UA73493C2

UA73493C2 - A microbiological process for the preparation of pravastatin and biologically pure culture mortierella maculata, being used in this process

Info

Publication number: UA73493C2
Application number: UA2001086010A
Authority: UA
Original assignee: Inst Drugs Res Ltd
Priority date: 1999-02-03
Filing date: 2000-03-02
Publication date: 2005-08-15
Also published as: CN1814766A; CN1328369C; ZA200106359B; RU2252258C2

Abstract

The present invention relates to a new microbial process for the preparation of pravastatin by the submerged cultivation of a mold strain able to 6-hydroxylate a compound of Formula (II) in aerobic fermentation and by the separation and purification of the product of Formula (I) formed in the course of the bioconversion. The process comprises cultivating a strain of Mortierella maculata filamentous mold species that is able to 6-hydroxylate a compound of general Formula (II), on a nutrient medium containing assimilable carbon and nitrogen sources and mineral salts and separating the product formed from the fermentation broth, then isolating the compound of formula (I) and purifying the same. Novel strains of Monierella maculata are also disclosed. (I)

Description

Опис винаходуDescription of the invention

Даний винахід відноситься до отримання правастатину, і, зокрема, до мікробіологічного способу виробництва 2 правастатину в промислових масштабах.The present invention relates to the production of pravastatin, and, in particular, to the microbiological method for the production of 2 pravastatin on an industrial scale.

Основним чинником ризику виникнення атеросклерозу і особливо коронарної оклюзії є високий рівень холестерину в плазмі За останні два десятиріччя були виконані інтенсивні дослідженняThe main risk factor for the occurrence of atherosclerosis and especially coronary occlusion is a high level of cholesterol in the plasma Over the past two decades, intensive research has been carried out

З-гідрокси-3-метилглутарил-кофермент А-редуктази (Ес. 1.1.1.34) як ключовий фермент обмеження швидкості біосинтезу холестерину. Правастатин, сполука формули І, 70 г. ОНC-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A-reductase (Es. 1.1.1.34) as a key enzyme limiting the rate of cholesterol biosynthesis. Pravastatin, compound of formula I, 70 g. OH

МмасОоСс ВMmasOoSs V

НО.BUT.

ЩО що бо к ств сн но у « : й о, , й й й і інші споріднені сполуки (компактен, мевинолин, симвастатин) є конкурентними інгибіторами ферментуХО что бо к ств сн no у « : и о, , и и и and other related compounds (compacten, mevinolin, simvastatin) are competitive inhibitors of the enzyme

НМО-СоА-редуктази |А.Епадо еї аІ., РЕВЗ І ей. 72, 323-326 (1976); С.Н. Кио еї аї., 9. Огд. Спет. 48,1991 (1983)).NMO-CoA-reductase | A. Epado ei aI., REVZ I ei. 72, 323-326 (1976); S.N. Kyo ei ai., 9. Ogd. Spent 48, 1991 (1983)).

Правастатин уперше був виділений М. ТапакКа з співробітниками (результати не опубліковані) з сечі собаки при дослідженнях метаболізму компактину (Агаї, М. Еї аІ., Запкуо КепКуизуо Мепро, 40,1-38, 1988). В цей час сч ль правастатин є терапевтичним засобом пониження рівня холестерину з найбільш довершеним механізмом дії.Pravastatin was isolated for the first time by M. Tapakka and coworkers (results not published) from dog urine during studies of compactin metabolism (Agai, M. Ei aI., Zapkuo KepKuizuo Mepro, 40,1-38, 1988). At this time, pravastatin is a therapeutic means of lowering cholesterol with the most perfect mechanism of action.

Найважливішою його властивістю є тканинна селективність, яка полягає в тому, що він інгибує синтез (о) холестерину на двох основних ділянках холестерогенезу, таких як печінка і тонка кишка, в той час як в інших органах лімітуючий ефект внутрішньоклітинного ферменту ледве виявимий. У той же час біосинтез холестерину мевинолином і симвастатином виявляє значний лімітуючий ефект в більшості органів (Т. Кода еї а!., Віоспіт. с 20 Віорпуз. Асіа, 1045,115-120, 1990).Its most important property is tissue selectivity, which consists in the fact that it inhibits the synthesis of (o) cholesterol in the two main areas of cholesterologenesis, such as the liver and the small intestine, while in other organs the limiting effect of the intracellular enzyme is barely detectable. At the same time, the biosynthesis of cholesterol by mevinolin and simvastatin shows a significant limiting effect in most organs (T. Koda ei a!., Viospit. p. 20 Viorpuz. Asia, 1045, 115-120, 1990).

По своїй хімічній структурі правастатин істотно відрізняється від мевинолину і симвастатину, які мають (22) більш липофільну природу. В разі останніх сполук заступник, сполучений із С-1 атомом вуглецю « гексагідронафталенового скелета, закінчується б-ланковим лактоновим кільцем, а у разі правастатину замість лактонового кільця присутня біологічно активна відкрита форма натрієвої солі дигідроксикислоти. Інша важлива со структурна відмінність складається в тому, що замість метальної групи мевинолину і симвастатину в положенні МIn its chemical structure, pravastatin differs significantly from mevinolin and simvastatin, which have (22) a more lipophilic nature. In the case of the latter compounds, the substituent connected to the C-1 carbon atom of the hexahydronaphthalene skeleton ends with a b-linked lactone ring, and in the case of pravastatin, instead of the lactone ring, there is a biologically active open form of the sodium salt of dihydroxy acid. Another important co-structural difference consists in the fact that instead of the metal group of mevinolin and simvastatin in position M

С-6 гексагідронафталенового кільця в правастатині може бути виявлена гідроксильна група, що приводить до додаткового підвищення гідрофільності.At C-6 of the hexahydronaphthalene ring in pravastatin, a hydroxyl group can be detected, which leads to an additional increase in hydrophilicity.

Завдяки описаним структурним відмінностям правастатин здатний проникати крізь липофільну мембрану периферичних клітин лише в мінімальній мірі (А.Т.М., Зега|цааіп еї аї., У. Ріагт. Зеї. 80, 830-834,1991). « 20 Промислове виробництво правастатину може здійснюватися за допомогою двох ферментаційних стадій. На -в першій, мікробіологічній, стадії отримують компактен, потім в ході другої ферментації натрієву сіль с компактину як субстрат перетворюють в правастатин шляхом мікробіологічного гідроксилювання в б. юр :з» -положенні.Due to the described structural differences, pravastatin is able to penetrate through the lipophilic membrane of peripheral cells only to a minimal extent (A.T.M., Zega|tsaaip ei ai., U. Riagt. Zei. 80, 830-834, 1991). « 20 Industrial production of pravastatin can be carried out with the help of two fermentation stages. In the first, microbiological, stage, compacten is obtained, then during the second fermentation, the sodium salt of compactin as a substrate is converted into pravastatin by microbiological hydroxylation in b. jur:z" -provisions.

Згідно з опублікованими патентами, мікробіологічне гідроксилювання компактину може здійснюватися в різній мірі за допомогою плісневих грибків різних видів і за допомогою ниткоподібних бактерій, що належать до виду -1 Мосагаїа, за допомогою видів Асііпотадига і Згеріотусез |(патент Бельгії Мо895090, патент Японії Мо5,810,572, патенти США 4,537,859 і 4,346,227 і Європейської патентної заявки Мо0605230)|. Описана біоконверсія о компактинового субстрату при концентрації 50Омкг/мл з використанням ниткоподібних грибків, таких як Мисог їх Ппіетаїйїв, Зупсерпа|авігит підгісап5, Сиппіпапатейа еспіпціаєа і при 2000-400Омкг/мл з використанням штамів 20 Мосагаїа, Асііпотадига і Згеріотусев, що відносяться до прокаріотів. се) Основна проблема, яка виникає при виробництві правастатину ниткоподібними грибками, пов'язана з тим, що с» через протигрибковий ефект компактину мікроорганізми не переносять навіть низьких концентрацій компактинового субстрату, що вводиться в культуру (Зегігама еї аї., 9. Апіібіоїїсв, 36, 887-891, 1983).According to published patents, the microbiological hydroxylation of compactin can be carried out to varying degrees with the help of molds of various species and with the help of filamentous bacteria belonging to the species -1 Mosagaia, with the help of the species Asiipotadiga and Zgeriotusez (Belgium patent Mo895090, Japanese patent Mo5,810,572 , US patents 4,537,859 and 4,346,227 and European patent application Mo0605230). The bioconversion of the compactin substrate at a concentration of 50 Ωkg/ml using filamentous fungi such as Mysog their Ppietaiyiv, Zupserpa|avigit podgisap5, Sippipapatheia espiptsiaea and at 2000-400 Ωkg/ml using 20 Mosagaia, Asiipotadiga and Zgeriotusev strains, which belong to prokaryotes, is described. se) The main problem that arises during the production of pravastatin by filamentous fungi is related to the fact that, due to the antifungal effect of compactin, microorganisms cannot tolerate even low concentrations of the compactin substrate introduced into the culture (Zegigama et al., 9. Apiibioiisv, 36 , 887-891, 1983).

Клітинну токсичність цього субстрату також спостерігали при гідроксилюванні за допомогою ЗгеріотусезCellular toxicity of this substrate was also observed during hydroxylation using Zgeriotusez

Сагрорнпіїиз, всебічно вивченому японськими дослідниками (М. Нозориспі ей аї., Віоїесппоіоду апаSagrornpiyiz, comprehensively studied by Japanese researchers (M.

Віоепдіпеегіпо, 42, 815-820, 1993). (Ф) Японські автори намагалися поліпшити гідроксилюючу здатність штаму Згеріотусез Сагрорпі85 за ко допомогою технології рекомбінантних ДНК. Для гідроксилювання компактину потрібна система цитохром-Р-450-моноокисгеназа (МаївиоКа еї аї., Еиг. У. Віоспет. 184, 707-713, 1989). Однак, згідно з цими бо авторами, в бактерійній системі цитохром-Р-450-моноокисгеназа не один, а декілька протеїнів беруть участь в транспорті електронів, що затруднює застосування технології ДНК. Створення екномічно ефективного мікробіологічного способу гідроксилювання для виробництва правастатину являє собою надто важку, комплексну задачу.Vioepdipeegipo, 42, 815-820, 1993). (F) Japanese authors tried to improve the hydroxylating capacity of Zgeriotusez Sagrorpi85 strain using recombinant DNA technology. Hydroxylation of compactin requires the cytochrome-P-450 monooxygenase system (MaivioKa ei ai., Eig. U. Viospet. 184, 707-713, 1989). However, according to these authors, in the bacterial cytochrome-P-450 monooxygenase system, not one, but several proteins are involved in electron transport, which complicates the use of DNA technology. Creating an economically efficient microbiological method of hydroxylation for the production of pravastatin is a very difficult, complex task.

Задача даного винаходу полягає в створенні нового мікробіологічного способу отримання правастатину з б5 Компактину в промисловому масштабі, яким можна було б отримувати правастатин в більш сприятливих умовах, ніж в способах, що раніше використовувалися. Під час нашої дослідницької роботи передусім ми намагалися знайти штам мікроорганізмів з ферментом гідроксилазою, який може бути адаптований для мікробіологічної трансформації компактину в правастатин з високою концентрацією.The task of this invention is to create a new microbiological method of obtaining pravastatin from b5 Compactin on an industrial scale, by which it would be possible to obtain pravastatin under more favorable conditions than in the methods previously used. During our research work, we primarily tried to find a strain of microorganisms with a hydroxylase enzyme that could be adapted for the microbiological transformation of compactin into high-concentration pravastatin.

Даний винахід відноситься до мікробіологічного способу отримання сполуки формули (І) 9 марост туяThis invention relates to the microbiological method of obtaining the compound of formula (I) 9 of thuja marost

І: о) енAnd: o) en

А, : () еко г їн но ї зв і з з субстратної сполуки формули (ІЇ) «ОН кос й но 9) т н ав вс ст А СН с де К означає іон лужного металу або амонію, г) що включає етапи (а) культивування штаму ниткоподібного вигляду грибків Могіегеа тасиіада, здатного 6 р -гідроксилювати сполуку формули (Ії) на поживному середовищі, що містить засвоювані джерела вуглецю і азоту і мінеральні солі, (Б) введення субстрату, що підлягає трансформації, в розвинену культуру МогіегеїІа тасціайа, (с) ферментації субстрату до завершення біоконверсії, (4) відділення сполуки формули (І) від і. культурального бульйону і (е) ізоляції сполуки формули (1). ФА, : () ecological connection with the substrate compound of the formula (II) "OH kos y no 9) tnav vst А СН s where K means the ion of an alkali metal or ammonium, d) which includes stages ( a) cultivation of a strain of filamentous fungi Mogiegea tassiada capable of 6 p -hydroxylation of the compound of formula (II) on a nutrient medium containing assimilable sources of carbon and nitrogen and mineral salts, (B) introduction of a substrate to be transformed into a developed culture of Mogiegea tassiada , (c) fermentation of the substrate until the completion of bioconversion, (4) separation of the compound of formula (I) from i. culture broth and (e) isolation of the compound of formula (1). F

Даний винахід також відноситься до біологічно чистої культури штаму МогііегеМНйа тасціайа п. зр. Е-97, депонованого в Національній колекції сільськогосподарських і промислових мікроорганізмів, Будапешт, вThe present invention also relates to a biologically pure culture of the strain MogiiegeMNya tasciaia p. zr. E-97, deposited in the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, c

Угорщина, під реєстраційним номером МСАЇМ(Р) 001266 і біологічно чистій культурі його мутанта штаму «95Hungary, under registration number MSAYIM(R) 001266 and biologically pure culture of its mutant strain "95

Могііегейа птасціайа оп. вр. Е-97/15/13, депонованого в Національній колекції сільськогосподарських і промислових мікроорганізмів, Будапешт, Угорщина, під реєстраційним номером МСАЇІМ(Р)Е 001267. -Mogiiegeia ptasciaia op. vr. E-97/15/13, deposited in the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary, under the registration number MSAYIM(R)E 001267. -

На Фіг. показані фізичні характеристики МогііегеМа тасціайа п. зр. Е-97.In Fig. the physical characteristics of MogiiegeMa tasciaia p. zr. are shown. E-97.

У ході здійснення нашої програми скринінгу, що охоплює близько 5500 прокаріотичних і еукаріотичних клітин, були вибрані 23 мікроорганізми, здатні гідроксилювати компактньі у відгук на його вплив. Серед цих « штамів ниткоподібний плісневий грибок виявився більш відповідним для вироблення правастатину завдяки його підвищеній стійкості до компактину в порівнянні зі штамами, відомими з опублікованих патентів. Згідно з в с таксономічними дослідженнями, цей штам виявився новим представником виду, що відноситься до роду з» МогііегеМПа (Могііегейа тасціайа п. зр.). Із вибраних грибків новий штам ізолювали, з одного боку, шляхом мутаційно-селекційних методик, а з іншого боку - шляхом індукування ферменту гідроксилази цього штаму, єдиного, який здатен гідроксилювати компактиновий субстрат у правастатин з більш високою концентрацією, ніж 49 описано досі. Як мутагенні агенти використовували фізичні і хімічні мутагени (УФ-опромінення,In the course of our screening program, covering about 5500 prokaryotic and eukaryotic cells, 23 microorganisms were selected that are capable of hydroxylating compaction in response to its influence. Among these strains, the filamentous mold fungus appeared to be more suitable for the production of pravastatin due to its increased resistance to compactin compared to strains known from published patents. According to taxonomic studies, this strain turned out to be a new representative of a species belonging to the genus MogiiegeMPa (Mogiiegeia tasciaia p. zr.). From the selected fungi, a new strain was isolated, on the one hand, by mutational selection methods, and on the other hand, by inducing the hydroxylase enzyme of this strain, the only one capable of hydroxylating the compactin substrate into pravastatin at a higher concentration than 49 described so far. Physical and chemical mutagens were used as mutagenic agents (UV irradiation,

Ше метилметансульфонат, М-метил-М'-нітро-М-нітрозогуанідин). Після мутагенної обробки, для отримання галоїднихShe methyl methanesulfonate, M-methyl-M'-nitro-M-nitrosoguanidine). After mutagenic treatment, to obtain haloides

Ге) клітин, суспензію спор нанесли на агарові пластини, які містять беномил, потім для індукування ферменту гідроксилази розвинені колонії інокулювали на 1ООмкг/мл - агарові пластини, які містять шк 8-дез(2-метилбутирил)-компактин або компактин. За допомогою цих методик з нового штаму отрималиGe) cells, the spore suspension was applied to agar plates containing benomyl, then to induce the enzyme hydroxylase, the developed colonies were inoculated at 100 μg/ml - agar plates containing shk 8-des(2-methylbutyryl)-compactin or compactin. With the help of these techniques, a new strain was obtained

Ге) 20 мутантний штам, здатний перетворювати компактин в правастатин в значно більш високій мірі, ніж батьківський штам. с» У ході оптимізуючих дослідів ми визначили склад найбільш відповідного інокуляту і найбільш відповідного біоконверсійного середовища для гідроксилювання компактину, а також оптимальний спосіб повторного введення компактину з високою концентрацією.Ge) 20 mutant strain capable of converting compactin into pravastatin to a much higher extent than the parental strain. c" In the course of optimization experiments, we determined the composition of the most suitable inoculum and the most suitable bioconversion medium for hydroxylation of compactin, as well as the optimal way to re-introduce compactin with a high concentration.

