UA65516C2 - Defect adenovirus-derived vectors and the use thereof in gene therapy - Google Patents
Defect adenovirus-derived vectors and the use thereof in gene therapy Download PDFInfo
- Publication number
- UA65516C2 UA65516C2 UA95038233A UA95038233A UA65516C2 UA 65516 C2 UA65516 C2 UA 65516C2 UA 95038233 A UA95038233 A UA 95038233A UA 95038233 A UA95038233 A UA 95038233A UA 65516 C2 UA65516 C2 UA 65516C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- adenovirus
- fact
- gene
- sequence
- virus
- Prior art date
Links
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 142
- 239000013598 vector Substances 0.000 title abstract description 29
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 title abstract description 11
- 230000007547 defect Effects 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 115
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 80
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 19
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 101150066038 E4 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 5
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 claims description 4
- 101150082674 E2 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 claims description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 2
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 claims description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 2
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 claims description 2
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 claims description 2
- -1 trophic factors Proteins 0.000 claims description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims 1
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 claims 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 claims 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 claims 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 claims 1
- 230000009962 secretion pathway Effects 0.000 claims 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 97
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 83
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 64
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 description 36
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- 208000016063 arterial thoracic outlet syndrome Diseases 0.000 description 9
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150021948 SAM2 gene Proteins 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102100025232 Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type II subunit beta Human genes 0.000 description 2
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001077352 Homo sapiens Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type II subunit beta Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000004005 Nypa fruticans Species 0.000 description 2
- 235000005305 Nypa fruticans Nutrition 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- AYNDKKQQUZPETC-NXVVXOECSA-N (z)-2,3-bis(2,4,5-trimethylthiophen-3-yl)but-2-enedinitrile Chemical compound CC1=C(C)SC(C)=C1\C(C#N)=C(\C#N)C1=C(C)SC(C)=C1C AYNDKKQQUZPETC-NXVVXOECSA-N 0.000 description 1
- QSQFARNGNIZGAW-UHFFFAOYSA-N 2-methylsulfonyloxyethyl methanesulfonate Chemical compound CS(=O)(=O)OCCOS(C)(=O)=O QSQFARNGNIZGAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VIIYYMZOGKODQG-UHFFFAOYSA-N 2-nitrobenzene-1,4-diol Chemical compound OC1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 VIIYYMZOGKODQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100049050 Arabidopsis thaliana PVA41 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000701168 Murine adenovirus 1 Species 0.000 description 1
- 108020003217 Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000043141 Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 206010068319 Oropharyngeal pain Diseases 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100022304 Rhizobium meliloti (strain 1021) tme gene Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 101150095244 ac gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 101150010487 are gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701792 avian adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10323—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
- C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
Abstract
Description
Данное изобретение относится к новьім вирусньмм векторам, их получению и их использованию в генной терапии. Оно относится также ок содержащим вьшеуказаннье вируснье векторь фармацевтическим композициям. Более конкретно, данное изобретение относится к рекомбинантньім аденовирусам, как векторам для генной терапии.This invention relates to new viral vectors, their preparation and their use in gene therapy. It also applies to pharmaceutical compositions containing a multipurpose viral vector. More specifically, this invention relates to recombinant adenoviruses as vectors for gene therapy.
Генная терапия заключается в том, чтобь! коррегировать дефицит или дефект(мутация, ошибочная зкспрессия и т. д.) путем введения генетической информации в пораженную клетку или орган. Ота генетическая информация может вводиться или іп міо в клетку, извлеченную из органа, и затем измененная клетка снова вводится в организм, или непосредственно іп мімо в соответствующую ткань. Во втором случає существуют различнье методики, среди которьїх различнье методики трансфекции с применением комплексов ДНК и ДЗАЗ-декстрана |Радапо еї аї., 9). МігоІЇ. 1 (1967) 891), ДНК и липидовGene therapy is to! to correct a deficiency or defect (mutation, misexpression, etc.) by introducing genetic information into the affected cell or organ. This genetic information can be introduced either directly into the cell extracted from the organ, and then the modified cell is re-introduced into the body, or directly into the corresponding tissue. In the second case, there are various methods, among which are various methods of transfection with the use of DNA complexes and DZAZ-dextran |Radapo eyi ai., 9). MigoII. 1 (1967) 891), DNA and lipids
ІРеіопег еї аІ., РМАБ 84 (1987) 7413), использованием липосом (Егаїєу еї а!., у. Віої. Снет. 255 (1980) 10431) и т. д. Совсем недавно появилось использование вируса в качестве вектора для переноса генов в качестве обещающей альтернативь! зтим физическим методикам трансфекции. В зтом отношений бьіли испьітань! различнье вирусьі! на их способность инифицировать определеннье клеточнье популяции. В частности испьітаньі ретровирусь(А5М, НМ5, ММ5 и т. д.), вирус Н5М, аденоассоциированнье вирусь и аденовирусь!.IReiopeg eii aI., RMAB 84 (1987) 7413), using liposomes (Egaieu eii a!., u. Vioi. Snet. 255 (1980) 10431), etc. More recently, the use of a virus as a vector for gene transfer has appeared as a promising alternative! with those physical methods of transfection. In that relationship, there were tests! various viruses! on their ability to infect certain cell populations. In particular, studies of retroviruses (A5M, NM5, MM5, etc.), H5M virus, adeno-associated virus and adenovirus!
Среди зтих вирусов аденовирусьї проявляют некоторье интереснье свойства для использования в генной терапии. А именно, они имеют достаточно широкий круг хозяев, способньї инифицировать клетки в состояний покоя, не включаются в геном инифицированной клетки и на сегодняшний день не связань со значительной патологией у людей.Among these viruses, adenoviruses show some interesting properties for use in gene therapy. Namely, they have a fairly wide range of hosts capable of infecting cells in a resting state, are not included in the genome of the infected cell, and are currently not associated with significant pathology in humans.
Аденовирусьі! являются вирусами с двунитевой линейной ДНК размером около Збкр. Их геном состоит конкретно из одного обратного повтора(ІТЕ) с последовательностью инкапсидации на его конце из ранних и поздних генов (Сї фиг.1). Главньіми ранними генами являются гень! с 11 по І 5.Adenovirus! are recognized as viruses with double-stranded linear DNA about the size of Zbkr. Their genome consists specifically of one inverted repeat (ITE) with an encapsidation sequence at its end from early and late genes (Fig. 1). The main early genes are gene! from 11 to I 5.
Принимая во внимание свойства аденовирусов, упомянутье вьше, они уже использовались для переноса генов іп мімо. С зтой целью бьли полученьі различнье векторьі, производнье аденовирусов, включающие различнье гень(В-да!, ОТО, 8--АТ, цитокинов и т. д.). В каждой из зтих конструкций аденовирус бьіл модифицирован так, чтобь! сделать его неспособньім к репликации в инифицированной клетке. Таким образом, конструкции, описаннье в предшествующем прототипе, являются аденовирусами, лишенньїми областей ЕЦ(ЕїЇа и/или РІБ) и, в случае необходимости и ЕЗ, на место которьїх встрайваются последовательности гетерологичной ДНК І емгего єї аї., бепе 101 (1991) 195; Созп-Споцапигу еї аї., Сбепе (1986) 161). Однако, векторьі, описанньсе в прототипе, имеют много недостатков, которне ограничивают их применение в генной терапии. В частности, все зти векторьі включают много вирусньїх генов, зкспрессия которьх іп мімо нежелательна в рамках генной терапии. К тому же в зти векторь не могут бьіть включень фрагменть! ДНК очень большого размера, что может бьіть необходимо для некоторьх целей.Taking into account the above-mentioned properties of adenoviruses, they have already been used for the transfer of ip mimo genes. For this purpose, various vectors, derived from adenoviruses, including various genes (B-da!, OTO, 8-AT, cytokines, etc.) were obtained. In each of these constructions, the adenovirus was modified so that! make it incapable of replication in an infected cell. Thus, the constructions described in the previous prototype are adenoviruses, lacking regions of EC (EiYa and/or RIB) and, if necessary, and EZ, in place of which sequences of heterologous DNA and human genome are inserted., Bepe 101 (1991) 195 ; Sozp-Spotsapigu ei ai., Sbepe (1986) 161). However, the vectors described in the prototype have many shortcomings that limit their use in gene therapy. In particular, all these vectors include many viral genes, the expression of which is undesirable in the framework of gene therapy. In addition, a fragment cannot be included in this vector! DNA is very large, so it may be necessary for some purposes.
Данное изобретениеє опозволяєт устранить зти недостатки. Данное изобретение описьваеєет рекомбинанть! аденовируса для генной терапии, способнье зффективно переносить ДНК(до ЗОКБ) іп мімо, стабильно зкспрессировать на вьісоких уровнях зту ДНК іп мімо, при полном ограничений риска продукции вирусньїх протеинов, трансмиссии вируса, патогенности и т. д. В частности, било обнаружено, что возможно значительно уменьшить размер генома аденовируса без помехи образованию инкапсидированной вирусной частицьі. Зто удивительно для размера, которьій наблюдался в случає другого вируса, например, ретровируса, т. к. некоторне последовательности, распределеннье по всей длине генома, необходимь!ї для зффективной инкапсидации вирусньїх частиц. Вот почему реализация векторов, обладающих значительньми внутренними делениями, бьла сильно ограничена. Данное изобретение показьівает также, что угнетение основньїх вирусньїх генов не мешаєт никак образованию вирусной частицьі как таковой. К тому же, рекомбинанть! аденовирусов, полученньюе таким образом, сохраняют несмотря на значительнье модификации их геномной структурь, их полезнье свойства сильной инфекционной способности, стабильности іп умо и т. д.This invention makes it possible to eliminate these shortcomings. This invention describes a recombinant! adenovirus for gene therapy, capable of effectively transferring DNA (to ZOKB) and mimo, stably expressing high levels of this DNA and mimo, while fully limiting the risk of viral protein production, virus transmission, pathogenicity, etc. In particular, it was found that it is possible to significantly reduce the size of the adenovirus genome without interfering with the formation of an encapsulated viral particle. It is surprising for the size that was observed in the case of the second virus, for example, a retrovirus, because a certain sequence, distributed along the entire length of the genome, is necessary for the effective encapsidation of viral particles. That's why the implementation of vectors with significant internal divisions was severely limited. This invention also shows that the suppression of the main viral genes does not interfere in any way with the formation of a viral particle as such. Besides, a recombinant! Adenoviruses obtained in this way retain, despite significant modification of their genomic structure, their useful properties of strong infectious ability, stability and intelligence, etc.
Векторь зтого изобретения особенно вьгоднь, так как они дают возможность включения желательньмх последовательностей ДНК очень большого размера. Так возможно встроить ген, по длине превосходящийThe vector of this invention is especially desirable, as they allow the inclusion of the desired DNA sequences of a very large size. Thus, it is possible to insert a gene superior in length
Ззокр. Зто особенно интересно для некоторьїх патологий, для лечения которьїх необходима козкспрессия многих генов, или зкспрессия очень больших генов. Так, в случае мьішечной дистрофии до настоящего времени бьло невозможно перенести соответствующую ДНК нативного гена, ответственного за зту патологию(ген дистрофии) из-за его большого размера(14Ккб).close up This is especially interesting for some pathologies, for the treatment of which the co-expression of many genes, or the co-expression of very large genes, is necessary. Thus, in the case of meningeal dystrophy, until now it was impossible to transfer the corresponding DNA of the native gene responsible for this pathology (dystrophy gene) due to its large size (14 Kb).
Векторь зтого изобретения также очень полезнь! потому, что они имеют очень мало функциональньх вирусньїх областей, и позтому отрицательнье действия, связаннье с использованием вируса в качестве векторов при генной терапии, такие как иммуногенность, патогенность, трансмиссия, репликация, рекомбинация и т. д. сильно снижень и даже устранень!.The vector of that invention is also very useful! because they have very few functional viral regions, and therefore the negative effects associated with the use of the virus as vectors in gene therapy, such as immunogenicity, pathogenicity, transmission, replication, recombination, etc., are greatly reduced and even eliminated!
Данное изобретение представляеєт также, в частности, вируснье векторьі, приспособленньюе для переноса и зкспрессии іп мімо желательньїх последовательностей ДНК.This invention also presents, in particular, a viral vector adapted for transfer and zkspressii ip past the desired DNA sequences.
Первьй ообьект данного изобретения касается, таким образом, дефектного рекомбинантного аденовируса, содержащего: последовательности ІТА, последовательность, делающую возможной инкапсидацию, гетерологичную ДНК-последовательность и в котором: ген ЕІ является нефункциональньм и по крайней мере один из генов Е2, Е4, І 1 - І 5 является нефункциональньм.Thus, the first object of this invention relates to a defective recombinant adenovirus containing: an ITA sequence, a sequence that makes encapsidation possible, a heterologous DNA sequence and in which: the EI gene is non-functional and at least one of the E2, E4, and I 1 genes - And 5 is non-functional.
С точки зрения данного изобретения термин "дефектньй аденовирус" обозначаєт аденовирус, неспособньійй автономно реплицироваться в клетке-мишени. Обьічно геном дефектньїх аденовирусов по зтому изобретению, таким образом, лишен по крайней мере последовательностей, необходимьх для репликации указанного вируса в инфицированной клетке. Зти области могут или удаляться(полностью или частично), или превращаться в нефункциональнье, или заменяться на другие последовательности, а именно на последовательности гетерологичной ДНК.From the point of view of this invention, the term "defective adenovirus" refers to an adenovirus that is unable to autonomously replicate in a target cell. In general, the genome of the defective adenoviruses according to this invention, thus, lacks at least the sequences necessary for the replication of the specified virus in the infected cell. These areas can either be deleted (completely or partially), or become non-functional, or be replaced by other sequences, namely, by sequences of heterologous DNA.
Повторяющиеся инвертированнье последовательности(!ТА) представляют начало репликации аденовируса. Они располагаются на концах 3' и 5' вирусного генома(Сі фиг.1), откуда они могут бьіть легко вьіделеньі по классическим методикам молекулярной биологии, известньм специалистам. Нуклеотидная последовательность ІТА аденовирусов человека(в частности, серотипов Ад2 и Аа5) описана в литературе, так же как и аденовирусов собаки(а именно, САМІ и САМ2). Что касаєтся аденовируса Аа5, например, левая последовательность ІТА соответствует области, содержащей нуклеотидь! генома с 1 по 103.Repetitive inverted sequences (!TA) represent the beginning of adenovirus replication. They are located at the 3' and 5' ends of the viral genome (Fig. 1), from where they can be easily isolated by classical methods of molecular biology, known to specialists. The nucleotide sequence of ITA of human adenoviruses (in particular, serotypes Ad2 and Aa5) is described in the literature, as well as dog adenoviruses (namely, SAMI and SAM2). As for adenovirus Aa5, for example, the left ITA sequence corresponds to the region containing a nucleotide! genome from 1 to 103.
