UA72796C2 - A method for the preparation of viable embryonic pluripotential progenital cells by means of collagenase - Google Patents
A method for the preparation of viable embryonic pluripotential progenital cells by means of collagenase Download PDFInfo
- Publication number
- UA72796C2 UA72796C2 UA2002097445A UA2002097445A UA72796C2 UA 72796 C2 UA72796 C2 UA 72796C2 UA 2002097445 A UA2002097445 A UA 2002097445A UA 2002097445 A UA2002097445 A UA 2002097445A UA 72796 C2 UA72796 C2 UA 72796C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- cells
- collagenase
- liver
- preparation
- viable
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 title claims abstract description 10
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 title claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 abstract description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000003366 colagenolytic effect Effects 0.000 description 5
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 201000010000 Agranulocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 102000056189 Neutrophil collagenases Human genes 0.000 description 1
- 108030001564 Neutrophil collagenases Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012865 aseptic processing Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 231100000052 myelotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002556 myelotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000004258 portal system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-N sodium;5-ethyl-5-pentan-2-yl-1,3-diazinane-2,4,6-trione Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Опис винаходуDescription of the invention
Винахід відноситься до галузі медицини та біології і може бути використаним у технології створення 2 препаратів для клітинної терапії.The invention relates to the field of medicine and biology and can be used in the technology of creating 2 drugs for cell therapy.
У теперішній час у клітинній трансплантології застосовуються способи виділення і кріоконсервації ембріональних клітин, які засновані на механічному роздрібленні тканин ембріону (гомогенізація) і фільтрації, що знижує вихід життєздатних клітин до 0,1-5,0-10/мл |Застосування трансплантації кріоконсервованих гемопоетичних клітин ембріональної печінки в комплексному лікуванні хворих на злоякісні новоутворення: Метод, 70 рекомендації. Автори: Гриневич Ю.Я., Смикодуб О.І, Бендюг Г.Д. та ін. - Київ, 1999. - 9с. Лікування хворих з вперше виявленим інсулінозалежним цукровим діабетом гемопоетичними клітинами ембріональної печінки:Currently, in cell transplantology, methods of selection and cryopreservation of embryonic cells are used, which are based on mechanical crushing of embryo tissues (homogenization) and filtration, which reduces the yield of viable cells to 0.1-5.0-10/ml | Application of transplantation of cryopreserved hematopoietic cells embryonic liver in complex treatment of patients with malignant neoplasms: Method, 70 recommendations. Authors: Hrynevych Yu.Ya., Smikodub O.I, Bendyug G.D. etc. - Kyiv, 1999. - 9p. Treatment of patients with newly discovered insulin-dependent diabetes mellitus with embryonic liver hematopoietic cells:
Метод, рекомендації. Автори: Єфімов А.С., Смикодуб О.І., Новицька А.В. - Київ, 2000. - 16бс. Лікування мієлотоксичного агранулоцитозу у хворих на гострий лейкоз гемопоетичними клітинами ембріональної печінки людини: Метод, рекомендації. Автори: Смикодуб О.І., Гайдукова СМ., Третяк Н.М., Снігир Н.В. - Київ, 2001. - 19 12б. Лікування анемії у хворих на інсулінозалежний цукровий діабет гемопоетичними клітинами ембріональної печінки людини: Метод, рекомендації. Автори: Єфімов А.С., Смикодуб О.І., Новицька А.В. - Київ, 2002. - 16сі.Method, recommendations. Authors: Yefimov A.S., Smykodub O.I., Novytska A.V. - Kyiv, 2000. - 16bs. Treatment of myelotoxic agranulocytosis in patients with acute leukemia with hematopoietic cells of human embryonic liver: Method, recommendations. Authors: Smykodub O.I., Haydukova SM., Tretyak N.M., Snigyr N.V. - Kyiv, 2001. - 19 12b. Treatment of anemia in patients with insulin-dependent diabetes mellitus with hematopoietic cells of the human embryonic liver: Method, recommendations. Authors: Yefimov A.S., Smykodub O.I., Novytska A.V. - Kyiv, 2002. - 16si.