Таким чином, даний винахід заснований на визнанні того, що штами, позначені Е-97 і Е-97/15/13 (ФІ ізольованого плісневого грибка МогііегеПа тасціада, депоновані під реєстраційними номерами МСАЇІМ(Р)Е 001266 ії МСАІМ(Р)Е 001267, відповідно, в Національній колекції сільськогосподарських і промислових мікроорганізмів о (Відділення мікробіології і біотехнології, університет рослинництва і харчової промисловості, Будапешт), в певних умовах ферментації здатні виготовляти правастатин у великому об'ємі, в той час як небажані споріднені бо сполуки, такі як кислотні форми б с -гідрокси-компактину, 2, -гідрокси-компактин, 8-дез(2-метилбутирил)-компактин, Зо ,5р -дигідрокси-5,6-дигідро-ізокомпактин, Зо р -гідрокси-компактин і гідроксильовані похідні в положеннях 2 і З 2-метилбутирильних бічних ланцюгів компактину виробляються в ході біоконверсії лише в малих або незначних кількостях. Таким чином, ці штами найбільш придатні для виробництва правастатину в промисловому масштабі. бо Враховуючи, що економічне виробництво активного інгредієнта в промисловому масштабі є функцією концентрації компактинового субстрату, важливо мати штам, який здатний витримувати високі концентрації компактину і правастатину. Отже, інша важлива частина винаходу - визнання того, що гідроксилююча здатність ізоляту вихідного грибка може бути поліпшена шляхом використання методик мутації-селекції і ферментативної індукції, а крім того, що шляхом розробки відповідного способу введення субстрату гідроксилювання великих кількостей компактину в правастатин може здійснюватися у вигляді однієї операції. У результаті новий мутантний штам, позначений як Могіегейа тасціайа п. зр. Е-97/15/13 виявився найбільш придатним для виробництва правастатину.Thus, the present invention is based on the recognition that the strains designated E-97 and E-97/15/13 (FI of the isolated mold fungus Mogiigepa tastiada, deposited under registration numbers MSAIIM(R)E 001266 and MSAIIM(R)E 001267 , respectively, in the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (Department of Microbiology and Biotechnology, University of Plantation and Food Industry, Budapest), under certain fermentation conditions are able to produce large amounts of pravastatin, while undesirable related compounds such as acid forms of b c -hydroxy-compactin, 2, -hydroxy-compactin, 8-des(2-methylbutyryl)-compactin, Zo,5p -dihydroxy-5,6-dihydro-isocompactin, Zo p -hydroxy-compactin and hydroxylated derivatives in positions 2 and 3 of the 2-methylbutyryl side chains of compactin are produced during bioconversion in only small or insignificant amounts. Thus, these strains are most suitable for the production of pravastatin on an industrial scale. Because considering that eco nomic production of the active ingredient on an industrial scale is a function of the concentration of the compactin substrate, it is important to have a strain that can withstand high concentrations of compactin and pravastatin. Therefore, another important part of the invention is the recognition that the hydroxylating ability of the isolate of the original fungus can be improved by using methods of mutation-selection and enzymatic induction, and in addition, that by developing a suitable method of introducing the substrate, the hydroxylation of large amounts of compactin into pravastatin can be carried out in the form one operation. As a result, a new mutant strain, designated as Mogiegeia tasciaia p. zr. E-97/15/13 turned out to be the most suitable for the production of pravastatin.

Таксономічні особливості ізольованого нового виду грибків в порівнянні з найбільш важливими 70 діагностичними властивостями відомих видів МогііегеїЇа зрезіез приведені нижче.The taxonomic features of the isolated new species of fungi in comparison with the most important 70 diagnostic properties of the known species of the genus Mogiiegia are given below.

Таксономічний опис штаму голотипу МогііегеММа тасціайа пом. зрес. Е-97Taxonomic description of the strain of the holotype MohiiegeMMa tasciaia pom. coll. E-97

На середовищі крохмаль-казеїн-солодового екстракту-агару добре розвивається повітряний міцелій (більше 10мкм товстого покривного шару згори субстратного міцелію). Спочатку він має вигляд щільно витканої білої гіфової сітки, в якій пізніше з'являються рідкі жовтуваті спорулюючі плями діаметром в декілька міліметрів /5 (нова назва "тасціайв8" означає "плямистий"). Це жовтувате фарбування може іноді займати більш обширні безперервні поверхні повітряної сітки. Субстратний міцелій на Цапек кров'яної-Цапек тирозин крохмаль-казеїн-солодовий екстракт- і т.д. агаровому середовищі буває в основному безбарвний або злегка жовтуватого кольору. Колір сітки субстратного міцелію на дріжджевому екстракт-глюкоза-пептоновому середовищі злегка червонуватий. Вироблення здібних до дифузії і розчинення пігментів на вищеперелічених середовищах відсутнє, лише зрідка на цих середовищах з'являється незначне жовтувате фарбування. Колонії штаму Е-97, внаслідок вироблення ними летючих масел і подібно багатьом іншим видам Могіегеїйа (за винятком деяких з вигляду Ізабеїпа), можуть видавати дуже характерний сильний запах.Aerial mycelium develops well on the medium of starch-casein-malt extract-agar (more than 10 μm thick covering layer from above the substrate mycelium). At first, it has the appearance of a densely woven white hyphal net, in which liquid yellowish sporulating spots with a diameter of several millimeters /5 appear later (the new name "tastiaiv8" means "spotted"). This yellowish staining may sometimes occupy more extensive, continuous surfaces of the air mesh. Substrate mycelium on Tzapek blood-Tzapek tyrosine starch-casein-malt extract-etc. agar medium is mostly colorless or slightly yellowish. The color of the network of the substrate mycelium on the yeast extract-glucose-peptone medium is slightly reddish. There is no production of pigments capable of diffusion and dissolution on the above media, only occasionally a slight yellowish staining appears on these media. Colonies of strain E-97, due to their production of volatile oils and like many other species of Mogiegeiia (with the exception of some of the Izabeipa species), can emit a very characteristic strong odor.

Локально на повітряних гіфах (але менше на субстратних) у великих кількостях на самих різних відстанях один від одного часто розвиваються спорангіофори, позначені на Фіг. позиціями 1-7. Вони не розгалужені, а в сч ов основному прямі або зігнуті. їх довжина в основному становить 60-80мкм. Початковою точкою в переважній більшості випадків є більш або менш коротка, але сильно роздута гіфова ділянка повітряної сітки, від якої (8) вони відділені стінкою. Самі спорангіофори також можуть бути роздутими (іноді сильно), як показано в позиції б, але в напрямку спорангію вони поступово звужуються, від 5,0-9,0 до 1,0-2,0мкм. Важливою таксономічною ознакою є те, що під спорангіями вони ніколи не розширюються (див. поз.8). с зо Спорангії мають сферичну форму; в деяких випадках це можуть бути злегка сплюснуті сфери. їх діаметр складає близько 6,0-17,0мкм, що відносно мало в порівнянні з розмірами спорангіїв інших видів Могііегеї Іа. Ме)Locally on aerial hyphae (but less so on substrate hyphae), sporangiophores marked in Fig. often develop in large quantities at very different distances from each other. positions 1-7. They are not branched, but mostly straight or bent. their length is mainly 60-80 µm. The starting point in the vast majority of cases is a more or less short, but highly inflated hyphal section of the air net, from which (8) they are separated by a wall. The sporangiophores themselves may also be inflated (sometimes greatly so), as shown in position b, but they gradually taper towards the sporangium, from 5.0-9.0 to 1.0-2.0 µm. An important taxonomic feature is that they never expand under the sporangia (see item 8). c z z Sporangia have a spherical shape; in some cases these may be slightly flattened spheres. their diameter is about 6.0-17.0 µm, which is relatively small compared to the size of the sporangia of other species of Mohiiegei Ia. Me)

Спорангії можуть містити багато спор, але існують також і спорангії, які несуть тільки одну спору. Спори 9 «г циліндричні або рідше овальні. їх розмір 3,0-5,0х 1,5-2,0мкм. Всередині окремих спор можуть бути присутніми одна або дві маленькі темні сферичні масляні краплі 10. Завдяки дуже легкому руйнуванню стінки спорангію, у і.Sporangia can contain many spores, but there are also sporangia that bear only one spore. Spores of 9 g are cylindrical or rarely oval. their size is 3.0-5.0 x 1.5-2.0 μm. One or two small dark spherical oil droplets may be present inside individual spores 10. Due to the very easy destruction of the sporangium wall, in i.

Зз5 Вологих умовах спори будуть швидко розсіюватися. Після руйнування спорангію біля кінця спорангіофорів іноді ї- можна спостерігати тонкий вилоподібний "хомутик" і дуже коротку рудиментарну (і нетипову) колумелу. Геми 15-28, сферичні або циліндричні, можуть з'являтися в більшості різних діагностичних середовищ. їх розмір звичайно становить 10-25мкм. У ланцюгах культур сферичних гем 13 можуть зустрічатися клітини, які почкуються, впроваджені геми 15-23, гіфові асоціації за рахунок рідкого спірального розростання однієї гіфи « навколо іншої 11, анастомоз-подібні структури і гігантські клітини і т.д. У повітряному міцелії також можна шщ с побачити великі (50-250пм в діаметрі) дуже щільні гіфові сітки 14, але без зигот, що можна виявити. й Культури штаму Е-97 здатні відновлювати нітрат в нітрити, не гідролізують крохмаль, ескулин, аргінін або «» желатин, але гідролізують полісорбати Тмееп, і не розщеплюють парафінові вуглеводні. Культури штаму Е-97 мають активність уреази, показують хороше зростання при рН між 7,0 і 9,0 і витримують максимум 290 Масі.35 In humid conditions, spores will quickly disperse. After the destruction of the sporangium near the end of the sporangiophores, sometimes a thin fork-shaped "clamp" and a very short rudimentary (and atypical) columella can be observed. Hemes 15-28, spherical or cylindrical, can appear in most different diagnostic environments. their size is usually 10-25 μm. In the chains of cultures of spherical hemes 13, budding cells, embedded hemes 15-23, hyphal associations due to the liquid spiral growth of one hypha around another 11, anastomose-like structures and giant cells, etc. can be found. In the aerial mycelium, you can also see large (50-250 pm in diameter) very dense hyphal nets 14, but no detectable zygotes. and E-97 strain cultures are able to reduce nitrate to nitrites, do not hydrolyze starch, esculin, arginine or "" gelatin, but hydrolyze Tmeep polysorbates, and do not split paraffinic hydrocarbons. Cultures of strain E-97 have urease activity, show good growth at pH between 7.0 and 9.0, and withstand a maximum of 290 Mass.

Ефект ксантину, гіпоксантину, лецитину, тирозину і аденіну негативний. Сильне виділення кислоти культурами -і було виявлене при впливі глюкози, фруктози, гліцерину і галактози, але дуже слабке виділення або його відсутність при впливі ксилози, арабінози, рафінози, сорбіту, інозиту, інуліну і т.д. Слабке зростання о виявляється на піруваті й ацетаті, а відсутність зростання може бути виявлена з бензоатом, саліцилатом, ї» цитратом, лактатом, сукцинатом, тартратом і малонатом. Хороше зростання спостерігається з глюкозою і фруктозою як єдинми джерелами вуглецю в середовищі. Тести використання з ксилозою, арабінозою, рамнозою, о сахарозою, рафінозою, манітом і інозитом виявилися негативними. Культури не розщеплюють целюлозу. се» Систематизація: Штам Е-97 належить до сімейства Могіегейасеае і є типовим членом роду Могіегеїа: спорангії звичайно містять багато спор, колумела надзвичайно знижена, геми присутні часто, появи зигот не виявлено, і колонії видають дуже характерний сильний запах. Всередині роду Могіегейа штам Е-97 є типовим представником "Зесійоп АПІріпа". Він характеризується дуже короткими нерозгалуженими спорангіофорами (з максимальною довжиною до 200мкм) і найдрібнішими спорангіями (7успа, Н. Опа бЗіертапп, К, Мисогаіез. Еіпе іФ) Везспгеірипоу айег Сайипдеп па Агіеп аіезег Ріїгоагирре. 0О-3301 Іепге, Меп. Моп .). Статег. 1969). Серед ко членів Зесійоп АІріпа штам У-97 показує найбільшу схожість із видами М. (НахіегіThe effect of xanthine, hypoxanthine, lecithin, tyrosine and adenine is negative. A strong release of acid by cultures was detected under the influence of glucose, fructose, glycerol and galactose, but a very weak release or its absence under the influence of xylose, arabinose, raffinose, sorbitol, inositol, inulin, etc. Weak growth is seen with pyruvate and acetate, and no growth can be seen with benzoate, salicylate, citrate, lactate, succinate, tartrate, and malonate. Good growth is observed with glucose and fructose as the only sources of carbon in the medium. Tests for use with xylose, arabinose, rhamnose, sucrose, raffinose, mannitol and inositol were negative. Cultures do not break down cellulose. se» Systematization: Strain E-97 belongs to the family Mogiegeiaceae and is a typical member of the genus Mogiegeia: the sporangia usually contain many spores, the columella is extremely reduced, the hemes are often present, no zygotes appear, and the colonies emit a very characteristic strong odor. Within the genus Mogiegeia, strain E-97 is a typical representative of "Zesiope APIripa". It is characterized by very short unbranched sporangiophores (with a maximum length of up to 200 μm) and the smallest sporangia (7uspa, N. Opa bZiertapp, K, Mysogaiez. Eipe iF) Vesspgeiripou ayeg Sayipdep pa Agiep aiezeg Riigoagirre. 0O-3301 Iepge, Map. Mop.). Stateg. 1969). Among the members of Zesiop AIripa strain U-97 shows the greatest similarity with the species of M. (Nakhiegi

Віцпіпуо 1936 апа М. Кеїпзрога Оіхоп-Зіемжагй 1932. Однак дані в Табл. ясно показують відмінності в бо діагностичних властивостях штаму Е-97 і цих двох видів. Відповідно, ми представляємо тут в якості нового штаму штам під назвою МогіегеПйа тасціайга пом. зрес. Е-97. властивостей бо Могіегенйа Кеїіпзрога Могпіегенйа штам Е-97 Мопіегеїа ТнахіегіWitspipuo 1936 apa M. Keipzrog Oihop-Ziemzhagy 1932. However, the data in Table. clearly show the differences in the diagnostic properties of strain E-97 and these two species. Accordingly, we present here as a new strain the strain named MogiegePya tasciaiga pom. coll. E-97. properties of Mogiegenya Keiipzroga Mogiegenya strain E-97 Mopiegeia Tnahiegi

Місце зародження Звичайне, однак гіфи ширше Збоку від (роздутих або нормальних) Збоку від роздутих відділених сегментів спорангіофорів нормальних, збоку від розширених повітряних гіф або невідокремлені ділянки повітряних гіф або невідокремлені роздутих гіф. субстратних гіф. сегменти субстратних гіф.Germination site Normal, but hyphae wider Lateral to (inflated or normal) Lateral to inflated separated segments of sporangiophores normal, lateral to expanded aerial hyphae or unseparated areas of aerial hyphae or unseparated areas of inflated hyphae. substrate hyphae. segments of substrate hyphae.

Форма і розмір Поступово зменшуються догори від В основному прямі або зігнуті, Довжина близько 60-90 мкм. Ширина біля спорангіофорів 1Омкм до Змкм. Довжина близько |нерозгалужені. Ширина поступово початкової точки близько 5-7мкм, біля 200Омкм. зменшується до вершини від 5-Умкм до вершини зменшується до 1,5-2мМкм. 1,5-2,5мкм. Довжина близько 60-8Омкм. Безпосередньо під спорангіємShape and size Gradually decrease upwards from Mostly straight or bent, Length about 60-90 microns. The width near the sporangiophores is 1µm to Zµm. Length about |unbranched. The width of the starting point is about 5-7 μm, about 200 μm. decreases to the top from 5 µm to the top decreases to 1.5-2 µm. 1.5-2.5 microns. The length is about 60-8 Ohm. Directly under the sporangium

Біля вершини ніколи не розширюються. розширюється.They never expand near the top. expands

Форма і розмір Безбарвні, діаметр 25мкм. В основному сферичні (діам. 6-17мкм), Сферичні (діам. 12-2О0мкм). Містять спорангіїв рідше злегка сплюснуті. Звичайно містять багато спор, але на певному середовищі 70 багато спор, зрідка одну спору. існують також спорангії, які несуть лише одну спору.Shape and size Colorless, diameter 25 μm. Mostly spherical (diam. 6-17μm), Spherical (diam. 12-2O0μm). Containing sporangia are less often slightly flattened. Usually contain many spores, but on a certain medium 70 many spores, occasionally one spore. there are also sporangia that bear only one spore.