Последовательность инкапсидации(также назьшваемой последовательностью Рві) необходима для инкапсидации вирусной ДНК. Зта область, таким образом, должна бьть представлена, чтобьї дать возможность получения дефектньїх аденовирусов по зтому изобретению. Последовательность инкапсидации локализуется в геноме аденовируса между левой ІТА(5) и геном ЕС фиг.1). Она может бьіть вьіделена или искусственно синтезирована по классическим методикам молекулярной биологии.The encapsidation sequence (also called the Rvi splice sequence) is necessary for viral DNA encapsidation. This region, thus, must be represented to enable the production of defective adenoviruses according to this invention. The encapsidation sequence is localized in the adenovirus genome between the left ITA(5) and the EC genome (Fig. 1). It can be isolated or artificially synthesized according to classical methods of molecular biology.
Нуклеотидная последовательность последовательности инкапсидации аденовирусов человека(в частности, серотипов Ад2 и Ай) описана в литературе, так же как и аденовирусов собаки( а именно, САМ и САМ2). В отношений аденовируса Аа5, например, последовательность инкапсидаций соответствует области, включающей нуклеотидь! генома со 194 по 358.The nucleotide sequence of the encapsidation sequence of human adenoviruses (in particular, serotypes Ad2 and Ai) is described in the literature, as well as canine adenoviruses (namely, CAM and CAM2). In the relations of adenovirus Aa5, for example, the sequence of encapsidations corresponds to the region that includes a nucleotide! 194 to 358 of the genome.
Существуют различнье серотипьї аденовирусов, и следовательно, структура и свойства несколько варьируют. Тем не менее зти вирусьї демонстрируют сравнимое генетическое строение, и сведения, опубликованнье по данному вопросу, могут бьіть легко воспроизведеньі специалистом для всех типов аденовирусов.There are different serotypes of adenoviruses, and consequently, the structure and properties vary somewhat. Nevertheless, these viruses demonstrate a comparable genetic structure, and the information published on this issue can be easily reproduced by a specialist for all types of adenoviruses.
Аденовирусь зтого изобретения могут происходить от человека, животного или бьть смешанной природьцчеловеческой и от животньх).Adenoviruses of this invention can originate from humans, animals, or mixed human and animal origin.
Что касается аденовирусов человеческого происхождения, предпочтительно использовать те, которье по классификации относятся к группе с. Более предпочтительно из различньїх серотипов человеческих аденовирусов в рамках данного изобретения использовать аденовирусь! типов 2 или 5(Ад2 или Аа5).As for adenoviruses of human origin, it is preferable to use those classified as belonging to the c group. It is more preferable to use adenovirus from different serotypes of human adenovirus within the scope of this invention! type 2 or 5 (Ad2 or Aa5).
Как показано вьіше, аденовирусь! зтого изобретения могут также иметь происхождение от животньх или включать последовательности из аденовирусов животного происхождения. Заявитель на самом деле показьвшаєт, что аденовирусьь животного происхождения способньї инифицировать с большой зффективностью человеческие клетки, и что они не способньї размножаться в человеческих клетках, в которьїх они испьітьївались |СЇ заявка БА 93 05954|. Заявитель также показьвает, что аденовирус животного происхождения совсем не транскомплементарен аденовирусу человеческого происхождения, так что полностью устраняєтся риск рекомбинации и размножения іп мімо в присутствий человеческого аденовируса, что могло бьї привести к образованию инфицирующей частицьі. Использование аденовируса или участков аденовирусов животного происхождения, таким образом, особенно вьігодно, так как риск, присущий использованию вируса в качестве вектора в генной терапии к тому же очень мал.As shown above, adenovirus! of the invention may also be of animal origin or include sequences from adenoviruses of animal origin. The applicant actually shows that adenoviruses of animal origin are capable of infecting human cells with great efficiency, and that they are not capable of multiplying in human cells in which they were tested |SI application BA 93 05954|. The applicant also shows that the adenovirus of animal origin is not at all transcomplementary to the adenovirus of human origin, so that the risk of recombination and reproduction is completely eliminated in the presence of human adenovirus, which could lead to the formation of an infectious particle. The use of an adenovirus or parts of adenoviruses of animal origin is thus especially beneficial, since the risk inherent in the use of the virus as a vector in gene therapy is also very small.
Аденовирус животного происхождения, используемьй в рамках данного изобретения, может бьть собачьим, бьічьим, мьішиньм (например, МАМІ, Веага еї аї., Мігоїсіоду 75 (1990) 811), овечьим, свиньим, птичьим или еще и обезьяньим(например, ЗАМ). Более конкретно, из птичьих аденовирусов можно упомянуть серотипь с 1 по 10, доступнье из АТСС, как, например, штаммь РНеїрз (АТОС МА-432), Еопіев (АТС МА-280), Р7-А(АТОС УВ-827), ІВН-2А(АТСС УВ-828), І2-А(АТОС Ув-829), Т8-А(АТОС УВА-830), К- 11(АТСС Мв8-921) и еще штаммь! для сравнения(референс-штаммь) АТСС МА-831 по 835. Из бьічьих аденовирусов можно использовать различнье известнье серотипь! и особенно те, которне находятся вAdenovirus of animal origin used in the framework of this invention can be canine, bovine, murine (for example, MAMI, Veaga et al., Migoisioudu 75 (1990) 811), sheep, pig, bird or even monkey (for example, ZAM). More specifically, from avian adenoviruses, we can mention serotypes 1 to 10, available from ATCC, such as, for example, the RNeirz strain (ATOS MA-432), Eopiev (ATS MA-280), P7-A (ATOS UV-827), IVN -2A (ATSS UV-828), I2-A (ATOS UV-829), T8-A (ATOS UVA-830), K-11 (ATSS Mv8-921) and another strain! for comparison (reference strain) ATSS MA-831 to 835. Different serotypes can be used from bovine adenoviruses! and especially those that are in
АТСсС(типь! с 1 по 8) со штаммами сравнения АТОС МУА-313, 314, 639 - 642, 768 и 769. Можно также назвать мьішинье аденовирусьь ЕІ(АТОС МА-550) и Е20308(АТОС МВА-528), овечий аденовирус типа 5(АТСС МА-1343) или типа б(АТОС УВ-1340); свиной аденовирус 5359, или обезьяньи аденовирусь, особенно те, которние являются референс-аденовирусами в АТСС под номерами УА-591-594, 941-943, 195-203 ит. д.АТСсС (typ! s 1 to 8) with comparison strains ATOS MUA-313, 314, 639 - 642, 768 and 769. It is also possible to name murine adenovirus EI (ATOS MA-550) and E20308 (ATOS MVA-528), sheep adenovirus type 5 (ATSS MA-1343) or type b (ATOS UV-1340); swine adenovirus 5359, or monkey adenovirus, especially those recognized as reference adenoviruses in the ATCC under numbers UA-591-594, 941-943, 195-203, etc. d.
Предпочтительно, из различньїх аденовирусов животного происхождения в рамках зтого изобретения используются аденовирусь или участки аденовирусов собак, и особенно все штаммь! аденовирусов САМ2Preferably, from various adenoviruses of animal origin, within the framework of this invention, adenoviruses or sections of adenoviruses of dogs are used, and especially all strains! adenovirus SAM2
Їштамм Манхзттен или А26/61 (АТСС МУНА-800), например|Ї. Собачьи аденовирусь бьіли обьектом многочисленньїх структурньїх исследований. Таким образом, бьіли описаньі полнье карть! рестрикации аденовирусов САМІ и САМ2 в предшествующей работе (5ріреу еї а/., І. Сеп. Міго!.70 (1989) 165), и гень! Еїа,Yishtamm Munich or A26/61 (ATSS MUNA-800), for example | Canine adenovirus has been the subject of numerous structural studies. Thus, white descriptions of full maps! restrictions of adenoviruses SAMI and SAM2 in a previous work (5rireu ei a/., I. Sep. Migo!.70 (1989) 165), and gene! hey
ЕЗ, так же как последовательности ІТА бьіли клонировань и секвенировань! І(смотрите, в частности, 5ріреу еї аї., Міги5 Вев. 14(1989) 241; І Іппе, Мігиз Нез. 23(1992) 119, ММО91/115251І.EZ, just as ITA sequences were used for cloning and sequencing! I (see, in particular, 5rireu ei ai., Migy5 Vev. 14(1989) 241; I Ippe, Migiz Nez. 23(1992) 119, ММО91/115251І.
Как указано ранее аденовирусьь данного изобретения включают одну гетерологичную последовательность ДНК. Последовательностью гетерологичной днк назьівается вся последовательность ДНК, вводимая в рекомбинантньій вирус, которьій ее переносит и/или зкспрессия которой достигается в клетке-мишени.As indicated earlier, the adenovirus of this invention includes one heterologous DNA sequence. The sequence of heterologous DNA is called the entire DNA sequence introduced into the recombinant virus that carries it and/or the expression of which is achieved in the target cell.
В частности, последовательность гетерологичной ДНК может содержать один или множество терапевтических генов и/или один или множество генов, кодирующих антигеннье пептидь!.In particular, the sequence of heterologous DNA may contain one or more therapeutic genes and/or one or more genes encoding an antigenic peptide.
Терапевтическими генами, которье могут таким образом переноситься, являются все гень, транскрипция и, в известньїх случаях, трансляция которьїх в клетке-мишени производит продукть,Therapeutic genes that can be transferred in this way include any gene, transcription and, in some cases, translation, which in the target cell produces a product,
имеющие терапевтическое действие.having a therapeutic effect.
Можно говорить в частности о генах, кодирующих белковье продуктьї, имеющие терапевтическое действиє. Белковьїм продуктом, кодируемь/м таким образом, может бьіть белок, пептид, аминокислота и т. д. Зтот белковьій продукт может бьіть гомологичньім клетке-мишени(то есть, продуктом, которьй в норме зкспрессируєтся в клетке-мишени, когда в ней не присутствуєт никакая патология). В зтом случає зкспрессия белка дает возможность, например, покрьїть недостаточную зкспрессию в клетке или зкспрессию неактивного или слабоактивного белка в соответствии с модификацией и, кроме того, дает возможность суперпродукции указанного белка. Терапевтический ген может также кодировать мутант клеточного белка, имеющего повьішенную устойчивость, измененную активность и т. д. Белковьій продукт может также бьть гетерологичньм клетке-мишени. В зтом случає зкспрессируемьй белок может, например, дополнять или привносить в клетку недостающую активность, давая ей возможность бороться с патологией.It is possible to speak, in particular, about genes encoding protein products that have a therapeutic effect. A protein product encoded in this way can be a protein, peptide, amino acid, etc. This protein product can be a homologous target cell (that is, a product that is normally expressed in the target cell when it is not present no pathology). In this case, protein expression makes it possible, for example, to cover insufficient expression in the cell or expression of an inactive or weakly active protein in accordance with the modification and, in addition, it makes it possible to overproduce the specified protein. The therapeutic gene can also encode a mutant cellular protein that has increased stability, altered activity, etc. The protein product can also be a heterologous target cell. In this case, the expressed protein can, for example, supplement or bring the missing activity to the cell, giving it the opportunity to fight pathology.
Среди терапевтических продуктов по данному изобретению можно привести, в частности, ферменть, производнье из крови, гормоньі, лимфокиньї; интерлейкиньі, интерфероньі, ТМЕ и т. д. (ЕЕ! 9203120), факторьї роста, нейротрансмиттерьї и их предшественники или ферменть! для синтеза, трофические факторь: ВОМЕ, СМТЕ, МО, ІСЕ, СМЕ, агат, пес, МТЗ, МТ5 и т. д.; аполипопротейинь!: АроАї, АроА!М,Among the therapeutic products according to this invention, it is possible to cite, in particular, an enzyme derived from blood, hormones, lymphokinia; interleukins, interferons, TME, etc. (EE! 9203120), growth factors, neurotransmitters and their precursors or enzymes! for synthesis, trophic factors: VOME, CMTE, MO, ISE, CME, agate, pes, MTZ, MT5, etc.; apolipoproteins: AroAi, AroA!M,
АроЕ и т.д. (ЕН 93 051125), дистрофии или минидистрофин (ЕВ 9111947), геньі-супрессорь! опухолей: рбЗAroE, etc. (EN 93 051125), dystrophy or minidystrophin (EB 9111947), genius-suppressor! tumors: rbZ
АБ, Раріа ОССК-гем и т. д. (ЕВ 93 04745), геньї, кодирующие факторь, участвующие в коагуляции: факторь!AB, Raria OSSK-hem, etc. (EB 93 04745), geniuses encoding a factor involved in coagulation: a factor!
МІ, УШ, ЇХи т. д.MI, USH, IHY, etc.
Терапевтический ген может также бьіть геном или антисмьісловой последовательностью, зкспрессия которьїх в клетке-мишени даєт возможность контролировать зкспрессию генов или транскрипцию клеточной МРНКЮ. С зтих последовательностей, например, в клетке-мишени могут транскрибироватьсяThe therapeutic gene can also be a gene or an antisense sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control gene expression or transcription of cellular mRNA. From these sequences, for example, in the target cell, they can be transcribed
РНК, комплементарная клеточной мРНК и блокировать таким образом их трансляцию в белок, соответствующая методика описана в патенте ЕР 140308.RNA that is complementary to cellular mRNA and thus block their translation into protein, the corresponding technique is described in patent EP 140308.
Как показано вьіше, последовательность гетерологичной ДНК может также включать один или множество генов, кодирующих антигенньїй пептид, способньй генерировать у человека имунньй ответ. В зтом особом случає осуществления изобретение дает возможность реализации таким образом вакцин, позволяющих иммунизировать человека, особенно против микроорганизмов или вирусов. Можно, в частности, говорить об антигенньїх пептидах, специфичньїх для вируса Зпштейна-Барра, вируса ВИЧ, вируса гепатита В(ЕР 185573), вируса псевдобешенства и специфичньїх для опухолей(ЕР 259212).As shown above, the sequence of heterologous DNA can also include one or multiple genes encoding an antigenic peptide capable of generating an immune response in a person. In this particular case, the invention makes it possible to implement vaccines in this way, allowing to immunize a person, especially against microorganisms or viruses. It is possible, in particular, to talk about antigenic peptides specific for Zpstein-Barr virus, HIV virus, hepatitis B virus (ER 185573), pseudorabies virus and specific for tumors (ER 259212).
