UA74134C2 - Антитіло зі специфічною афінністю до характерної антигенної детермінанти ed-b домену фібронектину, його застосування для лікування ангіогенезу, кон'югати та діагностичний набір, до складу якого входить вказане антитіло - Google Patents

Abstract

Винахід описує антитіла з субнаномолярною афінністю, специфічні до характерної антигенної детермінанти ED-B домену фібронектину, маркеру ангіогенезу. Крім того, він має також відношення до використання мічених радіоактивним ізотопом високоафінних анти-ED-B антитіл для виявлення новоутворюваних кровоносних судин in vivo та діагностичного набору, до складу якого входить згадане антитіло. Також описано кон'югати, до складу яких входять згадані антитіла та відповідні фотоактивні молекули та їх використання для селективної опосередкованої світлом оклюзії нових кровоносних судин.

Description

Опис винаходу

Цей винахід має відношення до антитіл з субнаномолярною афінністю, специфічних до характерної 2 антигенної детермінанти ЕЮО-В домену фібронектину, маркеру ангіогенезу. Він має також відношення до використання мічених радіоактивним ізотопом високоафінних анти-ЕЮО-В антитіл для виявлення новоутворюваних кровоносних судин іп мімо та діагностичного набору, до складу якого входить згадане антитіло.

Крім того, цей винахід має відношення до кон'югатів, до складу яких входять вищезгадані антитіла та відповідна фотоактивна молекула (наприклад, фотосенсибілізатор), та до їхнього використання для виявлення та/або коагулювання нових кровоносних судин.

Пухлини не можуть переростати певну масу без утворення нових кровоносних судин (ангіогенез); для цілого ряду пухлин повідомлялось про кореляцію між густиною мікросудин та інвазивністю пухлин |Фолькман (БоЇКтап) (1995), Майиге Меа., 1, 27-31). Більше того, ангіогенез лежить у основі більшості очних захворювань, кінцевим наслідком яких є втрата зору |Лі (ее) та інші, Зигм. ОрпйаІтої. 43, 245-269 (1988); Фрідлендер. М. 12 (ЕГпедіапдег М.) та інші, Ргос. Май. Асай. сі. ЦО.5.А. 93, 9764-9769 (1996). Молекули, здатні до селективного таргетування маркерів ангіогенезу, надали б клінічні можливості діагностування та лікування пухлин та інших захворювань, характерною рисою яких є проліферація судин, наприклад, діабетичної ретинопатії та вікової дегенерації жовтої плями. Маркери ангіогенезу експресуються більшістю агресивних солідних пухлин і повинні бути легсодоступними для специфічних зв'язувальних агентів, які впорскуються інтравенозно (Паскаліні (Раздамаїїйпі) та інші, (1997), Майте Віобесипої, 15, 542-546; Нері (Мегі) та інші, (1997), Маїшиге Віобесппої., 15, 1271-1275). Наслідком таргетованої оклюзії новоутворених кровоносних судин може бути інфаркт та колапс пухлини (О'Рейлі (О'КейШу) та інші, (1996), Майте Меа., 2, 689-692; Хуанг (Ниапо) та інші, (1997), Зсіепсе, 275, 547-550).

ЕОБ-В домен фібронектину, послідовність з 91 амінокислоти, яка є ідентичною у мишей, пацюків та людини та с 22 яка вставляється шляхом альтернативного сплайсингу до молекули фібронектину, накопичується, зокрема, Го) довкола новоутворених судинних структур |(Кастеллані (СавіейПапі) та інші, (1994), Ійї. У. Сапсег 59, 612-618) і міг би представляти собою мішень для молекулярного впливу. Дійсно, нами, за допомогою флуоресцентних методів, нещодавно було продемонстровано, що одноланцюгові Ем фрагменти анти-ЕО-В антитіл (зсЕм) селективно накопичуються у кровоносних судинах пухлин у мишей, які мають пухлини, і що ефективність М 30 таргетування, здається, визначається афінністю антитіл (Нері (Мегі) та інші, (1997), Майте ВіогФесппої., 15, со 1271-1275; міжнародна заявка МЯРСТ/53897/01412 на основі 58-96/10967.3). Таргетування пухлин оцінювали через 24 години після впорскування або через довші періоди часу. --

У цій галузі є відомими спроби одержання антитіл проти ЕО-В домену з метою їхнього використання для «І таргетування пухлин. Петерс (Реїегз) та інші (СеїЇ Адпевзіоп апа Соттипісайоп, 1995, 3:67-89) розкривають 32 поліклональні антитіла, які було одержано до антигенів, до складу яких не входило іншої послідовності ЕМ - (фібронектину), окрім згаданого інтактного ЕЮО-В домену, та показують, що вони зв'язуються, конкретно та безпосередньо, зі згаданим доменом.

Однак, згадані реагенти Петерса (Рейеге) та інших мають ряд недоліків: згадані антисироватки Петерса « (Рейегз) та інших розпізнають ЕО-В()-ЕМ лише після обробки за допомогою М-гліканази. Завдяки цьому згадані З 70 реагенти є непридатними для використання у таких варіантах застосування, як, наприклад, таргетування, с сцинтиграфія та лікування пухлин, оскільки деглікозилування не може здійснюватись іп мімо. Згадані автори

Із» самі підтверджують, що їхні антитіла не розпізнають повномірний ЕЮ-В(4)-ЕМ, який продукується клітинами ссавців. Вони також підтверджують неможливість продукування моноклональних антитіл, специфічних до ЕО-В домену фібронектину, незважаючи навіть на те, що було одержано антитіла проти інших доменів фібронектину 45 (наприклад, ЕЮО-А). У цій галузі добре відомо, що поліклональні антисироватки є непридатними для 7 вищезгаданих варіантів застосування. «» Навіть після тривалих інтенсивних досліджень у цій галузі моноклональні антитіла, які розпізнають згаданий ЕО-В домен фібронекгину без обробки за допомогою М-гліканази, можна одержати лише за допомогою - методів відтворення фагами, які використовуються у цьому винаході. со 20 Занг (7апда) та інші (Маїгіх Віоіоду, 1994, 14:623-633) розкривають поліклональні антисироватки, які було

І» одержано проти собачого ЕЮО-В домену. Згадані автори припускають можливість перехресного реагування з людським ЕЮБ-В(ї-)-ЕМ, хоча це припущення випробуванню не піддавалось. Згадані автори, однак, визнають труднощі, пов'язані з продукуванням моноклональних антитіл, які безпосередньо розпізнають згаданий ЕО-В домен фібронектину (сторінка 631). Згадана антисироватка розпізнає ЕО-В(-ЕМ під час вестерн-блотингу лише після обробки за допомогою М-гліканази. Як згадувалось перед тим, завдяки згаданій обробці за допомогою

ГФ) гліканази згадані реагенти стають непридатними для варіантів застосування за цим винаходом.

Розпізнавання ЕЮО-В(ї-)-ЕМ під час проведення твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІ5А) о відбувається без необхідності здійснення деглікозилування, але лише на хрящі, який було екстраговано за допомогою денатуровального агенту (4М сечовина) та імобілізовано на пластиковій підложці за допомогою 60 желатини. Згадані автори коментують, що "зв'язування молекули фібронектину з желатиною, яка вкриває поверхню пластикового планшету для проведення твердофазного імуноферментного аналізу, може якось виставляти антигенні детермінанти у мірі, достатній для розпізнавання згаданою антисироваткою". Оскільки для варіантів застосування іп мімо фібронектин не може денатуруватись та зв'язуватись з желатиною, очевидні переваги надаються моноклональними зв'язувальними агентами, які надаються цим винаходом. бо Патенти Японії Мо02076598 та Мо04169195 мають відношення до анти-ЕО-В антитіл. Зі згаданих документів,

однак, неможливо зрозуміти, чи належить наведений опис до моноклональних анти-ЕО-В антитіл. Більше того, видається неможливим, що окреме антитіло (наприклад, антитіло, опис якого наведено у Мо02076598) має "антигенну детермінанту у амінокислотній послідовності формул (1), (2) або (3): - (1) ЕСІРІРЕОРМО5БМУОСУ - (2) УТМТОІ ЕРОСІЮМОІВ - (3) МОСЕБАРТТІ ТООТ виходячи з наведених далі доказів: ї) Моноклональне антитіло повинно розпізнавати добре визначену антигенну детермінанту. 70 ї) Об'ємну структуру згаданого ЕО-В домену фібронектину було визначено засобами ЯМР-спектроскопії.

Сегменти (1), (2) та (3) знаходяться на протилежних боках згаданої ЕО-В структури і не можуть одночасно зв'язуватись одним моноклональним антитілом.

Крім того, з метою демонстрації придатності згаданих антитіл, повинна бути продемонстрована локалізація у пухлинах, а також свідчення про забарвлювання структур ЕО-В(-ЕМ у біологічних зразках без обробки за 7/5 допомогою реагентів, які руйнують згадані структури.

Згадане ВСІ антитіло, опис якого було надано Карнемолла (Сагпетоїйа) та іншими, 1992, у). Віої. Спет., 267, 24689-24692, розпізнає антигенну детермінанту на домені 7 фібронектину (але не на ЕО-В домені), який є замаскованим у разі присутності згаданого ЕО-В домену фібронектину. Воно є суворо специфічним для людей.

Таким чином, згадане ВСІ антитіло та згадані антитіла за цим винаходом демонструють різну реактивність.

Більше того, згадане ВСІ антитіло розпізнає лише домен 7, та домен 7-8 фібронектину за відсутності згаданого

ЕО-В домену (Карнемолла (Сагпетоїїа) та інші, 1992, 9. Віої. Спет., 267, 24689-24692). Такі антигенні детермінанти можна одержати іп мімо шляхом протеолітичного розщеплення молекул фібронектину (ЕМ).

Перевага згаданих реагентів за цим винаходом полягає у тому, що вони можуть локалізуватись на молекулах або фрагментах фібронектину лише у випадку, коли згадані молекули або фрагменти мають згаданий ЕО-В сч ов домен.

Для діагностування раку та, більш конкретно, для візуалізації первинних та вторинних пухлинних і) пошкоджень, одним з найбільш придатних методів є імуносцинтиграфія. За цією методикою пацієнта обстежують за допомогою придатного пристрою (наприклад, іонізаційної камери для гамма-випромінювання) після впорскування сполуки, міченої радіоактивним ізотопом (наприклад, радіонукліду, зв'язаного з відповідним «г

Зо Носієм). Для сцинтиграфічного застосування за типовим варіантом використовують короткоїснуючі гамма-активні ізотопи, наприклад, технецій-99т, йод-123 або індій-111, з метою зведення до мінімального рівня піддавання і пацієнта впливу іонізуючого випромінювання. «-

Радіонуклідом, який найчастіше використовується у відділеннях медичної радіології, є технецій-9У9т (99ттТс), гамма-активний ізотоп, період напіврозпаду якого становить шість годин. Зображення пацієнтів, яким « було впорскнуто радіоактивні фармацевтичні препарати на основі 99тТс, за типовим варіантом можна ї- одержувати впродовж 12-24 годин після впорскувань; бажаним, однак, є накопичення згаданого нукліду на пошкодженні, яке є об'єктом, який викликає зацікавлення, впродовж більш ранніх періодів часу.

