UA54993C2 - Method for producing trypsin inhibitor - Google Patents
Method for producing trypsin inhibitor Download PDFInfo
- Publication number
- UA54993C2 UA54993C2 UA2002064738A UA2002064738A UA54993C2 UA 54993 C2 UA54993 C2 UA 54993C2 UA 2002064738 A UA2002064738 A UA 2002064738A UA 2002064738 A UA2002064738 A UA 2002064738A UA 54993 C2 UA54993 C2 UA 54993C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- trypsin inhibitor
- extract
- trypsin
- water
- carried out
- Prior art date
Links
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 title claims abstract description 73
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 title claims abstract description 73
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 73
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 89
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 51
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 39
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 36
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims abstract description 29
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims abstract description 28
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 51
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 44
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 28
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 22
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 21
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 21
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 21
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 18
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 13
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 claims description 12
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 11
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 11
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 10
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 8
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 7
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims description 7
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 claims description 6
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 5
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 abstract 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 56
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 50
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 38
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 27
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 25
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 24
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 14
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 11
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 9
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 9
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 9
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 8
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 7
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 7
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000219823 Medicago Species 0.000 description 4
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 4
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 3
- NQIBQILAMKZKFE-UHFFFAOYSA-N 2-(5-bromo-2-fluorophenyl)-3-fluoropyridine Chemical compound FC1=CC=C(Br)C=C1C1=NC=CC=C1F NQIBQILAMKZKFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000013527 bean curd Nutrition 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N ficin Chemical compound FI=CI=N POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XVMSFILGAMDHEY-UHFFFAOYSA-N 6-(4-aminophenyl)sulfonylpyridin-3-amine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=N1 XVMSFILGAMDHEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000270 Ficain Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000002852 cysteine proteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 229940001501 fibrinolysin Drugs 0.000 description 1
- 235000019836 ficin Nutrition 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000007983 food acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 108010079099 gordox Proteins 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000013021 overheating Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000079 pharmacotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013528 soy cheese Nutrition 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003860 topical agent Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Beans For Foods Or Fodder (AREA)
Abstract
Description
Опис винаходуDescription of the invention
Винахід відноситься до медицини та хіміко-фармацевтичної промисловості, зокрема, до розробки способів 2 одержання інгібітора трипсину з рослинної сировини.The invention relates to medicine and the chemical-pharmaceutical industry, in particular, to the development of methods 2 of obtaining a trypsin inhibitor from plant raw materials.
Відомий спосіб одержання з рослинної сировини інгібітора трипсину шляхом екстрагування водою очищеною подрібненого насіння гороху при перемішуванні на протязі Тгод. Отриману суспензію центрифугують, потім екстракт підкислюють соляною кислотою до рн 4,0 - 4,3, знову центрифугують. З отриманої надосадкової рідини висолюють сульфатом амонію фракцію 0,75. Осад суспендують у 29 - 5Змл 0,1М натрію хлориду при рН 8,2, 70 переносять у целофанові мішки та діалізують до негативної реакції на сульфат-іон. Вміст целофанових мішків (ретентат) центрифугують, надосадкову рідину наносять на колонку з діетиламіноетилцелюлозою, яку заздалегідь урівноважують трис-НСІ буфером 0,025М, рН 8,15 - 8,28 з іонною силою 0,0135. Білки елююють тим же буфером на колекторі. Хроматограмою визначили, що інгібує трипсин тільки білок другого піку. Цей білок висолюють, діазолюють, ретентат ліофілізують. Всі операції з білками проводять на холоді (4 - 520), а хроматографію - при кімнатній температурі (17 - 2022). Отримують ЗБмг інгібітора трипсину з питомою активністю білка 1050міЄ/мг (1).There is a known method of obtaining a trypsin inhibitor from vegetable raw materials by extracting crushed pea seeds with purified water while stirring for 1 hour. The resulting suspension is centrifuged, then the extract is acidified with hydrochloric acid to pH 4.0 - 4.3, and centrifuged again. A fraction of 0.75 is salted out with ammonium sulfate from the resulting supernatant. The sediment is suspended in 29 - 5 ml of 0.1 M sodium chloride at pH 8.2, 70 is transferred to cellophane bags and dialyzed until a negative reaction to sulfate ion occurs. The contents of cellophane bags (retentate) are centrifuged, the supernatant liquid is applied to a column with diethylaminoethyl cellulose, which is pre-equilibrated with Tris-HCI buffer 0.025M, pH 8.15 - 8.28 with an ionic strength of 0.0135. Proteins are eluted with the same buffer on the collector. The chromatogram determined that only the protein of the second peak inhibits trypsin. This protein is salted out, diazolized, and the retentate is lyophilized. All operations with proteins are carried out in the cold (4 - 520), and chromatography - at room temperature (17 - 2022). ZBmg of a trypsin inhibitor with a specific protein activity of 1050 miU/mg is obtained (1).
Відомий спосіб одержання інгібітора трипсину шляхом подрібнення скошеної люцерни (у стадії бутонізації) з подальшим віджиманням соку. Сік підігрівають до 852. Коагульовані білки осаджують центрифугуванням, супернатант (4 2л) використовують для біоспецифічного хроматографування на трипсин-сефарозі. Колонку (150 х 15)см? з сорбентом заповнюють порцією супер-натанту, що дорівнює 250мл (зовнішній об'єм, сорбенту). Кожну порцію (всього 17 порцій) витримують у колонці у відповідності з терміном зв'язування інгібітора з трипсином.There is a known method of obtaining a trypsin inhibitor by grinding mowed alfalfa (in the stage of budding) with subsequent squeezing of the juice. The juice is heated to 852. Coagulated proteins are precipitated by centrifugation, the supernatant (4 2 l) is used for biospecific chromatography on trypsin-sepharose. Column (150 x 15) cm? with a sorbent, fill with a portion of the supernatant equal to 250 ml (external volume, sorbent). Each portion (a total of 17 portions) is kept in the column in accordance with the binding time of the inhibitor with trypsin.
Пігменти видаляють 8 об'ємами води, неспецифічно зв'язані білки десорбують 10 об'ємами 0,15М ацетатного буферного розчину з 0,3М хлориду натрію, рН 7,0. Десорбцію здійснюють 0,15М ацетатним буферним розчином с б З 0О,3М хлориду натрію при рН 7,0. Хлорид натрію відділяють промивкою б об'ємами води. Елююють 0,08М уксусною кислотою. Отримують 5Змг інгібітора трипсину, електрофоретичне гомогенного, нетоксичного: так, (8) внутрішньовенне введення препарату в дозі 5Омг, що є 20-кратною лікувальною дозою, не визиває загибелі щурів (2).Pigments are removed with 8 volumes of water, non-specifically bound proteins are desorbed with 10 volumes of 0.15M acetate buffer solution with 0.3M sodium chloride, pH 7.0. Desorption is carried out with 0.15 M acetate buffer solution with 0.3 M sodium chloride at pH 7.0. Sodium chloride is separated by washing with volumes of water. Elute with 0.08M acetic acid. Receive 5mg of trypsin inhibitor, electrophoretic homogeneous, non-toxic: yes, (8) intravenous administration of the drug in a dose of 5Omg, which is 20 times the therapeutic dose, does not cause death of rats (2).
Відомий спосіб виділення інгібітора трипсину з курячих яєць, який здійснюють таким чином. З 1Змл курячого со зо білку механічно відділяють бмл рідкого білка, екстрагують його у 20мл 2М розчину хлориду натрію протягомThere is a known method of extracting a trypsin inhibitor from chicken eggs, which is carried out in this way. From 13 ml of chicken fat and protein, 1 ml of liquid protein is mechanically separated, it is extracted in 20 ml of a 2 M sodium chloride solution for
ЗОхв. при перемішуванні при 4 - 59. Отриманий екстракт підкислюють 0,5М соляною кислотою до рН 1,5, потім (22) центрифугують 45хв. при 55009. Надосадочну рідину відділяють і витримують 28год при 4 - 592С, потім знову дз центрифугують. Отриману надосадочну рідину діалізують у целофанових мішках роти дистильованої води, підлуженої до рН 10,0 (до отримання негативної реакції на сульфатіон). Вміст целофанових мішків ЗREFERENCE with stirring at 4 - 59. The obtained extract is acidified with 0.5 M hydrochloric acid to pH 1.5, then (22) centrifuged for 45 min. at 55009. The supernatant liquid is separated and kept for 28 hours at 4 - 592C, then centrifuged again. The resulting supernatant is dialyzed in cellophane bags with a mouthful of distilled water alkalized to pH 10.0 (until a negative reaction to sulfation is obtained). Contents of cellophane bags Z
Зз5 центрифугують, а надосадкову рідину ліофілізують. Отримують 115мг препарату інгібітора трипсину, який має ою питому активність 290,2міО/мг білка (3).ZZ5 is centrifuged, and the supernatant is lyophilized. 115 mg of the trypsin inhibitor preparation is obtained, which has a specific activity of 290.2 miO/mg of protein (3).