В основном, последовательность гетерологичной ДНК включаеєт как последовательности, обеспечивающие зкспрессию терапевтического гена, так и/или ген, кодирующий антигенньій пептид в инфицируемой клетке. Можно упомянуть последовательности, которье естественно ответственнь! за зкспрессию рассматриваеємого гена, когда зти последовательности способньї функционировать в инфицируемой клетке. Можно также сказать о последовательностях различного происхождения(ответственньїх за зкспрессию других белков или полностью синтетических). А именно, можно упомянуть промоторнье последовательности генов зукариотов или вирусов. Например, можно говорить о промоторньїх последовательностях генома той клетки, которую хотят инфицировать. Также можно сказать о промоторньїх последовательностях генома вируса, включая используемьй аденовирус. В зтом отношений можно привести в качестве примера промоторь! генов ЕІА, МІ Р, СМУ, В5М и т. д. Кроме того, зти последовательности зкспрессии могут модифицироваться путем добавления последовательностей активации, регуляции и т. д. С другой сторонь, когда встрайваемьй ген не содержит последовательностей зкспрессии, он может помещаться в геном дефектного вируса после такой последовательности.Basically, the sequence of heterologous DNA includes both sequences that ensure the expression of a therapeutic gene and/or a gene encoding an antigenic peptide in an infected cell. It is possible to mention sequences that are naturally responsible! for the expression of the gene under consideration, when these sequences are capable of functioning in the infected cell. You can also tell about sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins or completely synthetic). Namely, it is possible to mention the promoter sequence of the genes of zukaryotes or viruses. For example, one can talk about the promoter sequences of the genome of the cell that they want to infect. The same can be said about the promoter sequences of the virus genome, including the adenovirus used. In this relationship, the promoter can be cited as an example! genes EIA, MI R, SMU, B5M, etc. In addition, these expression sequences can be modified by adding sequences of activation, regulation, etc. On the other hand, when the inserted gene does not contain expression sequences, it can be placed in the genome of a defective virus after such a sequence.
С другой стороньї, последовательность гетерологичной ДНК может также содержать в обратном направлений от терапевтического гена сигнальную последовательность, обеспечивающую секрецию терапевтического продукта из клетки-мишени. Зта сигнальная последовательность может бьіть природной сигнальной последовательностью терапевтического продукта, но могут бьіть также названь! совсем другие функциональньсе сигнальнье последовательности или искусственная сигнальная последовательность.On the other hand, the sequence of heterologous DNA may also contain a signal sequence directed in reverse direction from the therapeutic gene, ensuring the secretion of the therapeutic product from the target cell. This signal sequence can beat the natural signal sequence of the therapeutic product, but names can also beat! completely different functional signal sequences or artificial signal sequences.
Как показано здесь оранеєе, векторьі зтого изобретения имеют по крайней мере один нефункциональньй ген из Е2, Е4, 11 - 15. Рассматриваемьй вирусньй ген можно сделать нефункциональньм с помощью всех известньїх специалистам методик, а именно путем супрессии, замещения, делениий или добавлением одного или многих оснований в него или рассматриваєемьсєе гень.As shown above, the vectors of this invention have at least one non-functional gene from E2, E4, 11 - 15. The viral gene in question can be made non-functional using all methods known to those skilled in the art, namely by suppression, substitution, division or addition of one or more based on it or the gene under consideration.
Такие модификации могут бьть получень! іп міго(на вьіделенной ДНК) или іп зіш, например, или с помощью методов генной инженерии, или путем обработки мутагенами.Such modifications can be received! ip migo (on isolated DNA) or ip zish, for example, or with the help of genetic engineering methods, or by treatment with mutagens.
В качестве мутагенньіїх средств можно привести, например, физические средства, такие как жесткое облучение(рентгеновское, гамма, ультрафиолетовоеє и т. д.) или химические средства, способнье воздействовать на различнье функциональньюе группьі оснований ДНК, и, например, алкилирующие средства(зтиленметансульфонат(З МС), М-метил-М'-нитро-М-нитрозогуанидин, М-нитрохинол /- ин-1- оксид(МХО)), интеркалируюшие средства й т. д.As mutagenic agents, we can cite, for example, physical agents, such as harsh radiation (X-ray, gamma, ultraviolet, etc.) or chemical agents capable of affecting various functional groups based on DNA, and, for example, alkylating agents (ethylene methanesulfonate With MS), M-methyl-M'-nitro-M-nitrosoguanidine, M-nitroquinol /- yn-1- oxide (MHO)), intercalating agents, etc.
Под делецией в данном изобретениий подразумеваєтся любая супрессия рассматриваємого гена. А именно, можно говорить о всей или части области, кодирующей указанньй ген, и/или о всей или части промоторной области транскрипции указанного гена. Супрессия может бьть вьполнена путем расщепления с помощью соответствующих ферментов рестрикции, затем лигирования, в соответствий с классическими методами молекулярной биологии, так, как показано в примерах.Deletion in this invention means any suppression of the gene in question. Namely, it is possible to talk about all or part of the region encoding the specified gene, and/or all or part of the promoter region of the transcription of the specified gene. Suppression can be performed by cleavage with the help of appropriate restriction enzymes, then ligation, in accordance with classical methods of molecular biology, as shown in the examples.
Генетические модификации могут также осуществляться путем разрушения генов, например, по методу, первоначально описанному Ноїнзієїп |Месй. Епгутої, 101 (1983) 202|Ї. В данном случає вся кодирующая последовательность или ее часть предпочтительно разрушаеєтся, чтобьї сделать возможной замену путем гомологичной рекомбинации геномной последовательности на нефункциональную последовательность или мутантную.Genetic modifications can also be carried out by the destruction of genes, for example, according to the method originally described by Noinzieip |Messy. Epgutoi, 101 (1983) 202 | In this case, the entire coding sequence or its part is preferably destroyed in order to make a possible replacement by homologous recombination of the genomic sequence with a non-functional or mutant sequence.
Там, где указанньюе генетические модификации могут локализоваться, зто - в части, кодирующей рассматриваеємьй ген, или вне кодирующей области, и, например, в областях, ответственньїх за зкспрессию и/или регуляцию транскрипции указанньїх генов. Нефункциональньй характер указанньх генов может, таким образом, проявляться продукцией неактивного белка вследствиеє структурньїх или информационньїх модификаций, отсутствием продукции, продукцией белка, имеющего измененную активность, или продукцией природного белка на сниженном уровне или в соответствии с желаемьм способом регуляции.Where the specified genetic modifications can be localized, that is, in the part encoding the gene in question, or outside the coding region, and, for example, in the regions responsible for the expression and/or regulation of the transcription of the specified genes. The non-functional nature of the specified genes can thus be manifested by the production of an inactive protein as a result of structural or informational modifications, the absence of production, the production of a protein with altered activity, or the production of a natural protein at a reduced level or in accordance with the desired method of regulation.
С другой стороньії, некоторне изменения, такие как точечнье мутации, по природе способнь! исправляться или бьть ослабленьйї с помощью клеточньїх механизмов. Такие генетические изменения представляют в таком случає ограниченньй интерес для производства. Таким образом, особенно предпочтительно, чтобь! свойство нефункциональности бьло бьї совершенно стабильньім сегрегационно и/или необратимьм.On the other hand, some changes, such as point mutations, are naturally capable! be corrected or weakened with the help of cellular mechanisms. Such genetic changes are in this case of limited interest for production. Thus, it is especially preferable that! the property of non-functionality was completely stable segregationally and/or irreversible.
По преимуществу ген становится нефункциональньм в результате частичной или полной делеции.For the most part, the gene becomes non-functional as a result of partial or complete deletion.
Предпочтительно, дефектнье рекомбинантнье аденовирусь зтого изобретения лишень! поздних генов аденовируса.Preferably, defective recombinant adenovirus from the invention only! adenovirus late genes.
Наийболее преиймущественньй способ зтого изобретения состоит в получении рекомбинантного дефектного аденовируса, включающего: последовательность ІТА, последовательность, обеспечивающую инкапсидацию, последовательность гетерологичной ДНК и область, несущую ген или часть гена Е2.The most preferred method of this invention consists in obtaining a recombinant defective adenovirus, including: the ITA sequence, the encapsidation sequence, the heterologous DNA sequence and the region carrying the E2 gene or part of the gene.
Другой особенно вьігодньій способ зтого изобретения состоит в ополучениий дефектного рекомбинантного аденовируса, содержащего: последовательность ІТА, последовательность, обеспечивающую инкапсидацию, последовательность гетерологичной ДНК и область, несущую ген или часть гена Е4.Another particularly advantageous method of the invention consists in obtaining a defective recombinant adenovirus containing: the ITA sequence, the encapsidation sequence, the heterologous DNA sequence and the region carrying the gene or part of the E4 gene.
Всегда, особенно при преимущественном способе, векторь! зтого изобретения обладают, кроме того, функциональньїм геном ЕЗ под контролем гетерологичного промотора. Найболее предпочтительно, когда векторьї обладают частью гена ЕЗ, обеспечивающей возможность зкспрессии белка др197Л.Always, especially with the preferred method, a vector! of the invention also have a functional EZ gene under the control of a heterologous promoter. It is most preferable when the vectors have a part of the EZ gene, which provides the possibility of expression of the dr197L protein.
Дефектньюе рекомбинантнье аденовирусь! по зтому изобретению могут бьіть полученьі различньіми способами.Defective recombinant adenovirus! according to this invention can be obtained in different ways.
Первьй способ состоит в трансфекции ДНК в дефектньійй рекомбинантньій вирус, полученньй іп міпо(или путем лигирования, или через плазмидную форму) в компетентной клеточной линии, то есть несущую при культивированиий все функции, необходимье для комплементации дефектного вируса. Зти функции предпочтительно интегрировань! в геном клетки, что позволяет избежать риска рекомбинации и придаєт повьишенную стабильность клеточной линии. Получение таких клеточньїх линий описано в примерах.The first method consists in the transfection of DNA into a defective recombinant virus, obtained by mipo (or by ligation, or through a plasmid form) in a competent cell line, that is, carrying all the functions necessary for the complementation of the defective virus during cultivation. These functions are preferably integrated! into the cell genome, which allows avoiding the risk of recombination and gives increased stability to the cell line. The preparation of such cell lines is described in the examples.
Второй подход состоит в контранфекции, соответствующей клеточной линии ДНК дефектного рекомбинантного вируса, полученного іп міго(или путем лигирования, или в форме плазмидь) и ДНК хелперного вируса. По зтому методу не нужно располагать компетентной клеточной линией, способной восполнять дефектнье функции рекомбинантного аденовируса. Часть зтих функций на деле восполняєтся хелперньм вирусом. Зтот хелперньій вирус должен сам бьть дефектньм, и клеточная линия при культивирований несет необходимье функции для его дополнения.The second approach consists in counterinfection corresponding to the cell line of the DNA of the defective recombinant virus, obtained by migo (or by ligation, or in the form of plasmids) and the DNA of the helper virus. According to this method, it is not necessary to have a competent cell line capable of replacing the defective functions of the recombinant adenovirus. Some of these functions are actually supplemented by a helper virus. Therefore, the helper virus must itself be defective, and the cell line when cultivated carries the necessary functions for its complement.
Получение дефектньїх рекомбинантньїх вирусов зтого изобретения по зтому методу также показано в примерах.The production of defective recombinant viruses of the invention by this method is also shown in the examples.
Среди клеточньїх линий, используемьх в рамках зтого второго подхода, можно, в особенности, назвать линию клеток почки змбриона человека 293, клеток КВ, клеток Неіїа, МОСК, СНК и т. д.(Сї примерь)/).Among the cell lines used in the framework of this second approach, it is possible to name, in particular, the cell line of human embryo kidney 293, KV cells, Neiia cells, MOSC, SNK, etc. (This example)/).
Затем, векторьі, которне размноженьі, вьіделяют, очищают и амплифицируют по классическим методикам молекулярной биологии.Then, vectors that reproduce are isolated, purified and amplified according to classical methods of molecular biology.
Данное изобретениеє, таким образом, имеет отношение также и к клеточньім линиям, инфицируемьм аденовирусом, подразумевая интегрирование в их геном функции, необходимой для дополнения дефектного рекомбинантного аденовируса, такого, как описанньй ранее. В частности оно касаєтся клеточньїх линий, включающих интегрированнье в их геном области Еї и Е2д2(а именно, области, кодирующей белок 72К), и/или Е4 и/или ген рецептора для глюкокортикоидов. Предпочтительно, зти линии получень для части линии 293 или дт ОВРб.This invention, thus, is also related to cell lines infected with adenovirus, implying the integration into their genome of the function necessary to complement the defective recombinant adenovirus, such as described earlier. In particular, it concerns cell lines that include integration into their genome of the E1 and E2d2 regions (namely, the region coding for the 72K protein), and/or E4 and/or the glucocorticoid receptor gene. Preferably, there are lines of receipts for part of line 293 or dt OVRb.
Данное изобретение относится также ко всей фармацевтической композиции, содержащей один или несколько дефектньїх рекомбинантньїх аденовирусов, таких, которне описаньії вьіше. Фармацевтические композиции зтого изобретения могут бить сформированьі для введения путем местного применения, перорального, парентерального, интраназального, внутривенного, внутримьшечного, подкожного, внутриглазного, трансдермального введения и т. д.This invention also applies to the entire pharmaceutical composition containing one or more defective recombinant adenoviruses, such as those described above. Pharmaceutical compositions of this invention can be formulated for administration by local administration, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intraaxillary, subcutaneous, intraocular, transdermal administration, etc.
Предпочтительно, фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемье носители для иньекционньх форм. Можно, в частности, назвать растворьі солей(мононатриєвьй фосфат,Preferably, the pharmaceutical composition contains pharmaceutically acceptable carriers for injection forms. It is possible, in particular, to name solutions of salts (monosodium phosphate,
динатриевьй фосфат, хлорид натрия, калия, кальция или магния, и т. д., или смеси зтих солей), стерильнье, изотонические или вьісушеннье композиции, особенно лиофилизированнье, которьм по потребности путем добавления стерилизованной водьй или физиологической сьворотки придают вид(состав) иньекционньх растворов.disodium phosphate, sodium chloride, potassium, calcium, or magnesium, etc., or mixtures of these salts), sterile, isotonic, or drying compositions, especially lyophilization, to which, if necessary, by adding sterilized water or physiological serum, the type (composition) of injectable solution
Дозь! вируса, используемье для иньекции, могут бьіть адаптированьі в зависимости от различньх параметров, и особенно в зависимости от используемого способа введения, затрагиваемой патологии, гена, которьй нужно зкспрессировать, и от продолжительности искомого лечения. Обьічно, рекомбинантнье аденовирусь! по зтому изобретению готовятся и вводятся в дозах, содержащих от 10 до 10бое/мл, и предпочтительно от 10 до 10бое/мл. Термин бое("бляшкообразующая единица") соответствует инифицирующей способности раствора вируса, и определяєтся по инфицированию соответствующей клеточной культурь! и подсчету, обьічно через 5 дней, числа бляшек инфицированньх клеток. Методики определения титра бое вирусного раствора хорошо представлень! в литературе.Doz! the virus used for injection can be adapted depending on various parameters, and especially depending on the method of administration used, the affected pathology, the gene to be expressed, and the duration of the desired treatment. By the way, recombinant adenovirus! according to this invention are prepared and administered in doses containing from 10 to 10 boe/ml, and preferably from 10 to 10 boe/ml. The term boe ("plaque-forming unit") corresponds to the infecting ability of the virus solution, and is determined by infecting the corresponding cell culture! and counting, usually after 5 days, the number of plaques of infected cells. Methods of determining the titer of a viral solution are well presented! in the literature.
