RU2525714C1 - METHOD OF PRODUCTION OF SHEEP EMBRYOS in vitro - Google Patents
METHOD OF PRODUCTION OF SHEEP EMBRYOS in vitro Download PDFInfo
- Publication number
- RU2525714C1 RU2525714C1 RU2013121616/10A RU2013121616A RU2525714C1 RU 2525714 C1 RU2525714 C1 RU 2525714C1 RU 2013121616/10 A RU2013121616/10 A RU 2013121616/10A RU 2013121616 A RU2013121616 A RU 2013121616A RU 2525714 C1 RU2525714 C1 RU 2525714C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- medium
- fertilization
- oocytes
- added
- sperm
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к области биотехнологии, к клеточной инженерии, в частности к способу получения эмбрионов овец in vitro, и может быть использовано для культивирования животных клеток, а именно ооцитов и эмбрионов овец вне организма.The invention relates to the field of biotechnology, to cellular engineering, in particular to a method for producing sheep embryos in vitro, and can be used to cultivate animal cells, namely oocytes and sheep embryos outside the body.
Уровень техникиState of the art
Известен способ получения зародышей овец после созревания и оплодотворения ооцитов и культивирования зародышей in vitro, включающий получение яичников овец от половозрелых особей после убоя и транспортировку в лабораторию при 30-35°C в течение 1-3 часов, причем ооциты получают методом аспирации фолликулов диаметром 2-6 мм в среде ТСМ 199 с добавлением HEPES и 50 ЕД/мл гепарина. Далее ооциты культивируют в среде SOF с HEPES, с добавлением аминокислот, 2 мМ L-глютамина, 0,05 ЕД/мл ФСГ, 0,2 мМ пирувата Na, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% сыворотки плода коровы. Ооциты помещают в капли среды объемом 45 мкл под стерильным парафиновым маслом. Время культивации составляет 24 часа при температуре 39°C, влажности 100%, содержании CO2 5%.A known method for producing sheep embryos after maturation and fertilization of oocytes and culturing embryos in vitro, including obtaining ovaries of sheep from sexually mature individuals after slaughter and transportation to the laboratory at 30-35 ° C for 1-3 hours, the oocytes obtained by follicle aspiration with a diameter of 2 -6 mm in TCM 199 medium with the addition of HEPES and 50 U / ml heparin. The oocytes are then cultured in SOF with HEPES, supplemented with amino acids, 2 mM L-glutamine, 0.05 U / ml FSH, 0.2 mM Na pyruvate, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin and 10% fetal serum cows. Oocytes are placed in drops of medium with a volume of 45 μl under sterile paraffin oil. The cultivation time is 24 hours at a temperature of 39 ° C,
Для оплодотворения используют свежеполученную сперму барана, 100 мкл которой помещают в 1 мл среды SOF с добавлением 20 мМ HEPES и 8 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 45 минут инкубируют в термостате при 39°C. Далее супернатант в объеме 800 мкл отбирают в новую пробирку, дважды отмывают в 3 мл среды с центрифугированием при 200 оборотах в течение 3 минут. Для оплодотворения используют объем 5 мкл с содержанием сперматозоидов 1000000 в мл, который добавляют в каплю среды с добавлением 20% инактивированной сыворотки овец во время течки объемом 45 мкл, находящуюся под парафиновым маслом из расчета 10 ооцитов в одной капле. Оплодотворение производят в течение 22 часов при температуре 39°C, влажности 100%, содержании CO2 5%.For fertilization, freshly obtained ram sperm is used, 100 μl of which is placed in 1 ml of SOF medium supplemented with 20 mM HEPES and 8 mg / ml bovine serum albumin, 100 IU / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin and incubated for 45 minutes in an incubator at 39 ° C. Next, the supernatant in a volume of 800 μl was taken into a new tube, washed twice in 3 ml of medium with centrifugation at 200 rpm for 3 minutes. For fertilization, a volume of 5 μl with a sperm content of 1,000,000 per ml is used, which is added to a drop of medium with the addition of 20% inactivated sheep serum during estrus with a volume of 45 μl, which is under paraffin oil at the rate of 10 oocytes in one drop. Fertilization is carried out for 22 hours at a temperature of 39 ° C, a humidity of 100%, a CO 2 content of 5%.
После оплодотворения зиготы центрифугируют в течение 2-3 минут для удаления клеток кумулюса и помещают в капли среды объемом 20 мкл. В качестве среды используют среду SOF с добавлением 2% заменимых аминокислот, 1% незаменимых аминокислот, 1 мМ глютамина и 8 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Инкубация выполняют при температуре 39°C, содержании CO2 5%, содержании O2 7%. На 3 и 5 дни инкубации в среду добавляют по 10% сыворотки плода коровы. Культивирование продолжают до 8 дня (см. The Effect of Macromolecule Source and Type of Media During in vitro Maturation of Sheep Oocytes on Subsequent Embryo Development. / A. Shirazi, M.A. Ardali, E. Ahmadi, H. Nazari, M. Mamuee, B. Heidari. // J. Reprod. Infertil. - 2012. - Vol.13, №1. - P.13-19).After fertilization, the zygotes are centrifuged for 2-3 minutes to remove cumulus cells and placed in drops of medium with a volume of 20 μl. The medium used is SOF medium with the addition of 2% essential amino acids, 1% essential amino acids, 1 mM glutamine and 8 mg / ml bovine serum albumin. Incubation is performed at a temperature of 39 ° C, a CO 2 content of 5%, an O 2 content of 7%. On days 3 and 5 of incubation, 10% of the fetal serum of the cow is added to the medium. Cultivation is continued until 8 days (see The Effect of Macromolecule Source and Type of Media During in vitro Maturation of Sheep Oocytes on Subsequent Embryo Development. / A. Shirazi, MA Ardali, E. Ahmadi, H. Nazari, M. Mamuee, B Heidari. // J. Reprod. Infertil. - 2012. - Vol.13, No. 1. - P.13-19).
Способ позволяет получать достаточно высокий процент бластоцист, но имеет ряд недостатков. К ним относится, в первую очередь, использование материала от забитых животных. Это позволяет получать от одной высокопродуктивной особи небольшое количество яйцеклеток (не более 5-6 на голову) и, к тому же, всего лишь однократно. Понятно, что в племенной работе такой подход является далеко не оптимальным и может быть использован только для включения в процесс продукции эмбрионов забиваемых по тем или иным причинам животных. Также из недостатков следует отметить отсутствие в среде созревания лютеинизирующего гормона (ЛГ), который, как известно, необходим для нормального процесса развития кумулюсных клеток в фазу созревания ооцита. Для капацитации спермиев используется инактивированная сыворотка крови овец во время течки, добавляемая в среду оплодотворения, что не является оптимальным методом, так как ее состав может существенно варьировать, а это не позволяет стандартизировать условия оплодотворения ооцитов. Среди недостатков стоит упомянуть и использование одной среды для культивирования эмбрионов в течение всех 8 дней, хотя известно, что метаболизм морулы и поздней бластоцисты существенно различается (см. Hewitson, L.C. Energy metabolism of the trophectoderm and inner cell mass of the mouse blastocyst. / Hewitson L.C., Leese H.J. // J. Exp. Zool. - 1993. - №267. - P.337-343), и потребность в ряде веществ, содержание которых в сыворотке плода коровы, добавляемой в среду, недостаточно для полноценного развития зародышей.The method allows to obtain a sufficiently high percentage of blastocysts, but has several disadvantages. These include, first of all, the use of material from slaughtered animals. This allows you to get from a single highly productive individual a small number of eggs (no more than 5-6 per head) and, moreover, only once. It is clear that in breeding this approach is far from optimal and can only be used to include animals slaughtered for one reason or another in the production process of embryos. Also of the shortcomings, it should be noted the absence of luteinizing hormone (LH) in the maturation medium, which, as you know, is necessary for the normal development of cumulus cells in the oocyte maturation phase. For inoculation of sperm, an inactivated blood serum of sheep during estrus is used, added to the fertilization medium, which is not an optimal method, since its composition can vary significantly, and this does not allow standardizing the conditions of fertilization of oocytes. Among the disadvantages, it is worth mentioning the use of a single medium for culturing embryos for all 8 days, although it is known that the metabolism of morula and late blastocyst varies significantly (see Hewitson, LC Energy metabolism of the trophectoderm and inner cell mass of the mouse blastocyst. / Hewitson LC, Leese HJ // J. Exp. Zool. - 1993. - No. 267. - P.337-343), and the need for a number of substances, the content of which in the serum of the fetal cow, added to the medium, is insufficient for the full development of the embryos.
