ОпсоіЇ. Нетайоі. 5: 57-85). Внаслідок взаємної активації (3 поверхнево зв'язаного Е ХІіЇ та РК, закріпленого на поверхні через НК утворюється Е Хііа та РКа, таким чином посилюючи початковий сигнал. Після цього фактор ХІїЇа може активувати Фактор ХІ, і отже, започатковується природний шлях коагуляції. Відомо що РК також гідролізує НК для утворення ефективного нонапептиду, брадикініну (Каріап апа Зіїмегрего, 1987, Віоса 70:1-15). Кініни вважають основними посередниками запального о процесу, які спричинюють біль, призводять до розширення та порушення функції проникності судин внаслідок їх с прямої дії на ендотеліальні клітини, змушуючи їх стягуватися й допускати як міграцію нейтрофілів, так і транссудацію компонентів плазми |Суміп еї а!., 1970, Ехрегепііа 26:843-844). Можливе також місцеве вироблення о простагландин та оксиду азоту, МО ЦНаїЇ, 1992, РНаптасої. Тег. 56:131-190). Отже, активація системи ча контактної фази може призводити до побічної дії, наприклад, запалення, септичного шоку, синдрому розладу 32 дихання у дорослих, дисемінованої внутрішньосудинної коагуляції, післяопераційної кровотечі при в серцево-судинних операціях.
Зокрема, система контактної фази може бути активована, в період коли нейтрофіли зв'язуються з ендотеліальними клітинами за умови наявності ендотоксинів та шляхом бактеріальної інфекції (див. Соїтап еї « аі,, 1997, Віоод 90:3819-3843). Наприклад, було виявлено що під час сепсису активація фактора Хі! та З прекалікреїну призводить до розщеплень, які активують їх до ферментів, що швидко реагують з інгібітором С1 с для утворення комплексів інгібітор фактора ХПа-С1 та інгібітор калікреїну-С1. Значне посилення в утворенні
Із» комплексу інгібітор калікреїну-С1 спостерігають при змодельованому серцево-легеневому шунтуванні.
Було виявлено що апротинін, інгібітор плазміну та калікреїну плазми, знижує втрату крові після операцій на серці й скорочує тривалість сильної післяопераційної кровотечі. Зокрема, було виявлено що апротинін знижує 49 комплекси інгібітор калікреїну-С1 та інгібітор С1-С1 в обвідній моделі штучного кровообігу (М/асипйодеї! еї і аІ., 1993, У. Тпогас. Сагаіомазс Зиго. 106:1). У разі додавання апротиніну до систем для серцево-легеневого -І шунтування, які використовують із суцільною кров'ю, обробленою проти коагуляції гепарином, апротинін фактично доповнює дію гепарину ІВаппап еї аї!., 1998, Вій. У. Нает. 101:455-461). Отже, апротинін має ще одну о дію, крім тієї, яку було виявлено у гепарин-зв'язаних системах, - кровоспинну дію. о 20 Апротинін також збільшує життєздатність ендотеліальних клітин за гіпоксичних умов зберігання у холодильній камері, коли такі клітини містяться у розчинах для збереження органів, і поліпшує зберігання сл легенів та міокарда у моделях цілих органів |Зипатогі еї аіІ., 1991, Апп. Тпог. Зигу. 52:971-978 та Кобегів еї аІ,, 1998, Апп. Тпогас. Зиго. 66:225-2301|. Крім того, якщо брадикінін спричинював більшу проникність судин, то апротинін знижував цю проникність судин та кількість нейтрофілів (О'Вгіеп еї аЇ.,, 1997, Сап. 9. Рузіо|. 22 Рнагтасої. 75:741-749 та Омжепдегега!., 1995, Еиг. У). Сііп. Снет. Сііп. Віоспет. 34:207-214).
ГФ) Гепарин-зв'язаний білок
Нещодавно було визначено ковалентну структуру двох споріднених білків, виділених із лейкоцитів о периферичних нейтрофілів людини та свині (пор. Н. Ріоддаага еї аї., 1991, Еиг. У. Віоспет. 197:535-547; У.
Ропі еї аЇ.,, 1990, РЕВ5 Їей. 272: 200131. Обидва білки виявляють високу спорідненість з еластазою 60 нейтрофілів, але через селективну мутацію активного серину 195 та гістидину 57 (нумерація хімотрипсину |В. 5.
Нашпеу, "Нотоїіодіез іп Зегіпе Ргоїеіпазев", РА. Тгапв. Коу. бос. Зегпез 257,1970, с.77И.| білки не мають активності протеази. Білки відповідно назвали гепарин-зв'язаним білком людини (ННВР) та гепарин-зв'язаним білком свині (рНВР) внаслідок їх високої спорідненості з гепарином.
Зспаїтег еї аї. |(Зспатег еї аїЇ., 1984, Іпїесі. Іттип. 53:651| назвали білок катіонним антимікробним білком бо (САРЗ7) внаслідок його антимікробної активності. НВР міцно зв'язується з компонентом ліпіду АЛ Р5 та ендотоксином (Каве-0,8х109М 7. Вказувалося на те що бактерицидна дія НВР зумовлена зв'язуванням ліпіду А (Ре(егзеп еї аїЇ.,, 1993, Еиг. 9. Віоспет. 8214: 271-279., Ріоддаага еї аї.,, 1994, 9. СеїЇ. Віоспет. Зиррі. 78ААрзіг. Е5БО5; Регеїга еї аїЇ., 1993, Ргос. Май. Асай. Зсі. БА 90:4733-4737)ї За припущеннями, сайт
Зв'язування ліпіду А//Р5 природного НВР розміщується як незаряджена вставка між основною та кислотною вставками на НВР і включає в себе залишки 20-26 та 41-43. У сайті зв'язування ліпіду АЛ РЗ Рпе25, Суза2б,
Суз42 та РНе43 утворюють гідрофобну нішу, здатну до зв'язування жирнокислотних ланцюгів або глікозамінільного цукрового кільця ліпіду А. За цією нішею розміщується іонна та гідрофільна ніша (Авп20,
СбіІп21 та Агд23), яка має високу здатність до зв'язування глікозамініл-з'єднаної фосфатної групи ліпіду А 70 Цмегвеп еї а!., 1997, Майшге Зігисі. Віоіоду 4:265-268).
Крім того, результати лікування калового перитоніту з застосуванням НВР у тварин показали, що наприклад миші з допомогою цього лікування можуть уникнути смертельного пошкодження |Мегсег-допез еї аї., 1996, Іп зЗигдіса! Гогит, сс.105-108 та УМіскКеї! еї аї., 1997, Іп ДІ |піегпайопа)! Сопдгезв оп (Ше Іттипе Сопзедцепсев ої
Тгашта, ЗносК апа Зерзіз, Мипісй, Сепгтапу, сс.413-416). Було запропоновано, щоб гепарин-зв'язаний білок або 75 його | Ре-зв'язані частини застосовувалися для лікування септичного шоку |(МУО95/28949, патенти США
МоМо5,458,874, 5,607,916 та 5,650,392І.
Спершу проводилися дослідження антибіотичних та І Ро-зв'язувальних властивостей НВР (|Сабауега)!., 1989,
Ргос. Май. Асай. Зсі. О.5.А. 86:5610-5614 та Регеїга еї аЇ., 1993, Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 90: 4733-7|.
Однак зібрані останнім часом дані підтверджують концепцію, згідно з якою НВР, крім бактерицидної дії, спричинює прогресування запалень внаслідок його властивості впливати на залучення та активацію моноцитів (Регеїйга еї аї.,, 1990, 9. Сп. Іпмеві. 85:1468-1476 та Казтивззеп еї аїЇ.,, 1996, РЕВ5 Ген. 390:109-1121, залучення Т-клітин (Спегіом еї аї!., 1996, У). Віої. Спет. 271: 2935-2940).
Було виявлено що НВР викликає скорочення в ендотеліальних клітинах та фібробластах |Озіегдаага апа
Ріоддаага, 1992, 9. ек. Віої. 51:316-323)Ї. У зв'язку з цим |у УУО 93/05396| описано спосіб відбору с інгібіторів НВР шляхом інкубації НВР або клітин, які виробляють НВР, з речовиною, яку вважають інгібітором о
НВР, та з тканиною або клітинами, здатними взаємодіяти з НВР; знижена взаємодія (наприклад, скорочення ендотеліальних клітин) свідчить про те, що речовина є інгібітором НВР.
ЇУ заявці УУО99/26647| описано застосування гепарин-зв'язаного білка для модуляції або профілактики апоптозу клітин ссавців. У заявці також описано, що НВР звільняє клітини інсуломи щура від спричиненого | -1 ІС о) апоптозу.
Було також виявлено що тільки гепарин-зв'язаний білок людини, а не гепарин-зв'язаний білок свині, со зв'язується з апротиніном (ВРТІ) |Рейфегвеп еї аї., Еиг. У. Віоспет. 214:271-279). Зокрема, ВРТІ все ж здатен со зв'язуватися з НВР з К ах0,1х109М ІРесегзеп еї аї., 1993, Еиг. У. Віоспет. В214:271-279). Було визначено що їч-
Р1 специфічність НВР є насамперед І уз або Іі еи ІКіслак еї аї!., 1999, Віої. Спет. 380:101-105). Було зазначено що найпомітнішими залишками в НВР, які впливають на зв'язування ВРТІ, є СІу169, (Іу175, Зег192 та Азр201, які - відповідають Авзр 189, бег195, СІу216 та Авзр226 у трипсині (Ре(егвзеп еї аїЇ.,, 1993, Еицг. У. Віоспет. В214: 271-279. Кіслак еї аіІ., 1999, Віої. Спет. 380:101-106| зібрали бібліотеку мутантів у боковому ланцюгу Р1 апротиніну, застосовуючи способи показу фагів. Вони виявили що у НВР високий ступінь спорідненість із Р1 ГГ ув, « а також із незарядженими Р1-амінокислотами, Г ем, ТАг, Меї, Сіп.
Було виявлено новий факт, що гепарин-зв'язаний білок (НВР) служить сигнальною ланкою у спричиненому т с нейтрофілами порушенні функції проникності судин та активації системи контактної фази з паралельним ч утворенням брадикініну, і що він відіграє роль в опосередкованому РК розщепленні НК для одержання » послідовності брадикініну. До того ж було виявлено, що антагоністи НВР знижують проникність ендотеліальних клітин. Як було вже визначено, "антагоніст НВР" є речовиною, яка взаємодіє з гепарин-зв'язаним білком і інгібує дію гепарин-зв'язаного білка. - Винахід стосується способу лікування або профілактики захворювань, які виникають в результаті вивільнення - брадикініну у ссавців, зокрема людини, особливо, ссавців, які виробляють НВР, що зв'язується з антагоністом
НВР, який передбачає введення вищезгаданому ссавцю, який цього потребує, відповідної дози антагоніста о гепарин-зв'язаного білка людини для модуляції або зниження вивільнення брадикініну у вищезгаданого ссавця. о 20 До таких захворювань, крім інших, належать синдром системної запальної реакції, ішемічна реперфузія, анафілаксія та відторгнення алотрансплантата. До цих захворювань також можуть належати синдром розладу сл дихання у дорослих - побічна дія синдрому системної запальної реакції. Анафілаксія може виникнути внаслідок невідповідної активації РММ під час серцево-легеневого шунтування, операції на легенях, травми голови та широкої травми всього тіла. Модуляції або зниження у вивільненні брадикініну досягають шляхом запобігання контакту НВР з ендотеліальними клітинами та/або з системою контактної фази. У конкретному втіленні винаходу
Ге! антагоніст НВР модулює або зменшує опосередковане калікреїном розщеплення Н-кініногену для одержання послідовності брадикініну. Винахід також стосується застосування антагоніста НВР з метою одержання де медикаменту для лікування синдрому системної запальної реакції, ішемічної реперфузії, анафілаксії та відторгнення алотрансплантата у пацієнта, що має НВР, який зв'язується з антагоністом НВР. Антагоністи НВР 60 також можуть використовуватися у лікування або в одержанні медикаменту для лікування ускладнення синдрому системної запальної реакції - синдрому розладу дихання у дорослих.
У конкретному втіленні винахід стосується способу профілактики захворювань, які виникають в результаті вивільнення брадикініну у ссавців, зокрема людини, особливо ссавців, які виробляють НВР, що зв'язується з антагоністом НВР, який передбачає введення вищезгаданому ссавцю, який цього потребує, домену або аналога 65 інгібітору серинової протеази Кипії2-типу, або його похідної, що зв'язується з НВР, у кількості, ефективній для модуляції або зниження вивільнення брадикініну у вищезгаданого ссавця.
В іншому конкретному втіленні винахід стосується способу лікування або профілактики захворювань, які виникають в результаті вивільнення брадикініну у ссавців, зокрема людини, особливо ссавців, які виробляють
НВР, який зв'язується з моноклональним антитілом, яке зв'язується з принаймні одним епітопом на НВР, причому вищезгаданий епітоп зв'язується з комплексом прекалікреїну-Н-кініногену й активує вивільнення брадикініну, і цей спосіб передбачає введення вищезгаданому ссавцю, який цього потребує, моноклонального антитіла, яке зв'язується з принаймні одним епітопом на НВР, причому вищезгаданий епітоп зв'язується з комплексом прекалікреїну-Н-кініногену й активує вивільнення відповідної кількості брадикініну для модуляції або зниження вивільнення брадикініну у вищезгаданого ссавця. 70 Винахід також стосується способів виявлення антагоніста НВР. В одному з втілень винаходу вищезгаданий спосіб включає в себе: (а) культивування ендотеліальних клітин за наявності НВР і за наявності та відсутності речовини, яку вважають вищезгаданим антагоністом, та (б) виявлення будь-якого впливу вищезгаданої речовини на функцію проникності ендотеліальних клітин, причому знижена функція проникності вищезгаданих ендотеліальних клітин, порівняно з функцією проникності вищезгаданих клітин при інкубації за наявності НВР без вищезгаданої речовини вказує на те, що вищезгадана речовина є антагоністом. В іншому втіленні винаходу вищезгаданим способом передбачено (а) інкубацію НВР з першою речовиною) яка взаємодіє з НВР, та другою речовиною, яку вважають антагоністом НВР, та (б) виявлення будь-якого впливу вищезгаданої другої речовини, яку вважають антагоністом, на взаємодію НВР з вищезгаданою першою речовиною.