Більше того, у разі наявності антитіл, здатних до швидкої та селективної локалізації на новоутворених кровоносних судинах, це стимулювало б дослідників на пошуки інших молекул, придатних для кон'югування з « антитілами з метою одержання діагностичної та/або терапевтичної користі. з с Приймаючи до уваги потребу медичної радіології у радісактивних фармацевтичних препаратах, здатних до . локалізації пухлинних пошкоджень через декілька годин після впорскування, та інформацію про те, що, як и?» здається, афінність антитіл впливає на ефективність таргетування ангіогенезу, метою цього винаходу є продукування антитіл, специфічних до згаданого ЕО-В домену фібронектину з субнаномолярною константою дисоціації (щодо визначень та вимірювань афінності комплексу антитіло-антиген, дивись оглядову статтю Нері -І (Мегі) та інших, (1996), Тгепаз їїї ВіосФесппої., 14, 465-470). Додатковою метою цього винаходу є надання антитіл, мічених радіоактивним ізотопом, у придатному форматі, спрямованих проти згаданого ЕЮО-В домену ве фібронектину, які виявляють пухлинні пошкодження вже через декілька годин після впорскування. - За одним з аспектів цього винаходу, згадані цілі досягаються антитілом зі специфічною афінністю до 5р характерної антигенної детермінанти згаданого ЕО-В домену фібронектину та з поліпшеною афінністю до і згаданої ЕО-В антигенної детермінанти. ї» За додатковим аспектом цього винаходу, антитіло, опис якого було наведено перед тим, використовують для швидкого таргетування маркерів ангіогенезу.

Іншим аспектом цього винаходу є діагностичний набір, до складу якого входить згадане антитіло та один або в декілька реагентів для виявлення ангіогенезу.

Ще іншим додатковим аспектом цього винаходу є використання згаданого антитіла для діагностування та (Ф, лікування пухлин та захворювань, характерною ознакою яких є проліферація кровоносних судин. ка Врешті-решт, важливий аспект цього винаходу представлено кон'югатами, до складу яких входять згадані антитіла та відповідні фотоактивні молекули (наприклад, розумно вибраний фотосенсибілізатор), ті їхнє бо Використання для селективної опосередкованої світлом оклюзії нових кровоносних судин.

Термінологія

У цій заявці використано декілька технічних виразів, які визначаються наведеним далі чином. - антитіло

Цим терміном визначається імуноглобулін, природний або такий, який було частково або повністю одержано б5 синтетичним шляхом. Цей термін також визначає будь-який поліпептид або білок, який має зв'язувальну ділянку, яка представляє собою зв'язувальну ділянку антитіла або є гомологічною зв'язувальній ділянці антитіла. їх можна одержати з природних джерел або продукувати, частково або повністю, синтетичним шляхом.

Прикладами антитіл є ізотипи імуноглобулінів та підкласи згаданих ізотипів; фрагменти, які включають антигенну зв'язувальну ділянку, наприклад, Рар, зсЕм, Ем, дАБ, Га; та половинчасті антитіла. Можна взяти моноклональні та інші антитіла і, за допомогою методів рекомбінантних ДНК, одержати інші антитіла або химерні молекули, які зберігають специфічність згаданого вихідного антитіла. Такі методи можуть залучати введення

ДНК, яка кодує варіабельну ділянку імуноглобуліну, або гіперваріабельні ділянки (СОКз5), антитіла до згаданих константних ділянок, або константні ділянки плюс каркасні ділянки різних імуноглобулінів. Дивись, наприклад,

ЕР-А-184187, ЗВ 2188638А або ЕР-А-239400. Гібридома або інша клітина, яка продукує антитіло, може /о піддаватись генетичній мутації або іншим змінам, які можуть або не можуть змінювати зв'язувальну специфічність одержаних антитіл. Оскільки антитіла можуть модифікуватись декількома шляхами, згаданий термін "антитіло" повинен розглядатись як такий, що охоплює будь-який специфічний зв'язувальний агент або речовину, яка має зв'язувальну ділянку з необхідною специфічністю. Таким чином, згаданий термін визначає фрагменти, похідні, функціональні еквіваленти та гомологи антитіл, у тому числі будь-який поліпептид, які 7/5 Включають ділянку зв'язування імуноглобуліну, які є як природними, так і повністю або частково синтетичними.

Таким чином, до обсягу згаданого визначення входять химерні молекули, які включають ділянку зв'язування імуноглобуліну або її еквівалент, злиті з іншим поліпептидом. Опис клонування та експресії химерних антитіл наведено у ЕР-А-0120694 та ЕР-А-0125023. Було показано, що фрагменти цілого антитіла можуть здійснювати функцію зв'язування антигенів. Прикладами зв'язувальних фрагментів є (І) Гар фрагмент, до складу якого

ВХОДЯТЬ МІ, МН, С. та СНІ ділянки; (її) Ба фрагмент, до складу якого входять МН та СНІ ділянки; (ії) Ем фрагмент, до складу якого входять МІ. та МН ділянки простого антитіла; (ім) ЗА6 фрагмент (Уорд (Умага) та інші, (1989), Майшге, 9, 341, 544-546), до складу якого входить МН ділянка; (М) виділені СОК ділянки; (мі) Е(ар)2 фрагменти, бівалентний фрагмент, до складу якого входить дві зв'язані Раб ділянки; (мії) одноланцюгові Ем молекули (зсЕУ), де МН ділянка та Мі. ділянка є зв'язані поліпептидним лінкером, який забезпечує об'єднання сч ов двох згаданих ділянок з утворенням ділянки зв'язування антигену (Берд (Віга) та інші, (1988), Зсіепсе, 242, 423-426; Гастон (Низіоп) та інші, (1988), Ргос. Май Асай. Зсі. И.5.А., 85, 5879-83); (мії) біспецифічні і) одноланцюгові ЕМ одимери (РСТ/Ш592/09965) та (їх) "половинчасті антитіла", мультивалентні або мультиспецифічні фрагменти, які було одержано шляхом злиття генів (МУО94/13804; Холліджер (Ноіїїдег) та інші, (1993), Ргос. Май. Асай. Зсі. О.5.А., 90, 6444-6448). Половинчасті антитіла є мультимерами поліпептидів, «г зо причому кожен поліпептид включає перший домен, до складу якого входить зв'язувальна ділянка легкого ланцюгу імуноглобуліну, та другий домен, до складу якого входить зв'язувальна ділянка важкого ланцюгу і, імуноглобуліну, причому два згадані домени є зв'язаними (наприклад, пептидним лінкером), але неспроможними - де до взаємного об'єднання з утворенням рецептору антигену: рецептори антигену утворюються шляхом об'єднання згаданого першого домену одного поліпептиду у межах згаданого мультимеру зі згаданим другим -

Зз5 доменом іншого поліпептиду у межах згаданого мультимеру (МУО94/13804). У разі необхідності використання ї- біспецифічних антитіл, ними можуть бути традиційні біспецифічні антитіла, які можна одержати різноманітними шляхами (Холліджер (НоіЇїдег) та Вінтер (УМіпіег), (1993), Сип. Оріп. Віоїесн., 4, 446-449), наприклад, одержати хімічним шляхом або з гібридних гібридом, або це можуть бути будь-які фрагменти біспецифічних антитіл, які згадувались перед тим. Перевага може надаватись використанню зсЕм димерів або половинчастих « антитіл, у протилежність цілим антитілам. Половинчасті антитіла та зсгу можуть конструюватись без Гсділянки, пла) с з використанням лише варіабельних ділянок, що, потенційно, зменшує ефекти антиідіотипової реакції. Іншими формами біспецифічних антитіл є одноланцюгові СК-антитіла, опис яких було наведено Нері (Мегі) та іншими, з (1995), 9. Мої. Віої., 246, 367-373). - гіперваріабельні ділянки

Традиційно, гіперваріабельні ділянки (СОК»з) варіабельних ділянок антитіла ідентифікуються, як ті -І гіперваріабельні послідовності антитіла, які включають залишки, необхідні для специфічного розпізнавання антигену. У цьому документі ми посилаємося на визначення та нумерацію СОК, які було наведено у роботі Чотіа о (Споїпіа) та Леска (І езК), (1987), 9. Мої. Віої., 196, 901-917. - - функціонально еквівалентна варіантна форма

Цей вираз означає молекулу (варіант), яка, незважаючи на те, що структурно відрізняється від іншої о молекули (вихідної), зберігає деяку суттєву гомологію, а також як мінімум деякі біологічні функції згаданої ї» вихідної молекули, наприклад, здатність до зв'язування певного антигену або антигенної детермінанти. Варіанти можуть бути у формі фрагментів, похідних або мутантів. Варіант, похідну або мутант можна одержати шляхом модифікування згаданої вихідної молекули шляхом додавання, видалення, заміщення або введення однієї або ов декількох амінокислот, або приєднанням іншої молекули. Ці зміни можна здійснювати на рівні нуклеотиду або білку. Наприклад, закодованим поліпептидом може бути Раб фрагмент, який у подальшому приєднується до Ес (Ф, хвосту з іншого джерела. За альтернативним варіантом може приєднуватись маркер, наприклад, фермент, ка флуоресцеїн тощо. Наприклад, функціонально еквівалентною варіантною формою антитіла "А" проти характерної антигенної детермінанти згаданого ЕЮО-В домену фібронектину може бути антитіло "В" з іншою бо послідовністю гіперваріабельних ділянок, яке, однак, розпізнає ту ж саму антигенну детермінанту антитіла "А".

Ми виділили рекомбінантні антитіла у зсЕм форматі з бібліотеки проявлення комплексу антитіло-фаг, специфічні для згаданого ЕО-В домену фібронектину, які розпізнають ЕО-В(ж1)-фібронектин у тканинних зрізах.

Одне зі згаданих антитіл, Е1, було афінно зрілим для продукування антитіл Н1І0 та І 19 з поліпшеною афінністю.

Антитіло І 19 має константу дисоціації для згаданого ЕО-В домену фібронектину у субнаномолярному діапазоні 65 концентрацій.