Відомий спосіб одержання Інгібітора трипсину з зерен ячменю, який здійснюють таким чином: З0Ог зерен ярового ячменю сорту Чорноморець" подрібнюють і екстрагують 1,вл 0,1М соляної кислоти. Після діалізу проти 20-кратного надлишку дистильованої води на протязі 20год. збирають осад шляхом центрифугування. Із сухого « 720 осаду інгібітор здобувають 0,1М триетаноламіновим буфером рН 8,0 трикратними порціями по 75; 50 і 25мл. 8 с Об'єднані екстракти прогрівають на киплячій водяній бані 15хв., після чого денатуровані білки відділяють й центрифугуванням. До надосадкової рідини додають Зіг сульфату амонію (до 4095 насичення) і після и"? відстоювання на холоду на протязі ночі відділлють осад центрифугуванням. До осаду додають 100мл 01М амоній-ацетатного буферу рН 6,0, перемішують 45хв., центрифугують, супернатант ліофільно висушують.There is a known method of obtaining a trypsin inhibitor from barley grains, which is carried out as follows: 300 g of spring barley grains of the Chornomorets variety are crushed and extracted with 1.1 ml of 0.1 M hydrochloric acid. After dialysis against a 20-fold excess of distilled water for 20 hours, the precipitate is collected by centrifugation From the dry "720 sediment, the inhibitor is obtained with 0.1 M triethanolamine buffer, pH 8.0, in three-fold portions of 75, 50, and 25 ml. 8 s. The combined extracts are heated in a boiling water bath for 15 minutes, after which the denatured proteins are separated by centrifugation. To the supernatant liquid, add Zig of ammonium sulfate (up to 4095 saturation) and after i" standing in the cold overnight, separate the precipitate by centrifugation. Add 100ml of 01M ammonium-acetate buffer pH 6.0 to the precipitate, mix for 45 minutes, centrifuge, and lyophilize the supernatant.
Отримують 132г інгібітора трипсину з питомою активністю 0,61 (4). 4! Відомий спосіб одержання інгібітора трипсину з вегетативних органів люцерни, який здійснюють таким чином.132 g of trypsin inhibitor with a specific activity of 0.61 (4) are obtained. 4! There is a known method of obtaining a trypsin inhibitor from the vegetative organs of alfalfa, which is carried out in this way.
Зелену масу люцерни подрібнюють, під пресом віджимають сік, підкислюють 1М. НСІ до рН 4,2 і відділяють е коагульовані білки центрифугуванням. Отриманий сік підкислюють 2095 трихлороцтовою кислотою до кінцевої (се) концентрації 295, центрифугують, осад відкидають, надосадну рідину діалізують на холоду проти 01М с 50 ацетатного буферу рН 5,0. Хроматографію на колонці з КМ-целюлозою (3,5 х 20)см? проводять в 0,1М ацетатному буфері, рН 5,0. Білок елююють, використовуючи безперервний градієнт концентрації розчину натрію сю хлориду 0,1 - 0,5М. Афінну хроматографію інгібітора трипсину здійснюють на трипсин-сефарозі 48. Сорбцію інгібітора проводять при рН 5,0 в 0,1М ацетатном буфері, що містить 0,22М натрію хлориду і 0,01М кальцію хлориду. Елюювання інгібітора здійснюють розчином, що містить О,01М соляну кислоту, рН 2,0, 1М натрію хлориду і 1595 (по об'єму) ізопропілового спирту. Гель-хроматографію очищеного інгібітора трипсину проводять на колонці з сефадексом 0-100, урівноваженій 0,05М цитратним буфером, рН 2,7 і колонці з акрилексом П-60, о урівноваженій О0,1М ацетатним буфером, рН 5,0. Диск-електрофорез препаратів ферменту проводять у системі іме) гелів: 7,590 поліакриамідний розподіляючий гель, лужна система буферів, 1 - 5мМА на 1 стовпчик гелю. Активність інгібітора трипсину виражають у кількості трипсину (мг), інгібуємого 1мг білка препарату інгібітора (5). 60 Відомий спосіб одержання інгібіторів цистеінових протеїназ із соєвих бобів сорту "Приморська 491", який здійснюють таким чином. 1. Отримання препарату спирторозчинних білків. Подрібнену сировину знежирюють ацетоном, білки екстрагують 6095 спиртом етиловим при 5592С. Після доведення рН екстракту до 5,3 (за допомогою концентрованої НОСІ) білки висаджують двома об'ємами охолодженого ацетону при 09С, відстоюють 2,0 - 65 2,5год. при 09С, осад відокремлюють. Отриманий осад розчиняють у мінімальній кількості води, діалізують, висушують ліофільно.The green mass of alfalfa is crushed, juice is squeezed out under a press, acidified with 1M. NCI to pH 4.2 and separate the coagulated proteins by centrifugation. The resulting juice is acidified with 2095 trichloroacetic acid to a final (se) concentration of 295, centrifuged, the sediment is discarded, the supernatant is dialyzed in the cold against 01 M with 50 acetate buffer pH 5.0. Chromatography on a column with KM-cellulose (3.5 x 20) cm? carried out in 0.1M acetate buffer, pH 5.0. The protein is eluted using a continuous concentration gradient of 0.1 - 0.5M sodium chloride solution. Affinity chromatography of the trypsin inhibitor is carried out on trypsin-sepharose 48. Sorption of the inhibitor is carried out at pH 5.0 in a 0.1M acetate buffer containing 0.22M sodium chloride and 0.01M calcium chloride. Elution of the inhibitor is carried out with a solution containing 0.01 M hydrochloric acid, pH 2.0, 1 M sodium chloride and 1595 (by volume) of isopropyl alcohol. Gel chromatography of the purified trypsin inhibitor is carried out on a Sephadex 0-100 column equilibrated with 0.05M citrate buffer, pH 2.7 and on a P-60 acrylic column equilibrated with O0.1M acetate buffer, pH 5.0. Disc electrophoresis of enzyme preparations is carried out in a gel system: 7.590 polyacrylamide dividing gel, alkaline system of buffers, 1 - 5 mM per 1 gel column. The activity of trypsin inhibitor is expressed in the amount of trypsin (mg) inhibited by 1 mg of protein of the inhibitor preparation (5). 60 There is a known method of obtaining inhibitors of cysteine proteinases from soybeans of the "Primorska 491" variety, which is carried out as follows. 1. Preparation of alcohol-soluble proteins. Crushed raw materials are degreased with acetone, proteins are extracted with 6095 ethyl alcohol at 5592C. After bringing the pH of the extract to 5.3 (with the help of concentrated NOSI), proteins are planted in two volumes of cooled acetone at 09C, stand for 2.0 - 65 2.5 hours. at 09C, the sediment is separated. The resulting precipitate is dissolved in a minimum amount of water, dialyzed, and freeze-dried.
2. Виділення інгібіторів типу Баумана-Бірк. Для отримання очищених інгібіторів препарат спирторозчинних білків розчинюють у 0,1М фосфатному буфері (рН 8,0), наносять на колонку з хімотрипсин-сефарозой 48.2. Isolation of inhibitors of the Bauman-Birk type. To obtain purified inhibitors, the preparation of alcohol-soluble proteins is dissolved in 0.1M phosphate buffer (pH 8.0), applied to a column with chymotrypsin-sepharose 48.
Колонку промивають тим же буфером, який містить 0,5М натрію хлориду, потім проводять елюцію інгібітора 0,Д2М калію хлоридом при рН 2,0.The column is washed with the same buffer containing 0.5M sodium chloride, then the inhibitor is eluted with 0.D2M potassium chloride at pH 2.0.
З. Виділення інгібіторів цистеїнових протеїназ. Препарат фіцину активують у розчині, що містить 01М фосфатний буфер (рН 6,0), 2мМ цистеїн та 0,1мМ ЕДТА, протягом год. при 202С і обробляють іодацетамідом до кінцевої концентрації 10ММ. Отримане неактивне похідне фіцину приєднують до СМВг-активованої сефарози 48 у стандартних умовах. Препарат спирторозчинних білків розчиняють у 0,1М фосфатному буфері рН 80 і 7/0 перемішують з суспензією фіцин-сефарози протягом 18год. при 4 9С. Потім сорбент переносять на хроматографічну колонку і промивають 0,1М фосфатним буфером (рН 8,0), який містить 0,5М Масі. Елюцію інгібіторів проводять 0,1М Масі при рН 12,0. Елюат доводять до рН 7 - 8 за допомогою 0,24М КНоРО, (6).C. Isolation of cysteine proteinase inhibitors. The drug ficin is activated in a solution containing 01M phosphate buffer (pH 6.0), 2mM cysteine and 0.1mM EDTA for an hour. at 202C and treated with iodoacetamide to a final concentration of 10MM. The resulting inactive ficin derivative is attached to CMVg-activated sepharose 48 under standard conditions. The preparation of alcohol-soluble proteins is dissolved in 0.1 M phosphate buffer pH 80 and 7/0 is mixed with a ficin-sepharose suspension for 18 hours. at 4 9C. Then the sorbent is transferred to a chromatographic column and washed with 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0), which contains 0.5 M Mass. Elution of inhibitors is carried out with 0.1M mass at pH 12.0. The eluate is adjusted to pH 7 - 8 with the help of 0.24 M KNoRO, (6).