Стінка (мембрана) Мембрана, що розсіюється. Після Що руйнується. Залишається вилоподібний Що руйнується, залишається найдрібніший спорангіїв руйнування залишається хомутик. заломлений назад хомутик. хомутоподібна структура.Wall (membrane) Scattering membrane. After What is destroyed. Remains fork-shaped What is destroyed, remains the smallest sporangia of destruction remains a clamp. the clamp is bent back. collar-like structure.

Форма і розмір Мають приблизну форму бруньки. Циліндричні. Довжина (3-5мкм) вдвічі Еліпсоїдні скловидні спори розмірами спор Скловидна структура, розміри 2х перевищує ширину (1,5-2мкм). 3,5-4х 1,5-2мкм.Shape and size They have the approximate shape of a bud. Cylindrical. Length (3-5 µm) twice Ellipsoid vitreous spores spore size Vitreous structure, dimensions 2x larger than width (1.5-2 µm). 3.5-4x 1.5-2 microns.

А4мкм.A4μm.

Гемма Зустрічаються на більшості Часто зустрічаються на самих різних Украплені овальні геми (10-14мкм) в різних середовищ. середовищах, в основному в повітряному субстратному міцелії. міцелії. Сферичні або подовжені (10-25мМкм).Gemma Found in most Often found in a variety of scattered oval gems (10-14μm) in various environments. environments, mainly in aerial substrate mycelium. mycelium Spherical or elongated (10-25 mm).

Зігоги Часто зустрічаються у всіх Не виявлені. Не спостерігаються. діагностичних середовищах.Zygoes Often found in everyone Not detected. Not observed. diagnostic environments.

Діаметр разом з покриваючими гірами близько 50Омкм, без них - близько ЗОмкм.The diameter together with the covering mountains is about 50μm, without them - about ZOμm.

Фокуси щільності Великі щільно виткані гіфові фокуси У старих культурах великі (діам. с гіфової сітки. (50-25Омкм), часті але без зигот. 100-125мкм) жовтувато-сірі щільні гіфові сітки, без зигот. Ге)Dense foci Large densely woven hyphal foci In old cultures, large (diam. of hyphal net. (50-25µm), frequent but without zygotes. 100-125µm) yellowish-gray dense hyphal nets, without zygotes. Gee)

Колір і характер Нещільна, завжди біла гіфова Білий з жовтуватими плямами. Спочатку павутиноподібний, пізніше - повітряного міцелію сітка. більш щільний.Color and character Loose, always white hypha White with yellowish spots. At first it is web-like, later - an aerial mycelium network. denser

У процесі отримання правастатину по даному винаходу переважно використовують культуру грибкового со штаму, позначеного МогііегеМйа тасціага п. зр. Е-97 або його мутанта, позначеного Е-97/15/13. Вибраний штам володіє великими перевагами завдяки його швидкому зростанню. Як джерело вуглецю він легко використовує о глюкозу, гліцерин, фруктозу або галактозу. Як джерело азоту може бути використаний дріжджовий екстракт, «ф пептон, казеїн, м'ясний екстракт, соєва мука, рідкий кукурудзяний екстракт, нітрат натрію або сульфат амонію.In the process of obtaining pravastatin according to this invention, the culture of the fungal strain designated MogiiegeMya tasciaga p. zr. is preferably used. E-97 or its mutant, designated E-97/15/13. The selected strain has great advantages due to its rapid growth. It easily uses glucose, glycerol, fructose or galactose as a carbon source. Yeast extract, peptone, casein, meat extract, soybean meal, liquid corn extract, sodium nitrate or ammonium sulfate can be used as a source of nitrogen.

У середовищі культури, що використовується для виробництва правастатину, крім вищезазначених джерел оIn the culture medium used for the production of pravastatin, in addition to the above-mentioned sources,

Зз5 Вуглецю і азоту можуть бути присутні мінеральні солі, наприклад, дигідрофосфат калію, хлорид магнію, сульфат магнію, мікроелементи (солі заліза, марганцю), амінокислоти і антиспінюючі агенти.35 Carbon and nitrogen may contain mineral salts, for example, potassium dihydrogen phosphate, magnesium chloride, magnesium sulfate, trace elements (iron, manganese salts), amino acids, and antifoaming agents.

Відповідно до переважного варіанту здійснення даного винаходу, суспензію спор, приготовану з культури на косячку агару штаму Могііегейа тасціайа п. зр., позначеного Е-97, або його мутанта |ІМСАЕМ(Р)Е 0012671, « позначеного Е-97/15/13, висівають в середовище інокуляту; потім 1095 середовища інокуляту, культивованого З доби при «25-302С, переважно при -24-282С, найбільш переважно при «282С, переносять в біоконверсійне /-- с середовище. Потім її інкубують 4 доби при «25-282С, переважно при «282С, і після цього вводять в культуру "з глюкози або натрієву сіль компактинової кислоти. У залежності від концентрації компактинового субстрату, що и вводиться, культивування продовжують ще 2-12 діб в аеробних умовах, при цьому рН підтримують від 5,5 до 7,5, переважно при 7,0. Біоконверсію проводять при перемішуванні і аерації, при цьому швидкість повітряного потоку становить 0,2 ммт(?), швидкість обертання мішалки 4ООоб/хв. -і У ході ферментації після біоконверсії компактинового субстрату проводили рідинну хроматографію високого сю дозволу (НРІ С). Відповідно до цієї методики зразок бульйону вдвічі розбавляють метанолом і центрифугують, і надосадову рідину використовують для аналізу НРІС при наступних параметрах: аналітичне обладнання ї УУаїегг; колонка Мисіеозвії С18 10мкм; довжина хвилі виявлення 238нм; об'єм вприскування 2Омкл, швидкість течії с 50 Ммл/хв.; використовують градієнтне елюювання з наступними елюентами: А-0,0595 водний розчин фосфорної кислоти, В-ацетонітрил. (45) Градієнт елюювання:According to the preferred embodiment of the present invention, a spore suspension prepared from a culture on an agar stick of the strain Mohiiegeya tasciaia p. zr., designated E-97, or its mutant |IMSAEM(P)E 0012671, "designated E-97/15/13 , are sown in the medium of the inoculum; then 1095 medium of the inoculum cultured for 3 days at 25-302C, preferably at -24-282C, most preferably at 282C, is transferred to the bioconversion medium. Then it is incubated for 4 days at 25-282С, preferably at 282С, and after that, glucose or the sodium salt of compactin acid is introduced into the culture. Depending on the concentration of the compactin substrate that is introduced, cultivation is continued for another 2-12 days in aerobic conditions, while the pH is maintained from 5.5 to 7.5, preferably at 7.0. Bioconversion is carried out with stirring and aeration, while the air flow rate is 0.2 mmt(?), the speed of rotation of the stirrer is 400 rpm. -i In the course of fermentation, after the bioconversion of the compactin substrate, high-performance liquid chromatography (HPLC) was performed. According to this technique, the broth sample is diluted twice with methanol and centrifuged, and the supernatant liquid is used for NRIS analysis with the following parameters: analytical equipment and UUaiegg; Mysieozvii column С18 10μm, detection wavelength 238nm, injection volume 2Oml, flow rate s 50 Mml/min, using gradient elution with the following eluents: A-0.0595 aqueous solution of phosphoric acid, B-acetonitrile. (45) Elution gradient:

Елюент А (95) Елюент В (95) з 01 юю о 51796 517961 ю боEluent A (95) Eluent B (95) from 01 juyu o 51796 517961 ju bo

Приблизні часи утримання: правастатин 8,6-9,О0хв.; компактинова кислота 11,6-12,Охв.; лактон правастатину 15,0-15,5хв.; компактин 16,5-17,ОхХв.Approximate retention times: pravastatin 8.6-9.00 min.; compactic acid 11.6-12,Ochv.; pravastatin lactone 15.0-15.5 min.; compactin 16.5-17, Ххв.

Для отримання правастатину на 96б-у годину культивування додають водний розчин натрієвої солі компактинової кислоти. Для цієї операції готують субстрат у твердій формі таким чином. Лактон компактину 65 Гідролизують у 0,2М розчині гідроксиду натрію протягом 2 годин при 402С, потім рН реакційної суміші доводять до 7,5 соляною кислотою і нейтралізований розчин вміщують в адсорбентну колонку Оіаіоп НР-20; хлорид натрію, що утворився під час нейтралізації, видаляють шляхом промивання колонки водою, і потім натрієву сіль компактинової кислоти елююють із колонки 50956-ним водним розчином ацетону. Після цього елюат дистилюють під вакуумом і водний залишок ліофілізують. Після нейтралізації водний розчин лужного гідролізату компактину також може бути безпосередньо використаний як субстрат. У цьому випадку вміст в гідролізаті натрієвій солі компактинової кислоти вимірюють при допомозі НРІ С, і розчин витримують при 202С до моменту використання.To obtain pravastatin, an aqueous solution of the sodium salt of compactic acid is added to the 96th hour of cultivation. For this operation, prepare the substrate in solid form as follows. The lactone of compactin 65 is hydrolyzed in a 0.2M solution of sodium hydroxide for 2 hours at 402С, then the pH of the reaction mixture is adjusted to 7.5 with hydrochloric acid and the neutralized solution is placed in an adsorbent column Oiaiop HP-20; the sodium chloride formed during the neutralization is removed by washing the column with water, and then the sodium salt of compactic acid is eluted from the column with a 50956 aqueous solution of acetone. After that, the eluate is distilled under vacuum and the aqueous residue is lyophilized. After neutralization, the aqueous solution of alkaline compactin hydrolyzate can also be directly used as a substrate. In this case, the content of the sodium salt of compactic acid in the hydrolyzate is measured with the help of NRI C, and the solution is kept at 202C until the moment of use.

Чим вище величина рН бульйону, що досягається на четвертий день ферментації, тим вона сприятливіше для гідроксилювання компактинового субстрату. Введення компактинового субстрату дозволяється при перевищенні рН бульйону величини 6,3. На четвертий день ферментації додають стільки стерильного 7/0 профільтрованого водного розчину натрієвої солі компактинової кислоти, скільки треба для досягнення концентрації 50Омкг/мл. Глюкозу також вводять в культуру з її 5095 розчину, стерилізованого при 12123 протягом 25 хвилин, таким чином: якщо рН бульйону вище за величину 6,7, додають 195 глюкози від об'єму бульйону, а якщо рН знаходиться в діапазоні 6,3-6,7, кількість глюкози, що вводиться, становить 0,595. Натрієва сіль компактинової кислоти витрачається з бульйону через 24 години; її трансформацію аналізують шляхом 75 Вимірювання при допомозі НРІ С. У цьому випадку на кожний мл бульйону додають ще 500Омкг компактину. Крім компактинового субстрату також вводять глюкозу, як описано вище. Морфологія 120-годинної культури відрізняється зростанням маленьких кульок (діаметр кульки 0,5-Змм). Через 24 години друга доза субстрату також витрачається з бульйону, таким чином, наступну порцію натрієвої солі компактинової кислоти, створюючу концентрацію 50Омкг/мл у всьому об'ємі бульйону, вводять паралельно з глюкозою в залежності від величини рн бульйону. З 4-го дня ферментації введення субстрату і глюкози повторюють щодня, як описано вище, до 17-18-го дня ферментації.The higher the pH value of the broth, which is reached on the fourth day of fermentation, the more favorable it is for the hydroxylation of the compactin substrate. The introduction of the compactin substrate is allowed when the pH of the broth exceeds 6.3. On the fourth day of fermentation, add as much sterile 7/0 filtered aqueous solution of the sodium salt of compactic acid as is necessary to achieve a concentration of 50 Ωkg/ml. Glucose is also introduced into the culture from its 5095 solution, sterilized at 12123 for 25 minutes, as follows: if the pH of the broth is higher than 6.7, add 195 glucose per volume of the broth, and if the pH is in the range of 6.3-6 .7, the amount of glucose administered is 0.595. The sodium salt of compactic acid is consumed from the broth after 24 hours; its transformation is analyzed by 75 Measurements with the help of NRI S. In this case, 500 Ωkg of compactin is added to each ml of broth. In addition to the compactin substrate, glucose is also administered as described above. The morphology of the 120-hour culture is characterized by the growth of small balls (ball diameter 0.5 mm). After 24 hours, the second dose of the substrate is also consumed from the broth, thus, the next portion of the sodium salt of compactic acid, creating a concentration of 50 Ωkg/ml in the entire volume of the broth, is introduced in parallel with glucose depending on the pH value of the broth. From the 4th day of fermentation, the introduction of substrate and glucose is repeated daily, as described above, until the 17th-18th day of fermentation.

Для виділення продукту з бульйону доцільно використовувати той факт, що від час біоконверсії правастатин утворюється в кислотній формі, тому він може бути ізольований із фільтрату бульйону шляхом його адсорбції в колонці з аніонообмінною смолою. Для ізоляції продукту доцільно використовувати сильноосновну аніонообмінну су смолу, яка являє собою полістирол-дивінілбензольний полімер, який несе активні групи четвертинного амонію.To isolate the product from the broth, it is advisable to use the fact that during bioconversion, pravastatin is formed in an acidic form, so it can be isolated from the broth filtrate by its adsorption in a column with an anion exchange resin. To isolate the product, it is advisable to use a strongly basic anion-exchange resin, which is a polystyrene-divinylbenzene polymer that carries active quaternary ammonium groups.

Продукт може адсорбуватися безпосередньо з фільтрату бульйону шляхом домішування до нього о аніонообмінної смоли в гідроксильній формі. Продукт, що адсорбується на іонообмінній смолі, може бути елюйований із колонки оцтовою кислотою або ацетоно-водною сумішшю, що містить хлорид натрію, переважно ацетоно-водною сумішшю (1:1), яка містить 1906 хлориду натрію. Фракції, які містять правастатин, об'єднують, а со зо ацетон, що міститься в елюаті, переганяють під вакуумом. рН концентрату регулюють 1590о-ною сірчаною кислотою в діапазоні 3,5-4,0 і водний розчин екстрагують етилацетатом. Етилацетатний екстракт промивають о водою і висушують безводним сульфатом натрію. Потім з правастатину отримують лактонову похідну. Закриття «І лактонового кільця здійснюють у висушеному розчині етилацетату при кімнатній температурі при безперервному перемішуванні шляхом індукування створення актону трифтороцтовою кислотою, присутньою в каталітичній оThe product can be adsorbed directly from the broth filtrate by mixing it with an anion exchange resin in the hydroxyl form. The product adsorbed on the ion exchange resin can be eluted from the column with acetic acid or an acetone-water mixture containing sodium chloride, preferably an acetone-water mixture (1:1) containing 1906 sodium chloride. The fractions containing pravastatin are combined, and the acetone contained in the eluate is distilled off under vacuum. The pH of the concentrate is adjusted with 1590% sulfuric acid in the range of 3.5-4.0 and the aqueous solution is extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate extract is washed with water and dried with anhydrous sodium sulfate. Then a lactone derivative is obtained from pravastatin. The closure of the "I" lactone ring is carried out in a dried ethyl acetate solution at room temperature with continuous stirring by inducing the formation of an actone with trifluoroacetic acid present in the catalytic

Кількості. Операцію трансформації контролюють шляхом тонкошарової хроматографії (ТІ С). По закінченні ч- створення лактону етилацетатний розчин промивають спочатку 595-ним водним розчином гідрокарбонату натрію, а потім водою, після чого висушують безводним сульфатом натрію і випаровують під вакуумом. Залишок випаровування обробляють в ацетоновому розчині деревним вугіллям, потім знов випаровують і « перекристалізують із аліфатичного спирту, що містить 1-4 атома вуглецю, переважно з етанолу. Залишок випаровування перекристалізаційного маточного розчину очищують шляхом колоночної хроматографії на - с силікагелі із застосуванням суміші етилацетату-п-гексану з вмістом етилацетату, що поступово збільшується, в ц якості елюенту. "» З лактону правастатину, отриманого після перекристалізації і хроматографічного очищення, правастатин отримують шляхом гідролізу при кімнатній температурі в ацетоні з еквівалентною кількістю гідроксиду натрію.Quantities The transformation operation is monitored by thin-layer chromatography (TLC). At the end of the formation of the lactone, the ethyl acetate solution is washed first with a 595% aqueous solution of sodium bicarbonate, and then with water, after which it is dried with anhydrous sodium sulfate and evaporated under vacuum. The evaporation residue is treated with charcoal in an acetone solution, then evaporated again and recrystallized from an aliphatic alcohol containing 1-4 carbon atoms, preferably from ethanol. The residue of the evaporation of the recrystallization mother liquor is purified by column chromatography on silica gel using a mixture of ethyl acetate-p-hexane with a gradually increasing content of ethyl acetate as an eluent. "» From pravastatin lactone obtained after recrystallization and chromatographic purification, pravastatin is obtained by hydrolysis at room temperature in acetone with an equivalent amount of sodium hydroxide.