Згадані високоафінні антитіла 19 та 01.3 (антитіло, специфічне до стороннього антигену, лізоциму курячого яйця) помічали радіоактивним ізотопом та впорскували мишам, які мали пухлини. Біологічний розподіл у пухлинах, крові та органах визначали через різні проміжки часу та виражали як відсоток згаданої дози, яку було впорскнуто, на грам тканини (95 ІО/грам). Уже через З години після впорскування 95 ІО/грам (пухлина) був

Кращим для 19, аніж 95 ІО/грам (кров) для негативного контролю 01.3. Співвідношення пухлина:кров зростало при збільшенні часових періодів. Це дозволяє зробити припущення, що згадане високоафінне антитіло 119 може бути корисним агентом для таргетування пухлин, наприклад, для імуносцинтиграфічного виявлення ангіогенезу. - фотосенсибілізатор

Фотосенсибілізатор може бути визначено як молекулу, яка після опромінювання та у присутності води та/або 7/0 Кисню буде утворювати токсичні різновиди молекул (наприклад, синглетний кисень), здатні до реагування з біомолекулами, тим самим, потенційно, спричинюючи пошкодження біологічним цілям, наприклад, клітинам, тканинам та загальним рідинам тіла.

Фотосенсибілізатори є особливо придатними, коли вони поглинають світло при довжині хвилі, яка перевищує 600 нм. Фактично, максимальне проникнення світла до тканин та загальних рідин тіла відбувається у діапазоні 7/5 500-900 нм (Ван (УМап) та інші, (1981), Рпоїюспет. Рпоорбіо!., 34, 679-681.

Таргетована доставка фотосенсибілізаторів з подальшим опромінюванням є привабливим шляхом для лікування захворювань, пов'язаних з ангіогенезом |Ярмаш М.Л. (Маптиви М.І.) та інші, Апіїбоду (агдеїеа рпоїоіузів, Ст. Кем. Тпегар. ЮОгид Саїтіег бувіетв, 10, 197-252 (1993); Роув П.М. (Кожше Р.М.), І апсеї, 351, 1496 (1998); Леві (Гему), 9У. Тгепаз Віоїесппої., 13, 14-18 (1995)), зокрема, для вибіркової деструкції 2о новоутворених очних кровоносних судин. Доступні терапевтичні методи, наприклад, лазерна фотокоагуляція, безпосередньо або після введення фотосенсибілізувальних агентів, мають обмеження унаслідок відсутності вибірковості, наслідком чого за типовим варіантом є пошкодження здорових тканин та судин ІМасшаг

РІПоосоадшіайоп бішау Сгоцир, Агсп. ОрпНіаїт., 112, 480-488 (1994); Хаймовічі Р. (Наітомісі К.) та інші, Сигт.

Еуе Кев., 16, 83-90 (1997); Шмідт-Ерфурт Ю. (5сптійїЕпипй 0.) та інші; Огаєїтез Агсй. Сііп. Ехр. сч Оріннаїтої., 236, 365-374 (1998).

На основі аргументів, які було наведено перед тим, можна бачити, що було б надзвичайно важливо відкрити і) способи поліпшення вибірковості та специфічності фотосенсибілізаторів, наприклад, шляхом кон'югування згаданих фотосенсибілізаторів з відповідною молекулою-носієм. Ймовірно, що розробка молекул-носіїв високої якості виявиться не тривіальним завданням. Більше того, ймовірно, що не усі фотосенсибілізатори будуть «г зо придатними для "перенесення" іп мімо до ділянки, яка представляє інтерес. Головний та вирішальний вплив на "таргетивність" та ефективність кон'югатів фотосенсибілізаторів можуть здійснювати такі фактори, як хімічна о структура фотосенсибілізатору, розчинність, ліпофільність, липкість та активність. «-

У цьому описі ми показуємо, що згадане високоафінне антитіло І 19, специфічне до згаданого ЕЮО-В домену фібронектину, вибірково локалізується на новоутворених кровоносних судинах на кролячій моделі очного - ангіогенезу у разі системного введення. Згадане антитіло 119, хімічно сполучене з фотосенсибілізувальним ї- агентом хлористим оловом (ІМ) ес та опромінене червоним світлом, опосередковує вибіркову оклюзію новоутворених очних кровоносних судин та активізує апоптоз відповідних ендотеліальних клітин. Ці результати демонструють, що нові очні кровоносні судини можуть імунохімічно відрізнятись іп мімо від судин, які існували попередньо, та активно змушують висунути припущення про те, що таргетована доставка фотосенсибілізаторів з « подальшим опромінюванням може бути ефективною при лікуванні очних хвороб, які ведуть до втрати зору, та, в с можливо, інших патологій, пов'язаних з ангіогенезом.

Варіанти втілення цього винаходу ілюструються наведеними далі малюнками, на яких ;» на Фіг.1 показано розроблену бібліотеку комплексів антитіло-фаг; на Фіг.2 показано результати двомірного гель-електрофорезу та вестерн-блотингу лізату клітин СОЇ 0-38 меланоми людини; -І на фігурах ЗА, ЗВ, ЗС показано результати імуногістохімічних експериментів з поліморфною гліобластомою; на Фіг.4 показано результати аналізу стабільності комплексів антитіло-'ЄО-В); ве на Фіг.5 показано біологічний розподіл у мишей, що мають пухлини, яким було впорскнуто фрагменти антитіл, - мічені радіоактивним ізотопом; на Фіг.б6 показано амінокислотну послідовність 1 19; о на Фіг.7 А та 7В показано кролячі очі з імплантованою кулькою; ї» на Фіг.8 показано імуногістохімічні показники зрізів рогової оболонки ока кролика; на Фіг.9 показано імуногістохімічні показники зрізів очних структур кроликів (рогова оболонка ока, райдужна оболонка ока, сполучна оболонка ока) з застосуванням субстрату лужної фосфатази червоного

Кольору та гематоксиліну; на Фіг.10 показано локалізацію антитіл, мічених флуоресцентною речовиною, у новоутворених очних (Ф, кровоносних судинах; ка на Фіг.11 показано макроскопічне зображення очей кроликів, до яких було впорскнуто білки, сполучені з фотосенсибілізаторами, перед та після опромінювання; во на Фіг.12 показано результати мікроскопічного аналізу зрізів очних структур кроликів, до яких було впорскнуто білки, сполучені з фотосенсибілізаторами, та опромінено червоним світлом.

На Фіг.1 показано:

Розроблену бібліотеку комплексів антитіло-фаг. (а) Фрагменти антитіла проявлено на фагові як ріП злиття, що зображено схематично. На ділянці зв'язування антитіла (антиген зображено з верхньої точки), остов МК СОК» 65 має жовтий колір, остов МН СОК має синій колір. Залишками, які було піддано довільній мутації, є положення 91, 93, 94 та 96 Мк СОМКЗ (жовтий колір), та положення 95, 96, 97 та 98 МН СОКЗ (синій колір). СЬ атоми згаданих бокових ланцюгів представлено у темніших кольорах. Представлено також (сірий колір) залишки СОК1 та СОК2, які можуть піддаватись мутаціям з метою поліпшення афінності антитіла. За допомогою програми

КазМої (пЕеЕр/Лумлу.спетівіу.исвс.едилміркеЛеаснпіпд/газтої.йіті) структуру зсЕм було змодельовано з файлу раб Ідт (ВгооКпамеп Ргоївіп ЮОайа Вапк; пЕер:/Аммлу2.ері.ас.иКк/рсзегм/рарар.ніт). (Б) Стратегія ампліфікації за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (РСК) та клонування бібліотеки. Зародкові матриці ОР47 та

ОРК22 було модифіковано (дивись текст) для спричинення мутацій на СОКЗ ділянках. Гени позначено як прямокутники, СОКз» позначено як нумеровані рамки у межах згаданих прямокутників. Згадані МН та Мі. сегменти після цього складали та клонували у рОМ332 фагемідному векторі. Перелік праймерів (від ПОСЛІДОВНОСТІ 76 Мо11 до ПОСЛІДОВНОСТІ Мо18), які було використано під час ампліфікації та складання, наведено у нижній частині малюнку.

На Фіг.2 показано:

Результати двомірного гель-електрофорезу та вестерн-блотингу. (а) Забарвлювання сріблом під час двомірного електрофорезу у поліакриламідному гелі лізату клітин СОЇ 0-38 людської меланоми, до якого було /5 додано рекомбінантний 7889, до складу якого входив ЕЮО-В. Дві плями 7889 (коло) обумовлено частковим протеолізом Ніз-мітки, яку було використано для очищення білку. (б) Імуноблот гелю, ідентичний імуноблоту

Фіг.2а, з використанням анти-ЕО-В Е1 (Таблиця 1) та М2 анти-РГ Ас антитіл як реагенту для виявлення.

Виявлено лише 7889 плями, що підтверджує специфічність рекомбінантного антитіла, яке було виділено з плями у гелі.

На Фіг.ЗА-3С показано:

Результати імуногістохімічних експериментів на серійних зрізах поліморфної гліобластоми, на яких показано типові клубочкоподібні судинні структури, які було пофарбовано за допомогою зсгЕуз ЕЇ (А), А2 (В) та 04 (С).

Шкала масштабу: 20мкм.

На Фіг.4 показано: сч

Стабільність комплексів антитіло--ЕЄЮ-В). Результати аналізу зв'язування зсЕуз ЕЇ, НІ0 та 119 зі згаданим

ЕБ-В доменом фібронектину. (а) Сенсограма, яку було одержано на апараті ВіАсоге, яка показує поліпшені і) профілі дисоціації які було одержано у разі визрівання афінності антитіла. (Б) Нативний гель-електрофоретичний аналіз комплексів 5сЕУ-«(ЕО-В). Лише згадане високоафінне антитіло 119 може утворювати стабільний комплекс з антигеном, який було помічено флуоресцентною речовиною. Виявлення «Е зо флуоресценції здійснювали за описом (Нері (Мегі) та інші, (1996), ВіоТесппідцевз, 20, 708-712). (с) Конкуренція згаданого комплексу 5сЕМ-(ЕЮ-В-біотин) із 100-кратним мольним надлишком о небіотинільованого ЕЮО-В, яка контролювала за електрохемілюмінісценцією за допомогою апарату Огідеп. «-

Спостерігається тривалий час напівжиття згаданого комплексу І 19-'Є0О-В). Квадрати чорного кольору: І 19; незафарбовані трикутники: Н10. «

На Фіг.5 показано: ї-

Біологічний розподіл у мишей, що мають пухлини, яким було впорскнуто фрагменти антитіл, мічені радіоактивним ізотопом.

Одержано криві часової залежності біологічного розподілу у пухлинах та крові, який було виражено як відсоток дози, яку було впорскнуто, на грам. Наведено також дані біологічного розподілу у відповідних органах. «

На Фіг.б показано амінокислотну послідовність антитіла /19, яка включає важкий ланцюг (МН), лінкер та з с легкий ланцюг (МІ).

На Фіг.7А та Фіг.7В показано кролячі очі з імплантованими полімерними кульками, які було просочено ;» ангіогенними речовинами.