Известен также способ получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro, включающий использование одной основы для всех питательных сред - SOF, состоящей из 117,7 мМоль NaCl, 7,16 мМоль KCl, 1,19 мМоль KH2PO4, 0,49 мМоль MgCl2, 0,33 мМоль пирувата натрия, 0,75 мг/мл канамицина сульфата, причем яичники забирают на бойне, помещают в физиологический раствор и транспортируют при 20°C в лабораторию в течение 1 дня. Фолликулы диаметром 2-8 мм пунктируют шприцем на 5 мл с иглой 18 G. Ооцит-кумулюсные комплексы промывают в среде SOF с добавлением HEPES и помещают для созревания по 5-6 штук в капли среды объемом 50 мкл или 1 в каплю объемом 10 мкл. Среда созревания состоит из SOF с добавлением 0.02 ЕД/мл свиного гипофизарного фолликулостимулирующего гормона и 1 мг/мл эстрадиола. Культивируют в течение 22-24 часов при 39°C, 5% СО2, 95% влажности.There is also known a method for producing cattle embryos in vitro, including the use of a single base for all nutrient media - SOF, consisting of 117.7 mmol NaCl, 7.16 mmol KCl, 1.19 mmol KH 2 PO 4 , 0.49 mmol MgCl 2 , 0.33 mmol of sodium pyruvate, 0.75 mg / ml kanamycin sulfate, the ovaries being taken in a slaughterhouse, placed in physiological saline and transported to a laboratory at 20 ° C for 1 day. Follicles with a diameter of 2-8 mm are punctured with a 5 ml syringe with a 18 G. needle. The oocyte-cumulus complexes are washed in SOF medium with the addition of HEPES and placed for maturation of 5-6 pieces in 50 μl drops of medium or 1 in 10 μl drop. The maturation medium consists of SOF with the addition of 0.02 IU / ml of pork pituitary follicle-stimulating hormone and 1 mg / ml of estradiol. Cultivate for 22-24 hours at 39 ° C, 5% CO 2 , 95% humidity.
Для оплодотворения используют оттаянную сперму быка, которую выдерживают в среде SOF без глюкозы с добавлением поливинилалкоголя (1 мг/мл), HEPES, 20 мкМоль пеницилламина, 10 мкМоль гипотаурина, 2 мкМоль эпинефрина в течение 1 часа, после чего 3 раза центрифугируют и промывают.For fertilization, thawed semen of a bull is used, which is kept in glucose-free SOF medium with the addition of polyvinylalcohol (1 mg / ml), HEPES, 20 μmol of penicillamine, 10 μmol of hypothaurine, 2 μmol of epinephrine for 1 hour, after which it is centrifuged and washed 3 times.
Для оплодотворения ооциты по 5-6 штук помещают в капли среды объемом 46 мкл с добавлением 4 мкл суспензии спермиев (конечная концентрация 1000000 в мл) или 1 в каплю объемом 8 мкл с 2 мкл суспензии спермиев под парафиновым маслом. Среда оплодотворения готовится на основе SOF без глюкозы с добавлением поливинилалкоголя (1 мг/мл), хлорида кальция 1,71 мМоль, 1% раствора незаменимых аминокислот, 5 ЕД/мл гепарина, 20 мкМоль пеницилламина, 10 мкМоль гипотаурина, 2 мкМоль эпинефрина. Инкубируют в течение 22-24 часов при 39°C в атмосфере 5% CO2 и 95% влажности.To fertilize, 5-6 oocytes are placed in 46 μl drops of medium with the addition of 4 μl sperm suspension (final concentration 1,000,000 per ml) or 1 drop in an 8 μl drop with 2 μl sperm suspension under paraffin oil. The fertilization medium is prepared on the basis of glucose-free SOF with the addition of polyvinyl alcohol (1 mg / ml), calcium chloride 1.71 mmol, 1% solution of essential amino acids, 5 U / ml heparin, 20 μmol of penicillamine, 10 μmol of hypothaurine, 2 μmol of epinephrine. Incubated for 22-24 hours at 39 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 and 95% humidity.
После оплодотворения зиготы инкубируют в каплях среды, состоящей из SOF с добавлением 1 мг/мл поливинилалкоголя, 1,5 мМоль глюкозы, 1 мМоль глютамина, 1,71 мМоль хлорида кальция, 2% заменимых и 1% незаменимых аминокислот, 0.34 мМоль цитрата натрия, 2,77 мМоль миоинозитола, 100 мг/мл аскорбиновой кислоты. Инкубируют в течение 8 суток при 39°C в атмосфере 5% CO2, 5% O2 и 95% влажности (см. Additional effect of epidermal growth factor during in vitro maturation for individual bovine oocytes using a chemically defined medium. / T. Oyamada, H. Iwayama, Y. Fukui. // Zygote. - 2004. - V.12, №02. - P.143-150).After fertilization, zygotes are incubated in drops of medium consisting of SOF with the addition of 1 mg / ml polyvinyl alcohol, 1.5 mmol of glucose, 1 mmol of glutamine, 1.71 mmol of calcium chloride, 2% essential and 1% essential amino acids, 0.34 mmol of sodium citrate, 2.77 mmol of myoinositol, 100 mg / ml ascorbic acid. Incubated for 8 days at 39 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 , 5% O 2 and 95% humidity (see Additional effect of epidermal growth factor during in vitro maturation for individual bovine oocytes using a chemically defined medium. / T. Oyamada, H. Iwayama, Y. Fukui. // Zygote. - 2004. - V.12, No. 02. - P.143-150).
Данный способ также предполагает использование материала от забитых животных, что делает его мало применимым в племенной работе. Он ранее не применялся для работы с ооцитами и эмбрионами у овец. Для оплодотворения используется замороженная сперма, что снижает ее качество и эффективность процесса оплодотворения. В связи с тем, что метод используется для получения эмбрионов крупного рогатого скота, то в среде не используется бычий сывороточный альбумин для предотвращения переноса губчатой энцефалопатии. Он заменен на поливинилалкоголь, который не является естественным метаболитом, как и HEPES, и может снижать выживаемость бластоцист. Для капацитации спермиев применена комбинация пеницилламина, гипотаурина, эпинефрина, а в среду для оплодотворения, кроме этого, добавлен гепарин. Таким образом, в данном методе не используется сыворотка животных во время течки для капацитации спермиев.This method also involves the use of material from slaughtered animals, which makes it of little use in breeding. It has not previously been used to work with oocytes and embryos in sheep. Fertilization uses frozen semen, which reduces its quality and the efficiency of the fertilization process. Due to the fact that the method is used to obtain cattle embryos, bovine serum albumin is not used in the medium to prevent the transfer of spongiform encephalopathy. It is replaced by polyvinyl alcohol, which is not a natural metabolite, like HEPES, and can reduce blastocyst survival. A combination of penicillamine, hypothaurine, epinephrine was used for sperm capacitation, and heparin was added to the medium for fertilization. Thus, in this method, animal serum is not used during estrus for capacitation of sperm.
Известен способ обеспечения созревания, оплодотворения ооцитов и культивирования эмбрионов крупного рогатого скота, включающий использование одной основы для всех питательных сред - SOF, состоящей из 99,7 мМоль NaCl, 7,16 мМоль KCl, 1,19 мМоль KH2PO4, 0,49 мМоль MgCl2*6H2O, 3,3 ммоль/л натриевой соли молочной кислоты, 25,07 ммоль/л гидрокарбоната натрия, 1,71 ммоль/л хлорида кальция, причем яичники забирают на бойне, помещают в физиологический раствор и транспортируют при 27-31°C в лабораторию. Фолликулы пунктируют вакуумной системой с иглой 18 G. Ооцит-кумулюсные комплексы промывают в среде SOF с добавлением HEPES и помещают для созревания по 10 штук в капли среды объемом 50 мкл или 1 в каплю объемом 10 мкл. Среда созревания состоит из SOF с добавлением 0,33 мМоль пирувата натрия, 1,5 мМоль глюкозы, 1,0 мМоль глютамина, по 1% заменимых и незаменимых аминокислот, 10% сыворотки плода коровы, 0,01 ЕД/мл бычьего гипофизарного фолликулостимулирующего гормона, 0,01 ЕД/мл бычьего гипофизарного лютеинизирующего гормона, 50 нг/мл эпидермального фактора роста, пенициллина, стрептомицина и амфотерицина. Культивируют в течение 22-24 часов при 38,7°C, 5% CO2, 95% влажности.A known method of ensuring the maturation, fertilization of oocytes and cultivation of cattle embryos, including the use of one base for all nutrient media - SOF, consisting of 99.7 mmol of NaCl, 7.16 mmol of KCl, 1.19 mmol of KH 2 PO 4 , 0, 49 mmol MgCl 2 * 6H 2 O, 3.3 mmol / L sodium salt of lactic acid, 25.07 mmol / L sodium bicarbonate, 1.71 mmol / L calcium chloride, whereby the ovaries are removed from the slaughterhouse, placed in physiological saline and transported at 27-31 ° C to the laboratory. The follicles are punctured with a vacuum system with an 18 G needle. The oocyte-cumulus complexes are washed in SOF medium with the addition of HEPES and placed for maturation in 10 pieces in 50 μl drops of medium or 1 in 10 μl drops. The ripening medium consists of SOF with the addition of 0.33 mmol of sodium pyruvate, 1.5 mmol of glucose, 1.0 mmol of glutamine, 1% of essential and non-essential amino acids, 10% of fetal bovine serum, 0.01 IU / ml bovine pituitary follicle-stimulating hormone , 0.01 IU / ml bovine pituitary luteinizing hormone, 50 ng / ml epidermal growth factor, penicillin, streptomycin and amphotericin. Cultivate for 22-24 hours at 38.7 ° C, 5% CO 2 , 95% humidity.
Для оплодотворения используют оттаянную сперму быка, которую выдерживают в среде SOF без глюкозы с HEPES, лактатом натрия, 0,33 мМоль пирувата натрия, 3 мг/мл бычьего сывороточного альбумина в течение 1 часа, после чего 3 раза центрифугируют и промывают.For fertilization, thawed bull sperm is used, which is kept in glucose-free SOF medium with HEPES, sodium lactate, 0.33 mmol of sodium pyruvate, 3 mg / ml of bovine serum albumin for 1 hour, after which it is centrifuged and washed 3 times.