По закінченні створення натрієвої солі правастатину реакційну суміш розбавляють водою і нейтралізують, а -І ацетон, що міститься, переганяють під вакуумом. Правастатин адсорбують з отриманого водного залишку в колонці зі смолою Оіаїоп НР-20, промивають деіонізованою водою і елююють з колонки сумішшю ацетону і о деіонізованої води. Потім фракції, які містять правастатин, об'єднують, ацетон, що міститься, переганяють, і ьч після ліофілізації водного залишку може бути отриманий правастатин високої чистоти, який може бути потім перекристалізований із етилацетат-етанольної суміші. шо В ході цього процесу може бути адсорбований весь правастатин. Під час закриття лактонового кільця с» правастатину можуть також утворюватися З у -гідрокси-ізокомпактин і інші побічні продукти. Хоча ці реакції знижують вихід ізоляції, однак ці сполуки можуть бути відділені вищеописаними методами очищення і, отже, правастатин може вироблятися цим способом з фармацевтично прийнятною якістю.After the creation of the sodium salt of pravastatin, the reaction mixture is diluted with water and neutralized, and the contained acetone is distilled off under vacuum. Pravastatin is adsorbed from the resulting aqueous residue in a column with Oiaiop HP-20 resin, washed with deionized water and eluted from the column with a mixture of acetone and deionized water. Then the fractions containing pravastatin are combined, the acetone contained is distilled off, and after lyophilization of the aqueous residue, high-purity pravastatin can be obtained, which can then be recrystallized from an ethyl acetate-ethanol mixture. During this process, all pravastatin can be adsorbed. During the closing of the lactone ring c» of pravastatin, C y -hydroxy-isocompactin and other side products can also be formed. Although these reactions reduce the yield of the isolation, these compounds can be separated by the above-described purification methods and, therefore, pravastatin can be produced by this method with pharmaceutically acceptable quality.

Після закінчення біоконверсії правастатин може бути екстрагований або з ферментаційного бульйону, або з фільтрату, отриманого після відділення клітин ниткоподібних грибків. Клітини ниткоподібних грибків можуть о бути видалені шляхом фільтрації або центрифугування; однак більш сприятливо, особливо в промисловому іме) масштабі, проводити екстракцію всього бульйону. Перед екстракцією рН ферментаційного бульйону або фільтрату бульйону регулюють до 3,5-3,7 мінеральною кислотою, переважно розбавленою сірчаною кислотою. 60о Екстракцію здійснюють складним ефіром оцтової кислоти і аліфатичного спирту, що містить 2-4 атома вуглецю, переважно етилацетатом або ізобутилацетатом. Етапи екстракції повинні здійснюватися дуже швидко, щоб уникнути створення лактонової похідної з правастатину при кислій рН.After the end of bioconversion, pravastatin can be extracted either from the fermentation broth or from the filtrate obtained after the separation of cells of filamentous fungi. Cells of filamentous fungi can be removed by filtration or centrifugation; however, it is more advantageous, especially on an industrial scale, to extract the entire broth. Before extraction, the pH of the fermentation broth or broth filtrate is adjusted to 3.5-3.7 with mineral acid, preferably diluted sulfuric acid. 60o Extraction is carried out with a complex ester of acetic acid and an aliphatic alcohol containing 2-4 carbon atoms, preferably with ethyl acetate or isobutyl acetate. The extraction steps must be carried out very quickly to avoid the formation of a lactone derivative of pravastatin at acidic pH.

Із екстракту в органічному розчиннику правастатин в кислотній формі може бути перенесений у вигляді натрієвої солі у водну фазу. Наприклад, з етилацетатного екстракту правастатин може бути екстрагований 65 Бдо-ним гідрокарбонатом натрію або слаболужною водою (рН 7,5-8,0) в кількості 1/10 і 1/20 від об'єму екстракту. Було виявлено, що правастатин може бути витягнутий у чистій формі з отриманого вище лужного водного екстракту шляхом колоночної хроматографії із застосуванням неіонної адсорбційної смоли. Сприятливо спочатку видалити розчинник, розчинений у водній фазі, шляхом вакуумної перегонки з лужного водного екстракту, а потім завантажити водний екстракт в колонку Оіаіоп НР-20.From the extract in an organic solvent, pravastatin in acid form can be transferred in the form of a sodium salt to the aqueous phase. For example, pravastatin can be extracted from the ethyl acetate extract with 65 ppm sodium bicarbonate or slightly alkaline water (pH 7.5-8.0) in the amount of 1/10 and 1/20 of the volume of the extract. It was found that pravastatin can be extracted in pure form from the alkaline aqueous extract obtained above by column chromatography using a nonionic adsorption resin. It is advantageous to first remove the solvent dissolved in the aqueous phase by vacuum distillation from the alkaline aqueous extract, and then load the aqueous extract into the Oiaiop HP-20 column.

Натрієву сіль правастатину, адсорбовану в колонці очищають шляхом елюювання з поступовим збільшенням вмісту ацетону у водних розчинах, потім головні фракції, які містять правастатин, об'єднують і концентрують під вакуумом. Водний концентрат піддають подальшому очищенню шляхом хроматографії в іншій колонці Оіаіїоп НР-20 з отриманням елюату, що містить чистий правастатин, з якого після прояснення деревним вугіллям і ліофілізації може бути отриманий правастатин фармацевтично прийнятної якості. 70 Така методика ізоляції включає меншу кількість стадій, ніж попередня, оскільки ця методика не включає створення лактону з правастатину і його гідролізу. Під час ізоляції правастатин лише обмежений час знаходиться в кислих умовах, в яких він менш стабільний, ніж в нейтральних або лужних розчинах, тому артефакти під час проведення такої методики ізоляції практично не утворюються.The sodium salt of pravastatin adsorbed in the column is purified by elution with a gradual increase in the content of acetone in aqueous solutions, then the main fractions containing pravastatin are combined and concentrated under vacuum. The aqueous concentrate is subjected to further purification by chromatography in another Oiaiop HP-20 column to obtain an eluate containing pure pravastatin, from which, after clarification with charcoal and lyophilization, pravastatin of pharmaceutically acceptable quality can be obtained. 70 This isolation technique involves fewer steps than the previous one, since this technique does not involve the creation of a lactone from pravastatin and its hydrolysis. During the isolation of pravastatin, only a limited time is in acidic conditions, in which it is less stable than in neutral or alkaline solutions, so artifacts during the implementation of this isolation technique are practically not formed.

Крім того, було виявлено, що для очищення правастатину доцільно використати хроматографію в гелі 7/5 Зерпадех ІН-20 Рехігап (гідроксипропільована похідна). При застосуванні цього способу може бути отриманий правастатин з чистотою, яка досягає 99,595 (що вимірюється шляхом НРІ С).In addition, it was found that for the purification of pravastatin it is advisable to use chromatography in a 7/5 Zerpadeh IN-20 Rehigap gel (hydroxypropylated derivative). Using this method, pravastatin can be obtained with a purity that reaches 99.595 (as measured by NRI C).

У ході наших дослідів було виявлено, що з екстракту в органічному розчиннику, переважно з етилацетатного або ізобутилацетатного екстракту бульйону або нітрату бульйону штамів ниткоподібних грибків або ниткоподібних бактерій, включаючи штам Могіегейа тасціайа п. зр. здатний бр -гідроксилювати сполуку формули (Ії), правастатин може бути осаджений вторинними амінами у вигляді кристалічної солі. Крім того, було виявлено, що для створення солі придатні декілька вторинних амінів, що містять алкільні, циклоалкільні, аралкільні або арильні заступники. Серед них цілеспрямовано були вибрані нетоксичні вторинні аміни, наприклад, діоктиламін, дициклогексиламін, дибензиламін. Ізоляцію проміжних солей органічних вторинних амінів, наприклад, дибензиламінової солі, здійснювали шляхом додавання дибензиламіну в кількості 1,5 с еквівалента відносно вмісту правастатину в екстракті, потім екстракт концентрували шляхом вакуумної перегонки до 595 його початкового об'єму, після чого другу порцію дибензиламіну додавали в концентрат в о кількості О0,2екв. Кристалічну дибензиламінову сіль осадили з концентрату. Кристалічний неочищений продукт відфільтрували і висушили під вакуумом. Потім його прояснили деревним вугіллям і перекристалізували в ацетоні. соIn the course of our experiments, it was found that from the extract in an organic solvent, mainly from the ethyl acetate or isobutyl acetate extract of the broth or nitrate broth of strains of filamentous fungi or filamentous bacteria, including the strain Mogiegeia tasciaia p. zr. able to br -hydroxylate the compound of the formula (II), pravastatin can be precipitated by secondary amines in the form of a crystalline salt. In addition, several secondary amines containing alkyl, cycloalkyl, aralkyl, or aryl substituents were found to be suitable for salt formation. Among them, non-toxic secondary amines were purposefully selected, for example, dioctylamine, dicyclohexylamine, dibenzylamine. Isolation of intermediate salts of organic secondary amines, for example, dibenzylamine salt, was carried out by adding dibenzylamine in the amount of 1.5 s equivalent to the content of pravastatin in the extract, then the extract was concentrated by vacuum distillation to 595 of its initial volume, after which the second portion of dibenzylamine was added to concentrate in the amount of O0.2 equiv. The crystalline dibenzylamine salt was precipitated from the concentrate. The crystalline crude product was filtered off and dried under vacuum. It was then clarified with charcoal and recrystallized in acetone. co

У згаданій раніше методиці, в якій беруть участь екстракція органічним розчинником і доекстракція при лужній величині рН, спосіб ізоляції, заснований на утворенні солі вторинного аміну, може бути також іа використаний для заміни очищення при допомозі колоночної хроматографії. У цьому випадку доцільно «І осаджувати дибензиламінову сіль правастатину з ізобутилацетатного екстракту, отриманого після підкислення лужного водного екстракту. оIn the previously mentioned technique, which involves extraction with an organic solvent and co-extraction at an alkaline pH value, the isolation method based on the formation of a salt of a secondary amine can also be used to replace the purification with the help of column chromatography. In this case, it is advisable to precipitate the dibenzylamine salt of pravastatin from the isobutyl acetate extract obtained after acidification of the alkaline aqueous extract. at

Солі правастатину з органічними вторинними амінами можуть бути перетворені в правастатин гідроксидом о/з натрію або алкоксидом натрію, переважно етоксидом натрію.Salts of pravastatin with organic secondary amines can be converted to pravastatin with sodium hydroxide o/z or sodium alkoxide, preferably sodium ethoxide.

Перетворення детально представлене у разі дибензиламінової солі. Перекристалізовану дибензиламінову сіль суспендують в ізобутилацетатно-водній суміші, потім до суспензії додають еквівалентну кількість гідроксиду натрію у водному розчині, підтримуючи рН в діапазоні 8,0-8,5 при перемішуванні. Після зникнення « суспензії фази розділяють і водну фазу, яка містить правастатин, двічі промивають ізобутилацетатом. Водний шщ с розчин прояснюють активованим вугіллям і ліофілізують з отриманням правастатину фармацевтично прийнятної й якості. "» Один з переважних способів перетворення дибензиламінової солі правастатину в правастатин полягає в суспендуванні перекристалізованої дибензиламінової солі в етанолі, потім додаванні до суспензії еквівалентноїThe transformation is presented in detail in the case of the dibenzylamine salt. The recrystallized dibenzylamine salt is suspended in an isobutyl acetate-water mixture, then an equivalent amount of sodium hydroxide in an aqueous solution is added to the suspension, maintaining the pH in the range of 8.0-8.5 with stirring. After the disappearance of the suspension, the phases are separated and the aqueous phase, which contains pravastatin, is washed twice with isobutyl acetate. The aqueous solution is clarified with activated carbon and lyophilized to obtain pravastatin of pharmaceutically acceptable quality. "» One of the preferred ways of converting the dibenzylamine salt of pravastatin to pravastatin is to suspend the recrystallized dibenzylamine salt in ethanol, then add to the suspension an equivalent

Кількості або невеликого надлишку етоксиду натрію при перемішуванні, потім концентрації реакційної суміші під -І вакуумом, після чого, шляхом додвання ацетону, з концентрату осаджують правастатин в кристалічній формі.Amount or a small excess of sodium ethoxide with stirring, then the concentration of the reaction mixture under -I vacuum, after which, by adding acetone, pravastatin in crystalline form is precipitated from the concentrate.

Інший переважний спосіб перетворення дибензиламінової солі правастатину в правастатин полягає в о розчиненні перекристалізованої дибензиламінової солі в етилацетат-етанольній суміші, після чого, шляхом ї» додавання до розчину еквівалентної кількості або невеликого надлишку гідроксиду натрію в етанолі, осаджують 5р правастатин. о Ізоляція правастатину через проміжну сіль вторинного аміну являє собою більш просту методику, ніж се» будь-яка з раніше відомих методик ізоляції. При проведенні цієї методики артефакти не утворюються, а проблема відділення правастатину від побічних продуктів біоконверсії і від різних метаболічних продуктів, біосинтезуємих гідроксилюючим мікроорганізмом, може бути вирішена без застосування хроматографічнихAnother preferred way of converting the dibenzylamine salt of pravastatin into pravastatin is to dissolve the recrystallized dibenzylamine salt in an ethyl acetate-ethanol mixture, after which, by adding to the solution an equivalent amount or a small excess of sodium hydroxide in ethanol, 5 g of pravastatin is precipitated. o Isolation of pravastatin via a secondary amine salt intermediate represents a simpler technique than any of the previously known isolation techniques. When performing this technique, artifacts are not formed, and the problem of separating pravastatin from the by-products of bioconversion and from various metabolic products biosynthesized by the hydroxylating microorganism can be solved without the use of chromatographic

Засобів.Means

Структури правастатину, лактону правастатину і ізольованих солей правастатину з вторинними амінами були о підтверджені аналітичними методами УФ, ІЧ, ЯМР ІН ЯМР сі мас-спектрометрії. ко ПрикладиThe structures of pravastatin, pravastatin lactone, and isolated pravastatin salts with secondary amines were confirmed by analytical methods of UV, IR, NMR, NMR, and mass spectrometry. Examples

Далі винахід буде описаний більш детально на прикладах, які приведені лише з метою ілюстрації і ні в якій бо мірі не обмежують область винаходу.Next, the invention will be described in more detail using examples, which are given only for the purpose of illustration and in no way limit the scope of the invention.

Приклад 1Example 1

Приготували суспензію спор в 5мл 0,995 розчині хлориду натрію, отриману з 7-10-денної культури на косячку агару з солодовим екстрактом і дріжджовим екстрактом штаму МогііегеМа тасціайа пом. зрес. Е-97 |ІМСАІМ(Р)Е 001266), здатного бр -гідроксилювати компактин, і використали суспензію для інокуляції ї00мл середовища 65 інокуляту РІ, стерилізованого в 500-мл колбі Ерленмейера.A spore suspension was prepared in 5 ml of a 0.995 sodium chloride solution obtained from a 7-10-day culture on an agar stick with malt extract and yeast extract of the strain MogiiegeMa tasciaia pom. coll. E-97 |IMSAIM(R)E 001266), able to br-hydroxylate compactin, and used the suspension for inoculation of 100 ml of medium 65 inoculum RI, sterilized in a 500-ml Erlenmeyer flask.

Склад середовища РІ:Composition of RI environment:

глюкоза БОГ соєва мука 20г в 1000мл водопровідної водиglucose BOG soy flour 20g in 1000ml tap water

Перед стерилізацією рН середовища довели до 7,0, потім стерилізували при 12190 25 хвилин. Культуру струшували на роторному шейкері (250об/хв., амплітуда 2,5см) протягом З днів при 282С, потім 1Омл отриманої культури перенесли в 100-100мл біоконверсійного середовища МИ/4, стерилізованого в 500-мл колбі 70 Ерленмейера при 121202 25 хвилин.Before sterilization, the pH of the medium was adjusted to 7.0, then sterilized at 12190 for 25 minutes. The culture was shaken on a rotary shaker (250 rpm, amplitude 2.5 cm) for 3 days at 282C, then 1 Oml of the obtained culture was transferred to 100-100 ml of bioconversion medium MI/4, sterilized in a 500-ml 70 Erlenmeyer flask at 121202 for 25 minutes.