У конкретному втіленні винахід стосується способів розпізнавання моноклонального антитіла, яке 2о Зв'язується з принаймні одним епітопом НВР, зокрема НВР людини, у яких вищезгаданий епітоп зв'язується з комплексом прекалікреїну-Н-кініногену й активує вивільнення брадикініну. В одному з втілень винаходу спосіб включає в себе: (а) культивування ендотеліальних клітин за наявності НВР і за наявності та відсутності моноклонального антитіла, яке вважають таким, що зв'язується з принаймні одним епітопом НВР, зокрема НВР людини, причому вищезгаданий епітоп зв'язується з комплексом прекалікреїну-Н-кініногену й активує сч ов Вивільнення брадикініну, і (б) виявлення будь-якого впливу вищезгаданої речовини на функцію проникності ендотеліальних клітин, причому знижена функція проникності вищезгаданих ендотеліальних клітин, порівняно з і) функцією проникності вищезгаданих клітин при інкубації за наявності НВР без вищезгаданого антитіла вказує на те, що вищезгадане антитіло є моноклональним антитілом, яке зв'язується з принаймні одним епітопом на НВР, причому вищезгаданий епітоп зв'язується з комплексом прекалікреїну-Н-кініногену й активує вивільнення ю зо брадикініну. в іншому втіленні винаходу способом передбачено (а) інкубацію комплексу прекалікреїну-Н-кініногену за наявності НВР і за наявності та відсутності моноклонального антитіла, яке со вважають таким, що зв'язується з принаймні одним епітопом на НВР, зокрема НВР людини, причому с вищезгаданий епітоп зв'язується з комплексом прекалікреїну-Н-кініногену й активує вивільнення брадикініну, і (б) виявлення будь-якого впливу вищезгаданого антитіла на вивільнення брадикініну, зниження вивільнення ї- брадикініну, що свідчить про те, що вищезгадане антитіло зв'язується з вищезгаданим епітопом на НВР. ї-
Винахід також стосується способів та комплектів для визначення, чи виробляє ссавець НВР, який зв'язується з антагоністом НВР. Цим способом передбачено такі етапи: (а) відокремлення НВР або клітин, або тканини, що виробляють НВР, від організму ссавця, зокрема людини; (б) інкубацію вищезгаданого НВР або клітин, або тканини, що виробляють НВР, з речовиною, тканиною, клітинами або їх компонентом, що взаємодіє з НВР та « вищезгаданим антагоністом НВР і (в) виявлення впливу вищезгаданого гепарин-зв'язаного антагоніста на з с взаємодію НВР з вищезгаданою речовиною, тканиною, клітинами або їх компонентами, зниження взаємодії вказує на те, що вищезгаданий НВР зв'язується з вищезгаданим антагоністом НВР. Випробувальний комплект ;» включає в себе (а) антагоніст НВР; (б) природний НВР та (в) речовину, тканину, клітини або їх компонент, що взаємодіють з НВР.
У конкретному втіленні винахід також стосується способів та комплектів для визначення, чи виробляє -І ссавець, зокрема людина, НВР, який зв'язується з моноклональним антитілом, що зв'язується з принаймні одним епітопом на природному НВР, зокрема НВР людини, причому вищезгаданий епітоп зв'язується з комплексом
Ш- прекалікреїну-Н-кініногену й активує вивільнення брадикініну, а також передбачає (а) відокремлення НВР або 2) клітин, або тканини, що виробляють НВР, від організму вищезгаданого ссавця; (б) культивування вищезгаданого
НВР або клітин, або тканини, що виробляють НВР, з ендотеліальними клітинами за наявності або відсутності со вищезгаданого антитіла та (в) виявлення будь-якого впливу вищезгаданого антитіла на функцію проникності сп ендотеліальних клітин, знижена функція проникності вказує на те, що вищезгаданий НВР зв'язується з вищезгаданим антитілом. В іншому втіленні способом передбачено (а) відокремлення НВР або клітин, або тканини, що виробляють НВР, від організму вищезгаданого ссавця; (б) інкубацію вищезгаданого НВР або клітин, або тканини, що виробляють НВР, з комплексом прекалікреїну-Н-кініногену за наявності та відсутності вищезгаданого антитіла та (в) виявлення будь-якого впливу вищезгаданого НВР на вивільнення брадикініну з
Ф) комплексу прекалікреїну-Н-кініногену, зниження вивільнення брадикініну вказує на те, що вищезгаданий НВР ка зв'язується з вищезгаданим антитілом. Комплект згідно з даним винаходом включає в себе (а) моноклональне антитіло, яке зв'язується з принаймні одним епітопом на природному НВР, зокрема НВР людини, причому во вищезгаданий епітоп зв'язується з комплексом прекалікреїну-Н-кініногену й активує вивільнення брадикініну, (6) природний НВР людини та (в) комплекс прекалікреїну-Н-кініногену, приєднаний до твердої основи.
На Фіг.1 показано вплив зшивання СО18 з вторинним антитілом кози анти-миші Е(аб)».
На Фіг.2 показано вплив НВР, що залежить від дози (25-75мг/мл), на функцію проникності моношару ендотеліальних клітин. 65 На Фіг.3 показано інгібування викликаного НВР збільшення проникності ЕС поліклональною антисироваткою до НВР.
На Фіг.4 показано вплив антитіл анти-НВР на дію секреції РММ на ендотеліальну бар'єрну функцію.
На Фіг.5 показано інгібування викликаного брадикініном та НВР збільшення проникності ЕС моноклональним антитілом МВКЗ до брадикініну. Брадикінін (Т00нНМ; Фігура ба) або НВР (75мкг/мл; Фіг.5б6) вводять на початку відліку часу з ламінального боку моношарів ЕС, попередньо інкубованих тАбБ МВКЗ (4Омкг/мл).
На Фіг.6 показано інгібування викликаного НВР збільшення проникності ЕС моноклональним антитілом РКНА до калікреїну плазми. НВР (75мкг/мл; заштриховані символи) або брадикінін (100нМ; незаштриховані символи).
На Фіг.7 показано інгібування викликаного НВР збільшення проникності ЕС внаслідок пептидної обробки нкНго. 70 На Фіг.8 показано інгібування викликаного НВР збільшення проникності ЕС внаслідок пептидної обробки 5ООЗ1.
На Фіг.9 показано інгібування викликаного НВР збільшення проникності ЕС внаслідок обробки апротиніном.
Фіг.10: вилучення 1І-6 з моноцитів людини. Моноцити культивують в їмл середовища без сироватки протягом 24 годин разом з І РЗ та/або природним НВР/ЛК235,Е25ЕІНВРЛО175О0НВР у кількостях, вказаних на Фіг.
Фіг.11: насичення природного НВР, ІБ235,Е25ЕЇНВР та |С175О|НВР-(А) ЗНА РУ і (Б) конкуренція за 725І1-ВРТІ-зв'язування з постійними, зростаючими концентраціями неміченого ВРТІ. (В)
Концентрацію 722І-ВРТІ показано у 95 ОнМ неміченого ВРТІ. Очевидна різниця у зв'язуванні між НВР та
ІК235,Р25Е)НВР обговорюється у розділі "Результати". Стовпчики означають стандартне відхилення.
Гепарин-зв'язаний білок
Уданому контексті термін "гепарин-зв'язаний білок" ("НВР") означає білок, який (ї) є протеолітично неактивним; (ії) зберігається в азурофільних гранулах поліморфно-ядерних лейкоцитів; і (ії) є хемоатрактантом для моноцитів і/або активує моноцити. НВР може бути ссавця, зокрема людини. Зокрема, НВР може бути розвинутий НВР людини, що принаймні має приблизно 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою в ЗЕО 0 МО:1, краще - принаймні приблизно 9095, ще краще - принаймні ЄМ приблизно 9595, найкраще - принаймні приблизно 9795 (далі - "гомологічні поліпептиди"), які якісно зберігають г) активність вищезгаданого НВР. зл ШЕ В На я в
Амінокислотні послідовності гомологічних поліпептидів відрізняються від амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО І МО: 1, вставкою або делецією одного або кількох амінокислотних залишків та/або « дю заміщенням одного або кількох амінокислотних залишків іншими амінокислотними залишками. Переважно з амінокислотні зміни є незначними, тобто консервативними амінокислотними заміщеннями, які не мають значного с впливу на склад та/або активність білка; невеликі делеції, як правило, від однієї до приблизно 30 :з» амінокислот; невеликі подовження на аміно- або карбоксильному кінці, такі як аміно-кінцевий метіоніновий залишок; невеликий лінкерний пептид з приблизно 20-25 залишків; або невелике подовження, яке сприяє очищенню шляхом зміни результуючого заряду або іншої функції, таке як полігістидиновий тракт, антигенний - 75 епітоп або домен зв'язування.
Приклади консервативних заміщень належать до групи основних амінокислот (таких як аргінін, лізин та -і гістидин), кислотних амінокислот (таких як глутамінова кислота та аспарагінова кислота), полярних амінокислот с (таких як глутамін та аспарагін), гідрофобних амінокислот (таких як лейцин, ізолейцин та валін), ароматичних амінокислот (таких як фенілаланін, триптофан та тирозин) та малих амінокислот (таких як гліцин, аланін, (ее) 50 серин, треонін та метіонін). Амінокислотні заміщення, які в цілому не змінюють специфічну активність, сп спеціалістам відомі і описані, (наприклад, у роботах Н. Мега апа Кк... НіІЇЇ, 1979, Те Ргоївіпз, Асадетіс
Ргезв, Мем/ МогКк)|. Найпоширенішими змінами є: Аїа/Зег, МаїЛіе, Азр/сІШ, Тиг/Зег, АїІа/зІу, Аїа/ТНг, Зег/Авзп,
Аїа//аї, Зег/СіІу, Ту/Рпе, АїІа/Рго, І ув/Агд, Авр/Авп, ІешІе, Іеши/Маї, Аїа/СіІй, Авзр/бІуУ, а також ці зміни у зворотному напрямку.
Цей термін, зокрема охоплює пептидні фрагменти НВР, і особливо фрагменти з хемотаксичним впливом,
ГФ) подібним до природного НВР. Крім того, НВР, які застосовують у способах згідно з даним винаходом, 7 зв'язуються з антагоністами НВР, такими як апротинін та/або моноклональне антитіло, яке виробляється проти природного НВР людини. Природний НВР людини у його розвинутій формі має амінокислотну послідовність, показану в ЗЕО ІО МО:1 і, крім того, () є протеолітично неактивним; (ії) зберігається в азурофільних 60 гранулах поліморфно-ядерних лейкоцитів; і (ії) є хемоатрактантом для моноцитів і/або активує моноцити.
НВР виділяють із кров'яних пластинок, одержаних із крові людини з застосуванням процедур, описаних |У патенті США Мо 5,814,6021. Точніше, білок виробляється шляхом фракціонування екстракту кров'яних пластинок.
З цією метою доцільно застосовувати колонкову хроматографію з використанням гепарин-сефарози. Такий хроматографічний спосіб, який включає в себе градієнтне елюювання з Масі від О,5М до ЗМ колонки, через яку 65 спочатку пропускали екстракт кров'яних пластинок, в результаті призводить до елюювання двох піків. Перший пік
- приблизно 1,2М Масі - може бути виміряний на рівні 280НМ як великий білковий пік, який і є фактором росту тромбоцитів (РЕ,) та відомий у галузі. Кількість білка приблизно 1,8М Масі є меншою за межу виявлення у застосовуваній системі, але фракції в цій ділянці мають ангіогенну активність. Активні фракції додатково очищують шляхом мікроколонкової протифазної НРІС на колонці С 4, при 214НМ можна виявити повністю очищений білок, цей білок ідентично представлений в НВР як свинячого, так і людського типу, залежно від типу застосованих пластинок.
Якщо НВР має бути застосований для виявлення антагоністів НВР, його в оптимальному варіанті одержують через представлені нижче способи рекомбінантних ДНК. Нуклеїновокислотна послідовність, що кодує НВР, може 7/0 бути одержана синтетично загальноприйнятими стандартними способами, наприклад, фосфоамідитним способом, (описаним 5... Веаисаде апа М.Н. СагціНегз, 1981, Теїгапедгоп І ебеге 22:1859-1869, або способом, описаним Майпез еї аІ., 1984, ЕМВО доигпа! 3:801-8051. Згідно з фосфоамідитним способом, олігонуклеотиди синтезують, наприклад, в автоматичному синтезаторі ДНК, очищують, відпалюють, зшивають і клонують у відповідні вектори.
Технології виділення або клонування нуклеїновокислотної послідовності, що кодує гепарин-зв'язаний білок, застосовані у способі згідно з даним винаходом, спеціалістам відомі і включають в себе виділення з геномної
ДНК, одержання з кДНК або комбінацію цих способів. Клонування нуклеїновокислотних послідовностей із геномної ДНК згідно з даним винаходом здійснюють, наприклад, шляхом застосування загальновідомої полімеразноланцюгової реакції (РСК) або відбору за допомогою антитіл експресійних бібліотек для виявлення Клонованих фрагментів ДНК зі спільними структурними фрагментами. Дивись, |наприклад, Іппіз еї а!., 1990, А
Сціде о Меїйодз апа Арріїсайоп, Асадетіс Ргез5, Мем Могк). Застосовують й інші процедури нуклеїновокислотної ампліфікації, такі як лігазноланцюгова реакція (І СК), зшита активована транскрипція (Г АТ) та ампліфікація на основі нуклеїновокислотної послідовності (МАЗВА).
Нуклеїновокислотну послідовність після цього вставляють у рекомбінантний експресійний вектор, який може сч бути будь-яким вектором, який можна піддати процедурі рекомбінантної ДНК. Вибір вектора часто залежить від клітини-хазяїна, в яку його вводять. Таким чином, вектор може бути автономним вектором реплікації, тобто і) вектором, що існує як позахромосомне утворення, реплікація якого є незалежною від хромосомної реплікації, наприклад плазміда. В альтернативному втіленні вектор може бути таким, який при введенні у клітину-хазяїн інтегрується в геном клітини-хазяїна й реплікується разом із хромосомою(ами), у яку (які) його було інтегровано. ю зо Нуклеїновокислотна послідовність, яка кодує ЗЕО І МО: 1, ЗЕО ОО МО:2, може бути функціонально зв'язана з нуклеїновою кислотою, яка кодує гетерологічну рго- та/або сигнальну послідовність. В со альтернативному втіленні нуклеїнова кислота, яка кодує ЗЕО ІЮ МО5:4 (сигнальна послідовність - розвинутий с
НВР) та 6 (сигнальна послідовність ї- рго-послідовність - розвинутий НВР), ЗЕО ІЮ МОБ5:З та 5 відповідно, можуть бути введені у рекомбінантний вектор. - ші ай 5 и З -і -і (95) Що (ее) 60 б5
ШИ
Ії ик ти стен - поле ки скит й м н с
ПОД т Кт око КС ИН Отит ВІТ сн вд ЗВ пе нн нн ан їм
Нуклеїновокислотна послідовність, яка кодує НВР, також може бути функціонально зв'язана з придатним з с термінатором, таким як термінатор гормону росту людини (Раїті(ег еї аї., ор. сії) Вектор також може містити інші елементи. До них належать сигнали поліаденілування (наприклад, з ЗМ 40 або ділянки аденовірусу 5 ЕЇїб), ів . . НЯ . . . НЯ а послідовності транскрипційних енхансерів (наприклад, енхансер ЗМ 40) та послідовності трансляційних енхансерів (наприклад, ті, що кодують аденовірус МА КМАзв). Рекомбінантний експресійний вектор також може
Містити ДНК послідовність, яка дозволяє вектору повторюватися в даній клітині-хазяїні. Цей вектор також може -І включати в себе селектований маркер, наприклад, ген, продукт якого доповнює нестачу в клітині-хазяїні, такий як ген, що кодує дигідрофолат-редуктазу (ОНЕК), або такий, що надає резистентності до медикаменту,
Ш- наприклад, неоміцин, генетицин, ампіцилін або гігроміцин. 2) У конкретному втіленні НВР можна виробляти шляхом культивування клітин-хазяїнів, що містять послідовність ДНК, яка кодує розвинутий НВР, розташований після М-кінцевого подовження, у відповідному со культуральному середовищі в умовах, які дозволяють експресію НВР, і вилучення одержаного в результаті НВР сп з культурального середовища як подовженого на М-кінці НВР.