Для оплодотворения ооциты помещают в капли среды объемом 44 мкл с добавлением суспензии спермиев (конечная концентрация 1000000 в мл) под парафиновым маслом. Среду оплодотворения готовят на основе SOF без глюкозы с добавлением 6 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 1,0 мМоль пирувата, 2% раствора незаменимых аминокислот, 2 мкг/мл гепарина, 20 мкМоль пеницилламина, 10 мкМоль гипотаурина, 2 мкМоль эпинефрина. Инкубируют в течение 22-24 часов при 38,7°C в атмосфере 5% CO2.For fertilization, the oocytes are placed in drops of medium with a volume of 44 μl with the addition of a suspension of sperm (final concentration of 1,000,000 in ml) under paraffin oil. The fertilization medium is prepared on the basis of glucose-free SOF with the addition of 6 mg / ml bovine serum albumin, 1.0 mmol of pyruvate, 2% solution of essential amino acids, 2 μg / ml of heparin, 20 μmol of penicillamine, 10 μmol of hypotaurin, 2 μmol of epinephrine. Incubated for 22-24 hours at 38.7 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 .
После оплодотворения зиготы инкубируют по 10 штук в каплях среды 50 мкл под парафиновым маслом, состоящей из SOF с 8 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, добавлением 1,5 мМоль глюкозы, 1 мМоль глютамина, 1% заменимых и 1% незаменимых аминокислот, 0,1 мМоль ЭДТА, 0,1 мМоль таурина. Инкубируют в течение 3 суток при 38,7°C в атмосфере 5% CO2. На 4 сутки эмбрионы переносят в среду с 8 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, содержание глюкозы 3,0 мМоль, 1,0 мМоль глютамина, 1% заменимых и 1% незаменимых аминокислот, 1% витаминов и инкубируют еще 96 часов (см. A single medium supports development of bovine embryos throughout maturation, fertilization and culture. / A.P. Gandhi, M. Lane, D.K. Gardner, R.L. Krisher. // Human Reproduction. - 2000. - Vol.15, №2. - P.395-401).After fertilization, 10 zygotes are incubated in 50 μl drops of medium under paraffin oil consisting of SOF with 8 mg / ml bovine serum albumin, 1.5 mM glucose, 1 mM glutamine, 1% essential and 1% essential amino acids, 0, 1 mmol of EDTA, 0.1 mmol of taurine. Incubated for 3 days at 38.7 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 . On day 4, embryos are transferred to the medium with 8 mg / ml bovine serum albumin, glucose 3.0 mMol, 1.0 mM glutamine, 1% essential and 1% essential amino acids, 1% vitamins and incubated for another 96 hours (see A single medium supports development of bovine embryos throughout maturation, fertilization and culture. / AP Gandhi, M. Lane, DK Gardner, RL Krisher. // Human Reproduction. - 2000. - Vol.15, No. 2. - P.395-401 )
Недостатком способа является использование материала от забитых животных, к тому же, он не применялся для работы с ооцитами и эмбрионами овец. Для оплодотворения используют замороженную сперму, что снижает ее качество и эффективность процесса оплодотворения. Для капацитации спермиев при использовании данной технологии никаких дополнительных веществ в среду для промывки спермиев не добавляется, что также может отражаться на процессе проникновения спермиев в яйцеклетку, а в среду для оплодотворения, как и в описанном выше методе, введена комбинация пеницилламина, гипотаурина, эпинефрина, кроме этого, добавлен гепарин. Таким образом, в данном методе также не используется сыворотка животных во время течки для капацитации спермиев и добавления в среду оплодотворения.The disadvantage of this method is the use of material from slaughtered animals, moreover, it was not used to work with oocytes and sheep embryos. For fertilization, frozen semen is used, which reduces its quality and the efficiency of the fertilization process. For sperm capacitation using this technology, no additional substances are added to the sperm washing medium, which can also affect the penetration of sperm into the egg, and a combination of penicillamine, hypothaurine, epinephrine is introduced into the fertilization medium, as in the method described above. in addition, heparin is added. Thus, this method also does not use animal serum during estrus to capacitate sperm and add to the medium of fertilization.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ получения эмбрионов свиней in vitro, включающий отделение яичников от животных после убоя, их транспортировку, извлечение ооцитов из яичников, культивирование их до стадии метафазы II, подготовку спермы хряка, совместное культивирование ооцитов и сперматозоидов и культивирование оплодотворенных яйцеклеток, причем яичники отделяют от не подвергнутых ошпарке животных не позднее 30 минут с момента их обездвиживания. Яичники трансплантируют в физиологическом растворе, не содержащем антибиотики при 35-37°C в течение 1 часа. Ооциты получают из яичников путем рассечения видимых антральных фолликулов. Полученные ооциты разделяют на группы по количеству окружающих слоев кумулюсных клеток, а именно, на ооциты, окруженные 4-5 слоями кумулюсных клеток, 2-3 слоями и 1 слоем кумулюсных клеток. Каждую группу ооцитов культивируют в среде, содержащей 10 IU хорионического гонадотропина человека. Для оплодотворения ооцитов in vitro используют эякуляторную сперму хряков, разбавленную глюкозо-хелато-цитратно-сульфатным разбавителем, отмытую от семенальной плазмы, разбавленную средой mTBM и проинкубированную в течение 25 минут в условиях инкубатора при 5% CO2 и 38,5°C. Полученные зиготы культивируют в среде NCSU-23, не содержащей феноловый красный, обогащенной 0,1% аминокислот в течение 6-7 дней; в первые трое суток культивирования в среду NCSU-23 дополнительно вводят 0,17 мМ Na-пирувата и 2,75 мМ Na-лактата. Изобретение позволяет повысить выход зрелых ооцитов до 80%, их оплодотворяемость in vitro до 77%, при этом стадии морулы/бластоцисты достигали до 25,7% эмбрионов (см. пат. RU №2340177 МПК9 A01K 67/02, A61D 19/04).The closest in technical essence and the achieved positive effect and adopted by the authors for the prototype is a method of obtaining pig embryos in vitro, including separation of the ovaries from animals after slaughter, their transportation, extraction of oocytes from the ovaries, culturing them to metaphase II stage, preparation of boar sperm, joint the cultivation of oocytes and sperm and the cultivation of fertilized eggs, the ovaries being separated from the animals not scalded no later than 30 minutes after they were immobilized. The ovaries are transplanted in saline that does not contain antibiotics at 35-37 ° C for 1 hour. Oocytes are obtained from the ovaries by dissecting visible antral follicles. The obtained oocytes are divided into groups according to the number of surrounding layers of cumulus cells, namely, oocytes surrounded by 4-5 layers of cumulus cells, 2-3 layers and 1 layer of cumulus cells. Each group of oocytes is cultured in a medium containing 10 IU of human chorionic gonadotropin. For in vitro fertilization of oocytes, ejaculatory boar semen diluted with glucose-chelate-citrate-sulfate diluent, washed from seminal plasma, diluted with mTBM medium and incubated for 25 minutes in an incubator at 5% CO 2 and 38.5 ° C, is used. The obtained zygotes were cultured in NCSU-23 medium not containing phenol red, enriched with 0.1% amino acids for 6-7 days; in the first three days of cultivation, 0.17 mM Na-pyruvate and 2.75 mM Na-lactate are additionally introduced into the NCSU-23 medium. The invention allows to increase the yield of mature oocytes to 80%, their in vitro fertilization to 77%, while the morula / blastocyst stages reached 25.7% of embryos (see Pat. RU No. 2340177 IPC 9 A01K 67/02, A61D 19/04 )
Недостатком данного способа является использование материала от забитых животных и применение его только для одного вида (свиней). The disadvantage of this method is the use of material from slaughtered animals and its use for only one species (pigs).
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения эмбрионов овец in vitro, который предусматривает повышение выхода получения яйцеклеток и их созревание до момента готовности к оплодотворению, что в свою очередь способствует получению эмбрионов овец в искусственно созданных условиях вне организма для развития как племенного животноводства, так и в научно-исследовательских целях.The objective of the invention is to develop a method for producing sheep embryos in vitro, which involves increasing the yield of egg production and their maturation until ready for fertilization, which in turn contributes to the production of sheep embryos in artificially created conditions outside the body for the development of both livestock breeding and research purposes.
Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к повышению доли выхода ооцитов, достигших метафазы II, оплодотворенных ооцитов, достигших эмбрионального развития до стадии морулы/бластоцисты in vitro.The technical result that can be obtained using the present invention is to increase the proportion of the output of oocytes that have metaphase II, fertilized oocytes that have reached embryonic development to the morula / blastocyst stage in vitro.