Склад середовища МИ/4: глюкоза 40г соєва мука 20г 75 казеїн-пептон 1г аспарагін 2г дигідрофосфат калію ОБГ в 1000мл водопровідної водиComposition of medium MI/4: glucose 40g soybean flour 20g 75 casein-peptone 1g asparagine 2g potassium dihydrogen phosphate OBG in 1000ml of tap water

Перед стерилізацією рН середовища довели до 7,0, потім стерилізували при 12120 25 хвилин. 720 Колби струшували на роторному шейкері (250об/хв., амплітуда 2,5см) протягом 4 днів при 252С, потім 50-50мг компактинового субстрату (натрієва сіль компактинової кислоти) в стерильно-фільтрованій водній формі ввели в культури, потім продовжили культивування. Подібним чином на 5-й день ввели ще 50-5Омг натрієвої солі компактинової кислоти в грибкові культури і продовжували ферментацію ще 24 години. Вміст правастатину в сч бульйоні визначали шляхом НРІС. Ферментацію продовжували 168 годин. У кінці біоконверсії середня концентрація правастатину в ферментаційному бульйоні становила 620мкг/мл. оBefore sterilization, the pH of the medium was brought to 7.0, then sterilized at 12120 for 25 minutes. 720 The flasks were shaken on a rotary shaker (250 rpm, amplitude 2.5 cm) for 4 days at 252C, then 50-50 mg of compactin substrate (sodium salt of compactin acid) in a sterile filtered aqueous form was introduced into the cultures, then the cultivation was continued. Similarly, on the 5th day, another 50-5mg of the sodium salt of compactic acid was added to the fungal cultures and the fermentation was continued for another 24 hours. The content of pravastatin in the broth was determined by NRIS. Fermentation continued for 168 hours. At the end of bioconversion, the average concentration of pravastatin in the fermentation broth was 620 μg/ml. at

Приклад 2Example 2

У лабораторному ферментері на 5 літрів робочого об'єму приготували біоконверсійне середовище культуриA bioconversion culture medium was prepared in a laboratory fermenter with a working volume of 5 liters

МИ)/В8, при цьому компоненти середовища культури ввели відповідно 5 літрам, але завантажили її тільки до 4,5л, со зо потім стерилізували її 45хв. при 1219207 і засіяли 500мл культури інокуляту, яку приготували відповідно доМY)/B8, while the components of the culture medium were introduced in 5 liters respectively, but it was loaded only to 4.5 liters, so then it was sterilized for 45 minutes. at 1219207 and sowed 500 ml of inoculum culture, which was prepared according to

Прикладу 1. Ме)Example 1. Me)

Склад середовища МИ/В: «Е глюкоза 20г Ге) гліцерин 20г соєва мука 20г ї- пептон Бг дигідрофосфат калію ОБГ поліпропіленгліколь 2000. 1г « в 1000мл водопровідної води. шщ с Перед стерилізацією рН середовища довели до величини 7,0. :з» Ферментацію проводили при 282С, при швидкості перемішування 4О00об/хв. і швидкості аерації знизу бОл/г протягом 4 днів. На 2-й день після перенесення культура почала сильне піностворення, яке може бути зниженеThe composition of the MI/V medium: "E glucose 20 g Ge) glycerol 20 g soy flour 20 g i- peptone Bg potassium dihydrogen phosphate OBG polypropylene glycol 2000. 1 g " in 1000 ml of tap water. Before sterilization, the pH of the medium was adjusted to 7.0. :z» Fermentation was carried out at 282C, with a stirring speed of 4000 rpm. and aeration rates below bOl/h for 4 days. On the 2nd day after the transfer, the culture began to foam strongly, which can be reduced

Шляхом додавання додаткової кількості поліпропіленгліколю 2000. На початку ферментації (16-20 годин) - величина рН знизилася від початкової величини 6,5 до 5,0-5,5, потім з 3-го дня вона почала підвищуватися і досягла 6,3-7,5 на 4-й день. Введення компактинового субстрату допускається при перевищенні рН бульйону о величини 6,3. На 4-й день ферментації додали 2,5г компактинового субстрату в стерильному фільтрованому їз водному розчині. В культуру додали, з розрахунку на об'єм бульйону, 0,5-1,095 глюкози в залежності від рН в формі 5095 розчину, стерилізованого 25 хвилин при 12123 паралельно з введенням субстрату. Через 24 години се) компактиновий субстрат витрачається з бульйону, що визначають хроматографією (НРІ С) проб, взятих з с» ферментера. У цьому випадку додали ще 2,5г компактинового субстрату і глюкози, як описано вище, і продовжували біоконверсію ще 24 години, коли субстрат перетворився в правастатин.By adding an additional amount of polypropylene glycol 2000. At the beginning of fermentation (16-20 hours) - the pH value decreased from the initial value of 6.5 to 5.0-5.5, then from the 3rd day it began to rise and reached 6.3- 7.5 on the 4th day. The introduction of the compactin substrate is allowed when the pH of the broth exceeds 6.3. On the 4th day of fermentation, 2.5 g of compactin substrate was added in a sterile filtered aqueous solution. Based on the volume of the broth, 0.5-1.095 glucose was added to the culture, depending on the pH, in the form of a 5095 solution, sterilized for 25 minutes at 12123 parallel to the introduction of the substrate. After 24 hours, the compactin substrate is consumed from the broth, which is determined by chromatography (NRI C) of the samples taken from the fermenter. In this case, another 2.5 g of compactin substrate and glucose were added as described above, and bioconversion was continued for another 24 hours, when the substrate was converted to pravastatin.

Після закінчення ферментації 5,1л бульйону, що містить бЗОмкг/мл правастатину, профільтрували через фильтрувальну тканину. Два літри води додали до відділеного міцелію, потім суспензію міцелію перемішували протягом години і профільтрували. Ці два фільтрати об'єднали і пропустили зі швидкістю 50Омл/година через (Ф. колонку, що містить 138г (250мл) смоли Юожех АЇ 400 (ОН) (діаметр колонки З,4см, висота шару смоли 28см), ко потім шар смоли промили З0Омл деіонізированої води. Потім провели елюювання зі смоли 1 літром суміші ацетон-вода (1:1), яка містить 10г хлориду натрію. Об'єм кожної з фракцій становив 10Омл. Елюат аналізували бо за допомогою наступної методики тонкошарової хроматографії (ТІ С): адсорбент: алюмінієва фольга Кіезеде! 60After the end of fermentation, 5.1 l of broth containing bZOmkg/ml of pravastatin was filtered through a filter cloth. Two liters of water were added to the separated mycelium, then the mycelium suspension was stirred for an hour and filtered. These two filtrates were combined and passed at a rate of 50 Oml/hour through a column containing 138 g (250 ml) of Yuozhekh AI 400 (OH) resin (column diameter 3.4 cm, height of the resin layer 28 cm), before the resin layer was washed 30 Oml of deionized water. Then elution was carried out from the resin with 1 liter of acetone-water mixture (1:1), which contains 10 g of sodium chloride. The volume of each of the fractions was 10 Oml. The eluate was analyzed using the following technique of thin-layer chromatography (TLC): adsorbent: Kiezede aluminum foil!60

Е254 ОС (Мегск); проявлюючий розчинник: суміш ацетон-бензол-оцтова кислота (50:50:3); проявлення: фосфомолібденовою кислотою. Величина Кї правастатину становить 0,5. Фракції, що містять продукт, об'єднали, а ацетон перегнали під вакуумом. рН 400мл концентрату відрегулювали до 3,5-4,0 1595-ною сірчаною кислотою, потім його екстрагували тричі по 15О0мл етилацетату. Етилацетатні екстракти об'єднали і висушили 65 безводним сульфатом натрію. Потім отримали лактон правастатину з правастатинової кислоти шляхом додавання при кімнатній температурі при безперервному перемішуванні трифтороцтової кислоти в каталітичній кількості. Створення лактону правастатину контролювали при допомозі ТІ С (величина КІ лактону правастатину у вищеописаній системі ТІ С становить 0,7). Після завершення створення лактону етилацетат промили 2х 50Омл 590 водного розчину гідрокарбонату натрію, потім промили 5О0мл води, висушили безводним сульфатом натрію і випарили під вакуумом. Залишок випаровування, отриманий в кількості Зг, розчинили в 100мл ацетону і прояснили 0,Зг деревного вугілля. Потім деревне вугілля відфільтрували, а ацетон випарили під вакуумом.E254 OS (Megsk); developing solvent: a mixture of acetone-benzene-acetic acid (50:50:3); manifestation: phosphomolybdic acid. The Ki value of pravastatin is 0.5. The fractions containing the product were combined, and the acetone was distilled off under vacuum. The pH of 400 ml of the concentrate was adjusted to 3.5-4.0 with 1595 sulfuric acid, then it was extracted three times with 1500 ml of ethyl acetate. The ethyl acetate extracts were combined and dried over anhydrous sodium sulfate. Pravastatin lactone was then obtained from pravastatin acid by addition at room temperature with continuous stirring of catalytic amount of trifluoroacetic acid. The formation of pravastatin lactone was monitored with the help of TI C (the CI value of pravastatin lactone in the above-described TI C system is 0.7). After completion of lactone creation, ethyl acetate was washed with 2x 50Oml of 590 aqueous solution of sodium bicarbonate, then washed with 5O0ml of water, dried with anhydrous sodium sulfate and evaporated under vacuum. The evaporation residue, obtained in the amount of Zg, was dissolved in 100 ml of acetone and clarified with 0.Zg of charcoal. The charcoal was then filtered and the acetone evaporated under vacuum.

Отриманий неочищений продукт кристалізували з 20мл етанолу. Осаджений кристалічний лактон правастатину відфільтрували, промили на фільтрі ЗОмл п-гексану і висушили при кімнатній температурі під вакуумом. Таким способом отримали 1,5г хроматографічно чистого лактону правастатину. Температура плавлення 140-142 С, 70. о |р--1942 (с-0,5, метанол). Маточний розчин кристалізації випарили під вакуумом і отримали 1,2г залишку випаровування, який хроматографували в колонці, що містить адсорбент Кіезеде! 60 (діаметр колонки 1,бсм, висота шару 20см). Неочищений продукт, розчинений в бмл бензолу, вмістили в колонку. Для елюювання використали суміші етилацетату-п-гексану, в яких вміст етилацетату поступово збільшували. Лактон правастатину може бути елюйований з колонки сумішшю бОбо етилацетату - 4095 п-гексану. Фракції 75 контролювали при допомозі ТІ С з використанням суміші етилацетату-п-гексану (9:1) як проявлюючий розчинник.The obtained crude product was crystallized from 20 ml of ethanol. Precipitated crystalline pravastatin lactone was filtered, washed on the filter with 30 ml of p-hexane and dried at room temperature under vacuum. In this way, 1.5 g of chromatographically pure pravastatin lactone was obtained. Melting point 140-142 C, 70. o |p--1942 (c-0.5, methanol). The crystallization mother liquor was evaporated under vacuum and 1.2 g of the evaporation residue was obtained, which was chromatographed in a column containing Kiezede adsorbent! 60 (column diameter 1, bcm, layer height 20cm). The crude product, dissolved in bml of benzene, was placed in the column. For elution, mixtures of ethyl acetate-p-hexane were used, in which the content of ethyl acetate was gradually increased. Pravastatin lactone can be eluted from the column with a mixture of 50% ethyl acetate - 4095 n-hexane. Fractions 75 were monitored with the help of TI C using a mixture of ethyl acetate-p-hexane (9:1) as a developing solvent.

Фракції, що містять лактон правастатину, об'єднали і випарили під вакуумом. По цій методиці отримали 0,Зг чистого продукту, якість якого ідентична якості лактону правастатину, отриманого кристалізацією.Fractions containing pravastatin lactone were combined and evaporated under vacuum. According to this technique, 0.3 g of pure product was obtained, the quality of which is identical to that of pravastatin lactone obtained by crystallization.

Дві партії лактону правастатину об'єднали і отримали натрієву сіль наступним способом: 1,8г лактону правастатину розчинили в 20мл ацетону і при перемішуванні додали 4,5мл 1М водного розчину гідроксиду натрію, потім розчин перемішували півгодини при кімнатній температурі. По закінченні створення солі в суміш додали 2Омл води і нейтралізували розчин, потім ацетон випарили під вакуумом. Водний концентрат хроматографували в колонці, заповненій 150мл смоли Оіаїоп НР 20 (діаметр колонки 2,б6см, висота шару смолиTwo batches of pravastatin lactone were combined and the sodium salt was obtained in the following way: 1.8 g of pravastatin lactone was dissolved in 20 ml of acetone and, with stirring, 4.5 ml of 1 M aqueous sodium hydroxide solution was added, then the solution was stirred for half an hour at room temperature. After the formation of the salt, 2 ml of water was added to the mixture and the solution was neutralized, then the acetone was evaporated under vacuum. The aqueous concentrate was chromatographed in a column filled with 150 ml of Oiaiop HP 20 resin (column diameter 2.6 cm, height of the resin layer

ЗОсм). Як елююючий агент використали суміші ацетону-деіонізованої води, при цьому концентрацію ацетону збільшували ступінчасто з кроком 5956. Правастатин може бути елюйований з колонки 15956-ною сумішшю, що с містить ацетон, ацетон-деіонізована вода. Фракції аналізували шляхом ТІ С. Фракції, що містять продукт, о об'єднали і ацетон випарили під вакуумом. Шляхом ліофілізації водного залишку отримали 1,Зг правастатину.ZOsm). Acetone-deionized water mixtures were used as an eluting agent, while the concentration of acetone was increased in steps of 5956. Pravastatin can be eluted from the column with a 15956 mixture containing acetone and acetone-deionized water. The fractions were analyzed by TI S. The fractions containing the product were combined and the acetone was evaporated under vacuum. By lyophilization of the aqueous residue, 1.3 g of pravastatin was obtained.

Хроматографічно чистий продукт кристалізували із суміші етанолу і етилацетату.The chromatographically pure product was crystallized from a mixture of ethanol and ethyl acetate.

Температура плавлення: 170-1732С (розкладання) (о. 1 ор 156 (с-0,5, уводі) і)Melting point: 170-1732C (decomposition) (o. 1 or 156 (s-0.5, inputs) and)

Спектр УФ поглинання (2Омкг/мл, у метанолі: 5, тах-231,237, 245нмМ Ге»! (де -4,236; 4,311; 4,136)UV absorption spectrum (2Omkg/ml, in methanol: 5, tach-231,237, 245nm Ge"! (where -4,236; 4,311; 4,136)

Спектр ІЧ поглинання (КВг): о ОН 3415, о СН 2965, 5 С-О 1730, о СОО-1575сМ7. чIR absorption spectrum (KVh): o OH 3415, o CH 2965, 5 С-О 1730, o СОО-1575сМ7. h

Спектр ЯМР "Н (020, 5, ррт): 0,86, а, ЗН (2-СНаі); 5,92, аа, уУ-10,0 І 54Гц, їн (С-Н); 5,99, а, У-10,0гц, «оNMR spectrum "H (020, 5, ppt): 0.86, a, ZN (2-ChNa); 5.92, aa, uU-10.0 I 54 Hz, yin (C-H); 5.99, a, U-10.0hz, "o

Зв ЛН (4-Н); 5,52, Бг 1Н (5-Н); 4,24, т 1Н (6-Н); 5,34, Бг, 1Н (8-Н); 4,06, т, 1Н (р -Н); 3,65, т, 1Н (5 -Н); 10554, 3 Й Кк. (2-СН»); 0,82, Ь ЗН (2-Н»).With LN (4-H); 5.52, Bg 1H (5-H); 4.24, t 1H (6-H); 5.34, Bg, 1H (8-H); 4.06, t, 1Н (р -Н); 3.65, t, 1H (5-H); 10554, 3 J Kk. (2-CH"); 0.82, b ЗН (2-Н»).

Спектр ЯМР С (020, 5, ррт): 15,3, д (2-СНаз); 139,5, й (С-3); 129,5, й, (С-4); 138,1, в (С-4а), 127,7, 4 (0-5); 66,6, а (0-6); 70,1, а (С-8); 182,6 з (СО); 72,6, а (С-р.); 73,0, а (0-5); 182,0, в (С-1) 18,8; 4 (2-СНаз); 13,7, « 4 (С-47).C NMR spectrum (020, 5, ppt): 15.3, d (2-CHnase); 139.5, and (C-3); 129.5, y, (C-4); 138.1, in (C-4a), 127.7, 4 (0-5); 66.6, and (0-6); 70.1, a (C-8); 182.6 with (SO); 72.6, a (S-r.); 73.0, and (0-5); 182.0, in (C-1) 18.8; 4 (2-CHase); 13.7, "4 (C-47).

Позитивний мас-спектр РАВ (характеристичні іони): З с ІМ-Ма)" 469; МАНІ" 447. з» Негативний мас-спектр РАВ (характеристичні іони):Positive RAV mass spectrum (characteristic ions): Z c IM-Ma)" 469; MANI" 447. z» Negative RAV mass spectrum (characteristic ions):

ІМ-НІ- 445, ІМІ|- 423, т/2 101 (2-метилмасляна кислота-Н|-.IM-NI- 445, IMI|- 423, t/2 101 (2-methylbutyric acid-H|-.

