UA72310C2 - Kukharchuk-radchenko-sirman method for reinstallation of system controlling antigenic homeostasis of the body - Google Patents

Description

Винахід відноситься до галузі медицини та біології і може бути використаним при ало- і ксенотрансплантації органів і тканин, в лікуванні автоїмунних хвороб (гломерулонефрит, ревматоїдний артрит, хронічний активний гепатит та ін.); дегенеративних нервових хвороб, де автоїмунний процес відіграє роль основної патогенетичної ланки (хвороба Альцгеймера, розсіяний склероз, АЛС та ін.); імунного безпліддя; інфаркту міокарда; інсульту; хвороби Паркінсона; гіпо- та апластичних анемій; імунного невиношування вагітності; ендокринних захворювань, пов'язаних з гіпофункцією залоз внутрішньої секреції, в тому числі й цукрового діабету; різних форм остеопорозу; клімаксу жіночого і чоловічого; променевої хвороби та інших захворювань різної етіології.

Закони трансплантації, які засновані на сучасних уявленнях про імунну систему організму ссавців, наголошують, що відторгнення алогенного трансплантата відбувається внаслідок того, що він несе антигени, які не відповідають головному комплексу гістосумісності реципієнта (МНС, НГІА). При цьому унікальність імунної відповіді при алотрансплантації визначається тим, що чужорідні молекули МНС (НГА) безпосередньо активують Т-клітини реципієнта, тобто молекулярною основою реакції відторгнення алотрансплантата є взаємодія між рецепторами Т-лімфоцитів і молекулами МНС (НГА), переважно НІ А-ОК (Ройт А., Бростофф

Дж., Мейл Д. Иммунология./Пер. с англ. В.И.Кандрора, А.Н.Маца, Л.А.Певницкого, М.АА.Серовой. - М.: Мир, 2000. - 592с). Тому в теперішній час (цілком обгрунтовано, але з різною мірою ефективності) в практичній трансплантології застосовуються такі способи попередження відторгнення трансплантата, як неспецифічна і специфічна імуносупресія, індукція ареактивності до трансплантата шляхом спрямованого впливу на цитокінову регуляцію імунної відповіді моделювання співвідношення між ТПп-лімфоцитами 1 і 2 типів, використання антитіл проти СО3-ошйП та ін (М/09930730А1. Тгетбріау, Ччасдиев, Р. Способь! и композиции для трансплантации клеток хозяину. - Изобретения стран мира. - 2000. - Вьп.8, Ме12. - б.70; 055914314А. Раїк,

Ецаоїї Еддаг, Азсціаі, зхатие! 5. Форма гиалуроновой кислоть! и лекарственное средство, применяемье для уменьшения реакции отторжения трансплантированньх органов у млекопитающих. - Изобретения стран мира. -2000. - Вьіп.8, Ме12. - С.50; Ш55916559А. Бігот, Тегпу В. Применение агентов, специфичньїх в отношений рецептора интерлейкина-2, для лечения отторжения трансплантата. - Изобретения стран мира. - 2000. -

Вьп.8, Ме12. - 0.54; бАб1К39/385. Карпов И.А., Копьільцов В.Н., Скалецкий Н.Н. Способ трансплантации органов и тканей. - 1998. - КО БИ Ме32. - С.340; ММОбАб1КЗ31/70. бітоп, Раці М.; Медціге, Едулага, 9. Способь и олигосахаридь! для ослабления отторжения трансплантата. - Изобретения стран мира. - 2000. - Вьіп.8, Ме1. -

С.71).

Останніми роками у науковій літературі з'явилась величезна кількість нових повідомлень щодо біології ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) і перспектив використання останніх в практичній медицині. Основним напрямком більшості досліджень є трансформація ЕСК, які знаходяться на етапах тоті-, плюрі- або поліпотентності, в спеціалізовані клітини в зоні ушкодження тканин різних органів (Сіміп С.І. Нитап ріигіроїепі віт сеїв: зсієпсе йсійоп розе5 по іттеадіайє дапдегз//5ієт Сеїїв. - 2000. - МоІ.18. - Р.4-5.; Такаївиди У.,

Мазапіае У., Зеїї К., Моко К., Хозпіуикі М., ЗНідеакі І., МиКіо Т. Іп міго аїйбегепіаноп ої етргуопіс вієт сеїЇв іп

Пперайосуїе-іїке сеї ідепійєа Бу сеїїшаг иріаке ої іпаосуапіпе дгеєп // Бієт СеїІв. - 2002. - МоІ.20. - Р.146-154.).

Доведено, що ЕСК ії прогеніторні клітини на рівні плюріпотентності здатні перетворюватися в спеціалізовані клітини, тип і вид яких залежать від мікрооточення (Рапагісп Р., Сіп Х., Спаї ОХ. Ргеітріапіаноп-5іаде 5іет сеї іпдисе Іюпод-їегт аПодепеїс дгай ассеріапсе мітоції зирріетепіагу пові сопайіопіпд/ Маї. Мей. - 2002. - Мо1.8. -

Р.171-178.; Намієу В.С, 5обієвзкі О.А. Мем Теаштге: віет сеї іп Ше пемув // ЗЇет Сеїїв. - 2002. - Моі!.20. - Р.103- 104). Цей факт є предметом серйозної уваги провідних вчених світу (Зїет Сеї5 іп те пеже: Нобеїй а.Нам/ієу,

Ооппа А.ЗобріезКу, 2002) і аналізується з різних позицій і точок зору, однак жодна з них не передбачає можливість заміни контролюючої антигенний гомеостаз частини імунної системи організму на нову при введенні дорослим ссавцям ЕСК або прогеніторних клітин ембріону.

Розробити спосіб індукції мегадозами ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин (ЕППК) імунологічної толерантності шляхом створення нової бази імунокомпетентних клітин з одночасною інсталяцією де помо системи контролю антигенного гомеостазу організму ссавців (ефект Кухарчука-Радченка-Сірмана).

Відомо, що тотіпотентні ембріональні стовбурові і плюріпотентні прогеніторні клітини під впливом певного спектру факторів росту і цитокінів здатні диференціюватися в клітини будь-якої тканини, у тому числі в клітини імунної і кровотворної систем (5спцідіпег М., Мапика О., НеКомії2-ЕІдег У. ЕМесів ої 8 дгом/п Тасіог5 оп Ше ажйегепйайоп ої питап етбгуопіс зієт сеїЇв // Ргос. Маї. Асай. сі. ОБА. - 2000. - МоІ.97. - Р.111307-11312.).

Особливістю структурно-функціональної побудови останніх є те, що вони уявляють собою динамічну сукупність клітин-попередників, фіксованих на стромальних елементах, і диференційованих клітин-ефекторів, які виконують свої функції за межами спеціалізованих органів. Зокрема, така особливість структурно- функціональної побудови системи крові призводить до виникнення так званого "кров'яного хімерізму", коли в організмі імунологічно послабленого реципієнта після трансплантації кісткового мозку одночасно існують еритроцити, антигени яких належать до різних груп. Тривалість кров'яного хімерізму досягає 90-420 днів, а динаміка змін груп крові характеризується поступовим зменшенням кількості еритроцитів донора на тлі перманентного зростання еритроцитів, які мають групові антигени реципієнта (Зотиков Е.А. Карл Ландштейнер и его наследие//Гематология и трансфузиология. - 2001. - 7.46, Ме5. - С.25-27.), що є яскравим проявом законів збереження клітинної маси, стромальної сингенної преференції і алогенної інгібіції (Вершигора А.Е.