Відомий спосіб одержання інгібітора трипсиноподібних протеаз, який здійснюють таким чином: легені білих мишей промивають від крові фосфатним буфером (рН 7,5) при температурі 42С, потім подрібнюють, додають 75 фосфатний буфер, гомогенізують ультразвуком протягом 30 - босек. і центрифугують. Супернатант заморожують до температури -18 -202С, до осаду додають 195 розчин тритону Х-100, перемішують і поміщають на холод при температурі 4 - боб на 18 - 20год. Після цього осад гомогенізують і центрифугують при вказаних вище параметрах. І ії І супернатанти об'єднують і піддають розподілу протеази та інгібітора за допомогою іонообмінної хроматографії. Очистку інгібітора протеаз до гомогенного стану проводять за допомогою гельфільтрації на сефадексах з подальшою афінною хроматографією на трипсин-сефарозі 48. Десорбцію білків проводять фосфатним буфером і діалізом проти води з подальшою ліофільною сушкою та ампулюванням (7).There is a known method of obtaining an inhibitor of trypsin-like proteases, which is carried out as follows: the lungs of white mice are washed from blood with a phosphate buffer (pH 7.5) at a temperature of 42C, then crushed, 75% phosphate buffer is added, and homogenized with ultrasound for 30 seconds. and centrifuged. The supernatant is frozen to a temperature of -18-202С, 195% Triton X-100 solution is added to the precipitate, mixed and placed in the cold at a temperature of 4-bob for 18-20 hours. After that, the sediment is homogenized and centrifuged at the above parameters. Both supernatants are combined and subjected to separation of protease and inhibitor by ion exchange chromatography. Purification of the protease inhibitor to a homogeneous state is carried out using gel filtration on Sephadex followed by affinity chromatography on trypsin-sepharose 48. Desorption of proteins is carried out with a phosphate buffer and dialysis against water, followed by lyophilic drying and ampoulation (7).
Найбільш близьким до заявляємого є спосіб одержання інгібітора трипсину з соєвих бобів, який здійснюють таким чином. 1. Промивка 8095 спиртом етиловим. 1000г обробленої на холоді знежиреної муки з соєвих бобів додаютьдо СМ суміші з 2400мл 9595 спирту етилового, охолодженого до 5923 та 450мл води дистильованої. Суспензію ретельно о перемішують і залишають при 20 - 252С на ЗОхв. Потім фільтрують під вакуумом, фільтрат відкидають. 2. Екстракція 0,25М сірчаною кислотою. Напівсуху муку знову суспендують у 5000мл 0,25М сірчаної кислоти при 20 - 25920 і залишають на год. при кімнатній температурі, періодично перемішуючи. Суспензію знову фільтрують під вакуумом, осад відкидають. Ше 3. Видалення інертного білка. До кислого фільтрату додають 20г суміші, що вміщує рівні частини бентоніту Ф) і супер-селу, і перемішують 1Охв. Одержану суспензію фільтрують, отримують фільтрат. Осад промивають двома порціями по 125мл води (промивні води). Осад відкидають. Ме. 4. Адсорбція інгібітора на Сентоніті. «ІThe method of obtaining trypsin inhibitor from soybeans, which is carried out in this way, is the closest to the claimed one. 1. Washing 8095 with ethyl alcohol. 1000g of cold-processed defatted soybean flour is added to the CM mixture with 2400ml of 9595 ethyl alcohol cooled to 5923 and 450ml of distilled water. The suspension is thoroughly mixed and left at 20 - 252С at ЗОхв. Then it is filtered under vacuum, the filtrate is discarded. 2. Extraction with 0.25 M sulfuric acid. The semi-dry flour is again suspended in 5000 ml of 0.25 M sulfuric acid at 20 - 25920 and left for an hour. at room temperature, stirring occasionally. The suspension is again filtered under vacuum, the precipitate is discarded. Step 3. Removal of inert protein. Add 20 g of a mixture containing equal parts of bentonite F) and super-silt to the acidic filtrate, and mix for 1 hour. The obtained suspension is filtered, and the filtrate is obtained. The precipitate is washed with two portions of 125 ml of water (washing water). The sediment is discarded. Me. 4. Adsorption of the inhibitor on Sentonite. "AND
До фільтрату, який об'єднали з промивними водами після операції Мо3, повільно додають при перемішуванні 4100г суміші бентоніту і супер-селу, продовжують перемішувати ще 10Охв., після чого суспензію фільтрують, а о осад на фільтрі промивають двома порціями води по 125мл. Фільтрат і промивні води відкидають. 5. Елюція піридином та діаліз.To the filtrate, which was combined with the washing waters after the Mo3 operation, slowly add 4100 g of bentonite and super-silt mixture while stirring, continue to stir for another 10 minutes, then filter the suspension, and wash the sediment on the filter with two portions of 125 ml of water. The filtrate and washings are discarded. 5. Elution with pyridine and dialysis.
Бентонітовий осад розмішують у 270мл води, суспензію нагрівають до 259С, додають при перемішуванні «Bentonite sediment is mixed in 270 ml of water, the suspension is heated to 259C, added while stirring.
ЗОмл піридину, фільтрують, осад на фільтрі промивають 200мл 595 розчину піридину у воді. Фільтрат об'єднують 7 70 з промивною рідиною, діалізують проточною водою протягом 10 - 12год. у целофанових трубках довжиною ЗОсм. с 6. Видалення інертного матеріалу при рН 5,3. "з Діалізований розчин, вільний від клейкого осаду, доводять до рН 5,3 додаванням приблизно 2мл 1М соляної кислоти. У розчині перемішують 4г суміші бентоніту і супер-селу, фільтрують під вакуумом, осад промивають водою і відкидають. сл 15 7. Перше осадження інгібітора при рН 4,65.3 ml of pyridine, filtered, the sediment on the filter is washed with 200 ml of a 595 solution of pyridine in water. The filtrate is combined 7 70 with the washing liquid, dialyzed with running water for 10 - 12 hours. in cellophane tubes with a length of ZOcm. c 6. Removal of inert material at pH 5.3. "z The dialyzed solution, free of sticky sediment, is brought to pH 5.3 by adding approximately 2 ml of 1M hydrochloric acid. 4 g of a mixture of bentonite and super-sela are mixed in the solution, filtered under vacuum, the sediment is washed with water and discarded. sl 15 7. First sedimentation inhibitor at pH 4.65.
Фільтрат і промивні води (операція Моб) об єднують, охолоджують до 52С, титрують 1М соляною кислотою до - рН 4,65. Відфільтровують осад, що утворився. Фільтрат відкидають. Вага осаду складає 10 - 12г. о 8. Друге осадження інгібітора при рН 4,65.The filtrate and washing water (Mob operation) are combined, cooled to 52C, titrated with 1M hydrochloric acid to pH 4.65. The sediment formed is filtered. The filtrate is discarded. The weight of the sediment is 10 - 12 g. at 8. The second precipitation of the inhibitor at pH 4.65.
Отриманий осад суспендують при переміщуванні у 100мл води, охолодженої до 59С, додають по краплям 1М се) розчин гідроксиду натрію до повного розчинення осаду (рН не вище 6,4). Прозорий розчин нагрівають до 252С,The resulting sediment is suspended when moving in 100 ml of water cooled to 59C, 1M sodium hydroxide solution is added dropwise until the sediment is completely dissolved (pH not higher than 6.4). The transparent solution is heated to 252C,
ГК) титрують до утворення осаду, додають 2г супер-селу. Осад відфільтровують, промивають на фільтрі декільками мл води. Фільтрат і промивні води об'єднують, охолоджують до 59С, титрують до рН 4,65. Одержаний осад відфільтровують, вихід становить 8 - 10г. Фільтрат відкидають. 9. Кристалізація.HC) titrate until a precipitate is formed, add 2 g of super-seltzer. The precipitate is filtered, washed on the filter with several ml of water. The filtrate and washing water are combined, cooled to 59C, titrated to pH 4.65. The resulting precipitate is filtered, the yield is 8 - 10 g. The filtrate is discarded. 9. Crystallization.
Отриманий від операції Мо8 осад (приблизно 10г) розтирають у 1Омл холодної води до отримання суспензії, іФ) потім нагрівають до 35923. Додають по краплям при ретельному перемішуванні 0,5М розчин гідроксиду натрію до ко повного розчинення осаду і до рН 5,2, залишають для кристалізації при 35 - 37 «С протягом 5 - бгод. Осад відділяють за допомогою центрифугування. 60 10. Перекристалізація.The precipitate obtained from the Mo8 operation (approximately 10 g) is ground in 1 ml of cold water to obtain a suspension, iF) then heated to 35923. Add dropwise with thorough stirring a 0.5 M sodium hydroxide solution until the precipitate is completely dissolved and the pH is 5.2, leave for crystallization at 35 - 37 "C for 5 - bh. The precipitate is separated by centrifugation. 60 10. Recrystallization.
Отриманий кристалічний осад розмішують у подвійній кількості холодної води та титрують 0,5М розчином гідроксиду натрію до одержання прозорого розчину і до рН 6,0. Прозорий розчин нагрівають до 352 і титрують 0,5М розчином соляної кислоти до рН 5,1 до отримання слабкого осаду, додають 2г супер-селу і фільтрують до тих пір, поки розчин не стане прозорим. У фільтрат додають затравку і залишають при 36 - 3720. Поступово 65 утворюється густа суспензія кристалів, яку через 5 - бгод. відділяють центрифугуванням. Осад зберігають приThe resulting crystalline precipitate is mixed in a double amount of cold water and titrated with a 0.5 M sodium hydroxide solution until a clear solution is obtained and the pH is 6.0. The clear solution is heated to 352 and titrated with 0.5 M hydrochloric acid solution to pH 5.1 until a weak precipitate is obtained, 2 g of super sel is added and filtered until the solution becomes clear. Inoculum is added to the filtrate and left at 36 - 3720. Gradually 65 a thick suspension of crystals is formed, which after 5 - bhd. separated by centrifugation. The sediment is stored at
590. Додаванням 1 - 2 крапель розчину 0,2М соляної кислоти доводять рН відстою до рН 5,1, вводять затравку і розчин залишають ще на декілька годин при 36 - 372 для отримання додаткової порції кристалів, яку відділяють таким же чином, як описано вище. Можна ще отримати кристали з кінцевого відстою, якщо його охолодити до 52С і додати 0,25 об'єму холодного 9595 спирту етилового, як описано у наступному розділі. 11. Кристалізація з розбавленого спирту.590. By adding 1 - 2 drops of a 0.2 M hydrochloric acid solution, the pH of the sediment is brought to pH 5.1, the seed is introduced and the solution is left for several more hours at 36 - 372 to obtain an additional portion of crystals, which is separated in the same way as described above . Crystals can still be obtained from the final residue if it is cooled to 52C and 0.25 volume of cold 9595 ethyl alcohol is added, as described in the next section. 11. Crystallization from diluted alcohol.