Для підвищення кількості стовбурових клітин застосовують їх стимуляцію ростовими факторами і культивацію (5 5817773 А. УМізоп Е.І.., сзабгоме У. Способ стимуляции, получения, культивирования и трансплантации стволовьїх клеток с помощью ростовьїх факторов фибробластов. - Изобретения стран мира. - 1999. -Вьіп.8, Мо19. 20 -С.74), що може змінювати властивості клітин щодо диференціювання аж до пухлинної трансформації.To increase the number of stem cells, their stimulation with growth factors and cultivation are used (5 5817773 A. UMizop E.I., szabgome U. The method of stimulation, production, cultivation and transplantation of stem cells with the help of growth factors of fibroblasts. - Izobreteniya stran mira. - 1999 . -Vyip.8, Mo19. 20 -S.74), which can change the properties of cells regarding differentiation up to tumor transformation.
Мета винаходу.The purpose of the invention.
Розробити методику виділення підвищеної кількості життєздатних ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин без застосування факторів, що стимулюють проліферацію.To develop a technique for the selection of an increased number of viable embryonic pluripotent progenitor cells without the use of factors that stimulate proliferation.
Поставлена мета досягається тим, що ембріональні плюріпотентні прогеніторні клітини виділяються шляхом с 25 біохімічної обробки сполучнотканинної строми органів ембріону колагеназою іп зі та іп міго. Ге)The set goal is achieved by the fact that embryonic pluripotent progenitor cells are isolated by means of 25 biochemical processing of the connective tissue stroma of the organs of the embryo with collagenase ip zi and ip migo. Gee)
Результати експериментальних досліджень.Results of experimental studies.
Дослідження виконані на білих щурах. Вагітну самку вводили в наркоз (натрію етамінал - 40мг на кг маси тіла). Після асептичної обробки операційного поля (962 етиловий спирт, йод) проводили серединну лапаротомію по Іпеа аіра. Строк вагітності самки - 18-19 днів. Правий (7 ембріонів) і лівий (7 ембріонів) роги матки ї-оі 30 розрізали ножицями вздовж. Між ембріонами роги матки послідовно перетискували затискувачами типу "москіт". д)Studies were performed on white rats. A pregnant female was put under anesthesia (sodium ethaminal - 40 mg per kg of body weight). After aseptic processing of the operative field (962 ethyl alcohol, iodine), a median laparotomy was performed through Ipea air. The gestation period of a female is 18-19 days. The right (7 embryos) and left (7 embryos) horns of the uterus were cut lengthwise with scissors. Between the embryos, the horns of the uterus were successively compressed with "mosquito" clamps. e)
Після розтину рогів матки і плідних оболонок ембріонів переносили у стерильні флакони з охолодженим до 49С середовищем Хенкса з гентаміціном (кінцева концентрація - 0,00195). У печінку ембріонів через портальну ге систему вводили під тиском 0,5мл колагенолітичної суміші (20,О0мл середовища Хенкса ї-50,О0мкл 1095 Сасі» сем 35 я1омг колагенази (Зідте) т44Мг НЕРЕЗ (5ідта))|. Через Зохв. після потрійної промивки у середовищі ДМЕМ м печінку кожного ембріона роздрібняли за допомогою хірургічного очного пінцету в 2,0мл середовища Хенкса.After dissection of the uterine horns and amniotic membranes, the embryos were transferred to sterile vials with Hanks medium cooled to 49C with gentamicin (final concentration - 0.00195). 0.5 ml of a collagenolytic mixture (20.00 ml of Hanks' medium - 50.00 μl 1095 Sasi» sem 35 100 mg collagenase (Zidte) t44 Mg NEREZ (5idta)) was injected into the liver of the embryos through the portal system under pressure. Through Storage. after triple washing in DMEM medium, the liver of each embryo was minced using surgical eye forceps in 2.0 ml of Hanks' medium.