Общая иммунология. - К.: Вища школа, 1989. - 736бс; Шевченко Ю.Л., Жибурт Е.Б. Безопасное переливание крови. - СПб, Питер, 2002. - 320с; Кікоуа 5., НіггоКо Н., дипіі І., Мазивзпі А., 5Ппідеги Т., ЗПпПіпгуц Г., Такавпі М.,

Зивити І. Майог пізвіосотрайрійу сотріех гевіпсйоп рейуееп Ппетаїйороїієїйс 5ієт сеї апа взіготаї! сеїЇв5 іп міго//5іет СеїЇв. - 2001. - МоіІ.19. - Р.46-58.). Загальновизнано, що строма органів є не лише їх просторовим каркасом, а уявляє собою сукупність біологічно активних елементів, які забезпечують всі аспекти функціонування паренхіматозних клітин. В ембріогенезі людини і ссавців утворення поряд 350 типів спеціалізованих клітин відбувається за рахунок клітинного пула зародкових листків (екто-, енто- і мезодерми), а також мезенхіми, яка виконує численні метаболічні, сигнальні, механічні і морфогенетичні функції.

Клоногенна проліферація стовбурових і прогеніторних мезенхімальних клітин, їх міграція та синтез біологічно активних речовин регулюють органогенез, забезпечують випереджуючий розвиток кровоносних і лімфатичних судин та формування строми майбутніх органів. Впродовж ембріогенезу мезенхімальні клітини виробляють ростові фактори (НОЕ, ТОБ-ох, ЕСЕ, КОР), до яких на мембранах паренхіматозних прогеніторних клітин експресуються рецептори, а в диференційованій дорослій тканині стромальна сітка генерує сигнали для підтримки життєздатності і проліферації прогеніторних клітин (ЗСЕ, НО, 1-6, ІІ -7, 1-8, 11-11, 11-12, 11-14, /- 15, М-С5Е, МЕ та ін.). Більше 2095 мезенхімальних стовбурових і прогеніторних клітин після введення в кров у дорослої людини захоплюється стромою кровотворної тканини і паренхіматозних органів, що в теперішній час використовується для підвищення ефективності реколонізації кісткового мозку в онкологічних хворих після радіаційного опромінення, коли незрілі мезенхімальні клітини вводять у кров разом з гемопоетичними стовбуровими/прогеніторними клітинами (Оеппів У.Е., Спагрога Р. Огідіп апа аїййбегепіайоп ої питап апа тигіпе вігота//бієт Се. - 2002. - МоІ.20. - Р.205-214.; Нивв НА. ІзоЇїайоп ої ріїтагу апа іттопаїййей СО34- петагйороїєїйс апа тезепспутаї! віет сеї їот мапоив зоигсев//5іет Сеїїв. - 2000. - МоїІ.18. - Р.1-9.; Такефювні К.,

Мипео І., Нігоко Н., Масуа Г, ТакКазпї Е., Вуокеї 0О., Нігокаги І., Зизити І. Стписіа! гоЇїє ої допог-депмей віготаї! сеї іп зиссезвіці ігеайтепі ог іпігасіаріє ашоїттипе аізеазез іп МАГ Лрг тісе Бу ВМТ міа ропаї меіп//їет Сеїїв. - 2001. - МоіІ.19. - Р.226-235.; Тіап-Хце Е, НігоКко Н, Тіе-Мап у., Спепд-2е У., 7пе-Хіопод І., 5п!и-Віп С, Мип-2е С,

Віао Р., Сцо-Хіапд У., Оіпд Г., Зизити І. Зиссезайі аПодепеїс ропе татом ігапзріапіайоп (ВМТ) Бу іпіесіоп ої ропе татом сеїЇ5 міа рога! меіп: віготаї сеї аз ВМТ -Гасіїнайпд сеїІв//5ієт СеїІв. - 2001. - МоіІ.19. - Р.144-150.).

Враховуючи зазначене вище, гіпотеза про можливість інсталяції де помо системи контролю антигенного гомеостазу організму за допомогою ЕППК набуває наукової реальності.

Поставлена мета досягається тим, що для переінсталяції системи контролю антигенного гомеостазу організму ссавців застосовуються мегадози ЕППК, що індукує імунологічну толерантність до алотрансплантатів шкіри і селезінки у статевозрілих щурів.

Для виділення ЕППК вагітних самок щурів (сертифікат розпліднику Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця

НАН України) вводили в наркоз (натрію етамінал - 40мг на кг маси тіла) на 11-13 стадіях розвитку ембріонів за

Астауровим (Обьекть! биологии развития/Под ред. Б.Л.Астаурова. - М.: Наука, 1975. - 580с). Після асептичної обробки операційного поля (967 етиловий спирт, йод) виконували серединну лапаротомію по Ійпеа аїра.

Обидва роги матки виводили в операційну рану і розрізали стерильними ножицями поперек (біля ембріонів).

Останні вилущували в стерильну чашку Петрі з охолодженим до 4"С середовищем Хенкса з гентаміціном (кінцева концентрація - 0,00195). Після потрійної промивки з ембріонів виділлли ЕППК за розробленою нами методикою (заявка на патент України Ме 20022097445). Суспензію ЕППК профільтровували через капроновий фільтр (200мкм). До фільтрату додавали рівний об'єм 5950-го розчину димексиду (попередньо профільтрованого через клітинний фільтр з розміром пор 0,20мкм). Після трансплантації шкіри дослідним щурам внутрішньовенно вводили суспензію ЕППК (контроль життєздатності здійснювали шляхом світлової мікроскопії при забарвленні клітин трипановим синим) у мегадозі. Поняття "мегадоза" передбачає наявність в 1Тмл клітинної суспензії декількох мільйонів життєздатних ядровмістних клітин. За розробленою нами методикою вихід ЕПІПК становив 807109/л. Розрахунки свідчать, що, наприклад, максимальна доза гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини при внутрішньовенному введенні 4,0мл суспензії, що містить 2,57108/мл ядровмістних клітин, забезпечує концентрацію останніх у крові (без врахування тканинного пулу), яка складає 0,2 клітини на 1мкл. Доза, яка застосовувалась у наших дослідженнях (80-103/л ЕППК в об'ємі 15мл/кг маси тіла тварини), дозволяє досягнути концентрації ЕППК у 16000 клітин на 1мкл крові, що вдвічі вище верхньої межи норми кількості лейкоцитів у крові людини і в 80000 разів більше, ніж після введення тієї дози клітин, що застосовується в клініці у теперішній час (Снігир, Н.В. Застосування гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини в лікуванні цитостатичної мієлодепресії у онкологічних хворих: Автореф. дис. ... канд. мед. наук/14.01.07 - онкологія. - Київ, 2001. - 20а). Контрольним тваринам вводили відповідний об'єм 590-го розчину димексиду в середовищі Хенкса. Всього в роботі використано 376 білих щурів. Протокол операції попарної алотрансплантації шкіри. По дві тварини одночасно вводили в наркоз (натрію етамінал - 40мг на кг маси тіла). Ножицями ретельно видаляли шерсть на шкірі спіни. Шкіру обробляли 96" спиртом та спиртовим розчином йоду. По шаблону (діаметр - 5см) концентрованим йодом відмічали межі шкірних лоскутів. Лоскути шкіри відсепаровували і проводили попарну (одна тварина з пари щурів входила до групи контролю, інша отримувала ЕППК) алотрансплантацію шкіри з ушиванням шкірних країв вузловими однорядними швами. Протокол операції попарної алотрансплантації селезінки. По дві тварини одночасно вводили в наркоз (натрію етамінал - 4Омг на кг маси тіла). Ножицями ретельно видаляли шерсть на шкірі живота. Шкіру обробляли 96" спиртом та спиртовим розчином йоду. Після серединної лапаротомії у обох щурів видаляли 1/2 селезінки, декапсулювали її і виконували попарну (одна тварина з пари щурів входила до групи контролю, інша отримувала ЕППК) алотрансплантацію селезінки в чіпець. Шкіру і м'язи ушивали вузловими однорядними швами.

