UA64693C2 - Novel staphylokinase derivatives, a method for the preparation thereof and pharmaceutical composition - Google Patents

Description

Цей винахід стосується нових похідних стафілокінази зі зниженою імуногенністю, їх виробництва та використання при лікуванні тромбозу артерій та для виготовлення фармацевтичної композиції для лікування тромбозу артерій. Більш конкретно, він стосується використання сконструйованих похідних стафілокінази для виготовлення фармацевтичної композиції для лікування інфаркту міокарду.

Тромбозні ускладнення серцево-судинних захворювань є основною причиною смерті та непрацездатності, і отже, тромболіз (тобто розчинення за допомогою лікарських засобів згустку крові) могло б сприятливо впливати на кінець таких загрозливих життю захворювань, як інфаркт міокарду, тромбоз судин мозку та венозна тромбоемболія. Тромболітичні засоби є активаторами плазміногену, які перетворюють плазміноген, неактивний профермент фібринолітичної системи крові, в протеолітичний фермент плазмін. Плазмін розчиняє фібрин згустку крові, але може також руйнувати нормальні компоненти гемостатичної системи та викликати так званий "літичний стан". Фізіологічний фібриноліз, проте, є фібриноорієнтованим у результаті конкретних молекулярних взаємодій між тканинним активатором плазміногену, фібрином, плазміном (плазміногеном) та о2- антиплазміном (1,2).

У даний час шість тромболітичних препаратів або утверджені для клінічного застосування або знаходяться на клінічних випробуваннях при лікуванні пацієнтів з гострим інфарктом міокарду. Ці препарати включають стрептокіназу, урокіназу, рекомбінантний активатор тканинного плазміногену (рт-АП) або його похідні, анізоїльований плазміногено-стрептокіназний активаторний комплекс (АПСАК), рекомбінантний одноланцюговий урокіназний активатор плазміногену (роцу-АП, рекомбинантна проурокіназа) та рекомбінантна стафілокіназа (Зак) (2,3). Після лікування стрептокіназою, рт-АП або

АПСАК у пацієнтів з гострим інфарктом міокарду спостерігалось зниження розміру області інфаркту, збереження функції шлуночків та зниження смертності (2).

Одним з тромболітичних засобів, що використовуються у даний час для терапії, є стрептокіназа, білок з

М. 45000, секретуємий Д-гемолітичними стрептококами. Її введення, однак, пов'язано з інтенсивним руйнуванням системного фібриногену, та її ефективність щодо коронарного тромболізу у хворих при гострому інфаркті міокарду обмежена, сягаючи приблизно 50-відсоткової реканалізації коронарних артерій протягом 90 хвилин (2). Крім того, введення стрептокінази викликає алергічні реакції у приблизно 5 відсотків пацієнтів, що лікувалися, і відповідно викликає утворення специфічних антитіл, що виключає її повторне застосування протягом місяців або років.

Стафілокіназа - білок, що продукується деякими штамами бБїіарпуососси5 ацйгеи5, який має профібринолітичні властивості, що було показано більше 4 десятків років тому (5-7), також, видимо, представляє сильний тромболітичний засіб у хворих з гострим інфарктом міокарду (8). Ген стафілокінази був клонований з бактеріофагів закос (9) та зак420 (10), а також з геномної ДНК (закоТАБК) лізогенного штаму 5іарпуіососси5 ацгецйз (11). Він був експресований під контролем промотору ХРЕ та його власних трансляційних сигналів в ЕзсПегіспіа соїї, а також під контролем його природного промотору та трансляційних сигналів в Васіїйц5 зЇибБійй5 або Езспегіспіа соїї, що приводило до накопичення продукту гену в періплазматичному просторі або в культуральному середовищі, відповідно (10-13).

Стафілокіназний ген кодує білок з 163 амінокислот, з амінокислотою 28, що відповідає МНо-кінцневому залишку зрілої стафілокінази повної довжини (10, 14, 15). Білкова послідовність варіанту дикого типу закотТАВ (15) представлена на фігурі 1. У кодуючих ділянках генів закосС, зак420 та 5акоТтАК було виявлено різницю лише чотирьох нуклеотидів, один з яких створював мовчащу мутацію (10, 14, 15).

Було виділено та очищено декілька молекулярних різновидів стафілокінази з трохи різними М; (16500- 18000 по електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію - ДСН-ЕПАГ) та ізоелектричними точками (11-13). Були одержані похідні зрілої стафілокінази з більш низьким М; з відсутністю 6 (Зак-лб) або 10 (Зак-А10) МНг - кінцевих амінокислот. При взаємодії з плазміном (плазміногеном) у буферному середовищі зріла стафілокіназа (з МНо - кінцем 5Бег-бег-Зег) швидко та кількісно перетворюється в Зак-А10 (МНе- кінець Гуз-Стіу-Авр-). Зріла стафілокіназа та Зак-л10, як було показано, мають однакову фібринолітичну активність (11, 12).

Амінокислота в положенні 26 видимо має вирішальне значення для активації плазміногену стафілокіназою. Дійсно, заміна єдиного залишку Меї в положенні 26 або Агд або Ма! приводить до втрати функціональної активності, тоді як заміна Ге або Суб має слабкий вплив на активність або зовсім не впливає на неї. Оскільки жодна з замін єдиної амінокислоти не викликає значних змін структури мутантних білків в розчині, механізм цієї диференцюючої поведінки залишається невідомим.

В середовищі плазми стафілокіназа здатна розчиняти фібринові згустки без руйнування зв'язаного фібриногену (17-19). Ця фібриноспецифічність стафілокінази є результатом зниженого приглушення оо- антиплазміном плазмін-стафілокіназного комплексу, зв'язаного з фібрином, рециркуляції стафілокінази від плазмін- стафілокіназного комплексу після приглушення ог-антиплазміном та запобігання перетворення циркулюючої плазміноген-стафілокінази в плазмін-стафілокіназу ог-антиплазміном (20-22). На декількох експериментальних моделях тварин стафілокіназа, видимо, проявляє однакову активність зі стрептокіназою щодо розчинення згустків цільної крові або плазми, але значно більш активна щодо розчинення багатих на тромбоцити або стиснених тромбів (23, 24).

Результати, що подають надію, одержані зі стафілокіназою на моделях тромбозу на тваринах сформували основу для її оцінки в масштабі попереднього дослідження у хворих з гострим інфарктом міокарду (3, 25). У 4 з 5 хворих з гострим інфарктом міокарду 1Омг рекомбінантної стафілокінази (закзтАК), введені внутрівенно протягом ЗОхв., як було виявлено, викликають ангіографічно підтверджену реканалізацію коронарних артерій протягом 40хв. На рівні фібриногену плазми та ог-антиплазміну впливу не здійснювалося (залишкові рівні через 40хв. становили 90-9595 від початкового), та алергічні реакції не спостерігались (3). У другій групі з 5 хворих з гострою оклюзією (закупорюванням) коронарних артерій внутрівенне введення 10мг стафілокінази (закоТАК) протягом 30 хвилин приводило до реканалізації у всіх хворих протягом 20 хвилин без деградації зв'язаного фібриногену (25). Контрольна ангіографія через 24 години показала, що реканалізація залишалась.

Імуногенність стафілокінази (зЗакеТтА) порівняно з стрептокіназою вивчали на собаках (23) та бабуїнах (24). В цілому ці дані, одержані на експериментальних тваринах, свідчать про більш низьку імуногенність стафілокінази порівняно зі стрептокіназою. Однак, у перших 5 пацієнтів з гострим інфарктом міокарду, що отримали внутрівенне вливання 1Омг стафілокінази протягом 30 хвилин, титри нейтралізуючих антитіл до стафілокінази (зЗакзТАК) були низькими на початковий момент та до 6 днів після вливання, але високі титри (титри нейтралізуючих стафілокіназу антитіл, рівні 12-42мкг/мл плазми) постійно виявлялись у плазмі через 14-35 днів (3). Ці дослідження були повністю підтверджені у другому попередньому випробуванні у 5 пацієнтів (25). Так, що стосується імуногенності, первісні спостереження на людях не були такими обнадійливими, як дані, отримані на експериментальних тваринах. Таким чином, подібно стрептокіназі, застосування стафілокінази повинно бути обмежено єдиними введенням. Але, відсутність перехресної реактивності індуцьованих антитіл до стафілокінази та стрептокінази (26, 27) приводить до думки, що введення обох речовин не буде взаємовиключним.

Імуногенність, властива стрептокіназі та стафілокіназі, явно перешкоджає їх необмеженому використанню. Не тільки хворі з попередніми високими титрами антитіл будуть несприйнятливі до тромболітичної дії цих речовин, але можуть з'являтися побічні алергічні ефекти та у рідких випадках загрозлива для життя анафілаксія (28). Оскільки як стрептокіназа, так і стафілокіназа є гетерологічними білками, не очевидно, що їх імуногенність могла б бути знижена інженерією білків. Дійсно, не повідомлялось про успішні спроби створення активних фрагментів з низькою молекулярною вагою з стрептокінази. У стафілокінази делеція МНо-кінцевих 17 амінокислот або СООН-кінцевих 2 амінокислот інактивує молекулу, яка, крім того, дуже чутлива до інактивації за допомогою сайт-специфічного мутагенезу (25, 29).

Але, ми несподівано виявили, що варіант стафілокінази дикого типу (закзТАК) (8, 15) містить три імунодомінантних епітопи, що неперекриваються, принаймні, два з яких можуть бути еліміновані за допомогою специфічного сайт-направленого мутагенезу без інактивації молекули. Ці сконструйовані варіанти стафілокінази є менш реактивними з антитілами, що виявляються у хворих, які лікувалися стафілокіназою дикого типу, та значно менш імуногенні, ніж стафілокіназа дикого типу, що показано на моделях на кроликах та бабуїнах та у хворих з закупоркою периферичних артерій.

Даний винахід, таким чином, стосується похідних стафілокінази, що проявляють знижену імуногенність порівняно зі стафілокіназою дикого типу. Ці похідні мають по суті амінокислотну послідовність стафілокінази дикого типу або її модифіковані версії, але, принаймні, один імунодомінантний епітоп елімінований без порушення біологічної активності похідних. В одному здійсненні цього винаходу похідні мають по суті амінокислотну послідовність, яка зображена на фігурі 1, на якій одна або більше амінокислот в одному або більше підкреслених кластерів мають заміну іншою амінокислотою, таким чином, змінюючи відповідний) ізотоп(и). Переважно, амінокислоти заміняються аланіном. За допомогою зміни епітопу(ів) реактивність похідних з панеллю моноклональних антитіл до одного або більше з трьох епітопних кластерів І, ІЇ та І знижена. Це показує, що за допомогою заміни амінокислот дикого типу аланіном антигенність стафілокінази знижується.

Цей винахід, зокрема, стосується похідного стафілокінази М8, що має амінокислотну послідовність, яка представлена на фігурі 1, в якій амінокислоти Гуз в положенні 74, СІш в положенні 75 та Агд в положенні 77 у підкресленому кластері 8 були замінені аланіном, змінюючи таким чином відповідний еїіпітоп, похідного стафілокінази М3, що має амінокислотну послідовність, яка зображена на фігурі 1, в якій амінокислоти Гуз в положенні 35 та Си в положенні 38 в підкресленому кластері З були замінені аланіном, змінюючи таким чином відповідний епітоп, похідного стафілокінази МУ, що має амінокислотну послідовність, яка представлена на фігурі 1, в якій амінокислоти Сіш в положенні 80 та Азр в положенні 82 в підкресленому кластері 9 були замінені аланіном, змінюючи таким чином відповідний епітоп, похідного стафілокінази

М3.8, що має амінокислотну послідовність, яка представлена на фігурі 1, в якій амінокислоти Гуз в положенні 35, бій в положенні 38, Гуз в положенні 74, Сбіш в положенні 75 та Агд в положенні 77 в підкреслених кластерах З або 8 були замінені аланіном, змінюючи таким чином відповідні епітопи, та похідного стафілокінази М8.9, що має амінокислотну послідовність, яка представлена на фігурі 1, в якій амінокислоти Гу5 в положенні 74, Сі в положенні 75, та А в положенні 77, СІ в положенні 80 та А в положенні 82 в підкреслених кластерах 8 і 9 були замінені аланіном, змінюючи таким чином відповідні епітопи. Таким чином М3.8 та М8.9 є подвійними мутантами, що мають два зруйнованих епітопи.

Цей винахід демонструє, що сконструйовані варіанти стафілокінази зі зниженою імуногенністю можуть бути практичними альтернативними стрептокіназі або стафілокіназі дикого типу тромболітичними препаратами.

Цей винахід також стосується способу продукції похідних цього винаходу шляхом одержання фрагменту ДНК, що містить, принаймні, частину кодуючої послідовності стафілокінази, яка забезпечує її біологічну активність; здійснення іп міго сайт-направленого мутагенезу у фрагменті ДНК для заміни одного або більше кодонів для амінокислот дикого типу кодоном для іншої амінокислоти; клонування фрагменту мутантної ДНК в підхожий вектор; трансформації або трансфекції придатної клітини-хазяїна цим вектором; та культивування клітин-хазяїнів в умовах, придатних для експресії фрагменту ДНК. Переважно, фрагмент

ДНК є фрагментом Есогі-Ніпді!О з 453 п.о. з плазміди РМЕХбО25АК, сайт-направлений мутагенез виконується за допомогою системи олігонуклеотиднаправленого мутагенезу з використанням плазміди рМа/с і дефіцитного по репарації штаму Е/СОГ ії УУКвМиї5, та фрагмент мутантної ДНК клонується в Е.СоїїЇ, штам УУКб.

Цей винахід також стосується фармацевтичних композицій, що містять, принаймні, одне з похідних стафілокінази по цьому винаходу разом з придатним носієм, для лікування артеріального тромбозу.