Приклад ЗExample C

У лабораторному ферментері на 5 літрів робочого об'єму приготували біоконверсійне середовище культури і МИи/4, як описано в Прикладі 1, і хоч його завантажили тільки до 4,5л, склад середовища культури розрахували оз на 5 літрів. Потім його стерилізували 45хв. при 12122 і інокулювали 500мл культури інокуляту, приготованої їз відповідно до Прикладу 1. Ферментацію проводили при 259С, при швидкості перемішування ЗООоб/хв. і швидкості аерації 5Ол/г протягом 4 днів. Після введення в культуру 5г компактинового субстрату біоконверсію (се) 50 проводили відповідно до Прикладу 2. сю» По закінченню біоконверсії 4,9л бульйону, що містить ббОмкг/мл правастатину, профільтрували і відділений міцелій промили шляхом суспендування в 2 х 1л деіонізованої води. рН об'єднаного фільтрату бульйону (5,бл) відрегулювали 2090-ною сірчаною кислотою до 3,5-3,7, потім кислий фільтрат перемішували з 2750мл вв бтилацетату протягом ЗО хвилин. Після цього фази розділили. Водну фазу знов екстрагували 2 х 1375мМл етилацетату. 47О0мл деіїонізованої води додали до 4740мл об'єднаного етилацетатного екстракту, потім рн (Ф; водо-етилацетатної суміші довели до 7,5-8,0 1М гідроксидом натрію. Після 20 хвилин перемішування фази ко розділили, потім етилацетатний екстракт екстрагували 2х 235мл деіонізованої води, як описано вище. Після цього об'єднаний слаболужний водний розчин об'ємом 1080мл концентрували під вакуумом до об'єму 280мл. во Концентрований водний розчин вмістили в хроматографічну колонку (співвідношення висота:діаметр - 6,5), заповнену 280мл неіїонної смоли Оіаіоп НР-20 (Міїзирізпі Со., дарап). Адсорбцію в колонці проводили з швидкістю ходу 250-300мл/г, потім колонку промили 84Омл деїіонізованої води. Після цього колонку елюювали в наступному порядку: ЗООмл 595, 100О0мл 1095, 50О0мл 15956 і 50Омл 2095 води, що містить ацетон. У ході елюювання зібрали 50-мл фракції, які аналізували по методиці ТС, приведеній в Прикладі 2. Фракції, що 65 Містять правастатин як головний компонент, об'єднали і отриманий розчин концентрували під вакуумом до об'єму 260мл. Концентрований водний розчин хроматографували в колонці, що містить смолу Оіаіоп НР-20 в об'ємі 260О0мл. Після адсорбції правастатину колонку промили 79Омл дейіонізованої води, потім елюювали водо-ацетоновими розчинами порціями по 260-260мл з поступовим підвищенням вмісту ацетону таким чином: 2,5, 5,0, 7,5, 10,0, 12,5, 15,0 ії 20095. У ході колоночної хроматографії зібрали 25-мл фракції, і вміст правастатину в фракціях аналізували, як описано вище. Фракції, що містять правастатин як єдиний компонент (після аналізу ТІ С), об'єднали і випарили під вакуумом. Потім до концентрованого водного розчину (близькоBioconversion culture medium and MIi/4 were prepared in a laboratory fermenter for 5 liters of working volume, as described in Example 1, and although it was loaded only to 4.5 liters, the composition of the culture medium was calculated for 5 liters. Then it was sterilized for 45 minutes. at 12122 and inoculated with 500 ml of inoculum culture, prepared according to Example 1. Fermentation was carried out at 259C, with a stirring speed of ZOOrpm. and aeration rate of 5Ol/h for 4 days. After introducing 5 g of compactin substrate into the culture, bioconversion (se) 50 was carried out according to Example 2. After the end of bioconversion, 4.9 l of broth containing bbOmkg/ml of pravastatin was filtered and the separated mycelium was washed by suspending it in 2 x 1 l of deionized water. The pH of the combined broth filtrate (5.bl) was adjusted with 2090 sulfuric acid to 3.5-3.7, then the acidic filtrate was mixed with 2750 ml of ethyl acetate for 30 minutes. After that, the phases were separated. The aqueous phase was extracted again with 2 x 1375 mL of ethyl acetate. 4700 ml of deionized water was added to 4740 ml of the combined ethyl acetate extract, then the pH of the water-ethyl acetate mixture was adjusted to 7.5-8.0 with 1 M sodium hydroxide. After 20 minutes of stirring, the co phase was separated, then the ethyl acetate extract was extracted twice with 235 ml of deionized water , as described above. After that, the combined weakly alkaline aqueous solution with a volume of 1080 ml was concentrated under vacuum to a volume of 280 ml. The concentrated aqueous solution was placed in a chromatographic column (height:diameter ratio - 6.5), filled with 280 ml of nonionic Oiaiop resin HP-20 (Miizyrizpi So., Darap). Adsorption in the column was carried out at a flow rate of 250-300ml/g, then the column was washed with 84Oml of deionized water. After that, the column was eluted in the following order: ZOOml 595, 100O0ml 1095, 50O0ml 15956 and 50Oml 2095 of water containing acetone. During the elution, 50-ml fractions were collected, which were analyzed according to the TC method given in Example 2. The fractions containing pravastatin as the main component were combined and the resulting it was concentrated under vacuum to a volume of 260 ml. The concentrated aqueous solution was chromatographed in a column containing Oiaiop HP-20 resin in a volume of 26000 ml. After adsorption of pravastatin, the column was washed with 79 Oml of deionized water, then eluted with water-acetone solutions in portions of 260-260 ml with a gradual increase in the acetone content as follows: 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15, 0 ii 20095. In the course of column chromatography, 25-ml fractions were collected, and the pravastatin content of the fractions was analyzed as described above. Fractions containing pravastatin as a single component (after TI C analysis) were combined and evaporated under vacuum. Then to a concentrated aqueous solution (approx

ЗОмл) додали 0,3Зг деревного вугілля і прояснили правастатин при кімнатній температурі протягом ЗОхв. Потім деревне вугілля видалили з розчину шляхом фільтрації і фільтрат ліофілізували. Таким способом отримали 1,62г правастатину в ліофілізованій формі. 70 Приклад 4ZOml) added 0.3g of charcoal and clarified pravastatin at room temperature for ZOhv. Then the charcoal was removed from the solution by filtration and the filtrate was lyophilized. In this way, 1.62 g of pravastatin in lyophilized form were obtained. 70 Example 4

З культури на косячку агару штаму Могііегейа тасшціага пом. зрес. Е-97 |МСАІМ(Р)Е 001266), культивованої 10-12 днів, приготували суспензію спор в бмл стерильного 0,995 розчину хлориду натрію і використали цю суспензію для інокуляції ХООмл середовища інокуляту УНІС, стерилізованого в 3000-мл колбі Ерленмейера.From the culture on agar agar strain Mogiiegeia tasshciaga pom. coll. E-97 |МСАИМ(Р)Е 001266), cultivated for 10-12 days, a spore suspension was prepared in bml of sterile 0.995 sodium chloride solution and this suspension was used for inoculation of 10 ml of UNIS inoculum medium, sterilized in a 3000-ml Erlenmeyer flask.

Склад середовища УНІС: глюкоза ЗОог м'ясний екстракт 8г дріжджовий екстракт 1гThe composition of the UNIS medium: glucose, ZOog, meat extract, 8g, yeast extract, 1g

Тмееп-80 (поліоксиетилену (20) сорбітмоноолеат) 0,5г в 1000мл водопровідної води.Tmeep-80 (polyoxyethylene (20) sorbitol monooleate) 0.5 g in 1000 ml of tap water.

Перед стерилізацією рН середовища довели до 7,0 і стерилізували при 12190 25 хвилин. Культуру культивували на роторному шейкері (250об/хв., амплітуда 2,5см) протягом З днів, потім отриману культуру інокуляту використали для інокуляції лабораторного ферментеру, що містить біоконверсійне середовище сч культури РК в 5 літрах робочого об'єму.Before sterilization, the pH of the medium was brought to 7.0 and sterilized at 12190 for 25 minutes. The culture was cultivated on a rotary shaker (250 rpm, amplitude 2.5 cm) for 3 days, then the resulting inoculum culture was used for inoculation of a laboratory fermenter containing a bioconversion medium of RK culture in 5 liters of working volume.

Склад середовища РК: (8) глюкоза 40г пептон Бг соєва мука 20г ШкThe composition of the RK medium: (8) glucose 40g peptone Bg soy flour 20g Shk

КоРОд г оCode of the city o

КНоРОХ 1г «Е мамоз 2гKNoROH 1g "E mamoz 2g

КСІ ОБГ о в 1000мл водопровідної води. уKSI OBG in 1000 ml of tap water. in

Перед стерилізацією рН середовища довели до 7,0. Після інокуляції проводили культивування, введення субстрату і біоконверсію відповідно до Прикладу 2, потім правастатин ізолювали з бульйону, в якому його концентрація в кінці ферментації становила б5Омкг/мл. «Before sterilization, the pH of the medium was adjusted to 7.0. After inoculation, cultivation, introduction of the substrate and bioconversion were carried out according to Example 2, then pravastatin was isolated from the broth, in which its concentration at the end of fermentation was 5 Ωkg/ml. "

По закінченні ферментації рН бульйону (4,9л), що містить б5Омкг/мл правастатину, відрегулювали при пу с безперервному перемішуванні до 9,5-10,0, потім після 1 години перемішування рН довели до 3,5-3,7 2095-ною сірчаною кислотою. Після цього кислий розчин екстрагували 2,45л етилацетату. Фази розділили і шляхом ;» центрифугування з емульгованої органічної фази отримали прозорий екстракт. Бульйон знов екстрагували 2 х 1,22л етилацетату по методиці, приведеній вище. Етилацетатні екстракти об'єднали і додали 0,4л деїіонізованоїAt the end of the fermentation, the pH of the broth (4.9 L) containing 5 Ωkg/ml of pravastatin was adjusted with constant stirring to 9.5-10.0, then after 1 hour of stirring, the pH was brought to 3.5-3.7 2095- sulfuric acid. After that, the acidic solution was extracted with 2.45 l of ethyl acetate. Phases were also divided by: centrifugation from the emulsified organic phase gave a clear extract. The broth was again extracted with 2 x 1.22 l of ethyl acetate according to the method given above. Ethyl acetate extracts were combined and 0.4 l deionized was added

ВОДИ, потім рН суміші відрегулювали до 8,0-8,5 1М гідроксидом натрію. Фази розділили, етилацетатну фазу -і екстрагували 2х 0,2л деіонізованої води з рН 8,0-8,р5, як описано вище. рН об'єднаного правастатин слаболужного розчину, який містить правастатин, відрегулювали при перемішуванні 2096-ною сірчаною кислотоюWATER, then the pH of the mixture was adjusted to 8.0-8.5 with 1M sodium hydroxide. The phases were separated, the ethyl acetate phase was extracted with 2 x 0.2 l of deionized water with a pH of 8.0-8.p5, as described above. The pH of the combined pravastatin weakly alkaline solution containing pravastatin was adjusted by stirring with 2096 sulfuric acid

Мн до 3,5-3,7. Отриманий кислий розчин екстрагували 4х хО,2л етилацетату. Об'єднані етилацетатні екстракти г» промили 2х 0,2л деіонізованої води, потім додали 150мольбо дибензиламіну (з розрахунку на вміст с 50 правастатину, виміряний шляхом НРІ С) в етилацетатний розчин. Етилацетатний розчин концентрували під вакуумом до об'єму 0,2л. Ще 20мольбо дибензиламіну додали до отриманого концентрату і осаджений розчин сб» витримували протягом ночі при 0-52. Осаджену дибензиламінову сіль правастатину відфільтрували, потім осад промили на фільтрі холодним етилацетатом і потім два рази п-гексаном, після чого висушили під вакуумом при 40-50. Отриманий неочищений продукт (3,9г) розчинили в 100мл метанолу при кімнатній температурі, потім го розчин прояснили 0,45г деревного вугілля. Після цього метанольний фільтрат концентрували під вакуумом.Mn up to 3.5-3.7. The obtained acidic solution was extracted with 4 x 0.2 l of ethyl acetate. The combined ethyl acetate extracts of g" were washed twice with 0.2 l of deionized water, then 150 moles of dibenzylamine (based on the content of c 50 pravastatin, measured by NRI C) was added to the ethyl acetate solution. The ethyl acetate solution was concentrated under vacuum to a volume of 0.2 l. Another 20 moles of dibenzylamine was added to the resulting concentrate, and the precipitated solution was kept overnight at 0-52. The precipitated dibenzylamine salt of pravastatin was filtered, then the precipitate was washed on the filter with cold ethyl acetate and then twice with p-hexane, after which it was dried under vacuum at 40-50. The obtained crude product (3.9 g) was dissolved in 100 ml of methanol at room temperature, then the solution was clarified with 0.45 g of charcoal. After that, the methanol filtrate was concentrated under vacuum.

ГФ! Залишок випаровування розчинили в 120мл ацетону при зовнішній температурі 62-662С, потім розчин охолодили до кімнатної температури. Після цього проводили перекристалізацію протягом ночі при 0-52С. Осаджені кристали о відфільтровали, промили на фільтрі два рази холодним ацетоном і два рази п-гексаном. Перекристалізовану дибензиламінову сіль правастатину суспендували в суміші 1б0мл ізобутилацетату і вОмл деїіонізованої води. 60 Після цього в суспензію додали при перемішуванні гіроксид натрію в еквівалентній кількості. Після зникнення суспензії фази розділили і водний розчин, що містить правастатин, промили 2х ЗОмл ізобутилацетату.GF! The evaporation residue was dissolved in 120 ml of acetone at an external temperature of 62-662C, then the solution was cooled to room temperature. After that, recrystallization was carried out overnight at 0-52C. Precipitated crystals were filtered off, washed on the filter twice with cold acetone and twice with n-hexane. The recrystallized dibenzylamine salt of pravastatin was suspended in a mixture of 10 ml of isobutyl acetate and 0 ml of deionized water. 60 After that, an equivalent amount of sodium hydroxide was added to the suspension with stirring. After the disappearance of the suspension, the phases were separated and the aqueous solution containing pravastatin was washed with 2 x 30 ml of isobutyl acetate.

Отриманий водний розчин прояснтлт деревним вугіллям. Потім водний фільтрат концентрували до об'єму близько 20мл. Отриманий водний розчин завантажили в хроматографічну колонку (висотагдіаметр - 22), заповнену гелем Зерпадех ІН-20 (постачальник: Ріпагтасіа, Зуледеп). У ході хроматографії в якості елюенту бо використали деіонізовану воду і зібрали 20-мл фракції. Фракції аналізували шляхом ТІ С, потім фракції, що містять правастатин - додатково шляхом НРІ С з використанням методик, описаних вище. Фракції, що містять чистий правастатин, об'єднали і ліофілізували. Таким способом отримали 1,75г правастатину з чистотою вище 99,595, перевіреною НРІ С.The resulting aqueous solution is clarified with charcoal. Then the aqueous filtrate was concentrated to a volume of about 20 ml. The obtained aqueous solution was loaded into a chromatographic column (height diameter - 22), filled with Zerpadeh IN-20 gel (supplier: Ripagtasia, Zuledep). In the course of chromatography, deionized water was used as an eluent and 20-ml fractions were collected. Fractions were analyzed by TI C, then fractions containing pravastatin - additionally by NRI C using the methods described above. Fractions containing pure pravastatin were combined and lyophilized. In this way, we obtained 1.75 g of pravastatin with a purity higher than 99.595, tested by NRI S.

Приклад 5Example 5

Суспензію спор приготували з культури на косячку агару штаму Могііегейа тасціайа пом. взрес. Е-97The spore suspension was prepared from the culture on a cob agar of the strain Mohiiegeya tasciaia pom. adult E-97

ІМСАІМ(Р) 001266), культивованої 10-12 днів, в 5мл стерильного 0,990 розчину хлориду натрію, і потім інокулювали нею 500мл середовища інокуляту, як описано в Прикладі 4. У лабораторному ферментері на бл робочого об'єму біоконверсійне середовище культури РС/4 стерилізували 45хв. при 1219 і потім інокулювали 70 Ввисівною культурою.IMSAIM(R) 001266), cultured for 10-12 days, in 5 ml of a sterile 0.990 sodium chloride solution, and then 500 ml of the inoculum medium was inoculated with it, as described in Example 4. In a laboratory fermenter at a working volume of bioconversion culture medium RS/4 sterilized for 45 min. at 1219 and then inoculated with 70 V seed culture.

Склад середовища РС/4: солодовий екстракт 5,090 соєва мука 1,095 пептон 1,095 рідкий кукурудзяний екстракт 1,095Composition of medium RS/4: malt extract 5.090 soy flour 1.095 peptone 1.095 liquid corn extract 1.095

МазоОдх7НгО 0,196 в 1000мл водопровіднлі води.MazoOdkh7NgO 0.196 in 1000 ml of tap water.