На Фіг.8 показано імуногістохімічні показники зрізів рогової оболонки ока кролика з новоутвореними Кровоносними судинами, які було забарвлено за допомогою згаданого антитіла І 19. -І На Фіг.9 показано результати імуногістохімічних досліджень очних структур з застосуванням згаданого антитіла 19. Специфічне червоне забарвлення спостерігається довкола новоутворених судинних структур у ве роговій оболонці ока (а), яке є відсутнім довкола кровоносних судин райдужної оболонки ока (б) та сполучної - оболонки ока (с). Стрілки невеликого розміру: епітелій рогової оболонки ока. Відповідні кровоносні судини 5р позначено стрілками великого розміру. Шкала масштабу: 5Омкм. о На Фіг.10 показано імунофотодетекцію антитіл, мічених флуоресцентною речовиною, які таргетують очний ї» ангіогенез. Сильна флуоресценція новоутворених кровоносних судин рогової оболонки ока (які позначено стрілкою) спостерігається у кроликів, яким було впорскнуто кон'югат антитіла І 19-Су5 (а), специфічний до ЕО-В домену фібронектину, яка не спостерігається у кроликів, яким було впорскнуто антитіло НУНЕЇ -10-Су5 (б). дв Результати імунофлуоресцентної мікроскопії зрізів рогової оболонки ока підтвердили, що довкола новоутворених судинних структур у роговій оболонці ока локалізується І 19-Су5 (с), а не НУНЕЇ -10-Су5 (4). Зображення (а, Б) (Ф, було одержано через 8 годин після впорскування антитіла; зображення (с, 4) було одержано з використанням ка зрізів рогової оболонки ока, яку було видалено у кроликів через 24 години після впорскування антитіла. Р, кулька. во На Фіг.11 показано макроскопічні зображення очей кроликів, які оброблялись кон'югатами фотосенсибілізатору. Око кролика, якому було впорскнуто /19-Р5 перед (а) та через 16 годин після опромінювання червоним світлом (Б). Стрілка вказує коагульовані новоутворені кровоносні судини, що підтверджується, як гіпофлуоресцентна площа на Суб флуороангіограмі набору (с) через 16 годин після опромінювання. Зверніть увагу на те, що коагуляції не спостерігається на інших судинних структурах, б5 наприклад, на розширених судинах сполучної оболонки ока. Для порівняння, Суб флуороангіограму з гіперфлуоресценцією нещільних кровоносних судин та відповідну кольорову фотографію кролячого ока, яке не піддавалось обробці, наведено на (4) та (п). Зображення (е, Її, 9) є аналогічними до (а, б, с), але відповідають кролику, якому було впорскнуто овальбумін-?5 та опромінено червоним світлом. Коагуляція не спостерігається і відповідна ангіограма демонструє гіперфлуоресценцію нещільних кровоносних судин. На зображеннях (і-1) представлено очі кроликів з ангіогенезом початкової стадії, яким було впорскнуто І19-Р5. На зображеннях перед (і) та через 16 годин після опромінювання червоним світлом (|) спостерігається екстенсивна та вибіркова індукована світлом внутрішньосудинна коагуляція (стрілка). Оклюзія судин (стрілка) є особливо очевидною у оці (1) кролика, яке було піддано опромінюванню, безпосередньо після забиття, але не спостерігається у оці (К) того ж самого кролика, яке не піддавалось опромінюванню. Р, кулька. Вістря стрілки /о вказує на край (лімб) рогівки. На усіх фігурах над лімбом спостерігаються розширені кровоносні судини сполучної оболонки ока, які існували попередньо, у той час як у напрямку від лімбу до кульки (Р) може спостерігатись ріст новоутворених кровоносних судин рогової оболонки ока.

На Фіг.12 показано результати мікроскопічного аналізу вибіркової оклюзії кровоносних судин. Забарвлені гематоксиліном/«еозином (Н/Е) зрізи рогових оболонок ока (а, е, Б, ї не офіксовано; і, | фіксовано 7/5 параформальдегідом) кроликів, яким було впорскнуто овальбумін-РЗ (а, е, ї) або І 19-РБ5 (Б, Її, |) та піддано опромінюванню. Стрілками великого розміру позначено репрезентативні непошкоджені (є, ї) або повністю перекриті (ї |) кровоносні судини. У протилежність вибірковій оклюзії новоутворених кровоносних судин рогової оболонки ока та обмеженого пошкодження довкола судин (еозинофілія), яке було опосередковане /19-Р5 після опромінювання (Б, ї, |), кровоносні судини сполучної оболонки ока (к) та райдужної оболонки ока (1) тих же самих кроликів не мають ознак пошкоджень. Результати аналізу флуоресценції з опосередкованим кінцевою деоксинуклеотиділтрансферазою кінцевим "нік'-«міченням а-ОТР-біотином (ТОМЕЇ) надають різну кількість апоптозних клітин у зрізах кроликів, яких було піддано опромінюванню та яким було впорскнуто І 19-85 (с, 4) або овальбумін-?5 (й, М). Стрілками великого розміру позначено деякі відповідні судинні структури.

Стрілками невеликого розміру позначено епітелій рогової оболонки ока. Шкала масштабу: 100мкм (а-4) та 25мкм сч дв (е-1).

Більш докладний опис цього винаходу надається у наведених далі прикладах. і)

Приклад 1

Виділення зсЕм фрагментів антитіла людини, специфічних до згаданого ЕЮО-В домену фібронектину. з бібліотеки проявлення комплексу антитіло-фаг «г зо Бібліотеку антитіл людини було клоновано з застосуванням МН (ОР47; Томлінсон (Тотіїпзоп) та інші, (1992),

У. Мої. Віоі., 227, 776-798) та МК (ОРК22; Кокс (Сох) та інші, (1994), Еицг. 9. Іттипої., 24, 827-836) і зародкових генів (стратегію клонування та ампліфікації дивись на Фіг.1). Згаданий МН компонент бібліотеки «- було одержано з використанням частково вироджених праймерів (Фіг1) (з ПОСЛІДОВНОСТІ Мо11 до

ПОСЛІДОВНОСТІ Мо18) у методі, основу якого складає полімеразно-ланцюгова реакція, для введення довільних « мутацій у положення 95-98 СОМКЗ. Згаданий МІ компонент було одержано таким же чином шляхом введення ї- довільних мутацій у положення 91, 93, 94 та 96 СОМКЗ. Полімеразно-ланцюгові реакції було здійснено за наведеним описом (Маркс (Магкв5) та інші, (1991), 9. Мої. Віоі,, 222, 581-597). МН-МІ всЕм фрагменти конструювали шляхом РСК складання (Фіг.1; Клаксон (Сіасквоп) та інші, (1991), Маїиге, 352, 624-628) очищених методом імуносорбції у лунках з гелем МН та Мі. сегментів. ЗОмкг очищених УН-МІ. зсЕм фрагментів було піддано « подвійному розщеплюванню Мсо! (300 одиниць) та Мої (300 одиниць) з подальшим літуванням до 15мкг з с роОМ3321 фагемідного вектору, який було розщеплено за допомогою Мой/МсоІЇ. рОМ332 є похідним фагеміду . РНЕМІ (Хугенбум (Ноодепроот) та інші, (1991), Мисі. Асідз Кевз., 19, 4133-4137), у якого послідовність між и? МОЇ! сайтом та амбер-кодоном, який передує гену ІІ, було заміщено наведеною далі послідовністю, яка кодує 035БОЗ-РІ АОС-Нівб мітку (Нері (Мегі) та інші, (1996), Макиге Віоїесппоіоду, 14, 385-390):

Мей ро В 5 ре ши еще 5 -І У ков

У - Об ССС ОСА САТ САС ОАТ ТСС АС АТ САС ТАС АЛ БАС САС - 0 0 КК НН НН НН атьс - САС АС ААО САС САТ САССАТ САС САТ ТАС. У

Трансформації ТІ штаму Е.соїї було здійснено за Марксом (Магкв) та іншими, (1991, 9. Мої. Віої, 222, (95) 50 581-597); фаги було одержано за стандартними протоколами (Ніссім (Міззіт) та інші, (1991), 9. Мої. Віо).,

ГТ» 222, 581-597). П'ять клонів було відібрано випадковим чином та секвеновано з метою перевірки на відсутність первазивної контамінації.

Рекомбінантні фрагменти ЕО-В та 7889 фібронектину, до складу яких входить один та чотири гомологічні повтори типу І, відповідно, експресували за допомогою вектору експресії на основі рОЕ12 (компанія Оіадеп,

Спаївжопй, штат Каліфорнія, США) за наведеним описом (Карнемолла (Сагпетоїйа) та інші, (1996), Іпї. 9.

ГФ) Сапсег, 68, 397-405). 7 Селекції проти рекомбінантного ЕО-В домену фібронектину (Карнемолла (Сагпетоїіа) та інші, (1996), Ії. 9.

Сапсег, 68, 397-405, Зарді (7агаї) та інші, (1987), ЕМВО )3., 6, 2337-2342) здійснювали у концентрації 10 НМ з застосуванням антигену, який було біотинільовано М-гідросукцинімідним ефіром дисульфіду біотину (реактив 60 В-4531; компанія бідта, Висй5, Швейцарія; 10), та елюювали після двомірного гель-електрофорезу та імобілізації на покритих стрептавідином мікросферах Рупабреааз (компанія Бупаї, Осло, Норвегія). 1013 фаги було використано для кожного етапу сортування у мл реакційній суміші. Фаги інкубували з антигеном у 295 суміші молока/РВ5 (забуференого фосфатом фізіологічного розчину (МРВ5) впродовж 10 хвилин. До згаданого розчину додавали 1Омкл мікросфер Рупабеавдз (1Омг/мл; компанія Бупаї, Осло, Норвегія), які попередньо було бо блоковано у МРВ5. Після перемішування впродовж 5 хвилин згадані мікросфери за допомогою магніту з розчину видаляли та промивали сім разів сумішшю РВБЗ-0,195 Твін-20 (РВ5Т) та тричі за допомогою РВ5. Елюювання, після інкубування впродовж 2 хвилин, здійснювали за допомогою 500мкл 5О0мММ дитіотреїтолу (ОТ) з метою відновлення дисульфідного містку між антигеном та біотином. Мікросфери знову імобулізували і одержаний

ВОЗчЧИН було використано для інфікування штаму ТО1 клітин Е.соїї на етапі експоненційного росту. Після трьох етапів сортування елюйований фаг було використано для інфікування штаму НВ2151 клітин Е.соїЇ на етапі експоненційного росту з подальшим висіванням на планшети (2хТУ (триптонядріжджовий екстракт)н196 розчин глюкозиї1ООмкг/мл ампіциліну)-1,590 розчин агару). Окремі колонії вирощували на 2хХГУ0,195 розчині глюкози-1ООмкг/мл ампіциліну та індукували експресію антитіла за допомогою їмМ о ІРТО 7/0 (зопропілтіогалактозиду) впродовж ночі при температурі 302С. Одержані супернатанти піддавали скринінгу за допомогою ЕЇГ ІЗА з застосуванням сенсибілізованих стрептавідином титраційних мікропланшетів, які піддавали обробці 1ОнНМ біотинільованого ЕЮО-В, та використанням анти-РІ АС М2 антитіла (компанія ІВІ Кодак, Мем Намеп, штат Коннектикут) як виявлювального реагенту. 3295 клонів, які було піддано скринінгу, виявились позитивними за результатами цього аналізу; три з них, які дали найсильніший ЕГІЗА сигнал (ЕЇ, А2 та 54), було секвеновано 7/5 З подальшим додатковим визначенням характеристик.