Виділення клітин. На першу, другу, третю, четверту, п'яту, шосту, сьому, десяту і п'ятнадцяту доби після операції у тварин під нембуталовим наркозом видаляли тімус, кістковий мозок, брижові лімфовузли і селезінку. Органи роздрібняли і виділяли клітини за допомогою м'ягкого піпетування тканин у забуференому фосфатами 0,995-ному розчині натрію хлориду (ЗФНХ) з наступним фільтруванням отриманої суспензії через капроновий фільтр (200мкм).

Активність каспази-8 і каспази-З3 у лізатах клітин, виділених із тимуса, кісткового мозку, селезінки і лімфатичних вузлів визначали за допомогою реактивів і рекомендацій фірми Віомізіоп (США) з реєстрацією показників на мультіскані «Уніплан-М» (Росія). Концентрацію білка в суспензії клітин визначали за методом

Лоурі. Для визначення тканинної локалізації ЕППК після їх внутрішньовенного або внутрішньочеревного введення проводили забарвлення мембран ЕППК лінкорним флюоресцентним барвником "РКН 67" згідно інструкції фірми-виробника (Зідта). Для дослідження апоптозу клітини забарвлювали за методикою 5пПіті?и 5. еї а. (Зпітіги 5., Едиспі У., Катіїке МУ. Іпмоїметепі ої ІСЕ Тату ргоїеазез іп ароріозів іпдисейд Бу геохудепайоп ої пурохіс перайосуїевз//Атег. У. Рпувіо!. - 1996. - МоІ.271. - Р.2949-5958.). У суспензію клітин вносили розчин ядерних барвників "Хехст 33342" і пропідіум йодид (кінцева концентрація 15мкмоль/л) та інкубували впродовж

15хв при кімнатній температурі, в темряві. Для відмивання барвників до суспензії клітин додавали (8:1) розчин

ЗФНХ і центрифугували при 9009 протягом 7хв. Приготування препаратів. Суспензію забарвлених клітин наносили на предметне скло і після висушування фіксували в парах формаліну впродовж 10хв, промивали, висушували і заключали в РоїЇутоишпі. Підрахунок клітин. Препарати досліджували в люмінесцентному мікроскопі "МЛ-2" (імерсійний об'єктив, збільшення - в 100 разів). Підраховували кількість апоптотичних клітин і тілець, а також клітин з вираженою конденсацією ядерного хроматину за апоптотичним типом (у кожному препараті оцінювали на наявність ознак апоптозу по 400 клітин). Мікрофотографування. Використовували кольорову негативну плівку "Кодак сої 100" (І5О 100/21) з витримкою при фотографуванні люмінесценції від до 120с, фазово-контрастного зображення - від 4 до 15с.

Отримані результати статистично оброблені на РОС ІВМ Репійшт ПП за програмою "Віовіаї" (Гланц С.

Медико-биологическая статистика. - М.: Практика, 1999. - 459с).

Перелік фігур, що демонструють результати дослідження.

Фіг.1-фФіг.8 - вплив ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин (ЕППК) на приживлення алотрансплантатів селезінки у щурів.

Фіг.1 - фото контрольної тварини, яка не отримувала ЕППК. Через 1міс. після операції під нембуталовим наркозом проведена серединна лапаротомія. В операційну рану вивернуто чіпець, в який вшивалась алоселезінка. Остання осумкована чіпцем.

Фіг.2 - за тих самих умов проведена серединна лапаротомія щуру, який отримував ЕППК. Алоселезінка знаходиться у товщі не запаленого чіпця. До неї підходять судини.

Фіг.3 - на фото наведені результати розтину запальної кишені чіпця у контрольного щура через 1міс. після алотрансплантації селезінки. Всередині детритних мас знаходиться алоселезінка блідо-коричневого кольору, яка вільно лежить на сполучнотканинній капсулі, не має судин, що відходять від чіпця.

Фіг.4 - на фото наведені результати спроби виділити алоселезінку з чіпця. Навколо травмованого при цьому чіпця вогнища кровотечі. Алоселезінка звичайного кольору, щільно контактує з чіпцем через васкуляризацію його судинами.

Фіг.5 - фото контрольної тварини, яка не отримувала ЕППК. Через 2міс. після операції під нембуталовим наркозом проведена серединна лапаротомія. В операційну рану вивернуто чіпець, в який вшивалась алоселезінка. Остання знаходиться в запальний кишені, утвореної чіпцем.

Фігб - через 2міс. після операції проведена серединна лапаротомія щуру, який отримував ЕППК.

Алоселезінка знаходиться у товщі нормального чіпця, васкуляризована.

Фіг.7 - на фото наведені результати розтину запальної кишені чіпця у контрольного щура через 2міс. після алотрансплантації селезінки. Всередині кишені знаходяться лише детритні маси, алоселезінки немає. Стінки запальної кишені утворені грубою сполучною тканиною.

Фіг8 - фото оалоселезінки тварини, яка отримувала ЕППК. 2міс. після операції. Селезінка васкуляризована, звичайного кольору. Чіпець не має запальних змін.

Фіг.9 - Загальна схема досліду по індукції ембріональними плюріпотентними прогеніторними клітинами (ЕПГПО) імунологічної толерантності до алотрансплантатів селезінки.

А - виділені з ембріонів самки щура ЕППК внутрішньовенно введено щуру-реципінту. Контрольна тварина отримує відповідний об'єм розчину Хенкса. Виконується попарна алотрансплантація: половина селезінки контрольного щура трансплантується в чіпець щура-реципієнта ЕППК, а половина селезінки останнього - в чіпець контрольної тварини.

В - через 2міс. після операції виконується серединна лапаротомія, яка виявляє приживлення алоселезінки у щура-реципієнта ЕППК і відторгнення алоселезінки у контрольного щура. Відразу виконується етап с.

С о - половину селезінки контрольного щура, що залишилася після першої операції (див. етап А), трансплантовано в чіпець тварини-реципієнта ЕППК, а залишок селезінки щура-реципієнта ЕППК вшито в чіпець контрольної тварини. Ділянка шкіри щура-реципієнта трансплантована контрольній тварині та, навпаки, ділянка шкіри контрольної тварини трансплантована дослідному щуру, який отримував ЕППК. о - через 2 тижні після алотрансплантації другої половини селезінок контрольної і дослідної тварин, які отримували ЕППК відторгається алошкіра, але приживлюється алоселезінка, тоді як у щурів контрольної групи спостерігається відторгнення як алотрансплантатів як шкіри, так і селезінки.

Фіг.10-Фіг.15 - результати досліду по індукції ембріональними плюріпотентними прогеніторними клітинами (ЕППК) імунологічної толерантності до алотрансплантатів селезінки.

Фіг.10 - 11 - фотографії демонструють етап В загальної схеми досліду, наведеної на Фіг.9: у щура, який отримував ЕППК, відбувається приживлення алоселезінки, а у тварини контрольної групи - її відторгнення. (Фіг.10 - введення ЕППК, Фіг.11 - контроль).

Фіг12-13 - фотографії демонструють етап 0 загальної схеми досліду, наведеної на Ффіг.9: алотрансплантати шкіри відторгаються як у контрольної, так й у дослідної тварини. (Фіг.12 - введення ЕППК,

Фіг.13 - контроль).

Фіг.14-15 - фотографії демонструють етап О загальної схеми досліду, наведеної на Ффіг.9: повторна алотрансплантація другої половини алоселезінки у щура, який отримував ЕППК, завершується її приживленням, тоді як у контрольної тварини відбувається відторгнення алоселезінки. (фФіг.14 - введення

ЕППК, Фіг.15 - контроль).

Фіг.16-25 - РКН 67 - позитивні клітини в тимусі щурів.

Фіг.16 - люмінесцентна мікроскопія базальної суспензії ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин, перед її введенням щурам-реципієнтам.

Фіг.17 - фазово контрастна мікроскопія базальної суспензії ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин, перед її введенням щурам-реципієнтам.

Фіг.18, 20, 22, 24 - люмінесцентна мікроскопія тімуса, яка виявляє РКН 67 - позитивні клітини у вилочковій залозі.