Отримані кристали розмішують у п'ятикратному об'ємі холодної води і додають по краплям розчин 0,5М гідроксиду натрію до повного розчинення кристалів до рН розчину не вище 6,6. Прозорий розчин титрують 0,2М соляної кислоти до рН 5,2, до утвореного осаду додають супер-сел з розрахунку 4г на 100мл розчину, осад 70 відділяють і промивають на фільтрі незначною кількістю води. Фільтрат охолоджують до 52С, повільно додають чверть об'єму охолодженого 9595 спирту етилового для утворення осаду. Додаванням розчину 0,2М соляної кислоти доводять рН суміші до 5,0 і залишають її при 3020. Аморфний осад перетворюється на протязі 2год. у кристалічний, який швидко осідає на дно ємності. Відстій розчину кожну годину декантують, доводять розчином соляної кислот до рН 5,0 і повертають до основної ємності. Так повторюють протягом декількох годин до повного припинення появи осаду при рН 5,0. Після цього суміш, яка кристалізується, витримують ще ЗОхв. при 30 20.The obtained crystals are mixed in five times the volume of cold water and a solution of 0.5 M sodium hydroxide is added dropwise until the crystals are completely dissolved to a pH of the solution no higher than 6.6. The clear solution is titrated with 0.2 M hydrochloric acid to pH 5.2, super-sel is added to the formed precipitate at the rate of 4 g per 100 ml of solution, the precipitate is separated and washed on a filter with a small amount of water. The filtrate is cooled to 52C, a quarter of the volume of cooled 9595 ethyl alcohol is slowly added to form a precipitate. By adding a solution of 0.2 M hydrochloric acid, the pH of the mixture is brought to 5.0 and left at 3020. The amorphous precipitate is transformed over the course of 2 hours. into the crystalline, which quickly settles to the bottom of the container. The sediment of the solution is decanted every hour, adjusted to pH 5.0 with a solution of hydrochloric acid and returned to the main container. This is repeated for several hours until the appearance of sediment at pH 5.0 is completely stopped. After that, the mixture, which crystallizes, is kept for another ЗОхв. at 30 20.
Утворений осад відфільтровують і висушують при кімнатній температурі протягом 24год. 12. Перекристалізація із спирту етилового.The precipitate formed is filtered and dried at room temperature for 24 hours. 12. Recrystallization from ethyl alcohol.
Сухі кристали суспендують у тридцятикратному (по відношенню до їх ваги) об'ємі холодної води, витримують 5 - 10хв., а потім обробляють таким же чином, як і в операції Мо11.Dry crystals are suspended in thirty times (relative to their weight) volume of cold water, kept for 5-10 min., and then processed in the same way as in operation Mo11.
Вихід кристалів інгібітора трипсину змінюється у залежності від сорту муки і, в середньому, становить приблизно 1г з 1000г сировини - 0,190 (8).The yield of trypsin inhibitor crystals varies depending on the type of flour and, on average, is approximately 1g from 1000g of raw material - 0.190 (8).
До недоліків способу- прототипу слід віднести багатостадійність, значну тривалість процесу, невисокий вихід цільового продукту, великі енерго- та трудовитрати, екологічну забрудненість виробництва.Disadvantages of the prototype method include multistage, significant process duration, low output of the target product, high energy and labor costs, and environmental pollution of production.
В основу винаходу поставлено завдання створення способу одержання з рослинної сировини інгібітора с трипсину шляхом підбору технологічних операцій у такій послідовності та взаємозв'язку і з такими режимами та Ге) параметрами, які б забезпечили підвищення виходу цільового продукту, спрощення технологічного процесу шляхом зменшення кількості стадій і їх тривалості у часі, скорочення енерго- і трудовитрат, екологічну чистоту виробництва.The invention is based on the task of creating a method of obtaining a trypsin inhibitor from vegetable raw materials by selecting technological operations in such a sequence and relationship and with such modes and parameters that would ensure an increase in the yield of the target product, simplification of the technological process by reducing the number of stages and their duration in time, reduction of energy and labor costs, ecological cleanliness of production.
Поставлене завдання вирішується тим, що у способі одержання інгібітора трипсину з рослинної сировини, що і) включає підготовку насіння сої шляхом його подрібнення, екстракцію, відділення екстракту від шроту, очистку Ф екстракту від супутніх білків, адсорбцію інгібітора трипсину та промивку його на сорбенті, елюювання інгібітора трипсину розчинником, відмивання елюату від домішок, фільтрацію очищеного елюату, висушування (22) цільового продукту, згідно з винаходом, при підготовці сировини перед подрібненням здійснюють замочування « насіння сої у воді для набухання протягом 10 - 12год., екстракцію сировини здійснюють водою очищеноюThe task is solved by the fact that in the method of obtaining a trypsin inhibitor from vegetable raw materials, which i) includes preparation of soybean seeds by grinding them, extraction, separation of the extract from the meal, purification of the extract from accompanying proteins, adsorption of the trypsin inhibitor and washing it on a sorbent, elution trypsin inhibitor with a solvent, washing the eluate from impurities, filtering the purified eluate, drying (22) the target product, according to the invention, during the preparation of raw materials before grinding, soybean seeds are soaked in water for swelling for 10-12 hours, extraction of raw materials is carried out with purified water
Зо одночасно з подрібненням, відділення екстракту від шроту проводять за допомогою центрифугування або що) фільтрації під вакуумом, очистка екстракту від супутніх білків включає їх осадження шляхом додавання до екстракту, лимонної кислоти або оцтової кислоти, або трихлороцтової кислоти, або сульфату кальцію, або хлориду кальцію з подальшим відділенням осаджених продуктів центрифугуванням або фільтрацієй під « вакуумом, обробку одержаного екстракту інгібітора трипсину здійснюють на ультрафільтраційній установці шляхом його діафільтрації та концентрації, для адсорбції інгібітора трипсину використовують як біоспецифічні о) с сорбенти трипсин-сефарозу або трипсин-целюлозу, або ензайт-трипсин, або трипсин-тойоперл та буфер 0,045 - "» 0,О5М трис-НСЇ з рН 7,0 - 8,0, а промивку його на сорбенті проводять спочатку буфером 0,045 - О0,05М трис-НеСЇ " з рН 7,0 - 8,0, потім 0,5 - 0,7М натрію хлориду та водою очищеною, елюювання інгібітора трипсину проводять підкисленою до рн 2,0 - 2,5 водою, або підкисленою водою з додаванням 0,15 - О0,20М натрію хлориду, або 0,20 - 0,25М калію хлориду, відмивання елюату від домішок здійснюють електродіалізом або діафільтрацією з 1 подальшим його концентруванням, а висушування продукту здійснюють шляхом ліофілізації, причому після їх відмивання елюату від домішок та перед висушуванням його піддають стерильній фільтрації у випадку створення стерильних лікарських засобів, таких, як ін'єкційні та інфузійні розчини або стерильні мазі та інші се) стерильні місцеві засоби. со 20 Технічний результат, якого досягають при здійсненні винаходу, полягає у розробці способу одержання інгібітора трипсину з рослинної сировини, який, за рахунок підбору технологічних операцій у такій с» послідовності та взаємозв'язку і з такими режимами та параметрами, забезпечує підвищення виходу цільового продукту, спрощення технологічного процесу шляхом зменшення кількості стадій і їх тривалості у часі, скорочення енерго- і трудовитрат, екологічну чистоту виробництва. 99 Наводимо конкретні приклади здійснення винаходу.At the same time as grinding, the separation of the extract from the meal is carried out using centrifugation or vacuum filtration, the purification of the extract from accompanying proteins includes their precipitation by adding citric acid or acetic acid, or trichloroacetic acid, or calcium sulfate, or calcium chloride to the extract with subsequent separation of the precipitated products by centrifugation or filtration under vacuum, processing of the obtained trypsin inhibitor extract is carried out on an ultrafiltration unit by diafiltration and concentration, for the adsorption of the trypsin inhibitor, trypsin-sepharose or trypsin-cellulose, or enzyme-trypsin are used as biospecific sorbents , or trypsin-toioperl and buffer 0.045 - "» 0.05M Tris-HCl with pH 7.0 - 8.0, and its washing on the sorbent is carried out first with buffer 0.045 - 0.05M Tris-HCl" with pH 7.0 - 8.0, then 0.5 - 0.7M sodium chloride and purified water, elution of the trypsin inhibitor is carried out with water acidified to pH 2.0 - 2.5, or deacidified water with the addition of 0.15 - 0.20 M sodium chloride or 0.20 - 0.25 M potassium chloride, washing the eluate from impurities is carried out by electrodialysis or diafiltration with 1 subsequent concentration, and drying of the product is carried out by lyophilization, and after washing eluate from impurities and before drying it is subjected to sterile filtration in the case of creating sterile medicinal products, such as injection and infusion solutions or sterile ointments and other se) sterile local means. со 20 The technical result achieved during the implementation of the invention consists in the development of a method for obtaining a trypsin inhibitor from plant raw materials, which, due to the selection of technological operations in such a sequence and interrelationship and with such modes and parameters, ensures an increase in the yield of the target product , simplification of the technological process by reducing the number of stages and their duration in time, reduction of energy and labor costs, environmental cleanliness of production. 99 We give concrete examples of the implementation of the invention.