В соответствии со встроенной последовательностью гетерологичной ДНК аденовирусь! зтого изобретения могут использоваться для лечения или предотвращения многих патологий, включая генетические болезни(дистрофию, цистофиброз и т. д.), нейродегенеративнье болезни(Альцгеймера,In accordance with the built-in sequence of heterologous DNA adenoviruses! of this invention can be used for the treatment or prevention of many pathologies, including genetic diseases (dystrophy, cystofibrosis, etc.), neurodegenerative diseases (Alzheimer's,
ПаркинсонаАЇ 5 и т. д.), раковьїх заболеваний, патологий, связанньїх с растройствами коагуляции или с дислипопротеинемиями, патологиями, связанньіми с вирусньіми инфекциями(гепатитьі, БІ: ит. д.) и т. д.ParkinsonAI 5, etc.), cancer diseases, pathologies associated with coagulation disorders or dyslipoproteinemias, pathologies associated with viral infections (hepatitis, BI: etc.), etc.
Данное изобретение будет более полно описано с помощью примеров, которье следуют далее, и которне должнь! рассматриваться как иллюстративньсе, а не ограничивающие.This invention will be more fully described with the help of the following examples, and it should be! are considered illustrative and not restrictive.
Описание рисунковDescription of drawings
Фиг.1. Генетическое строение аденовируса Аа5. Полная последовательность Аа доступна на основе базьї данньїх и позволяет специалисту вьібрать или создать любой сайт рестрикции и таким образом вьіделить всю область из генома.Fig.1. Genetic structure of adenovirus Aa5. The complete sequence of Aa is available on the basis of the database and allows the specialist to select or create any restriction site and thus isolate the entire region from the genome.
Фиг.2. Карта рестрикции аденовируса САМ2 штамм Манхозттен(по 5ріреу еї а!., упломянутой вьіше).Fig. 2. Restriction map of the adenovirus CAM2 strain Mankhoztten (according to the 5th edition of this article, shown above).
Фиг.3. Создание дефектньх вирусов зтого изобретения путем лигирования.Fig.3. Creation of defective viruses from the invention by ligation.
Фиг.4. Конструкция рекомбинантного вируса, несущего ген Е4.Fig.4. Construction of a recombinant virus carrying the E4 gene.
Фиг.5. Конструкция рекомбинантного вируса, несущего ген Е2.Fig. 5. Construction of a recombinant virus carrying the E2 gene.
Фиг.6. Конструкция и общий вид плазмидьі рРУЗ2.Fig.6. Construction and general appearance of the pRUZ2 plasmid.
Фиг.7. Общий вид плазмидь рРУБ5.Fig. 7. General view of pRUB5 plasmids.
Фиг.8. Общий вид плазмидь ра.Fig. 8. General view of plasmids.
Фиг.9. Общий вид промежуточной плазмидь, используемой для построения плазмидь рітВІ. 5-Е4.Fig. 9. General view of the intermediate plasmids used for the construction of ritVI plasmids. 5-E4.
Общие методики молекулярной биологийиGeneral methods of molecular biology
Классические методь, используемье в молекулярной биологии, такие, как препаративная зкстракция плазмидной ДНК, центрифугирование плазмидной ДНК в градиенте хлорида цезия, злектрофорез в агарозном или акриламидном геле, очистка фрагментов ДНК путем злектрозлюции, зкстракция белков фенолом или фенолом-хлороформом, осаждение ДНК в солевой среде зтанолом или изопропанолом, трансформация БЕ. сої и т. д. хорошо известньі специалистам и широко описань! в литературе (Мапіаїйз ї. єї а!І., "МоІесшаг Сіопіпо, а І арогаїюгу Мапиа!", Соїа рігіпд Нагрог І арогаїюгу, Соїа 5ргіпд Нагбог, М. У., 1982;Classical methods used in molecular biology, such as preparative extraction of plasmid DNA, centrifugation of plasmid DNA in a cesium chloride gradient, electrophoresis in an agarose or acrylamide gel, purification of DNA fragments by electrolysis, extraction of proteins with phenol or phenol-chloroform, precipitation of DNA in a salt medium ztanol or isopropanol, BE transformation. soybeans, etc. are well known to specialists and widely described! in the literature (Mapiaiyz y. yi a!I., "MoIesshag Siopipo, a I arogaiyugu Mapia!", Soia rigipd Nagrog I arogaiyugu, Soia 5rgipd Nagbog, M. U., 1982;
А!,йзибеї Е. М. еї аї. (едв), "Сштепі Ргоїосої5 іп МоїІесшаг Віоіоду", хопп УМієу й 5опв5, Мем Хогк, 19871.A!,yzybei E. M. ei ai. (edv), "Sstepi Rgoiosoi5 ip MoiIesshag Vioiodu", hopp UMieu and 5opv5, Mem Hogk, 19871.
Плазмидь! типа рВАЗ22, рис и фаги серии МІЗ закуплень(ВеїНезаа Незеагсі І арогайфгієв).Plasmid! type rVAZ22, rice and phages of the MIZ procurement series (VeiNezaa Nezeagsi I arogaifgiev).
Для лигирования фрагментьї ДНК могут бьїть разделеньі по их размеру путем злектрофореза в агарозном или акриламидном геле, зкстрагированьї фенолом или смесью фенола/хлороформа осаждень зтанолом и затем инкубированьй в присутствий ДНК-лигазьй фага Т4(Віоїар5) по рекомендациям поставщика.For ligation, DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in an agarose or acrylamide gel, extraction with phenol or a mixture of phenol/chloroform, precipitates with ethanol and then incubated in the presence of DNA ligase phage T4 (Vioyar5) according to the recommendations of the supplier.
Заполнение вьіступающих концов 5 может бьїть осуществлено с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразьй ІЕ с Гі(Віоїарб5) по спецификации производителя. Устранение вьступающих концов 5' вьіполняется путем осторожной обработки нуклеазой 51.Filling in the protruding ends of 5 can be carried out with the help of a fragment of Klenova DNA polymerase IE with Gi(Vioyarb5) according to the manufacturer's specification. The elimination of protruding 5' ends is accomplished by careful treatment with nuclease 51.
Направленньй мутагенез іп мій с помощью синтетических олигодезоксинуклеотидов может вьполняться по методу, разработанному Тауог єї аї. (Мисієїс Асідз Нев5. 13 (1985) 8749-8764), с использованием набора фирмь!ї Атегзпат.Directional mutagenesis with the help of synthetic oligodeoxynucleotides can be performed according to the method developed by Taurogya. (Misieis Asidz Nev5. 13 (1985) 8749-8764), using a set of Ategzpat company.
Ферментативная ампликация фрагментов ДНК с помощью метода РСА |Роімтегазе-саїаІугеа СпаїпEnzymatic amplification of DNA fragments with the help of the RSA method
Веасійп, Заїкі В. К. єї аі., Зсіепе 230(1985) 1350-1354; Миїїїв К. В. єї РаІоопа РЕ. А., Меп. Епгут. 155(1987) 335-350| может осуществляться при использований "ОМА Шептаї сусіег'(Реїкіп ЕІтег Сейв) по описанию изготовителя.Veasiip, Zaiki V.K. Miiiev K. V. Yei RaIoopa RE. A., Map. Epgut. 155(1987) 335-350| can be carried out when using "OMA Sheptai susieg" (Reikip EITeg Save) according to the manufacturer's description.
Определение нуклеотидньїх последовательностей может вьіполняться по методу, разработанномуNucleotide sequences can be determined using the developed method
Заподег еї а. |Ргої. Маї). Асай. 5сі. ОБА, 74(1977) 5463-5467| с использованием набора фирмьі! АтегеНат.It's a sore throat. |Rgoi Mai). Asai. 5 BOTH, 74(1977) 5463-5467| with the use of a set of firms! AtegeNat.
Используемье клеточнье линийWe use cell lines
В примерах, которне следуют ниже, используются или могут использоваться следующие клеточнье линии:In the examples below, the following cell lines are used or may be used:
Линия 293 клеток почки змбриона человека (Стапат еї аї., І. Сеп.МігоЇ. 36(1977) 59). Зта линия содержит конкретно встроенную в ее геном левую часть человеческого аденовируса Ааб(1295).Line 293 of kidney cells of a human embryo (Stapat et al., I. Sep. MigoYi. 36(1977) 59). This line contains the left part of the human adenovirus Aab (1295) specifically embedded in its genome.
Линия клеток КВ человека: вьіделенная из зпидермальной карциномь! человека, зта линия доступна из АТСС(Мхран. ССІ 17), так же как доступнь и условия ее культивирования.Human KV cell line: isolated from epidermal carcinoma! человека, this line is available from ATSS (Мхран. ССИ 17), as well as the availability and conditions of its cultivation.
Линия клеток Неїа человека: полученная из карпиномь! человеческого зпителия, зта линия доступна вThe human cell line: obtained from carpinom! человексого зпителия, zta line is available in
АТОС(Мхран. ССІ 2), также доступнь и условия ее культивирования.ATOS (Mhran. SSI 2), also availability and conditions for its cultivation.
Линия клеток МОСК собаки: условия культурь! клеток МОСК бьли описань! в частности Масаїаєу еї аї.,Line of cells MOSCOW dogs: culture conditions! MOSCOW cells were described! in particular, Masaiayeu ei ai.,
Зсієпсе 44 (1988) 9.Zsiepse 44 (1988) 9.
Линия клеток дт ОВРБ |Вгоцоп еї аї., Мігоюду 190(1992) 624). Зта линия бьіла образована клеткамиLine of cells dt OVRB | Vgotsop eii AI., Migoyudu 190(1992) 624). This white line is formed by cells
Неїа, несущими ген аденовируса Е2 под контролем ТА ММТУ.Neia, carrying the E2 adenovirus gene under the control of TA MMTU.
ПримерьExample
Пример 1Example 1
Зтот пример показьявает возможность рекомбинантного аденовируса, лишенного основньїх вирусньх генов. Для зтого била создана серия мутантов с делецией в аденовирусе путем лигирования іп міо, и каждьй из зтих мутантов бьіл котрансфицирован с вирусом-хелпером в клетки КВ. Зти клетки не позволяют размножаться вирусу, дефектному по ЕТ, причем транскомплементация направлена на областьThis example shows the possibility of a recombinant adenovirus devoid of the main viral genes. For this purpose, a series of mutants with a deletion in the adenovirus was created by ligation of ip myo, and each of these mutants was cotransfected with a helper virus into KV cells. Zty cells do not allow the ET-defective virus to reproduce, and transcomplementation is directed to the region
Е1.E1.
Бьіли получень! различнье мутантьї с делецией на основе аденовируса АЯ5 путем расщепления и затем лигирования іп міо. Для зтого по методике, описанной |Гірр еї аї. І. Міго! 63 (1989) 5133), вьиіделена вирусная ДНК из Аа5, подвергнута расщеплению в присутствий различньїх ферментов рестрикции(Сї фиг.3), затем продукт расщепления лигировали в присутствий ТА ДНК-лигазьі. Размер различньїх делеций затем контролировали в 0,895 агарозном геле с ДСН(ЗО5). Зти мутанть! затем картировали(Сії фиг.3). Зти различньсе мутанть! несут следующие области: ти: датирования между фрагментами Аа5 0-20642(5Заці) и (Заш)33797-35935 ті2; датирования между фрагментами лах 0-19549(Маєеї) и (мае!)31089-35935 тіЗ: лигирования между фрагментами Ааб5 0-10754(Аай)и (Аай)25915-35935 ті4: лигирования между фрагментами Аа5 0-11311 (Міні) и (Міш)24392-35935 ті5: лигирования между фрагментами Аа5 0-9462(5аї|) и (Хпо)29791-35935 тіб: лигирования между фрагментами лаб 0-5788(Хпої) и (Хпо)29791-35935 ті7: лигирования между фрагментами Аа5 0-3665(5рнї) и (Брп)31224-35935Get it! various mutants with deletion on the basis of adenovirus AYA5 by cleavage and then ligation of ip myo. For that, according to the method described by Girr. I. Migo! 63 (1989) 5133), isolated viral DNA from Aa5, subjected to cleavage in the presence of various restriction enzymes (Ci fig.3), then the cleavage product was ligated in the presence of TA DNA ligase. The size of different deletions was then controlled in a 0.895 agarose gel with DSN(ZO5). You are a mutant! then they were mapped (Figure 3). You are a different mutant! carry the following areas: ti: dating between fragments Aa5 0-20642 (5Zatsi) and (Zash) 33797-35935 ti2; dating between fragments of lah 0-19549(Mayeei) and (mae!)31089-35935 tiZ: ligation between fragments of Aab5 0-10754(Aai) and (Aai)25915-35935 ti4: ligation between fragments of Aa5 0-11311 (Mini) and (Mish)24392-35935 ti5: ligation between fragments Aa5 0-9462(5ai|) and (Xpo)29791-35935 tib: ligation between fragments lab 0-5788(Xpoi) and (Xpo)29791-35935 ti7: ligation between fragments Аа5 0-3665(5рны) and (Brp)31224-35935
Каждьй из мутантов, полученньїх вьіше, бьл контрасфицирован с вирусной ДНК Аа.нзмУвсаїEach of the mutants obtained above was counterinfected with Aa.nzmUvsai viral DNA
ІбБітанога-Ретсацаві еї аї., І. Сіїп. Іпмеві. 90 (1992) 626) в клетки КВ в присутствиий фосфата кальция. Клетки собирали через 8 дней после трансфекции и супернатанть! культурь! собирали, затем амплифицировали в клетках КБ до получения накоплений 50 чашек для каждой трансфекции. Сначала из каждого образца бьіла вьіделена зписомная ДНК и разделена в градиенте хлорида цезия.IbBitanoga-Retsatsavi ei ai., I. Siip. Ipmevi 90 (1992) 626) in KV cells in the presence of calcium phosphate. Cells were collected 8 days after transfection and the supernatant! culture! collected, then amplified in KB cells to obtain an accumulated 50 plates for each transfection. First, transcribed DNA was isolated from each sample and separated in a cesium chloride gradient.