Фіг.19, 21, 23, 25 - фазово контрастна мікроскопія тімуса, яка виявляє РКН 67 -позитивні клітини у вилочковій залозі.

Фіг.26-32 - апоптоз і активність каспаз в органах імунної системи щурів з алотрансплантацією селезінки, які отримували ембріональні плюріпотентні прогеніторні клітини ембріону (ЕППК).

Фіг.26 - апоптоз у тимусі щурів, які отримували ЕППК.

Фіг.27 - апоптоз у кістковому мозку щурів, які отримували ЕППК.

Фіг.28 - апоптоз у селезінці щурів, які отримували ЕППК.

Фіг.29 - апоптоз у лімфатичних вузлах щурів, які отримували ЕППК.

Фіг.30 - динаміка апоптозу (95) клітин тімуса контрольних тварин (темні стовпчики) і щурів, які отримували

ЕППК (світлі стовпчики).

Фіг.31 - активність каспази-8 (а) і каспази-3 (б) в тімусі контрольних тварин (темні стовпчики) і щурів, які отримували ЕППК (світлі стовпчики) (одиниця виміру - ШЕ/І мг білка).

Фіг.32 - активність каспази-8 (а) і каспази-3 (б) в кітковому мозку контрольних тварин (темні стовпчики) і щурів, які отримували ЕППК (світлі стовпчики) (Одиниця виміру - ОЕ/1 мг білка).

Фіг.33 - 34 - лінії тренда інтенсивності апоптозу клітин тімуса і кісткового мозку контрольних тварин і щурів, які отримували ембріональні плюріпотентні прогеніторні клітини ембріону (ЕГШК) при алотрансплантації селезінки.

Фіг.33 - лінії тренду відсотку апоптотичних клітин у тимусі контрольних щурів (пунктирна лінія) і тварин, які отримували ЕППК (безперервна лінія).

Фіг.34 - лінії тренду відсотку апоптотичних клітин у тимусі контрольних щурів (пунктирна лінія) і тварин, які отримували ЕППК (безперервна лінія).

Фіг.35-41 - апоптоз ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин (ЕППК) у змішаній суспензії (від двох різних ембріонів).

Фіг.35 - суспензія А. ЕППК забарвлені РКН 67.

Фіг.36 - суспензія В. ЕППК забарвлені пропідія йодидом.

Фіг.37 - суспензія А. ЕППК забарвлені РКН 67 і пропідія йодидом.

Фіг.38 - змішана суспензія ЕППК "АВ". Класичний апоптоз клітини В.

Фіг.39 - змішана суспензія ЕППК "А«В". Клітини А: конденсація хроматину. Віебв.

Фіг.40 - змішана суспензія ЕППК "АВ". Апоптотичний розпад ядра клітини В.

Фіг.41 - змішана суспензія ЕППК "АВ" через 18год інкубації: накопичення апоптотичних клітин і тілець.

У щурів, які отримували ЕППК, впродовж експерименту відторгнення алотрансплантатів шкіри не відбувалося, тоді як у групі контрольних тварин алотрансплантати шкіри відторгнулись на третю (595 тварин), сьому (7595 випадків) і девяту (20905 щурів) доби спостереження. Контрольна лапаротомія, що була проведена у щурів через 1 і 2 місяці після алотрансплантації селезінки, виявила приживлення останньої тільки у тварин, яким вводили ЕППК (Фіг.1-8). Для виключення імовірного імунодепресивного ефекту ЕППК і підтвердження розвитку під їх впливом імунологічної толерантності (тобто ареактивності імунної системи до конкретного антигену, яка була індукована саме цим антигеном), проведено серію дослідів, загальна схема яких наведена на Фіг.9. На етапі А експериментальним тваринам першої групи вводили ЕППК (реципієнти ЕППК), щурам другої групи - розчин Хенкса (контрольні щури). Під нембуталовим наркозом проводили попарну алотрансплантацію 1/2 селезінки (див. протокол операції). Через 2 місяця при лапаротомії встановлено приживлення алоселезінки у тварин, яким вводили ЕППК, та відторгнення алотрансплантатів селезінки у щурів контрольної групи (Ффіг.9, В, Фіг.10-11). У тих самих пар щурів на наступному етапі досліду одночасно проведено алотрансплантацію шкіри і другої половини селезінки (Фіг.9, С). Через 2 тижні встановлено приживлення другої половини алоселезінки у тварин першої групи та інтенсивну реакцію відторгнення алоселезінки у контрольних щурів (Фіг.14-15)3. Важливим є те, що відторгнення алотрансплантатів шкіри спостерігалося у всіх тварин обох груп (фіг.9, О, фіг.14-15), тобто результати експерименту свідчать, що внутрішньовенне введення ЕППК викликає не імуносупресію, а формує стійку імунологічну толерантність до того алоантигену, який знаходився в організмі під час введення ЕППК.

Відомо, що імунологічна толерантність до власних антигенів організму не є генетично детермінованою, а встановлюється в процесі онтогенезу за механізмами позитивної і негативної селекції Т-лімфоцитів у вилочковій залозі. Для індукції імунологічної толерантності необхідною умовою є не тільки наявність у тимоцитів певного ступеня спорідненості рецепторів до молекул головного комплексу гістосумісності, але й контакт Т-лімфоцитів, що дозрівають, з пептидним матеріалом власних тканин, експресованим на епітеліальних, дендрітних та інтердігітатних клітинах тімуса (Ройт А., Бростофф Дж, Мейл Д.

Иммунология./Пер. с англ. В.И.Кандрора, А.Н.Маца, Л.А.Певницкого, М.А.Серовой. - М.: Мир, 2000. - 592с). "Завантаження" тімуса власним антигенним матеріалом відбувається в процесі ембріогенезу, після чого утворюються структури гематотімічного бар'єру (Хльістова 3.С. Становление системь! иммуногенеза плода человекалї/АМН СССР. - М. Медицина, 1987. - 256с). У людини гематотімічний бар'єр утворюється ще внутрішньоутробно, у гризунів - через 5 днів після народження. Варто зазначити, що у щурів імунологічну толерантність можна індукувати шляхом введення чужерідного антигену впродовж перших 5-ти днів неонатального періоду (Вершигора А.Е. Общая иммунология. - К.: Вища школа, 1989. - 736с; Апдегззеп С,

Зіюоскег Е., Кіїп: Б... еї аІ. Мевііп-зресійс дгеєп Пиогезсепі ргоїєїп ехргезвіоп іп етбгуопіс вієт сеїІ-депмей пеишгаї ргесигеог сеї ве г ігаперіапіайоп//бієт СеїІв. - 2001. - МоІ.19. - Р.419-424.). Отже, для реалізації початкових етапів механізму переінсталяції системи контролю антигенного гомеостазу дорослого організму потрібна інтеграція ЕППК не тільки з клітинами кісткового мозку, але й з клітинами тімуса, які розташовані забар'єрно. Іншою необхідною умовою є підвищення проникності гематотімічного бар'єру для алогенного пептидного матеріалу.

Результати наших досліджень свідчать, що вже через 1 годину після внутрішньовенного і через 1,5 години після внутрішньочеревного введення ЕППК, мембрани яких були забарвлені РКН 67, мічені клітини виявляються серед клітин тімуса (Фіг.16-25). Окрім того, РКН 67 - позитивні клітини локалізувалися в лімфовузлах, селезінці і кістковому мозку. В останньому їх наявність доведена у подібних експериментах на інших видах тварин (АзКепазу М., 2огіпа Т., Рагказ О.Г., зпаій і. Тгапзріапіей петогороіеїіс сеїї5 зееєй іп сіив(ег5 їп гесіріепі бопе татом іп мімо//бієт Сеїв. - 2002. - МоІ.20. - Р.301-310.). Варто зазначити, що РКН 67 є лінкорним барвником, який не змінює природних властивостей клітинної мембрани (АзКепазу М., Рагказ О.Г.