Твердофазний імуноферментний аналіз (ЕП ІЗА) здійснювали з використанням біотинільованого ЕЮ-В, який було виділено з плям у гелі, біотинільованого ЕЮО-В, який не було денатуровано, ЕЮО-В, який було сполучено з прилеглими доменами фібронектину (рекомбінантний білок, до складу якого входили домени 7889) та ряду сторонніх антигенів. Антитіла Е1, А2 та 04 сильно та специфічно реагували з усіма трьома білками, до складу го яких входив ЕО-В. Це, разом із згаданим фактом, суть якого полягала у тому, що три згадані рекомбінантні антитіла можна очищати з бактеріальних супернатантів за допомогою ЕЮ-В-афінної колонки, активно примушує висунути припущення про те, що вони розпізнають антигенну детермінанту, яка є присутньою у нативній конформації ЕО-В. Реакції з фрагментами фібронектину, до складу яких не входив згаданий ЕЮО-В домен, не було виявлено (дані не наведено). З метою перевірки того, чи мають антитіла, які було виділено проти плями у гелі, с хорошу афінність до нативного антигену, за наведеним описом на приладі ВіАсоге було здійснено аналіз взаємодії у реальному масштабі часу з використанням резонансу поверхневого плазмону (Нері (Меггі) та інші, о (1997), Маїшге Віобгесппої., 15, 1271-1275). Мономерні фракції зсЕм фрагментів ЕЇ1, А2 та 04 зв'язувались з

ЕБ-В з афінністю у діапазоні 107-108 М-1 (Таблиця 1).

Як додаткову перевірку специфічності та придатності антитіла, було здійснено імуноблот двомірного /-«ф електрофорезу у поліакриламідному гелі з нанесенням на гель лізату лінії клітин СОЇ О-38 меланоми людини, до якого було додано незначні кількості рекомбінантного білку 7889, до складу якого входив ЕЮО-В (Фіг.2). і,

ЗСЕМ(ЕЇ) сильно та специфічно забарвлював лише пляму 7889. «--

Антитіла ЕТ, А? та 54 було використано для імунолокалізації фібронектину, до складу якого входив ЕО-В (В-ЕМ), у кріостатних зрізах поліморфної гліобластоми, агресивної пухлини головного мозку людини з активними в ангіосенними процесами. На Фіг.З представлено серійні зрізи поліморфної гліобластоми з типовими р. клубочкоподібними судинними структурами, пофарбованими трьома згаданими антитілами у червоний колір.

Імунне забарвлювання зрізів зразків поліморфної гліобластоми, які було заморожено у рідкому азоті безпосередньо після видалення за допомогою хірургічних процедур, було здійснено за наведеним описом (Карнемолла (Сагпетоїа) та інші, (1996), Іпї 9). Сапсег, 68, 397-405, Кастеллані (Савіейапі) та інші, « (1994), Іпйї 9. Сапсег, 59, 612-618). Стисло, імунне забарвлювання було здійснено з застосуванням шщ с М2-анти-РГ Ас антитіла (компанія ІВІ Кодак), біотинільованих антимишачих поліклональних антитіл (компанія й Зідта), набору для забарвлювання, до складу якого входив комплекс стрептавідин-біотин-лужна фосфатаза «» (компанія Віобра, Мілан, Італія), нафтол-АБ-МХ-фосфату та розчину стійкого червоного барвника (компанія

Зідта). Гематоксилін Джілла було застосовано як контрастний барвник, з подальшим заключениям до гліцерогелю (компанія Оако, Сагрепіегіа, штат Каліфорнія), як повідомлялось раніше (Кастеллані (СазіеПапі) -і та інші, (1994), Іпї. У. Сапсег, 59, 612-618).

З застосуванням подібних же методів та згаданого антитіла І 19 (дивись наступний приклад) ми могли також ть специфічно забарвлювати новоутворені кровоносні судини, які було індуковано шляхом імплантування до - рогової оболонки очей кроликів полімерних кульок, просякнутих ангіогенними речовинами, наприклад, фактором 5р росту судинного ендотелію або ефірами форболу. о Приклад 2

Та» Виділення зсЕм фрагменту антитіла людини, який зв'язується з ЕЮ-В із субнаномолярною афінністю

ЗСЕМ(ЕЇ) було відібрано для перевірки можливості поліпшення його афінності за допомогою обмеженої кількості мутацій СОМК залишків, розміщених на периферії рецептору антигену (Фіг1А). Ми піддавали Комбінаторним мутаціям залишки 31-33, 50, 52 та 54 МН антитіла та проявляли відповідний набір на нитчастому фагові. Було встановлено, що згадані залишки часто контактують зі згаданим антигеном у відомих об'ємних

ІФ) структурах комплексів антитіло-антиген. Одержаний набір з 4х109 клонів було селектовано для зв'язування зі ко згаданим ЕО-В доменом фібронектину. Після двох етапів сортування та скринінгу 96 окремих клонів було виділено антитіло з афінністю, яку було поліпшено у 27 разів (НІ10; Таблиці 1 та 2). Подібно до спостережень 60 інших з афінно-зрілими антитілами, поліпшену афінність було обумовлено повільнішою дисоціацією від згаданого антигену, а не поліпшеними значеннями коп (Шер (Зспіег) та інші, (1996), Сепе, 169, 147-155, Іто (Ко), (1995), У. Мої. Віо!., 248, 729-732). Часто думають, що легкий ланцюг антитіла вносить менший внесок до зв'язувальної афінності антитіла, що підтверджується фактом, суть якого полягає у тому, що як природні, так і штучні антитіла, позбавлені легкого ланцюгу, все ще можуть зв'язуватись з антигеном (Уорд (Умага) та 65 інші, (1989), Маїйшге, 341, 544-546, Хамерс-Кастерман (Натеге-Савіегтап) та інші, (1993), Маїшге, 363, 446-448). З цього приводу ми вирішили рандомізувати лише два залишки (32 та 50) МІ домену, які розміщено у центральній частині рецептору антигену (Фігура та) та які, як встановлено, у об'ємних структурах часто контактують з антигеном. Одержану бібліотеку, до складу якої входило 400 клонів, проявляли на фагові та селектували за зв'язуванням антигену. За результатами аналізу профілів дисоціації з застосуванням аналізу взаємодії у масштабі реального часу за допомогою приладу ВіІАсоге (Джонссон (допззоп) та інші, (1991),

ВіоТесппідцез, 11, 620-627) та вимірювань Кох за допомогою конкуруючих експериментів з електрохемілюмінесцентним виявленням, було ідентифіковано клон (І 19), який зв'язувався зі згаданим ЕО-В доменом фібронектину з Ку-54пМ (Таблиці 1 та 2). Експерименти з визріванням афінності було здійснено наведеним далі чином. Згаданий ген зсЕм(Е1) було ампліфіковано за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції 7/0 З праймерами ІМВІБіз (5-ВСООСССАВССООССАТОСССОАС-3) (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мої) та ОРА7СОК Пог (Б-САВССТООСОБАСССАОСТСАТМУММММММММОСТАААООТОААТССАСАСОСТО-3) (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо2) для введення довільних мутацій у положеннях 31-33 СОКІ МН (для нумерації: 28), та з праймерами

ОРА7СОМКТраск (5-АТСАОСТОООТССОССАСОоСсСТоСсС-3) (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо3) та ОРА7СОКООгГ (Б-СТСТОСОТАСТАТОТОСТАССМММАСТАССМММААТМММТОАСАСССАСТОСАСССССТТ-3) 7/5 «ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме4) для довільної мутації положень 50, 52, 54 СОК2 МН. Залишковий фрагмент згаданого зем гену, який охоплював 3-частину МН гену, пептидний лінкер та МІ. ген, було ампліфіковано з праймерами оРАТСОМ2раск (5-АСАТАСТАСОСАСАСТОСОТОААО-3) (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо5) та УюгМої (Б-- САТТСТССАСТТОСООССОСТТТОАТТТССАССТТООСТОССТТООССОААСО-3) (ПОСЛІДОВНІСТЬ Моб) (942С впродовж 1 хвилини, б0еС впродовж 1 хвилини, 7292С впродовж 1 хвилини). Три продукти полімеразно-ланцюгової реакції, які було одержано, піддавали очищенню методом імуносорбції у лунках з гелем та складали за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (21) з праймерами І МВІбБіз та ЛогіМої (9423 впродовж 1 хвилини, 609 впродовж 1 хвилини, 722 впродовж 71 хвилини). Простий продукт полімеразно-ланцюгової реакції, який було одержано, очищали з полімеразно-ланцюгової реакційної суміші, піддавали подвійному розщепленню за допомогою Мой/Мсо! та літували до рОМ332 вектору, який було розщеплено за допомогою Ге

МоШ/МсоЇ. Приблизно Омкг вектору та Змкг інсерційного сегменту було використано у згаданій лігувальній (5) суміші, яку очищали шляхом фенолізу та осадження етанолом, ресуспендували у 5О0мкл стерильної води та піддавали електропорації у електрокомпетентних клітинах штаму ТО! Е.соїї. До складу бібліотеки визрівання афінності, яку було одержано, входило 4х1089 клонів. Комплекси антитіло-фагові частинки, які було одержано за наведеним описом (Ніссім (Мівзвіт) та інші, (1994), ЕМВО .)., 13, 692-698), було використано для першого етапу « селекції на імунних пробірках, сенсибілізованих 7889 (Карнемолла (СагпетоїМа) та інші, (1996), Іпйб. 5. со

Сапсег, 68, 397-405). Відібрані фаги було використано для другого етапу сортування, яке здійснювали з біотинільованим ЕЮО-В, з подальшою імобілізацією на магнітних кульках, які було покрито стрептавідином -- (компанія Бупаї, Осло, Норвегія; дивись попередній параграф). Після селекції приблизно 2595 згаданих клонів « виявились позитивними у розчинному твердофазному ферментному аналізі (експериментальний протокол дивись у попередньому параграфі). З-посеред кандидатів, позитивних у ЕПІЗА, ми додатково ідентифікували Її один (НІТО; Таблиця 1) з найнижчим Койя за результатами аналізу на апараті ВіАсоге (Джонссон (допевоп) та інші, (1991), ВіоТесппідцев, 11, 620-627).