В каждом случає наблюдались две четкиєе полось! вируса, которнье вьіделяли и анализировали. Более тяжелая соответствовала вирусной ДНК Аа.А5УВСсаіІ, и более легкая - ДНК рекомбинантного вируса, произведенная путем лигирования(фиг.3). Титр, полученньй для зтой последней составляет около 10боеє/мл.In each case, two clear stripes were observed! virus, which was isolated and analyzed. The heavier one corresponded to viral DNA Aa.A5UVSsaiI, and the lighter one - recombinant virus DNA produced by ligation (fig. 3). The titer obtained for the latter is about 10 boe/ml.
Вторая серия мутантов с делецией в аденовирусе создавалась путем лигирования іп міо по той же самой методологии. Зти другие мутанть! несут следующие области: ті8: лигирования между фрагментами 0-4623(Араї) Аа п5Увсаї и (Араї)31909-35935 Да ті9: лигирования между фрагментами 0-10178(Ва!!) Аа я5Увсааї и (Ватні)21562-35935 ДаThe second series of mutants with a deletion in the adenovirus was created by ligation of IP myo according to the same methodology. You are another mutant! carry the following regions: ti8: ligation between fragments 0-4623 (Arai) Aa p5Uvsai and (Arai) 31909-35935 Yes ti9: ligation between fragments 0-10178 (Va!!) Aa i5Uvsaai and (Vatni) 21562-35935 Yes
Зти мутантьї, несущие ген Гас7 под контролем промотора І ТА вируса В5М, затем коинфицировали в клетки 293 в присутствиий вирусной ДНК Н2 1808 | М/єїпрегу еї аї., І. МігоІ.57 (1986) 833), которая лишена области Е4. По зтой второй методике транскомлементация направлена на Е4, а не на Е1. Зта методика позволяет также, как описано вьіше, получать вируснье рекомбинантьі, обладающие только вирусньім геном, но не областью Е4.These mutants, carrying the Has7 gene under the control of the I TA promoter of the B5M virus, were then co-infected into 293 cells in the presence of viral DNA H2 1808 | M/eipregu ei ai., I. MigoI.57 (1986) 833), which is confined to the E4 area. According to the second method, transcomplementation is directed to E4, not to E1. This technique also allows, as described above, to obtain viral recombinants that possess only the viral gene, but not the E4 region.
Пример 2Example 2
В зтом примере описьшваєтся получение дефектньх рекомбинантньїх аденовирусов по зтому изобретению путем котрансфекции ДНК рекомбинантного вируса, включенной в плазмиду, с вирусом- хелпером.This example describes the production of defective recombinant adenoviruses according to this invention by cotransfection of DNA of a recombinant virus included in a plasmid with a helper virus.
Для зтого бьла сконструирована плазмида, несущая примькающие ІТА Ай5, последовательность инкапсуляции, ген Е4 под контролем соответствующего промотора и в качестве гетерологичного гена генFor this purpose, a plasmid was constructed, carrying ITA Ai5 binding, the encapsulation sequence, the E4 gene under the control of the appropriate promoter and, as a heterologous gene, the gene
Їасй под контролем промотора ТА вируса НОМ(фиг.4). Зта плазмида, обозначенная рЕ4сСаї, бьла получена путем клонирования и лигирования следующих фрагментов(фиг.4): фрагмента Ніпа-Засії, происходящего из плазмидь! рЕеЕаІ44 |ганат еї аї., ЕМВО І. 8 (1989) 2077).It is under the control of the TA promoter of the NOM virus (fig. 4). This plasmid, designated pE4cSai, was obtained by cloning and ligation of the following fragments (fig. 4): a fragment of Nipa-Zasia, originating from plasmids! rEeEaI44 |ganat ei ai., EMVO I. 8 (1989) 2077).
Зтот фрагмент несет последовательности ІТА Айб5 от сголовьі Кк хвосту и последовательность инкапсидации: фрагмент Ніпай!і! (34920) - Засі! (352). фрагмента Ад5, содержащегося между сайтами Засі(расположенном на уровне парьії оснований 3827) и РеЦрасположенном на уровне парьї оснований 4245); фрагмента роР 72(Рготеда), содержащегося между сайтами РзЦ(рь 32) и ЗаІЦ(рь 34); фрагмента ХпоіІ-Храї! плазмидь рАаї твсаїйхХ, описанного в біганога-Регтісацавеї еї а! (ІСІ 90 (1992) 626).This fragment carries the ITA Aib5 sequence from the head of the Kk tail and the encapsidation sequence: the Nipai!i! fragment. (34920) - Go back! (352). fragment of Ad5, contained between the sites Zasi (located at the level of pariah base 3827) and ReCslocated at the level of pariah base 4245); the fragment of РоР 72 (Rgoteda), contained between the sites of RzC (р 32) and ZaIC (р 34); fragment of KhpoiI-Khrai! Plasmid rAai tvsaikhH, described in the runner-Regtisatsavei ei a! (CSI 90 (1992) 626).
Зтот фрагмент несет ген І ас под контролем І ТР вируса АБУ. фрагмента Хбаї(рь 40) - Має(ро 2379) плазмидь роР 72; фрагмента Маеї(ро 31089) - Ніпац(роь 34930) да. Зтот фрагмент, локализованньй в правом конце генома Ад5, содержит область Е4 под контролем соответствующего ему промотора. Он бьл клонирован на уровне сайтов Мае|(2379) плазмидь роР 72 и Ніпа первого фрагмента.This fragment carries the Ias gene under the control of ITR of the ABU virus. fragment Khbai (r 40) - Maye (r 2379) plasmid roR 72; of a fragment of Maeia (bod. 31089) - Nipats (bod. 34930) da. This fragment, located at the right end of the Ad5 genome, contains the E4 region under the control of the corresponding emu promoter. It was cloned at the level of sites Mah|(2379) plasmid roR 72 and Nipa of the first fragment.
Зта плазмида бьла получена путем клонирования различньїх фрагментов в указанньїх областях плазмидь роР 72. Понятно, что зквивалентнье фрагменть! могут бьіть полученьі! специалистами, исходя из других источников.This plasmid was obtained by cloning different fragments in the indicated regions of the pOR 72 plasmid. It is clear that it is the equivalent fragment! you can beat the receipts! specialists, based on other sources.
Плазмида рЕ4Саї затем котрансфируется с ДНК вируса Нга1808 в клетки 293 в присутствий фосфата кальция. Затем получают рекомбинантньй вирус, как описано в примере 1. Зтот вирус несет в качестве единственного вирусного гена ген Е4 аденовируса лахз(фиг. 4). Его геном имеет размер около 12 кр, такой, которьій дает возможность встройки гетерологичной ДНК весьма большого размера(до 20КБ). К тому же специалист может легко заменить ген І ас на совершенно другой терапевтический ген из тех, которье упомянуть! вьіше. С другой стороньі зтот вирус несет некоторне последовательности, происходящие из плазмидь роР 72, которне могут исключаться с помощью классических методик молекулярной биологии, если необходимо.Plasmid rE4Cai is then cotransfected with the DNA of the Hga1808 virus into cells 293 in the presence of calcium phosphate. Then a recombinant virus is obtained, as described in example 1. This virus carries the E4 adenovirus lahz gene as the only viral gene (Fig. 4). Its genome has a size of about 12 cr, which makes it possible to insert heterologous DNA of a very large size (up to 20 KB). In addition, a specialist can easily replace the Ias gene with a completely different therapeutic gene from those that will be mentioned! more On the other hand, this virus carries some sequences originating from pOR 72 plasmids, which can be excluded using classical methods of molecular biology, if necessary.
Пример ЗExample C
В зтом примере описьівается получение другого дефектного рекомбинантного аденовируса по зтому изобретению путем коинфицирования с помощью вируса-хелпера, ДНК рекомбинантного вируса, включенного в плазмиду.In this example, the preparation of the second defective recombinant adenovirus according to this invention is described by co-infection with the helper virus, the DNA of the recombinant virus included in the plasmid.
Для зтого бьла создана плазмида, несущая примькающие ІТА Аа5, последовательность инкапсидации, ген Е2 Аа2 под контролем собственного промотора и, в качестве гетерологичного гена, ген ас под контролем промотора ТА вируса Н5М(фиг.5). Зта плазмида, обозначенная как рЕг2Саї, бьіла получена путем клонирования и дотирования следующих фФрагментов(фиг.5): фрагмента Ніпаїїї-Засії, происходящего из плазмидь! рЕс1144 |сганат еї аї., ЕМВО І. 8 (1989) 2077).For this purpose, a plasmid was created, carrying ITA Aa5, the encapsidation sequence, the E2 Aa2 gene under the control of its own promoter and, as a heterologous gene, the ac gene under the control of the TA promoter of the H5M virus (Fig. 5). This plasmid, designated as pEg2Sai, was obtained by cloning and doting the following fFragments (fig. 5): a fragment of Nipaiia-Zasia, originating from plasmids! pEs1144 |sganat ei ai., EMVO I. 8 (1989) 2077).
Зтот фрагмент несет последовательности ІТА Айб5 от сголовьі Кк хвосту и последовательность инкапсидации: фрагмент НіпайШ (34920) - Басі! (352). Он бьл клонирован вместе со следующим фрагментом на уровне сайтов НіпаПц16) - Рец(32) плазмидь рор 72; фрагмента АЯ5 содержащегося между сайтами Засі(локализованного на уровне парьї оснований 3827) и РаЦЦ(локализованного на уровне парьі! оснований 4245). Зтот фрагмент бьіл клонирован на уровне сайта Засі! предшествующего фрагмента и сайта Реі(32) плазмидь рр 72; фрагмента роР 72(Рготеда), содержащегося между сайтами Резц(рь 32) и Зац(34); фрагмента ХпоіІ-Храї! плазмидь рАаї. тА саїХхХ, описанного біганога-Ре!тісацаєеї еї а!. (ІСІ 90 (1992) 626).This fragment carries the ITA Aib5 sequence from the head of the Kk tail and the encapsidation sequence: fragment NipaiSh (34920) - Basi! (352). It was cloned together with the following fragment at the site level NipaPc16) - Rec(32) plasmid ror 72; of the АЯ5 fragment contained between the sites of Zasi (localized at the pariah level based on 3827) and RaCC (localized on the pariah level based on 4245). This fragment was cloned at the level of the Zasi site! of the preceding fragment and site of Rei(32) plasmid rr 72; the fragment of РоР 72 (Rgoteda), contained between the sites Rezts(р 32) and Zats(34); fragment of KhpoiI-Khrai! pAai plasmid. тА сайХхХ, the described runner-Re!tisatsaeei ei a!. (CSI 90 (1992) 626).
Зтот фрагмент несет ген їас под контролем ТА вируса А5М. Он бьіл клонирован на уровне сайтовThis fragment carries the ias gene under the control of TA of the A5M virus. It was cloned at the site level
За!/І(34) и Храї! плазмидь рор 72. фрагмента роР 72(Рготеда), содержащегося между сайтами Хбаї(рь 34) и Ваті (ро 46); фрагмента Ватні(21606) - Хта|(рь 27339) Ааг. Зтот фрагмент генома Ад2 содержит область Е2 под контролем его соответствующего промотора. Он бьл клонирован на уровне сайтов Ватні(46) и ЕсопУ плазмидь роР 72. фрагмента ЕсоВМірь 81) - НіпацЦрь 16) плазмидь роР 72.Za!/I(34) and Khrai! plasmid roR 72. fragment roR 72 (Rgoteda), contained between sites Khbai (r 34) and Vati (ro 46); fragment of Vatni (21606) - Khta|(r 27339) Aag. This fragment of the Ad2 genome contains the E2 region under the control of the corresponding promoter. It was cloned at the level of Watni sites (46) and EsopU plasmid roR 72. fragment of EsoVMir 81) - NipatsCr 16) plasmid roR 72.
Зта плазмида бьла получена путем клонирования различньїх фрагментов в указаннье области плазмидь роР 72. Понятно, что специалисть! могут получить зквивалентнье фрагменть, исходя из других источникКов.This plasmid was obtained by cloning various fragments in the region of plasmid pOR 72. It is clear that the specialist! can get an equivalent fragment based on other sources of Kov.
Далее плазмида рЕг2Саї контрансфицировалась вместе с ДНК вируса Нга1802, лишенной области Е2Next, the pEg2Cai plasmid was transfected together with the DNA of the Hga1802 virus, lacking the E2 region
ІВісе еї аї. І. Мігої. 56 (11985) 767) в клетки 293, в присутствий фосфата кальция. Рекомбинантньй вирус затем получали, как описано в примере 1. Зтот вирус несет в качестве единственного вирусного гена генIVise ei ai. I. Migoi. 56 (11985) 767) in cells 293, in the presence of calcium phosphate. The recombinant virus was then obtained as described in Example 1. This virus carries as the only viral gene the gene
У2 аденовируса Ааг(фиг.5). Его геном имеет размер около 12Кр, такой, которьй дает возможность встройки гетерологичной ДНК весьма большого размера(до 20кр). Таким образом, специалист может легко заменить ген ас на любой другой терапевтический ген, такой, коториій упомянут вьіше. С другой стороньі, зтот вирус несет некоторне последовательности, происходящие из промежуточной плазмидь,, которье могут бьть устранень с помощью классических методик молекулярной биологии, если необходимо.U2 adenovirus Aag (Fig. 5). Its genome has a size of about 12 Kr, which makes it possible to insert heterologous DNA of a very large size (up to 20 Kr). Thus, a specialist can easily replace the as gene with any other therapeutic gene, such as those mentioned above. On the other hand, this virus carries some sequences originating from intermediate plasmids, which can be eliminated using classical methods of molecular biology, if necessary.