Фармацевтичні композиції що мають менш імуногенні варіанти стафілокінази в якості активного інгредієнту, для лікування тромбозу артерій у людей або у ветеринарній практиці можуть мати форму порошків або розчинів і можуть застосовуватись для внутрівенного чи внутріартеріального введення. Такі композиції можуть бути виготовлені шляхом об'єднання (наприклад, змішування, розчинення тощо)

активної речовини з фармацевтично прийнятними наповнювачами нейтрального характеру (такими як водні або неводні розчинники, стабілізатори, емульгатори, детергенти та добавки), і крім того, якщо необхідно, барвниками. Концентрація активного інгредієнту у терапевтичній композиції може широко мінятися в інтервалі від 0,195 до 10095, залежно від характеру захворювання та способу введення. До того ж доза активного інгредієнту, яку потрібно застосувати, може змінюватися у межах від 0,05мг до 1,Омг на кг ваги тіла.

Крім того, цей винахід стосується способу застосування похідних стафілокінази для лікування тромбозу артерій, зокрема, інфаркту міокарду, та використання похідних стафілокінази для виготовлення фармацевтичної композиції для лікування тромбозу артерій, зокрема, інфаркту міокарду.

Вище і далі терміни "похідні", "мутанти", та "варіанти" використовуються, замінюючи один одного.

Даний винахід буде показано більш детально в наступних прикладах, які, однак, не призначені для обмеження обсягу винаходу. Для досвідченого спеціаліста будуть очевидні декілька варіантів та удосконалень на основі даного винаходу. Таким чином, випадковий мутагенез, починаючи з комбінаційного мутанту 3.8 та з комбінаційного мутанту 8.9 повинен дати альтернативні мутанти зі зниженою імуногенністю та, можливо, підвищеною функціональною активністю, тоді як альтернативний мутагенез в епітоп-нейтралізуючих кластерах буде давати інші варіанти зі зниженою імуногенністю.

Приклад 1

Картирування епітопу стафілокінази дикого типу

Епітопна специфічність панелі з 17 мишиних моноклональних антитіл, індукованих стафілокіназою дикого типу (варіант ЗакоТАК), визначали шляхом аналізу біоспецифічної взаємодії у реальному часі (ВІА) з використанням прибору ВіАсоге" (Рпагтасіа, Віозепзог АВ, Оррзаїа, Зулуедеп). Моноклональні антитіла до закзТтТАК продукувались за допомогою методу Сайге та Міїбівїп (30). Мишей ВАГ В/с Імунізували шляхом підшкірної ін'єкції їО0мкг зЗак5ТАК у повному ад'юванті Фрейнда, за якою через два тижні йшло внутрішньочеревинне введення 1О0мкг зЗакзтТАкК у повному ад'юванті Фрейнда. Після проміжку, рівного принаймні б тижням, миші одержували внутрішньочеревинно повторну ін'єкцію їОмкг закзтТАКк у фізіологічному розчині на 4 день та за два дні до злиття клітин. Клітини селезінки виділяли та виробляли злиття з клітинами мієломи РЗХб3-Ад.8-6.5.3 (отриманими від д-ра ОО. 5спбппегт, Огдапоп, О55,

МеїШПегіапа5) по Ралека5з де 51. Сгоїй апа 5Зспеідеддег (31). Після селекції у гіпоксантин-аміноптерин- тімідиновому середовищі супернатанти відбирали по продукції специфічних антитіл за допомогою односайтового неконкурентного мікро-ЕГІЗА з використанням мікротитровальних плат, покритих стафілокіназою. Зв'язані імуноглобуліни визначали за допомогою кролячого протимишиного до, кон'югованого з пероксидазою хрону (32). Позитивні клони використовували для продукції асцитної рідини у приміруваних пристаном мишей ВАГ В/с (33). Фракцію (Дб моноклональних антитіл вичищували від асцитної рідини за допомогою аффінної хроматографії на протеїн А-сефарозі (34).

Ця техніка аналізу біоспецифічної взаємодії, основана на поверхневому плазмовому резонансі (ППР) дає можливість прямого вимірювання взаємодії у реальний строк без використання міток (35).

Стафілокіназа була імобілізована на поверхні сенсорного чипу -Зепзог Спір СМ5 з використанням набору для зв'язування амінів - Атіпе Соиріїпд Кії (Рпагтасіа Віозепзог АВ), як рекомендовано виробником. Ця процедура зв'язує первинні аміногрупи у ліганд до карбоксиметилованої декстранової поверхні сенсорного чипу (36). Імобілізацію виконували з розчинів білка з концентрацією 1Омкг/мл в 10мМ ацетаті натрію з рН 5,0 при потоці зі швидкістю 5мкл/хв протягом бхв. Це приводить до ковалентного зв'язування 1000-1500 РО (резонансних одиниць) стафілокіназних частин (що відповідають приблизно 0,07пмоль/мм2 (37). Другий взаємодіючий компонент (аналізуєма речовина: тобто моноклональні антитіла) вводили в розчин над сенсором. Концентрація вільної аналізуємої речовини підтримувалась постійною по безперервному потоку розчину при 20"С по поверхні сенсора. Вводили, принаймні, чотири концентрації кожної аналізуємої речовини (в інтервалі 0-400нм або 0-50мкМ) в 10ММ НЕРЕ5, 3,4мММ ЕДТК, 0,15 М Масі та 0,00595 сурфактанті Р2О, рН 7,2 при швидкості потоку, що дорівнює 5мкл/хв у фазі зв'язування. Потім зразок заміняли буфером також при швидкості потоку, рівною 5мкл/хв протягом від 6 до 30 хвилин. Після кожного циклу поверхню сенсорного чипу регенирували за допомогою введення 5мкл 15мМ НС1. Константи швидкості зв'язування (Касс ) та дислокації (Кдисс) виводили з сенсограм, як докладно описано в іншому місці (38). Константи рівноважного зв'язування (Кс), розраховані як відношення Касс та Кдисс, для зв'язування стафілокінази дикого типу на панелі з 17 вивчаємих моноклональних антитіл змінювались в інтервалі між 0,6 та » 25Х109 М" (середнє значення 1019 М") (таблиця 1).

В таблиці 1 колонка, позначена "Ір" вміщує різні стафілокіназні похідні. Позначення "170511", "26А2" тощо стосуються моноклональних антитіл, що зв'язуються з вказаними епітопними кластерами І, ПП і ПІ. В колонці "варіант" показані мутантні амінокислоти та їх положення в однолітерному коді для амінокислот.

Епітопний кластер І розпинається антитілами 17П11, 26А2, ЗОА2, 2812 і 3010, тоді як епітопний кластер ЇЇ розпізнається антитілами 29С1, 18Е12, 14Н5, 28Н4, 2006, 3282 і 7Е10 і епітопний кластер ІІ - антитілами 7ТНІ1, 25Е1, 40С8, 24С4 та 1А10.

Моноклональні антитіла, направлені проти окремих епітопів, будуть зв'язуватися незалежно один від одного, тоді як моноклональні антитіла, направлені проти близькородинних епітопів будуть взаємодіяти кожний з місцем зв'язування іншого. Тому епітопна специфічність панелі моноклональних антитіл найбільш легко визначається шляхом визначення здатності пари моноклональних антитіл одночасно зв'язуватися з антигеном. Аналіз біоспецифічної взаємодії у реальний час (АБВ-ВІА) може використовуватися для вимірювання конкурентного зв'язування пар моноклональних антитіл зі стафілокіназою, зв'язаною з поверхнею сенсорного чипу. Аналіз проводили, як описано в Арріїсайоп Моїе 101 (Рпаптасіа Віозепзог АВ).

Випробування парного зв'язування розділили 17 моноклональних антитіл на З групи, що представляють З епітопи на антигені, що неперекриваються, як показано на фігурі 2. Незалежність цих епітопів була підтверджена прямою демонстрацією додаткового зв'язування моноклональних антитіл 26А2, 28НА і 2404.

Антитіла об'єднували за їх епітопною специфічністю, що показано в таблиці 1.

Приклад 2

Конструювання та епітопне картирування варіантів стафілокінази "заряджений-кластер-для-аланіну"(спагдеа-сіивтег-о-аіапціє")

При ретельному вивченні "заряджений-кластер-для-аланіну" намічали кластери гідрофільних заряджених амінокислот. Стафілокіназа (закзТАК) містить 45 заряджених амінокислот (2 Ні, 14 сим, 8

Азр, 1 Агд і Гуз). Ці заряджені залишки піддавали мутагенезу на Аіа в кластерах з двох або трьох амінокислот, що підсумовано на фігурі 1. Всього був створений 21 мутант, в яких підкреслені заряджені амінокислоти були замінені аланіном. Амінокислоти, які повинні бути замінені аланіном, показані за допомогою невеликої вертикальної лінії у кластері.

Мутанти одержували шляхом сайт-направленого мутагенезу та експресували в Е.соїї, що детально показано нижче. Ферменти рестрикції були закуплені у Рпаптасіа Оррзаїа, Зууедеп ог Воепгіпдег Мапппеіт (Мапппеїт, Ссегтапу). ДНК-лігаза Т4, фрагмент Кленова ДНК-полімерази 1 Е.соїї та лужна фосфатаза були одержані від Воепгіпдег Мапппеіт. Система олігонуклеотид-направленого мутагенезу та плазміди рРМА/с були люб'язно надані Согма5 (соПпепі, ВеїІдійт) (39). Вектор експресії РМЕХбО25акв був люб'язно наданий

Інститутом молекулярної біотехнології, Йена, Німеччина (25), Хелперний фаг М1І23КО7 був закуплений у

Рготеда (Лейден, Нідерланди). Бульйонне ростове середовище Луріа було закуплено у (іїТе Тесппоодіев (МегеїІреке, ВеІдіит). Плазміноген виділяли та очищували з людської плазми, як описано раніше (40).

Ферментативні реакції виконували, використовуючи умови, які пропонувались постачальниками.

Плазмідну ДНК виділяли, використовуючи методику очищення ОІАСЕМ (надану УмМевіриго, Геийзаеп,

Нідерланди). Трансформацію Е.соїї виконували з застосуванням кальцій-фосфатної методики.

Секвенування ДНК виконували, використовуючи метод реакції термінації дідезокси-ланцюга та автоматичного лазерного флюоресцентного А... м (РПпагптасіа) Сайт-направлений мутагенез для мутантів 05, Кб (М20) до К8еб, Е88, (М10) проводився з використанням рма/с, з застосуванням дефіцитного по репарації штаму Е.соїї М/КбМиї5. Розмноження плазмід рМа/с або похідних, одержання однониткової

ДНК і експресію проводили в Е/соїї М/УКб (39). Мутанти 093, КО4 (МИ) по К134, К135, К1І36 (М19) були сконструйовані в Інституті молекулярної біотехнології, Йєна, Німеччина, як описано раніше (16).

Хромогенний субстрат (52403) І -піроглютаміл-І -фенілаланіл-І! -лізин-п-нітроаналін гідрохлорид був закуплений у Спготодепіх. Фібриноген, мічений "25І, був закуплений у Атегзпат.

Фрагмент ЕсовіІ-Ніпапй! з 453 пар основ, що містить всю кодуючу область для ЗакзтТАРК, вирізали з плазміди рМЕХбО25акв (стійкість до ампіциліну) і клонували в сайти ЕсоКІ-Ніпа!П плазміди рімМе5-8 (стійкість до хлорамфеніколу), одержуючи рМео-ЗТАК. Для сайт-направленого мутагенезу іп мйго однониткову ДНК цієї конструкції одержували шляхом трансформації конструкції РЯмМо-ЗТАК в Б.соїї та введення в нічну культуру хелперного фагу М1З3КО7. Через чотири години після ін'єкції клітини відокремлювали від середовища за допомогою преципітації ПЕГ та екстракцією фенолом-хлороформом.

Потім однониткову рМо-ЗТАК гібридизували з однонитковою рМа (ЕсокКіІ-Ніпа!и) векторної ДНК та відповідним синтетичним олігонуклеотидом з 28-44 основ з мовчащою мутацією, що створює або делегує рестрикційний сайт. Реакції подовження проводили з фрагментом Кленова ДНК-полімерази, як описано.

Після трансформації Е.соїї М/КбМиї5 та селекції на ампіцилінову рецистентність колонії підрощували на нітро-делюлозних мембранах, денатурували іп 5йи, і ДНК гібридизували протягом ночі при кімнатній температурі з використанням відповідних радіоактивно мічених олігонуклеотидів (1,5х109 імп/хв (У2РІ|-АТФ, використаної для мічення полінуклеотидкіназою ТА 20-ЗОнг олігонуклеотиду). Фільтри промивали при 42"С, використовуючи розчини, що містять 0,190 ДСН та 2х55С, 1х55С, 0,2х5550, 0,1х550. Плаз мідну ДНК екстрагували з 1О0мл бактеріальних культур, одержаних з кожного позитивного клону та аналізували шляхом розщеплення ферментом рестрикції. Бажані мутації підтверджували шляхом секвенування повної кодуючої послідовності з використанням А... м,

Мутований фрагмент НіпаШй-Есокі! потім лігірували зворотно в вектор експресії РМЕХбО25акв, що містить промотор ртТаяд (39). Мутантні білки продукувались внутріклітинно і у розчинній формі у клітинах

Е.соїї МУКб, трансформованих цим вектором. Мутанти виділяли та очищали зі зруйнованих ультразвуком бактеріальних екстрактів з використанням катіонообмінної та з гіброфобною взаємодією хроматографії (25).

Мутанти закозТАРЕ були одержані з виходом у інтервалі від 10 до 80мг/л, що представляє виділення від до 8895 вихідного матеріалу. Очищений матеріал був чистим, що показано за допомогою електрофорезу на нередукованих 10-1595 градієнтних гелях (не показано). Аналіз МНо-кінцевих амінокислот підтверджував послідовність Зег-Зег-Зег-Рпе-Азр зрілої стафілокінази. Більш детальні біохімічні характеристики цих стафілокіназних мутантів повідомлялись раніше (41).