ГФ! Приклад 1. 5кг промитого насіння сої замочують у воді очищеній при температурі 42С для набухання протягом 1Огод. Воду зливають, а розбухле насіння сої заливають 50л води очищеної і екстрагують, одночасно ді подрібнюючи сировину у середовищі екстрагенту. Отриману суміш центрифугують або фільтрують під вакуумом для відділення екстракту від шроту, після чого отриманий екстракт інгібітора трипсину передають на стадію 60 очистки, яку здійснюють у декілька етапів. Спочатку для осадження супутніх білків до екстракту додають при перемішуванні кислоту лимонну до рН 3,5 - 4,0, після чого осаджені білки відділяють на центрифузі при 100049 протягом 15бхв. або фільтрують під вакуумом. Одержаний прозорий екстракт інгібітора трипсину на ультрафільтраційній установці діафільтрують до відсутності білків і пігментів і концентрують до 1,Ол.GF! Example 1. 5 kg of washed soybean seeds are soaked in purified water at a temperature of 42C for swelling for 1 hour. The water is drained, and the swollen soybean seeds are poured with 50 liters of purified water and extracted, simultaneously grinding the raw materials in the medium of the extractant. The resulting mixture is centrifuged or filtered under vacuum to separate the extract from the meal, after which the obtained trypsin inhibitor extract is transferred to stage 60 of purification, which is carried out in several stages. First, to precipitate accompanying proteins, citric acid is added to the extract with stirring to a pH of 3.5 - 4.0, after which the precipitated proteins are separated in a centrifuge at 100049 for 15 minutes. or filtered under vacuum. The obtained clear extract of the trypsin inhibitor is diafiltered on an ultrafiltration unit to the absence of proteins and pigments and concentrated to 1.Ol.
Подальшу очистку одержаного концентрату інгібітора трипсину здійснюють методом афінної хроматографії на бо хроматографічній колонці, що заповнена біоспецифічним сорбентом трипсин-сефорозою з попереднім урівноваженням 0,045М трис-НСІ буфером з рН 7,0. Колонку відмивають від неспецифічно зв'язаних білків цим же буфером з подальшою промивкою розчином 0,5М натрію хлориду. Видаляють буфер водою очищеною і елююють інгібітор трипсину підкисленою до рН 2,0 водою. Одержаний елюат відмивають від кислоти електродіалізом або діафільтрацією, концентрують, розливають у ємності і ліофілізують. Вихід інгібітора трипсину становить 8,0.Further purification of the obtained trypsin inhibitor concentrate is carried out by the method of affinity chromatography on a chromatographic column filled with a biospecific trypsin-sephorose sorbent pre-equilibrated with 0.045M Tris-HCl buffer with pH 7.0. The column is washed from nonspecifically bound proteins with the same buffer followed by washing with a 0.5M sodium chloride solution. Remove the buffer with purified water and elute the trypsin inhibitor with water acidified to pH 2.0. The resulting eluate is washed from acid by electrodialysis or diafiltration, concentrated, poured into containers and lyophilized. The trypsin inhibitor yield is 8.0.
Приклад 2. 5кг промитого насіння сої замочують у воді очищеній при температурі 62С для набухання протягом 11год. Воду зливають, а розбухле насіння сої заливають 50л води очищеної і екстрагують, одночасно подрібнюючи сировину у середовищі екстрагенту. Отриману суміш центрифугують при 15009 протягом 12хв. або 70 фільтрують під вакуумом для відділення екстракту від шроту, після чого отриманий екстракт інгібітора трипсину передають на стадію очистки, яку здійснюють у декілька етапів. Спочатку для осадження супутніх білків до екстракту додають при перемішуванні кислоту оцтову до рН 2,0 - 4,0, після чого осаджені білки відділяють на центрифузі або фільтрують під вакуумом. Одержаний прозорий екстракт інгібітора трипсину на ультрафільтраційній установці діафільтрують до відсутності білків і пігментів і концентрують до 1,1л. 75 Подальшу очистку одержаного концентрату інгібітора трипсину здійснюють методом афінної хроматографії на хроматографічній колонці, що заповнена біоспецифічним сорбентом трипсин-сефарозою з попереднім урівноваженням 0,045М трис-НСІ буфером з рН 7,5. Колонку відмивають від неспецифічно зв'язаних білків цим же буфером з подальшою промивкою розчином 0,5М натрію хлориду. Видаляють буфер водою очищеною і елюють інгібітор трипсину підкисленою до рН 2,0 водою. Одержаний елюат відмивають від кислоти 2о електродіалізом або діафільтрацією, концентрують, розливають у ємності і ліофілізують. Вихід інгібітора трипсину становить 8,5г.Example 2. 5 kg of washed soybean seeds are soaked in purified water at a temperature of 62C for swelling for 11 hours. The water is drained, and the swollen soybean seeds are poured with 50 liters of purified water and extracted, simultaneously grinding the raw materials in the medium of the extractant. The resulting mixture is centrifuged at 1500 g for 12 minutes. or 70 is filtered under vacuum to separate the extract from the meal, after which the obtained trypsin inhibitor extract is transferred to the stage of purification, which is carried out in several stages. First, to precipitate accompanying proteins, acetic acid is added to the extract with stirring to a pH of 2.0 - 4.0, after which the precipitated proteins are separated in a centrifuge or filtered under vacuum. The obtained transparent extract of the trypsin inhibitor is diafiltered on an ultrafiltration unit to the absence of proteins and pigments and concentrated to 1.1 l. 75 Further purification of the obtained trypsin inhibitor concentrate is carried out by the method of affinity chromatography on a chromatographic column filled with a biospecific sorbent trypsin-Sepharose with a preliminary equilibration with 0.045M Tris-HCI buffer with pH 7.5. The column is washed from nonspecifically bound proteins with the same buffer followed by washing with a 0.5M sodium chloride solution. Remove the buffer with purified water and elute the trypsin inhibitor with water acidified to pH 2.0. The resulting eluate is washed from 2o acid by electrodialysis or diafiltration, concentrated, poured into containers and lyophilized. The yield of trypsin inhibitor is 8.5 g.
Приклад 3. 5кг промитого насіння сої замочують у воді очищеній при температурі 82С для набухання протягом 12год. Воду зливають, а розбухле насіння сої заливають 50л води очищеної і екстрагують, одночасно подрібнюючи сировину у середовищі екстрагенту. Отриману суміш центрифугують при 20009 протягом 1Охв. або с фільтрують під вакуумом для відділення екстракту від шроту, після чого отриманий екстракт інгібітора трипсину передають на стадію очистки, яку здійснюють у декілька етапів. Спочатку для осадження супутніх білків до о екстракту додають при перемішуванні кислоту трихлороцтову до рН 2,0 - 3,0, після чого осаджені білки відділяють на центрифузі або фільтрують під вакуумом. Одержаний прозорий екстракт інгібітора трипсину на ультрафільтраційній установці діафільтрують до відсутності білків і пігментів і концентрують до 1,2л. «9Example 3. 5 kg of washed soybean seeds are soaked in purified water at a temperature of 82C for swelling for 12 hours. The water is drained, and the swollen soybean seeds are poured with 50 liters of purified water and extracted, simultaneously grinding the raw materials in the medium of the extractant. The resulting mixture is centrifuged at 20009 for 1 hour. or c is filtered under vacuum to separate the extract from the meal, after which the obtained trypsin inhibitor extract is transferred to the stage of purification, which is carried out in several stages. First, to precipitate accompanying proteins, trichloroacetic acid is added to the extract with stirring to a pH of 2.0 - 3.0, after which the precipitated proteins are separated in a centrifuge or filtered under vacuum. The obtained transparent extract of the trypsin inhibitor is diafiltered on an ultrafiltration unit to the absence of proteins and pigments and concentrated to 1.2 liters. "9
Подальшу очистку одержаного концентрату інгібітора трипсину здійснюють методом афінної хроматографії на хроматографічній колонці, що заповнена біоспецифічним сорбентом трипсин-целюлозою з попереднім о урівноваженням 0,05М трис-НСІ буфером з рН 7,8. Колонку відмивають від неспецифічно зв'язаних білківцим же Фд) буфером з подальшою промивкою розчином О0,6М натрію хлориду. Видаляють буфер водою очищеною і елююють інгібітор трипсину підкисленою до рнН 2,0 - 2,5 водою з додаванням 0,15М натрію хлориду. Одержаний З елюат відмивають від кислоти електродіалізом або діафільтрацією, концентрують, стерильно фільтрують (для юю ін'єкційних або інфузійних розчинів, або для стерильних мазей та інших стерильних місцевих лікарських засобів), розливають у ємності і ліофілізують. Вихід інгібітора трипсину становить 9,Ог.Further purification of the obtained trypsin inhibitor concentrate is carried out by the method of affinity chromatography on a chromatographic column filled with a biospecific trypsin-cellulose sorbent with a preliminary equilibration with 0.05M Tris-HCl buffer with pH 7.8. The column is washed from non-specifically bound proteins with Fd) buffer followed by washing with a 0.6M sodium chloride solution. Remove the buffer with purified water and elute the trypsin inhibitor with water acidified to pH 2.0 - 2.5 with the addition of 0.15M sodium chloride. The resulting C eluate is washed from acid by electrodialysis or diafiltration, concentrated, sterile filtered (for injection or infusion solutions, or for sterile ointments and other sterile local medicinal products), poured into containers and lyophilized. The yield of trypsin inhibitor is 9.Og.