Пример 4Example 4
В зтом примере описьівается создание клеточньїх линий, комплементирующих области Е1, Е2 и/илиThis example describes the creation of cell lines complementing the regions E1, E2 and/or
Е4 аденовируса. Зти линии позволяют создавать конструкции рекомбинантньїх аденовирусов по зтому изобретению, лишенньх зтих областей, не прибегая к использованию вируса-хелпера. Зти вирусь получень путем рекомбинации іп мімо и могут включать важнье гетерологичньюе последовательности,E4 adenovirus. These lines make it possible to create constructs of recombinant adenoviruses according to this invention, only those regions, without resorting to the use of a helper virus. These viruses are obtained by recombination and may include important heterologous sequences,
В описанньїх клеточньїх линиях, области Е?2 и Е4, потенциально цитотоксичнье, помещеньі! под контроль индуцируемого промотора: ТА ММТМ(РНагтасіа), которьій индуцируется дексаметазоном или нативньм или в минимальной форме, описанной в РМАБ5 90 (1993) 5603; или подавляемой тетрациклином системой, описанной Сбовзеп Виц)ага |РМА5 89 (1992) 5547). Понятно, что могут использоваться другие промоторьї, и в частности варианть! ТР ММТУ, несущие, например, гетерологичнье области регуляций(а именно, "знхансерную" область). Линии зтого изобретения бьли созданьй путем трансфекции соответствующих клеток в присутствий фосфата кальция фрагментом ДНК, несущим указаннье гень(области аденовируса и/или ген рецептора для глюкокортикоидов) под контролем промотора транскрипции и терминатора(сайта полиаденилирования). Терминатор может бьть или природньм терминатором трансфицируемого гена или другим терминатором, как например терминатор раннего мессенджера вируса 5М40. Предпочтительно, фрагмент ДНК несет также ген, дающий возможность селекции трансформированньїх клеток, как например ген устойчивости к генетицину. Ген устойчивости может нести также фрагмент другой ДНК, контрансфицируемой с первой.In the described cell lines, areas E?2 and E4, potentially cytotoxic, premises! under the control of an inducible promoter: TA MMTM (RNagtasia), which is induced by dexamethasone either natively or in the minimal form described in RMAB5 90 (1993) 5603; or by the system suppressed by tetracycline, described by Sbovzep Vytsaga |РМА5 89 (1992) 5547). It is clear that other promoters can be used, and in particular the variant! TR MMTU, carrying, for example, a heterologous area of regulation (namely, a "non-enhanced" area). The lines of this invention were created by transfection of the corresponding cells in the presence of calcium phosphate with a DNA fragment carrying the gene (regions of the adenovirus and/or receptor gene for glucocorticoids) under the control of the transcription promoter and the terminator (polyadenylation site). The terminator can be either a natural terminator of the transfected gene or a second terminator, such as the terminator of the early messenger virus 5M40. Preferably, the DNA fragment also carries a gene that enables the selection of transformed cells, such as a geneticin resistance gene. The resistance gene can also carry a fragment of the second DNA transfected with the first one.
После трансфекции трансформированнье клетки отбирали, и их ДНК анализировали для подтверждения интеграции фрагмента ДНК в геном.After transfection, the transformed cells were selected, and their DNA was analyzed to confirm the integration of the DNA fragment into the genome.
Зта методика позволяет получить следующие клеточньсе линии: 1. Клетки 293, обладающие геном 72К области Е2 Ад5 под контролем І ТА ММТУ; 2. Клетки 293, обладающие геном 72К области Е2 Аа5 под контролем ТА ММТМУ и геном рецептора для глюкокортикоидов; 3. Клетки 293, обладающие геном 72К области Е2 Аа5 под контролем ТА ММТМУ и областью Е4 под контролем ТА ММТУ; 4. Клетки 293, геном 72К области Е2 Аа5 под контролем ТА ММТУ, областью Е4 под контролем І! ТАThis technique makes it possible to obtain the following cell lines: 1. 293 cells, possessing the 72K gene of the E2 Ad5 region under the control of I TA MMTU; 2. 293 cells possessing the 72K gene of the E2 Aa5 region under the control of TA MMTMU and the glucocorticoid receptor gene; 3. 293 cells possessing the 72K gene of the E2 Aa5 region under the control of TA MMTMU and the E4 region under the control of TA MMTU; 4. Cells 293, genome 72K region E2 Aa5 under the control of TA MMTU, region E4 under the control of I! AND
ММТУ и геном рецептора для глюкокортикоидов; 5. Клетки 293, обладающие областью Е4 под контролем І ТА ММТМ; б. Клетки 293, обладающие областью Е4 под контролем ТА ММТМ и геном рецептора для глюкокортикоидов; 7. Клетки дт ОВРб, обладающие областями ЕТА и Е1В под контролем их собственного промотора и областью Е4 под контролем І ТА ММТУ.MMTU and the glucocorticoid receptor gene; 5. Cells 293, possessing the E4 region under the control of I TA MMTM; b. 293 cells possessing the E4 region under the control of TA MMTM and the glucocorticoid receptor gene; 7. Dt OVRb cells possessing the ETA and E1B regions under the control of their own promoter and the E4 region under the control of I and MMTU.
Пример 5Example 5
В зтом примере описьшваєтся получение дефектньх рекомбинантньїх аденовирусов по зтому изобретению, геном которьїх лишен генов Е!1, ЕЗ и Е4. По предпочтительному способу осуществления, проиллюстрированному в примере и в примере 3, геном рекомбинантньїх аденовирусов зтого изобретения модифицирован так, чтобьі геньї Еї и Е4 бьли бь по крайней мере нефункциональньми. Такие аденовирусьї обладают прежде всего способностью включения важньїх гетерологичньїх генов. С другой сторонь, зти векторьї имеют вьісокую безопасность, потому что деления области Е4, которая участвует в регуляции зкспрессии поздних генов, стабильности поздних ядерньх РНК, прекращения зкспрессий белков клетки-хозянина и зффективности репликации вирусной ДНК. Зти векторьї обладают, таким образом, фоновьім шумом транскрипции, и зкспрессия вирусньїх генов сильно снижена. И, наконец, по особенно предпочтительному способу, зти векторь! могут производиться до титров, сравнимьіх с таковьми диких аденовирусов.In this example, the production of defective recombinant adenoviruses according to this invention is described, the genome of which lacks the E!1, EZ and E4 genes. According to the preferred method of implementation, illustrated in example and in example 3, the genome of the recombinant adenoviruses of the invention is modified so that the E1 and E4 genes are at least non-functional. Such adenoviruses have, first of all, the ability to include important heterologous genes. On the other hand, these vectors have high safety because of the division of the E4 region, which is involved in the regulation of the expression of late genes, the stability of late nuclear RNAs, the termination of expression of host cell proteins, and the efficiency of viral DNA replication. Thus, these vectors have background transcription noise, and the expression of viral genes is greatly reduced. And, finally, in a particularly preferred way, this is a vector! can be produced to titers comparable to those of wild adenoviruses.
Зти аденовирусь! получали, начиная с плазмидьі рРУ55, несущей модифицированную правую часть генома аденовируса Аа5, или путем трансфекции с хелперной плазмидой(также примерь! 1, 2 и 3), или с помощью дополняющей линий(пример 4). 5.1. Создание плазмидь рРУ55 а) Построение плазмидь! рРУ32It's an adenovirus! were obtained, starting with the pRU55 plasmid, which carries the modified right part of the Aa5 adenovirus genome, either by transfection with a helper plasmid (also examples 1, 2 and 3), or with the help of complementary liny (example 4). 5.1. Creation of pRU55 plasmids a) Construction of plasmids! pRU32
Фрагмент АупіІ-ВсіЇ плазмидьі рес144 (Р. І. Станат еї а. ЕМВО 1. 8(1989) 2077-2085), соответствующий правому концу генома аденовируса Ад5, сначала бьіл клонирован между сайтами Хвраї! и Ватні вектора рІС1Т9Н, начиная с контекста дат-. Зто давало плазмиду рРУ23. Интересной характеристикой плазмидь! рРУ23 яявляеєтся то, что сайт ЗаїІ, происходящий из мультисайта клонирования вектора ріС19нН, остается единственньм и что он располагается около правого конца генома аденовируса Аа5. Фрагмент Нае!ПІ-Заї плазмидьй рРУг23, которьій содержит правьй конец генома аденовируса Ай5, начиная с сайта НаєеіЇї, располагается в положений 35614 и затем клонируется между сайтами ЕсоВМ и Хпої! вектора рІС2ОН, что дает плазмиду рРУ29. Интересной характеристикой зтой плазмидь! является то, что сайть! Храї и Сіаї, происходящие из мультисайта клонирования вектора ріСОН, располагаются около соединенияThe AupiI-All plasmid res144 fragment (R.I. Stanatei a. EMVO 1. 8(1989) 2077-2085), corresponding to the right end of the Ad5 adenovirus genome, was first cloned between the sites of Khvrai! and Vatni vector pIC1T9H, starting from the context dat-. This gave plasmid pRU23. An interesting characteristic of plasmids! pRU23 is characterized by the fact that the ZaiI site, originating from the multisite cloning of the rC19nH vector, remains the only one and that it is located near the right end of the Aa5 adenovirus genome. The Nae!PI-Zai plasmid pRUg23 fragment, which contains the right end of the Ai5 adenovirus genome, starting from the NaeeiIi site, is located at the position 35614 and then cloned between the EsoVM and Khpoi sites! vector pIC2OH, which gives plasmid pRU29. This plasmid has an interesting characteristic! is what the site is! Chrays and Siai, originating from the multisite cloning of the RiSON vector, are located near the junction
ЕсонМУ/Нае!й полученного в результате клонирования. Кроме того, зто соединениє модифицирует нуклеотидньй контекст непосредственно примькающий к сайту СіаІ, которьй теперь становится метилируемьм в контексте дати. Фрагмент Хба/І(30470)-Мае!І(32811) генома аденовируса Аа5 затем клонировали между сайтами хХваї и СіаІ плазмидьі рРУ29, полученной начиная с контекста дат-, что дает плазмиду рРУЗ0О. Фрагмент 551 плазмидьій рРУЗО, которьйй соответствуєт последовательности генома аденовируса АЯ5 с сайта 55іЇ в положении 30556 до правого конца, в заключение клонировали между сайтами 55 вектора ріС2ОнН, что дает плазмиду рРУЗІ, карта рестрикции вставки которой, локализованной между сайтами Ніпаї|, дана на фиг.6.EsonMU/Nae!y obtained as a result of cloning. In addition, this compound modifies the nucleotide context directly adjacent to the CiaI site, which now becomes methylated in the context of the date. The fragment Xba/I(30470)-Mae!I(32811) of the adenovirus Aa5 genome was then cloned between the xXvaI and CiaI sites of the plasmid pRU29, obtained starting from the dat- context, which gives the plasmid pRUZ00. Fragment 551 of the plasmid pRUZI, which corresponds to the sequence of the adenovirus AYA5 genome from site 55iY in position 30556 to the right end, was finally cloned between sites 55 of the vector riC2OnH, which gives the plasmid rRUZI, the restriction map of the insertion of which, localized between the sites of Nipai|, is given in fig. 6.
Плазмида рРУЗ2 бьіла получена после частичного расщепления плазмидь! рРУЗ1 с помощью ВаїЇ, с последующим полньм расщеплением с помощью Ватні, а затем повторньім лигированием. Плазмида рРУЗ32 соответствуєт, таким образом, делеции генома аденовируса АЯа5, расположенной между сайтомPlasmid pRUZ2 was obtained after partial cleavage of plasmids! pRUZ1 with the help of VaI, followed by complete cleavage with the help of Vatna, and then repeated ligation. Plasmid pRUZ32 corresponds, thus, to the deletion of the adenovirus AYA5 genome, located between the site
Ватні плазмидь рРУЗІ1 и сайтом ВаОіЇЇ, локализованном в положений 30818. Карта рестрикции фрагментаWatni plasmid rRUZI1 and the VaOiYI site localized in position 30818. Fragment restriction map
Ніпа! плазмидьі рРУ32 дана на фиг.б6. Особенность плазмидьі рРУ32 состоит в том, что она обладаєт уникальнь/ми сайтами заї и Хваї.Nope! pRU32 plasmids is given in fig.b6. The peculiarity of the pRU32 plasmid is that it has unique Zai and Khvai sites.
БЮ) Построение плазмидь ргРу47BYU) Construction of rgRu47 plasmids
Фрагмент Ватн(і(21562)-Хра(28592) генома аденовируса АЯ5 сначала клонировали между сайтамиThe Vatn(i(21562)-Khra(28592) fragment of the AYA5 adenovirus genome was first cloned between sites
Ватні и Хваї вектора ріС19Н, полученного начиная с контекста дат-, что давало плазмиду рРУ17. Зта плазмида содержит, таким образом, фрагмент Ніпац(26328)-Вац (28133) генома аденовируса Аа5, которьй может бьіть клонирован между сайтами Ніпаїїї и Воді! вектора ріС2ОВА, для получения плазмидь! рРУ34.Watni and Khvai of the riC19H vector, obtained starting from the dat- context, which gave the pRU17 plasmid. Thus, this plasmid contains a fragment of the Nipac(26328)-Vac (28133) genome of adenovirus Aa5, which can be cloned between the sites of Nipaiia and Vodi! vector riS2OVA, to obtain plasmids! pRU34.
Особенность зтой плазмидь состоит в том, что сайт Ватні, происходящий из мультисайта клонирования, располагаєтся непосредственно вблизи сайта Ніпа(26328) генома аденовируса Аа5.The peculiarity of this plasmid is that the Watni site, originating from the multisite of cloning, is located directly near the Nipa site (26328) of the Aa5 adenovirus genome.
Фрагмент Ватні(21562)-Ніпац(26328) генома аденовируса Аа5, происходящий из плазмидьі рРУ17, затем клонируется между сайтами Ватні и НіпаїЇ плазмидь! рРУЗ34, что дает плазмиду рРУЗО9. ФрагментThe Vatni(21562)-Nipac(26328) genome fragment of adenovirus Aa5, originating from the pRU17 plasmid, is then cloned between the sites of the Vatni and Nipai plasmids! rRUZ34, which gives plasmid rRUZ9. Fragment
Ватні-ХраиІ плазмидьй рРУЗ39, полученной начиная с контекста дат-, содержащий часть генома аденовируса Аа5, заключающегося между сайтами Ватні(21562) и Ва! (28123), затем клонировали между сайтами Ватні и Хра! вектора рРІС19Н, полученного, начиная с контекста дат-. Зто дает плазмиду рРМУ47, интересной особенностью которой является то, что сайт ЗаїЇ происходящий из мультисайта клонирования, локализуется вблизи сайта НіпапП(фиг.7). с) Построение плазмидь рРУБ55Watni-KraiI plasmid pRUZ39, obtained starting from the dat- context, containing part of the adenovirus Aa5 genome, which is located between the sites of Watni (21562) and Ba! (28123), then cloned between the sites of Watni and Hra! pRIS19H vector obtained starting from the dat context. This gives the pRMU47 plasmid, an interesting feature of which is that the ZaiI site originating from the multisite cloning site is localized near the NipapP site (fig. 7). c) Construction of rRUB55 plasmids
Фрагмент ЗаїпІ-Хва! плазмидьі рРУ47, полученной начиная с контекста дат-, и которьій содержит часть генома аденовируса Ай5, начиная с сайта ВатнНі(21562) до сайта ВоП(28133), клонировали между сайтами заї| и Хвра! плазмидьі рРУЗ2, что давало плазмиду рРУ55. Зта плазмида непосредственно может использоваться для получения рекомбинантньїх аденовирусов, лишенньїх, по крайней мере, областиA fragment of ZaipI-Hwa! pRU47 plasmid, obtained starting from the dat- context, and which contains a part of the AI5 adenovirus genome, starting from the VatNi site (21562) to the VoP site (28133), was cloned between the sites of and Khvra! plasmid pRUZ2, which gave plasmid pRU55. This plasmid can directly be used to produce recombinant adenoviruses, which have at least the region
ЕЗ(деления между сайтами Ваіїї, расположенньіми в положениях 28133 и 30818 генома аденовируса да5) и полной области Е4(делеция между сайтами Мае!(32811) и Нае!1ІІ(35614) генома аденовируса дахз(фиг.7).EZ (deletions between Vaiii sites located at positions 28133 and 30818 of the adenovirus da5 genome) and the complete E4 region (deletion between sites Ma! (32811) and Nae!1II (35614) of the adenovirus dahz genome (fig. 7).