Технический результат изобретения достигается с помощью способа получения эмбрионов овец in vitro, включающего извлечение ооцит-кумулюсных комплексов из яичников, культивирование их до стадии метафазы II, совместное культивирование ооцитов и сперматозоидов, культивирование оплодотворенных яйцеклеток, причем в него дополнительно вводят фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормон в виде комбинированного препарата рекомбинантных человеческих гипофизарных гормонов Менопур, эстрадиол, гепарин, кофеин и антибиотик, а культивирование проводят на базовой среде, при этом извлечение ооцит-кумулюсных комплексов из яичников получают от живых овец под наркозом путем пунктирования фолликулов яичников при проведении лапаротомии, причем предварительно производят стимуляцию суперовуляции, получают ооцит-кумулюсные комплексы, а в среду созревания добавляют фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормон в виде комбинированного препарата рекомбинантных человеческих гипофизарных гормонов Менопур, причем концентрация обоих компонентов составляет 0,075 МЕ/мл, а эстрадиол добавляют в среду созревания в концентрации 10 мкг/мл, при этом для оплодотворения используют свежеполученную сперму баранов, для капацитации спермиев барана и в состав среды оплодотворения добавляют комбинацию гепарина в количестве 5 ЕД/мл и кофеина в количестве 0,2 мг/мл, а культивирование и оплодотворение осуществляют в четырехлуночных чашках Петри в 500 мкл питательной среды под 200 мкл парафинового масла.The technical result of the invention is achieved using an in vitro method for producing sheep embryos, including extraction of oocyte-cumulus complexes from the ovaries, culturing them to metaphase II stage, co-culturing oocytes and sperm cells, culturing fertilized eggs, and additionally introducing follicle-stimulating and luteinizing hormone into it the combined preparation of recombinant human pituitary hormones Menopur, estradiol, heparin, caffeine and antibiotic, and cultivation carried out on the base medium, while the extraction of oocyte-cumulus complexes from the ovaries is obtained from live sheep under anesthesia by puncture of the ovarian follicles during laparotomy, and superovulation is first stimulated, oocyte-cumulus complexes are obtained, and follicle-stimulating and luteinosis are added to the maturation medium as a combined preparation of recombinant human pituitary hormones Menopur, and the concentration of both components is 0.075 IU / ml, and estradiol doba poured into the ripening medium at a concentration of 10 μg / ml, while freshly obtained ram sperm is used for fertilization, a combination of heparin in an amount of 5 U / ml and caffeine in an amount of 0.2 mg / ml is added to the fertilization medium for fertilization; cultivation and fertilization is carried out in four-well Petri dishes in 500 μl of culture medium under 200 μl of paraffin oil.
Технический результат достигается с помощью способа, в котором в качестве антибиотика используют гентамицин.The technical result is achieved using a method in which gentamicin is used as an antibiotic.
Технический результат достигается с помощью способа, в котором используется один базовый раствор для основы всех питательных сред, в который добавляют раствор глюкозы, раствор пирувата, раствор гидрокарбоната, раствор лактата, раствор глютамина, сыворотку плода коровы, бычий сывороточный альбумин, незаменимые аминокислоты, заменимые аминокислоты, гепарин, кофеин, деионизированную воду, фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормоны, эстрадиол и соляную кислоту.The technical result is achieved using a method in which one base solution is used for the basis of all nutrient media, in which glucose solution, pyruvate solution, bicarbonate solution, lactate solution, glutamine solution, cow fetal serum, bovine serum albumin, essential amino acids, essential amino acids are added , heparin, caffeine, deionized water, follicle-stimulating and luteinizing hormones, estradiol and hydrochloric acid.
Сущность способа получения эмбрионов овец in vitro, включающий извлечение ооцит-кумулюсных комплексов из яичников, культивирование их до стадии метафазы II, совместное культивирование ооцитов и сперматозоидов, культивирование оплодотворенных яйцеклеток, причем в него дополнительно вводят фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормон в виде комбинированного препарата рекомбинантных человеческих гипофизарных гормонов Менопур, эстрадиол, гепарин, кофеин и антибиотик, а культивирование проводят на базовой среде, при этом извлечение ооцит-кумулюсных комплексов из яичников получают от живых овец под наркозом путем пунктирования фолликулов яичников при проведении лапаротомии, причем предварительно производят стимуляцию суперовуляции, получают ооцит-кумулюсные комплексы, в среду созревания добавляют фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормон в виде комбинированного препарата рекомбинантных человеческих гипофизарных гормонов Менопур, причем концентрация обоих компонентов составляет 0,075 МЕ/мл, а эстрадиол добавляют в среду созревания в концентрации 10 мкг/мл, при этом для оплодотворения используют свежеполученную сперму баранов, для капацитации спермиев барана и в состав среды оплодотворения добавляют комбинацию гепарина в количестве 5 ЕД/мл и кофеина в количестве 0,2 мг/мл, а культивирование и оплодотворение осуществляют в четырехлуночных чашках Петри в 500 мкл питательной среды под 200 мкл парафинового масла.The essence of the method of producing sheep embryos in vitro, including the extraction of oocyte-cumulus complexes from the ovaries, culturing them to metaphase II stage, the joint cultivation of oocytes and spermatozoa, the cultivation of fertilized eggs, and follicle-stimulating and luteinizing hormone recombinant in the form of a combined preparation hormones Menopur, estradiol, heparin, caffeine and antibiotic, and cultivation is carried out on the base medium, while the extraction of OOC T-cumulus complexes from the ovaries are obtained from live sheep under general anesthesia by puncture of the ovarian follicles during laparotomy, superovulation is first stimulated, oocyte-cumulus complexes are obtained, follicle-stimulating and luteinizing hormones are added to the maturation medium in the form of a combined preparation of recombinant human, recombinant human hormones moreover, the concentration of both components is 0.075 IU / ml, and estradiol is added to the ripening medium at a concentration of 10 μg / ml, pr for this, freshly obtained sheep sperm is used for fertilization, a combination of heparin in the amount of 5 U / ml and caffeine in the amount of 0.2 mg / ml is added to the fertilization of ram sperm for fertilization, and cultivation and fertilization are carried out in four-well Petri dishes in 500 μl of nutrient medium under 200 μl of paraffin oil.
В способе в качестве антибиотика используют гентамицин.In the method, gentamicin is used as an antibiotic.
В способе в используется один базовый раствор для основы всех питательных сред, в который добавляют раствор раствор глюкозы, раствор пирувата, раствор гидрокарбоната, раствор лактата, раствор глютамина, сыворотку плода коровы, бычий сывороточный альбумин, незаменимые аминокислоты, заменимые аминокислоты, гепарин, кофеин, деионизированную воду, фолликуло-стимулирующий и лютеинизирующий гормоны, эстрадиол и соляную кислоту.The method uses one base solution for the basis of all nutrient media, to which glucose solution, pyruvate solution, bicarbonate solution, lactate solution, glutamine solution, bovine fetal serum, bovine serum albumin, essential amino acids, essential amino acids, heparin, caffeine, deionized water, follicle-stimulating and luteinizing hormones, estradiol and hydrochloric acid.
Краткое описание чертежей и их материаловA brief description of the drawings and their materials
На фиг.1 дан способ получения эмбрионов овец in vitro, результаты получения ооцит-кумулюсных комплексов у овец, таблица 1.Figure 1 shows a method of producing sheep embryos in vitro, the results of obtaining oocyte-cumulus complexes in sheep, table 1.
На фиг.2 - то же, результаты созревания ооцит-кумулюсных комплексов у овец, таблица 2.Figure 2 - the same, the maturation results of oocyte-cumulus complexes in sheep, table 2.
На фиг.3 - то же, результаты оплодотворения и культивирования овец, таблица 3.Figure 3 - the same, the results of fertilization and cultivation of sheep, table 3.
На фиг.4 - то же, результаты получения ооцит-кумулюсных комплексов у овец после стимуляции суперовуляции, таблица 4.Figure 4 is the same, the results of obtaining oocyte-cumulus complexes in sheep after stimulation of superovulation, table 4.
На фиг.5 - то же, результаты созревания ооцит-кумулюсных комплексов у овец, таблица 5.Figure 5 is the same, the maturation results of oocyte-cumulus complexes in sheep, table 5.
На фиг.6 - то же, приготовление готовых растворов питательных сред в расчете на 5 мл, таблица 6.Figure 6 is the same, the preparation of ready-made solutions of nutrient media per 5 ml, table 6.
На фиг.7 - то же, результаты оплодотворения и культивирования овец, таблица 7.Figure 7 is the same, the results of the fertilization and cultivation of sheep, table 7.
На фиг.8 - то же, результаты получения ооцит-кумулюсных комплексов у овец, таблица 8.On Fig - the same, the results of obtaining oocyte-cumulus complexes in sheep, table 8.
На фиг.9 - то же, результаты созревания ооцит-кумулюсных комплексов у овец, таблица 9.Figure 9 is the same, the maturation results of oocyte-cumulus complexes in sheep, table 9.
На фиг.10 - то же, приготовление готовых растворов питательных сред в расчете на 5 мл, таблица 10.Figure 10 is the same, the preparation of ready-made solutions of nutrient media per 5 ml, table 10.
На фиг.11 - то же, результаты оплодотворения и культивирования овец, таблица 11.Figure 11 is the same, the results of the fertilization and cultivation of sheep, table 11.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Примеры конкретного выполнения способа получения эмбрионов овец in vitro.Examples of specific performance of the method of producing sheep embryos in vitro.
В примерах оценивают общую эффективность усовершенствованного метода созревания, оплодотворения и развития эмбрионов овец in vitro, определенную по проценту созревших, оплодотворенных ооцитов и норме развития эмбрионов до стадии морулы/бластоцисты.In the examples, the overall effectiveness of the improved method of ripening, fertilization and development of sheep embryos in vitro is estimated, determined by the percentage of matured, fertilized oocytes and the rate of development of embryos to the morula / blastocyst stage.