Приклад 4. 5кг промитого насіння сої замочують у воді очищеній при температурі 42С для набухання « протягом 1Огод. Воду зливають, а розбухле насіння сої заливають 50л води очищеної і екстрагують, одночасно подрібнюючи сировину у середовищі екстрагенту. Отриману суміш центрифугують при 10009 протягом 15хв. або - с фільтрують під вакуумом для відділення екстракту від шроту, після чого отриманий екстракт інгібітора трипсину а передають на стадію очистки, яку здійснюють у декілька етапів. Спочатку для осадження супутніх білків до "» екстракту додають при перемішуванні кальцію сульфат, після чого осаджені білки відділяють на центрифузі або фільтрують під вакуумом. Одержаний прозорий екстракт інгібітора трипсину на ультрафільтраційній установці діафільтрують до відсутності білків і пігментів і концентрують до 1,4л. Подальшу очистку одержаного 1 концентрату інгібітора трипсину здійснюють методом афінної хроматографії на хроматографічній колонці, що їз заповнена біоспецифічним сорбентом ензайт-трипсином з попереднім урівноваженням 0,05М трис-НСІ буфером з рН 8,0. Колонку відмивають від неспецифічно зв'язаних білків цим же буфером з подальшою промивкою (Се) розчином 0,7М натрію хлориду. Видаляють буфер водою очищеною і елююють інгібітор трипсину підкисленою до с 50 рН 2,0 - 2,5 водою з додаванням 0,2М натрію хлориду. Одержаний елюат відмивають від кислоти електродіалізом або діафільтрацією, концентрують, стерильно фільтрують (для ін'єкційних або інфузійних сю розчинів, або для стерильних мазей та інших стерильних місцевих лікарських засобів), розливають у ємності і ліофілізують. Вихід інгібітора трипсину становить 9,5г.Example 4. 5 kg of washed soybean seeds are soaked in purified water at a temperature of 42C for swelling for 1 hour. The water is drained, and the swollen soybean seeds are poured with 50 liters of purified water and extracted, simultaneously grinding the raw materials in the medium of the extractant. The resulting mixture is centrifuged at 10,000 for 15 minutes. or - c is filtered under vacuum to separate the extract from the meal, after which the obtained extract of the trypsin inhibitor and is transferred to the purification stage, which is carried out in several stages. First, calcium sulfate is added to the "" extract to precipitate accompanying proteins while stirring, after which the precipitated proteins are separated in a centrifuge or filtered under vacuum. The resulting clear extract of the trypsin inhibitor is diafiltered on an ultrafiltration unit until the absence of proteins and pigments and concentrated to 1.4 liters. Further purification of the obtained 1 trypsin inhibitor concentrate is carried out by the method of affinity chromatography on a chromatographic column filled with a biospecific enzyme-trypsin sorbent pre-equilibrated with 0.05 M Tris-HCI buffer with pH 8.0. The column is washed from non-specifically bound proteins with the same buffer, followed by washing (Ce) with a 0.7 M sodium chloride solution. Remove the buffer with purified water and elute the trypsin inhibitor with water acidified to pH 2.0 - 2.5 with 0.2 M sodium chloride. The resulting eluate is washed from acid by electrodialysis or diafiltration, concentrated , sterile filtered (for injection or infusion solutions, or d for sterile ointments and other sterile local medicines), pour into containers and lyophilize. The yield of trypsin inhibitor is 9.5 g.
Приклад 5. 5кг промитого насіння сої замочують у воді очищеній при температурі 89 для набухання протягом 12год. Воду зливають, а розбухле насіння сої заливають 50л води очищеної і екстрагують, одночасно о подрібнюючи сировину у середовищі екстрагенту. Отриману суміш центрифугують при 10009 протягом 15хв. або фільтрують під вакуумом для відділення екстракту від шроту, після чого отриманий екстракт інгібітора трипсину іме) передають на стадію очистки, яку здійснюють у декілька етапів. Спочатку для осадження супутніх білків до екстракту додають при перемішуванні кальцію хлорид, після чого осаджені білки відділяють на центрифузі або бо фільтрують під вакуумом. Одержаний прозорий екстракт інгібітора трипсину на ультрафільтраційній установці діафільтрують до відсутності білків і пігментів і концентрують до 1,5л. Подальшу очистку одержаного концентрату інгібітора трипсину здійснюють методом афінної хроматографії на хроматографічній колонці, що заповнена біоспецифічним сорбентом трипсин-тойоперлом з попереднім урівноваженням 0,05М трис-НСЇІ буфером з рН 8,0. Колонку відмивають від неспецифічно зв'язаних білків цим же буфером з подальшою 65 промивкою розчином 0,5М натрію хлориду. Видаляють буфер водою очищеною і елююють інгібітор трипсину підкисленою до рН 2,0 водою з додаванням 0,20 - 0,25М калію хлориду. Одержаний елюат відмивають від кислоти електродіалізом або діафільтрацією, концентрують, стерильно фільтрують (для ін'єкційних розчинів або стерильних мазей та інших місцевих засобів), розливають у ємності і ліофілізують. Вихід інгібітора трипсину становить 10,Ог.Example 5. 5 kg of washed soybean seeds are soaked in purified water at a temperature of 89 for swelling for 12 hours. The water is drained, and the swollen soybean seeds are poured with 50 liters of purified water and extracted, simultaneously grinding the raw materials in the medium of the extractant. The resulting mixture is centrifuged at 10,000 for 15 minutes. or filtered under vacuum to separate the extract from the meal, after which the resulting trypsin inhibitor extract (namely) is transferred to the stage of purification, which is carried out in several stages. First, to precipitate accompanying proteins, calcium chloride is added to the extract while stirring, after which the precipitated proteins are separated in a centrifuge or filtered under vacuum. The obtained transparent extract of the trypsin inhibitor is diafiltered on an ultrafiltration unit to the absence of proteins and pigments and concentrated to 1.5 l. Further purification of the obtained trypsin inhibitor concentrate is carried out by the method of affinity chromatography on a chromatographic column filled with a biospecific sorbent trypsin-toiopearl with preliminary equilibration with 0.05M Tris-HCII buffer with pH 8.0. The column is washed from nonspecifically bound proteins with the same buffer followed by 65 washes with a 0.5M sodium chloride solution. Remove the buffer with purified water and elute the trypsin inhibitor with water acidified to pH 2.0 with the addition of 0.20 - 0.25M potassium chloride. The resulting eluate is washed from acid by electrodialysis or diafiltration, concentrated, sterile filtered (for injection solutions or sterile ointments and other topical agents), poured into containers and lyophilized. The yield of trypsin inhibitor is 10.Og.
У значній мірі вихід інгібітора залежить від якості сировини, тобто вмісту інгібітора трипсину в ній.To a large extent, the output of the inhibitor depends on the quality of the raw material, that is, the content of the trypsin inhibitor in it.
Заявляємим способом отримують цільовий продукт (інгібітор трипсину) - порошок білого або білого з жовтуватим відтінком кольору.The claimed method produces the target product (trypsin inhibitor) - a white or white powder with a yellowish tinge.
Інгібітор трипсину, одержаний по заявляємому способу, проявляє інгібуючу активність по відношенню до таких ферментів, як трипсин, хімотрипсин і фібринолізин (плазмін) і може бути використаний у різних 7/0 лікарських формах: у формі ін'єкційних та інфузійних розчинів, у таблетованій формі, у капсулах, супозиторіях, мазях та ін. Фармакологічними дослідженнями встановлено, що отриманий інгібітор трипсину є нетоксичним.The trypsin inhibitor obtained by the claimed method exhibits inhibitory activity against such enzymes as trypsin, chymotrypsin and fibrinolysin (plasmin) and can be used in various 7/0 dosage forms: in the form of injection and infusion solutions, in tablet form , in capsules, suppositories, ointments, etc. Pharmacological studies have established that the obtained trypsin inhibitor is non-toxic.