Згаданий ген зсЕЖ(НІО) ампліфікували за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з праймерами І МВІбБіз « та ОРКСОРОг (5-СТТТСТОСТООТАССАСОСТААМММОСТОСТОСТААСАСТСТОАСТО) (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо7) для введення довільної мутації у положенні 32 СОКІ1 МІ. (для нумерації: Чотіа (Споїніа) та Леск (І езК), (1987), З с У. Мої. ВіоІ. 196, 901-917), та з праймерами ОРКСОК'ІВраск (5-ТТАОССТООТАССАССАСААДАСС-5) "» (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мов) та ОРКОСОКООгГ " (-СССАСТООСССТОСТООАТОСМУММАТАСАТОАОСАОССТОООАССС-3) (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо9) для введення довільної мутації у положенні 50 СОК2 МІ. Залишкову частину згаданого зсЕм гену було ампліфіковано за допомогою олігонуклеотидів ОРКСОК2васк (5-сСсСАТССАОСАСООСсССАСТО(ОС-3) (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо10) та і УюгМої (9422 впродовж І хвилини, 602 впродовж 1 хвилини, 7223 впродовж 1 хвилини). Три продукти, які було ї5» одержано, складали, розщеплювали та клонували до рОМ332 за описом, який було наведено перед тим, для мутагенезу згаданого важкого ланцюгу. Одержану бібліотеку інкубували з біотинільюованим ЕО-В у 3956 ВБА - (сироватковий альбумін великої рогатої худоби) впродовж 30 хвилин з подальшою імобілізацією на титраційному 2) 20 мікропланшеті, який було сенсибілізовано стрептавідином (компанія Воейгіпдег Маппйеєїт ОтрнН, Німеччина), впродовж 10 хвилин. Фаги, які було одержано, елюювали 20ММ розчином ОТТ (1,4-дитіо-ОЇІ -треїтол, компанія

Т» Ріка) та використовували для інфікування клітин ТО1 на етапі експоненційного росту. За результатами аналізу

ЕБ-В зв'язування супернатантів 96 колоній за допомогою ЕЇ ІЗА та ВіІАсоге було ідентифіковано клон 119. 5сЕм фрагменти анти-ЕО-В ЕТ, 4, А2, Н1І0 та І 19 антитіл селективно забарвлювали новоутворені кровоносні судини 22 у зрізах агресивних пухлин (Фігура 3).

ГФ) Після цього було одержано вищезгадані фрагменти анти-ЕО-В антитіла шляхом інокуляції однієї свіжої колонії до 1 літру 2ХТУ середовища, за описом, який було наведено перед тим у роботі Піні (Ріпі) та інших, де ((1997), 9. Іттипої. Меїйй., 206, 171-182), з подальшим афінним очищенням на СМВг-активованій сефарозній колонці (компанія Ріагтасіа, Оррзаїа, Швеція), які було сполучено з 10мг рекомбінантного білку 7889, до 60 складу якого входив ЕО-В (Карнемолла (Сагпетоїа) та інші, (1996), Іпйі У. Сапсег, 68, 397-405). Після завантаження згадану колонку промивали Б5Омл урівноваженого буферу (РВ5, л1мММ ЕОТА (етилендіамінтетраоцтова кислота), 0,5М Масі). Після цього фрагменти антитіла елюювали триетиламіном (100ММ), негайно нейтралізували за допомогою 1М Гепес-буферу, рН 7, та діалізували проти РВ5. Визначення афінності на апараті ВіАсоге було здійснено за наведеним описом (Нері (Мегі) та інші, (1997), Майшге бо Віобїесппої., 15, 1271-1275) |Фіг4). Аналіз зсувусмуг було здійснено за наведеним описом (Нері (Месії) та інші, (1996), Майшге Віоїесппоіоду, 14, 385-390) з застосуванням рекомбінантного ЕЮО-В, який було мічено на

М-кінцевій ділянці флуоресцентною речовиною інфрачервоним флуорофором Суб (компанія Атегепат) (Карнемолла (Сагпетоїа) та інші, (1996), Іпї 9. Сапсег, 68, 397-405, Нері (Мегі) та інші, (1997), Майшге

Віоїесппої., 15, 1271-1275) |Фіг4ї1. Результати аналізу на приладі ВіІАсоге не завжди забезпечують точне визначення кінетичних параметрів для реакцій повільної дисоціації унаслідок можливих ефектів поновного зв'язування, вихідної нестабільності та тривалого періоду вимірювання, який є необхідним для підтвердження того, що згадана фаза дисоціації відбувається за одним експоненційним профілем. Унаслідок цього, ми здійснювали вимірювання константи кінетичної дисоціації Кої за допомогою конкуруючих експериментів (Нері 7/0 (Мегі) та інші, (1996), Тгепав іп Віоїесппої., 14, 465-470) |Фіг4). Стисло, анти-ЕО-В антитіла (ЗОнМ) інкубували з біотинільованим ЕЮО-В (ТОНМ) впродовж 10 хвилин у присутності М2 анти-РІ АС антитіла (0,5мкг/мл) та поліклонального антимишачого дос (компанія Зідта), який попередньо було помічено комплексом рутенію за наведеним описом (Дівер Д.Р. (ЮОеамег О.К.), (1995), Маїшге, 377, 758-760). До цього розчину, у паралельних реакціях, через різні періоди часу, додавали небіотинільований ЕЮО-В (мкм). Після цього додавали (20мкл, 7/5 мг/мл) сенсибілізовані стрептавідином мікросфери Юупабреадз, які було розбавлено у експериментальному буфері компанії Огідеп (Дівер Д.Р. (Оєсамег О.К.), (1995), Маїшге, 377, 758-760) і суміші, які було одержано, піддавали аналізу на аналізаторі ОКІСЕМ (компанія ІСЕМ Іпс. «зайпегзриго, штат Мериленд, США). Цей прилад виявляє електрохемілюмінесцентний сигнал (ЕСІ), який корелює з кількістю зсЕм фрагменту, яка все ще залишається зв'язаною з біотинільованим ЕО-В перед кінцем конкуруючої реакції. Графічна реєстрація ЕСІ. 2о сигналу у залежності від часу конкурування дає профіль, який можна узгодити за допомогою однієї експоненційної функції з характерною константою Кої |Фіг.4; Таблиця 21.

Приклад З

Таргетування пухлин високоафінним зсЕм, який було помічено радіоактивним ізотопом, специфічним до ЕЮ-В домену фібронектину сч зеЕМ( 19) або зсЕм(01.3) (стороннє антитіло, специфічне до лізоциму курячого яйця), які було помічено радіоактивним йодом, впорскували інтравенозно мишам з підшкірно імплантованою мишачою і) тератокаркциномою РЕ9, агресивною пухлиною, яка швидко росте. Біологічний розподіл антитіл визначали через різні часові періоди (Фіг.4). 5сЕМ( 19) та зсЕм(О01.3) очищали на колонці з імобілізованими антигенами (Нері (Мегі) та інші, (1997), Маїшге Віоїесппої., 15, 1271-1273) та мітили радіоактивним ізотопом, йодом-125, «г зо методом йодування (компанія Ріегсе, КоскКіога, штат Іллінойс, США). Фрагменти антитіл, мічені радіоактивним ізотопом, зберігали 28095 імунореактивності, за результатами оцінки шляхом завантаження антитіла, яке було о помічене радіоактивним ізотопом, до колонки з антигеном, з подальшим підрахунком імпульсів матеріалу, який «- пройшов через колонку, та фракцій елюату. "-солим" мишам (Шведські "голі" миші, самці, віком 12 тижнів) з підшкірно імплантованою мишачою тератокарциномою Г9 (Нері (Мегі) та інші, (1997), Маїшиге Віоїесппої., 15, « 1271-1273) впорскували Змкг (3-4-мкКюрі) зсЕбм у 100Омкл фізіологічного розчину. Розмір пухлин дорівнював ї- 50-250мг, оскільки пухлини більшого розміру мають схильність до виникнення некротичного центру. Однак, експерименти з таргетування, які було здійснено з пухлинами більшого розміру (300-60Омг), дали по суті такі ж самі результати. Для кожного періоду часу було використано по три тварини. Мишей забивали гуманними методами, органи зважували та підраховували рівень радіоактивності. Результати таргетування « репрезентативних органів виражають у вигляді відсотку дози антитіла, яку було впорскнуто, на грам тканини в с (9бІО/грам). ЗсЕмМ(І 19) швидко видалялось з крові через нирки; у протилежність до традиційних антитіл, воно не накопичувалось у печінці або інших органах. 895 дози, яку було впорскнуто, на грам тканини локалізувалось на ;» пухлині вже через три години після впорскування; подальше зниження цієї величину було обумовлене тим, що розмір згаданої пухлини подвоювався кожні 24-48 годин. Співвідношення пухлина:кров через З години, 5 годин

Та 24 години після впорскування дорівнювало 1,9, 3,9 та 11,8, відповідно, для 1 19, однак завжди було нижче за -І 1,0 для негативного контрольного антитіла.

Мічене радіоактивним ізотопом зсЕМ(І 19), переважно, локалізується на пухлинах вже через декілька годин о після впорскування, що дозволяє висунути припущення про його придатність для імуносцинтиграфічного - виявлення ангіогенезу у пацієнтів.

Приклад 4 о Анти-ЕО-В антитіла вибірково забарвлюють новосутворені очні кровоносні судини ї» Ангіогенез, тобто утворення нових кровоносних судин з судин, які існували перед тим, є характерним процесом, який становить основу багатьох захворювань, у тому числі раку та більшості очних захворювань, кінцевим наслідком яких є втрата зору. Здатність до селективного таргетування та перекриття новоутворених в Кровоносних судин відкриє діагностичні та терапевтичні можливості.

Ми досліджували, чи є В-ЕМ специфічним маркером очного ангіогенезу та чи антитіла, які розпізнають В-ЕМ,

Ф) могли б селективно таргетувати очні новоутворені судинні структури іп мімо у разі системного введення. З цією ка метою ми стимулювали ангіогенез у роговій оболонці очей кроликів, що дозволяє здійснювати безпосередні спостереження за новоутворюваними кровоносними судинами, шляхом хірургічного імплантування кульок, які бо Містять фактор росту ендотелію кровоносних судин або форболовий ефір (Фіг.7). Цукральфатно (щедрий дарунок компанії Мегск, Юагптвіаді, Німеччина)/гідронові кульки, які містили або 800 нг фактору росту ендотелію кровоносних судин (компанія бідта), або 40О0нг форбол 12-міристат 13-ацетату ("РМА"; компанія

Зідта), було імплантовано до рогівок кроликів-самиць білої новозеландської породи за наведеним описом

ІДАмато Р.Дж. (Ш'Атайю МК.).) та інші, Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА, 91, 4082-4085 (1994)). Ангіогенез було 65 індуковано обома факторами. Кроликів було контрольовано щоденно. Новоутворені кровоносні судини, за імуногістохімічними даними, були чітко ЕЮО-В позитивними у разі обох індукторів. Для усіх подальших експериментів було використано кульки з РМА.