Перед стерилізацією рН середовища довели до 7,0. Після інокуляції проводили культивування і введення субстрату відповідно до Прикладу 2, а потім отримали 5,1л бульйону з концентрацією б1Омкг/мл правастатину.Before sterilization, the pH of the medium was adjusted to 7.0. After inoculation, cultivation and introduction of the substrate was carried out according to Example 2, and then 5.1 liters of broth with a concentration of 100 kg/ml of pravastatin were obtained.

З бульйону отримали 3,7г неочищеної дибензиламінової солі правастатину по методиці, описаній в Прикладі 4, з якої після перекристалізації отримали 2,9г дибензиламінової солі правастатину. Перекристалізовану дибензиламінову сіль правастатину суспендували в 45мл етанолу, потім при перемішуванні додали 11О0мольоОо сч гідроксиду натрію шляхом введення 1М етанольного розчину гідроксиду натрію. Перемішування розчину продовжували півгодини, потім в нього додали 0,Зг деревного вугілля і перемішували ще півгодини. Розчин о) профільтрували, і фільтрат концентрували до 15мл. Потім до концентрату додали бОмл ацетону при 56-6090.From the broth, 3.7 g of the crude dibenzylamine salt of pravastatin were obtained according to the method described in Example 4, from which, after recrystallization, 2.9 g of the dibenzylamine salt of pravastatin were obtained. The recrystallized dibenzylamine salt of pravastatin was suspended in 45 ml of ethanol, then with stirring, 1100 mol of sodium hydroxide was added by introducing a 1 M ethanolic solution of sodium hydroxide. Mixing of the solution was continued for half an hour, then 0.3 g of charcoal was added to it and mixed for another half hour. Solution o) was filtered, and the filtrate was concentrated to 15 ml. Then bOml of acetone at 56-6090 was added to the concentrate.

Отриманий розчин охолодили до кімнатної температури, потім витримували протягом ночі при 52. Після цього осад відфільтрували і промили 2х 20мл ацетону, 2х 20мл етилацетату і 2х 20мл п-гексану і потім «се висушили під вакуумом. Результуючі 1,7г неочищеного правастатину розчинили в етанолі, потім прояснили деревним вугіллям і кристалізували з етанол-зтилацетатної суміші. Таким способом отримали 1,54г Ф правастатину, ідентичного продукту Прикладу 2. ч;ЕThe resulting solution was cooled to room temperature, then kept overnight at 52. After that, the precipitate was filtered and washed with 2 x 20 ml of acetone, 2 x 20 ml of ethyl acetate and 2 x 20 ml of p-hexane and then dried under vacuum. The resulting 1.7 g of crude pravastatin was dissolved in ethanol, then clarified with charcoal and crystallized from an ethanol-ethyl acetate mixture. In this way, 1.54 g of F pravastatin, identical to the product of Example 2, was obtained

Приклад 6Example 6

Як описано в Прикладі 4, культурою на косячку агару штаму МогіегеЇйа тасціага пом. зрес. Е-97 |МСАІМ(Р)Е о 001266), культивованою 7-10 днів, інокулювали 500мл середовища інокуляту МІ, стерилізованого в ЗО00-мл колбі /-|ч«As described in Example 4, culture on a cob of agar strain MohiegeYia tasciaga pom. coll. E-97 |MSAIM(R)E o 001266), cultivated for 7-10 days, was inoculated with 500 ml of MI inoculum medium, sterilized in a 300-ml flask /-|h«

Ерленмейера, і інкубували при 282С протягом З днів на роторному шейкері.Erlenmeyer, and incubated at 282C for 3 days on a rotary shaker.

Склад середовища МІ: глюкоза 40г « казеїн Бг шщ с КС ОБГ и мамоз Зг ,» КоРОд 2гThe composition of the MI medium: glucose 40g "casein Bg shsh with KS OBG and mamose Zg," KoROd 2g

МазОдх7НгО ОБГMazOdh7NgO OBH

ЕевОдх7НоО 0,01г в 100Омл водопровідної води. (95)EevOdh7NoO 0.01g in 100Oml of tap water. (95)

Перед стерилізацією рН середовища довели до 6,0 і проводили стерилізацію при 12122 35 хвилин. Отриману шк висівну культуру інокулюовали в 5 літрів біоконверсійного середовища Р12, стерилізованого в ферментері. (Те) 20 Склад середовища Р12: с» глюкоза 1ог солодовий екстракт Бог дріжджовий екстракт Бг 99 рідкий кукурудзяний екстракт 5гBefore sterilization, the pH of the medium was brought up to 6.0 and sterilization was carried out at 12122 for 35 minutes. The obtained shk seed culture was inoculated into 5 liters of bioconversion medium P12, sterilized in a fermenter. (Te) 20 The composition of medium P12: c» glucose 1g malt extract God yeast extract Bg 99 liquid corn extract 5g

ГФ) МазОдх7НгОо 1гGF) MazOdh7NgOo 1g

ГФ Тмжееп-80 шо ОБГ в 1000мл водопровідної води. 60 Перед стерилізацією рН середовища довели до 7,0 і проводили стерилізацію при 121920 45 хвилин.GF Tmzheep-80 sho OBG in 1000 ml of tap water. 60 Before sterilization, the pH of the medium was brought to 7.0 and sterilization was carried out at 121920 for 45 minutes.

Ферментацію, введення субстрату і біоконверсію проводили відповідно до Прикладу 2. По закінченні біоконверсії правастатин, що утворився, з концентрацією 6б2Омкг/мл ізолювали таким чином: рН 5,15л бульйону, що містить 620мкг/мл правастатину, довели 2М гідроксидом натрію до величини 9,5, потім перемішували при кімнатній температурі 1 годину. Бульйон профільтрували і міцелій промили шляхом бо утворення суспензії в 1 х 2л і потім їх Обл води. Фільтрати об'єднали і рН водного розчину відрегулювалиFermentation, introduction of the substrate and bioconversion were carried out according to Example 2. At the end of the bioconversion, the resulting pravastatin with a concentration of 6b2Omkg/ml was isolated as follows: the pH of 5.15 liters of broth containing 620μg/ml of pravastatin was adjusted to 9 with 2M sodium hydroxide. 5, then stirred at room temperature for 1 hour. The broth was filtered and the mycelium was washed by forming a suspension in 1 x 2 liters and then adding them to water. The filtrates were combined and the pH of the aqueous solution was adjusted

2090-ною сірчаною кислотою до величини 3,7 і екстрагували 2,5л, потім 1,5л етилацетату. Етилацетатні екстракти об'єднали, промили 2х Обл води і додали 1,95г дициклогексиламіну. Етилацетатний екстракт концентрували при 402С до 200мл при зниженому тиску і в концентрат знов додали 0,195г дициклогексиламіну, потім перемішували б годин при 1520. Осаджену кристалічну речовину відфільтрували, промили 20мл і 15мл етилацетату і висушили при 409С. Таким способом отримали 3,51г неочищеного продукту. Після перекристалізацій неочищеного продукту в ацетоно-етанольній суміші отримали 3,05г дициклогексиламінової солі правастатину (температура плавлення: 162-1682С), яку перетворили в правастатин відповідно до Прикладу 5.with 2090 sulfuric acid to a value of 3.7 and extracted 2.5 l, then 1.5 l of ethyl acetate. The ethyl acetate extracts were combined, washed with 2 mL of water, and 1.95 g of dicyclohexylamine was added. The ethyl acetate extract was concentrated at 402C to 200ml under reduced pressure and 0.195g of dicyclohexylamine was again added to the concentrate, then stirred for 1520 hours. The precipitated crystalline substance was filtered, washed with 20ml and 15ml of ethyl acetate and dried at 409C. In this way, 3.51 g of crude product was obtained. After recrystallization of the crude product in an acetone-ethanol mixture, 3.05 g of the dicyclohexylamine salt of pravastatin (melting point: 162-1682C) were obtained, which was converted into pravastatin according to Example 5.

Приклад 7Example 7

Ферментацію, введення субстрату і біоконверсію проводили з використанням штаму МогіегеПйа тасиїайга поу. врес. Е-97 |ІМСАІМ(Р)Е 001266), як описано в Прикладі 2. Правастатин, отриманий в результаті біоконверсії, ізолювали з бульйону таким чином. 5 літрів культурального бульйону, що містить правастатин з концентрацією б5Омкг/мл, профільтрували через фільтрувальну тканину. Міцелій грибка перемішували в 2 літрах 0,1М розчину гідроксиду натрію протягом 2 годин, потім профільтрували. Два фільтрати об'єднали і рН довели до 3,5-4,0 1595-ною сірчаною кислотою. Потім розчин екстрагували 2х 1,8л етилацетату. Об'єднані етилацетатні фази промили 80Омл води. Потім додали 40Омл деіонізированої води і рН суміші відрегулювали 1М гідроксидом натрію до величини 8,0-8,5. Суміш перемішували 15 хвилин, потім фази розділили. До етилацетатної фази додали ЗО0Омл води і рН відрегулювали до 8,0-8,5. Після перемішування протягом 15 хвилин фази розділили. ЗООмл води знов додали до етилацетатної фази і рН відрегулювали до 8,0-9,5. Потім суміш перемішували 15 хвилин. Дві фази знов розділили. Всі водні фази об'єднали і рН відрегулювали 1590-ною сірчаною кислотою до 3,5-4,0, потім екстрагували Зх ЗбООмл етилацетату. Об'єднані етилацетатні екстракти промили 150мл води, висушили безводним сульфатом натрію і профільтрували. Потім 15О0мольбо діоктиламіну (з розрахунку на вміст правастатину) додали до етилацетатного с 29 екстракту. Етилацетат випарили до об'єму близько 1/10 і додавали ацетон до випадання осаду. Суміш Ге) витримували при 59 протягом ночі. Осад відфільтрували на фільтрі 5-4, промили 20мл ацетону і потім 20мл п-гексану і висушили під вакуумом при кімнатній температурі. 3,3г отриманої неочищеної діоктиламінової солі правастатину перекристалізували з 20мл ацетону з отриманням 2,7г чистої діоктиламінової солі правастатину.Fermentation, introduction of the substrate and bioconversion were carried out using the strain MogiegePia tasiyaiga pou. September E-97 |IMSAIM(R)E 001266), as described in Example 2. Pravastatin, obtained as a result of bioconversion, was isolated from the broth as follows. 5 liters of culture broth containing pravastatin with a concentration of 5 Ωkg/ml was filtered through a filter cloth. The mycelium of the fungus was stirred in 2 liters of 0.1M sodium hydroxide solution for 2 hours, then filtered. The two filtrates were combined and the pH was adjusted to 3.5-4.0 with 1595 sulfuric acid. Then the solution was extracted with 2 x 1.8 liters of ethyl acetate. The combined ethyl acetate phases were washed with 80 ml of water. Then 40 Oml of deionized water was added and the pH of the mixture was adjusted to 8.0-8.5 with 1M sodium hydroxide. The mixture was stirred for 15 minutes, then the phases were separated. 300 ml of water was added to the ethyl acetate phase and the pH was adjusted to 8.0-8.5. After stirring for 15 minutes, the phases were separated. ZOO ml of water was again added to the ethyl acetate phase and the pH was adjusted to 8.0-9.5. Then the mixture was stirred for 15 minutes. The two phases were separated again. All aqueous phases were combined and the pH was adjusted with 1590 sulfuric acid to 3.5-4.0, then extracted with 300 ml of ethyl acetate. The combined ethyl acetate extracts were washed with 150 ml of water, dried with anhydrous sodium sulfate and filtered. Then 15O0molbo dioctylamine (based on the content of pravastatin) was added to the ethyl acetate c 29 extract. Ethyl acetate was evaporated to a volume of about 1/10 and acetone was added until precipitation. The mixture (He) was kept at 59 overnight. The precipitate was filtered on a 5-4 filter, washed with 20 ml of acetone and then with 20 ml of p-hexane and dried under vacuum at room temperature. 3.3 g of the obtained crude dioctylamine salt of pravastatin was recrystallized from 20 ml of acetone to obtain 2.7 g of pure dioctylamine salt of pravastatin.

Температура плавлення: 143-1462С. Діоктиламінову сіль правастатину перетворили в правастатин по методиці, о приведеній в Прикладі 5. Ге)Melting point: 143-1462C. The dioctylamine salt of pravastatin was converted into pravastatin according to the method given in Example 5.

Приклад 8Example 8

Шляхом розвитку гідроксилюючої активності штаму МогіегеМйа тасціаїа п. зрес. Е-97, ізольованого з т природного середовища мешкання, який здатний б ДВ -гідроксилювати компактин, в ході дослідів по «9 мутації-селекції і ферментативній індукції, детально описаних вище, отримали мутантний штам МогіегейПйа тасціайа п. зр. Е-97/15/13 |(МСАІМ(Р)Е 0012671. геBy developing the hydroxylating activity of the strain MogiegeMya tasciaia p. zres. E-97, isolated from the natural habitat, which would be able to DV-hydroxylate compactin, in the course of experiments on "9 mutation-selection and enzymatic induction, described in detail above, obtained a mutant strain MogiegeiPia tasciaia p. zr. E-97/15/13 | (MSAIM(R)E 0012671.

Штам МогііегеНйа тасціайа п. зр. Е-97/15/13 ІМСАМ(Р) 001267), ізольований нами, культивували на середовищі косого агару М5 при 282С протягом 7 днів.Strain MohiiegeNya tasciaia p. zr. E-97/15/13 ИМСАМ(Р) 001267), isolated by us, was cultivated on M5 oblique agar medium at 282С for 7 days.

Склад агаровому середовищі М5: « 70 глюкоза Аг 8 с солодовий екстракт 1ог :з» дріжджовий екстракт Аг агар 20г в 1000мл водопровідної води. 7 Спори вимили з агарових культур 5 мілілітрами 0,995 розчину хлориду натрію, потім після перенесення оз суспензії спор в стерильну чашку Петрі її опромінювали ультрафіолетовим світлом протягом 1хв. Після цього до суспензії спор додали М-метил-М'-нітро-М-нітрозогуанідин при кінцевій концентрації 200Омкг/мл. Потім шк суспензію перенесли в 100-мл колбу Ерленмейера і струшували при 282С зі швидкістю 150об/хв. протягом (Се) 20 20хв. Після цього спори осадили шляхом центрифугування з швидкістю 4000об/хв. протягом 1Охв., потім суспендували в стерильному 0,995 розчині хлориду натрію. Суспензію розподілили по агаровій пластині МО-МВ, с» що містить 1Омкг/мл беномілу і 195 дефібрильованої крові.The composition of agar medium M5: « 70 glucose Ag 8 s malt extract 1 g : with» yeast extract Ag agar 20 g in 1000 ml of tap water. 7 Spores were washed from agar cultures with 5 milliliters of 0.995 sodium chloride solution, then after transferring the spore suspension to a sterile Petri dish, it was irradiated with ultraviolet light for 1 minute. After that, M-methyl-M'-nitro-M-nitrosoguanidine was added to the spore suspension at a final concentration of 200 Ωkg/ml. Then the shk suspension was transferred to a 100-ml Erlenmeyer flask and shaken at 282C at a speed of 150 rpm. during (Se) 20 20 min. After that, the spores were precipitated by centrifugation at a speed of 4000 rpm. for 1 hour, then suspended in a sterile 0.995 sodium chloride solution. The suspension was distributed on an agar plate MO-MV, c" containing 1Okg/ml benomyl and 195 defibrillated blood.

Склад середовища МО-УВ: 99 глюкоза 40гThe composition of the MO-UV medium: 99 glucose 40g

ГФ) аспарагін 2г пептон 2,5г о дигідрофосфат калію 0,5г агар 20г 60 в 990мл дистильованої води; після стерилізації в середовище додали 1Омл бичачої крові і 1Омг беномилу.GF) asparagine 2g peptone 2.5g potassium dihydrogen phosphate 0.5g agar 20g 60 in 990ml of distilled water; after sterilization, 1 Oml of bovine blood and 1 Omg of benomyl were added to the medium.

Агарові пластини інкубували при 282С протягом 7 днів, колонії, що потім зросли, перенесли шляхом випадкового вибору в пробірки, що містять агарове середовище Р5.Agar plates were incubated at 282C for 7 days, colonies that then grew were transferred by random selection to test tubes containing P5 agar medium.

Склад середовища Р: б5 глюкоза 40г мікологичний пептон 1ог агар 15г в 100Омл дистильованої води. й й й йThe composition of medium P: b5 glucose 40g mycological peptone 1g agar 15g in 100Oml of distilled water. y y y

Перед стерилізацією рН середовища довели до величини 5,6-5,7. Стерилізацію проводили при 12120 протягом 20хв.Before sterilization, the pH of the medium was adjusted to 5.6-5.7. Sterilization was carried out at 12120 for 20 minutes.