Білкові інгібітори протеолітичних ферментів грають важливу роль у підтримці гомеостазу. Вони беруть участь у регулюванні функцій протеаз шлунково-кишкового тракту, кровоносної системи, клітин шкіри та інших органів і тканин. Численними доклінічними і клінічними дослідженнями доведено, що активація протеаз є основним фактором у ланцюзі патогенезу таких тяжких захворювань людини, як панкреатити різної етіології, захворювання системи згортання крові, шокові та алергічні стани, різні запальні процеси та ін. Уведення до схеми лікування цих захворювань препаратів на основі інгібіторів протеолітичних ферментів дозволяє швидко купірувати біль і знизити розвиток патологічного процесу. З цією метою застосовують інгібітори синтетичного і го тваринного походження. Зараз у клініках використовують такі препарати, як контрикал, трасілол, гордокс, амінокапронову кислоту та ін.Protein inhibitors of proteolytic enzymes play an important role in maintaining homeostasis. They are involved in regulating the functions of proteases of the gastrointestinal tract, circulatory system, skin cells and other organs and tissues. Numerous preclinical and clinical studies have proven that the activation of proteases is the main factor in the chain of pathogenesis of such serious human diseases as pancreatitis of various etiologies, diseases of the blood coagulation system, shock and allergic states, various inflammatory processes, etc. The introduction of drugs based on inhibitors of proteolytic enzymes into the scheme of treatment of these diseases makes it possible to quickly relieve pain and reduce the development of the pathological process. For this purpose, inhibitors of synthetic and animal origin are used. Currently, clinics use such drugs as Kontrical, Trasilol, Gordox, aminocaproic acid, etc.
Потреба в інгібіторах протеаз задовольняється, в основному, за рахунок препаратів тваринного походження, що імпортуються, і які часто є недоступними для населення через високу вартість, а також можуть ставати джерелом алергізації організму через присутність у їх складі супутніх білків, пігментів та інших домішок. У сч ов Зв'язку з цим актуальною є задача створення вітчизняних антипротеазних препаратів, особливо, на основі рослинної сировини, а також розробки ефективних способів їх одержання. і)The need for protease inhibitors is met, mainly, at the expense of imported drugs of animal origin, which are often unavailable to the public due to their high cost, and can also become a source of body allergy due to the presence of associated proteins, pigments, and other impurities in their composition. In connection with this, the task of creating domestic antiprotease drugs, especially based on plant raw materials, as well as the development of effective methods of their production, is urgent. and)
Заявляємий спосіб одержання інгібітора трипсину має такі переваги перед прототипом і аналогами: збільшення виходу цільового продукту за рахунок оптимізації технологічного процесу; спрощення процесу одержання цільового продукту за рахунок зменшення кількості технологічних стадій, со зо скорочення термінів їх проведення (наприклад, відсутність стадії знежирення сировини органічними розчинниками, які негативно впливають на організм людини); б» комплексна переробка рослинної сировини; б екологічна чистота технології (наприклад, за рахунок підібраних для проведення процесу умов і реактивів, які не проявляють негативного впливу на організм людини), що дозволяє використовувати відходи виробництва - (шрот, білки після стадії осадження) як харчові продукти (окара, тофу - соєвий сир); ю отримання цільового продукту високої якості шляхом використання для його виробництва обладнання, що вже є у наявності на вітчизняних хіміко-фармацевтичних підприємствах.The proposed method of obtaining a trypsin inhibitor has the following advantages over the prototype and analogs: increasing the yield of the target product due to optimization of the technological process; simplification of the process of obtaining the target product due to the reduction of the number of technological stages, thereby shortening the terms of their implementation (for example, the absence of the stage of degreasing raw materials with organic solvents, which have a negative effect on the human body); b" complex processing of plant raw materials; b environmental cleanliness of the technology (for example, due to the conditions and reagents selected for the process, which do not have a negative effect on the human body), which allows the use of production waste - (meal, proteins after the sedimentation stage) as food products (okara, tofu - soy cheese); obtaining a target product of high quality by using equipment for its production that is already available at domestic chemical and pharmaceutical enterprises.
Взаємозв'язок і послідовність технологічних операцій заявляємого способу, підбір режимів і параметрів повністю забезпечують виконання поставленого завдання. «The relationship and sequence of technological operations of the claimed method, the selection of modes and parameters fully ensure the fulfillment of the task. "
Попереднє набухання насіння сої у середовищі води інтенсифікує технологічний процес одержання інгібітора пев) с трипсину.Preliminary swelling of soybean seeds in a water medium intensifies the technological process of obtaining a specific trypsin inhibitor.
Й Вода є найбільш прийнятним розчинником для проведення процесу набухання, тому що являється найбільш и?» біологічно придатною складовою частиною рослинної сировини, завдяки чому швидко відбувається її дифузія у клітини і міжклітинний простір. Термін процесу замочування насіння сої, що становить 10 - 12год., необхідний для повноцінного набухання сировини з метою оптимізації процесу подрібнення, а також підвищення виходу с цільового продукту. При тривалості замочування менше заявляємих значень не досягається необхідний рівень набухання насіння, при значеннях більше заявляємих - у воду для замочування відбувається небажане ве виділення (екстракція) цільового продукту.Water is the most suitable solvent for the swelling process, because it is the most a biologically suitable component of plant raw materials, due to which its diffusion into cells and intercellular space occurs quickly. The duration of the soaking process of soybean seeds, which is 10-12 hours, is necessary for the complete swelling of the raw material in order to optimize the grinding process, as well as to increase the yield of the target product. If the duration of soaking is less than the stated values, the required level of seed swelling is not reached, if the values are longer than the stated values, unwanted separation (extraction) of the target product occurs in the water for soaking.
Ге) Використання води для проведення екстракції обумовлено належною розчинністю цільового продукта у воді, 5о а також необхідністю збереження високого рівня біологічної активності інгібітора трипсину, економією ік сировини, енерго- і трудовитрат. При цьому зберігається необхідний фармакотерапевтичний ефект цільового сю продукту.Ge) The use of water for extraction is due to the proper solubility of the target product in water, 5o, as well as the need to maintain a high level of biological activity of the trypsin inhibitor, saving raw materials, energy and labor costs. At the same time, the necessary pharmacotherapeutic effect of the target product is preserved.
Подрібнення сировини у середовищі екстрагенту скорочує тривалість технологічного процесу і спрощує його за рахунок об'єднання стадій подрібнення і екстрагування. 5Б Екстрагування цільового продукту водою з подальшим осадженням супутніх білків харчовими кислотами (наприклад, оцтової, лимонної) дозволяє використовувати відходи виробництва (шрот, білки після осадження) якGrinding raw materials in an extractant medium shortens the duration of the technological process and simplifies it due to combining the stages of grinding and extraction. 5B Extraction of the target product with water followed by precipitation of accompanying proteins with food acids (for example, acetic, citric) allows the use of production waste (meal, proteins after precipitation) as
Ф) харчові продукти (окара, тофу). ка Для успішного здійснення заявляємого способу велика увага була приділена умовам подрібнення рослинної сировини, водної екстракції та очищення цільової речовини, як найвразливішим стадіям процесу, при яких бор Можуть спостерігатися втрати цільового продукту.F) food products (okara, tofu). For the successful implementation of the proposed method, great attention was paid to the conditions of crushing plant raw materials, water extraction and purification of the target substance, as the most vulnerable stages of the process, in which losses of the target product can be observed.
Подрібнення і екстракція за заявляємим способом здійснювалися у "цадящому" режимі із застосуванням інтенсивної технології - подрібнення проводилося одночасно з екстракцією при оптимальному співвідношенні екстрагент-сировина, у певних температурних і часових умовах екстрагування, завдяки чому зберігається біологічна активність цільового продукту. Таким чином, в заявляємому способі не застосовували подрібнення 65 рослинної сировини загальноприйнятими способами, при яких спостерігається місцеве перегрівання, окислення і осмолювання сировини, внаслідок чого відбувається розклад діючої сполуки і зменшується її біологічна активність, а отже, погіршується якість цільового продукту.Grinding and extraction according to the claimed method were carried out in the "drying" mode using intensive technology - grinding was carried out simultaneously with extraction at an optimal extractant-raw material ratio, under certain temperature and time conditions of extraction, thanks to which the biological activity of the target product is preserved. Thus, in the proposed method, grinding of 65 plant raw materials by generally accepted methods was not used, in which local overheating, oxidation and tarring of the raw materials are observed, as a result of which the active compound decomposes and its biological activity decreases, and therefore, the quality of the target product deteriorates.
Відділення екстракту від шроту проводять за допомогою центрифугування у зв'язку з тим, що при цьому зменшуються втрати екстракту, отримується більш очищений екстракт, скорочуються терміни проведення стадії фільтрації.Separation of the extract from the meal is carried out using centrifugation due to the fact that the losses of the extract are reduced, a more purified extract is obtained, and the duration of the filtration stage is shortened.
Очистку екстракту від супутніх білків здійснюють шляхом додавання лимонної або оцтової, або трихлороцтової кислот, або сульфату кальцію, або хлориду кальцію, концентрації яких підібрані експериментальним шляхом. Додавання кислот, наприклад, лимонної або оцтової (до рН 2,0 - 4,0) обумовлено вибірковою денатурацією супутніх білків при очищенні інгібітора трипсину, які осаджуються у кислому /о середовищі, а додавання сульфату чи хлориду кальцію (до конценпрації 0,20 - 0,2590) обумовлено виборчим осадженням супутніх білків іонами цих солей. Менша концентрація цих реагентів не дозволяє повністю осадити супутні білки, більша - недоцільна.Purification of the extract from accompanying proteins is carried out by adding citric or acetic or trichloroacetic acids, or calcium sulfate, or calcium chloride, the concentrations of which are selected experimentally. The addition of acids, for example, citric or acetic (up to pH 2.0 - 4.0) is due to the selective denaturation of accompanying proteins during the purification of the trypsin inhibitor, which are precipitated in an acidic environment, and the addition of sulfate or calcium chloride (up to a concentration of 0.20 - 0.2590) due to the selective precipitation of accompanying proteins by the ions of these salts. A lower concentration of these reagents does not allow complete precipitation of accompanying proteins, a higher concentration is impractical.