Апіїдеп багтіегз ог амайаріе зрасе до пої гевінісії іп зїш адневіоп ої петороїеїіс сеї Ю ропе татом зігота//5іет

Сеїїв. - 2002. - МоІ.20. - Р.301-310.). Важливість отриманого факту полягає в тому, що наявність ЕППК в тімусі вже через 1 годину після внутрішньовенного введення свідчить про їх здатність підвищувати проникність гематотімічного бар'єру. Надалі диференціювання ЕППК, як це було встановлено іншими авторами (Такаїзиди

У., Мазапіае У., зей К., МоКко К., МХо5піуцкі М., Зпідеакі І., МиКкіо Т. Іп міго айегепіайоп ої етбгуопіс 5іет сеїЇ5 їпо Ппераїйосуїе-іїКе сеї ідепійієа ру сейшаг иріаке ої іпаосуапіпе дгеєп//біет СеїЇв. - 2002. - МоіІ.20. - Р.146- 154), визначається виключно їх мікрооточенням, у першу чергу, стромальним (Віапсо Р., Кітіписсі М.,

Стопіпов 5., Вобеу Р.С. Вопе татом зіготаї! 5ієт сеїІв: пайшге, Біоіоду апа роїепіа! арріїсайопв//5їет СеїЇв. - 2001. - МоїІ.19. - Р.180-192). У вилочковій залозі диференціювання ЕППК в епітеліальні, інтердігітатні і дендритні клітини на тлі алоантигенного завантаження тімуса призводить до експресії алоантигенів (в наших дослідах - шкіри і селезінки), які включаються до процесу негативної селекції Т-лімфоцитів. Водночас на утворених де помо клітинах тімуса експресуються молекули головного комплексу гістосумісності І і ІЇ класів, які генетично детерміновані в ЕППК. Складається ситуація, що подібна імунологічної толерантності тетраплоїдних гермафродитів до антигенів обох їх батьків - в організмі реципієнта ЕППК встановлюється подвійний стандарт гістосумісності На різних експериментальних лініях тварин показано, що тетрапарентальні алофенні миши-хімери мають антигени гістосумісності обох батьківських ліній і не відторгають їх трансплантатів (Вершигора А.Е. Общая иммунология. - К.: Вища школа, 1989. - 7366с).

З іншого боку, в кістковому мозку ЕППК за дії стромального мікрооточення зазнають диференціації в гемопоетичні клітини-попередники, в тому числі і попередники лімфопоезу. За таких умов ключовим питанням переінсталяції системи контролю антигенного гомеостазу організму при введенні ЕППК є проблема конфлікту двох одночасно існуючих в організмі груп зрілих імунокомпетентних ефекторних клітин. Відсутність локальних і системних проявів імунного запалення при наявності короткочасного позитивного клінічного ефекту після введення малих доз гемопоетичних стовбурових клітин ембріональної печінки людини (Новицька А.В.

Лікування хворих на цукровий діабет з імунними та гематологічними порушеннями гемопоетичними клітинами ембріональної печінки людини: Автореф. дис. ... канд. мед. наук/14.01.14 - ендокринологія. - Київ, 2000. - 20с.) вказує на те, що конфлікт між двома різними групами зрілих лімфоцитів може реалізуватись через апоптоз.

Важливо, що кровотворні попередники завжди знаходяться у стані готовності до розвитку апоптозу і потребують для захисту від реалізації програми загибелі протекторної дії цитокінів. Саме тому в патології системи крові суттєву роль відіграє апоптоз, зокрема, з його підсиленням зв'язаний патогенез цілого ряду цитопеній та панцитопенії (В ладимирская Е.Б. Механизмь! апоптотической смерти клеток//Гематология и трансфузиология. - 2002. - Т.47, Ме2. - С.35-40.).

За результатами наших досліджень, у препаратах тканин тімуса, кісткового мозку, селезінки і лімфовузлів після попарної алотрансплантації шкіри і селезінки у всіх тварин вивлялись клітини на різних стадіях загибелі за механізмом апоптозу (фіг.26-32). Аналіз динаміки змін відносної кількості апоптотичних клітин в центральних і периферичних органах імунної системи щурів показав, що в тімусі тварин, які отримували ЕППК, інтенсивність апоптозу значно перевищувала контрольні показники на першу, третю, шосту і п'ятнадцяту доби спостереження (Фіг.3О) при наявності експоненціального тренду апроксимації отриманих результатів, тоді як динаміка апоптозу в тімусі контрольних щурів характеризувалася трендом логарифмічним (Фіг.33). Кількість апоптотичних клітин у кістковому мозку також різко зростала у тварин, які отримували ЕПГЖ, виявляючи при цьому лінійний тренд зростаючої динаміки, на відміну від контролю, де апроксимація динаміки змін кількості апоптотичних клітин виявляла експоненціальний тренд з вектором спрямованого зниження (Фіг.34). Водночас як у тімусі, так і в кітковому мозку зростала активність каспази-8 і каспази-3 (Фіг.26-41).

Роль апоптозу в детермінації структури клітинних популяцій особливо важлива для клітин імунної системи.

В основі селекції клонів тимоцитів лежить здатність їх мембранних рецепторів розпізнавати ліганди, які присутні на поверхні клітин строми тімуса. В юних клітинах фенотипу СО4-СО8: у зв'язку зі слабкістю системи репарації накопичуються численні розриви ДНК, що призводить до реалізації програми загибелі, якщо вони не отримають сигналу від епітеліальних клітин строми, який викликає підсилення експресії захисного фактора

ВсІ-2. Такий сигнал отримують тільки ті клони тимоцитів, які здатні розпізнавати автологічні молекули гістосумісності (позитивна селекція). Інші клітини отримають сигнал до апоптозу, коли роспізнають автологичні пептиди, що вбудовані в автологічні молекули гістосумісності (негативна селекція). У результаті структура першопочаткової популяції тимоцитів, які володіють величезною різноманітністю антигенрозпізнаючих рецепторів, у тому числі й потенційно небезпечних, корегується і зрілі Т-клітини реагирують лише на чужерідні пептиди, які презентуються разом з автологічними молекулами гістосумісності (Ройт А., Бростофф Дж., Мейл

Д. Иммунология./Пер. с англ. В.И.Кандрора, А.Н.Маца, Л.А.Певницкого, М.А.Серовой. - М.: Мир, 2000. - 5926).

Таким чином, у разі інтеграції ЕППК в тімус і кістковий мозок та їх диференціювання у спеціалізовані клітини, тип яких визначається стромальним мікрооточенням, жоден із зазначених вище механізмів дозрівання

Т-лімфоцитів в процесі індукції природної імунологічної толерантності не порушується, а включення до утворених де помо антигенпрезентуючих клітин вилочкової залози алоантигенів трансплантованих органів розширює спектр "власних" антигенів, що забезпечує специфічну ареактивність до алотрансплантатів.

Для відповіді на запитання, чи дійсно відбувається заміна імунокомпетентних клітин на нові, чи має місце лише оновлення системи контролю антигенного гомеостазу організму внаслідок створення в тімусі подвійного

МН (НГА)-стандарту, потрібно було визначити як поводяться ЕППК з різними гаплотипами за умов існування в одній клітинній суспензії. Дослідження динаміки апоптозу виявило його різке збільшення при чотирнадцятигодинній інкубації змішаної суспензії ЕППК з різними гаплотипами (ЕППК, що були виділені з різних ембріонів), відносно показників, отриманих при ізольованій інкубації гомогенних суспензій ЕППК (фіг.35- 41). Отриманий факт свідчить про те, що ЕППК мають системи для розпізнавання подібних клітин з іншим гаплотипом і здатні реалізувати програму клітинної загибелі, що є основою для заміни стовбурового пулу клітин кісткового мозку на новий за умов введення в організм мегадоз ЕППК.