Концентрації білка визначали по Вгадоога (42). Фібринолітичну активність розчинів ЗакоТАЕ визначали за допомогою дослідження з хромогенним субстратом, що проводиться в мікротитровальних платах з використанням суміші з д8Омкл розчину БзакзтТАкК та 100мкл розчину Сіи-плазміногену (кінцева концентрація 0,5мММ). Після інкубації протягом ЗОхв. при 37"С генерований плазмід визначали кількісно шляхом додавання ЗОмкл 52403 (кінцева концентрація їмкМ) та вимірювання поглинання при 405нм.

Активність виражали в умовних одиницях (УС) шляхом порівняння з місцевим стандартом (сер. ЗТАМУ5), який встановлював активність, рівну 100000 УО на мг білку, що визначалось по складу амінокислот (11).

ДСН-ЕПАГ виконували за допомогою Рпавзі Зузіет"м (Рпагтасіа, Оррзаїа, зуледеп), використовуючи 10- 1595 градієнтні гелі та забарвлювання брильянтовим синім Соотавззіє. Відновлення зразків проводили шляхом нагрівання при 100"С протягом Зхв. у присутності 190 ДСН і 195 дитіоеритритолу. Конструювання, продукцію та очистку мутантів М3.8 та М8.9 проводили, як описано детально нижче. Олігонуклеотиди, використані для конструювання, 5-АТАВСААТаСАТТТОСТасАСТАТСААС-3" (М), 5-СТААТТСААСТАСТаСАААСаТстасСАТАТОАСТОаТСОасСАТО-3 (МВ) і 5в--ттасасттавасСсасССААТаСААСТАСТСОТАААСТСТТТАТАТ-З3' (МО) були синтезовані на замовлення в Рпаптасіа Віоїтесп.

При конструюванні мутанту М3.8 використовували однониткові рМо-зТАК та фрагмент ЕсокіІ-НіпацІ рМа5-8 для одержання дуплексної молекули ДНК, що містить пробіли, яку гібридизували з синтетичним олігонуклеотидом М3З з 28 основ (що містить сайт рестрикції М5ії). Реакції подовження проводили за допомогою фрагменту Кленова ДНК-полімерази та лігази, як описано. Після переносу Е.соїї М/КбМиш5 та селекції на середовищі з ампіциліном 81 колонію підрощували на нітроцелюлозних мембранах, денатурували іп 5йци, ії ДНК гібридизували протягом ночі при кімнатній температурі з використанням радіоактивно-міченого олігонуклеотиду М3З (1,5х108 імп/хв (У2Р|-АТФ на мічення полінуклеотидкіназою ТА 20-3Онг олігонуклеотиду). Фільтри промивали при 42"С, використовуючи розчини, що містять 0,195 ДСН та 2х550С, 1х550, 0,2х550, 01х550. ДНК з 1 відібраного клону з 16 позитивних одержували з 150мл бактеріальних культур та аналізували за допомогою розщеплення рестрикційними ферментами Мвії і РУЦІ.

Мутацію МЗ3 (рМа-5ТАКЗ) підтверджували шляхом секвенування повної кодуючої області з використанням

АЛЕ. м, Однониткову ДНК одержували шляхом трансформації рМа-зтТАКЗ в БЕ.соїї, як описано вище.

Однониткову рМа-5ТАКЗ гібридизували з рМе (ЕсоРІ-Ніпаї) та з синтетичним олігонуклеотидом М8 з 40 основ, який містить сайт рестрикції Маеї, як описано вище. Після трансформації Е.соїї М/КбМиї5 і селекції на середовищі з хлорамфеніколом підрощували 100 колоній на нітроцелюлозних мембранах і гібридизували з міченим олігонуклеотидом М8. Підрощували позитивні клони (2 з 7) та аналізували за допомогою розщеплення рестрикційним ферментом (М5іІ-Ніпа!й ї маеї), що давало один позитивний клон.

Подвійний мутант М3.8 потім лігірували зворотно в вектор експресії РМЕХбО2Ззакв. З 12 мініпрепаратів

ДНК 6 мали правильну рестрикційну карту. Один з цих клонів (РМЕХЗакКЗТАК.М38) секвенували та використовували для одержання мутанту М3.8 під контролем індуцьованого ІПТГ (ас промотору та двох послідовностей Шайна-Дальгарно (Зпіпе-ОаІдагпо), розташованими одна за одною. 1Омкл суспензії клітин Е.соїї УМКб, трансформовані за допомогою рекомбінантної плазміди

РМЕХЗакзтТАВ.М38, інкубували в 100мл середовища ІВ (Сірсо/вкІ), що містить 100мкг/мл ампіциліну.

Суміш інкубували протягом ночі при 37"С з перемішуванням при 200об/хв, що давало в результаті щільність клітин, рівну приблизно 5 одиницям поглинання при бООнм. Аліквоти у 20мл переносили в 2л об'єми (в 5л колбах) середовища І В, що містить 100мкл/мл ампіциліну. Суміші інкубували протягом З годин при 37"С при перемішуванні перед додаванням 200мкМ ІПТГ для індукції експресії М3.8, якій давали розвиватися протягом 4 годин. Клітини осаджували центрифугуванням при 4000об/хв протягом 20хв, ресуспендували в 1/10 об'єму 0,01М фосфатного буферу, рН 6,5, та руйнували ультразвуком при 0"С.

Залишки клітин видаляли центрифугуванням протягом ЗОхв при 20000об/хв, і супернатант зберігали при 20"С до використання.

У поєднаних просвітлених клітинних лізатів (2-х літрові об'єми) з 20-30 літрових бактеріальних культур рН доводили до 5,9, їх стерилізували фільтруванням через 0,22мкм фільтр Сарторіуса та наносили на 5х25см колонку сефарози, попередньо оброблену 0,5М Маон і стерильним 0,01М фосфатним буфером, при швидкості потоку, рівній 12мл/хв при 4"С в ламінарному потоці. Колонку промивали 2-3 літрами буферу та елюювали за допомогою градієнту солі від 0 до 1М понад 50О0мл і від 1М до 2М понад 250мл при швидкості потоку, рівній ТОмл/хв і при 4"С. Фракції що містять М3.8, локалізовані за допомогою електрофорезу в гелі з ДСН, поєднували (приблизно 200мл) та діалізували проти 15л стерильного 0,01М фосфатного буфера, рН 8,0 при 4"С. Матеріал, що пройшов діаліз, центрифугували при 4000боб/хв протягом ЗОхв, знов стерилізували фільтрацією та наносили на колонку 2,5х12см О-сефарози з швидким струмом, попередньо оброблену 0,5М МаонН та стерильним 0,01М фосфатним буфером, рН 8,0, при швидкості потоку, рівній Змл/хв при 4"С. Колонку промивали приблизно б0Омл 0,01М фосфатного буферу, рН 8,0, при швидкості потоку, рівній Змл/хв та елюювали розчином солі з градієнтом концентрації від 0 до 0,17М понад ЗОмл, від 0,17 до 0,2М понад 100мл та від 0,2М до 1,5М понад 200мл, при швидкості потоку, рівній 4мл/хв. Фракції, що містять М3.8, локалізовані за допомогою електрофорезу в гелі з ДСН, поєднували, концентрацію білка доводили до 1мг/мл та матеріал стерилізували шляхом фільтрації через 0,22мкм-фільтр Мілліпор. Три препарати М3.8 давали 80-425мг чистого білка (середнє-СО) зі специфічною активністю, рівною 45000--5200 УО/мг.

При конструюванні мутанту М8.9 для одержання дуплексної молекули ДНК, що містить пробіли, використовували однониткову рМо-зТАЕ і фрагмент ЕсовІ-НіпсйІ рМа5-8, які гібридизували з синтетичним олігонуклеотидом МУ з 42 основ, що містить сайт рестрикції Магі. Реакції подовження проводили за допомогою фрагменту Кленова ДНК-полімерази і лігази, як описано. Після трансформації Е.соїї МУКвбМш5 та селекції на середовищі з ампіциліном, колонії підрощували на нітроцелюлозних мембранах, денатурували іп 5йи та ДНК гібридизували протягом ночі при кімнатній температурі з використанням радіоактивно міченого олігонуклеотиду (1,5х108імп/хв (У2Р|-АТФ на мічення полінуклеотидкіназою ТА 20-

ЗОнг олігонуклеотиду). Фільтри промивали при 42"С, використовуючи розчини, що містять 0,190 ДСН та 2х 5ЗС, 1х55С, 0,2х55С, 0,1х550. Одержували ДНК з 2 відібраних клонів з 4 позитивних та 1 з них характеризували за допомогою аналізу нуклеотидної послідовності з використанням А..Р.м, Вставку

ЕсовіІ-Ніпа!й з рМа-5ТАКУ потім лігірували зворотно в вектор експресії РМЕХбО25акв. Клони (58) сортували шляхом гібридизації іп 5йи з радіоактивно міченим олігонуклеотидом МОУ в якості проби. Один клон рРМЕХЗакзтТАМК.МУ характеризували за допомогою аналізу нуклеотидної послідовності і потім використовування для конструювання мутанту М8.9.

Щоб сконструювати М8.9 в МО вводили мутацію 8 за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР проводили в загальному об'ємі, рівному 100мкл з використанням 5 од ферменту та 1мкг кожного з наступних праймерів: олігонуклеотиду П-5' -САБсАААСАСААТТСАСбБАС, олігонуклеотиду ПІ-5'-

ТАТАТААТАТТССАСАТАСТАТТСААТТТТТ-3, олігонуклеотиду, ІУ-5-

ТтТАТСССОСОВОаСАТТАСАТаСОаАаАТаСаАСАаСАТАТОСАССИ ТТ ТасСАСтТА-3, та олігонуклеотиду М-5'-

СААДАДАСАаССААДасСтТТСАТТСАТТСАСС-3". Концентрації ЗДАТР, СТР, астР та аттР складали 200мкМ.

Денатурацію проводили протягом одної хвилини при 94"С, з ренатурацією протягом 2хв при 557С та подовженням протягом 1,5хв при 7270. Після 30 циклів зразки інкубували протягом 10 хвилин при 72"С та охолоджували до 4"С. У першій реакції ПЛР 2нг РрРМЕХЗакзтТАК.МУ ампліфікували з використанням олігонуклеотидів ЇМ і М як праймерів. Амплікон ПЛР розщеплювали за допомогою Зтаї і Ніпай та очищували після електрофорезу в 1,595 агарозному гелі при використанні набору Ргер-А-депе (Віо-Най

Гарогасогіе5, Негсшев5, СА, ОБА). Одержаний в результаті фрагмент клонували в сайти Зта!-Ніпа! росС18 (Рпагтасіа Віотесп, Оррзаїа, Зууедеп) з використанням набору для швидкого лігірування ДНК (Воегіпдег

Маппіеїт). Після трансформації в клітини Е.соїї М/Кб, одержували ДНК з 12 колоній, і всі 12 генерували фрагмент в приблизно 230 пар основ при розщеплені ЕсоРІ та Ніпа. Одну з цих ДНК (рОС18-М894А) використовували для клонування другого продукту ПЛР (див. нижче). Другу реакцію ПЛР виконували на 2нг

РМЕХЗакзтТАМК.МУ з використанням олігонуклеотидів І і ПІ як праймерів. Продукт реакції ПЛР розщеплювали за допомогою З5рі та ЕсоК!І та додатково очищували, як описано вище. Одержаний в результаті фрагмент лігірували в сайти ЗтаІ-ЕсоВІ рОоС18-М89 А. Після трансформації у клітини Е.соїї

МКв відбирали 6 клонів для одержання ДНК. П'ять з 6 генерували фрагмент з приблизно 453 пар основ після розщеплення за допомогою Есокі та НіпапІ. Цей фрагмент, кодуючий весь мутант М8.9, клонували у сайти ЕсоКІ-Ніпа вектора експресії РМЕХбО2зЗакв. Після трансформації клітин Е.соїї М/Кб ДНК з 6 колоній аналізували за допомогою розщеплення Есокі та Ніпа!!ї, що дає фрагмент з приблизно 453 пар основ у всіх випадках. Одну з цих ДНК, крім того, характеризували шляхом аналізу нуклеотидної послідовності. 100мл середовища І В (СІВСО/ВКІ), що містить 100мкг/мл ампіциліну засівали 10Омкл суспензії клітин

Е.соїї МУКб, трансформованих рекомбінантною плазмідою рМЕХЗакотТА.М89. Культуру інкубували протягом ночі при 37"С з перемішуванням при 140об/хв до щільності клітин, рівної приблизно 5 одиницям поглинання при бООнм. Аліквоти по 4мл використовували для інокуляції 2-літрових культур (в колбах з перегородкою 51) в середовищі «Теггійс Вгоїй», що містить 150мкл/мл ампіциліну. Культури інкубували протягом приблизно 20 годин при 30"С та при 14боб/хв, одержуючи в результаті кінцеву щільність клітин, рівну приблизно 4х10Уклітин/мл. Клітини осаджували центрифугуванням при 4000об/хв протягом 20хв, ресуспендували в 1/5 об'єму 0,01М фосфатного буферу, рН 6,5 та руйнували ультразвуком при 0"С. Потім рН доводили до 5,89 та залишки клітин видаляли 30-хвилиннм центрифугуванням при 20000об/хв.

Супернатант зберігали при -20"С до наступної обробки.

В об'єднаному просвітленому лізаті клітин (1800мл) рН доводили до 5,8 і наносили його на колонку 2,5х20см з 5Р-сефарози, попередньо обробленої 0,5М Маон та свіжим буфером з 0,01М фосфату, 2,5М масі, рн 7,5 при швидкості потоку, що дорівнює 2мл/хв при 4"С. Колонку промивали 500мкл буферу та елюювали градієнтом солі від 0 до 1 М понад 200мл при швидкості потоку, що дорівнює бмл/хв.