Результати імуногістохімічних досліджень показали, що 119 інтенсивно забарвлює новоутворені кровоносні судини, які було індуковано у рогівках кроликів (Фіг.8; Фіг.Уа), але не кровоносні судини ока, які існували раніше (Фіг.95, Фіг.Ус) та інші тканини (дані не наведено). Імуногістохімічні дослідження було здійснено за наведеним описом |(Карнемолла Б. (Сагпетоїа В.) та інші, Іпі. У. Сапсег, 68, 397-405 (1996)).

Приклад 5

Фрагмент людського І 19 антитіла, який зв'язується з ЕО-В з субнаномолярною афінністю. таргетуе очний ангіогенез іп мімо 70 Завдяки використанню моделі ангіогенезу на роговій оболонці очей кроликів, опис якої було наведено у попередньому прикладі, та методики імунофотодетектування |Нері Д. (Мегі Ю.) та інші, Майшге ВіоїесппоїЇ., 15, 1271-1275 (1997)), ми продемонстрували, що 119, хімічно сполучений з червоним флуорофором Суб, а не фрагмент антитіла (НУНЕЇ -10)-Су5, спрямований проти стороннього антигену (Фіг.10а, Б), селективно таргетує очний ангіогенез у разі інтравенозного впорскування. Флуоресцентне забарвлювання очних кровоносних судин, /5 Які росли, чітко виявлялось за допомогою І19 негайно після впорскування та зберігалось впродовж як мінімум двох днів, аналогічно до результатів попередніх спостережень з ангіогенезом пухлин. Результати подальшого ех мімо імунофлуоресцентного мікроскопічного аналізу на зрізах рогівки підтвердив локалізацію 119, а не

НУНЕГ-10, довкола судинних структур (Фіг.1Ос, Фіг.104). Демонстрація заснованого на використанні антитіл селективного таргетування новоутворених очних кровоносних судин, разом з реактивністю анти-В-ЕМ антитіл у 2о різних видів, потребує додаткових клінічних досліджень. Імунофлуоресцентна сцинтиграфія може бути придатною для раннього виявлення очного ангіогенезу у пацієнтів з групи ризику, перш, ніж ураження буде виявлено за допомогою флуороангіографії.

Деякі методологічні подробиці:

Для ех мімо імунофлуоресценції та для забарвлювання за допомогою гематоксиліну/еозину (Н/Е), рогові сч оболонки очей було фіксовано у 495 параформальдегіді у РВ5 (забуференому фосфатом фізіологічному розчині) перед заключениям об'єкту до блоку епоксидноїсмоли для виготовлення надтонких зрізів. Експерименти з і) фотодетектуванням флуоресценції здійснювали з введенням кроликам седативного препарату ацепромазину у дозі 5мг/кг. Для експериментів з таргетуванням, кожному кролику інтравенозно впорскували

З,омг о зом 19)4-Субовв та 2,8мг зсЕМ(НУНЕГ-10)/-Субовз (час впорскування-15 хвилин). Сильна «г зо флуоресценція новоутворених кровоносних судин рогової оболонки очей спостерігалась вже негайно після впорскування І 19, але не НУНЕЇ -10, та зберігалась впродовж декількох годин. Як додаткове випробування на і специфічність, кроликам, яким попереднього дня було впорскнуто зсЕмМ(НУНЕЇ -10)-Су5 та які були негативними «- щодо фотодетекції флуоресценції, наступного дня було впорскнуто зсЕм(І 19)-Су5 і у них спостерігалось сильне флуоресцентне забарвлювання новоутворених кровоносних судин рогової оболонки очей. -

Для виявлення флуоресценції, око освітлювали галогенною лампою з вольфрамовою ниткою розжарювання ї- (модель Зспой КІЛ5БОО; компанія 7еїз5, депа, Німеччина), яку було оснащено Суб-збуджувальним фільтром (компанія Спгота, Вгашерого, штат Вермонт, США), та двома світловодами, кінці яких було розміщено на відстані приблизно 2см від ока. Флуоресценцію виявляли за допомогою охолоджуваної чорно-білої камери

С-5985 на ПЗ3З (компанія Нататаїзи, Нататаїзви-Скйу, Японія), яку було оснащено варіооб'єктивом Сапоп (Убхіб; « 168-100мм: 1:1,9) з камерним штативом та фільтром емісії Суб (діаметр 5О0мм) (компанія Спгота), який з с розміщували на відстані 3-4см від ока, яке опромінювалось. Час виявлення дорівнював 0,4с.

Суб флуороангіографічні експерименти здійснювали за такою ж самою експериментальною схемою, однак, ;» інтравенозно впорскували 0,25мг Суб5-Трис-буферу (продукт реакції між Суб-МН5 (М-гідроксисукцинімідом) та трисігідроксиметил|амінометаном; час впорскування-5с). Час виявлення дорівнював 0,2с.

Фрагменти антитіл були у форматі зсЕм. Опис процесу очищення зсЕм(І 19) та зсЕм(НУНЕЇ -10), а також -І їхнього мічення за допомогою М-гідроксисукцинімідних (МН) ефірів індоціанінових барвників наведено у цілому ряді літературних джерел |ІНері Д. (Мегі О.) та інші, Маїшге Віобїесппої., 15, 1271-1275 (1997); Фатторуссо Р. ве (Гайогиззо МК.) та інші, (1999), Бігисішге, 7, 381-390). Співвідношення (антитіло:Суб5) радіоактивних ізотопів - для мічення двох антитіл становило 1,5:1 та 1,21, відповідно. СуУ5А-МНО було закуплено від компанії Атегзпат 5р Рпагтасіа Віогесй (7игіср, Швейцарія), овальбумін було закуплено від компанії Зідта (Висй5, Швейцарія). о Після завершення реакції мічення, кон'югати антитіл відокремлювали від флуорофору або ї» фотосенсибілізатору, які не було включено, за допомогою колонок РО-10 (компанія Атегзпат РНаптасіа

Віоїесі), які урівноважували за допомогою 5О0ММ фосфату, рН 7,4, та 100мМ Масі (РВ5). Імунореактивність кон'югатів антитіл визначали за допомогою афінного хроматографування на колонках з імобілізованими св антигенами (Нері Д. (Мегі О.) та інші, Маїшге Віоїесппої., 15, 1271-1275 (1997)), яка, в усіх випадках, становила 27895. Імунокон'югати аналізували засобами електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності

Ф, додецилсульфату натрію. Вони переміщались, яксмуга з молекулярною масою-30000 Дальтон (чистота 29096). ко Приклад 6

Фрагмент людського 19 антитіла. хімічно кон'югований з фотосенсибілізатором хлористим ЗпП(М) ев, бо селективно таргетує новоутворені очні кровоносні судини та опосередковує їхню оклюзію М разі опромінювання червоним світлом

Для випробування того, чи можна забезпечити селективну деструкцію кровоносних судин за допомогою таргетування, яке опосередковується антитілами, ми впорскували кроликам фрагмент 119 антитіла або сторонній білок, який не локалізується у новоутворених кровоносних судинах (овальбумін), 65 У сполученні з фотосенсибілізатором, хлористим оловом (іх) еб (який у подальшому скорочено позначається, як "РБЗ"). Очі тварин, яким було зроблено впорскування, опромінювали червоним світлом (доза освітлення- 78Дж/см 7). Репрезентативні результати представлено на Фіг.11. Вражаюча макроскопічна різниця спостерігалась через 16 годин після опромінювання у кроликів, яким було введено І 19-Р5 (Фіг.1т1а, 115), з коагуляцією новоутворених кровоносних судин рогової оболонки ока, але не судин сполучної оболонки ока або інших очних структур. Результати флуороангіографії з індоціаніновим флуорофором Суб (Фіг.11с) підтвердили оклюзію кровоносних судин як ділянку з характерною гіпофлуоресценцією. У протилежність до цього, у нещільних новоутворених кровоносних судинах очей, які не піддавали опромінюванню, спостерігались ділянки гшерфлуоресценції (Фіг.1т14а, Фіг.111). У опромінених судинах кроликів, яким було впорскнуто овальбумін-Р5 (Фіг.11е-119), макроскопічних змін не було виявлено ні офтальмоскопічно, ні Суб-флуороангіографічно. Ефект 70 опромінювання таргетованого кон'югату /19-Р5 на початкових етапах ангіогенезу рогової оболонки ока представлено на Фіг.11і-11І. Селективно коагульовані кровоносні судини спостерігались макроскопічно у живих тварин (Фіг.11і-11)) та були ще більш очевидними у тварин негайно після забиття (Фіг.11К, Фіг.111).

Фотодинамічне пошкодження додатково досліджували за допомогою мікроскопічних методів. Після опромінювання, оклюзію кровоносних судин можна було виявити за допомогою стандартних методів 75 забарвлювання гематоксиліном/еозином (Н/Е) як у нефіксованих, так і у параформальдегідфіксованих зрізах рогової оболонки очей тварин, яких обробляли за допомогою І19-Р5 (Фіг.11р, Фіг.117, Фіг.11)), але не у тварин, яких обробляли за допомогою овальбуміну-Р5 (Фіг.11а, Фіг.11е, Фіг.11ї). Апоптоз на ділянці рогової оболонки ока, таргетованій кон'югатом фотосенсибілізатору, чітко спостерігався під час проведення аналізу флуоресценції з опосередкованим кінцевою деоксинуклеотиділтрансферазою кінцевим "нік'-міченням а-ОТР-біотином (ТОМЕГ) (Фіг.11с, Фіг.119), але ледве виявлявся у контрольних тварин у разі контрастного забарвлювання тушшю (Фіг.114, Фіг.11й). Уразі підвищеного збільшення, спостерігали апоптоз клітин ендотелію судинних структур (Фіг.119). За результатами аналізу флуоресценції з опосередкованим кінцевою деоксинуклеотиділтрансферазою кінцевим "нік'-«міченням а-ТР-біотином (ТОМЕЇ) (не показано) та забарвлювання гематоксиліном/(еозином (Н/Е) (Фіг.11Кк, Фіг.11), пошкоджень кровоносних судин райдужної Га оболонки ока, склери та сполучної оболонки ока експериментальних тварин не спостерігалось.

Селективна фотодинамічна деструкція новоутворених кровоносних судин, які є доступними для і) опромінювання за допомогою розсіювачів світла або волоконнооптичних методів, обіцяє бути корисною для лікування захворювань очей або інших патологій, пов'язаних з ангіогенезом. Результати цього дослідження чітко демонструють, що новоутворені очні кровоносні судини можна піддавати селективній деструкції без «ф пошкодження кровоносних судин, які існували раніше, та нормальних тканин.

Деякі методологічні подробиці: і.