Результати біологічних експериментів підтверджують відкриття нового явища в біології і медицині, що полягає в індукції мегадозами ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин імунологічної толерантності шляхом створення нової бази імунокомпетентних клітин з одночасною інсталяцією де помо системи контролю головного комплексу гістосумісності (ефект Кухарчука-Радченка-Сірмана).

Відповідність критерію "новизна" даного способу забезпечує те, що в біології і експериментальній медицині відкрито невідоме раніше явище, яке полягає в індукції мегадозами ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин імунологічної толерантності до алогенних трансплантатів (ефект Кухарчука-Радченка-

Сірмана).

Відповідність критерію "суттєві відмінності" даного способу забезпечує те, що, на відміну від відомих раніше способів попередження реакції відторгнення трансплантату, імунологічна толерантність досягається шляхом створення нової бази імунокомпетентних клітин системи контролю антигенного гомеостазу організму.

Відповідність даного винаходу критерію "позитивний ефект" забезпечує те, що розроблений спосіб дозволяє принципово змінити підходи до лікування хвороб людини і створити новий напрямок в терапії невиліковних на сьогоднішній день захворювань - біологічну інформаційно-інтегративну медицину. г т ве зн их ло оо овал «и щеВЯ п в

М у по Кия

ЩЕ вне ий пох 7 зо 2

Шу Жх У но и ІНК я Й що. по МОН Б

Ме ОК З ек и, в

Я Мшоки Швея нн . Я ко ! л й «щі

ЩЕ ЖК ща се з | Шх я Е іх а Й й ще Ко в. шо Є р ВН я Що; тан що.

М даси я

НУ .. зйКоХ КВК. ки :: ВО ку БЕ Не о З ОВО ЯНА КО ой оо шк о 0 НЯ

УААН ше о 7" а са ша М СХ

Фі?

НЯ о. й

Ба гу - я шо то Б

Фі. З шорти кт хя те ет вттовя а рт о ще 7 роя 7 по СО ЖИ

Жуан жу е и СО усній Бо оп ТЕ й Я "я Й шок щ тож ї й ! в. ша Ж м. . ще на Не і ШИ ож

З Бех кН ! й о ва М - - КТ хг т

МОБ а , "7 Я КК Ех. Б , х ї. щоя З й чк ВЗ

Б. і 4 с й з

Ще У ї до ОА и.

БК - ВИК. дих БЕН

НК - х

Ох НИ й. . шко "та по УМІ шк Й жі: я оо г: з | - ОВ

І й М осо

Й ШИХ п й не і й й Ії ; х й ве й й

Фіг, 5 шви ВИ яти м ЖК му В с зи ВЯ Ще ЕК Й ех В фу в. жо о лк, о ми 2 КИ х

Ех ен и опе ай: ОМ ІЕ у а о о г 5 пе о НХ й ш пики Кс Пе У гу

Енн НН шов й жк й ее й Шк Ак: Й я жи екз ж Е Мою з ї: 5 заг ра "Ж 5 я гук те є Х за ї; КЕ СА,

Р сть . за Ж. і фіг. 6 ши КТ ккд а сен н х ; нь У Ки ш хо шина ННЯ в

Оу І . й шо тов і 7 ще ОВ: рак ше му вй

Й си Р Б ж о зай ДИ й т

М, ; шо,

Я ПИ Ко ж х о твй г ме ЗИ У т у, а . нок є їй з г й о ІЛ е - Ся не ї Мая Ще ну

Її й сх Й ку 2-х Й:

ВИНИ НН пай

Фіг. ї

: ; Нх СНИ ін хо | й о ЦЕ ке що я ЩЕ ; «В. З з Я КООВ В й з пед и і Й є й ій : їх

НИ: в а жк Ж КО во ТИ, х ро З я БК щі А оо ех Ж - лід и фіг. 8 ж ні М

Деснння й - А воли М

Ко Пн (р жив |) нн | Яаптиз самих Що шк рення шт ку й Н й шо Й С, --- 555 о «пит 100 Реципжит БПК у, | Хектроль

Ко ШШ2Ш2Ш. Н сореЖмхМ р пт, же) шт 7 ИЙ " вк -7 ній йнни. Ка

І ЛрИЖИВНЕННЯ СЯ Єватовгнення пд Й ння в яко Р ВВ»,

Я сом и сени моди ИН

Др ді покруепевоіовеввво вия ТЯ рай р дн і -о

І ше 10 тех ее.

ТТ... ди оний р ща ЯН важ тю

Бідтеечекня прі | Ї Відтомниенк ккоюря, прижизпення селезінки Н тав овлонЕй і «віг З

ВОВК ОХ КК ХУ

М о ЕВ

З Х мМ їх З о. с .

З З ОО Я в

РОС АБ ОК о МКК її «Ж Ух їй що

З я ее

Ко СХ и

Ух З Бека с і о х що КОХ с с ж КЕ за о сх . ть З г . За а хх о. с о. с ОХ і о . У

ХХ о: с о хх -Х пр о. о. її З

Х о. ХХ 5 я

Ге ОКХ ХХ ХК З о. а З г

В о. ж хх х Х ХХ - х ій З й х й

З о. СХ ї . о .

Фіг . ї е ще ща І

З Її : І ХХ АК і - ок х ї х КЕ . 5 ї Ж Не с їх КО : вк т що Щі ї ї й У ЩЕ х Ох У

Н с Зх 5 і ; о и: ЗО о ї зх о х Х 3 ї З о о. ще У : Е с МК ХК х Й о зе їх Б. х

М с ке ХОМ х оС

Н хх СО ох УЗ

Н ще с ще М Кс КІ : У о ех ОК и Н

І о н СЕ За що ї : г З о : с. ТК Що: і ВО с шо З 5 : х . -- ЗВ о . шо Зі шо З . Б. 7 Б о. о як КА: с З З о -- ак с Шк маанаь ве о за І се 5 о ща що пжжх п 5 КХ х Ох її ях Ї се ХХ хо ва З се кекхх З Ян

МУ СХ пк деку с плн ї

І т я КВУ дк ї і я о зх ЗК « хх ї

Н п Кк з Як шо

З Ко с М ії

Ї У о ХХ о. ї п ХХ ОО СК

Я т є і -

Н - х і З що з і З о о. о ї Х . хх с шо ОО

ІЗ Б с ТК с

Н її .

Н і С З с о.

Н В Е с. І : й В п:

З ех З с СО У хо і у 3 о

Ух. в Кох

Шо Кох Зх с о

У З о. с ї

Ва семи МЕ се Око і з о. денні я У Х, Т

МОХ х ще З й с НО не !

Її х ще ; хх - Н

ХК З С ХХ М ХК Сх ХО а ї ще Н

Е хх ГУ ще і

Х Ж ПК с з ще ї

ХУ о М З о о зх г ц

ХХ ха о. с сх СО З Я: с її. хе

КЕ ХО о - ї КО, їх т КК сх,

Ох о ХХ ЗХ ще ок З ще

ЗХ ПК КЕ ХК с о Кх СХ х ще о. о. Я . : ще З т В х с СХ о. ХК о. ВАХ З о й .

Х СХ х о с х шо

ОХ ОХ ЗХ ж

ХХ г хх

Й

Х Со с а о. і і о. З 7

Ух ж сх ХХ КК е хх СХ ОА ж СХ с о. ЩО ОО. СХ

У о МОВ Сх

Й ЗО о КК о М

У МОН Я В с с З ще СЕ

ІГ їй о Ву

Та і о. ОК

КеЗ ОХ а хна х ЗХ щх г,

ЗА 5 і

Я няння ї деку тчлттуютя

Н луку х сх с а З КК : Кк зкоховм вок ! З с щ ! ВОК с ях і 55 є

З с в ОКО с

Н КО х с

Й З ХМ КК КОС с іч Я. ще с з ОХ СО В ХУ МОХ ЕКО хх її о: щох с

Її. ОМ ЕВ ЗОВ ООН Я ККЗ о ох І ОК ше. с о -

Н ох о. с с.