Об'єднані фракції М8.9, ідентифіковані за допомогою електрофорезу з ДСН, доводили до 2,5М твердим Масі та піддавали хроматографії гідрофобної взаємодії на колонці 2,5х20см феніл-сефароза, попередньо обробленої 0,5М Маон та свіжим буфером з 0,01М фосфату, 2,5М масі з рН 7,5 при швидкості потоку, рівній 2мл/хв і 4"С. Колонку промивали приблизно 500мл буферу та елюювали 0,01М фосфатним буфером, рн 6,5. Фракції, що містять М8.9, локалізовані за допомогою електрофорезу в гелі з ДСН, об'єднували та піддавали діалізу в 2 літрах 0,01М фосфатного буферу, рН 9,0. Діалізований матеріал центрифугували при 4000об/хв протягом З0Охв і наносили на 1,6х5см колонку О-сефарози з швидким потоком, попередньо оброблену 0,5М Маон та свіжим 0,01М фосфатним буфером, рН 9,0, при швидкості потоку, що дорівнює 2мл/хв і 4"С. Колонку промивали приблизно 150мл 0,01М фосфатного буферу, рН 9,0, та елюювали градієнтним розчином солі від О до 1М Масі вище 100мл при швидкості потоку, що дорівнює 4 мл/хв. Колонку промивали приблизно 150мл 0,01М фосфатного буферу, рН 9,0, та елюювали градієнтом солі від 0 до 1М Масі понад 100мл при швидкості потоку, що дорівнює 4мл/хв. Фракції, що містять М8.9, локалізовані за допомогою електрофорезу на гелі з ДСН, об'єднували і концентрацію білка доводили до 1мг/мл, і матеріал стерилізували фільтруванням через 0,22мкМ фільтр Мілліпор. Ці препарати М8.9 давали 735217мг чистого білка зі специфічною активністю, рівною 51000 53500УО/мг.

Результати по фібринолітичній активності різних мутантів ЗакеТАК, визначеній за допомогою дослідження з хромогенним субстратом, узагальнені в таблиці 1.

З 21 мутанту, сконструйованого, як показано на фігурі 1, Е99, Е100 (М13) ії 299, Е100, Е102 (М14) можна було одержати в очищеній формі, тоді як К11, 013, 014 (МІ), Е46, Л50 (МУ) і Е65, 069 (М7) були неактивними. Шістнадцять мутантів, зведених в таблицю 1, були вивчені детально разом з 5акзтТАвк дикого типу. З цих мутантів 05, Кб (М20), К8, К1ТО (М21), 033, КЗ35 (М2), К57, Е58, К59 (М5), Еб1, Е65 (Мб),

Кб, Ев8 (М10), 093, КО4 (М11), Коб, КО7, КО8 (М12), Е108, К109 (М15), 0115, Е118, НІ119 (М16), Н119, К121 (М17), К1!30 (М18) і Е134, К1І35, К1І36 (М19) реагували з панеллю моноклональних антитіл також, як і

БакзТтТАК. Однак КЗ35, ЕЗ8 (М3) і ЕВО, 082 (МОУ) слабо реагували з антитільними кластерами 7НІ11, 25Е1, 408, тоді як К74, Е75, 77 (М8) слабо реагували кластером 26А2, ЗОА2, 2812 і 3010. Адитивність елімінації епітопу була встановлена з мутантами КЗ5, ЕЗВЛС74, Е75, К77 (М3.8) і К74, Е75, Е77/Е8О, 082 (М8.9), які поєднували знижену реактивність з моноклональними антитілами обох батьківських молекул.

Приклад З

Адсорбція з варіантами антитіл до стафілокінази дикого типу і «заряджений-кластер-на-аланін», виявлених у хворих при лікуванні зЗакзтТАтк

Щоб одержати інформацію по епітопній специфічності індукованих антитіл, виявлених у хворих з гострим інфарктом міокарду після лікування 5акетТАК, зразки плазми від 16 хворих абсорбували за допомогою молярного надлишку (над нейтралізуючою активністю стафілокінази) одного або поєднаних мутантів «заряджений-кластер-для-аланіну» протягом 10 хвилин перед визначенням залишкового зв'язування з 5акеТтАК за допомогою аналізу біоспецифічної взаємодії. Нейтралізуючу активність стафілокінази у цих зразків визначали таким чином. Підвищені концентрації варіанту дикого типу або

БакозТАРЕ (об'єми 50мкл, що містять 0,2-1000мкг//л) додавали до суміші ЗО0О0мкл цитратної людської плазми та 50мкл буферу або досліджуваної плазми, відразу після цього додавали 100мкл суміші, що містить тромбін (5ОМІН од/мл) та Сасі (25мМ.) Час лізису згустків плазми вимірювали та наносили на графік залежності від концентрації закзтТАмК складової. По цій кривій визначали концентрацію активатора плазміногену, яка викликала повний лізис згустку через 20 хвилин. Титр нейтралізуючої активності визначали як різницю між значеннями для досліджуваної плазми та буферу і виражали в мкг на мл досліджуваної плазми.

Результати підсумовані в таблиці 2. В той час як ЗакзТАЕ дикого типу абсорбував більше 90 відсотків зв'язуючих антитіл з всіх зразків, з мутантом КЗ5, ЕЗ8 (М3) у 4 хворих, з мутантом К74, Е75, К77 (М8) у 12 хворих та з мутантом Е80, 082 (МО) у 5 хворих спостерігалась неповна абсорбція. Абсорбція з поєднаними мутантами КЗ5, ЕЗз8/К74, Е75, К77 (М3.8) та К74, Е75, К77/Е80, 082 (М8.9) видаляла менше 9095 антитіл у 13 хворих (середнє значення з 68 та 65 відсотків, відповідно, від 16 хворих), тоді як очікувалось, суміш вихідних молекул поєднаних мутантів (М8 і МЗ або МОУ) постійно абсорбували понад 9095 антитіл.

Приклад 4

Імуногенність варіантів стафілокінази "заряджений-кластер-на-аланін) у кролів, імунізованих стафілокіназою (ЗакзТАК) дикого типу, мутантами КЗ5. Е3.8 (М3), К74, Е75, К77(М8) і Е8О, 082 (МО) та поєднаними мутантами К35, ЕЗ38/К74, Е75, 77 (М3.8) і К74, Е75, Е77/Е80, 082, (М8.9)

Порівняну імуногенність ЗакзТАК щодо кожного з варіантів ЗакзтТАмк, М3, М8, МУ, М3.8 та М8.9, вивчали після імунізації підшкірним введенням у групах з 4 або 8 кролів, призначених для введення закотТАК, і в групах з 8 кролів, призначених для введення певного варіанту. Імунізацію проводили шляхом внутрівенного вливання 40Омкг/кг зЗакоатТАкК та 200-1000мкг/кг мутантів на тиждень 0 (для визначення вихідної здатності лізису згустків) з наступною підшкірною ін'єкцією 40Омкг тієї ж самої речовини у повному ад'юванті Фрейнда на 2-й тиждень та в неповному ад'юванті Фрейнда на З і 5 тижні. Імуногенність оцінювали кількісно через б тижнів шляхом визначення активності, що нейтралізує стафілокіназу, в плазмі та залишкової тромболітичної здатності, як описано детально нижче.

Коротко, активність по нейтралізації стафілокінази в плазмі визначали шляхом додавання підвищених концентрацій ЗакзтТАК дикого типу або мутанту ЗакзтТАК (50мкл об'єми, що містять 0,2-1000мкг/мл) до суміші ЗОО0мкл цитратної людської плазми та 50мкл буферу або кролячої плазми з негайним наступним додаванням 10Омкл суміші, що містить тромбін (5ОМІН од/мл) і Сасі» (25мМ). Визначали час лізису згустку плазми та наносили його на графік залежності від концентрації закзтТАв або варіанту. По цій кривій визначали концентрацію активатору плазміногену, яка давала повний лізис згустку через 20 хвилин. Титр нейтралізуючої активності визначали як різницю між значеннями для кролячої плазми та для буферу і виражали в мкг на мл кролячої плазми.

Тромболітичні властивості вивчали, використовуючи 0,Змл згустки кролячої плазми, збідненої тромбоцитами, мічені 125І-фібрином, поміщені в екстракорпоральні артеріовенозні петлі. Виділену стегнову артерію для цього катетеризували катетером Френча 4 (Ропех Уупіїе, Ропех, НуїШйе, ШОК) і з'єднували через два підшкірних шприца з катетеризованою вушною веною. Потік крові через екстракорполярну петлю підтримували на рівні 1їОмлн/хв за допомогою перистальтичного насосу. Згустки плазми з міченими 1251- фібрином вводили в кожний з двох шприців, вставлених в петлю. Згустки плазми одержували шляхом змішуванням 0,Змл бідної тромбоцитами плазми з невеликою кількістю (приблизно 1,5мкКю) розчину міченого 125І-людського фібриногену (Атегзпат, Вискіпдпатвепіге, ОК) і 0,5М Сасі» з наступною інкубацією протягом ЗОхв при 37"С. За тридцять хвилин до початку інфузії вводили 7,5мг/кг рідогреля (поєднані інгібітор тромбоксансінтази і антагоніст простагландін-ендопероксидних рецепторів) (43) у вигляді швидкої внутрівенної ін'єкції для попередження осадження тромбоцитів в екстракорпоральній петлі. Тваринам для антикоагуляції вводили гепарин (З0бод/кг з наступним безперервним вливанням 200бод/кг/годину під час експерименту) та розподіляли по випадковій виборці на вливання 400мкг/кг зЗакоТАР (4-8 кролів) або на вливання 200-1000мкг/кг варіанту ЗакзтТАк (8 кролів). Через б тижнів половині кролів призначених для варіанту ЗакоТАК знову вводили той же самий варіант закзтТАК, а другій половині вводили закзтТАкК дикого типу, крім того кролям, імунізованим ЗакзтТАК, вводили або варіант ЗакзтТАРК (якщо ця контрольна група складалась з 4 кролів) або по випадковій виборці - зЗакоТАРЕ дикого типу або варіант зЗакоТАЕ (якщо ця контрольна група складалась з 8 кролів). Тромболітичні засоби вводили внутрівенно у вигляді ударного 1095 або 9095 вливання протягом 1 години. Хід з часом лізису згустку контролювали безперервно шляхом зовнішньої оцінки з гамма-випромінювання з використанням двох З3х0,5 дюймових кристалів йодиду натрію/галію (Вісгоп, Мем/бигу, ОН), поміщених над екстракорпоральними петлями, Сцинтиляційні кристали з'єднували з пристосованою системою Сапрегта-5І0О (Сапрегта-Раскага, Мегідеп, СТ) і дані були проаналізовані, як описано раніше (44). У кінці експерименту залишкові згустки також видалялися з шприців для визначення вмісту в них радіоізотопу. Експерименти на тваринах проводили у погодженні з керівними принципами Американського фізіологічного товариства та Міжнародного комітету по тромбозу та гемостазу (45).

Імуногенність ЗакозТАРЕ і відповідних одиночних мутантів (МЗ3, Ме і МУ) порівнюється в таблиці ЗА.

Результати виражені як середнє значення -СКО.

У 8 кролів випадок вибраних для мутанту М3 початкова нейтралізуюча активність складала 0,0--0,0 мкг/мл як щодо ЗакзтТАК, так і М3. Внутрівенне вливання 200мкг/кг МЗ3 викликало 76--23-відсотковий лізис згустку. Ці 8 кролів потім імунізували МЗ3, суспендованим у 500мкл повного ад'юванту Фрейнду через 2 тижні та в 500мкл неповного ад'юванту Фрейнду через З і 5 тижнів. Через б тижнів нейтралізуюча активність плазми збільшилася до 11-6,7мкг/мл щодо ЗакзтТАК і до 11-7.2мкг/мл щодо М3. Через 6 тижнів вливання 400мкг ЗакоТАК у 4 з цих кролів, вибраних випадковим чином, викликало 18427-відсотковий лізис згустків, тоді як вливання 200мкг/кг М3 у 4 інших кролів викликало 16--17-вісотковий лізис. У 4 кролів, призначених для введення закотТАК, вихідна нейтралізуюча активність склала 0,2-0,2мкг/мл щодо закзтАмк і 0,0-0,0мкг/мл щодо М3. Внутрівенне вливання 40Омкг/кг закоТАкК продукувало 89-48,6- відсотковий вихідний лізис. Цих чотирьох кролів потім імунізували 400мкг зЗакоТАРЕ, суспендованими в або 50Омкг повного (на другому тижні) або неповного (на З і 5 тижні) ад'юванту Фрейнду. На 6 тижні нейтралізуюча активність плазми збільшилася до 35-23 мкг/мл щодо ЗакоТАК і до 19--13мкг/мл щодо М3.

Внутрівенне вливання 200мкг/кг зЗакзТАК. М3З у цих кролів на 6 тижні індукувало 9,3-8,2-відсотковий лізис.

У 8 кролів, призначених для мутанту М8, вихідна нейтралізуюча активність у плазмі складала 1,4-0,2мкг/мл щодо закзтТАК та 0,6-0,5мкг/мл щодо М8. Внутрівенне вливання 100Омкг/мл М8 продукувало 41--13-відсотковий лізис. Цих кролів імунізували 400мкг М8, суспендованого в повному ад'юванті Фрейнду на 2 тижні та тією ж самою кількістю в неповному ад'юванті Фрейнду на З та 5 тижні. На б тижні нейтралізуюча активність плазми підвищувалась до 3,8-1,8мкг/мл щодо зЗакзтТАК і до 5,9-2,7мкг/мл щодо М8. Вливання 40Омкг/кг закоТАК у 4 з цих кролів давало 49-28-відсотковий лізис, тоді як вливання 100Омкг/кг М8 у 4 інших кролів продукувало 24--11-відсотковий лізис. У 8 кролів, призначених для групи ЗакзтТАК вихідна нейтралізуюча активність в плазмі складала 0,9-0,бмкг/мл щодо закотТАК і 0,6-0,Змкг/мл щодо М8. Внутрівенне вливання 400мкг/кг закоТАК продукувало 68--18-відсотковий лізис.