М-кінцеве подовження може бути послідовністю, яка містить у собі приблизно від 5 до 25 амінокислотних залишків, зокрема від приблизно 8 до приблизно 15 амінокислотних залишків. Походження амінокислотних ов Залишків в М-кінцевій послідовності вважають несуттєвим.
Для підвищення вироблення розвинутого НВР, як правило, обирають послідовність ДНК, що кодує
Ф) подовжений на М-кінці НВР, яка містить послідовність ДНК, що кодує сайт розщеплення протеази, розміщений ка між послідовністю ДНК, що кодує М-кінцеве подовження, та послідовністю ДНК, що кодує розвинутий НВР.
Прикладами підходящого сайта розщеплення протеази є сайт розщеплення ентерокінази з амінокислотною бо послідовністю, сайт розщеплення фактора Ха з амінокислотною послідовністю.
В альтернативному втіленні клітини-хазяїни, які містять ДНК, що кодує розвинутий НВР, якому передує сигнальна послідовність, культивують у відповідному культуральному середовищі в умовах, які дозволяють експресію НВР, і одержаний в результаті НВР вилучають із культурального середовища як розвинутий НВР.
Процедури, зшивання нуклеїновокислотних послідовностей, які кодують НВР або подовжений на М-кінці НВР, 65 дрго-НВР (сигнал ї- розвинутий НВР), промотор та термінатор відповідно, і введення їх у відповідні вектори, що містять інформацію, необхідну для реплікації, є добре відомими спеціалістам (пор., наприклад,
затргоок еї аї., ор. 9У.
Клітина-хазяїн (клітини-хазяїни), у яку(ї) вводять вектор експресії може бути будь-якою(ими) клітиною(ами), здатною(ими) виробляти НВР, і в оптимальному втіленні є еукаріотною(ими) клітиною(ами), наприклад, клітиною(ами) безхребетних (комах) або клітиною(ами) хребетних, наприклад, клітиною(ами) ссавців, зокрема клітиною(ами) хребетних та ссавців. В оптимальному втіленні, клітина ссавця є клітиною, яка може бути культивована в анаеробних умовах після трансфекції нуклеїновою кислотою, що кодує НВР ссавця. Особлива перевага надається втіленню, де клітина ссавця є трансформованою(ими) аденовірусом клітиною(ами) або походить від ембріональної(их) клітини(клітин). Як було визначено авторами, клітина, яка походить від 70 ембріональної клітини, є клітиною, одержаною від первинної культури ембріональних клітин, або клітина(и) з лінії клітин, яка первісно походить від первинної культури ембріональних клітин. Прикладом такої трансформованої аденовірусом клітини або похідної від ембріона клітини є клітина(и) нирки ембріона людини (НЕК), зокрема клітини НЕК 293. Клітина комахи може бути, наприклад, клітиною лускокрилих або дрозофіли.
Способи трансфікування клітин ссавців та експресування послідовностей ДНК, введених в клітини, описано,
Інаприклад, у роботах Кацїтап апа Зпагр, 1982, 9. Мої. Віої. 159:601-621; бБоційегп апа Вего, 1982, 9. Мо).
Аррі. Сепеї. 1:327-341; І оуїег еї аЇ.,, 1982, Рос. Май, Асад. Зсі. ОБА 79:422-426; МУідіег еї аї., 1978, Сеї 14:725; Согзаго апа Реагзоп, 1981, Ботаїйіс СеїЇ Сепеїйісв 7:603, бСгапат апа мап дег ЕБ, 1973, Мігоїюду 52:456;
ЕгаІеу еї аї., 1980, УВС 225:10431; Саресспі, 1980, СеїІ 22:479; М/ірегод еї аіІ., 1983, МАК 11:7287; і Мештапп еї аІ,, 1982, ЕМВО )). 1:841-845). Клітини комах трансфікують вектором бакуловірусу, як описано |в патенті США
Ме4,745,0511.
Середовище для культивування клітин може бути будь-яким традиційним середовищем, придатним для вирощування клітин ссавців, таким як середовище, що містить або не містить сироватку і містить відповідні додатки, або середовищем, придатним для вирощування клітин ссавців. Усі середовища, які можна придбати через торгову мережу або одержати згідно з опублікованими рецептами (наприклад, у каталогах Американського с зібрання типових культур), є придатними. Клітини відбираються на стійкість до антибіотиків. Після цього вибрані клони перевіряють на активність НВР, застосовуючи такі відомі спеціалістам способи, як хемотаксичний і) аналіз та аналіз вивільнення цитокінів з моноцитів |див., наприклад, Казтивззеп еї аіІ., 1996, РЕВ5З І ей. 390:109-112).
НВР, що виробляється клітинами, потім вилучають із культурального середовища традиційними способами, у ю зо тому числі відокремленням клітин-хазяїнів від середовища шляхом центрифугування або фільтрування, осадженням білкових компонентів спливаючого шару або фільтрату за допомогою солі, наприклад, сульфату со амонію, очищенням з застосуванням різних хроматографічних процедур, наприклад, іонообмінної хроматографії, с афінної хроматографії тощо.
Якщо НВР є подовженим на М-кінці НВР, після вилучення з культурального середовища подовжений на ї-
М-кінці НВР краще розщепити відповідною протеазою для утворення розвинутого (і активного) НВР. Прикладами ї- відповідних ферментів є, крім інших, ентерокіназа та фактор Ха.
Антагоністи НВР
Антагоністом НВР можуть бути як анти-НВР поліклональні, так і моноклональні антитіла. Для одержання поліклональних антитіл анти-НВР застосовують таку процедуру. Для вироблення антитіла шляхом ін'єкції НВР, в « оптимальному втіленні - НВР людини, імунізують різних тварин-хазяїнів, у тому числі, крім інших, кролів, з с мишей, щурів, кіз та ін. В одному з втілень НВР можуть бути кон'юговані з імуногенним носієм, наприклад, альбуміном сироватки великої рогатої худоби (В5А) або гемоціаніном молюсків виду Астаеа (КІН). Для ;» посилення імунологічної реакції, застосовують різні імуностимулятори, залежно від виду хазяїнів, а саме, крім інших, ад'ювант Фрейнда (повний і неповний), мінеральні гелі, такі як гідроксид алюмінію, поверхнево-активні Дечовини, такі як лізолецитин, поверхнево-активні поліоли/поліаніони, пептиди, олійні емульсії, гемоціаніни -І молюсків виду Астаєа, динітрофенол та потенційно корисні імуностимулятори людини, такі як ВСО (бацила
Саітеце-Сшиегіп) та Согуперасіегішт рагмит. - Для одержання моноклонального антитіла, яке зв'язується з принаймні одним епітопом НВР, зокрема НВР оо людини, застосовують різні процедури, причому вищезгаданий епітоп зв'язується з комплексом 5р прекалікреїну-Н-кініногену й активує вивільнення брадикініну. В оптимальному втіленні моноклональне антитіло со є моноклональним антитілом людини. Може бути застосована будь-яка технологія, яка забезпечує вироблення сп молекул антитіла безперервною лінією клітин у культурі. До них, крім інших, належать гібридомний спосіб, вперше розроблений |Копіег апа Міїзієїп (1975, Майте 256:495-497)), а також триомний спосіб, гібридомний спосіб В-клітин людини |Когбогеї а/!., 1983, ІттипоЇоду Тодау 4:721, та ЕВМУ- гібридомний спосіб для утворення дв Моноклонального антитіла людини |Соїе еї а), 1985, Мопосіопа! Апіродіез апа Сапсег ТНегару, АїЇап К. Іі івв,
Іпс., сс.77-96Ї1. У додатковому втіленні винаходу моноклональні антитіла можуть вироблятися у трансгенних
Ф) тваринах із застосуванням сучасних технологій |РСТ/І590/02545; Сгееп, 1999, у). Іттипої. Меїподз 231:11-23 та ка пат. США МоМо5,625,126 та 5,633,425). Згідно з винаходом, антитіла людини можуть бути використані та одержані шляхом застосування гібридом людини |Соїе еї а). 1983, Ргос. Май. Асад. Зсі. О.5.А. 80:2026-2030| або бо перетворенням В-клітин людини вірусом ЕВМ іп мйго |Соїе еї аї., 1985, Мопосіопа! Апіїродіев апа Сапсег
Тнегару, Аїап К І ізв, сс.7 7-96).
Згідно з винаходом, описані технології вироблення одноланцюгових антитіл (пат. США Мо4,946,778)| можуть бути адаптовані для утворення НВР-специфічних одноланцюгових антитіл. У додатковому втіленні винаходу застосовують технології, описані для конструювання Раб експресійних бібліотек |Низе еї аї!., 1989, Зсіепсе 65 246:1275-1281), що дозволяють швидко й легко розпізнавати моноклональні РГар фрагменти зі специфічністю до
НВР.
Фрагменти антитіл, які містять ідіотип молекули антитіла, можуть бути отримані відомими способами.
Наприклад, до таких фрагментів, крім інших, належать: фрагмент Е(абр').зир.2, який можна отримати шляхом розщеплення молекули антитіла пепсином; фрагменти Бар, які можна одержати шляхом відновлення дисульфідних містків фрагмента К(аб').зи0.2 та фрагментів Раб, які можна одержати шляхом обробки молекули антитіла папаїном та відновлювальним агентом.
При одержанні антитіл відбір потрібних антитіл здійснюють відомими спеціалістам способами, наприклад, способом радіоїмунного аналізу, ЕЇІ5А (твердофазного імуносорбентного аналізу), багатошарового імунологічного аналізу, імунорадіометричних аналізів, гель-дифузійних реакцій преципітації, імунодифузійних 70 аналізів, імунологічних аналізів іп зйш (з застосуванням, наприклад, колоїдного золота, ферментних або радіоїзотопних міток), вестерн-блотингу, реакцій осадження, аглютинаційних аналізів (наприклад, гель-аглютинаційних аналізів, гемаглютинаційних аналізів), аналізів фіксації комплементу, імунофлуоресцентних аналізів, протеїн А-аналізів, імуноелектрофорезних аналізів тощо. В одному з втілень зв'язування антитіла виявляють шляхом виявлення мітки на первинному антитілі. В іншому втіленні первинне антитіло виявляють /5 шляхом виявлення зв'язування вторинного антитіла або реагенту з первинним антитілом. В іншому втіленні мітять вторинне антитіло. Спеціалістам відомо багато способів виявлення зв'язування в імунологічному аналізі, і які охоплюються обсягом даного винаходу.
В альтернативному втіленні бібліотеку антитіл анти-НВР комплектують способом вияву фагів (див., наприклад, КозсієївКа еї аі., 1998, Асіа Віоспітіса Роїїпіса 45:705-720). З бібліотеки відбирають найсильніші Зв'язувальні компоненти, які використовують як антагоністи НВР.
Антагоніст НВР також може бути поліпептидом, який містить Кипіїг-типу домен інгібітору серинової протеази, який зв'язується з НВР. Пептиди, які містять Кипії:-типу домени інгібітору серинової протеази, як правило, мають приблизно 60 залишків та шість розташованих на певній відстані цистеїнів, присутніх у дисульфідних зв'язках. У конкретному втіленні, якщо НВР є НВР людини, то Кипії2-типу інгібітор може бути сч ов апротиніном, який також відомий як ВРТІ або його аналог, що зв'язується з НВР. В оптимальному втіленні аналог апротиніну має мутації у позиціях 12-19 та 34-39, перевага надається, якщо мутації у позиціях 15-19. Інші і) аналоги, які можуть бути застосовані, описано (у патентах США МоМо5,162,498, 5,316,923, 5,395,922, 5,514,585, 5,510,249, 5,591,603, 5,618,915, 5,621,074, 5,673,090, 5,618,696 та 5,576,294|. У найхарактернішому втіленні мутаціями є А16Н, К15А, 118М, 1195, К17Т. ю
Великі бібліотеки (107-109) поліпептидів, які включають в себе Кипії-типу домени, комплектують, застосовуючи різні підходи. Наприклад, піддана похибкам РОК |Заїкі еї аІ., 1988, Зсіепсе 293:487-491) може со бути застосована до кожного окремого Кипіїг-типу домену. Ця процедура передбачає випадкове включення со неправильного нуклеотиду до гена кожного відповідного Кипії2-типу домену шляхом здійснення РСК-реакції в умовах, коли Тад-полімераза включає в себе неправильні нуклеотиди на етапі ампліфікації. Бібліотеку можна - виявити на фагових частинках для відбору найкращого зв'язувального компонента для НВР. -
В альтернативному втіленні певні петлі можуть бути піддані мутагенезу шляхом застосування дегенерованих олігонуклеотидів (Зспіег еї аі., 1996, Сепе 169:147-153). Синтетичні випадкові олігонуклеотиди вводять у
Кипії2-типу домен під час РСК, що комплектує бібліотеку з варіантами в певній петлі. «
Згідно з іншим підходом, бібліотеки можуть бути укомплектовані через перетасовування ДНК |Зіеттег еї аї., 70 1994, Маїцге 370:389-391). Цей спосіб застосовують для рекомбінації між гомологічними Кипій2-типу доменами. - с Тобто, ДНК, що кодує кожен з варіантів, змішують і фрагментують на дрібні частини. Ці частини потім повторно ц збирають шляхом звичайної РОК реакції. Під час цієї реакції дрібні частини з'єднуються між собою, оскільки "» вони комплементарні, що спричинює рекомбінацію відповідних генів.
Способи виявлення
Для виявлення антагоністів гепарин-зв'язаного білка (НВР) потрібно визначити, чи зв'язується речовина, -І яку вважають антагоністом НВР, з НВР, з цією метою проводять (а) інкубацію НВР з першою речовиною, що взаємодіє з НВР, та другою речовиною, яку вважають антагоністом НВР, і (б) виявлення будь-якого впливу 7 вищезгаданої другої речовини, яку вважають антагоністом, на взаємодію НВР з вищезгаданою першою оз речовиною, причому зниження взаємодії НВР з першою речовиною вказує на те, що друга речовина є антагоністом НВР. со НВР або перша речовина можуть бути міченими. Мітку переважно вибирають із групи забарвлених сл ферментів або флуоресцентних речовин, радіоактивних ізотопів та агентів, що утворюють комплекси.