5.2. Получение аденовируса, содержащего по крайней мере одно делению в области Е4, и предпочтительно, по крайней мере в областях Е1 и Е4. а) Получение путем котрансфекции с вирусом-хелпером Е4 клеток 293.5.2. Obtaining an adenovirus containing at least one division in the E4 region, and preferably, at least in the E1 and E4 regions. a) Obtaining 293 cells by cotransfection with E4 helper virus.
Принцип, основанньй на транскомплементации между "минивирусом'(вирус-хелпер), зспрессирующим область Е4, и рекомбинантньїм вирусом, лишенньїм по крайней мере ЕЗ и Е4. Зти вирусь! бьіли получень или путем лигирования іп міїго, или после рекомбинации іп мімо по следующей стратегии: (І) ДНК вируса Аа-а1324 | пПіттаррауа еї аї., СеїЇ 31 (1982) 543) и плазмиду рРУ55, расщепленньеThe principle is based on transcomplementation between a "minivirus" (helper virus) suppressing the E4 region and a recombinant virus lacking at least EZ and E4. These viruses were obtained either by ligation with migo, or after recombination with mimo according to the following strategy : (I) DNA of the virus Aa-a1324 | pPittarraua ei ai., Seiyi 31 (1982) 543) and plasmid pRU55, cleavage
Ватні, сначала лигировали іп міо, затем котрансфицировали с плазмидой рЕАСаЦ(описанной в примере 2) в клетки 293. (І) ДНК вируса Аа-а1324, расщепленную ЕсоВІ и плазмиду рРУ55, расщепленную Ватні котрансфицировали с плазмидой рЕ4саї в клетки 293. (І) ДНК аденовируса Дй5 и плазмиду рРУ55, расщепленнье Ватні, лигировали и затем котрансфицировали с плазмидой рЕ4саї в клетки 293. (ІМ) ДНК аденовируса Аай5, расщепленную ЕсоВІ и плазмиду рРУ55, расщепленную Ватні, котрансфицировали с рЕАсСаїЇ в клетки 293.Vatni, first ligated with myo, then cotransfected with plasmid pEASaC (described in example 2) into 293 cells. (I) DNA of virus Aa-a1324, cleaved by EsoVI and plasmid pRU55, cleaved by Vatni, were cotransfected with plasmid pE4sai into 293 cells. (I) DNA of adenovirus Dj5 and plasmid pRU55, cleaved by Watni, was ligated and then cotransfected with plasmid pE4sai into 293 cells. (IM) DNA of adenovirus Aai5, cleaved by EsoVI and plasmid pRU55, cleaved by Watni, were cotransfected with rEAssaiI into 293 cells.
Стратегии (І) и (І) позволяют получить рекомбинантньй вирус, лишенньй областей Е!, ЕЗ и Е4; стратегии (ІЇЇ) и (ІМ) позволяют получить рекомбинантньїй вирус, лишенньїй области Е1, но виражающий какой-нибудь трансген, может использоваться вместо ДНК вируса Аа-де324 в соответствий со стратегиями (І) или (ІЇ), в целях получения рекомбинантного вируса, лишенного областей Е1, ЕЗ и Е4 и вниражающей указанньй трансген.Strategies (I) and (I) make it possible to obtain a recombinant virus lacking regions E!, EZ and E4; strategies (III) and (IM) allow to obtain a recombinant virus lacking the E1 region, but expressing some transgene, can be used instead of the DNA of the Aa-de324 virus in accordance with strategies (I) or (II), in order to obtain a recombinant virus, devoid of areas E1, EZ and E4 and showing transgene.
БЮ) Получение с помощью клеточньїх линий, транскомплементирующих функции Е1 и Е4.BYU) Obtaining with the help of cell lines transcomplementing the functions of E1 and E4.
Принцип, положенньй здесь в основу, тот, что линия клеток, производная от линии, зкспрессирующей область Е1, например, линия 293, и также зкспрессирующая по крайней мере открьітье рамки считьіванияThe underlying principle here is that a cell line derived from a line expressing the E1 region, for example, line 293, and also expressing at least the opening reading frame
ОВЕб и ОВЕб6/7 области Е4 аденовируса АЯ5 под контролем промотора, например, индуцируемого, способна транскомплементировать сразу обе области Е1 и Е4 аденовируса Ад5. Такие линии описань! в примере 4.ОВЕб and ОВЕб6/7 regions of E4 of adenovirus АЯ5 under the control of a promoter, for example, an inducible one, capable of transcomplementing both E1 and E4 regions of adenovirus Ad5 at once. Such lines of description! in example 4.
Рекомбинантньй вирус, лишенньїй областей Е1, ЕЗ и Е4, может, таким образом, бьіть получен путем лигирования іп мйго или путем рекомбинации іп мімо по методикам, описанньм здесь вьіше. Какая бь методика не использовалась для получения вирусов, лишенньїх по крайней мере области Е4, после трансфекции в зти использованнье клетки наблюдался цитопатический зффект(показьівающий продукцию рекомбинантньїх вирусов). Затем клетки собирали, разрушали путем трех циклов замораживания- размораживания в их супернатанте, затем центрифугировали при 4000об/мин в течение 10 минут.Recombinant virus lacking the E1, EZ and E4 regions can thus be obtained by ligation of Ip myo or by recombination of Ip mimo according to the methods described above. Whatever method was used to obtain viruses lacking at least the E4 region, a cytopathic effect (indicating the production of recombinant viruses) was observed after transfection into the cell. Then the cells were collected, destroyed by three cycles of freezing and thawing in their supernatant, then centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes.
Супернатант, полученньй таким образом, затем амплицировали на свежей клеточной культуре(клетки 293 по методикам а) и клетки 293, зкспрессирующие область Е4 по методике Б)). Затем вирус очищали от мембран и его ДНК анализировали по методу Ній(упомянутому вьіше). Концентратьь штамма вируса получали затем в градиенте плотности хлоида цезия.The supernatant obtained in this way was then amplified on a fresh cell culture (cells 293 according to methods a) and cells 293 expressing the E4 region according to methods B)). Then the virus was purified from membranes and its DNA was analyzed according to the Nii method (mentioned above). The concentration of the virus strain was then obtained in a cesium chloride density gradient.
Пример 6Example 6
В зтом примере описьтвается получениеє дефектньїх рекомбинантньїх аденовирусов, геном которьх лишен генов ЕТ, ЕЗ, І5 и Е4. Зти векторьї особенно предпочтительньї, потому что область І5 кодирует последовательность, которая являєтся белком, чрезвьмчайно токсичнь!м для клетки.This example describes the preparation of defective recombinant adenoviruses whose genome lacks ET, EZ, I5, and E4 genes. These vectors are especially preferred because the I5 region encodes a sequence that appears as a protein that is extremely toxic to the cell.
Зти аденовирусьії получили, начиная с плазмидьії р2, несущей модифицированную правую часть генома аденовируса Аа5, путем котрансфекции с различньмми хелперньми плазмидами. Они могут бьть также полученьї с помощью дополняющей линии. 6.1. Построение плазмидь ра.These adenoviruses were obtained, starting with plasmid p2, carrying the modified right part of the genome of adenovirus Aa5, by cotransfection with various helper plasmids. They can also be obtained with the help of an additional line. 6.1. Construction of plasmids.
Зта плазмида содержит всю правую область генома аденовируса Ай, начиная с сайта Ватні(21562), из которой удален фрагмент, заключенньій между сайтами Хвраї(28592) и Амп(35463), несущей геньі ЕЗ, І 5 и Е4. Плазмида ра2 бьіла получена путем клонирования и лигирования следующих фрагментов в плазмиду ріС19А8, расщепленную Ватні и дефосфорилированну(см. фиг.8): фрагмента генома аденовируса Аа5, содержащегося между сайтами Ватні(21562) и ХраІ(28592), и правого конца генома аденовируса Аабз(содержащего правую ІТР), начиная с сайта Ам'п((35463) по сайт Всі((соответствующий Ватні). 6.2. Построениеє хелперной плазмидь(рітАІ 5-Е4), несущей ген 5. Хелперная плазмида рітНІ 5-Е4 привносит геньі Е4 и 15. Она соответствует плазмиде рЕ4Саї, описанной в примере 2, несущей, кроме того, область І 5, кодирующую нить(последовательность) под контролем промотора МІ Р аденовируса Аа2.This plasmid contains the entire right region of the Ai adenovirus genome, starting from the Watni site (21562), from which the fragment between the Khvrai (28592) and Amp (35463) sites, carrying the EZ, I5 and E4 genes, was removed. Plasmid ra2 was obtained by cloning and ligation of the following fragments into plasmid riC19A8, cleaved by Vatna and dephosphorylated (see Fig. 8): a fragment of the genome of adenovirus Aa5, contained between the sites of Vatna (21562) and KhraI (28592), and the right end of the genome of adenovirus Aabz (containing the right ITR), starting from the site Am'p((35463) to the site Vsy((corresponding to Watni). 6.2. Constructs a helper plasmid (ritAI 5-E4) carrying gene 5. The helper plasmid ritNI 5-E4 brings the E4 gene and 15. It corresponds to the plasmid pE4Cai, described in example 2, carrying, in addition, region I 5, encoding a strand (sequence) under the control of the MI R promoter of adenovirus Aa2.
Плазмида рітТНїІ 5-Е4 бьіла построена следующим образом(фиг.9 и 10): биіл синтезирован олигонуклеотид из 58рр, содержащий в направлении 5' - 3' сайт Ніпаїї, АТО нити и последовательность, кодирующую нить до сайта Має! в положениий 31089 генома аденовируса Ад5. Последовательность зтого нуклеотида дана здесь ниже в ориентации 5 - 3"Plasmid ritTNiI 5-E4 was constructed as follows (fig. 9 and 10): an oligonucleotide was synthesized from 58pp, containing in the 5' - 3' direction the Nipai site, ATO strands and the sequence encoding the strand to the Maye site! in position 31089 of Ad5 adenovirus genome. The sequence of that nucleotide is given below in the orientation 5 - 3"
ААССТТАТОААаСаСасСААаАССО, ТСТаААСАТАССТТСААССССИататАТССАТАТОаААССТТАТОАаСаСасСААаАССО, ТСТаААСАТАССТТСААССССІatatАТССАТАТОa
Сайть Ніпай на 5' и Має! на 3' подчеркнуть! одной линией, АТО нити подчеркнута двойной линией.Site Nipai on 5' and May! 3' will be emphasized! with a single line, the ATO thread is underlined with a double line.
Фрагмент 52рі-Ніпаїїї, содержащий последовательность промотора МІ Р, следующую за состоящим из 3-х частей лидером аденовируса Ай2 бьл вьіделен из плазмидьі рМІ РІО |ВаїЇау еї аї., (1987)ОСІ АA fragment of 52ri-Nipaiii, containing the sequence of the promoter of MI R, following the 3-part leader of adenovirus A2 was isolated from the plasmid rMI RIO |VaiYau ei ai., (1987) OSI A
Зутровіа оп тоіесшаг апа сеїшіаг Біоюоду, Мем зепев. Мо! 70, Вобіпвзоп еї аї. (Едв) Мем/-Могк, 481). Зтот фрагмент бьіл встроен вместе с олигонуклеотидом из 58рр, описанньїм здесь вьіше, между сайтами Маєї иZutrovia op toiesshag apa seishiag Bioyuodu, Mem zepev. Mo! 70, Vobipvzop ei ai. (Edv) Mem/-Mogk, 481). This fragment was inserted together with the oligonucleotide from 58pp, described above, between the sites of Maya and
ЕсоВМ плазмидь ріІС19А с получением промежуточной плазмидь(см. фиг.9).EsoVM plasmid riIS19A to obtain an intermediate plasmid (see Fig. 9).
Фрагмент Засі(затупленньій)-МаеІ плазмидьї рЕ4Са(пример 2) затем вводили в промежуточную плазмиду между сайтами 55рі и Має! с получением плазмидь рітТВІ 5-Е4 (фиг.10).The fragment Zasi (blunt)-MaeI of plasmid pE4Ca (example 2) was then introduced into the intermediate plasmid between the sites 55ri and Maye! with obtaining plasmids ritTVI 5-E4 (fig. 10).
6.3. Получение дефектньїх рекомбинантньїх аденовирусов, содержащих делецию в областях Е1, ЕЗ,6.3. Obtaining defective recombinant adenoviruses containing deletions in regions E1, EZ,
ІЇ5 и Е4. а) Получение путем котрансфекции с вирусом-хелпером клеток 293.II5 and E4. a) Obtained by cotransfection with the helper virus of cells 293.
Принцип основан на транскомплементации между "минивирусом'(вирус-хелпер), зкспрессирующим область І 5 или области Е4 и І 5 и рекомбинантньмм вирусом, лишенньм, по крайней мере, ЕЗ, ЕФфи 15.The principle is based on transcomplementation between a "minivirus" (helper virus) expressing the I5 region or the E4 and I5 regions and a recombinant virus lacking at least EZ, EFF15.