Цих кролів потім імунізували підшкірно 400мкг закоТАК, суспендованого в повному ад'юванті Фрейнду на 2 тижні та тією ж самою кількістю в неповному ад'юванті Фрейнду на З та 5 тижні. На б тиждень нейтралізуюча активність плазми збільшувалась до 59-47мкг/мл щодо ЗакозтТАРК і до 22-16мкг/мл щодо

М8, тоді як залишкова тромболітична здатність 400мкг/кг зЗакзтТАК знижувалась до 7,5-42,4 відсотків і 100Омкг/кг М8 - до 4,1--4,8 відсотків.

У 8 кролів, призначених для мутанту МО, вихідна нейтралізуюча активність у плазмі складала 0,2-0,05 мкг/мл щодо закотТАКРК і 0,03--0,05мкг/мл щодо МОУ. Внутрівенне вливання 400мкг/кг МО продукувало 72-11 відсотковий лізис згустку. Цих кролів потім імунізували 400мкг МО, суспендованими в повному ад'юванті

Фрейнду на другому тижні та тією ж кількістю в неповному ад'юванті Фрейнду на З та 5 тижні. На 6 тижні нейтралізуюча активність плазми підвищувалась до 8,044 бмкг/мл щодо закотТАК і до 3,5-2,б6мкг/мл щодо

МО. На 6 тижні вливання 400мкг/кг закоТАК у 4 цих кролів продукувало 53--11-відсотковий лізис згустків, тоді як вливання 400мкг/кг МО у 4 інших кролів давало 40-78 відсотковий лізис. У 4 контрольних кролів, призначених для закозТАК, вихідна нейтралізуюча активність плазми складала 0,1-0,05мкг/мл щодо закатАК і 0,05-0,0бмкг/мл щодо МО. Внутрівенне вливання 400мкг/кг закоТАК давало 78--13-відсотковий лізис. Цих кролів потім імунізували 400мг зЗакоТАК, суспендованим у повному (2-й тиждень) і неповному (3 та 5 тиждень) ад'юванті Фрейнда, відповідно. На 6 тижні нейтралізуюча активність у плазмі підвищувалась до 16-5,0мкг/мл щодо БЗакзтТАК і до 12-9,1мкг/мл щодо МУ, тоді як тромболітична здатність МУ знижувалася до 24433 відсотків.

Імуногенність ЗакоТАЕ порівняно з подвійними мутантами М3.8 і М8.9 порівнюється у таблиці ЗВ. У 8 кролів, призначених для групи М3.8, вихідна нейтралізуюча активність у плазмі складала 0,6-0,Змкг/мл щодо закзтТАК і 3,542,0мкг/мл щодо М3.8. Внутрівенне вливання 100Омкг/кг М3.8 продукувало 534-139 лізис. Цих кролів потім імунізували 400мкг М3.8, суспендованими у повному ад'юванті Фрейнда, на 2 тижні та тією ж самою кількістю у неповному ад'юванті Фрейнда на З і 5 тижні. На 6 тижні нейтралізуюча активність плазми підвищувалась тільки до 1,7--0,/7мг/мл щодо закзтТАК і до 6,1-3,0мкг/мл щодо М3.8.

Вливання 40О0мкг/мл ЗзакзтТАК у 4 з цих кролів продукувало 77-18 відсотковий лізис згустку, тоді як вливання 100Омг/кг М3.8 у 4 інших кролів давало 59-25-відсотковий лізис. У 8 кролів, призначених для групи закозтТАК, вихідна нейтралізуюча активність у плазмі складала 0,6-0,4мкг/мл щодо закзтТАК і 2,0--2,О0мкг/мл щодо М3.8. Внутрівенне вливання 400мкг/мл закзТАК продукувало 80-10 відсотковий лізис.

Цих кролів потім імунізували підшкірно 400мкг закоТАК, суспендованими у повному ад'юванті Фрейнда, на 2 тижні та тією ж самою кількістю у неповному ад'юванті Фрейнда на З та 5 тижні. На 6 тижні нейтралізуюча активність у плазмі збільшувалась до 20--15мкг/мл щодо 5акотТАЕ і до 21-22мкг/мл щодо М3.8, тоді як залишкова тромболітична здатність 400мкг/кг ЗакоТАК знижувалась до 8,5-5,7 відсотків, а 100Омкг/кг М3.8 до 30--29 відсотків.

У 8 кролів призначених для групи М8.9 вихідна нейтралізуюча активність у плазмі складала 0,3-0,2мкг/мл щодо зЗакзтАК і 1,6-0,5мкг/мл щодо М8.9. Внутрівенне вливання д80Омкг/кг М8.9 продукувало 39--13-відсотковий лізис згустку в вихідний момент. Цих 8 кролів потім імунізували 400мкг

М8.9, суспендованими у повному (2 тижні) або в неповному (тижні З і 5) ад'юванті Фрейнду. Через 6 тижнів нейтралізуюча активність плазми збільшувалась тільки до 2,5-711,5мкг/мл щодо закзтАБЕ і до 4,9-41,3мкг/мл щодо М8.9. На 6 тижні вливання 40Омкг/кг ЗакзТАК у 4 з цих кролів продукувало 51-35 відсотковий лізис згустку, в той час як вливання З0Омкг/кг М8.9 і у інших кролів давало 39412 відсотковий лізис. У 4 контрольних кролів, призначених для закзтТАК, нейтралізуюча активність до введення препаратів становила 0,2-00,1мкг/мл щодо БЗакзтАкК і 0,7-0,Змкг/л щодо М8.9 Внутрівенне вливання 40Омкг/кг закозтТАК викликало 67419 відсотковий лізис згустку. Цих 4 кролів потім імунізували 400мкг закзТАК, суспендованими у повному (тиждень 2) або неповному (тиждень З і 5) ад'юванті Фрейнда. На 6 тижні нейтралізуюча активність у плазмі підвищувалась до 20-15 мкг/мл щодо закозтТАК і до 18--15мкг/мл щодо

М8.9, тоді як залишкова тромболітична дія М8.9 знижувалась тільки до 31 -30-відсоткового лізису.

Ці результати показують, що в цьому прямому порівняльному дослідженні закеТтАв і вибраних варіантів, особливо подвійні мутанти (М3.8 та М8.9) індукують значно меншу нейтралізуючу активність, пов'язану з антитілами, та стійкість до лізису, ніж ЗакоТАК.

Приклад 5

Порівняна імуногенність закотТАБР і М3.8 у бабуїнів

Порівняну імуногенність закзтТАкК і М3.8 щодо індукції нейтралізуючих антитіл і рефрактерності до тромболізу при повторному введенні вивчали на бабуїнах.

Дослідження на тваринах виконували відповідно до керівних принципів Американського фізіологічного товариства і Міжнародного комітету з тромбозів та гемостазу (45). У анестезованих та інтубованих бабуїнів створювали екстракорпоральний артеріовенозний кровопотік шляхом з'єднання через зовнішню поліетиленову петлю катетеризованої великогомілкової або плечової артерії з периферичною веною.

Перистальтичний насос спрямовував і підтримував безперервно контрольований потік крові через екстракорпоральну петлю, в якій були вставлені два пристосованих шприца для підшкірного введення, кожний з яких мав один свіжий 0,Змл згусток спільної плазми бабуїнів з міченим 7"25| фібрином. Хід лізису згустку під час вливання закоТтАК або варіанту М3.8 безперервно контролювали шляхом зовнішнього вимірювання гамма-випромінення над шприцами. В якості альтернативи підраховували баланс визначення ізотопу шляхом порівняння суми підрахування радіоактивності у всій крові в кінці експерименту (помноженої на фактор З для корекції на екстраваскулярне розподілення) плюс радіоактивність у повернених тромбах, разом з тою, яка початково була присутня у згустках.

Перед кожним експериментом тромболізу бабуїнам попередньо вводили внутрівенно ударну дозу рідогрелю Змг/кг для запобігання осіданню тромбоцитів у екстракорпоральній системі. Протягом експериментів тромболізу внутрівенно вводили гепарин у вигляді ударної дози ЗООМЕ/кг з наступним вливанням 200МЕ/кг/год.

Дванадцять дорослих самців-бабуїнів (Раріо Натайдгуаз) по випадковій виборці на початку експерименту (тиждень 0) розподіляли на введення 50мкг/кг закзтТАЕ (група 1) або варіанту М3.8 (група 2), що вливаються внутрівенно протягом одної години шляхом 1095 ударної дози, та вихідну тромболітичну здатність оцінювали шляхом спостереження за зникненням радіоактивності зі згустків протягом 2 годин.

Потім бабуїнів імунізували підшкірним введенням 500мкг або закотТАК (група 1) або варіанту М3.8 (група 2), суспендованих у повному ад'юванті Фрейнду, через 2 тижні та в неповному ад'юванті Фрейнда через З і тижнів. Через 6 тижнів тромболітичну дію оцінювали кількісно за допомогою моделі екстракорпорального тромболізу протягом 4 годин: по випадковій виборці відбирали З з 6 бабуїнів з групи 1, яким вводили на початку експерименту ЗакзТтТАК, а потім їх імунізували, і З з б бабуїнів групи 2, яким на початку експерименту вводили М3.8 і яких потім ним імунізували, та вводили їм спочатку 5О0мкг/кг ЗакКеТАК шляхом внутрівенного вливання протягом одної години одної ударної 1095 ін'єкції, а потім через 2 години від початку вливання ЗакзТАК давали М3.8 у тому ж режимі (групи ТА і 2А, відповідно). Інші 6 бабуїнів одержували ті ж препарати, але у зворотному порядку: спочатку М3.8, потім закзтТАК (групи 18 і 28 для бабуїнів, попередньо імунізованих закзтАк і М3.8 відповідно). Через 18 тижнів тромболітичну активність оцінювали втретє шляхом контролю зникнення радіоактивності з фібринових згустків протягом З годин: З з б бабуїнів, імунізованих ЗакзТтТАК, вводили 250мкг/кг закоТтАкК у вигляді внутрівенної ударної ін'єкції протягом 2,5 хвилин (група 1 А), в той час як З інші бабуїни, імунізовані ЗакоТАЕ, одержували ту ж саму кількість М3.8 (група 18). З б бабуїнів імунізованих М3.8, З одержували внутрівенну ударну ін'єкцію 250мкг/кг Зако ТАК (група 2А) та З - ту ж саму кількість М3. 8 (група 28).

Зразки крові збирали у цитратні пробірки (кінцева концентрація 0,01М) на початку дослідження і через певні проміжки часу потім для вимірювання активованого парціального тромбопластинового (аптвВ), визначення фібриногену, ог-антиплазміна (на початку та в кінці кожного експерименту) та активності по нейтралізації ЗакоТАЕ і М3.8 (перед тромболітичним вливанням). Для цього до суміші ЗООмкл цитратної людської плазми та 5Омкл буферу або досліджуваної плазми бабуїнів додавали кількості, що збільшуються, або ог-антиплазміна або М3.8 (5Омкл об'єми, які містять від 0,2 до 100Омкг/мл) безпосередньо після додавання 100мкл суміші тромбіну (50 МТН Од/мл) та Сасі» (25мМ). Час лізису згустку плазми вимірювали та наносили на графік залежності від концентрації ЗакоТАК або М3.8. По цій кривій визначали концентрацію активатора плазміногену, яка давала повний лізис згустку через 20 хвилин.

Нейтралізуючу активність визначали як різницю між значеннями для досліджуваної плазми і для буфера і виражали в мкг/мл плазми.

Системний фібриноген не руйнувався, як і не виснажувався ог-антиплазмін, що відображало загальну фібриноспецифічність обох препаратів.

По закінченні б тижнів нейтралізуюча активність щодо закеТтАкК у групи 1 була значно вище, ніж нейтралізуюча активність щодо М3.8 у групі 2. У групі 1 нейтралізуюча активність розвивалася скоріше та значно помітніше щодо закзтТАК, ніж щодо М3.8, тоді як активність нейтралізації М3.8 ніколи не перевищувала активність нейтралізації закозтТАРЕ у групі 2 (таблиця 4). По закінченні 8 тижнів у групі 1 розвивалась значно більша нейтралізуюча активність як щодо ЗзакзТАР, так і щодо М3.8, ніж у групі 2 (таблиця 4).

На початку дослідження 50мкг/кг ЗакоТАК, що вливали внутрівенно протягом одної години, індукували 7742,995 лізис згустку через 2 години у 6 бабуїнів (група 1) і ЗОмкг/кг М3.8, індукували 83 3,690 лізис згустку через 2 години у 6 інших бабуїнів (група 2) (середнє -СКО), р-0,2. Через 6 тижнів лізируюча дія 5Омкг/кг закзТАК, що вливалися внутрівенно протягом 1 години, через 2 години знижувалась до 9,2-1,095 у З бабуїнів, імунізованих закзтАЕ (група 14А) і до 8,5--3,295 у З бабуїнів, імунізованих М3.8 (група 2А), в той час як ефективність лізису 50мкг/кг М3.8 введених внутрівенно протягом 2 годин, знижувалась до 104-6,995 у трьох бабуїнів, імунізованих закотТАЕ (група 18) і до 11--7,495 у З бабуїнів, імунізованих М3.8 група 28; р-е0,001 при порівнянні з відповідним вихідним лізисом для всіх груп; р-НС між групами). Через дві години після початку першого тромболітичного вливання внутрівенно вливали 50мкг/кг іншої речовини протягом 1 години з одержанням порівняльної залишкової ефективності лізису: 7,7-1,595 та 11--5,795 лізис згустку протягом 2 годин за допомогою М3.8 у групах 1А і 2А, відповідно, та 13-2,7905 і 12-2,195-ий лізис згустку через 2 години за допомогою ЗакзтТАК у групах 18 і 28, відповідно.