Прикладами ферментів, які застосовують як мічені речовини, є пероксидази (наприклад, пероксидаза хрону), фосфатази (наприклад, кисла або лужна фосфатаза), В-галактозидаза, уреаза, глюкозооксидаза, Ккарбоангідраза, ацетилхолінестераза, глюкоамілаза, лізозим, малатдегідрогеназа, глюкоза-6-фосфатдегідрогеназа, р-глюкозидаза, протеази, піруватдекарбоксилаза, естерази, люцифераза тощо.
Ф, Ферменти самі не можуть бути виявлені, вони повинні бути у комбінації з субстратом для каталізації ко реакції, кіндневий продукт якої може бути виявлений. Прикладами субстратів, які застосовують згідно зі способом за даним винаходом, є перекис водню/тетраметилбензидин або хлорнафтол або о-фенілендіамін або бо З-(р-гідроксифеніл) пропіонова кислота або люмінол, індоксил фосфат, р-нітрофенілфосфат, нітофеніл галактоза, 4-метил умбеліферил-О-галактопіранозид або люциферин.
В альтернативному втіленні мічена речовина може містити забарвлені або флуоресцентні речовини, у тому числі частинки золота, забарвлені або флуоресцентні латексні частинки, частинки барвника, флуоресцеїн, фікоеритрин або фікоціанін. 65 Радіоактивні ізотопи, які застосовують з цією метою, вибирають з 7291, 1911111), ЗН, 82Р, С та 358,
Радіоактивність, що випромінюється цими ізотопами, вимірюють гамма-лічильником або сцинтиляційним лічильником відомим спеціалістам способом.
Агенти, що утворюють комплекси, які застосовують з цією метою, вибирають з біотину (який утворює комплекс з авідином або стрептавідином), авідину (який утворює комплекс з біотином), протеїну А (який утворює
Комплекс з імуноглобулінами) та лектинів (які утворюють комплекс з вуглеводими рецепторами). Оскільки комплекс не може бути прямо виявлений, необхідно позначити речовину, з якою цей агент утворює комплекс.
Мічення є успішним з будь-якою з вищезгаданих мічених речовин для мічення ферменту.
У конкретному втіленні зв'язування антагоніста НВР з НВР виявляють шляхом застосування, наприклад, технології ЗРА від Атегепат Рагтасіа Віоїесі. Тобто, біотиніловані плазматичні мембрани з ендотеліальних 7/0 Клітин пупкової вени (НОМЕС) зв'язуються з кон'югованими стрептавідином РУТ ЗРА гранулами. Ці гранули одержують від Атегепат РІагптасіа Віоїеси. До мембран додають мічений кініноген людини (наприклад, ЗН, 125|), доки сайти зв'язування з кініногеном не насичуються. НВР додають зі збільшенням концентрації для витіснення міченого кініногену й вимірюють зниження включення мітки. Будують стандартну криву витіснення. Антагоніст НВР випробують на здатність інгібувати опосередковане НВР витіснення 75 радіоактивного кініногену для плазматичних мембран. Зокрема, НВР інкубують з різними концентраціями, до молярного надлишку антагоністів НВР, і визначають їх здатність інгібувати опосередковане НВР витіснення міченого кініногену з мембран.
В альтернативному втіленні антагоністи НВР виявляють шляхом культивування ендотеліальних клітин за наявності НВР і за наявності та відсутності речовини, яку вважають антагоністом. У конкретному втіленні антагоністом є моноклональне антитіло, яке зв'язується з принаймні одним епітопом НВР, в оптимальному варіанті - НВР людини, причому вищезгаданий епітоп зв'язується з комплексом прекалікреїну-Н-кініногену й активує вивільнення брадикініну. В оптимальному втіленні моноклональне антитіло є моноклональним антитілом людини. В одному з втілень антитіло та НВР разом піддаються попередній інкубації перед інкубацією з ендотеліальними клітинами протягом приблизно 10 хвилин при 372С. Вплив речовини на функцію проникності СМ ендотеліальних клітин визначають шляхом вимірювання трансендотеліального електричного опору або (5) визначення альбумінового зазору, як описано нижче у Прикладах. Знижена функція проникності має свідчити, що речовина не діє як антагоніст НВР.
У конкретному втіленні зв'язування моноклонального антитіла з принаймні одним епітопом НВР, коли вищезгаданий епітоп зв'язується з комплексом прекалікреїну-Н-кініногену й активує вивільнення брадикініну, ІФ) визначають шляхом інкубації антитіла з НВР та комплексом прекалікреїну-Н-кініногену. Як більш детально со описано у Прикладах, НВР зв'язується з комплексом прекалікреїну-Н-кініногену, таким чином, стимулюючи вивільнення брадикініну. Моноклональне антитіло, яке зв'язується з принаймні одним епітопом НВР, має со знижувати вивільнення брадикініну або запобігати йому. Аналіз вивільнення брадикініну здійснюють відомими М спеціалістам процедурами, наприклад, імунологічним аналізом.
В одному з втілень вкриваючий буфер містить 0,0595 Тмееп, 15,9МмМ динатрійкарбонату З5мМ їК- гідрокарбонату натрію, рНО,б. Додають Н-кініноген і інкубують при 492С протягом ночі. Вкриваючий буфер видаляють і планшет промивають Тгіз буфером, рН7,4, що містить приблизно 50ОМ цинку. Після цього додають прекалікреїн і суміш інкубують протягом год. при кімнатній температурі. Після цього додають НВР у Ттгіз « буфері і зразки видаляють з приблизно 10-хвилинними інтервалами протягом приблизно 1 години, починаючи приблизно через 5 хвилин після додавання НВР і піддають аналізу на вивільнення брадикініну. В одному з - с втілень вивільнення брадикініну аналізують з допомогою комплекту для ЕІ ІЗА-аналізу серійного виробництва "» (МАККІТ-М ВгадукКкіп, Оаіпірроп РНаптасешцшііса! Со., (4). У цьому аналізі здійснюють конкурентну реакцію " брадикініну у зразку та міченого пероксидазою брадикініну з антитіла проти ВК (кроля), захопленого антитілом
Ід анти-кроля (кози), що вкриває мікросмужкову лунку. Концентрацію брадикініну визначають за ферментною активністю міченого пероксидазою брадикініну, зв'язаного з антитілом анти- брадикініну. - В альтернативному втіленні прекалікреїн та Н-кініноген додають в еквімолярній кількості до моношару -І ендотеліальних клітин і інкубують протягом год. при 372С. Після цього додають НВР і зразки видаляють з приблизно 10-хвилинними інтервалами протягом приблизно 1 години, починаючи приблизно через 5 хвилин і після додавання НВР, і проводять аналіз на вивільнення брадикініну, застосовуючи процедури, описані вище. о 20 У іншому втіленні прекалікреїн та Н-кініноген додають в еквімолярній кількості до розчину плазми, що містить інгібітор АСЕ (ангіотензин-конвертуючого ферменту) і інкубують протягом год. при 3720. Після цього сл додають НВР і зразки видаляють з приблизно 10-хвилинними інтервалами протягом приблизно 1 години, починаючи приблизно через 5 хвилин після додавання НВР, і проводять аналіз на вивільнення брадикініну, застосовуючи процедури, описані вище. 52 Способи лікування
Ф! Композиція згідно з даним винаходом містить частину водного розчину. Розчин в оптимальному варіанті має бути фізіологічно прийнятним, щоб після введення в організм пацієнта потрібної послідовності, розчин не о призводив до побічної дії на електролітичний та об'ємний баланс пацієнта. Водне середовище для композиції, таким чином, може містити в собі, наприклад, нормальний фізіологічний розчин (0,995 Масі, 0,15М), ріН7-7 4 або 60 інші його фармацевтично прийнятні солі. Розчини для застосування готують будь-яким способом, добре відомих серед фармацевтів, описаних, (наприклад, у роботі "Кетіпдіоп'є Рпагтасеціїса! Зсіепсев", (Сеппаго, А., ед.),
Маск Риб., 19901.
Концентрація антагоніста НВР може бути різною, а саме приблизно від менше ніж 0,595, наприклад, від 195 до 15-2095 за масою. Одинична доза композиції, як правило, містить приблизно від 1Омг до 1г антагоніста НВР. бо Терапевтично ефективні дози визначаються іп міо або іп мімо.
Антагоніст НВР вводять місцево, підшкірно або шляхом внутрішньовенної ін'єкції. Дозування призначається лікарем згідно з конкретним станом конкретного пацієнта. Дозування та частоту введення ретельно підбирають і врегульовують відповідно до параметрів, визначених лікарем. Оптимальним шляхом введення може бути, наприклад, внутрішньочеревинна ін'єкція. Внутрішньовенні внутрішньочеревинні ін'єкції антагоніста НВР здійснюють на 24-годинній основі доза відповідно становить 0,1-100мг, краще - 0,5-50мг, ще краще - 1-25мг на 1кг маси тіла. Дозу вводять 1-4 рази на 24 години або вводять безперервно через катетер. В альтернативному втіленні лікування здійснюють шляхом безперервного внутрішньовенного вливання під час хірургічної операції з наступним післяопераційним лікуванням протягом 1-4 днів. 70 Антагоніст НВР вводять лише пацієнтам, які виробляють НВР, який зв'язується з антагоністом НВР. Для визначення, чи виробляє пацієнт такий НВР, НВР виділяють із кров'яних пластинок пацієнта, застосовуючи процедури, описані вище. Зв'язування НВР з антагоністом НВР (наприклад, моноклональним антитілом) або вплив НВР на функцію проникності ендотеліальних клітин виявляють з допомогою процедур, описаних вище, і порівнюють із впливом природного НВР. В альтернативному втіленні вплив НВР на скорочення ендотеліальних /5 клітин або фібробластів чи агрегацію моноцитів за наявності або відсутності антагоніста НВР також може бути визначений із застосуванням процедур, (описаних у УУО93/05396). Знижена здатність до скорочення або агрегації клітин вказує на наявність взаємодії між НВР та антагоністом НВР. Випробувальний комплект, який застосовують для визначення, чи виробляє пацієнт такий НВР, включає в себе (а) антагоніст НВР; (б) НВР або клітину, що виробляє НВР, і (в) речовину, тканину, клітини або компонент, що взаємодіють із НВР.
У конкретному втіленні НВР чи клітини або тканину, які виробляють НВР, виділяють з організму пацієнта.
НВР чи клітини або тканину, що виробляють вищезгаданий НВР, інкубують з ендотеліальними клітинами й визначають вплив на функцію проникності за наявності та відсутності моноклонального антитіла, яке зв'язується з принаймні одним епітопом НВР, причому вищезгаданий епітоп зв'язується з комплексом прекалікреїну-Н-кініногену й активує вивільнення брадикініну. Цей вплив порівнюють із впливом природного НВР сч ов людини. У конкретному втіленні природний НВР людини може бути рекомбінантним НВР, який зв'язується з таким самим моноклональним антитілом. В альтернативному втіленні НВР або клітини, або тканину, які і) виробляють НВР, інкубують за наявності комплексу прекалікреїну-Н-кініногену та за наявності моноклонального антитіла. Визначають вплив моноклонального антитіла на вивільнення брадикініну. Зниження вивільнення брадикініну за наявності антитіла вказує на те, що пацієнт виробляє НВР, який зв'язується з антитілом. За цих ю зо умов випробувальний комплект має включати в себе (а) моноклональне антитіло, яке зв'язується з принаймні одним епітопом на НВР, причому вищезгаданий епітоп зв'язується з комплексом прекалікреїну-Н-кініногену й со активує вивільнення брадикініну; (б) природний НВР людини та (в) комплекс прекалікреїну-Н-кініногену, с приєднаний до твердої основи.
Приклади в.
Приклад 1: Активовані нейтрофіли ініціюють зміни в ендотеліальній бар'єрній функції сигналізуванням через ї-
В2 інтегрини
Матеріали та способи
Реагенти
Середовище-199, КРМІ-1640 (яке містить І-глутамін), сироватку ембріона великої рогатої худоби (ЕВ5), « трипсин-ЕОТА, фосфатну буферну сіл (РВ5) та збалансований соляний розчин Хенкса (НВ55) отримують від пл») с Же Тесппоіодієз (Сайпегериго, МО, ОА). Желатин, колагеназу, пеніцилін, стрептоміцин, каталазу, альбуміном сироватки великої рогатої худоби (ВЗА), М-форміл-метіоніл-лейцил-фенілаланін (МІ Р), блакитний барвник ;» Еванса, гексадецилтриметиламонійбромід та тетраметилбензидин отримують від бЗідта Спетіса! Со. (51. І оців,
МО, ОА). НьО» отримують від Е. МегскК (ЮОагтвіаді Сегтапу). Віотайіх І отримують від Віотеаісаї! Тесппоіодіез Іпс. (Зіоцдпіоп, МА, ОА) і Оехігап 70 (Масгодех) та Рісої-Радце отримують від РНаптасіа -І Віогесп АВ (ррзаіа, Зм'едеп). Основне культуральне середовище містить 1:11 суміш С-199 та КРМІ-1640 з додаванням 20905 інактивованого нагріванням ЕВ5, пеніциліну (100Од/мл) та стрептоміцину (1ООмкг/мл).
Ш- Моноклональне антитіло ІВА4 проти звичайного В-ланцюга (СО18) Во-інтегринів надано Ог. Сіаез І ипабего, 2) РПпагтасіа 8 Оріопп (Оррзаїіа, Зул"едеп) з люб'язного дозволу ЮОг. Затие! Ю. УМгідні, КосКетеПег Опімегейу, тАБ 601, що розпізнає о,)ланцюг інтегрину (СО11Б) надано Ог. Мапие! Раїагтоуо, КагоїїпзКа Іпзійше, тА ОКЕС бо 200 (анти-І -селектин) надано Ог. Еидепе Виїспег, їаптога Опімегейу, тАБ 5К11 (анти-І -селектин) отримано від 4 Весіоп ОісКіпзоп, (Зап дозе, СА) і тАБ 0544-26 (анти-СО44) отримано від Ріагм-іпдеп (Зап Оіедо, СА). К(аб)» фрагмент антитіла кози анти-миші дО надано даскКвоп ІттипоКезеагсі І арогайогіев, Іпс. (М/еві Огоме, РА),
ЕІТО-кон'югований К(ар)» фрагмент антитіла кроля анти-миші Ід отримано від Оако А/5 (СіІовігир, Оептагк).
Ендотеліальні клітини
Ендотеліальні клітини пупкової вени людини (НОМЕС) та ендотеліальні клітини аорти великої рогатої худоби іФ) (ВАЕС) виділяють і культивують, як описано вище |(Сашат еї аї., 1998, Вій. У. Рпагт. 125:1109-1114ї4. НОМЕС ко або ВАЕС першого-п'ятого пропущення відокремлюють шляхом короткої (2хв.) обробки трипсином-ЕОТА (0,2590 трипсину / 0,0195 ЕОТА) і наносять або на неорганічну мембрану Апороге з розміром пор 0,2мкм, або на бо полікарбонатні фільтри з розміром пор З,Омкм (включення тканинної культури, їОмм; МОМС, Козкіїде, Оептагк).