Агарові культури інкубували при 282С 12 днів і їх продуктивність відносно правастатину досліджували у колбі, що струшується, як описано в Прикладі 1. Цим способом вибрали мутантний штам МогііегеїМа тасцицїайа п. /уо0 8р. Е-97/15/13, який виробляв правастатин, перевищуючи 6095-ну швидкість конверсії з внесеного субстрату у вигляді натрієвої солі компактинової кислоти при її концентрації 100Омкг/мл.The agar cultures were incubated at 282C for 12 days and their productivity relative to pravastatin was studied in a shake flask as described in Example 1. In this way, a mutant strain of MogiiegeiMa tasciciaia p. /uo0 8r was selected. E-97/15/13, which produced pravastatin, exceeding the 6095th conversion rate from the introduced substrate in the form of the sodium salt of compactic acid at its concentration of 100 Ωkg/ml.

Фермент гідроксилазу штаму МогііегеНйа тасціаєа п. зр. Е-97/15/13 індукували шляхом культивування на агаровому середовищії МО-МВ, що містить 100мкг/мл 8-дез(2-метилбутирил)-компактин і/або компактин. Після випадкового вибору колоній, що зросли, їх перенесли в індуктор, що містить косячки з середовищем МО-МВ. 7/5 Продуктивність відносно правастатину агарових культур, що зросли, досліджували способом, описаним вHydroxylase enzyme of the strain MohiiegeNya tasciaea p. zr. E-97/15/13 was induced by cultivation on agar medium MO-MV containing 100μg/ml 8-des(2-methylbutyryl)-compactin and/or compactin. After random selection of growing colonies, they were transferred to an inducer containing shoals of MO-MV medium. 7/5 Productivity relative to pravastatin of the agar cultures that grew was studied by the method described in

Прикладі 1, з тією різницею, що введення компактинового субстрату в кількості Х0Омкг/мл проводили з 4-го дня ферментації і протягом наступних 11 днів, і натрійкомпактиновий субстрат додавали поступово протягом дванадцяти днів, з повним перетворенням в правастатин. До кінця біоконверсії, що проводиться в 50 колбах, що струшуються з культурами з З0г натрійкомпактинового субстрату, створення 18,5г правастатину вимірювали 2о шляхом НРІС. Витягування правастатину з об'єднаних ферментаційних бульйонів проводили наступним способом.Example 1, with the difference that the introduction of the compactin substrate in the amount of X0Omkg/ml was carried out from the 4th day of fermentation and during the next 11 days, and the sodium compactin substrate was added gradually over twelve days, with complete conversion to pravastatin. By the end of the bioconversion, which is carried out in 50 shake flasks with cultures from 30g of sodium compactin substrate, the creation of 18.5g of pravastatin was measured 2o by NRIS. The extraction of pravastatin from the combined fermentation broths was carried out by the following method.

По закінченні ферментації рН 5,бБл бульйону з концентрацією правастатину 33бОмкг/мл відрегулювали 2090-ним розчином сірчаної кислоти до 3,5-3,7. Потім кислий розчин екстрагували 2,75л етилацетату. Фази розділили і отримали прозорий екстракт шляхом центрифугування з емульгованої органічної фази. Бульйон сч ов екстрагували ще два рази 1,37л етилацетату, як описано вище. Об'єднані етилацетатні екстракти промили 2 х 1,15л деіонізованої води, потім до етилацетатного розчину додали 150мольбо дибензиламіну (з розрахунку на о вміст правастатину, виміряний НРІ С). Етилацетатний розчин концентрували під вакуумом до об'єму близько 0,23л. Ще 20мольоо дибензиалміну додали до концентрату і розчин осаду витримували протягом ночі при 0-56.At the end of fermentation, the pH of 5.bL of the broth with a pravastatin concentration of 33bOmkg/ml was adjusted to 3.5-3.7 with a 2090 solution of sulfuric acid. Then the acidic solution was extracted with 2.75 l of ethyl acetate. The phases were separated and a clear extract was obtained by centrifugation from the emulsified organic phase. The broth was extracted two more times with 1.37 l of ethyl acetate, as described above. The combined ethyl acetate extracts were washed with 2 x 1.15 l of deionized water, then 150 mol of dibenzylamine was added to the ethyl acetate solution (based on the content of pravastatin measured by NRI C). The ethyl acetate solution was concentrated under vacuum to a volume of about 0.23 l. Another 20 moles of dibenzylamine was added to the concentrate and the precipitate solution was kept overnight at 0-56.

Осаджену дибензилову сіль правастатинової кислоти відфільтрували, потім осад промили шляхом со суспендування його в охолодженому етилацетаті і потім два рази в п-гексані, після чого висушили при 40-502С під вакуумом. Отриманий неочищений продукт (22,4г) розчинили в 0,67л ацетону при температурі 62-669С і Ф прояснили розчин 2,2г деревного вугілля. Після прояснення ацетоновий фільтрат концентрували під вакуумом « до об'єму 0,5бл. Кристали, осаджені з концентрату, розчинили знов при вищезгаданій температурі, потім розчин с охолодили до кімнатної температури. Після цього перекристалізацію продовжували протягом ночі при 0-5 96.The precipitated pravastatin acid dibenzyl salt was filtered, then the precipitate was washed by suspending it in cooled ethyl acetate and then twice in n-hexane, after which it was dried at 40-502C under vacuum. The obtained crude product (22.4g) was dissolved in 0.67l of acetone at a temperature of 62-669C and 2.2g of charcoal solution was clarified. After clarification, the acetone filtrate was concentrated under vacuum to a volume of 0.5 ml. Crystals precipitated from the concentrate were dissolved again at the above-mentioned temperature, then the solution was cooled to room temperature. After that, recrystallization was continued overnight at 0-5 96.

Осаджені кристали відфільтрували і промили шляхом суспендування два рази в охолодженому ацетоні і два і - рази в п-гексані. Перекристалізовану дибензилову сіль правастатинової кислоти висушили під вакуумом при 40-50. Отриману дибензилову сіль правастатинової кислоти (14,8г) розчинили при 40-44 в 740мл суміші етилацетату-етанолу (9:1), потім до розчину додали 11Омольбо гідроксиду натрію у вигляді 1М етанольного « розчину. Перемішування отриманого осадженого розчину продовжували півгодини при кімнатній температурі, потім добилися повного осадження внаслідок застосування охолоджування у льоді протягом 1-1,5г. Після цього о, с осад відфільтрували і промили 2х 150мл охолодженого етилацетату і 2х 150мл п-гексану і, нарешті, висушили з» під вакуумом при 40-502С. Отриманий правастатин розчинили в етанолі, прояснили 1,0г деревного вугілля, потім кристалізували з етанол-етилацетатної суміші. Таким способом отримали 9,4г правастатину з фізичними властивостями, відповідними даним, приведеним в Прикладі 1.Precipitated crystals were filtered and washed by suspending twice in cooled acetone and twice in p-hexane. The recrystallized dibenzyl salt of pravastatin acid was dried under vacuum at 40-50. The obtained dibenzyl salt of pravastatin acid (14.8 g) was dissolved at 40-44 in 740 ml of a mixture of ethyl acetate-ethanol (9:1), then 11 mmol of sodium hydroxide was added to the solution in the form of a 1 M ethanol solution. Stirring of the obtained precipitated solution was continued for half an hour at room temperature, then complete precipitation was achieved due to the application of cooling in ice for 1-1.5 h. After that, the precipitate was filtered and washed with 2 x 150 ml of cooled ethyl acetate and 2 x 150 ml of p-hexane and, finally, dried with" under vacuum at 40-502С. The obtained pravastatin was dissolved in ethanol, clarified with 1.0 g of charcoal, then crystallized from an ethanol-ethyl acetate mixture. In this way, 9.4 g of pravastatin with physical properties corresponding to the data given in Example 1 were obtained.

Хоча тут описані деякі переважні в цей час варіанти здійснення винаходу, досвідченим фахівцям в даній і області буде зрозуміло, що в описаних варіантах можуть бути зроблені видозміни і модифікації, що не виходять оз за рамки області, що охоплюється винаходом. Відповідно до цього мається на увазі, що винахід обмежений ї» тільки приведеною нижче формулою винаходу і відповідними правовими нормами. о 50 сю»Although some currently preferred embodiments of the invention are described herein, it will be understood by those skilled in the art that changes and modifications may be made to the described embodiments that do not go beyond the scope of the invention. Accordingly, it is implied that the invention is limited only by the following claims and the relevant legal regulations. at 50

Ф) іме) 60 б5F) name) 60 b5

11 дебе зб ко . з ОР и 4 Ж або у що , з НЕ: сх, бе Ре що я семи бе КУ шо: нн б - г, х 2 Лех че - й 4 мето Ши о11 debe zb ko . with ОР и 4 Ж or у что , with NE: сх, бе Re что я семи бе КУ шо: nn b - g, х 2 Leh che - и 4 meto Shi o

И3- у 12:I3- at 12:00

М р!M r!

Е ві м, 14 і ой с ть. в 6 ди. неE vi m, 14 and oi s t. at 6 d. not

Ї т я во й К о "Ле уд 24 ї С 25 "ч со з | КЗ ій 18 22 Л 16 п ге «Y t ya voy y K o "Le ud 24 th S 25 "h so z | KZ iy 18 22 L 16 p ge «

СТSt

35. 19 20 щі ва м й ї сб,35. 19 20 Wednesdays and Saturdays,

ТКА до" « дю Фіг.1 -в с . зTKA to" " du Fig. 1 - in c . z

Claims

Formula of the invention - 75 1. Microbiological method of obtaining the compound of formula (I) "OH with Mmasost r I 50 Go! but. (se) a s» shk and 4, Sha . is ns ho gyn rya СН СН Ф) 6 a vo from the substrate compound of the formula (II) b5

"OH o) koOos y no (0) a nn neo 70 СН СН where K means the ion of an alkali metal or ammonium, which includes the steps: (a) cultivation of a strain of filamentous mold fungi Mogiiegea tasciava capable of 6-hydroxylating the compound of formula (I) on a nutrient medium containing assimilable sources of carbon and nitrogen and mineral salts, (B) introduction of the substrate to be transformed into the developed culture of MopiegeMa tasiaia, (c) fermentation of the substrate until the completion of bioconversion, (4) separation of the compound of formula (I) from culture broth and (e) isolation of the compound of formula (1).

2. The method according to claim 1, in which said medium is a nutrient broth.

C. The method according to claim 2, in which the mentioned step of separating the compound of formula (I) from the culture broth is carried out by adsorption on an anion exchange resin. at

4. The method according to claim 2, in which the mentioned step of separating the compound of formula (I) from the culture broth is performed by extraction with a water-immiscible organic solvent followed by obtaining its lactone derivative or its salt with a secondary amine as an intermediate.

5. The method according to claim 2, in which the mentioned step of separating the compound of formula (I) from the culture broth o is performed by purifying the alkaline aqueous extract obtained from the extract in the organic solvent b of the fermentation broth, using chromatography on a nonionic adsorbent resin.

6. The method according to claim 1, in which the MogiegePya tasciaia strain is a MogiegePya tasciava strain. E-97, "deposited in the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary, under the registration number MSAY!M(R)E 001266. Zo

7. The method according to claim 1, in which the Mogiegeia tasciaia strain is a strain of Mogiegeia tasciaia p. gr. и- Е-97/15/13, deposited in the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary, under registration number МСАИМ(Р)Е 001267.

8. The method according to claim 1, in which the hydroxylase enzyme of the strain used for transformation is induced by 8-de(2-methylbutyryl)-compactin or compactin.

9. The method according to claim 2, in which the compound of the formula (II) as a substrate is added to the culture in parallel with the step C of introduction, and in which the introduction stage depends on the pH of the culture, and the amount of the introduced substrate is "» 0.5- 1.0 95 from the volume of the broth."

10. The method according to claim 1, in which the fermentation step is carried out on a medium containing a carbon source selected from the group including glucose, fructose and glycerol.

11. The method according to claim 1, in which the fermentation step is carried out on a medium containing a nitrogen source selected from the group consisting of soy flour, peptone, casein, yeast extract and meat extract. 2)

12. The method according to claim 2, in which the compound of formula (I), created during bioconversion, is separated from the culture broth by adsorption from the filtrate of the broth and from the washing water of the mycelium on an anion exchange resin, elution of the compound of formula (I) from the resin, complete transformation compound of formula (I) in its Ge) 20 dactone form, isolation of the lactone derivative, hydrolysis of the lactone derivative with sodium hydroxide and desalting of the compound of formula (I) on a nonionic adsorption resin. Fe"

13. The method according to claim 12, in which the mentioned anion exchange resin has a polystyrene-divinylbenzene skeleton, which carries active quaternary ammonium groups and is used to separate the compound of formula (I) from the broth filtrate. 59

14. The method according to claim 4, in which the compound of formula (I), created during bioconversion, is extracted in acidic HF) form from the broth, previously acidified to pH 3.5-3.7, or from the broth filtrate with a water-immiscible organic solvent. where

15. The method according to claim 14, in which said water-immiscible organic solvent is ethyl acetate.

16. The method according to claim 14, in which said water-immiscible organic solvent is isobutyl acetate. 6o

17. The method according to claim 5, in which the mentioned compound of formula (I) is extracted in the form of a sodium salt from an organic solvent with an aqueous solution of sodium hydroxide and purified on a nonionic adsorption resin.

18. The method according to claim 14, in which the mentioned compound of formula (I) is precipitated from the extract in crystalline form with a secondary amine containing alkyl, cycloalkyl, aralkyl or aryl substituents.

19. The method according to claim 18, in which the salt of a crystalline secondary amine is suspended in a mixture of an alkyl ether containing salt, acetic acid and water; an equivalent amount of sodium hydroxide is added to the suspension in the form of an aqueous solution, so that an organic phase and an aqueous phase are formed; organic and aqueous phases are separated; the aqueous phase is washed with isobutyl acetate, then clarified with activated carbon; and the aqueous solution is lyophilized.

20. The method according to claim 19, in which said alkyl ether is isobutyl ether.

21. The method according to claim 18, in which the salt of a crystalline secondary amine is suspended in an alcohol containing C 44. From the suspension, a solution of the compound of formula (I) is obtained by adding an ethanolic solution of sodium hydroxide; and the compound of formula (I) is precipitated from the solution with acetone.

22. The method according to claim 21, in which said alcohol, which contains C..4, is ethanol. 70

23. The method according to claim 18, in which the salt of a crystalline secondary amine is dissolved in a mixture of an alkyl ether containing C 4.4, an alkane carboxylic acid containing C 4.4, and an alcohol containing C 4.4, and the compound of the formula is precipitated from the solution (I) in crystalline form by adding sodium hydroxide.

24. The method according to claim 23, in which said mixture is a mixture of ethyl acetate-ethanol.

25. The method according to claim 19, in which pravastatin is isolated from the fermentation broth through the dibenzylamine salt 7/5 of the acid form of the compound of formula (1).

26. The method according to claim 19, in which the acid derivative of the compound of formula (I) is purified through its dicyclohexylamine salt.

27. The method according to claim 19, in which the acid derivative of the compound of formula (I) is purified through its dioctylamine salt.

28. The method according to claim 19, in which the compound of formula (I) is purified to at least 99.5 95 (when measured by HRIS) using gel chromatography.

29. The method according to claim 1, in which the mentioned Mogiegeia tasciaia strain is cultivated at a temperature from 2590 to -3096.

30. Biologically pure culture of the strain Mogiegeia ptasciaia p. zr. E-97, deposited in the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary, under accession number МСАЙМ(Р)Ж 001266, where the strain is capable of converting the compactin substrate to pravastatin by hydroxylation. at

31. Biologically pure culture of the strain Mogiegeia tasciaia p. zr. E-97/15/13, deposited in the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary, under accession number MSAIIM(RI)E 001267, where the strain is capable of converting the compactin substrate to pravastatin co via hydroxylation.

32. The culture of MogiiegeiIa, able to -hydroxylate the compound of formula (II) o "OH g) h )540/0/0; 7 so no i - iv, SCHO n ver: En - SN SV s ;" where K means the ion of an alkali metal or ammonium, which essentially consists of a new strain MogiiegeMa tasiyaia p. -I zr. E-97, deposited in the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary, under the registration number MSAI!M(R)E 001266. Mn 33. A culture of Mogilliea, capable of 6 5 -hydroxylating the compound of the formula (II) Щ» что) with that o ik KoOos 7 syu» t (6) and Н Ф) ін кю СНЗз СН 60 where K means the ion of an alkali metal or ammonium, consisting essentially of a new strain of Mogiegeia tasciaia p.

with E-97/15/13, deposited in the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary, under registration number МСАИМ(Р)Е 001267. bo Official Bulletin "Industrial Property". Book 1 "Inventions, useful models, topographies of integrated microcircuits", 2005, M 8, 15.08.2005. State Department of Intellectual Property of the Ministry of Education and Science of Ukraine. s o so Fo « so m. shi s ;» -I (95) sh» o 50 syu» F) ime) 60 b5