Через 18 тижнів внутрівенне ведення ударної дози 250мкг/кг закоТАК давало 39-5,390 лізис згустку через З години у З бабуїнів, імунізованих ЗзакотТАБЕ (група 1 А), тоді як залишкова тромболітична здатність 250мкг/кг М3.8 у З бабуїнів, імунізованих М3.8 (група 28) була значно більше: 68-4,595 лізис згустку протягом З годин (р«е0,005). "95) мкг/кг закоТАК продукували 58-9,595 лізис згустку через З години у З бабуїнів, імунізованих М3.8 (група 2А; р-0,1 при порівнянні з групою 1А), в той час як лізис згустку через З години за допомогою 25О0мкг/кг М3.8 у 3 бабуїнів, імунізованих ЗакеТАК (група 18), складав 393,69 (р-0,0005 при порівнянні з групою 2В). Загальний аналіз, незалежно від речовини, що вводилася через 18 тижнів, продемонстрував залишковий лізис через З години, рівний 39--3,095 для групи 1, імунізованої закзтТАК, порівняно з 63.-5,295 для групи 2, імунізованої М3.8 (р«0,0005).

Тромболітична здатність корелювала обернено пропорціонально з відповідною нейтралізуючою активністю протягом періоду вивчення (Зреаптап г - -0,83; р«е0,0001).

Таким чином, мутант М3.8 є порівняно активним і фібриноспецифічним, але значно менш антигенний, ніж ЗакзтТАРЕ дикого типу у бабуїнів, про що свідчить менша індукція нейтралізуючої активності у плазмі та більш швидке відновлення тромболітичної здатності після імунізації. Ці результати, одержані на аутбредних приматах, підтверджують і розширюють вищеприведені спостереження на кролях.

Приклад 6

Порівняна тромболітична ефективність та імуногенність М3.8 і М8.9 щодо ЗакетТАкК у хворих з периферичним закупоренням артерій

ЗакотТАВ (п-8), М3.8 (п-4) і М8.9 (п-4) вводили внутріартеріально у або в проксимальний кінець закупорюючого тромбу у вигляді ударної дози в 2мг з наступним вливанням 1мг в годину у хворих з ангіографічно підтвердженою артеріальною оклюзією периферичної артерії або обхідного судинного шунта. Пацієнтів включали у дослідження після одержання згоди після повної інформації та методика затверджувалась Комітетом по дослідженням на людях університету м. Лувен. Критерії включення або виключення були по суті такими ж, як і описані раніше (46), за виключенням того, що припускалось повторне введення частини рекомбінантної стафілокінази протягом 48 годин. Поєднане антитромбозне лікування гепарином, аспірином і пероральними антикоагулянтами було таким же, як описано раніше (46).

Стан відкритості оклюдованих периферичних артерій або обхідного судинного шунта періодично досліджували перед, принаймні, кожні чотири години під час і в кінці внутріартеріального вливання

БакозтТАК дикого типу або модифікації зЗакозТАК. Стан агіографічної прохідності цільової судини в кінці вливання складала кінець основного вивчення. Введення тромболітичного засобу переривалось, коли досягалось відповідне відкриття судин, коли ускладнення вимагали його закінчення, або коли дві послідовні ангіограми не демонстрували прогресу у лізису згустку. Відновлення просвіту визначалось, як лізис згустку, достатній для відновлення активного прямого потоку через раніше оклюдований сегмент.

Були припущені додаткові внутрісудинні втручання, такі як підшкірна черезпросвітна ангіопластика (РТА-ПТА), коли дослідники вважали, що тромб був достатньо лізований або що додаткового лізису тромбу не очікується.

Тиск крові і пульс контролювали до, під час та після вливання закзтАк, М3.8 і М8.9. Зразки крові відбирали до, в кінці та через 6 годин після ангіографічного обстеження. Дослідження включали аналіз крові, визначення протромбінового часу (ПВ) аптВ, визначення фібриногену, ог-антиплазміну, плазміногену та біохімічну оцінку функції печінки та функції нирок. Активність по нейтралізації зЗакзтТАв,

М3.8 і М8.9 та анти-закеТАК, анти-М3.8 і анти-М8.9 Едсо і (ДМ періодично визначали в зразках крові, взятих під час госпіталізації та після виписування. Клінічне спостереження було зосереджено на рецидиві тромбозу та на побічній дії, такій як алергічні реакції та велика кровотеча (тобто необхідність переливання крові або хірургічного втручання, падіння гаматокриту, що становить »1095 або внутрішньочерепний крововилив).

Групи з 4 - 8 хворих (41-73 років) з ангіографічно підтвердженою ОПА, з тривалістю, що оцінюється а 1- 120 днів та довжиною у 8-50см, лікували М3.8, М8.9 або ЗакоТАР. У одного хворого (МАГ), що одержував закоатТАК дикого типу, розвилась анафілактоїдна реакція протягом 5 хвилин після введення ударної дози в 2мг. Вливання було відразу припинено, і тиск повернувся до норми протягом 20 хвилин під час вливання плазмозамінювачів. Цей хворий не був включений у підрахування середніх значень -СКО в таблицях 5-7. У одного хворого (ГАМ), що одержував М8.9, розвилася повторна оклюзія через 30 годин, що лікували 6,5мМг модифікованого варіанту. У цього хворого розвилась нейтралізуюча активність щодо 7,8мкг/мл М8.9 і концентрація 270мкг/мл специфічних анти-М8.9 Ід через 2-3 тижні.

Значення вихідних показників окремих хворих представлені у таблиці 5. Більшість ОПА були на стегново-підколінному рівні. Всі випадки були пов'язані з тромбозом іп 5йи. У дослідження були включені два випадки обхідного судинного шунта та 2 клубові артерії зі стентом. Представлені дев'ять хворих з непрацездатністю, пов'язаною з переміжною кульгавістю, і 2 з хронічним ішемічним залишковим болем, 4 з підгострюю та 1 з гострою ішемією.

В таблиці 6 узагальнені індивідуальні результати лікування та його кінець. Внутріартеріальне вливання у дозі 5,5-13мг протягом 3,5-11 годин, викликало повне відновлення просвіту у 13 хворих, часткове відновлення просвіту у 1 пацієнту та не дало поліпшення у одного хворого. Додаткові внутрісудинні втручання (в основному ПТА) виконувались у 12 і додаткове хірургічне втручання відразу ж після лізису тромбів у 1 пацієнта. Рецидив тромбозу після закінчення ангіографичної процедури стався у 4 хворих: перший хворий був вдало знову вилікуваний після 30-годинного введення 6,5мг М8.9, другий піддався аортоклубовому обхідному анастомозу, у третього хворого просвіт судини вдало відновлений після 20 годин введення 40мг п-РА та у четвертого хворого тромб аспірували через просвіт. Ускладнення у вигляді крововиливів були відсутні або обмежувались слабким або помірним утворенням гематом у місцях пункції для ангіографії, за виключенням одного хворого, у якого з'явилася гематома у правому квадрицепсному м'язі. Інші ускладнення, що відносяться до внутрісудинних втручань, включали дистальну емболізацію та розсічення артерії, яке вимагало передчасного припинення вливання тромболитиків у одного хворого.

Одна неглибока оклюзія стегнової артерії, як показано, була стійка до дії 3,0мг зЗакоТАК, що вливалася протягом 6,0 годин і з нею потім вдало справилися шляхом ПТА (таблиця 6).

Рівні фібриногену, плазміногену та ог-антиплазміну у кровотоку залишались незмінними під час вливання замісників закотТАЕ (таблиця 7), що відображає абсолютну фібриноспецифічність цих речовин у використаному дозуванні. Суттєве розщеплення фібрину іп мімо проявлялось у вигляді явного підвищення рівнів О-димерів. Внутріартеріальна гепаринова терапія продовжувала аптт (таблиця 7).

Нейтралізуюча активність щодо закозтТАК, М3.8 і М8.9, пов'язана з антитілами та анти-закеТАвВ-, анти-

М3.8- і анти-М8.9-специфічним (дО була низькою на початку терапії та протягом першого тижня після вливання (таблиця 8). З другого тижня після вливання (таблиця 8). З другого тижня рівні нейтралізуючої активності підвищувались до середніх значень, що дорівнюють 2,9 і 3,3мкг модифікацій зЗакзТАК, що нейтралізуються в мл плазми у хворих, яких лікували М3.8 і М8.9, відповідно, що значно нижче, ніж середнє значення, рівне 9,1мкг зЗакоаТтТАК дикого типу, що нейтралізується в мл у пацієнтів, що лікувались заказтАкК (р-0,03 для модифікацій при порівнянні з диким типом по критерію суми рангів Мапп-МУУпіїпеу).

Рівні закотТАК-специфічного (ДО підвищувались до середніх значень, рівних 51 і Зімкг/мл плазми у хворих, яких лікували М3.8 і М8.9, відповідно, що значно нижче, ніж середнє значення, рівне 240мкг/мл у хворих, яких лікували закатТАКк (р-0,01 для модифікацій при порівнянні з диким типом по критерію суми рангів Мапп-М/нпіпеу).

Таким чином у хворих з периферичною артеріальною оклюзією, які одержували дози, що становили 5,5-13мг сполуки, М3.8 і М8.9, індукували значно менше нейтралізуючих антитіл і специфічного атистафілокіназного ІДС, ніж ЗакотТАкК. Ці модифікації забезпечили доведення концепції про те, що зниження гуморальної відповіді до рекомбінантної стафілокінази шляхом конструювання білків здійснено.

Підписи до рисунків

Фіг. 1. Білкова послідовність стафілокінази дикого типу, закоТАК, Нумерація починається з Ме|2- кінцевої амінокислоти зрілої стафілокінази повної довжини. Показані модифікації "заряджений кластер на аланін", які були вивчені.

Фіг. 2. Схематичне зображення епітопної специфічності панелі з 17 мишиних моноклональних антитіл, індукованих закзтТАнм.

Таблиця: Константи рівноважної асошіації (КА х 107 "у для зв'язування мишиних моноклональних затитія зі стафілокіназою дикого типу та мутантами "зархджений-кластер-насаланін" шо

ПО Модифікація І Єпец | Епітопвий кластер Епітопний кластер ЇГ Ї Епітоппнй кинетер Й

І актіх и ел? З0л? Зв Зб199сі авргі: Из О8ЦЯ сор О32В» ОСЛО ІРНІ оз5р); ЗОСЮ 24С4 00 АЮ шшея 0 дакЕтАК о в Р" 7.4 то. 35 9 А 0 »5 8025 хі з пе й бо 63 22 ма го ке і50 1.3 71 ІЗ 97 ол М 17 73 17 аа їй 04 Гяк 3.5 о 45 За ми рКяхлю гля 1.8 16 з 29 15 8. 27 16 26 ія 18 19 бої п Таб 18 075 м: разі 125 ГІ 5 15 14 ІЗ 7 135 74 37 еп 16 з х 5.1 Ж 5 за

МІ кА 97 78 гя 3 »14 05 в а 10 8.5 0018 92 2761005 005 815 ва 25

МЕ КІЛЕБВЖКІВ 94 ча З 50 73 71 74 16 14 вл 17 3в 052 роле 1.7 ФА» 19 Ме ме | ББЕБХ Ії 30 5 юю 88 РІ. о м, ві зів 66 26 272 46 051 яв 2 52 ГУ

МЕ КІТ пи а ол 2 алі бля їз »л 225 21 47 хів 17 ІД. 15 12 зб. ла

М» С5О82. на 15 ІЗ 10 КІ 7я ів чл »25 зв 15 7 15 поз 007 005 «со 1.2 й мі фо 73 7 А зл 5 45 55 Кк 4 ке 2 15 44 оо 54 ов з ваз

Ми роза БІЙ пл. 19 Не за 24 71 ГЕ ІЙ! ма 22 9 088 114 М 74 7 2 мі» ркобкотжов чї з 4 73 Ку; ду 8.6 хв 9 1 1.2 16 041 1058 17 12 ІЗ оза

КИ гетавКков. 170 16 5. 7 19. 1 2 28 5 р за 21 7? 043 йо їа 16 '» ків ринзі янНіІю БУХ у 3х 3 КІ 7 о ІУ за ті 156 Уа КІ 1 та ЕК ь л іх ми ринок по 8 74 1 76 29 18. 25 а 2 4 іх 052 р Ів. зх 28 2 иЖжіІкнао че 1 12 - 15 їм тю 8.5 - 48 - 05 але. пшоапяя б п мк | віза Кіа 7 21 К Бл. 15 25 мВ жів 25 зх15 4. жі 17 ог ія. 2091 5 - вн каб ковеА т 45 злі о ою о4ю 007 8.5 5.8 вх вл бо: ва ов4 рот яша 005 о по

МЕ р клопів АтТсООВх 31000 базі 003 вда п : 19 20 26 ві? 30 03 Щ|0003 005 бля 001 4 о

Таблиця 2. Абсорбція антитід, викликаних лікуванням стафілоюіназою дикого типу Ї вакаТАВ) у хворих 2 гострим інфарктом міокарду, зі стафілокіназою дикого типу га модифікаціями Заряджений-кластеренасаланін"

Код Титр | Відсоток антитія, абеороовлних с. ММ 1 Бе ТАК. ОМ. М тт МІЯМЕ Мом 00М38 000, сом. 76 ж жк 61 я ж КУ Гл: КУ пАМе и я 58 59 54 я ж 50 І 36 лих 12 ж ж ла ся - кЯ ЗА 42

Угв5 15 ї в ж жк я кю Ж ж рове "М КЗ Я 47 81 жк Ж 53 57

УБИМ 45 4 во в «8 з я 55 54 Й

УгАВ Ів ж ся ж ж ж У ж 85

ОБГ 47 й ж із 213 56 20 22 топ 15 Ж 85 75 85 й 62

Упво Кл я ся Ки з 87 4 ве я ня п 64 З Гі в

ОКО 25 ж ж т Ж 15 73 "Ре 55. ж У 75 ТЯ 58 52

АБІЕ тах Ж ж іх) ж. | во 78 чо У Ж Е- ти СІ я ж 5МИН, Бк В Я,

Тропуск б І : цл о о їн вій спіхову

Середлне ІїКО зн СА же тр вужі бе жі Бк

Сщриднє - | тк в СхІН Ин: 5

Абсорбція 90 відобтків прелетавлена як: й

Енізомпні кластери ті жу що представлені у таблиці Ї.