Пример 1.Example 1
Исследования проводят на базе лаборатории вспомогательных репродуктивных технологий Научно-диагностического и лечебного ветеринарного центра ФГБОУ ВПО Ставропольский государственный аграрный университет в период с мая по декабрь 2012 года.Research is carried out on the basis of the laboratory of assisted reproductive technologies of the Scientific Diagnostic and Medical Veterinary Center of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education Stavropol State Agrarian University from May to December 2012.
Яичники получают от овец в возрасте 2-3 лет. Ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) получают из яичников, забранных у овец после убоя.Ovaries receive from sheep aged 2-3 years. Oocyte-cumulus complexes (OCCs) are obtained from ovaries taken from sheep after slaughter.
ОКК собирают в пластиковый шприц объемом 5 мл с иглой 22G с 1 миллилитром питательной среды ТСМ 199 с добавлением 10% сыворотки плода коровы и раствора пенициллина 100 ЕД/мл, 100 мкг/мл стрептомицина. Поиск и оценку ОКК выполняют на стереомикроскопе с термостоликом при температуре 38,5°C.OCC is collected in a 5 ml plastic syringe with a 22G needle with 1 milliliter of TCM 199 nutrient medium with the addition of 10% fetal bovine serum and
Для созревания отбирают ОКК I-III классов по системе Leibfried and First (1979).Class I-III class CSCs are selected for maturation according to the Leibfried and First system (1979).
Среднее количество ОКК (Таб.1).The average number of OCCs (Table 1).
ОКК трижды промывают в среде для созревания с добавлением HEPES, лактата натрия, эпидермального фактора роста, поливинилалкоголя и помещают в капли среды объемом по 50 мкл под стерильным парафиновым маслом. Далее проводят инкубацию в термостате при 38,5°C, влажности 90% и содержании CO2 5% в течение 24 часов. По окончании инкубации ОКК переносят в раствор гиалуронидазы 300 мкг/мл (Sigma-Aldrich, USA) на 1 минуту и аккуратным пипетированием капилляром диаметром 135 мкм удаляют клетки кумулюса. Затем ооциты трижды промывают в среде созревания и исследуют с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного термостоликом при температуре 38,5°C. Созревшими считают ооциты с первым полярным тельцем.OCC is washed three times in a maturing medium with the addition of HEPES, sodium lactate, epidermal growth factor, polyvinyl alcohol and placed in 50 μl drops of medium under sterile paraffin oil. Next, incubation is carried out in a thermostat at 38.5 ° C, humidity 90% and a CO 2 content of 5% for 24 hours. At the end of the incubation, OCC is transferred into a hyaluronidase solution of 300 μg / ml (Sigma-Aldrich, USA) for 1 minute and cumulus cells are removed by accurately pipetting with a 135 μm diameter capillary. Then the oocytes are washed three times in a maturing medium and examined using an inverted microscope equipped with a thermostol at a temperature of 38.5 ° C. Oocytes with the first polar body are considered mature.
Для оплодотворения оттаянную сперму в объеме 100 мкл разбавляют в 1 мл среды с добавлением пеницилламина, гипотаурина и эпинефрина для промывки спермы и помещают на 45 минут в инкубатор при 38,5°C и 90% влажности.For fertilization, thawed semen in a volume of 100 μl is diluted in 1 ml of medium with the addition of penicillamine, hypothaurine and epinephrine for washing sperm and placed for 45 minutes in an incubator at 38.5 ° C and 90% humidity.
После инкубации отбирают 800 мкл среды и дважды отмывают спермии, ресуспендируя промывочной средой и центрифугируя по 3 минуты при 200 g. Третий раз отмывают в среде для оплодотворения и считают концентрацию спермиев.After incubation, 800 μl of medium is removed and sperm are washed twice, resuspended in washing medium and centrifuged for 3 minutes at 200 g. The third time washed in a medium for fertilization and consider the concentration of sperm.
Вносят спермии в капли среды объемом по 50 мкл под стерильным парафиновым маслом с промытыми трижды в среде для оплодотворения яйцеклетками в 500 мкл среды оплодотворения под 200 мкл парафинового масла, создавая конечную концентрацию спермиев 1-2 миллиона в - миллилитре. Инкубируют 24 часа при 38,5°C, 90% влажности и 5% CO2. Показателем оплодотворения является наличие двух полярных телец, двух пронуклеусов или начало деления зиготы.Sperm are introduced into drops of medium with a volume of 50 μl under sterile paraffin oil and washed three times in egg fertilization medium in 500 μl of fertilization medium under 200 μl of paraffin oil, creating a final sperm concentration of 1-2 million per milliliter. Incubated for 24 hours at 38.5 ° C, 90% humidity and 5% CO 2 . An indicator of fertilization is the presence of two polar bodies, two pronuclei or the beginning of zygote division.
Для культивирования эмбрионов зиготы трижды промывают в среде культивирования с добавлением ЭДТА и таурина и переносят в капли среды объемом по 50 мкл под стерильным парафиновым маслом. Далее проводится инкубация в термостате при 38,5°C, влажности 90% и содержании CO2 5% в течение 24 часов. Через 72 часа эмбрионы трижды отмывают в среде культивирования с добавлением HEPES. Далее культивирование продолжается еще 96 часов до получения бластоцист без блестящей оболочки.To cultivate embryos, zygotes are washed three times in a culture medium supplemented with EDTA and taurine and transferred to 50 μl drops of medium under sterile paraffin oil. Next, incubation is carried out in a thermostat at 38.5 ° C, humidity 90% and a CO 2 content of 5% for 24 hours. After 72 hours, the embryos are washed three times in culture medium supplemented with HEPES. Further cultivation continues for another 96 hours to obtain a blastocyst without a shiny membrane.
Использование материала от забитых животных позволяет получать от одной высокопродуктивной особи небольшое количество яйцеклеток и только однократно. Отсутствие в среде созревания лютеинизирующего гормона может привести к нарушению нормального процесса развития кумулюсных клеток в фазу созревания ооцита. Для оплодотворения используется замороженная сперма, что снижает ее качество и эффективность процесса оплодотворения. В среде для культивирования эмбрионов не используется бычий сывороточный альбумин, а добавлен поливинилалкоголь, что снижает выживаемость бластоцист.The use of material from slaughtered animals makes it possible to obtain from a single highly productive individual a small number of eggs and only once. The absence of luteinizing hormone in the maturation medium can lead to disruption of the normal process of development of cumulus cells in the oocyte maturation phase. Fertilization uses frozen semen, which reduces its quality and the efficiency of the fertilization process. In the medium for embryo cultivation, bovine serum albumin is not used, but polyvinyl alcohol is added, which reduces the survival of blastocysts.
Пример 2. Проводят аналогично примеру №1, но животным для увеличения количества получаемых ОКК проводят синхронизацию полового цикла и стимуляцию суперовуляции. Для синхронизации полового цикла используют двукратное внутримышечное введение 125 мкг простагландина F2альфа на 1 и 10 день. Стимуляция суперовуляции осуществляется путем введения препарата аналога гонадотропин-релизинг гормона люлиберина на 9, 10,11 день внутримышечно в дозе 20 мкг.Example 2. Carried out analogously to example No. 1, but the animals to increase the number of received OKC conduct synchronization of the sexual cycle and stimulation of superovulation. To synchronize the sexual cycle, double intramuscular injection of 125 μg of prostaglandin F2alpha on days 1 and 10 is used. Superovulation is stimulated by administering an analogue of the gonadotropin-releasing hormone luliberin for 9, 10.11 days intramuscularly at a dose of 20 mcg.
Ооцит-кумулюсные комплексы получают путем пункции фолликулов. Операция выполняется на 12 день эксперимента.Oocyte-cumulus complexes are obtained by follicular puncture. The operation is performed on day 12 of the experiment.
Перед операцией животных в течение суток держат на голодной диете. Операции проводят под внутривенным наркозом 5% раствором тиопентала натрия в дозировке 15 мг/кг веса. Каудальный конец операционного стола с закрепленным на нем животным поднимают под углом 20° для смещения кишечника в сторону диафрагмы. После выполнения нижнесрединной лапаротомии яичники поочередно выводят в рану и пунктируют фолликулы диаметром 3 и более миллиметров.Before surgery, animals are kept on a starvation diet for 24 hours. The operations are carried out under intravenous anesthesia with a 5% sodium thiopental solution at a dosage of 15 mg / kg body weight. The caudal end of the operating table with the animal fixed on it is raised at an angle of 20 ° to move the intestine towards the diaphragm. After performing the lower middle laparotomy, the ovaries are alternately removed into the wound and punctured follicles with a diameter of 3 or more millimeters.
ОКК собирают в пластиковый шприц объемом 5 мл с иглой 22G с 1 миллилитром питательной среды ТСМ 199 с добавлением 10% сыворотки плода коровы и раствора антибиотика гентамицина в конечной концентрации 50 мкг/мл. Поиск и оценку ОКК выполняют на стереомикроскопе с термостоликом при температуре 38,5°C.OCC is collected in a 5 ml plastic syringe with a 22G needle with 1 milliliter of TCM 199 nutrient medium with the addition of 10% bovine fetal serum and a gentamicin antibiotic solution at a final concentration of 50 μg / ml. Search and evaluation of OCC are performed on a stereo microscope with a thermostol at a temperature of 38.5 ° C.
Для созревания отбирают ОКК I-III классов по системе Leibfhed and First (1979).For ripening, class I-III CSCs are selected according to the Leibfhed and First system (1979).