Для сприяння диференціації клітин та посилення з'єднання ендотеліальних клітин (ЕС) фільтри попередньо обробляють 50мМА Віотайіх І (167Мг/мл) і висушують на повітрі. ЕС висівають з густиною 2 х109 клітин на фільтр і інкубують у культуральному середовищі при 372С у зволоженій атмосфері 595 СО» в повітрі. ЕС вирощують до конфлюентних моношарів, які можна виявити шляхом щоденних спостережень під мікроскопом та 65 вимірювання електричного опору поперек моношару (Сашат еї а/!., 1998, Вій. У. Рпагт, 125:1109-1114).
Вимірювання бар'єрної функції ЕС
Для визначення спричинених стимуляцією змін у функції проникності ЕС застосовують два різні підходи. Для вимірювання трансендотеліального електричного опору (ТЕЕК) фільтрові вставки з ЕС переносять до камери вимірювання опору |докладно див. у роботі Сашціат еї аїЇ., 1998, Вій. У. Рпагт. 125:1109-1114). Камеру (нижнє/люмінальне відділення) з фільтровими вставками (верхнє/люмінальне відділення), заповнену 2мл та 40О0мкл культурального середовища відповідно поміщують в інкубатор клітинних культур. Електричний опір поперек моношару ЕС вимірюють при 372 за допомогою електродів у кожному відділенні, розташованих у точній позиції відносно один до одного та до моношару. Результати електричного опору окремого моношару ЕС одержують шляхом віднімання опору відповідного фільтра, вкритого Віотаїйгіх, виміряного перед висіванням 7/0 ендотеліальних клітин.
В окремих експериментах кон'югований з блакитним барвником Еванса альбумін (ЕВА) застосовують як маркер макромолекулярної проникності моношарів ЕС. Перед стимуляцією ЕС культуральне середовище у верхньому відділенні замінюють середовищем, яке містить ЕВА (культуральне середовище, яке містить 4956 ВБА, змішаного з блакитним барвником Еванса в остаточній концентрації О,б7мг/мл). Концентрацію ЕВА у зразках 75 рідини верхнього та нижнього відділення визначають спектрофотометрично шляхом вимірювання оптичної густини при 620НМ (Тіепек МийізКап МОСС; Ріомж/ І арогаюгіез, ЗоІпа, Зм"едеп). Альбуміновий зазор розраховують за співвідношенням: М1-А2 хМ2х1/А1, де М1 є об'ємом зазору (тобто, теоретичним об'ємом люмінального середовища, очищеного від альбуміну шляхом дифузії з аблюмінальним відділенням), М2 є аблюмінальним об'ємом, і АТ та А2 є оптичною густиною люмінального та аблюмінального середовища відповідно. Базовий го зазор за відсутності будь-якого стимулу, в середньому 0,08 ї0,0Змкл/хв., віднімають від об'єму зазору, отриманого у відповідь на відповідний специфічний подразник.
Одержання й визначення кількості РММ
РММ людини виділяють із багатої на лейкоцити плазми, як (описано в роботі Саціат еї аї., 1998, Вгії. ..
Рпагт. 125:1109-1114), і ресуспендують у культуральному середовищі при концентрації 2-5х10'клітин/мл. се 25 Чистота РММ становить 29895, і їх життєздатність при витісненні трипанового синього становить 29595. Перед о додаванням до моношарів ЕС РММ інкубують протягом ЗОхв. з моноклональними антитілами проти молекул поверхні клітин для наступного зшивання з вторинним тАБ (див. експериментальні процедури).
У деяких експериментах експресію клітинної поверхні СОТ 16/С0О 18 регулюють у підвищенням температури
РММ перед застосуванням. РММ за наявності анти-СО 18 тАБ ІВ4 інкубують при 42С протягом 10хв., переносять Іс) 30 до 372 на 10хв., а потім повертають у 42 ще на 10Охв., після чого двічі промивають. РММ, які не піддають с обробці антитілом, одержують згідно з тим самим протоколом, застосовуючи носій замість антитіла.
Зчеплення РММ з ЕС та трансендотеліальну міграцію кількісно визначають шляхом аналізу ме)
РММ-специфічного ферменту о мієлопероксидази (МРО). Тобто, РММ розчиняють у 0,595 ч- гексадецилтриматиламонійброміді й центрифугують, ферментну активність у спливаючому шарі визначають
Зо спектрофотометрично за зміною оптичної густини при 65ОНМ, яка відбувається в окисно-відновній реакції ї-
Н2Оо-тетраметилбензидину, каталізованій МРО |(|БигикКі еї аї., 1983, АпаїЇ. Віоспет. 132:345-352) МРО активність зчеплених і перенесених РММ, відповідно, співвідносять із показником загальної кількості РММ, доданих до моношару ЕС. «
Експериментальні процедури 40 Перед перенесенням фільтрових включень до камери вимірювання опору (яку тримають при 37 2с) З с середовище у включенні та у камері замінюють на свіже культуральне середовище (372С) з додаванням 10ММ "з Нерез. У деяких експериментах моношар ЕС інкубують перед стимуляцією 1Омкг/мл Негрітусіп А протягом 15хв. при 372С і двічі промивають. РММ (2х109) з моноклональними антитілами, зв'язаними з молекулами поверхні клітин, або без них, додають у верхнє відділення (співвідношення РМІМ:ЕС-10:1) і залишають для осадження на -І 10хв. на моношарі ЕС. Активацію РММ спричинюють або МІ Р (10-7М), який додають у нижнє відділення, або перехресною компоновкою молекул поверхні клітин вторинними фрагментами ІдсС Р(абБ)2 кози-анти-миші. - Тансендотеліальний електричний опір вимірюють до і щохвилини після початку стимуляції, доки не досягають с фази плато у зміні опору, а потім з 5-хвилинними інтервалами. В експериментах з дослідженням проникності альбуміну та міграції РММ крізь моношар ЕС середовище у включенні було наявно ЕВА. Після перевірки (ее) імунності фільтрові вставки переносять з 5-10-хвилинними інтервалами до нових лунок, що містять свіже с середовище. Інкубацію в усіх випадках здійснюють при 372. Наприкінці експерименту нижні лунки центрифугують при 425г і 49 протягом 2Охв. і надосадову рідину аналізують на вміст ЕВА. Кількість РММ, що мігрувала крізь моношар, визначають шляхом аналізу МРО-активності гранул, що залишилися в лунці. Із
Середовища у фільтровому включенні відсмоктують рідину для визначення кількості незчепленого РММ і фільтрувальну, мембрану з ЕС видаляють із вставки для визначення кількості зчепленої фракції РММ. і) В окремих експериментах очищені РММ, попередньо оброблені анти-СО 18 тА ІВ4 (бмкг на 2х109 клітин) ко протягом ЗОхв., інкубують у культуральному середовищі з Е(аб)» кози-анти-миші або без нього протягом 10хв. при 372С. РММ осаджують шляхом центрифугування при 300 хг протягом 15хв. при кімнатній температурі і 60 вільний від клітин спливаючий шар, що містить продукти секреції РММ, декантують для використання в експерименті іп мімо (див. нижче) або з ЕС-моношарами. В останніх умовах середовище у включенні фільтр/ЕС замінюють на середовище, що містить секрецію РММ, і дані щодо впливу на ТЕЕК та проникність альбуміну записують, як описано вище. У деяких випадках середовище, що містить секрецію РММ, перед застосуванням інкубують за підвищеної температури (802С протягом 15хв.). бо Визначення утворення внутрішньоклітинного |(Са?ЛЕС та г-актину
Чутливий до Са?" флуоресцентний зонд Яйшо-З/АМ (Моіесціаг Ргорез Ешгоре ВУ, І еідеп, Тпе МейШйепапос3в) застосовують для визначення змін у вільному внутрішньоклітинному Са?" ЕС. Конфлюентні ВАЕС моношари на фільтрах інкубують протягом ЗОхв. при 372 з Яшо-3/АМ (ЗмкМ у НВ55, що містить 296 ЕС та 10ММ НЕРЕЗ), який додають як до апікальної, так і до базолатеральної поверхні. Моношари тричі промивають і інкубують зі свіжим НВЗ5 у темноті протягом 20хв. при кімнатній температурі для повного гідролізу естеру-барвника. До ЕС додають оброблені анти-СО! 8 або анти-І-селектиновим тАБ РММ і рецепторне зшивання стимулюють вторинним тАбБ, як описано вище. В окремих експериментах застосовують секрецію РММ, що містить середовище (див. вище) для стимуляції ЕС за відсутності РММ. Зміни в Са 27) ЕС у відповідь на ці стимули 70 вимірюють через безперервну реєстрацію інтенсивності флуоресценції за допомогою системи конфокальної візуалізації з лазерним скануванням (Іпзідні Ріив; Мегідіап Іпзігитепів Іпс., ОКетоп, Міспідап).
Для аналізу утворення ї-актину в ЕС у відповідь на активацію РММ конфлюентні моношари ЕС, які вирощували на вкритому Віотаїйіх склі, інкубують протягом 15хв. при 372С або з РММ, підданих зшиванню з антитілом СО18, або з секрецією РММ, що містить середовище, ідентичне застосовуваному для вищеописаних 75 процедур. Інкубація ЕС з обробленими ІВА РММ служить як контроль. Моношари фіксують у 3,795 формальдегіді в РВЗ протягом 1Охв. при кімнатній температурі, двічі промивають і пермеабілізують 0,296 Топ Х-100 у РВЗ5 (Іхв. при 42С). Клітини двічі промивають і забарвлюють на виявлення акти нових елементарних волокон
ЕІТОС-кон'югованим фалоїдином протягом 20Охв. при 37 2С. Після трьох додаткових промивань ендотеліальні клітини спостерігають у системі конфокальної візуалізації з лазерним скануванням (Іпзіднпі Ріив; Мегіаіап
Іпзігитепів Іпс., ОКетоп, Міспідап).
Іп мімо експерименти
Для дослідження впливу продуктів секреції РММ на мікросудинну проникність іп мімо застосовують інтравітальну мікроскопію мікроциркуляції защічного мішка хом'яка. Як описано детально вище (Каца 8. І іпарот, 1994, Іттипоіоду ої (Ше Місгосігсціайоп, Асадетіс Ргезз, 1994, розд. 7|, лівий защічний мішок сирійських с 29 золотих хом'яків під анестезії вивертають готують до мікроскопічних спостережень в умовах безперервної Ге) суперфузії бікарбонатного буфера з підтриманням фізіологічного рівня температури, рН та газової напруги.
ЕІТС-кон'югований декстран (Мол. маса: 150,000), введений шляхом внутрішньовенної ін'єкції (25О0мг/кг маси тіла) застосовують як плазмовий трасер, що забезпечує візуалізацію змін у проникності судин для макромолекул.
Мікросудини у відкритому защічному мішку спостерігають при невеликому збільшенні у флуоресцентному світлі що за допомогою мікроскопа І ей» Огіпоріап і записують на відео. Після контрольних записів суперфузію зупиняють о і їмл середовища, яке містить спричинену зшиванням СО18т секрецію РММ, при 37 «С місцево наносять на защічний мішок. У паралельних експериментах застосовують оброблене анти-5О018 середовище РММ, не о піддане зшиванню. -
Результати м
РММ (2х109), попередньо оброблені анти-З018 тАБ (84), додають до ЕС/фільтрових включень (люмінальний бік ЕС/верхнього відділення камери опору) і дають відстоятися протягом 10хв. Зшивання СО18 з вторинним антитілом кози анти-миші К(аб)» виявляло помітне зниження ТЕЕК, яке виявляється протягом 1хв., досягає свого максимуму (36-13 контролю) через 15хв. і залишається на своєму рівні протягом усього періоду « спостереження (Фіг.1). Ні обробка РММ тільки одним ІВ4, ні обробка вторинним тАбБ без ІВ4 не викликали жодних 7 с змін у ТЕЕК.
Ефективність зшивання СО18 для збільшення макромолекулярного потоку та міграції РММ крізь моношар ЕС з досліджують у додаткових експериментах. РММ, попередньо оброблені насичувальною концентрацією ІВ4, додають до ЕС/фільтрових включень і дають відстоятися протягом 1Охв. у середовищі, що містить ЕВА.
Зшивання СО18 так само виникає внаслідок дії антитіла кози анти-миші Е(ар)», ії РММ/ЕВА, що містить фільтрові -І вставки, які переносять з однаковими інтервалами до нових лунок зі свіжим середовищем. За відсутності вторинного антитіла, існує незначний незмінний зазор альбуміну, 0,08-40,0З3мклхв" (сер.-50, п-13), що не змінювався з часом і точно відповідав спонтанному діапазону, який виявляли у фільтрових вставках, що містять о необроблені РММ. І навпаки, активація РММ шляхом зшивання СО18 призводила до збільшення альбумінового зазору, яке дедалі зростало з часом (Фіг.1). Чисте збільшення альбумінового зазору зростало з 0,5 -0,1мкл під (ее) Я й о, час першого 5-хвилинного періоду до загального показника 20,0-4,5мкл (сер.-50, п-10) за бОхв. На відміну сл від збільшення альбумінового зазору, зшивання СО18 не призвело до помітного зчеплення РММ з ЕС або трансендотеліальної міграції (Фіг.1). З допомогою аналізу активності МРО у різних відділеннях через бохв. після зшивання СО18 було виявлено, що 91 16905 (сер.--50, п-9) доданих РММ відновлюються у середовищі, зібраному з верхнього відділення, тоді як у ЕС/фільтрі або у середовищі нижнього відділення значної
Ге! активності МРО не було виявлено. Дані безпосереднього мікроскопічного спостереження прозорих фільтрів, які промивають наприкінці експерименту, підтверджували відсутність РММ, зчеплених з моношаром ЕС. де Моношари ендотеліальних клітин мітять чутливим до Са 27 флуорофором Пио-3, і зміни, спричинені стимулом в ЕС Са"), спостерігали шляхом конфокальної мікроскопічної візуалізації з лазерним скануванням. 60 Додавання оброблених анти-СО18 РММ до моношару ЕС не викликало ніяких змін у (Са?) ЕС. Однак зшивання
СО18 з вторинним тАБб виявляло швидке збільшення цитозольно вільного (Са 7") ЕС, яке досягало піку через приблизно 100с, а потім повільно знижувалося. Зшивання антитіла І-селектину рівноцінним способом не викликало ніяких змін (Са 211 ЕС, тоді як реакція Са 25. подібна до тієї, що викликається зшиванням СО18, 65 спостерігається після стимуляції необроблених РММ ЯМІ Р |пор. Сашціат еї аї., 1998, Вій. 9. РВагтасо). 125:1109-1114). Про причинний зв'язок між змінами внутрішньоклітинної активності Са 7" та функціональною реакцією ЕС на активацію РММ свідчать експерименти, в яких ендотеліальні клітини попередньо обробляють кальцієвим комплексоном ВАРТА АМ. Ця обробка повністю інгібувала як збільшення вільного внутрішньоклітинного Са?" ЕС, так і зміни у ТЕЕК у відповідь на зшивання СО18.