Після центрифугування (1000об/хв - ЗОс) супернатант видаляли, осад відновлювали в 2,0мл колагенолітичного розчину (20,О0мл середовища Хенкса ї-50,О0мкл 1095 СасСі» «1Омг колагенази (Зідта) н44мг НЕРЕЗ (Зідта)).After centrifugation (1000 rpm - ZOc), the supernatant was removed, the sediment was reconstituted in 2.0 ml of collagenolytic solution (20.00 ml of Hanks' medium 1-50,00 μl 1095 SasSi" "100 mg of collagenase (Zidta) and 44 mg NEREZ (Zidta)).
Пробирки інкубували у водяному термостаті при 37,02 впродовж 45хв. при постійному перемішуванні. Після « 20 центрифугування (1000об/хв. - б0с) осад відновлювали в 2,0мл середовища Хенкса. Інкубацію клітин печінки в -в колагенолітичному розчині проводили З рази, кожен раз перевіряючи кількість життєздатних клітин в камері с Горяєва мікроскопічно при забарвленні клітин трипановим синім. :з» Результати кількісної динаміки виділення життєздатних клітин за звичайною і запропонованою нами методикою (по 7 ембріонів у кожному дослідженні) свідчать, що одноразове застосування колагенази збільшує вихід життєздатних ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин печінки на 4595, дворазове - на 367905, -1 що триразове - на два порядки.The tubes were incubated in a water thermostat at 37.02 for 45 minutes. with constant stirring. After 20 centrifugations (1000 rpm - b0s), the sediment was reconstituted in 2.0 ml of Hanks medium. Incubation of liver cells in a collagenolytic solution was carried out 3 times, each time checking the number of viable cells in the chamber with Goryaev microscopically while staining the cells with trypan blue. :z» The results of the quantitative dynamics of the selection of viable cells according to the usual and our proposed method (7 embryos in each study) show that a single application of collagenase increases the output of viable embryonic pluripotent liver progenitor cells by 4595, twice - by 367905, -1 that three times - by two orders of magnitude.
Висновок. іме) Результати дослідження засвідчують значне збільшення виходу життєздатних ембріональних плюріпотентних -1 прогеніторних клітин печінки без застосування факторів стимуляції їх росту. 50 Відповідність критерію "новизна" даного способу забезпечує те, що для виділення підвищеної кількості се) життєздатних ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин печінки застосовується не механічний, аConclusion. име) The results of the study demonstrate a significant increase in the yield of viable embryonic pluripotent -1 liver progenitor cells without the use of factors to stimulate their growth. 50 Compliance with the "novelty" criterion of this method ensures that for the selection of an increased number of viable embryonic pluripotent liver progenitor cells, not mechanical, but
Ф біохімічний метод їх відокремлення від сполучнотканинної строми.Ф biochemical method of their separation from the connective tissue stroma.
Відповідність критерію "суттєві відмінності" даного способу забезпечує те, що на відміну від відомих раніше способів виділення ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин збільшення їх кількості і життєздатності досягається шляхом обробки сполучнотканинної строми печінки ембріону колагеназою іп віш та іп міго. (Ф) Відповідність даного винаходу критерію "позитивний ефект" забезпечується результатами г) експериментальних досліджень, які засвідчують збільшення виходу життєздатних ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин на два порядки. 60 б5Compliance with the "significant differences" criterion of this method ensures that, unlike previously known methods of isolating embryonic pluripotent progenitor cells, increasing their number and viability is achieved by treating the connective tissue stroma of the embryo's liver with collagenase ip visch and ip migo. (F) Compliance of this invention with the "positive effect" criterion is ensured by the results of d) experimental studies, which demonstrate an increase in the yield of viable embryonic pluripotent progenitor cells by two orders of magnitude. 60 b5
ВIN
1010
АAND
1 1 2 З1 1 2 Z
Логарифм кількості життєздатних клітин (10У/мл) пря їх виділенні шляхом гомогенізації та при застосуванні колагенолітичної суміші м й с: с в А - кількість життєздатних клітин, отримання методом гомогенізації і фільтрування оThe logarithm of the number of viable cells (10 U/ml) after their isolation by homogenization and when using a collagenolytic mixture of m and s: c in A - the number of viable cells, obtained by the method of homogenization and filtration o