Количество полученных в ходе эксперимента ОКК было меньше количества пропунктированных фолликулов на 33,4%. Из полученных ОКК наибольшее количество относилось ко II классу, наименьшее к IV классу качества ОКК. Представители I и III классов составляли приблизительно одинаковое число (Табл.4).The number of OCC obtained during the experiment was less than the number of punctured follicles by 33.4%. Of the received OKCs, the largest number belonged to class II, the smallest to class IV quality QCS. Representatives of classes I and III amounted to approximately the same number (Table 4).
Среди ОКК разных классов качества, помещенных на инкубацию, наибольший процент созревания ооцитов наблюдают при показателях качества, соответствующих I классу. Наименьший процент созревания был достигнут среди ОКК III класса качества (Табл.5).Among OCC of different quality classes placed on incubation, the highest percentage of oocyte maturation is observed at quality indicators corresponding to class I. The smallest percentage of ripening was achieved among quality class III JCCs (Table 5).
Непосредственно перед проведением процедуры взятия ооцит-кумулюсных комплексов готовятся пять питательных сред путем смешивания компонентов (Табл.6).Immediately before the procedure for taking oocyte-cumulus complexes, five nutrient media are prepared by mixing the components (Table 6).
Предварительно готовятся растворы по следующим прописям:Pre-prepared solutions for the following prescriptions:
Базовый раствор (10×)Stock solution (10 ×)
- 0,55 г NaCl- 0.55 g of NaCl
- 0,046 г KCl- 0.046 g KCl
- 0,014 г KH2PO4 - 0.014 g KH 2 PO 4
- 0,0087 MgCl2×6H2O- 0.0087 MgCl 2 × 6H 2 O
- 0,005 г гентамицина- 0.005 g of gentamicin
- Растворить в 10 мл деионизированной воды- Dissolve in 10 ml of deionized water
- Отфильтровать и хранить при 4°С в течение 3 месяцев- Filter and store at 4 ° C for 3 months
Раствор Ca (10×)Ca solution (10 ×)
- 0,022 г CaCl2×2H2O- 0.022 g of CaCl 2 × 2H 2 O
- Растворить в 10 мл деионизированной воды- Dissolve in 10 ml of deionized water
- Отфильтровать и хранить при 4°C в течение 3 месяцев- Filter and store at 4 ° C for 3 months
Раствор глюкозы (10×)Glucose solution (10 ×)
- 0,0237 г глюкозы- 0,0237 g of glucose
- Растворить в 10 мл деионизированной воды- Dissolve in 10 ml of deionized water
- Отфильтровать и хранить при 4°C в течение 3 месяцев- Filter and store at 4 ° C for 3 months
Раствор пирувата Na (10×)Pyruvate Na solution (10 ×)
- 0,0032 г пирувата- 0.0032 g of pyruvate
- Растворить в 10 мл деионизированной воды- Dissolve in 10 ml of deionized water
- Отфильтровать и хранить при 4°C в течение 1 недели- Filter and store at 4 ° C for 1 week
Раствор гидрокарбоната Na (10×)Na bicarbonate solution (10 ×)
- 0,184 г NaHCO3 - 0.184 g of NaHCO 3
- Растворить в 10 мл деионизированной воды- Dissolve in 10 ml of deionized water
- Отфильтровать и хранить при 4°C в течение 3 недель- Filter and store at 4 ° C for 3 weeks
Раствор лактата Na (10×)Na lactate solution (10 ×)
- 0,1175 мл Na лактата (60% сироп)- 0.1175 ml Na lactate (60% syrup)
- Растворить в 10 мл деионизированной воды- Dissolve in 10 ml of deionized water
- Отфильтровать и хранить при 4°C в течение 3 месяцев- Filter and store at 4 ° C for 3 months
Раствор глютамина (10×)Glutamine Solution (10 ×)
- 0,026 г глютамина- 0.026 g glutamine
- Растворить в 10 мл деионизированной воды- Dissolve in 10 ml of deionized water
- Отфильтровать и хранить при 4°C в течение 1 недели- Filter and store at 4 ° C for 1 week
После этого среды стерилизуются фильтрованием в стерильные пластиковые пробирки через фильтр 0,22 мкм и хранятся в холодильнике при 4°C в течение недели.After this, the media are sterilized by filtration into sterile plastic tubes through a 0.22 μm filter and stored in the refrigerator at 4 ° C for a week.
ОКК трижды промывают в среде для созревания, в которую добавляют эстрадиол в концентрации 10 мкг/мл и фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормон в виде комбинированного препарата рекомбинантных человеческих гипофизарных гормонов Менопур, концентрация обоих компонентов составляет 0,075 МЕ/мл и помещают по 10-20 штук в четырехлуночную чашку Петри с 500 мкл среды для созревания, покрытой 200 мкл парафинового масла для клеточных культур. Далее проводят инкубацию в термостате при 38,5°C, влажности 90% и содержании CO2 5% в течение 24 часов. По окончании инкубации OKK переносят в раствор гиалуронидазы 300 мкг/мл (Sigma-Aldrich, USA) на 1 минуту и аккуратным пипетированием капилляром диаметром 135 мкм удаляют клетки кумулюса. Затем ооциты трижды промывают в среде созревания и исследуют с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного термостоликом при температуре 38,5°C. Созревшими считают ооциты с первым полярным тельцем.OCC is washed three times in a maturation medium, to which estradiol is added at a concentration of 10 μg / ml and follicle-stimulating and luteinizing hormone in the form of a combined preparation of recombinant human pituitary hormones Menopur, the concentration of both components is 0.075 IU / ml and 10-20 pieces are placed in a four-well Petri dish with 500 μl of maturation medium coated with 200 μl of paraffin oil for cell cultures. Next, incubation is carried out in a thermostat at 38.5 ° C, humidity 90% and a CO 2 content of 5% for 24 hours. At the end of the incubation, OKK is transferred into a hyaluronidase solution of 300 μg / ml (Sigma-Aldrich, USA) for 1 minute, and cumulus cells are removed by accurately pipetting with a 135 μm diameter capillary. Then the oocytes are washed three times in a maturing medium and examined using an inverted microscope equipped with a thermostol at a temperature of 38.5 ° C. Oocytes with the first polar body are considered mature.
Для оплодотворения свежесобранную сперму в объеме 100 мкл разбавляют в 1 мл среды для промывки спермы и помещают на 45 минут в инкубатор при 38,5°C и 90% влажности. Пробирку желательно установить под наклоном 45° для удобства последующего отбора жидкости с живыми спермиями.For fertilization, freshly collected sperm in a volume of 100 μl is diluted in 1 ml of sperm washing medium and placed for 45 minutes in an incubator at 38.5 ° C and 90% humidity. It is advisable to install the tube at a slope of 45 ° for the convenience of subsequent sampling of fluid with live sperm.
После инкубации отбирают 800 мкл среды (пробирку не встряхивать!) и дважды отмывают спермии, ресуспендируя промывочной средой и центрифугируя по 3 минуты при 200 g. Третий раз отмывают в среде для оплодотворения и считают концентрацию спермиев.After incubation, 800 μl of medium is withdrawn (do not shake the tube!) And sperm are washed twice, resuspended in washing medium and centrifuged for 3 minutes at 200 g. The third time washed in a medium for fertilization and consider the concentration of sperm.
Вносят спермии в четырехлуночную чашку Петри с промытыми трижды в среде для оплодотворения яйцеклетками в 500 мкл среды оплодотворения под 200 мкл парафинового масла, создавая конечную концентрацию спермиев 1-2 миллиона в миллилитре. Инкубируют 24 часа при 38,5°C, 90% влажности и 5% CO2. Показателем оплодотворения является наличие двух полярных телец, двух пронуклеусов или начало деления зиготы.Sperm are introduced into a four-well Petri dish, washed three times in egg fertilization medium in 500 μl of fertilization medium under 200 μl of paraffin oil, creating a final sperm concentration of 1-2 million per milliliter. Incubated for 24 hours at 38.5 ° C, 90% humidity and 5% CO 2 . An indicator of fertilization is the presence of two polar bodies, two pronuclei or the beginning of zygote division.
Для культивирования эмбрионов зиготы трижды промывают в среде культивирования 1 и переносят в четырехлуночную чашку Петри, содержащую 500 мкл среды для культивирования 1 под 200 мкл парафинового масла. Далее проводят инкубацию в термостате при 38,5°C, влажности 90% и содержании CO2 5% в течение 24 часов. Через 72 часа эмбрионы трижды отмывают в среде культивирования 2 и переносят в среду культивирования 2. Далее культивирование продолжается еще 96 часов до получения бластоцист без блестящей оболочки. Результаты оплодотворения и культивирования эмбрионов приведены в таблице 7.To cultivate embryos, zygotes are washed three times in culture medium 1 and transferred to a four-well Petri dish containing 500 μl of culture medium 1 under 200 μl of paraffin oil. Next, incubation is carried out in a thermostat at 38.5 ° C, humidity 90% and a CO 2 content of 5% for 24 hours. After 72 hours, the embryos are washed three times in cultivation medium 2 and transferred to cultivation medium 2. Further, cultivation continues for another 96 hours until blastocysts without a shiny coat are obtained. The results of fertilization and cultivation of embryos are shown in table 7.