БО м п СО У і М іх КО М с ! а МОХ УКХ ОО ' й Й НЕ о ОК ! п оо

БО ОО ЗО

ХОМ ПУХ ВХ

КОХ Ох У

ЗХ МКК оо МА

З с

КАХ Б

ОО КО их Ом ОК алАААнААНАМ г С ОО

ХК КАМАКАЯ У Ж ККУ їм уеткретеенет :

Янко 15 ших ;

МК есе 33 4

ОО осея

ЕЕ ОК с ж о. КЕ ОО с 5 с ПО

КК с З с с : с о

ОО с

У МОЯ ОХ КН КО О зо ЗЕ с с с х с

ХО СО КОХ ОО КЗ С с

Е с х о

З с с

СО ОХ с о ЗХ

Б с їх с Ох ОК

М ПЕ С

ТАК о

ХХ кр рення а

ХК ЗУ с

Б пам

ХХ КК Зоо

ОВ ЖЕ хх

ОБОХ КО ЗХ ОХ с х с зах о СХ

ХО КК КК ОКО ее Зх с СОС с

СЕ с ЗОВ о со о ХК о ХХ о

МОМ ОХ ее ЕХ с

КК КОХ КО ОХ КК о о

ОК ОКУ КЕ СХ МО с с с 5 х

Кох о ЗК ж ОО с

ОКО КМ МО ОХ КК с о ее Сх с

ОХ ЖК ВКА ОКО

ХЕ о. ВОК

ПК ПОН КО

Шк чи ох с

ЯКЕ. Ку У М щ ХМ А х

БОМ пло о кове с - с дах - с ХО ооо с с с с с с с о с с с х с х с с

СОУ с КК

Бе. С. ше с х оС.

ОО с ккмохххю «ік ХМ ОК кома їх ЗХ х МКК ах хх

ОХ ХХ хх с с кхкккхаккнх оС песен с й

ОККО ОВО ПО ХХ с с ОО ще о КЕ о

М ТК ПК ХУ ще ОКО СК о

МЕ ОХ ОХ ОКО о с І с ЗХ с М

М с п З

ХЕ ОКУ с с

ВО хх ОБОХ ОХ КО с с ХК СХ ПК с с с Б х о а о я

КЕ с

БК о.

ОХ М що ООКООВ ОК

ЕХ МНЕ че ОКО

МАК й ТЕХ. їх ХХ ха

ММ - «ХХ с. с с розко с ще с с о о с х с з с

М ОКО Км ПК ОО х я а 0. 5 о. п с о. с ; КК о с с о

ХХ с ще С

ХК о

ОК с ж ж Ох

М. З їв ЗХ

Ху

Ве

ОМ: дя с с о ооо є с о с с с с о 5 с

С с 5 с с

ХК ОМ ТИ ОВ ПЕ СО І З п

ОК ОКУ ОО ОХ не с ро ЗК М ї : ОХ са ОН, сх МК

Я сосоге їх. 3 Шна

ОКХ МК Са 7. с хвоя с хх с с с с

Й х с

М З о ех ОХ ОХ АК ОО ее о

КЕ 0.

Ох с 5 о.

ОО. я с Я с с с о о с

Без с ж с мА Ох ще щ-. ЗКУ У ках їх ОХ

ОКО е хх їч Ко

З З КО о х ще . с . ух х ях ЗХ ОКХ х

З ЗО Ох ЗОВ ХО КО

М п ОК 2

ОХ М ЗЕ В

Ж ОХ Х ХХ ХЕ ХХ ХУ ХХ с

ХК ОХ З МОХ ХК

ОКО КО КЗ о Х КХ

ОХ ОККО УЖ ОХ хх ее хх хх КХ же ЗХ

КОКО МОХ ХОМ

ХХ ХО ХХ У УКХ НК

КК ОО,

Й ОК ОКХ ча ) ОКУ

АК см с ХХ

МОЯ Ко с сосоваа с со с с

ОООХ п ЗЕ

Ен ЗХ ПК М с с с о ше х М. З с о с п с Х о З

ОХ ОХ КЕ КВ с о с с осо с с як с З хх ОХ с

МОХ с й Я КОКО

Се ох ОХ

ОК МЕ. ЗА ОКХ

ОО ок " о. ХХ є ща с

ЗУ КОХ ОК МКК

В с ВО

ОО ОО КОХ ОК СО М

ХХ УКХ ОКХ ОККО ХХ СХ о. п о

ТО ХОККУ ОО ОО Х ЕВ х

МО о о о. КК З ХХ ї с о В о У о. о.

КОХ СХ о. ХО СЕ х

З ОВК ЗК

З ЗВ

Ше у хемхоах «мк Ха З

ОККО й с З с не с Ох сок с с с с с с с ОХ с о о с о с с ооо о с о о с оо с с Ох

Го с

ЗК с

МОМ о

ЗМУ МО х

РЕА хе ТАК СО

ВН ко см Ж т Яч

Х МОМ

ПО

ОХ ОКХ п

К ОО ОВ

ОХ

Е ОО В о

Ї ОК о

З о

ЗБ ОХ а КЕ

М З с.

ОВК ж ММ

ОО х ОК ЗО

ОХ М М

ООН КК

ОК МОУ

СКК ВОК

ОКХ ММ

ОКХ М

ОКО

ОК МОМ КОКО

ОО В

ОК

ОО У

ОКО о В

МУ ОО ОК

У ОКО а

ОК ОК

3

КК КК КАК КК КВ

ОКО ОКО

ОМ ЗХ

В зак СК

ЕКОН хх ХУ з сего хх З УХОКК

М

ОО

МО

ПОХХККНК КК ОО

Е ОО Зх

ОН ХУНОК

ОО

УМО

М М

М М М У

І ОО я

ОО З

НН

: ОК

ОМ МЕ

ОО

М

ОО ОК

ОО

М я

ОО В ОК

ОО в еВ

МЕМ М ММ

ОО ОК

ОО ПЕ

МОЯ М

КК ЗО

ОМ ОМ

МОМ ПИ о ОХ о

МОМ М КО

ХК ОКХ

7 ти СК свт ж

ММК УМ

Тх М

КОХ х о х о о

ОМ ММК

ОО КВ

М М

М

ОНКО ОО

Ох

ЕВ ОКХ о

ОКО ОО Є ЕК

М СХ СОЯ х ОО АК

ОМ М І

МО ОО ОО

ОК

ЗОМ

ОО

ОО ОО п В х Кая ок

ОО о

ОО

ОО В КК и

ХООККОМО КО

ОМ

ОК ння

ОО В

ОО В сх МО М

ОО во

ОН КСО

ОН

МЕН ОК і 7 аву жах сх.

ТК.

ГТ. щи Н ! і шт. й пон 1 м т Я : 1 ММ гі ! ї М я іі Я

Е зі 11 ЩЕ : ! : ЖЕ КА х НН !

Н НН мом ще «НН ! шк тт г ВВ Що

Н шк Н ме пт як і : ; : : КЗ їі тех Н : і і НН НН ЖЕ Я ї хі КО Н р: КИМ вк хх 1 Н Н і : : : Ж ту ще Н і Н : : : Н ха Ві у г В щі ! ! Н В сх. Ма НАД ки - Н

Е хх М МИ НК ПВ з х : за сщий і й й : Її КІ х х Ух т : нчяннннктннн маки я па

Н дж ж юю їх ?