В - кількість життєздатних клітини, отриманих з використачням колагенолітичної суміші со зо І1- одноразова обробка колагеназою 2 -- дворазова обробка колагеназою ФB - the number of viable cells obtained with the use of collagenolytic mixture со со И1 - one-time treatment with collagenase 2 - two-time treatment with collagenase Ф
З - триразова обробка колагеназою - фіг. см м. « ші сC - triple treatment with collagenase - fig. cm m. « shi p
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UA2002097445A UA72796C2 (en) | 2002-09-13 | 2002-09-13 | A method for the preparation of viable embryonic pluripotential progenital cells by means of collagenase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UA2002097445A UA72796C2 (en) | 2002-09-13 | 2002-09-13 | A method for the preparation of viable embryonic pluripotential progenital cells by means of collagenase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA72796C2 true UA72796C2 (en) | 2005-04-15 |
Family
ID=34884626
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2002097445A UA72796C2 (en) | 2002-09-13 | 2002-09-13 | A method for the preparation of viable embryonic pluripotential progenital cells by means of collagenase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA72796C2 (en) |
-
2002
- 2002-09-13 UA UA2002097445A patent/UA72796C2/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2322497C2 (en) | Isolated homozygous stem cell (variants), method for its preparing (variants), method for preparing required cell-ancestor, differentiated cell, group of differentiated cells or tissue type | |
| Jang et al. | Cryopreservation and its clinical applications | |
| Jin et al. | A novel two-step strategy for in vitro culture of early-stage ovarian follicles in the mouse | |
| Crozet et al. | Developmental competence of goat oocytes from follicles of different size categories following maturation, fertilization and culture in vitro | |
| Supeno et al. | IGF-1 acts as controlling switch for long-term proliferation and maintenance of EGF/FGF-responsive striatal neural stem cells | |
| CN103710299A (en) | In-vitro culture solution for culturing swine parthenogenetic activated embryos and swine in-vitro fertilized embryos | |
| JP2022043344A (en) | Methods relating to pluripotent cells | |
| Lebedeva et al. | Dynamics of morphofunctional changes in aging bovine ova during prolonged culture in vitro | |
| CH700956B1 (en) | Transferring human blastocyst-derived stem (hBS) cells into a feeder-free culture system, useful in treating cardio-related diseases, comprises transferring the hBS cells from feeder to feeder-free culture by mechanical treatment | |
| Hajian et al. | Effects of ovary storage temperature and embryo vitrification on somatic cell nuclear transfer outcomes in goats | |
| CN102533642B (en) | Kit for in-vitro primordial follicle activation | |
| CN110684718B (en) | Method for efficiently separating and culturing primary hepatocytes of fugu obscurus | |
| Stecher et al. | Case report: live birth following ICSI with non-vital frozen-thawed testicular sperm and oocyte activation with calcium ionophore | |
| UA72796C2 (en) | A method for the preparation of viable embryonic pluripotential progenital cells by means of collagenase | |
| Lopata | History of the Egg in Embryology | |
| RU2794773C1 (en) | Method for cultivating biomass of myoblasts obtained from sterlet muscles | |
| RU2525714C1 (en) | METHOD OF PRODUCTION OF SHEEP EMBRYOS in vitro | |
| Feltrin et al. | Effects of oocyte source, cell origin, and embryo reconstruction procedures on in vitro and in vivo embryo survival after goat cloning | |
| Nagashima et al. | Extracellular vesicles and assisted reproductive technology | |
| RU2807492C1 (en) | Technology for human oocyte maturation at gv stage using extracellular follicular fluid vesicles in fertilization programs in vitro: v-ivm (extracellular vesicles in vitro maturation) | |
| Kostaman et al. | Primordial germ cells profile incubated for 24 hours in phosphate buffer saline [-] solution | |
| Malik et al. | Peritoneal fluid from rabbits or goats as media for in vitro maturation, fertilization and initial culture of caprine oocytes | |
| Qiu et al. | Considerations in Immature Oocyte Cryopreservation | |
| Losonczi | Stress-preconditioning as a novel tool to improve assisted reproductive procedures | |
| Kharche et al. | Parthenogenesis |