Использование материала от животных, находящихся в состоянии наркоза при проведении лапаротомии, и провоцирование у них суперовуляции позволяют получать от одной высокопродуктивной особи большое количество яйцеклеток многократно. Добавление в среду созревания лютеинизирующего гормона способствует нормальному процессу развития кумулюсных клеток в фазу созревания ооцита. Для оплодотворения используется свежесобранная сперма, что повышает ее качество и эффективность процесса оплодотворения. В среде для культивирования эмбрионов используется бычий сывороточный альбумин, что увеличивает выживаемость бластоцист.The use of material from animals under anesthesia during laparotomy, and provoking superovulation in them, allows one to obtain a large number of eggs from one highly productive individual repeatedly. Adding luteinizing hormone to the maturation medium promotes the normal development of cumulus cells in the oocyte maturation phase. Freshly collected sperm is used for fertilization, which increases its quality and the efficiency of the fertilization process. Bovine serum albumin is used in the embryo culture medium, which increases blastocyst survival.
Пример 3. Проводят аналогично примеру №1, но OKK собирали в пластиковый шприц объемом 5 мл с иглой 22G с 1 миллилитром питательной среды ТСМ 199 (ООО «ПанЭко», Москва) с добавлением 10% сыворотки плода коровы (ООО «ПанЭко», Москва) и раствора антибиотика гентамицина в концентрации 50 мкг/мл. Поиск и оценку ОКК выполняли на стереомикроскопе SZX-10 («Olympus», Япония) с термостоликом Thermo Plate (Tokai Hit, Япония) при температуре 38,5°C.Example 3. Carried out analogously to example No. 1, but OKK was collected in a 5 ml plastic syringe with a 22G needle with 1 milliliter of TSM 199 nutrient medium (PanEco LLC, Moscow) with the addition of 10% cow fetal serum (PanEco LLC, Moscow ) and a solution of the antibiotic gentamicin at a concentration of 50 μg / ml. The search and evaluation of OCC was performed on a SZX-10 stereo microscope (Olympus, Japan) with a Thermo Plate thermostat (Tokai Hit, Japan) at a temperature of 38.5 ° C.
Для созревания отбирали ОКК I-III классов по системе Leibfried and First (1979). Результаты получения ОКК приведены в таблице 8.Classes I-III were selected for maturation according to the Leibfried and First system (1979). The results of the OCC are shown in table 8.
Количество полученных в ходе эксперимента ОКК было меньше количества пропунктированных фолликулов на 25,2%. Таким образом, количество OKK, получаемых при пункции фолликулов из удаленных яичников, больше, чем из пунктируемых во время лапаротомии. Из полученных OKK наибольшее количество относилось ко II классу, наименьшее к IV классу качества ОКК. Представители II класса качества составляли большее число, чем представители III класса, что отличает структуру показателей качества от результатов эксперимента по получению ооцитов путем лапаротомии. Среднее количество ОКК, полученных из одного яичника и в расчете на одну голову овцы, существенно меньше, чем в эксперименте с применением лапаротомии, так как там использовалась стимуляция суперовуляции, позволяющая значительно повысить количество ОКК у одной особи.The number of OCC obtained during the experiment was less than the number of punctured follicles by 25.2%. Thus, the amount of OKK obtained by puncture of follicles from distant ovaries is greater than from punctured during laparotomy. Of the received OKKs, the largest number belonged to class II, the least to class IV quality. Representatives of the II class of quality accounted for a larger number than representatives of the III class, which distinguishes the structure of quality indicators from the results of an experiment on obtaining oocytes by laparotomy. The average number of OCC obtained from one ovary and per sheep’s head is significantly less than in the experiment using laparotomy, since stimulation of superovulation was used there, which can significantly increase the number of OCC in one individual.
Описательная статистика выполнялась в программе «Primer of Biostatistic 3.01» для Windows на IBM-совместимом компьютере.Descriptive statistics were run in the Primer of Biostatistic 3.01 for Windows program on an IBM-compatible computer.
В таблице 9 приведены результаты эксперимента по созреванию ооцитов в искусственных условиях.Table 9 shows the results of an experiment on the maturation of oocytes in artificial conditions.
Непосредственно перед проведением процедуры взятия ооцит-кумулюсных комплексов готовятся пять питательных сред путем смешивания компонентов (Табл.10).Immediately before the procedure for taking oocyte-cumulus complexes, five nutrient media are prepared by mixing the components (Table 10).
Предварительно готовятся растворы по следующим прописям:Pre-prepared solutions for the following prescriptions:
Базовый раствор (10×)Stock solution (10 ×)
- 0,629 г NaCl- 0.629 g of NaCl
- 0,0534 г KCl- 0.0534 g KCl
- 0,0162 г KH2PO4 - 0.0162 g KH 2 PO 4
- 0,00996 MgCl2×6H2O- 0.00996 MgCl 2 × 6H 2 O
- 0,005 г гентамицина- 0.005 g of gentamicin
- Растворить в 10 мл деионизированной воды- Dissolve in 10 ml of deionized water
- Отфильтровать и хранить при 4°C в течение 3 месяцев- Filter and store at 4 ° C for 3 months
Раствор Ca (10×)Ca solution (10 ×)
- 0,0252 г CaCl2×2H2O- 0.0252 g of CaCl 2 × 2H 2 O
- Растворить в 10 мл деионизированной воды- Dissolve in 10 ml of deionized water
- Отфильтровать и хранить при 4°C в течение 3 месяцев- Filter and store at 4 ° C for 3 months
Раствор глюкозы (10×)Glucose solution (10 ×)
- 0,027 г глюкозы- 0.027 g of glucose
- Растворить в 10 мл деионизированной воды- Dissolve in 10 ml of deionized water
- Отфильтровать и хранить при 4°C в течение 3 месяцев- Filter and store at 4 ° C for 3 months
Раствор пирувата Na (10×)Pyruvate Na solution (10 ×)
- 0,0036 г пирувата- 0.0036 g of pyruvate
- Растворить в 10 мл деионизированной воды- Dissolve in 10 ml of deionized water
- Отфильтровать и хранить при 4°C в течение 1 недели- Filter and store at 4 ° C for 1 week
Раствор гидрокарбоната Na (10×)Na bicarbonate solution (10 ×)
- 0,21 г NaHCO3 - 0.21 g of NaHCO 3
- Растворить в 10 мл деионизированной воды- Dissolve in 10 ml of deionized water
- Отфильтровать и хранить при 4°C в течение 3 недель- Filter and store at 4 ° C for 3 weeks
Раствор лактата Na (10×)Na lactate solution (10 ×)
- 0,1175 мл Na лактата (60% сироп)- 0.1175 ml Na lactate (60% syrup)
- Растворить в 10 мл деионизированной воды- Dissolve in 10 ml of deionized water
- Отфильтровать и хранить при 4°C в течение 3 месяцев- Filter and store at 4 ° C for 3 months
Раствор глютамина (10×)Glutamine Solution (10 ×)
- 0,03 г глютамина- 0.03 g glutamine
- Растворить в 10 мл деионизированной воды- Dissolve in 10 ml of deionized water
- Отфильтровать и хранить при 4°C в течение 1 недели- Filter and store at 4 ° C for 1 week
Среду для созревания ооцитов готовили из среды ТСМ 199 с добавлением 10% сыворотки плода коровы, антибиотика гентамицина в концентрации 50 мкг/мл и помещали по 10-20 штук в четырехлуночную чашку Петри с 500 мкл среды для созревания, покрытой 200 мкл парафинового масла для клеточных культур. Далее проводят инкубацию в термостате при 38,5°C, влажности 90% и содержании CO2 5% в течение 24 часов. По окончании инкубации ОКК переносят в раствор гиалуронидазы 300 мкг/мл на 1 минуту и аккуратным пипетированием капилляром диаметром 135 мкм удаляют клетки кумулюса. Затем ооциты трижды промывают в среде созревания и исследуют с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного термостоликом при температуре 38,5°C. Созревшими считают ооциты с первым полярным тельцем.Oocyte maturation medium was prepared from TCM 199 medium with the addition of 10% cow fetal serum, gentamicin antibiotic at a concentration of 50 μg / ml and 10-20 pieces were placed in a four-well Petri dish with 500 μl of maturation medium coated with 200 μl of paraffin oil for cell cultures. Next, incubation is carried out in a thermostat at 38.5 ° C, humidity 90% and a CO 2 content of 5% for 24 hours. At the end of the incubation, OCC is transferred to a hyaluronidase solution of 300 μg / ml for 1 minute, and cumulus cells are removed by accurately pipetting with a capillary of 135 μm diameter. Then the oocytes are washed three times in a maturing medium and examined using an inverted microscope equipped with a thermostol at a temperature of 38.5 ° C. Oocytes with the first polar body are considered mature.
Для оплодотворения оттаянную сперму в объеме 100 мкл разбавляют в 1 мл среды для промывки спермы и помещают на 45 минут в инкубатор при 38,5°C и 90% влажности.For fertilization, thawed semen in a volume of 100 μl is diluted in 1 ml of sperm washing medium and placed for 45 minutes in an incubator at 38.5 ° C and 90% humidity.
После инкубации отбирают 800 мкл среды (пробирку не встряхивать!) и дважды отмывают спермии, ресуспендируя промывочной средой и центрифугируя по 3 минуты при 200 g. Третий раз отмывают в среде для оплодотворения и считают концентрацию спермиев.After incubation, 800 μl of medium is withdrawn (do not shake the tube!) And sperm are washed twice, resuspended in washing medium and centrifuged for 3 minutes at 200 g. The third time washed in a medium for fertilization and consider the concentration of sperm.