Н її ї Хумтум ло Її їз АК ІК кожнровї ї МО ТКА : ! ї х я ій ї :

Н х Твец х ІЗ : 5 й ї-жї х біржі і : хх, п: РОН ВЯ : І ШЕ пи м пеня ї Хоккююю юю юю ї хх : 3 ро 3 3 дижжкткюхя, 3 і 5 з

Н ІЗ І Ї : 1 : І 3 :

Її : ;

Н І ІЗ 3 Н ;

Н ІЗ З ї Ї ї

І КУ ІЗ Ї ї

ЕШШНЕ Ж Н З ї 3 х ІЗ ї 3 : ІЗ ї ше 3 І ї : 3 ї х :

З до ї ІЗ :

В ОЩх : В і ж ї т 3 : !

І ї х Я І їх Її . З ї : : ї ї ї Я І і ї І ОО ї ! : Х зе сем

Е ї Х Кука кю

Е в бо нн У - ! : | « А : ї пееглідино Й Жасди Я : Канн КВК : і : і : і : ї куту ку люттю тютюн х дока юю кю юю жа о кі. у мір ЩЕ

МО хаЯ ї : ї днк

Її т. з. Щ : з мед г еируюмьов роки ПОАЧ 1 ща туї ї З МО 3 ї

Ї і ГЕ З ї 3 Тіхнци Її і 4 Ко о М хх деки Ні ї ї 3 ї ї піки Мч ї 3 ІЗ ї ТЕЗАХ АДАТУ

ІНН Її 3 х па Ї І

ВОМ 3 ї ї 5 ї І ук ї 3 Її ї ї ї ї ІЗ Її ї х ї ї пк ї ї х ї

ІА ї ІЗ : ї

ІЗ їх 3 : ї

ІЗ Е 3 ІЗ Її х Кк У ї ї дя ; Не па ХУ І

Бах З Н і ї й Х ї ї ї ІЗ м ї ї ї х ї ії ІЗ ї

ГКУ І І ок І з 3 ї ї 3 : 3 І ї 3 : 3 І ї : 3 : ї 3 Н 3 ТП оч її ши. юю Н

Е Цен» ЕХ їх з Н

З

І Жасихах Жде : 3 БОСИМИ ТОКМАК

І

І

Кук ух У ААУ УК ААХАХАКАХУУ У УК ААААХАХКХАКККААКАК ААУ КАК

Мі ТУ

ММК. дк : Н хи мм, :

НУ й КСТАЖЖКІ : : ї пе Н

Н ї що Н 1:43 шиннт :

НУ шити Н ва НА и св : : фот МН : ї ї дм УСИК ЖАМІ І ї і: жі ДН

Н Ко шк : їх ; - шешюмо І ї : х :

Н : Е :

Н ї : у ії :

Н ї . Н

Н ї « :

Н ї Н фодроднннууууєчч уч ут ую ук руч учням :

І г ї ІЗ х ї ро 12 Н : :

І Ї

"ЖЖ ЛЕ їадя ! їж й : їн Н їй « КОМ УДК Н ря ту Н

І : ; " Сбодх Н

З шй - - : 1 хх зятя Н ї Н і і Н Ні т -:4 1 5. - : : Н пяжю зжюнт іж, :

НИШАН 7 ек Ух

НИ - х кованої

НУ Н ї 3 4 ї « ї х ті

КУ з З зх ч в''ф'ф' фл ' ' л' ' г гфл' т чцгфгфгфтфчФтгтгфФє г У їх ОО В о

М

ММ М ММ ММ

ММ М М М М М

ММ М ММ М М

МОМ М М М ММ М М М М

ХкЕОМІ М М М

МО М

МЕН В

ВМО НО М

МОМ ММ

Вк

НО М М М М М

ОМ М М М М М

М М М М М М

ОПО

ММ М М

ОМ М М М М М М кА М М М М М кН М М М М

М М М

МО А

МІ М М М

ОМ М М М М М М

МОБ М М ХХ

ОН М

МОМ

ОМ ММ

ВЕ М

ОКО

ОХ А ВК КО КК

ММ М

ВОМ ХХ КОХ М то см ЗК

МОХ

ХХ хе сао т тн т вт лвзФТооояоо им ХХ

ММ М МО М

МК ОО ж

ОМ М М М М

ОМ М М М ХХ

М

ММ М М М М М

МОМ М

МОМ М М М М М

ОО М

ОО М

ОО

ВЕБ

ОМ ММ

ОК А КК

ММ Є

ІМ М М М М М

МЕ ОККО

ММ ММ М М М

ОМ М М М М

МОХ

ОО У

МОМ М ММ

МОМ М М М М

ОН ХХ

ОМ М М

МО М М М М М М

М М М

ММ М М М

ОО А

ОМ КК М се ЗЕ «МК,

Уха

«хх З

ЗУ ОХОКОКККХ - с КОКО с ОЦ 0. ОН КОКО ЕХ 0. с с п. у . о. о. сс о ВО с З о. с п

Ех 3 о. с ОООКККО

С с с с с

С

С с с с с с с с

ПО о»

СОСОК сс

КК с я

ОК КЗ У ОКО

Ох п

ОКХ З М ОХ

ОО ОО х ХО ОХ п

ОККО ОК а х

В КК ки ТК і й

ЕК Я;

Мах

МОХ ХОМ

КЕ с

ПО СОУ іх З с МО оо СССсС ОХ с с с

ОКОМ ОО Ен с

ОКО КК ОМ ж с

ОК ОК ОВК У с 0. ТО о я

Ми ОВ КК ОО СКК КОКОЯ с х С с с с о о с с

ПК Ох ПОК КОКО с с с п с осо с с же ОО ОХ ОКХ еУ М с

ХО с

МК ОК

Не п їх «е- Зх МО не се ММ КМ

ОМ х

ОМ ХК о ООН

ОН ПККККНННК МОХ ХХ

МСС М С с

С

. 5 КО ПМ с с З с З

С с З с. М х ПО ОК п

М о. ооо

ПО о ХО Сх с

ОО С п. .

М Х МО

ОККО ОКО ОО СО о 0. С ТУ ОХ с Са Ж ОО

Ох хх ЗК с.

МОМ ЕК х п о

ОО о о о я с

М х о с о дО 5 с 5 с ее о . п Х ОО о с с

С

ОХ ОХ ОК

МЕ с

ОКО у

Ім М мин пп

З ММ

БОНН

УМХ я щ зе ооо вве

ОККО ЕКО ВВ с ОО с сс с

ОО ОКО ОО

МКК ОО ОКО

ХК Є хх я о с

ОО КС ПАХНЕ

ОК ОКХ ОК їх

БЕ ОКХ КК ОК

М ХОЖКХ У

ВОК СХ ОХ

ОА ОКХ х ОБ

ПОМ О ЗХ ОК КВ ПАК о. МУ Я

ОК ВХ КОКО

ОХ З ОО ок

ОО З КОКО У с о. . с

ОККО З КОХ о. о 0 СХ С ХХ СХ ОН

Ох УКХ Ох с ОО

ОК ОО УЖ ОМ с М є

ЩЕ я о 0 п с с с с

Я п ВЗ

М с

КК СС

ОКО п

КК КК ще ЕК

З КК

Мі, хо

СХ ;

МОМ МК о Є

К ОН ПИККНК ОО г З с» : с с о є МО

ОО З по

ОК У о с З х а

Км о

ВО 7 ОХ

ОО З МК

Я АВМ З

. Я ЕХ КК у й ОККО 0 Шк ЕХ о їв п

ЕМКОН хо: ОК СО

КО ОО ОО о Ї х хх ОО ОЗ

МОНЕ с. Не КОКО Б о. ОДН о

МОХ а ОКХ ОО

ОО СК ОХ ОО 0.

ВОНО З х 5 с

Ох по ОО

КК о З

МОЯ 5

МУ КЕ М КЕ

КИМ по ах

ОО КХ сн с о. с с с

ОХ с с

ОХ ооо»

СХ В і сх ЗОБА СКК

Фк а у

Claims (1)

1. Спосіб переїінсталяції системи контролю антигенного гомеостазу організму дорослого ссавця, який відрізняється тим, що зазначеному ссавцю вводять ефективну кількість ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин (ЕППК).