В інших експериментах моношари ЕС інкубують з РММ, а потім забарвлюють на виявлення актинових елементарних волокон ЕІТС-кон'югованим фалоїдином. Конфокальна мікроскопічна візуалізація з лазерним скануванням виявляла, що ендотеліальні клітини, інкубовані з обробленим ІВ4 РММ за відсутності вторинного антитіла виявляли кілька напружених волокон та тонку смугу актину уздовж країв клітин у прямому контакті з сусідньою клітиною. З другого боку, ендотеліальні клітини, інкубовані РММ та зшиті СО18, виявляли помітне 70 Збільшення вмісту г-актину, а також кількості та густини напружених волокон.
Щоб дослідити, чи регулює(ють) фактор(и), які виділяються РММ, реакцію, яка зрештою веде до збільшення проникності ЕС, РММ (2х109), попередньо оброблені анти-СО18 тА ІВА і промиті для видалення незв'язаного антитіла, інкубують з антитілом кози анти-миші Б(аб)» протягом ЗОхв., а потім піддають легкому центрифугуванню. Додавання вільного від клітин спливаючого шару до моношару ЕС виявляло зниження ТЕЕК 75 та збільшення альбумінового зазору на ту саму величину з тим самим часовим інтервалом, що й після зшивання
СО8 у РММ, доданих до ЕС. Спливаючий шар також викликав зміни в ЕСІСа?, та вмісті і розподілі
Т-актину. Крім того, місцеве нанесення спливаючого шару з вмістом секреції РММ на защічний мішок хом'яка іп мімо виявляло негайне витікання плазми з посткапілярних та малих венул. Місця витікання проявляються уже через 1,5хв. після нанесення, а максимальна реакція виявлялася приблизно через 5 хв. Після промивання тканин буфером протікання повільно зменшувалося. Цей вплив на функцію проникності мікросудин зникав після термічної обробки похідної від РММ секреції, що свідчить про те, що збільшення проникності пояснюється термочутливим(и) фактором(ами). Нанесення на защічний мішок спливаючого шару оброблених ІВ4 РММ, не підданих зшиванню, не призводило до помітного витікання плазми.
Обговорення с
Зчеплення поліморфно-клітинних лейкоцитів з ендотеліальним шаром та залучення до позасудинної тканини о при гострому запаленні значною мірою залежить від функції В-2 інтегринів. Збільшення проникності судин для макромолекул стимулюють у зв'язку з цією клітинною реакцією, що веде до проступания плазми та утворення набряку. Результати вищеописаних експериментів свідчать про причинний зв'язок між трансмембранним (ззовні всередину) сигналом з боку В2 інтегринів в активованих РММ та здатністю цих клітин викликати барєрну М) дисфункцію ЕС. Було виявлено, що викликане антитілом зшивання та утворення груп В2 інтегринів призводить со до збільшення проникності ЕС на зразок того, що спостерігається після стимуляції РММ хемоатрактантом. Це клітинне перехрещування відбувається за відсутності фізичного зв'язування РММ з ЕС, що свідчить про те, що со саме зчеплення РММ та сам структурний зв'язок прямо не передають сигнали на ЕС, якими опосередковується їм проникність. Скоріше, лігандне зв'язування В2 інтегрину спричинює внутрішньоклітинними сигнальними каскадами РММ секреторні події та вивільнення хімічного посередника, який адаптує залежні від РММ зміни у - проникності ЕС. Крім того, було продемонстровано, що зміна у проникності судин, викликана таким чином, є наслідком активної залежної від тирозинкінази реакції ЕС, включаючи цитоскелетну реорганізацію та оборотне утворення міжклітинного розриву, що свідчить про нелітичну функцію в цьому відношенні похідного(их) від РММ « факторайів).
Для більш детального дослідження механізмів, завдяки яким активовані РММ можуть передавати сигнали на - с ЕС, у цьому процесі моделюють взаємодію РММ/ЕС та залежну від зчеплення участь В» інтегринів через ч зшивання антитіла СО11/2018. Можливість зшивання антитіл В 5 інтегринів з шунтуванням викликаної » хемоатрактантом клітинної активації демонструє, що залучення та утворення груп рецепторів В 5 інтегрину як таке через внутрішньоклітинні сигнали призводять до збільшення проникності ЕС. Оскільки ця реакція відбувалася незалежно від зчеплення РММ з ЕС, передача сигналів між РММ та ЕС не може пояснюватися - взаємодією СО11/2О018 з контррецепторами на поверхні ЕС, а скоріше має відбуватися через вивільнення - похідної від РММ молекули-посередника. Такий механізм також підтверджується здатністю до викликання гіперпроникності ЕС вільного від клітин спливаючого шару, якої досягають після зшивання СО18 у суспензії РММ. о Приклад 2: Розпізнання похідного від нейтрофілів НВР (НВР) як сигнальної ланки у викликаному о 20 нейтрофілами витіканні плазми судин
У Прикладі 1 зчеплення РММ через В» інтегрин є попередньою умовою для спричиненого РММ впливу на сл проникність ендотеліальних клітин та того, що залежний від Са?" трансмембранний сигнал через зчеплення активованого Во інтегрину викликає секрецію розчинного(их) фактора(ів), які прямо безпосередньо діють на зміни у бар'єрній функції ЕС. 59 Як описано нами у Прикладі 2, розчинний фактор визначають як НВР людини. Приклад 2 також характеризує
ГФ) взаємодію НВР з системою контактної фази.
Матеріали та способи о Реагенти
Середовище-199, КРМІ-1640 (що містить І-глутамін), сироватку ембріона великої рогатої худоби (ЕВ5), 60 трипсин-ЕОТА, фосфатну буферну сіль (РВ5) та збалансований соляний розчин Хенкса (НВ55) отримують від
Же Тесппоіодієз ((зайпегзриго, МО, США). Желатин, колагеназу, пеніцилін, стрептоміцин, альбумін сироватки великої рогатої худоби (ВЗА), блакитний барвник Еванса та РІТО-кон'югований фалоїдин отримано від Зідта
Спетіса! Со. (5. І оцівб, МО, ОСОБА). Рішо-3/АМ отримано від МоЇІесцшіаг Ргобез (Ендепе, ОК, ОА). Віотаїгіх отримано від Віотедіса! Тесппоіодіев Іпс. (Зіоцдпіоп, МА, БА). ЮОехігап 70 (Масгодех) та РісоіІ-Радце бо отримано від Рпагтасіа Віоїесп АВ (Оррзаїа, Зм'едеп). Основне культуральне середовище містить в собі 1:1 суміш С-199 та КРМІ-1640 з додаванням 2095 інактивованого нагріванням ЕВ5, пеніциліну (100Од/мл) та стрептоміцину (100мкг/мл). Моноклональне антитіло ІВА4 проти звичайного В-ланцюга (СО18) В»-інтегринів надано Ог. Сіаез І ипдрего, Рпагтасіа 5 Оріопп (Оррзаїіа, Зм'едеп) з люб'язного дозволу ЮОг. Затие! О. УУгідні,
КоскегеїПег Опімегейу. Е(ар)» фрагмент кози анти-миші їдДО одержано від дасквоп ІттипокКезеагсі І арогафгіев,
Іпс. (МУеві Сгоме, РА).
Поліклональні антитіла до НВР одержують згідно з такою процедурою. Новозеландським білим кролям роблять підшкірні ін'єкції 5Омкг гепарин-зв'язаного білка людини (НВР), емульгованого у повному імуностимуляторі Фрейнда (ЕСА), після чого здійснюють три посилені ін'єкції ХОмкг НВР людини, емульгованого в 7/0 неповному ад'юванті Фрейнда (РІА), кожні два тижні. Через десять днів після останньої ін'єкції у тварин беруть кров і відокремлюють сироватку.
Моноклональні антитіла до НВР одержують згідно з такою процедурою. КВЕ мишей імунізують шляхом підшкірної ін'єкції 2о0мкг очищеного НВР людини у ЕСА, після чого здійснюють дві ін'єкції 2омкг НВР людини у
НА. Мишам з високим ступенем реакції роблять посилену внутрішньовенну ін'єкцію 20мкг НВР і через три дні /5 Видаляють селезінку. Клітини селезінки зливають із лінією клітин мієломи Рох. Спливаючі шари відбирають на вироблення антитіла проти НВР шляхом НВР-специфічного аналізу ЕГІЗА. Позитивні лінії відбирають для зв'язування з внутрішньоклітинною частиною лінії макрофагів за допомогою стандартних способів ГАСЗ5.
Позитивні лінії клонують і піддають повторному випробуванню в обох аналізах. Моноклональні антитіла очищують шляхом протеїн А-афінної хроматографії.
Ендотеліальні клітини
Ендотеліальні клітини пупкової вени людини (НОМЕС) виділяють із свіжих пуповин, як описано |у роботі
Уапйе еї а, 1973, 9. Сп. Іпмеві. 52:2745-2756), а ендотеліальні клітини аорти великої рогатої худоби (ВАЕС) виділяють згідно зі способом, описаним |У роботі Восузе еї аїЇ., 1975, Тиготь. Оіай. Наеттої!ти. 24:825-839|, з деякими змінами. Тобто, люмен пупкової вени або аорти великої рогатої худоби інкубують з 0,2596 с об розчином колагенази протягом 1Охв. і відокремлені ендотеліальні клітини вимивають із РВ5. Зібрані клітини гранулюють і ресуспендують у культуральному середовищі, висівають у колби з культурою тканин і інкубують за і) стандартних умов. Середовище змінюють кожні 48год., доки культури не досягають конфлюентності (3-5 днів). В експериментах застосовують НОМЕС або ВАЕС першого-п'ятого пропущення. Розпізнання та визначення чистоти ЕС основані на морфології булижника та характеристики за фактором МІ! Л//т-антигеном |Вооузе еї аї., ю зо 1975, Тпготр. Оіаїй. Наеттоггтй. 24:825-839). Забарвлення на фактор МІШ/Л/ЛЛЯ-фактор у клітинах є гомогенним.
Висівання на проникні мембрани со
Культивовані ЕС відокремлюють шляхом короткої (2хв.) обробки трипсином-ЕОТА (0,2595 трипсину/0,0190 с
ЕОТА) і наносять або на неорганічну мембрану Апороге з розміром пор 0,2мкм, або на полікарбонатні фільтри з розміром пор З, Омкм (включення тканинної культури, їОмм; МОМ, КозкКіїде, Юептагк). Для сприяння ї- з5 диференціації клітин та посиленню приєднання ЕС фільтри обробляють 50мкл Віотайіх | (167мкг/мл) і ї- залишають для просушування на повітрі. ЕС висівають з густиною 2 х109 клітин на фільтр і інкубують у культуральному середовищі при 372С у зволоженій атмосфері 596 СО» у повітрі. ЕС вирощують до конфлюентних моношарів, які можна виявити шляхом щоденних спостережень під мікроскопом та вимірювань « електричного опору поперек моношару.
Вимірювання трансендотеліального електричного опору (ТЕЕК) - с Для вимірювання електричного опору поперек моношару ЕС фільтрові вставки переносять до камери ц вимірювання опору (ЕМООНМ-12; УУогпій Ргесівіоп Іпзігитепів, бЗагавоїа, РІЇ, О5А), видозміненої з метою "» забезпечення точного розташування електродів відносно один до одного та фільтрових включень під час багаторазових вимірювань. Камеру (нижнє відділення) та фільтрові вставки (верхнє відділення) заповнюють 2мл та 400мкл культурального середовища відповідно. Усі вимірювання здійснюють при 37 С за допомогою -і обладнання, розташованого в інкубаторі клітинних культур. Безпосередні показники електричного опору - отримують від омметра (ЕМОМ; УМогід Ргесівіоп Іпвігитепів, Загазоїа, РІЇ, ОБА), сполученого з електродами камери опору. Електричний опір окремих моношарів ЕС отримують шляхом віднімання опору відповідного (95) фільтра, вкритого Віотаїіх, виміряного перед висіванням ендотеліальних клітин. со 50 Визначення альбумінового зазору
Кон'югований з блакитним барвником Еванса альбумін (ЕВА) застосовують як маркер макромолекулярної сл проникності моношарів ЕС. Барвник в остаточній концентрації 0,б7мг/мл змішують із культуральним середовищем, яке містить 495 В5А. В експериментах, у яких аналізують проникність для альбуміну, культуральне середовище у верхньому відділенні змінюють на середовище, яке містить ЕВА. Концентрацію ЕВА у рідких зразках верхнього та нижнього відділення визначають спектрофотометрично вимірюванням оптичної густини при о 620нМ (Тіепек Мийізкап МОСС; Ріом/ І арогаїгіез, ЗоІпа, Змедеп). Альбуміновий зазор розраховують за співвідношенням: М1-А2хМ2х1/А1, де М1 є об'ємом зазору (тобто, теоретичним об'ємом апікального середовища, іме) очищеного від альбуміну шляхом дифузії з базолатеральним відділенням), М2 є базолатеральним об'ємом, і А1 та А? є оптичною густиною апікального та базолатерального середовища відповідно. Базовий зазор за 60 відсутності будь-якого стимулу, в середньому 0,08 -0,01мкл/хв., віднімають від об'єму зазору, отриманого у відповідь на відповідний специфічний подразник.
Виділення та активація РММ
Багату на лейкоцити плазму, видобуту з суцільної крові людини шляхом осадження декстраном, обережно вкладають шарами на ГРісоІ-Радце і центрифугують при 400О0г протягом ЗОхв. Гранули, що містять РММ бо ресуспендують і двічі промивають (400г 7хв.) у льодяному РВ5. РММ ресуспендують у культуральному середовищі в остаточній концентрації 2-5х109 клітин/мл. Чистота РММ становить 29896, а життєздатність за витісненням трипанового синього становить 29590,
Зшивання антитіла молекул СО18 на поверхні нейтрофілів стимулюють, як описано вище. Тобто, очищені
РММ (Б5Х105/мл) інкубують з анти-СО18 тАБ ІВ4, 10мкг/мл у НВ55 протягом ЗОхв. Під час інкубаційного періоду клітини піддають різкій зміні температури з 42 до 372 С для збільшення поверхневої експресії СО11/С018. Клітини двічі промивають і здійснюють зшивання СО18 шляхом додавання фрагментів (аб) о кози анти-миші Ід (розведення 1:20). РММ осаджують шляхом центрифугування при ЗО00г протягом 15хв. при кімнатній температурі і вільний від клітин спливаючий шар збирають. В окремих експериментах зшивання антитіла СО18 стимулюють 70 після додавання до моношарів ЕС РММ попередньо інкубованих з тАБ ІВА (див. нижче).