Тебляця ЗА. Імуногкенність БаАКЗТАК, М3, МВ і МО у кролів.

А. 58Е5Т ЛК порівняно 2 М

Імунізуючий Нейтралізуюча активність (мкг/мл) оНзис згустку (відсотох) препарат зн ВВЕВАК 00000 оон Мн КВ ТА В (ЯЮ мейкт) 00000 яко) о. шо 7 Вяхідв; тиж. р Вихідн. тиж. п Вихід. тиж. р Вихідно бтиж В. акеТАВ Ото 35 Об ОО 0 ощіа)М 006000 8954) - - - У ЗЖЯ) ц

Мі ВахооВу різ 00005 бажОюЕ пелиюу я х 18328) - 76528) зві 0500005 в. во 042 |! 2 - - х 0,05 н

В. вакзіТ АВ. порівняко з МВ

Імунізуючий Нейзралізуюча активність (мколол) Лізис згустку (підсстох) препарат 11111011 11100000 0010 ніше. т АЕЯКАА 00 ВОМКЕК но Й Вихід тиж. В Вихідн. б тиж; р Вихідн ближ, г ВБихідн б Уиж. АВ. закУТАК але 53 о Обами ив 22161) НК ників та ОО1 я Фе -

МЕ ІМ ЗНЯВ 001 Об МмЕУ 855-983 Ох - 398) - зе оз пох

Р ля 9,095 - Кто 001 - ж ЯК - - хОДКЮ5: 7

КЗ БаквтАЯ, порівняно 30МО

Імукізуючий Нейтралізутюча зутнвність Смкгємі) «Пас згустку (відсоток) препарат плит с. до о тин си ОВАКВТАК 00000 М5....МЖБЖАВ 5... МОЮ мокко 00. дод тненннин о КіДН. 80ближ; 0 В о0О0ВНХЕЛяЬ 00 ближ. 00 ОВИхінно 8С0Облнж 0020000 Жіня 0 бтлиж ОВ

ЗаКБТАЙ. Од лезом о008 п о5оеЯ 25.) по 0 Яд - - за й

Ме ОНКО) Зоо) 0004 орав Зала ОО - ЗЕ - лехіцю ябьувя 0 жМО05

Р 0.59 003 7 об под - . - - 02 -

Результати: представасні сбредвіми значеннями їх КО від числа експериментів, даного у пужках

Статистичне значення різниць визначалось спо у-тесту Стьюденту дня парних айо непарних. значень або по критерію суми рангів Манн- Уїтні залежно від'застосування

Таблиця ЗВ. Імумогенність ЗакеТАТ, М. 1 М3.9 у кролів

А, ВакУГАВ. порівняно з М3.Я

Імунізуючий Нейтралізуюча актавність (мкг/мл Лізис згустку (відсоток) прапарат п п п шт шу пен ВАК ТАК 000 Я 00000000... МВНБТАК 000000000000ОМУ8(ОбО мкоює севдтре- тя ШО ВИХіДН; с обльж. 0 ро Вихідн. 80 биж. 80во0СВихідно бтюж. 00ро020ВИХіДн. блмжо00Во

БаКЕТАК 06508) о0в15493 0005 205004) 024 947 ЗОБУ Я58ЯХ «00005 - зок) - ща4 050308) СОЯ) 0001 35542008) БІВ 00 х зт - ЗЗЖІЩЯМ 5952) 07

Р 10 опод - ва бд я я «00005 - « 9.05 ні

В. 5акотТАН, порівняно з М8.9. імунізуючий Нейтралізуюча активність (мкгумл) Лізне згустку (відсоток) препарах пиши 14120000 и іі пн жи на нн и и и А ни и нн п нн закетаАВ. М. й БаК5ТАК Й МЯ.9 800 мкг/кл)

Вихідн. тиж. р Вихідн. бтиж. р вихідн. бтиж. в Вихідин. бтиж. Р

БакЗТАВ. 0.339.МАМ 2033504) 005 ол) ві 0007 ема) - я - ЗІ) -

МО ОЗ) 35.8) 0003 БО) о Жжі308) 09005 - Зіж35(4) я 3921306) ЗЗжЕНа о в 04 003 7 веж Ея 0.05 - - 7 05 7

Дані представляють середні значення КО від числа експериментів, даного у дужках

Статистичне значення різниць визназалось по т-тесту Стьюденту для парних або депарних зцачень абосло- критерію суми рангів Мади-

Уіїтні, залежно під застосування.

Таблязя 4: Зміна З часом активності нейтралізації Зак ТАК. та М3.8 (в омкг/мл)

Ветуя а 7 3 5 в КУ юю ї2 14 16 І5 20 вл п/к п/к п/к в/а в/в

Група Г Тмунізанія ЗАКТАК (пе 6)

Активність нейтралізуююта 030.02 13507 2855-36 т5376 зп 100:723. 541319 З8156 ЗВ» 1812.5 1419 55 в бактАК дру неність нейтралізутюча бо 03505 00500 ов ЗОж5.0 за ззк5.1 да ізжха 1427. б. 31574

М.

ЛИН и оди ПЕД ни Зк ос в НН ЗК а о В Й

Група Я: імунізація МІЗ.8 (п 6)

Активність найтралізуюча 0350.0 7.5538 74532 443 7 2555 052 МО 98-23 еббЖжі5 89-22 40547

БакатАк муть вайтрапізуюча 000.0 67433 4552А 88:32 то-еу зала 504.5. но 082 воло з 3459

В нн 5 о опо «нн 08300600 6й ОО

Дані представлені середійм значенням СКО по групі з 6 'бабуїнів. Для розрахунку значень п.використовували парний т-тест Стьюдентя,

Дивіться таблицю З для біль детального уявлення про графік імутізанії. в/в внутрівенно; п/к.- лідтякірно.

Таблиця 5, Характеристики хворих з оюлюзією периферичних артерій, що лікувались МІЗ.8, МУ. або Бак5ТАК.

Мослязяня Стать Вік Зклінічна кКиртина Анамнез, пю стосується справи Яталінця 0 Місце б Встановло- Вотуновис-.

Код озфєнта іроків) май страє ви Довжини оодндтеднненнотіпнечннтстстнтттуопнжие ото ттнтітннсдтннсінттзкотеттнносднтнннт- « КЛЕХОДНІ, ОЕЛюЗНСМх

А.Ммад то ч 83 Переміжиз; - Ж Прави середи «а тю хкульхавість ТІСА

МА Ж т ЛПеремокна. Тзуертєнзія; захворювинях каросидної ви Ліва середня СА: 25 ю жульсивість лржерії ою ч 36 Перемоква. Транеплавтація варки. - ЗХраваїІС У 7 729 кулнгввісте

МЕК ц 3 Іщехачняй біль Ддортхо-бістегновий трансилаятат; я Права СА, 9 45 па покою аммутація цередпьско відні лу стопа.

Ме хе Мо З и НН А А А и А НН В ДН НААН ох, ЗНАНИЙ 13, М8:9 нс ч в Тереміжна Двосторонній стент клубової уртерії ж Еравий ЗКА 16 15 кульгавість (стеяті ог Я 5 Тидтостри тюмія 0 Лівий підкопінопідковимий т Трансплантат ПА. 3 35 трансплантат Правий ЗКА

ТАМ ч 55 МПереміжна ТІефаркт міокарду; стентування правої з. (стент) Ії 1Х кульхавість загальної клубової артерії Права середня чо ч 7 ГПідгостра пемія 0 Тілерліпідеміня; гіпертензія; ІХС; - ПеА і 13 шо щу ши уомірна киркова нелостатність. пишу

Середи ЗСКО 0 0-2З2хВ.00 ОЙ ВИШ щи щи й 8.5х3.5 1545

С.ВахЗТАК

КкщА ч ЕІ Гостра ідемія Правий стесноволідколіний м Правий; є госоовохндікає 1 3 транспяаитатоюєттравматнчний) звичай тражсиниитет пав ч 5 ішемічний біль Абломізальна аорталька анекризхха Ж Права середня 50 12 покою ПСА дав й 6? Перемізнй Підозрюваяз ТХС Ж Трава ЛА ізо 8 кульгавість

ЖАЇЖ ч (57) Переміжній Гіпертензія ІХС ж Права середи су сна культахість ПСА ! 5МО ч У Жідгостра Пуемія Лівий схегнова-підкодінний - Трава ЛА. 3 1 траяспляктат. Аневризма правої ЛА. й

М Ж. 74 Переміжива Тіперлідемия - Ліва СА Фі 8 кульганість ши

РОТ ч в1 ТНЛгОстра премія о Аленокарцякома простати - Ніва СА 7 18

ЗА ж 59. Переміжна Гіпертанзія, іпсерліпідеуя я Трава се 40 7 п 3.1.1... Жультавіть щу оЄергане ско, 020000 5 Ов вок нн конк ІВ ОКУ

ТСА; похержнска стегнова артерія; ЗА: загальна кнубова артерія; ПА: підколіяна зртерія, Ж племінна хвороба серця. « яс включений ло розрахунку середнього: НСЖУ

Таблиця б. Лікування та його результат у хворих з ожлюзією периферичних арусрій, о ліусуналися М.Я, МІЯ.5 або ЗаКЕТА В.

Спелука Код Бідповлевня просвіту Загальна доза Загальна трива» Додаткова. Ускладнення при зуг'ясграфії тапіонтво пішяхом аіюсу тромбу; тромболітжаного. лісто вливання лератьх

ПЕ зве ДІ Зоо и в и о

АОМУХ 0 І | ШИ

ЕТО Повне ою 7.0 ччА Тремтіння (за відсутністю лихомкики)

УА Повне 10 80 ча Дистальна ембилігація після ЗНА, усуютна тіл, час лужне де со вливання акт Ан, МАВ, біровення ноз асуконе 4 дЕ ЧчЧа, Роюме прерій. лекки лихоманки, що проходитя

МЕЖ Повке ра 7.5 Степовобінь- о Грахмх, тегомічковий 010100 0000...-.....ї.... Траноплвнтьх берднежоКО шк ЕД А ПИ о

В.М . й що вис Повне ю 80 ччА Певторий оклююя пбфез З'днів, явілікуненя зв допомагою воуто-бі- отеситуваних хлубового уранеплансату

ОТ КШевра. 10 ва Мото Ніяких

Ач Повне її 85 НА Дистаниця емболізація пієля ЗА, вилікувкии аспірацією; помторня стснтуванах скнкхих через Ж педим, вилікувна 6,5 ми Зак БАХ; МУ. (урютяком дотодко)і ЧА вКО Повне: ну 85 Хепірензя ЗО меупе АТ, поводяться протяком 20 годи і") чахЯТАВ. бляапок х- пннаажанан аа нанні хІснтуванияй. 0110 бвреднеяСКО 00100000 00030000 ШО 000ооооннтю поняття нікотин

Є БАБВТАЯ -

КА Понег. 12 10 ЧЧА томельюв Гомоусих привогю стогно: лах, зстйржкіх: прумоа. сих лніжовк артерію) рВЗгдІ Повис Тл УЗ чл, абдпмінн: Гостра пмемія петоронатерхльної застини ступні у результиті льна йортельня (зидеугтерилі) ембалізації вол абдеміельної абрткликої впеяриами до аневриумоктомцу днотилоних хріцрій нижньої частклно лівої гамізка (лень Я) що ва ідечь у відповіляє пк лікування 110 му рат оо Ніякого ха во ЧА Гематома у міслі луйжції вони.

АГ 4 Дози - Анафізактичняй шок провятом. я хв. після улярного кнодеомя з

Моступивліюою чере 45 хи клин після пормолізний таску вроді. зенвуіною помісю обхюсу) лівій оерецевї перобряльної артерії ям Повне 7.3 пд Стентуваиня Повуврня оклюзії стемту через Зх жнів

УК. Повне 5,3 За ЗчА Нінких

ВОК йоеко 13 г - Гостра повторна оютуня (дени 1)

Вивйль черезпросвітна асуіряців тромбу.

ТА; Повке. ши 5 50 ччА Гематома у місді пунклії неви. "Середнє вок си. 2-2. 580 Боно спот пишу

ЧЧА, черезлкрна через оввітни вигопласіюка; чороз обмежену наявність ЗакиТАК, МУ:5; тервічю продовжували рт жжрде вишоченцій у розракувок соредивого СК,

Таблиця 7. Параметри коагуляції перед та після введення М3.8, М8.9 або з оклюзією периферичної артерії.