Хлористе олово (ІМ) ев вибрали з ряду фотосенсибілізаторів, на основі їхньої активності, розчинності та «ч- специфічности, після сполучення з кролячим антимишачим поліклональним антитілом (компанія бідта). Ці імунокон'югати піддавали скринінгу шляхом таргетованого фотолізису еритроцитів, сенсибілізованих М Моноклональним антитілом, специфічним до людського СО47 (Мо313441А; компанія Рпагтіпдеп, Зап Оіведо, штат рч-

Каліфорнія, США). Хлористе олово (ІМ) ев одержали за наведеним описом |Лу Кс.М. (и Х.М.) та інші, 3.

Іттипої. Меййодвз, 156, 85-99 (1992)). Для сполучення з білками, хлористе олово (ІМ) е 6 (2мг/мл) змішували впродовж 30 хвилин при кімнатній температурі у диметилформаміді з десятикратним мольним надлишком ЕОС « (М'-З-диметиламінопропіл-М-етилкарбодіїміду гідрохлорид, компанія Зідта) та МН (М-гідроксисукцинімід, 70 Компанія бЗідта). Після цього активовану суміш, яку було одержано, додавали до більшого у вісім разів об'єму - с розчину білку (мг/мл) та інкубували при кімнатній температурі впродовж 1 години. ц Після завершення реакції мічення, кон'югати антитіл відокремлювали від флуорофору або "» фотосенсибілізатору, які не було включено, за допомогою колонок РО-10 (компанія Атегзпат РНаптасіа

Віоїесі), які урівноважували за допомогою 5О0ММ фосфату, рН 7,4, та 100мМ Масі (РВ5). Імунореактивність 5 Кон'югатів антитіл визначали за описом, який було наведено у попередньому Прикладі. -І Для експериментів з фотоцитолізом, кроликам інтравенозно впорскували 12мг зсЕм(І 19)1-хлористого олова (ІМ) ебов або Звмг овальбуміну 1-хлористого олова (ІМ) ебозб та витримували у темряві впродовж часу ве проведення експерименту. Через вісім годин після впорскування кроликів було анестезовано кетаміном - (ЗбБмг/кгуксилазином (5мг/кг/ацепромазином (мг/кг) та одне з двох очей впродовж 13 хвилин опромінювали галогенною лампою з вольфрамовою ниткою розжарювання (модель Зспой КІ 1500), яку було оснащено о Суб5-фільтром (компанія Спгота), та двома світловодами, кінці яких було розміщено на відстані 1см від ока. чз» Площа освітлення дорівнювала приблизно їсм ? при питомій потужності опромінювання 10ОмВт/см 7, яку вимірювали за допомогою фотодетектору 51 818 (компанія Мемж'рогі Соф., Ігліпе, штат Каліфорнія, СІЛА). Ознак дискомфорту тварин після опромінювання не спостерігалось. Як запобіжний захід, кролики після опромінювання одержували аналгетичний препарат (бупренорфін, у дозі О,ОЗмг/кг). Для моніторингу фотоцитолізу, очі досліджували за допомогою офтальмоскопу та фотографували за допомогою апарату для фотографування о очного дна КОМУА 51 -14 (компанія СМР 5А, Кеппепз, І аизаппе, Швейцарія). П'ять кроликів обробляли кожним зі іме) згаданих кон'югатів хлористого олова (ІМ) ебє та опромінювали лише одне око; друге око було використано як внутрішній негативний контроль. Як додатковий контроль двох кроликів було лише опромінено, без введення 60 кон'югату фотосенсибілізатора.

Негайно після забиття кроликів за допомогою надмірної дози анестетику, очі вилущували, рогові оболонки видаляли, вміщували до блоку Тіззце Тек (компанія ЗаКига Ріпебгеснпісаї, Токіо, Японія) та заморожували. Для ех мімо імунофлуоресценції та для забарвлювання за допомогою гематоксиліну/еозину (Н/Е), рогові оболонки очей було фіксовано у 495 параформальдегіді у РВЗ (забуференому фосфатом фізіологічному розчині) перед 65 заключениям об'єкту до блоку епоксидноїсмоли для виготовлення надтонких зрізів. Для додаткового мікроскопічного аналізу було використано кріостатичні зрізи (мкм). Аналізи флуоресценції з опосередкованим кінцевою деоксинуклеотиділтрансферазою кінцевим "нік'-«міченням 4а-ОТР-біотином (ТОМЕЇ) здійснювали за інструкціями виробника (компанія Коспе Оіадпозіїс, Коїкгеи72, Швейцарія).

Таблишя 1

Послідовності відібраних клонів анти-ЕО-В антитіла 9 УН ланцюг Хі, ланцюг

Клон 31-332 50-54 95-987 з зок 91-69

А ЗА АІЗОоВОо СІ15І х б МОЖУ РУ б4 5УА АІ5О50 5ЗЕ5ЗЕ У б СОУМБРУ

ЕІ 5УА АІЗОБ5О ЕРЕУ У б ТОВІРР но БЕ5 5ІКО55 ЕРЕУ У б ТОВІРР 70 119 5Е5 5іКС55 ЕРЕУ У У ТОКІРР

Положення відповідних амінокислот (": нумерація за Томлінсоном (Тотіїпвоп) та іншими, (1995), ЕМВО 3., 14, 4628-4638) клонів антитіла, які було виділено з розроблених синтетичних бібліотек. Коди окремих амінокислот використано за стандартною номенклатурою ІЮПАК (ШРАС, Міжнародна спілка теоретичної та прикладної хімії).

Таблиця 2

Афінність анти-ЕГ-В зеРу Фрагментів

Клон Коп (71М-1) Корі) Когівтує (Му

А 1,5х105 з,ях103 - 1,9х10-8 са 4,0хци Зх ци - 8,7х10-8

ЕІ і, бх!05 вх Ну - я1х10-в нів 6,7х101 6,5х10-4 9,9х10-5 1,5х109 119 11х105 9,6х10-3 6,0х10-6 5,4х1071

У Ка-Ков/Коп. Для високоафінних зв'язувальних антитіл Н1І0 та І 19 значення К ої, які було одержано під час експериментів за допомогою апарату ВіІАсоге, є недостатньо надійними унаслідок впливу від'ємно зарядженої карбоксилованої твердої декстранової матриці; унаслідок цього, значення Ку вираховують з визначень Кок, які с було одержано за допомогою конкуруючих експериментів (Експериментальні Процедури), Кої, константа о кінетичної дисоціації; Код, константа кінетичної асоціації; Ку, константа дисоціації. В-визначено за допомогою апарату ВіІАсоге; С-визначено шляхом конкуренції з виявленням електрохемілюмінесценції. Точність значень дорівнює 45090, на основі акуратності визначення концентрацій.

Claims (25)

« Формула винаходу со -

1. Антитіло зі специфічною афінністю до характерної антигенної детермінанти ЕО-В домену фібронектину, де згадане антитіло має афінність до згаданої ЕЮО-В антигенної детермінанти у субнаномолярному діапазоні. З

2. Антитіло за п. 1, яке розпізнає ЕО-В(к) фібронектин. ї-

З. Антитіло за п. 1, яке має зсЕм формат.

4. Антитіло за п. З, яке є рекомбінантним.

5. Антитіло за п. 3, де згадана афінність поліпшена шляхом індукування обмеженої кількості мутацій у « залишках гіперваріабельних ділянок згаданого антитіла.

6. Антитіло за п. 5, де згаданими залишками є залишки 31-33, 50, 52 та 54 УН та два залишки 32 та 50 МІ. - с домену даного антитіла, піддані мутаціям.

а

7. Антитіло за п. 1,яке зв'язує ЕО-В домен фібронектину з Ку - 54 пМ. "»

8.Антитіло за п. 1, яке має амінокислотну послідовність варіабільної ділянки важкого ланцюга (УН) ЕМО! ГЕЗОСО ІМОРООБІ КІ 5ЗСААБОЕТЕЗ ЗЕЗМБУУМКОА РОКОЇ ЕМУМ5З ІЗОЗБОТТУХУ АОБМКОНЕТІ ЗКОМЗКМТІМ ГОММЗІКАЕО ТАМУУСАКРЕ РУБОУУМУСОСТ ІМТ -| (послідовність Мо19), яка їз з'єднана через лінкер СбрОоЗз5ОО5ОБАЗТО - (послідовність Мо20) з амінокислотною послідовністю варіабільної ділянки легкого ланцюга (МІ) о 50 ЕІМГТОЗРОТ І 5І ЗРОЕКАТ І ЗСКАБОЗУЗ 55 АММООК РООАРКІ ІМ МАЗЗКАТОІР ОКЕЗОЗООТ ОРТІТІЗКЕ РЕОБАМУУСО ОТОКІРРТЕС ОСТКМУБІК ЧТ» (послідовність Мо21).

9. Антитіло за п. 1, яке є функціонально еквівалентною варіантною формою І 19.

10. Антитіло за п. 9, помічене радіоактивним ізотопом. 5Б

11. Антитіло за п. 10, помічене радіоактивним йодом.

12. Антитіло за п. 1, яке включає МН домен (послідовність Мо19). о

13. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 1-12 для швидкого таргетування маркерів ангіогенезу. іме)

14. Застосування за п. 13 для імуносцинтриграфічного виявлення ангіогенезу.

15. Застосування за п. 14 для виявлення захворювань, які характеризуються проліферацією кровоносних 60 судин, зокрема, діабетичної ретинопатії, вікової дегенерації жовтої плями або пухлин.

16. Застосування за п. 13, де згадане антитіло локалізується у відповідній тканині через три-чотири години, найбільш переважно, через З години після його впорскування.

17. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 1-12 для діагностування та лікування пухлин та хвороб, які характеризуються проліферацією кровоносних судин. 65

18. Діагностичний набір, до складу якого входить антитіло за будь-яким з пп.1-12 та один або декілька реагентів, необхідних для виявлення ангіогенезу.

19. Кон'югат, до складу якого входить антитіло за п. 1 та молекула, здатна до індукування коагуляції крові та оклюзії кровоносної судини.

20. Кон'югат за п. 19, де згадана молекула, здатна до індукування коагуляції крові та оклюзії кровоносної будини, є фотоактивною молекулою.

21. Кон'югат за п. 20, де згаданою фотоактивною молекулою є фотосенсибілізатор.

22. Кон'югат за п. 21, де згаданий фотосенсибілізатор поглинає світло при довжині хвилі, яка перевищує 600 нм.

23. Кон'югат за п. 22, де згаданий фотосенсибілізатор є похідним хлористого олова (ІМ) ев. 70

24. Застосування кон'югату за п. 19 для одержання композиції для впорскування для лікування патологій, пов'язаних з ангіогенезом.

25. Застосування за п. 24, де згадана патологія, пов'язана з ангіогенезом, викликається або пов'язується з очним ангіогенезом. с щі 6) « (зе) «- « і -

- . и? -і щ» - (95) с» іме) 60 б5