Експериментальні процедури
Перед перенесенням фільтрових вставок до камери вимірювання опору (яку тримають при 372С) середовище у вставці та у камері замінюють свіжим культуральним середовищем (3723) з додаванням 10мМ Нерез. НВР (25-100мкг/мл) або продукт секреції РММ додають або у верхнє, або у нижнє відділення і зміни 72 трансендотеліального електричного опору вимірюють щохвилини, доки не буде досягнуто фази плато, а після цього - з 5-хвилинними інтервалами. В окремих експериментах РММ (2х109) попередньо інкубовані з тАб ІВА (1Омкг/мл), додають у верхнє відділення (співвідношення РММ:ЕС-10:1) і залишають для осадження на 1Охв.
Активацію РММ стимулюють через зшивання антитіла лейкоцитарного СО18 шляхом додавання кози анти-миші ідо К(аб)», розведеного у співвідношенні 1:20. В експериментах, у яких досліджують проникність для альбуміну поперек моношару ЕС, середовище у вставці містило ЕВА. Під час експерименту фільтрові вставки переміщують з 5-10-хвилинними інтервалами до нових лунок, що містять свіже середовище. Інкубацію в усіх випадках здійснюють при 372С. Після експерименту середовище у нижніх лунках відсмоктували й піддавали аналізу на вміст ЕВА. ря Визначення внутрішньоклітинне Са?" ЕС та розподілу Е-актину с
Для визначення змін у внутрішньоклітинному вільному Са 2" ЕС застосовують чутливий до Са?" о) флуоресцентний зонд Пшио-3/"АМ. Конфлюентні моношари НОМЕС або ВАЕС, культивовані на вкритих Віоптаїгіх І фільтрах, інкубують з розчином РіІшо-З3/АМ (Змкм у НВ55, що містить 296 ЕС5 та 10ММ НЕРЕЗ), який додають до апікальної та базолатеральної поверхні, протягом ЗОхв. при 37 «С. Моношари перед застосуванням тричі ю зо промивають і інкубують зі свіжим НВЗЗ у темному місці протягом 20хв. при кімнатній температурі для повного гідролізу естеру-барвника до його чутливої до кальцію вільнокислотної форми. ЕС стимулюють НВР, який со додають до апікальної поверхні. Зміни (Са?") ЕС у відповідь на стимуляцію НВР вимірюють безперервною со реєстрацією інтенсивності флуоресценції за допомогою системи конфокальної візуалізації з лазерним скануванням (Іпзідні Рів; Мегіаіап Іпвігитепів Іпс., ОКкетоп, Міспідап). -
Для аналізу розподілу Б-актину в ЕС у відповідь на стимуляцію НВР конфлюентні моношари ЕС, які - вирощували на вкритому Віотаїгіх склі, інкубують з НВР або самим носієм при 372С протягом 15хв. Моношари двічі промивають у культуральному середовищі й фіксують у 3,790 формальдегіді у РВ5 протягом 1Охв. при кімнатній температурі ЕС пермеабілізують 0,295 Тійоп Х-100 у РВБ5 (їхв. при 42С), двічі промивають і « забарвлюють на виявлення актинових елементарних волокон РІТО-кон'югованим фалоїдином протягом 20хв. при 372С. Ендотеліальні клітини знову тричі промивають у РВЗ і візуалізують за допомогою конфокального - с мікроскопа з лазерним скануванням. ч Вестерн-блотинг я Зразок очищеного НВР або секреції РММ додають до ЗО5 буфера для зразка і варять протягом 5хв.
Електрофорез здійснюють, наносячи зразки на 505 поліакриламідні градієнтні гелі (3-1095). Білки шляхом електрофорезу переносять на нітроцелюлозну мембрану (Віо-Кай Іаброгайгіез, Кіспйтопа, СА) для - імуноблот-аналізу. Додаткові сайти зв'язування блокують шляхом інкубації нітроцелюлозної мембрани протягом -1 2год. у молоці. НВР виявляють, застосовуючи вестерн-блотинг.
Результати о Активовані РММ вивільнюють НВР со 50 РММ у суспензії активуються через зшивання антитіл СО18. РММ центрифугують, спливаючий шар збирають і подають на БО5-РАСЕ. Вестерн-блотинг із застосуванням антитіл, спрямованих проти НВР, дозволяє розпізнати сл помітну смугу 27КО у секреції РММ. Особливих смуг у контрольному ідо кроля виявлено не було.
НВР збільшує проникність моношарів ЕС
Додавання НВР (75мкг/мл) у верхнє відділення викликало помітне зниження трансендотельального опору, що виявляє себе протягом однієї хвилини, досягає свого максимуму (3095 -395 від контролю) через 15хв. і
ГФ! залишається незмінним протягом усього періоду спостереження (Фігура 2). Перевірка імунності НВР також викликала збільшення макромолекулярної проникності ЕС, що відображається у поступовому збільшенні о альбумінового зазору, яке дає чистий об'єм зазору 20,4 -34мкл за період бОхв. (Фіг.2). Реакція ЕС на стимуляцію НВР явно залежить від дози, що підтверджується не так чітко виявленим зменшенням ТЕЕК у 60 стійкому стані з НВР 25 та 5оОмкг/мл (Фіг.2). Однак швидкість змін, при яких відбувається реакція, є однаковою для всіх доз НВР.
Стимуляція ЕС НВР з базолатерального боку моношару (НВР додавали у нижнє відділення) викликала такі самі зміни у проникності ЕС, що й апікальна стимуляція, однак при дещо вищих концентраціях.
Нейтралізація НВР послаблює викликане РММА4 збільшення проникності ЕС бо Очищений дос антисироватки кроля проти НВР застосовують для нейтралізації активності білка. Додавання антитіл НВР (5Омкг/мл) до моношару ЕС перед стимуляцією НВР (75мкг/мл) помітно послаблювало викликані зміни у ТЕЕК та макромолекулярній проникності. Зміни у ТЕЕК відбувалися з певною затримкою й досягали 7590-5965 від контролю (Фіг.3), що свідчило про інгібування викликаної НВР реакції приблизно на 6595. Подібним чином, витікання альбуміну інгібується приблизно на 6095 до чистого об'єму зазору 8,64 141,74мкл за бохв. (Фіг.3). Обробка неспецифічним Ідс кроля (5Омкг/мл) не має впливу на викликане НВР зниження ТЕЕК, що досягає 3195-5900 від контролю за 15хв.
Робиться визначення, чи можуть антитіла проти НВР мати інгібіторну дію також на зміни у бар'єрній функції
ЕС, викликаній активованими РММ. РММ у суспензії активують через зшивання антитіл СО18 лейкоцитів і 70 центрифугують. Спливаючий шар, який містить продукти секреції РММ (див. Матеріали та способи) переносять до моношару ЕС. За наявності антитіл проти НВР зниження у ТЕЕК та збільшення у макромолекулярній проникності помітно стримувалися порівняно з реакцією на стимуляцію секрецією РММ за відсутності антитіла проти НВР (Фіг.4). Майже ідентичний ефект спостерігають, коли зшивання антитіла СО18 стимулюють після додавання РММ до моношару ЕС, а отже, досягнення продукту секреції РММ моношару ЕС.
Стимуляція НВР збільшує внутрішньоклітинний вільний Са 7 ЕС
Для визначення, чи реагує ЕС на стимуляцію НВР збільшенням цитозольного Са 2", застосовують конфокальну мікроскопічну візуалізацію з лазерним скануванням. Додавання НВР (75мкг/мл) до конфлюентних моношарів НОМЕС або ВАЕС, заряджених чутливим до Са 7" флуорофорним йЙшо-З/АМ, викликало швидке збільшення інтенсивності флуоресценції, яка досягав піку протягом їхв., а потім поступово знижувалася до базового рівня. Ця мобілізація внутрішньоклітинного Са 2" чітко вказує на активну реакцію ЕС на стимуляцію
НВР.
Стимуляція НВР викликає реорганізацію мікрофіламентів ЕС
Конфлюентні моношари ЕС, інкубовані з НВР (75мкг/мл) або лише культуральним середовищем протягом 15хв., забарвлюють на виявлення актинових елементарних волокон РЕІТС-кон'югованим фалоїдином і с 29 візуалізують за допомогою конфокальної мікроскопії з лазерним скануванням. Порівняно з необробленим ЕС, що (У виявляє Е-актинові напружені волокна низької густини та чіткі компактні периферичні смуги уздовж країв клітини, існують суттєві зміни у вмісті Е-актину та розподілі у стимульованих НВР ЕС. Збільшення густини
Е-актинових напружених волокон, які стягують тріщину та розрив периферичних смуг, свідчить про реорганізацію цитоскелета ЕС як наслідок стимуляції НВР. о
НВР збільшує проникність судин іп мімо (ее)
Місцеве нанесення НВР (75мкг/мл) на мікросудини защічного мішка хом'яка за 2хв. призводить до утворення видимих місць витікання флуоресцентної мітки і з посткапілярних, і з великих венул. Максимальне витікання о спостерігають через 7-10хв. після перевірки імунності. Після цього витікання повільно знижується й повністю ї- зникає за ЗОхв.
Інгібування викликаного брадикініном та НВР збільшення проникності ЕС моноклональним антитілом МВКЗ - до брадикініну
Брадикінін (100ОнМ; Фіг.5а) або НВР (75мкг/мл; Фіг.56б) вводять на початку відліку часу з люмінального боку моношарів ЕС, попередньо інкубованих з моноклональним антитілом до брадикініну, МВКЗ (4Омкг/мл) «
ІНаазетапп еї аї., 1991, 9. Іттипої. 147:3882-3892). МВКЗ повністю запобігає збільшенню проникності ЕС, -о 70 викликаному брадикініном або НВР. Специфічність впливу тАбБ підтверджується відсутністю інгібування с викликаних гістаміном змін у проникності (гістамін вводили Через 15хв. після стимуляції брадикініном або з НВР), М-6.
Інгібування викликаного НВР збільшення проникності ЕС моноклональним антитілом РКНА до калікреїну плазми 395 НВР (75мкг/мл; заштриховані символи) або брадикінін (100нНМ; незаштриховані символи) вводять на початку відліку часу з люмінального боку моношарів ЕС, попередньо інкубованих тАБ РКНА (4Омкг/мл). Результати - І показано на Фіг.б. РКН4 запобігали збільшенню проникності ЕС, викликаному НВР, але не викликаному о брадикініном. Обробка РКНА не впливала на зміну проникності, викликану гістаміном (гістамін вводять через 15хв. після стимуляції НВР), М-6. (ее) 50 Інгібування викликаного НВР збільшення проникності ЕС шляхом обробки НКН2О-пептидом сп Моношари ЕС інкубують з НКН2О (Змкг/мл) протягом ЗОхв., видаляючи таким чином поверхнево зв'язаний
Н-кініноген. Після промивання на початку відліку часу з люмінального боку ЕС вводять НВР (75мкг/мл), після чого через 15хв. вводять брадикінін (Т0ОНМ). НК закріплюється на поверхні ЕС через домен 5 та 6, причому домен 5 є найважливішим. Мінімальну амінокислотну послідовність, яка необхідна для зв'язування НК людини у 99 домені 5 з ЕС, представлено опептидом з 20 амінокислот (НКН 20) з такою послідовністю:
ГФ) НКеКНОНОННККМКОККМОКН (ЗЕО ІО МО:7) (Н-кініноген 479-498 людини). Цей пептид інгібує приєднання НК до 7 ЕС (Назап сеї аї., 1995, у. Віої Спет. 270:19256-19261 та Непмуай сеї аї., 1996, у. ВіоЇї. Спет. 271:13040-13047)Ї. Результати показано на Фіг.7. Обробка НКН2О ЕС дозволяла запобігти викликаному НВР збільшенню проникності ЕС, але не зміні проникності, викликаній наступним введенням брадикініну, М-6. бо Інгібування викликаного НВР збільшення проникності ЕС шляхом обробки З0ООЗ31-пептидом
Моношари ЕС інкубують з 5БООЮЗ1 (Змкг/мл) протягом ЗОхв. 5ХЮ0ОЗ1, який також називають НКЗ1, є пептидом, що походить від домену 6 Н-кініногену людини НК, який блокує зв'язування НК з калікреїном плазми та фактором
ХІІ (Тай ек аї., 1986, у. Віої Спет. 261:15396-15401 та Моде! ей аїЇ, 1990, у. ВіоЇ Спет. 265:12494-12502). Він має послідовність бо ЗООБМЛРОІЮТОРМОЇ ЗЕМРІБОЕРРОТТЗРК (ЗЕО ІЮО МО:8) (Н-кініноген 565-595 людини). Після промивання на початку відліку часу з люмінального боку ЕС вводять НВР (75мкг/мл), після чого через 15хв. вводять брадикінін (10ОНМ). Результати показано на Фіг.8. ЗОЮЗ1-обробка ЕС дозволяла значною мірою запобігти викликаному НВР збільшенню проникності ЕС. Реакція ЕС на пряму стимуляцію брадикініном зберігалася після ЗХОЮЗ1-обробки,
М-6.
Інгібування викликаного НВР збільшення проникності ЕС шляхом обробки апротиніном
НВР (75мкг/мл) вводять на початку відліку часу з люмінального боку моношарів ЕС, попередньо інкубованих з апротиніном (1ООмкг/мл; ЗОхв.). Результати показано на Фіг.9. Обробка апротиніном дозволяла значною мірою запобігти викликаному НВР збільшенню проникності ЕС, але не зміні проникності, викликаній наступним /о введенням брадикініну (ТООНМ), М-6.
Мутант НВР (0 175М) не здатен зв'язуватися з апротиніном через мутацію, але тривимірна структура та поверхневий розподіл заряду залишаються незмінними. При випробуванні у моделі витікання цей мутант викликає вивільнення брадикініну та збільшення проникності ЕС. Однак додавання апротиніну не має інгібіторного впливу. Подібний результат отримують і з НВР свині, який є дуже гомологічним з НВР людини, але /5 Не може зв'язуватися з апротиніном через присутність К внизу дегенерованої каталітичної тріщини.
Приклад 3: Два мутанти гепарин-зв'язаного білка
Два мутанти НВР людини, ІК235,Е25Е|НВР та |(517591|НВР, було вироблено для дослідження взаємозв'язку структура-функція залишків у можливому сайті зв'язування ліпіду АЛ РЗ та сайті зв'язування ВРТІ (інгібітор трипсину підшлункової залози великої рогатої худоби). Мутація 51750) не змінює структуру білка, але зникає 2о здатність до зв'язування з ВРТІ, Її мутант опосередковує лише дуже обмежену стимуляцію викликаного ліпополісахаридом (І РБ) вивільнення цитокінів з моноцитів людини. Властивість зв'язування ліпіду АЛ Р5 можна порівняти з такою властивістю природного НВР. Мутація К235,Е25Е не впливає на зв'язування ліпіду АЛ Р та
ВРТІ або вивільнення ліпополісахаридом (І Р5) вивільнення цитокінів з моноцитів людини.