Вносят спермии в четырехлуночную чашку Петри с промытыми трижды в среде для оплодотворения яйцеклетками в 500 мкл среды оплодотворения под 200 мкл парафинового масла, создавая конечную концентрацию спермиев 1-2 миллиона в миллилитре. Инкубируют 24 часа при 38,5°C, 90% влажности и 5% CO2. Показателем оплодотворения является наличие двух полярных телец, двух пронуклеусов или начало деления зиготы.Sperm are introduced into a four-well Petri dish, washed three times in egg fertilization medium in 500 μl of fertilization medium under 200 μl of paraffin oil, creating a final sperm concentration of 1-2 million per milliliter. Incubated for 24 hours at 38.5 ° C, 90% humidity and 5% CO 2 . An indicator of fertilization is the presence of two polar bodies, two pronuclei or the beginning of zygote division.
Для культивирования эмбрионов зиготы трижды промывают в среде культивирования 1 и переносят в четырехлуночную чашку Петри, содержащую 500 мкл среды для культивирования 1 под 200 мкл парафинового масла. Далее проводят инкубацию в термостате при 38,5°C, влажности 90% и содержании CO2 5% в течение 24 часов. Через 72 часа эмбрионы трижды отмывают в среде культивирования 2 и переносят в среду культивирования 2. Далее культивирование продолжается еще 96 часов до получения бластоцист без блестящей оболочки. Результаты оплодотворения и культивирования эмбрионов приведены в таблице 11.To cultivate embryos, zygotes are washed three times in culture medium 1 and transferred to a four-well Petri dish containing 500 μl of culture medium 1 under 200 μl of paraffin oil. Next, incubation is carried out in a thermostat at 38.5 ° C, humidity 90% and a CO 2 content of 5% for 24 hours. After 72 hours, the embryos are washed three times in cultivation medium 2 and transferred to cultivation medium 2. Further, cultivation continues for another 96 hours until blastocysts without a shiny coat are obtained. The results of fertilization and cultivation of embryos are shown in table 11.
Среди ОКК разных классов качества, помещенных на инкубацию, наибольший процент созревания ооцитов наблюдался при показателях качества, соответствующих I и II классу. Наименьший процент созревания был достигнут среди ОКК III класса качества. Эффективность созревания была существенно ниже, чем в эксперименте с использованием среды для созревания на основе SOF по сравнению со средой ТСМ 199. Таким образом, выход эмбрионов при методах, использованных в данном эксперименте, будет значительно меньше, так как число созревших ооцитов уже снижено, по сравнению с экспериментом в примере 2.Among OCCs of different quality classes placed on incubation, the highest percentage of oocyte maturation was observed at quality indicators corresponding to class I and II. The smallest percentage of ripening was achieved among the quality class OCC III. The maturation efficiency was significantly lower than in the experiment using the SOF-based maturation medium compared with TCM 199. Thus, the yield of embryos in the methods used in this experiment will be significantly lower, since the number of matured oocytes is already reduced, according to compared with the experiment in example 2.
Результаты выполненного оплодотворения зрелых яйцеклеток в искусственных условиях показали, что количество оплодотворенных ооцитов и зигот, начавших деление, меньше, чем в примере 2. Это указывает на высокую эффективность использования кофеина и гепарина в качестве стимулирующих капацитацию факторов при проведении оплодотворения in vitro у овец.The results of the performed fertilization of mature eggs under artificial conditions showed that the number of fertilized oocytes and zygotes that started dividing is less than in Example 2. This indicates the high efficiency of using caffeine and heparin as factors stimulating capacitation during in vitro fertilization in sheep.
Таким образом, наиболее оптимальным является пример 2. Использование материала от животных, находящихся в состоянии наркоза при проведении лапаротомии, и провоцирование у них суперовуляции позволяет получать от одной высокопродуктивной особи большое количество яйцеклеток многократно. Разработанные питательные среды способствуют увеличению количества ооцит-кумулюсных комплексов, повышению эффективности их созревания и получению значительного количества эмбрионов in vitro.Thus, Example 2 is the most optimal. Using material from animals that are under anesthesia during laparotomy and provoking superovulation in them allows you to get a large number of eggs many times from one highly productive individual. The developed nutrient media contribute to an increase in the number of oocyte-cumulus complexes, an increase in the efficiency of their maturation and the production of a significant number of embryos in vitro.
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:The invention in comparison with the prototype and other known technical solutions has the following advantages:
- повышение доли выхода ооцитов, достигших метафазы II, оплодотворенных ооцитов, достигших эмбрионального развития до стадии морулы/бластоцисты in vitro;- increase the proportion of the output of oocytes that have reached metaphase II, fertilized oocytes that have reached embryonic development to the morula / blastocyst stage in vitro;
- применение одного базового раствора для основы всех питательных сред используется впервые для овец.- the use of one basic solution for the basis of all nutrient media is used for the first time for sheep.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013121616/10A RU2525714C1 (en) | 2013-05-07 | 2013-05-07 | METHOD OF PRODUCTION OF SHEEP EMBRYOS in vitro |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013121616/10A RU2525714C1 (en) | 2013-05-07 | 2013-05-07 | METHOD OF PRODUCTION OF SHEEP EMBRYOS in vitro |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2525714C1 true RU2525714C1 (en) | 2014-08-20 |
Family
ID=51384602
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013121616/10A RU2525714C1 (en) | 2013-05-07 | 2013-05-07 | METHOD OF PRODUCTION OF SHEEP EMBRYOS in vitro |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2525714C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110786289A (en) * | 2019-11-18 | 2020-02-14 | 内蒙古自治区农牧业科学院 | Method for regulating and controlling multiple lambs of goats |
| RU2818068C1 (en) * | 2023-10-26 | 2024-04-23 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский государственный университет" | Method of producing cattle embryos in vitro |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2340177C1 (en) * | 2007-05-14 | 2008-12-10 | Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства (ВИЖ) | Method for pig embryons generation in vitro |
| WO2012020077A1 (en) * | 2010-08-11 | 2012-02-16 | Inserm (Institut Mational De La Santé Et De La Recherche Médicale) | Methods of growing an embryo to a blastocyst stage of development |
-
2013
- 2013-05-07 RU RU2013121616/10A patent/RU2525714C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2340177C1 (en) * | 2007-05-14 | 2008-12-10 | Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства (ВИЖ) | Method for pig embryons generation in vitro |
| WO2012020077A1 (en) * | 2010-08-11 | 2012-02-16 | Inserm (Institut Mational De La Santé Et De La Recherche Médicale) | Methods of growing an embryo to a blastocyst stage of development |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110786289A (en) * | 2019-11-18 | 2020-02-14 | 内蒙古自治区农牧业科学院 | Method for regulating and controlling multiple lambs of goats |
| RU2818068C1 (en) * | 2023-10-26 | 2024-04-23 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский государственный университет" | Method of producing cattle embryos in vitro |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11957384B2 (en) | Method of producing a peripheral blood mononuclear cell composition suitable for repairing or engineering a tissue | |
| CN103184189A (en) | Cultivation method of cross-bred wagy | |
| CN102703377A (en) | Method for improving blastocyst rate of in-vitro embryos of animals | |
| Ongaratto et al. | Effect of FSH treatment on cumulus oocyte complex recovery by ovum pick up and in vitro embryo production in beef donor cows | |
| Hasler et al. | In vitro fertilization | |
| RU2525714C1 (en) | METHOD OF PRODUCTION OF SHEEP EMBRYOS in vitro | |
| CN110055212B (en) | Method for producing embryo in vitro by using sperm of pannage testis tissue | |
| CN107460162B (en) | Method for improving lamb in-vitro embryo development capability | |
| CN110438068B (en) | Method for improving in-vitro fertilization embryo development rate of river buffalo | |
| RU2818068C1 (en) | Method of producing cattle embryos in vitro | |
| RU2340177C1 (en) | Method for pig embryons generation in vitro | |
| Uzelac et al. | The role of in vitro maturation in fertility preservation | |
| US11208622B2 (en) | Processing and use of reproductive tract fluids to improve the in vitro production of mammalian embryos | |
| CN111280163B (en) | Egg extracting liquid for egg taking of live cattle and preparation method and application thereof | |
| CN113801840A (en) | Operating fluid for improving mouse in-vitro fertilization efficiency and using method thereof | |
| CN112914784B (en) | Bovine embryo segmentation method | |
| CN110283780B (en) | Method for collecting superovulation ovum of living cattle and preparation used by method | |
| Layek et al. | Ovum pick-up and in vitro embryo production in bovine | |
| Oberlender et al. | In vitro fertilization of porcine oocytes is affected by spermatic coincubation time | |
| CN113151155A (en) | Cutting liquid for bovine embryo segmentation and bovine embryo segmentation method | |
| CN113151156A (en) | Method for segmenting bovine embryo and segmentation liquid used in method | |
| Shamshidina et al. | Scientific Journal of Zoology | |
| CN117617226A (en) | Application of L-proline in improving post-freezing development rate of oocytes in vitrification frozen foaming period | |
| Hua et al. | A new tool for in vitro culture of porcine eggs | |
| KR20120045555A (en) | Composition for culturing mammalian embryos and method of culturing mammalian embryos using thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150508 |