Сполука Код Фібриноген Гілазміноген о сзгантиплазе Т-дімер (нг/мл) ач (сек) хворого 02040) ос ее МОЮ, 00 он птн од ді пиштшж пюєтйОоншо ія СО ШНсля ЩО ЇНоля 80 шини Я ой шо

АНЯ ; ПЕН Н КК «то кн аа ко ВІ в во «300 ва 35 аа

Мих 4 ха па но 97 но ПАН 2. в х 180 о Я в.о рі 52 10 пе 434 зах 33 Ві мив . 8.5 -4 ї50 Й Це 1 у аю З їх свекОо зако Зб о юктк мююьа с99к5а О0ж5 Й 07ОНоЛО 4ДОовкУ зако рю ру 02 пл НА е06 ві з. Щ '

Ес 42 4.6 94 9 97 51 яко 400 зо 3) ст КІ 36 82 я Ва 90 90 20 33 б:

Ам 35 4 в 96 98 Но тва «НОЮ ТВ 2 25 вВкО. АВ 30 75 я НІ як КУ А Іти 5ї

СрисКО с 37нНУ» 422 ТЕЗ Вб. рек реа Оп Ую 2,4Оо0к5а ЗА 53 ве в дю 06 оо 004

СБК АВ ння

КМА 20 за 9 Фо 87 во «100 оо з 53 тв їх КК ке Ка ЩЕ ню. ат 23КЮ За 48 оо 16 в Зх Уа ра ня: «10 45 37 48

Аг їз т п) (В 400) (3) їх МО) СОЮ 3) га

УМО 45 4.х це 94 пю 93 «100 з 12,50 33 99 чув у; 24 пі 76 об 85 550 Зо 79 по

Ра 32 25 9 53 16 ЩІ «а АЮ 33 55

ЗІ 5 з 19 ї20 ЦО 2 Лю З 21 44

СевескОо зом Зак ака вв оба аж 2ЗОЖ87 лобка лю З.6 БИ п І ПИ ооо с В і вищ "в'лю парному т-тесту Ствюдента | -

Для розрахувку середнього значення та "о" ме враховувались: ж не включену цля розрахунку середнього зназення ОКО.

Таблиця 8. Нейтралізуюча активність їй специфічний Ір у плазмі хворих, що лікувалися М3.8, М8.9 або 5ак5тТАК (зді ! дктивність, що ати лі- мейхралізує: кування | І лікування Нентралізуюча активність (мкс мл) Специфіч ІОСоантитіла (мюр/ми) пт нини ВИН 01 ЛИЖД; блиЖд ЗЛА. Я ТиЖжд. ВИХіДи ки. Я лтижд о Злижд. Я тку. ес: юна ппинннжшжшжлщтФлдннлиаавиананннннян каляза ка «зн по котво за та 42 - я о 385

МА 55,04. "і ві яз 06 оо о ЗЕ 56 за 42 ца 95.05.18 08 ба ов 25 іл 32 83 92 З та

МЕК 95:05:26 ві во 2.3 з за за ПЕ 3 5 гі

Алік

Пе 95.05.29 ва во 23 44 : 1.9 16 та з - ої 95:05:22 Бо оз зв 45 40 38 зв та Зі 48

МАН 9546 ВІ й б їв 35 52 п 14 208 9 у ве 9597413 90 - 5 05 аз 45 - 56 44 за

А биКВТАТЕ й

КнА 950747 ад паї Із 16 15 13 57 їз 100 95

ЮР щ5д19 оо 925 8 100 то зл ба то 2408 1лоб соб а5.7:26 023 Із 48 21 5 44 15 2 209 230

МАВ) 950276 йл5 ві а 45 63 73 Ії 1 5 мюо єм два? во аб оо по 05 за 22 33 33 47

Усе 95 дл ба во І 5. 10 50 бя 216 250 25 тот 53012 по оо 40 43 43 15 33 за за «во

ЗА 954443 п во т 74 н 33 в 210 280 т Хежохі М3Я в... «то. во - 40 з 25 Где - то по 100

УА по во ах бо о5 аз За 53 75 ах йо во 95 по 25 КУ з 33 ІЗ 15 к

НН ва 93 за «0 15 Ки за Бі то. 63 пломво пес во ай зо 5 : їх 28 39 42 - тт йо 35 Ай 5 2о т 32 1 по мо

БАМИ пе зо п о їв т 230 20 зо вно Фе - зв 5 КО 5.У - 23 31 Ху наяв тАн -

КА во па із й ка яз 74 200 75 ГЯ3) з ий пп 5 ат 49 пт 59 1700. оо 1лекс сов ах з з 23 23 93 зт 50 дк Зко мкіДЗ ІТКу 95 га а 54 4 Ез 8о 96 по

Зм чо за за ва по 3.5 за 51 70 зв

Б по оп 50 50 за чо ГРЗ В. ві вх

Ра ва 05 25 20 22 єв р ко іо

ТА оо по 30 За КИ в в 210 що

Таблиця Я; Нейтралізуювча активність та спедифіяний Таб у плазмі хворих, що лікуваляся МЗ. В, МБО або хакуТАв. 125,12.14), прадовження.

Ме

Самі ох 5. Пд Н 35 3.5 70 13 12 83 58 23

УА 02 0.5 0.5 08 19 23 и 4 й 92 я! їх 1 05 я за 7 У. 7.3 13 І5 ІК

МеВ па 05 ок 2.4 3. Бк 72:5 ЗЕ зі 6 сл.омня пе пп а о за - 16 2.3 КІ 30 - ог по а 5 6.6 150 ьЯ- 513 97 79 та

ТА КК пе 53 за 74 ї - юю за зю а Й по - 16 їо 00 40 - 6.25 33 з В сдочекЕТАН

КА чо 28 16 12 7 38 зе за 51 ах ви - по 1 ща ха 45 за 9 Ба Бо клю боо іш 05 зі 72 23 8.4 8 т «00 зо

АБО іо ап 45 7 -35 за 7. 3, ів 25 мае по ча по бо аа Я 53 за 1 18 ня ва 0 ГЕ 20 5а 36 за 15 п зо тот ва 0 33 295 ЗЕ їл ЗА 75 0 793 ви иа З НН нн пн вин С сп В С ЛИНННН (2) Повторне лікування зерез 30 годин; (75) лікування перервано нісля ударної дови:

Бег Бе Бек Рне лев ух ФУ їуб Туг | 5 ду й в зе й в у ч ух У уз уз 8 У Кар АВ а Зі 1 т 35 - -і | , ! ЖВ ака Баг тут Кка в, Рго ТвВг о біу Бгто Тут їв Мет мі Аза зв ; а

Маг тв біу ма! Аврбєг цух біу Ап бів фен Шец Бег Рго

Їеееовгихьуьььжжькнний а т 3 43 , : ; ; 58

МНіз Тут Мі бів вне вто Це щує го біж,ТВНЕ ТВг бвя ТАг о понююетнноєтнстестеєстснсті

КЗ й

І . | й то

Був іш Муз йіж бі Тжт Тує Ма! біш бТгро Аа Бе Авр йіз а г 7 т | ши Й | да

ТБЕ АТ Тут м ув бій ймне Ат о маії Ма бі бец Або го Бе г с)

А зу | сім мМаб тв: т т А ЕВ вп Ю Ь шує зіуз ів ші Маг тн: т Туг Авр « дев бух вух же

М сонний ИН Даті машин і т т че 95 Й - ов й

ІЗ в Тіт фу бет вве то фе тнг бін уз Піу Ре Ма! за Х чнеесеін 15 1 пз | в

Узі Рге Авр Бей Бех бів Ні (Пе ж Ап бто біу Рне Ас 5 т

Я Що тав ви ііїє Твт,йув, Ма Ма Це а бух кує

І | ! Ї !

Кі

Фіг.

ж

СдаВАВ я

СК ит ло

СТАДА дл ВЕ12 ск НІМ. Ес сей ла Ва в '

ААУ

ДЕД да

ДИНА ЧИЯ дя АЮ Й си ДЯОСВ Длих

Фіг.

Claims (20)

1. Похідні стафілокінази, що проявляють знижену імуногенність порівняно зі стафілокіназою дикого типу, які мають по суті амінокислотну послідовність, зображену на фігурі 1: 1 14 Рпе А бег бег 5Бег Не зрГуз СІу Гуз Тут Гуз Гуз СІіу Авр А5бзр 20 21 1 15 28 Аа 5ег Туг РНе бів, Рго ТПг біу Рго Туг Ге Меї Маї Авзп У Ма! Ар б5ег (уз Сіу Азп бі (еи ів 5ег РГО Ма! Тнг су а зр б5ег Сув у зп и ви Се 5бег Рего 2 З аз 56 Ні5 Туг Ма! бі Ре Рго Пе бує Рго Сіу ,ТВйг Тйг Се Тиг ша во во 4 57 т7о Суз бі цух Пе бі Туг Туг Ма! Сбіш Тгр АїЇа Ге Азр Аз Ганни вом | олово в М п вв в б 7 71 ва Тиг Аа Туг Гуз Сіш Рпе Агуд Ма! Ма! Сі Гем Ар Рго 5ег СЕ ошшаинний В 9 ді Азр уз Ап уз 1уз 1У5 вп 5 Аа уз їе Січ Ма! Тпг Туг Туг зр Гуз У У -е-7 -т 12 99 п12 біб бі Тпг о цуз Бег Рпе Рго Пе Тпг біш ГСуз сіу Рвбе Ма":

Ся. -8 Й 14 пз 126 Маі Рго Ар іеш Ббег біш Ніз Пе цуб5 Авзп Рго біу Рпе А5п у ооо вивн ишино Мк прощ 16 17 127 136 іеп їе Тиг,Гуз, Ма! Ма! Пе Сі Суз Гуз лій с-г 18 19 2 в якій одна або більше амінокислот в одному чи більше з підкреслених кластерів були замінені іншою амінокислотою з руйнуванням, таким чином, відповідного(их) епітопу(ів).

2. Похідні стафілокінази за пунктом 1, що мають по суті амінокислотну послідовність, яка представлена на фігурі 1, в якій одна або більше амінокислот в одному чи більше з підкреслених кластерів замінені аланіном з руйнуванням, таким чином, відповідного(их) епітопу(ів).

3. Похідні стафілокінази за пунктом 1 або 2, що мають по суті амінокислотну послідовність, яка представлена на фігурі 1, в якій одна або більше амінокислот замінені аланіном зі зниженням, таким чином, реактивності цих похідних з панеллю моноклональних антитіл, що складається, зокрема, з антитіл 170311, 26А2, ЗОА2, 2812 ії 310, спрямованих на епітопний кластер |.

4. Похідні стафілокінази за пунктом 1 або 2, що мають по суті амінокислотну послідовність, яка представлена на фігурі 1, в якій одна або більше амінокислот замінені аланіном зі зниженням, таким чином, реактивності цих похідних з панеллю моноклональних антитіл, що складається, зокрема, з антитіл 7/НІ11, 25Е1, 40С8, 2404 і ЛА10, спрямованих на епітопний кластер ІІІ.

5. Похідні стафілокінази за пунктом 1 або 2, що мають по суті амінокислотну послідовність, яка представлена на фігурі 1, в якій одна або більше амінокислот замінені аланіном зі зниженням, таким чином, реактивності цієї похідної з панелями моноклональних антитіл, спрямованих на епітопні кластери І та ПІ.

6. Похідні стафілокінази за будь-яким одним з пунктів 1-5 для використання при лікуванні тромбозу артерій.

7. Похідна стафілокінази М8, що має амінокислотну послідовність, яка представлена на фігурі 1, в якій амінокислоти Гуз у положенні 74, Сі у положенні 75 та Ага у положенні 77 у підкресленому кластері 8 замінені аланіном з руйнуванням, таким чином, відповідного епітопу.

8. Похідна стафілокінази за пунктом 7 для використання при лікуванні тромбозу артерій.

9. Похідна стафілокінази М3, що має амінокислотну послідовність, яка представлена на фігурі 1, в якій амінокислоти Гуз у положенні 35 і Сі у положенні 38 у підкресленому кластері З замінені аланіном з руйнуванням, таким чином, відповідного епітопу.

10. Похідна стафілокінази за пунктом 9 для використання при лікуванні тромбозу артерій.

11. Похідна стафілокінази МУ, що має амінокислотну послідовність, яка представлена на фігурі 1, в якій амінокислоти Сіи у положенні 80 і Азр у положенні 82 у підкресленому кластері 9 замінені аланіном з руйнуванням, таким чином, відповідного епітопу.

12. Похідна стафілокінази за пунктом 11 для використання при лікуванні тромбозу артерій.

13. Похідна стафілокінази М3.8, що має амінокислотну послідовність, яка представлена на фігурі 1, в якій амінокислоти І уз у положенні З35 і Сім у положенні 38, Гуз у положенні 74, Сі у положенні 75 і Агд у положенні 77 у підкреслених кластерах З і 8 замінені аланіном з руйнуванням, таким чином, відповідного епітопу.

14. Похідна стафілокінази за пунктом 13 для використання при лікуванні тромбозу артерій.

15. Похідна стафілокінази Ме8.9, що має амінокислотну послідовність, яка представлена на фігурі 1, в якій амінокислоти Гуз у положенні 74, бій у положенні 75, Ага у положенні 77, СіІй у положенні 80 і Авр у положенні 82 у підкреслених кластерах 8 і 9 замінені аланіном з руйнуванням, таким чином, відповідного епітопу.

16. Похідна стафілокінази за пунктом 15 для використання при лікуванні тромбозу артерій.

17. Спосіб одержання похідних стафілокінази за будь-яким з пунктів 1-16, який включає стадії: а) одержання фрагменту ДНК, що включає принаймні частину кодуючої послідовності стафілокінази, яка забезпечує її біологічну активність; б) виконання іп мйго сайт-спрямованого мутагенезу на фрагменті ДНК для заміни одного або більше кодонів амінокислот дикого типу кодоном іншої амінокислоти; в) клонування мутантного фрагменту ДНК у придатний вектор; г) трансформації або трансфекції придатної клітини-хазяїна цим вектором; і д) культивування клітини-хазяїна в умовах, придатних для експресії фрагменту ДНК.

18. Спосіб за пунктом 17, в якому фрагмент ДНК являє собою ЕсоВІ-Ніпан! фрагмент з 453 пар основ плазміди РМЕХбО25АК, сайт-спрямований мутагенез виконується іп міо за о допомогою системи олігонуклеотид-спрямованого мутагенезу з використанням плазміди рМА/с і дефіцитного по репарації штаму Е.соїї М/КбМе, і мутантний фрагмент ДНК експресується в Е.соїї, штам УУКб.

19. Фармацевтична композиція, що складається принаймні з похідних стафілокінази за будь-яким одним з пунктів 1-16 разом з придатним наповнювачем.

20. Фармацевтична композиція за пунктом 19 для лікування тромбозу артерій.