Матеріали та способи сч
Побудова мутантного білка
Ржо ДНК полімерази отримано від Воейгіпдег Мапппеійт, затнНі, Т4 ДНК лігазу отримано від Мем Епдіапа і)
Віоїар5, клітини зродоріега Ігидірегда (519), і рМІ/ 1393 трансферплазміду отримано від Іпмйгодеп, ТС100, а
ЗЕ900-І вироблено на Момо Могаїзк А/5, сироватку ембріона великої рогатої худоби (ЕС5) отримано від сірсовВнї Всі інші хімікати мають найвищий сорт. ю зо ІК2З35,Р25Е)НВР мутант
ІК235,Р25Е)НВР мутант будують, застосовуючи технологію РОК з перекриттям ІНо, 5. М., Нипі, Н. 0., Ногіоп, со
К. М., РиПеп, 9. К., апа Реазе, |! К. (1989) Сепе (Атві.)77: 51-59). Шляхом РСК отримують два мутовані с фрагменти з частковим перекриттям, застосовуючи олігонуклеотиди 1-2 та 3-6, і одержані в результаті фрагменти з'єднують, застосовуючи олігонуклеотид 1-6 (Таблиця 1). кКДНК природного НВР людини ї- зв Застосовують як шаблон для РСК-реакції. Одержаний в результаті кДНК кодує 19 амінокислотних пропептидів, ї- 222 амінокислотні розвинуті частини та три амінокислотні С-кінцеві подовження. Сайти ВатН1т включено з кожного боку мутованої КДНК для клонування. Мутований фрагмент вставляють у рМміІ 1393 трансферну плазміду (Іпмйгодеп). ДНК для трансфекції одержують, застосовуючи комплекти Оіадеп тіадіргер. Після очищення вставку секвенують. « ши пн БиКе ей вен - с На Чен еймні МОЖЕ. саван у ВИН ТИИОВУВВ ДЖ ЛВ КУ ЯОЕЯЬя г) ШО кави йон на и ну ї з
Цей мутант в цілому будують так, як описано вище. Два мутовані фрагменти з частковим перекриттям о одержують шляхом РСК, застосовуючи олігонуклеотиди 14 та 5-6 і одержані в результаті фрагменти з'єднують, застосовуючи олігонуклеотиди 1146 (Таблиця 1). іме) Експресія та очищення 8/9-клітини комах тримають у середовищі ТС 100, підтримуваному 1095 ЕС5. Перед інфікуванням 60 середовище змінюють на вільне від сироватки ЗЕ9О00-ІІ. Експресію обох мутантів у середовищі без сироватки та очищення мутантів від спливаючого шару культури здійснюють, як описано вище для природного НВР людини (Казтивззеп, Р.В., Віогп, 5., Кавігир, 5., Міеівеп, Р. РГ., Моїтів, К., Тіт, Ї, УМірегд, Р. С, та Ріоддаага, Н. (1996) РЕВЗ І екК. 390:109-1121.
Аналіз викликаного І Р5 вивільнення ІІ -6 з моноцитів 65 Моноцити людини виділяють і обробляють, як описано (Казтиззеп, Р.В., Вішгп, 5., Казігир, 5., МіеіІзеп, Р.
Е., Моїтів, К., Тіт, Ї, УМірегод, Р. С, та Ріосддаага, Н. (1996) РЕВ5 ей. 390:109-112), за винятком того, що з середовища виключали 195 неесенціальних амінокислот.
Аналіз зв'язування ЗН-І Р5 з НВР
Спорідненість за ліпополісахаридом (ЗН-І Р) вимірюють шляхом сцинтиляційного аналізу близькості (РА), як описано (іпде, М., Віогп, 5., Кавігир, 5. та Ріоддаага, Н., 2000, Віоїеснпідцез 28:218-2221). Усі зразки представлено у трьох примірниках.
Аналіз зв'язування 722І-ВРТІ з НВР
Спорідненість за ВРТІ визначають, застосовуючи аналіз РА, практично як описано для аналізу І РБ | іпае,
М., Віотп, 5., Кавігир, 5. та Ріоддаага, Н., 2000, ВіоФесппіднез 28:218-2221 з деякими змінами. ЗН-І РУ замінюють на 125|-ВРТІ (одержаний Момо МогаїзкК А/5), а буфер замінюють на РВ5 (20мММ фосфат, рН7,4 і 150мМ масі), включаючи 0,0590 ВБА та 0,0590 Ттйоп Х-100. Відносну спорідненість НВР та мутантів визначають шляхом здійснення досліджень конкуренції з фіксованими, зростаючими концентраціями неміченого ВРТІ.
Результати
Біологічна характеристика 19 Біологічну активність двох мутантів порівнюють із природним НВР стосовно їх здатності підвищувати, залежно від дози, викликане І Р5 вивільнення 1ІІ-6Є з моноцитів людини іп міїго. | Ре-спорідненість двох мутантів та НВР вимірюють шляхом сцинтиляційного аналізу близькості (ЗРА) (І іпде, М., Вішгп, 5., Кавігир, 5. та
Еіододаага, Н., 2000, Віоїесппідцев 28:218-2221. Обидва мутанти зв'язуються з ЗН-І РЗ з можливістю насичення з подібним видимим Ку (приблизно 0,7г/мл), як можна спостерігати для природного НВР (Фіг.11 а). Крім того, у подібному сцинтиляційному аналізі близькості вимірюють спорідненість щодо ВРТІ для обох мутантів і для природного НВР, причому 722І-ВРТІ застосовують як ліганд для НВР. (К235,Е25Е|НВР мутант, а також природний
НВР зв'язуються з ВРТІ, у той час, як для (517502|НВР мутанта зв'язування не спостерігають (Фіг.116). Досліди конкуренції, проведені шляхом додавання фіксованих, зростаючих концентрацій неміченого ВРТІ, сч ов показали, що 125|-ВРТІ зв'язується з НВР та (К235,Е25Е|НВР з подібними видимими значеннями ІС5о приблизно 7 НМ. Як можна спостерігати на Фіг.11в, (К235,Б25Е|ЇНВР візуально має більшу здатність до зв'язування о порівняно з НВР. Ця різниця, можливо, зумовлюється здатністю (К235,Е25Е|НВР до зв'язування з різними формами застосованого йодованого ВРТІ. Однак більша здатність до зв'язування не впливає на спорідненість 125|-ВРТІ, Крім того, здатність ЗН-І РУ до витіснення 122І-ВРТІ, зв'язаного з природним НВР імісе мегва, досліджували шляхом експериментів з конкуренцією: конкуренцією за зв'язування з 722І-ВРТІ шляхом со додавання до бмкг/мл неміченого РО та конкуренцією за ЗН-Ї Рб-зв'язування шляхом додавання до 50ММ неміченого ВРТІ. У жодній із ситуацій не спостерігали ніякого інгібіторного впливу, це свідчить про те, що і сайти зв'язування І РЗ5 та ВРТІ розташовані у різних частинах молекули НВР. ча
Дані аналізу біологічної активності іп міо показують, що (51750О|НВР, на відміну від |(К2З35,Е25ЕЇ|НВР та
Зо природного НВР, опосередковує лише дуже обмежену стимуляцію викликаного ліпополісахаридом (ІРБ) - вивільнення цитокінів з моноцитів людини (Фіг.10).
Обсяг описаного й сформульованого авторами винаходу не обмежується конкретними описаними втіленнями, оскільки ці втілення ілюструють кілька аспектів винаходу. Будь-які рівноцінні втілення можуть « охоплюватися обсягом даного винаходу. Отже, для спеціалістів на основі вищенаведеного опису стають очевидними різні видозміни винаходу, тобто додаткові до показаних і описаних авторами. Такі видозміни також З с охоплюються обсягом формули винаходу, що додається. з» Наведені нами посилання включено як посилання в їх повному обсязі.

Claims (18)

  1. 45 Формула винаходу -І
  2. - 1. Застосування анти-НВР антитіла ссавця для приготування лікарського засобу для профілактики або лікування захворювання, яке виникає в результаті вивільнення брадикініну у ссавця, причому зазначений о ссавець виробляє НВР, який зв'язується з анти-НВР антитілом ссавця, де захворювання вибране з групи, яка о 20 включає синдром системної запальної реакції, ішемічну реперфузію, анафілаксію та відторгнення алотрансплантата. сл 2. Застосування за п. 1, у якому кількість анти-НВР антитіла, яку вводять ссавцеві, становить 0,1-100 мг/кг маси тіла.
  3. З. Застосування за п. 1, у якому кількість анти-НВР антитіла, яку вводять ссавцеві, становить 0,5-50 го мг/кг маси тіла. Ге!
  4. 4. Застосування за п. 1, у якому кількість анти-НВР антитіла, яку вводять ссавцеві, становить 1-25 мг/кг маси тіла. ко
  5. 5. Застосування за п. 1, у якому антитіло являє собою моноклональне антитіло, переважно моноклональне антитіло людини. 60
  6. 6. Застосування за п. 5, у якому ссавець являє собою людину і НВР являє собою НВР людини.
  7. 7. Спосіб визначення моноклонального антитіла, яке зв'язується з принаймні одним епітопом на природному НВР, у якому (а) культивують ендотеліальні клітини у присутності НВР та у присутності і за відсутності моноклонального антитіла, яке, як вважають, зв'язується з принаймні одним епітопом на НВР, та (б) виявляють будь-який вплив речовини на проникність ендотеліальних клітин, причому зниження проникності ендотеліальних 65 клітин, порівняно з проникністю клітин при інкубації у присутності НВР без речовини, вказує на те, що моноклональне антитіло зв'язується з принаймні одним епітопом на НВР.
  8. 8. Спосіб за п. 7, у якому природний НВР являє собою НВР людини.
  9. 9. Спосіб за п. 7, у якому вивільнення брадикініну визначають шляхом імунологічного аналізу.
  10. 10. Випробувальний комплект, який включає (а) НВР антитіло, (б) НВР або клітину, яка продукує НВР, та (с) Дечовину, тканину, клітини або компонент, що взаємодіє з НВР.
  11. 11. Випробувальний комплект за п. 10, у якому НВР є міченим.
  12. 12. Випробувальний комплект за п. 10, де випробувальний комплект включає речовину, яка взаємодіє з НВР.
  13. 13. Випробувальний комплект за п. 12, у якому вказана речовина являє собою Н-кініноген.
  14. 14. Випробувальний комплект за п. 12, у якому вказана речовина є міченою. 70
  15. 15. Випробувальний комплект за п. 12, який додатково включає гранули.
  16. 16. Спосіб визначення продукування клітиною або тканиною ссавця НВР, що зв'язується з моноклональним антитілом, яке зв'язується з принаймні одним епітопом на природному НВР, у якому (а) культивують клітину або тканину з ендотеліальними клітинами у присутності або за відсутності антитіла, та (б) виявляють будь-який вплив антитіла на проникність ендотеліальних клітин, причому зниження проникності вказує, що НВР зв'язується /5 З антитілом.
  17. 17. Спосіб за п. 16, у якому ссавець являє собою людину.
  18. 18. Спосіб за п. 16, у якому природний НВР являє собою НВР людини. с щі 6) ІФ) (ее) (зе) ча і - -
    с . и? -І -І (95) (ее) сл іме) 60 б5
UA2001107327A 1999-10-01 2000-04-28 Use of anti-hbp monoclonal antibody for therapeutic agent intended for treating or preventing disorders resulting from release of bradykinin in mammals, method for assaying monoclonal antibody, assay kit, method for assaying hbp production in mammalian cells and tissues UA77385C2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA199901402 1999-10-01
PCT/DK2000/000213 WO2000066151A1 (en) 1999-04-29 2000-04-28 Use of heparin-binding antagonists in the inhibition of bradykinin release

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA77385C2 true UA77385C2 (en) 2006-12-15

Family

ID=37605855

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA2001107327A UA77385C2 (en) 1999-10-01 2000-04-28 Use of anti-hbp monoclonal antibody for therapeutic agent intended for treating or preventing disorders resulting from release of bradykinin in mammals, method for assaying monoclonal antibody, assay kit, method for assaying hbp production in mammalian cells and tissues

Country Status (1)

Country Link
UA (1) UA77385C2 (uk)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kadoya et al. Antibodies against domain E3 of laminin-1 and integrin alpha 6 subunit perturb branching epithelial morphogenesis of submandibular gland, but by different modes.
Elferink et al. A role for synaptotagmin (p65) in regulated exocytosis
Siu et al. Extracellular matrix: recent advances on its role in junction dynamics in the seminiferous epithelium during spermatogenesis
Premzl et al. Intracellular and extracellular cathepsin B facilitate invasion of MCF-10A neoT cells through reconstituted extracellular matrix in vitro
EP2168599B1 (en) Cancer remedy containing antibody against peptide encoded by exon-17 of periostin
Ito et al. Immunocytochemical evidence for translocation of protein kinase C in human megakaryoblastic leukemic cells: synergistic effects of Ca2+ and activators of protein kinase C on the plasma membrane association.
AU2005203787A1 (en) Use of heparin-binding antagonists in the inhibition of bradykinin release
US7101976B1 (en) EphA2 monoclonal antibodies and methods of making and using same
US7575872B2 (en) Antibody against von Willebrand factor cleaving enzyme and assay system using the same
US20070190581A1 (en) Density enhanced protein tyrosine phosphatases
GB2142030A (en) Immunological methods for the determination of metastatic cell activity
EP0514481B1 (en) Merosin, nucleic acids encoding, fragments and uses thereof
US20040136985A1 (en) Methods of modifying behavior of CD9-expressing cells
EP1852442B1 (en) Antibody for assay of adamts13 activity and method of activity assay
US20020076736A1 (en) Methods of affecting laminin 5 processing
Fine et al. Chondroitin 6-sulfate proteoglycan but not heparan sulfate proteoglycan is abnormally expressed in skin basement membrane from patients with dominant and recessive dystrophic epidermolysis bullosa
US5180809A (en) Adhesion receptor for laminin and its use
Sonderegger Axonin-1 and NgCAM as” recognition” components of the pathway sensor apparatus of growth cones: a synopsis
UA77385C2 (en) Use of anti-hbp monoclonal antibody for therapeutic agent intended for treating or preventing disorders resulting from release of bradykinin in mammals, method for assaying monoclonal antibody, assay kit, method for assaying hbp production in mammalian cells and tissues
EP0452314B1 (en) Adhesion receptor for laminin and its use
RU2251433C2 (ru) Применение гепаринсвязывающих антагонистов в ингибировании высвобождения брадикинина
US20060154319A1 (en) Inhibition of bradykinin release
EP1674110A1 (en) Inhibition of bradykinin release
US20050196757A1 (en) Identification of a receptor controlling migration and metastasis of skin cancer cells
Hagiwara et al. Immunocytochemical Evidence for Translocation of Protein Kinase C in Human Megakaryoblastic Leukemic Cells: Synergistic Effects of Ca and Activators of Protein Kinase C on the Plasma Membrane Association