Зти вирусьї били полученьй или путем лигирования іп міо, или после рекомбинации іп мімо по следующим стратегиям: (І) ДНК вируса Аа-а1324 | Піттаррауа еї а!., Сеї! 31 (1982) 543) и плазмиду р2, расщепленнье Ватні, сначала лигировали іп міо, затем котрансфицировали с плазмидой-хелпером рітВІ5-Е4(пример 6.2) в клетки 293. (І) ДНК вируса Ай-а1324, расщепленную ЕсоВІ и плазмиду р2, расщепленную Ватні, котрансфицировали вместе с плазмидой ріТт ВІ 5-Е4 в клетки 293. (І) ДНК оаденовируса Ай5 и оплазмиду р2, расщепленнье Ватні, лигировали, затем котрансфицировали вместе с рітТВІ 5-Е4 в клетки 293. (ІМ) ДНК аденовируса ДАай5, расщепленную ЕсоНВІ и оплазмиду р2, расщепленную Ватні, котрансфицировали вместе с рітТВІ 5-Е4 в клетки 293.These viruses were obtained either by ligation of IP mio, or after recombination with IP mimo according to the following strategies: (I) DNA of the virus Aa-a1324 | Pittarraua ei a!., Seii! 31 (1982) 543) and plasmid p2, cleaved by Watni, were first ligated with myo, then cotransfected with the helper plasmid ritVI5-E4 (example 6.2) into 293 cells. cleaved Vatna, cotransfected together with ritTVI 5-E4 plasmid into 293 cells. (I) DNA of adenovirus AI5 and oplasmid p2, cleaved Watna, ligated, then cotransfected together with ritTVI 5-E4 into 293 cells. (IM) DNA of adenovirus DAai5, cleaved EsoNVI and oplasmid p2, cleaved by Watni, were cotransfected together with ritTVI 5-E4 into 293 cells.
Стратегии (І) и (І) позволяют получать рекомбинантньїй аденовирус, лишенньій областей Е1, ЕЗ, І 5 иStrategies (I) and (I) make it possible to obtain a recombinant adenovirus lacking regions E1, EZ, I 5 and
Е4; стратегии (ІЇЇ) и (ІМ) позволяют получать рекомбинантньй аденовирус, лишенньй областей ЕЗ, 15 и Е4.E4; strategies (III) and (IM) allow to obtain a recombinant adenovirus containing regions EZ, 15 and E4.
Разумеется, ДНК рекомбинантного вируса, лишенная области Е1, но виражающая какой-нибудь трансген, может использоваться вместо ДНК вируса Ай-а1324 по стратегиям (І) или (І) в целях получения рекомбинантного вируса, лишенного областей Е1, ЕЗ, І 5 и Е4 и зкспрессирующего указанньй трансген.Of course, the DNA of the recombinant virus lacking the E1 region, but expressing some transgene, can be used instead of the DNA of the Ai-a1324 virus according to strategies (I) or (I) in order to obtain a recombinant virus lacking the E1, EZ, I5, and E4 regions and expressing the transgene.
Методики, описаннье здесь вьіше, могут также использоваться с вирусом-хелпером, несущим только область 15, при использований клеточной линии, способной зкспрессировать области Еї и Е4 аденовируса, такой, которая описана в примере 4.The methods described above can also be used with a helper virus carrying only region 15, using a cell line capable of expressing the E1 and E4 regions of the adenovirus, such as that described in Example 4.
С другой стороньї, также можно использовать дополляющую линию, способную зкспрессировать области ЕТ, Е4 и 15, так, чтобьї полностью освободиться от вируса-хелпера.On the other hand, it is also possible to use a polling line capable of compressing the ET, E4 and 15 regions, so that it is completely free from the helper virus.
После трансфекции вируснье продуктьй извлекают, амплифицируют и очищают при условиях, описанньх в примере 5. » в Ф е Га) в, й о (19 (2) - оAfter transfection, the viral product is extracted, amplified and purified under the conditions described in example 5.
Бе (ее)Be (ee)
З о ї- ві 8 е - чи и щи а ІкФІ я З тZ o yivi 8 e - chi i schi a IkFI i Z t
Фо пл сFo square with
ФF
Са («в зЇ а ш ГіSa ("in zYi a sh Gi
ЕIS
Фиг.1 сук А в, Б ее в о Н РІ - Щяя«4и ппFig. 1 suk A v, B ee v o N RI - Shchaya«4y pp
А ва ! с Е ЕН А в 0 двтвAnd wow! with E EN A in 0 dvt
Я ШО 1I SHO 1
Фиг2 - з є ЕFig2 - with is E
З ФфFrom Ff
ЕЕEE
Ф ФоF Fo
ЕЕ ч ч евEE h ch ev
Е Е ЕE E E
Ж ІЗ ІZ IZ I
Ж ІЗ р 545 4 ї 5 чаZh IZ r 545 4 th 5 cha
Фиг.ЗFig.Z
Засії ше Сх ев лаб крої має! -5 рЕ4 Саї реР та 2, хваїZasii she Sh ev lab cut has! -5 rE4 Sai reR and 2, khvai
НагаІ8о8 сх ЮЯ--рІ (веловNagaI8o8 east of YuYa--rI (val
Фиг.АFig. A
ЗасіїSow
Ра санНЕВ ХвоїRa sanNEV Needles
Ніпоті Ол Ну, /Nipoti Ol Well, /
АабAab
РЕ? Саї роР 72 б хХваї сф. ВатніRE? Sai roR 72 b xHvai sf. cotton wool
Ой та! нагавог фиг.5Oh that! nagawag fig.5
Н5РРУХЬВ 5т К 58і ЗМ Н а 5р н б я СВH5RRUHV 5t K 58i ZM N a 5r n b i SV
РРУЗІ расшщепление частичноє ВО расщепление полнов Ватні повторноє лигированиє нНерРХЬ ЗМ та зов (Має!) ї ї ї КГ звів їРРУЗИ расшщепление партияльное ВО расшпление плонов Ватни repeated ligation of НерРХХ ЗМ and зов (Has!) и и КГ звив и
ВIN
7 виною рРУЗ27 is the fault of rRUZ2
Фиг.6 т ЕеЕ г А а ІFig. 6 t EeE g A a I
Е В/х л кE V/x l k
Е ою Ббим З у ЩЕ ск 5E oyu Bbym Z u SCHE sk 5
З їз ш ЕFrom iz sh E
ФF
ФF
М/ є ші. са Е бо ФM/ is shi. sa E bo F
Б є в ч ш т 1ї5 1 »- а. о.B is in h sh t 1і5 1 »- a. at.
Іга 121 а. я Фиг.7 - вк п шIga 121 a. i Fig. 7 - inside p w
Делеция Хра1/Амг2 те (СDeletion of Xra1/Amg2 (S
Фиг.8 олигосодержащеє АТО волокнаFig. 8 oligo-containing ATO fiber
Мбе1 Ніпаз 5врі ктMbe1 Nipaz 5vri kt
ЩеMore
Р «7 о « 9 2 з с ся аR «7 o « 9 2 z s sia a
Плазмида промежуточная р п в/ нPlasmid intermediate r p v/ n
Р яR. I
І я й (в) ! с Фиг.9 9 о в -5And I and (in) ! with Fig. 9 9 o in -5
Ф б » Звр1/Есок5 то » Й па ТА рву т ша Басгоінпуввр1F b » Zvr1/Esok5 to » Y pa TA rvu t sha Basgoinpuvvr1
Ж рітА 5-4Z ritA 5-4
Фиг.10 се йFig. 10 se and
Же моеIt's mine
Claims (30)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9308596A FR2707664B1 (en) | 1993-07-13 | 1993-07-13 | Viral vectors and use in gene therapy. |
| PCT/FR1994/000851 WO1995002697A1 (en) | 1993-07-13 | 1994-07-08 | Defective adenovirus vectors and use thereof in gene therapy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA65516C2 true UA65516C2 (en) | 2004-04-15 |
Family
ID=9449205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA95038233A UA65516C2 (en) | 1993-07-13 | 1994-08-07 | Defect adenovirus-derived vectors and the use thereof in gene therapy |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2707664B1 (en) |
| UA (1) | UA65516C2 (en) |
| ZA (1) | ZA945012B (en) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1024198A3 (en) * | 1992-12-03 | 2002-05-29 | Genzyme Corporation | Pseudo-adenoviral vectors for the gene therapy of haemophiliae |
| WO1994023582A1 (en) * | 1993-04-08 | 1994-10-27 | Genetic Therapy, Inc. | Adenoviral vectors including dna encoding lung surfactant protein |
| EP0710288B1 (en) * | 1993-06-10 | 2006-04-05 | Genetic Therapy, Inc. | Adenoviral vectors for treatment of hemophilia |
| IL113052A0 (en) | 1994-03-23 | 1995-06-29 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Recombinant viruses, their preparation and their use in gene therapy |
| EP0784690B1 (en) | 1994-06-10 | 2006-08-16 | Genvec, Inc. | Complementary adenoviral vector systems and cell lines |
| US5851806A (en) * | 1994-06-10 | 1998-12-22 | Genvec, Inc. | Complementary adenoviral systems and cell lines |
| FR2724945B1 (en) * | 1994-09-27 | 1996-12-27 | Centre Nat Rech Scient | VIRAL VECTORS AND USE IN GENE THERAPY |
| FR2725213B1 (en) * | 1994-10-04 | 1996-11-08 | Rhone Poulenc Rorer Sa | VIRAL VECTORS AND USE IN GENE THERAPY |
| FR2729674B1 (en) * | 1995-01-20 | 1997-04-11 | Centre Nat Rech Scient | CELLS FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT ADENOVIRUSES |
| FR2738575B1 (en) * | 1995-09-08 | 1997-10-10 | Centre Nat Rech Scient | CELLS FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT ADENOVIRUSES |
| FR2741891B1 (en) * | 1995-06-01 | 1998-01-09 | Centre Nat Rech Scient | CELLS FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT ADENOVIRUSES |
| IL116816A (en) * | 1995-01-20 | 2003-05-29 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof |
| DK1445322T4 (en) | 1995-06-15 | 2012-09-03 | Crucell Holland Bv | Packaging systems for human recombinant adenovirus for use in gene therapy |
| US6783980B2 (en) | 1995-06-15 | 2004-08-31 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| US6265212B1 (en) | 1995-06-15 | 2001-07-24 | Introgene B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| FR2735789B1 (en) * | 1995-06-23 | 1997-07-25 | Centre Nat Rech Scient | RECOMBINANT ADENOVIRUSES, THEIR USE FOR PREPARING AVA, COMPLEMENTARY CELL LINE AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING THEM |
| US5851826A (en) * | 1995-07-26 | 1998-12-22 | Children's Medical Center Corporation | Helper virus-free herpesvirus vector packaging system |
| FR2737501B1 (en) * | 1995-07-31 | 1997-10-24 | Transgene Sa | NOVEL AUXILIARY VIRUSES FOR THE PREPARATION OF RECOMBINANT VIRAL VECTORS |
| US6004797A (en) * | 1995-11-09 | 1999-12-21 | Avigen, Inc. | Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production |
| US20040156861A1 (en) | 1996-07-11 | 2004-08-12 | Figdor Carl Gustav | Melanoma associated peptide analogues and vaccines against melanoma |
| US6670188B1 (en) | 1998-04-24 | 2003-12-30 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| WO1999061638A1 (en) * | 1998-05-27 | 1999-12-02 | Transgene S.A. | Chimeric adenoviral vectors |
| US6413776B1 (en) | 1998-06-12 | 2002-07-02 | Galapagos Geonomics N.V. | High throughput screening of gene function using adenoviral libraries for functional genomics applications |
| US6113913A (en) | 1998-06-26 | 2000-09-05 | Genvec, Inc. | Recombinant adenovirus |
| DE01918975T1 (en) | 2000-03-24 | 2006-04-13 | Biosphere Medical, Inc., Rockland | Microspheres for active embolization |
| US20030158112A1 (en) | 2002-02-15 | 2003-08-21 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Selective induction of apoptosis to treat ocular disease |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2681786A1 (en) * | 1991-09-27 | 1993-04-02 | Centre Nat Rech Scient | RECOMBINANT VECTORS OF VIRAL ORIGIN, PROCESS FOR OBTAINING SAME AND THEIR USE FOR THE EXPRESSION OF POLYPEPTIDES IN MUSCLE CELLS. |
-
1993
- 1993-07-13 FR FR9308596A patent/FR2707664B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-07-11 ZA ZA945012A patent/ZA945012B/en unknown
- 1994-08-07 UA UA95038233A patent/UA65516C2/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2707664A1 (en) | 1995-01-20 |
| FR2707664B1 (en) | 1995-09-29 |
| ZA945012B (en) | 1995-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA65516C2 (en) | Defect adenovirus-derived vectors and the use thereof in gene therapy | |
| RU2219241C2 (en) | Defective recombinant adenoviral vector (variants) | |
| KR0179994B1 (en) | Recombinant herpes virus of turkeys and live vector vaccines derived thereof | |
| US5922576A (en) | Simplified system for generating recombinant adenoviruses | |
| JP3044062B2 (en) | Recombinant poxvirus host selection system | |
| US5616326A (en) | Recombinant canine adenovirus 2 (CAV-2) | |
| CA2074502C (en) | Vaccines | |
| US5093258A (en) | Recombinant fowlpox virus and recombination vector | |
| RU2233333C2 (en) | Viral vectors and their application in genetic therapy | |
| Pallister et al. | A single gene encoding the fiber is responsible for variations in virulence in the fowl adenoviruses | |
| JP4733795B2 (en) | Gene therapy using sheep adenovirus vector | |
| JPH10507927A (en) | Improved adenovirus and uses thereof | |
| FR2644177A1 (en) | System for selecting a replication domain of a recombinant poxvirus host | |
| JP3159476B2 (en) | Recombinant Marek's disease virus | |
| JPH084508B2 (en) | Recombinant vaccinia virus | |
| US6773709B2 (en) | Chicken embryo lethal (CELO) virus | |
| CS17291A2 (en) | Recombinantly prepared blood factors, method of stated blood factors expression and also recombinants of virus of vaccine that is used in stated process | |
| US5369025A (en) | Recombinant fowlpox vaccine for protection against Marek's disease | |
| KR100484441B1 (en) | Defective Adenovirus Deactivated IVa2 Gene | |
| CA1339774C (en) | Recombinant marek's disease virus, process for preparing the same and vaccine containing the same | |
| EA009525B1 (en) | Recombinant modified vaccinia virus ankara comprising the cowpox ati promoter and methods of use virus and promoter | |
| JPH04504357A (en) | Vaccinia vector, vaccinia gene and its expression product | |
| JP2818836B2 (en) | Method using recombinant vaccinia virus capable of growing in CHO cells | |
| Zou et al. | Stable expression of the reovirus μ2 protein in mouse L cells complements the growth of a reovirus ts mutant with a defect in its M1 gene | |
| CN113337476A (en) | Foot-and-mouth disease O type Panasia-2 lineage reserve vaccine strain and construction method and application thereof |