Очистку екстракту від супутніх білків здійснюють також шляхом центрифугування та діафільтрації до відсутності в ультрафільтраті білків та пігментів. Метод діафільтрації дозволяє швидко видалити кислоту з /5 екстракту Ї очистити цільовий продукт від низькомолекулярних домішок (білків, пігментів) з подальшим концентруванням екстракту для стадії афінної хроматографії.Purification of the extract from accompanying proteins is also carried out by centrifugation and diafiltration until the absence of proteins and pigments in the ultrafiltrate. The diafiltration method allows you to quickly remove acid from the extract and purify the target product from low-molecular-weight impurities (proteins, pigments) with further concentration of the extract for the stage of affinity chromatography.
Адсорбція інгібітора трипсину на біоспецифічному сорбенті дозволяє скоротити кількість стадій при очищенні цільового продукту. Умови проведення афінної хроматографії визначені експериментально. При використанні інших посадкових буферів зі значенням рН менше заявляємих не відбувається сорбції інгібітора на сорбенті, при значеннях рН більше заявляємих відбувається денатурація ліганду (трипсину), зв'язаного з матрицею сорбенту.Adsorption of the trypsin inhibitor on a biospecific sorbent allows to reduce the number of stages in the purification of the target product. The conditions for conducting affinity chromatography are determined experimentally. When using other landing buffers with a pH value less than the stated values, the inhibitor does not sorb on the sorbent, at pH values greater than the stated values, denaturation of the ligand (trypsin) bound to the sorbent matrix occurs.
При значеннях рН елююючого буферу вище заявляємих не відбувається процес десорбції цільового продукту з колонки.At pH values of the elution buffer higher than those claimed, the process of desorption of the target product from the column does not occur.
Порівняльний аналіз заявляємого способу і способу-прототипу : : оComparative analysis of the proposed method and the prototype method : : o
Стадія Тривал. Стадія Тривал. год год 1. Подрібнення насіння сої до одержання муки. 0,1 1. Замочування 5 кг насіння сої 11,0 при температурі (4 - 8)2С для о набухання протягом 11год., після Фу чого воду зливають. 2. Знежирення соєвої муки. 12,0 2. Заливка насіння сої Ол води 0,5 Ге!) очищеної і подрібнення сировини у середовищі екстрагенту до чІ отримання частинок не більше 15 - 20мкм. ІС 3. Промивка 8095 спиртом етиловим 1000г знежиреної муки з насіння сої при 0,5 З. Відділення екстракту шляхом 0,5 перемішуванні при 20 - 252С протягом ЗОхв., центрифугування отриманої маси фільтрація під вакуумом (фільтрат відкидають). при 1000 - 20009 протягом 10 - 0,5 15хв. або фільтрацією під « вакуумом. 4. Екстракція знежиреної муки шляхом суспендування у 500Омл 0,25М сірчаної 1,0 5. Видалення (осадження) 1,0 - с кислоти при 20 - 259; протягом год. при періодичному перемішуванні. супутніх білків з екстракту шляхом додавання до екстракту в! з» лимонної кислоти або оцтової " кислоти, або трихлороцтової кислоти, або сульфату кальцію, або хлориду кальцію. (9! 5. Відділення екстракту від шроту фільтрацією під вакуумом (осад відкидають). 1,0 6. Відділення осаду білків від 0,5 екстракту центрифугуванням при с» 1000 - 20004 протягом 10 - 15хв. або фільтрацією під вакуумом. се) 6. Видалення (осадження) супутніх білків з екстракту шляхом додавання до кислого 01 7. Обробка одержаного екстракту 2,0 фільтрату 20г суміші, що вмішує рівні частини бентоніту і супер-селу, інгібітора трипсину на се) перемішування протягом 1Охв. ультрафільтраційній установці шляхом його діафільтрації та с» концентрації до 1,0 - 1,5л. 7. Фільтрація отриманої суспензії (отримання фільтрату), промивки осаду двома 0,5 8. Очищення інгібітора трипсину 3,5 порціями по 125мл води (промивні води). Осад відкидають. за допомогою афінної хроматографії. 8. Адсорбція інгібітора на бентоніті шляхом повільного додавання при 0,5 8.1. Сорбція на хроматографічній 1,5Duration stage. Duration stage. hours hours 1. Grinding soybean seeds to obtain flour. 0.1 1. Soaking 5 kg of soybean seeds 11.0 at a temperature of (4 - 8)2C for swelling for 11 hours, after which the water is drained. 2. Defatting of soy flour. 12.0 2. Pouring soybean seeds with 0.5 g of water and grinding the raw material in the medium of the extractant until particles no larger than 15 - 20 μm are obtained. IS 3. Washing 8095 with ethyl alcohol 1000g of defatted flour from soybean seeds at 0.5 Z. Separation of the extract by 0.5 stirring at 20 - 252С during ЗОхв., centrifugation of the obtained mass, filtration under vacuum (filtrate is discarded). at 1000 - 20009 for 10 - 0.5 15 min. or filtration under vacuum. 4. Extraction of defatted flour by suspending it in 500 Oml of 0.25 M sulfuric acid 1.0 5. Removal (precipitation) of 1.0 - s acid at 20 - 259; during the hour with periodic stirring. of accompanying proteins from the extract by adding to the extract in! with citric acid or acetic acid, or trichloroacetic acid, or calcium sulfate, or calcium chloride. of the extract by centrifugation at 1000 - 20004 for 10 - 15 min. or by filtration under vacuum. se) 6. Removal (precipitation) of associated proteins from the extract by adding to acidic 01 7. Treatment of the obtained extract with 2.0 filtrate of 20 g of a mixture mixing equal parts of bentonite and super-sel, trypsin inhibitor on se) mixing during 1 Ov. ultrafiltration unit by means of its diafiltration and c" concentration to 1.0 - 1.5 L. 7. Filtration of the obtained suspension (obtaining filtrate), washing the sediment with two 0.5 8. Purification of trypsin inhibitor 3.5 with portions of 125 ml of water (washing water). The precipitate is discarded using affinity chromatography. 8. Adsorption of the inhibitor on bentonite by slow addition at 0.5 8.1. Sorption on chromatographic 1.5
ГФ) перемішуванні 100г суміші бентоніту і супер-селу до фільтрату, який об'єднали з колонці з трипсин-сефарозою (або промивними водами після операції Мо3. з трипсин-целюлозою, або іме) ензайт-трипсином, або трипсин-тойоперлом) з попереднім во урівноваженням 0,045 - 0,050М трис-НСІ буфером з рН 7,0 - 8,0. 9. Фільтрація отриманої суспензії, промивка осаду на фільтрі двома порціями по 0,5 8.2. Відмивання колонки від 1,0 125мл води (фільтрат і промивні води відкидають). неспецифічно зв'язаних білків цим же буфером з подальшою промивкою розчином 0,5 - 0,7М натрію хлориду. Видаляють буфер бо водою очищеною.HF) mixing 100g of a mixture of bentonite and super-sel to the filtrate, which was combined with a column with trypsin-sepharose (or washing waters after the Mo3 operation with trypsin-cellulose, or ime) enzyme-trypsin, or trypsin-toyoperl) with the previous in equilibrium with 0.045 - 0.050 M Tris-HCl buffer with pH 7.0 - 8.0. 9. Filtration of the obtained suspension, washing the sediment on the filter in two portions of 0.5 8.2. Column washing from 1.0 to 125 ml of water (filtrate and washing water are discarded). of nonspecifically bound proteins with the same buffer followed by washing with a 0.5-0.7M sodium chloride solution. The buffer is removed with purified water.
10. Елюція піридином і діаліз шляхом розмішування бентонітового осаду у 270мл 2,0 8.3. Елюювання інгібітора 2,0 води, підігрівання отриманої суспензії до 2520, додавання при перемішуванні ЗОмл трипсину підкисленою до рН 2,0 - піридину. 2,5 водою або підкисленою водою з додаванням 0,15 - О,20М натрію хлориду або 0,2 - 0,25М калію хлориду. 11. Фільтрація (декілька годин), промивка осаду на фільтрі 200мл 595 розчину 30 9. Відмивання елюату 1,0 піридину у воді, об'єднання фільтрату з промивною рідиною. електродіалізом або діафільтрацією з подальшим концентруванням. 70 12. Відмивання елюату діалізом проточною водою на протязі 10 - 12год. у 10 - 12 /)10. Стерильна фільтрація (для 0,5 целофанових трубках. ін'єкційних або інфузійних розчинів, або для стерильних мазей та інших стерильних місцевих лікарських засобів), розливання у ємності. 13. Видалення інертного матеріалу з діалізованого розчину шляхом доведення до рн 0,5 14. Висушування продукту шляхом | 36,0 5,3 додаванням соляної кислоти, з подальшим додаванням при перемішуванні 4г пліофілізації. суміші бентоніту і супер-селу. 14. Фільтрація під вакуумом, промивка осаду водою (осад відкидають). 1,0 Вихід інгібітора трипсину Всього становить 8,0 - 10,0Ог з 5кг 61 год. сировини (0,16 - 0,20)95. 15. Перше осадження інгібітора з об'єднаного фільтрату і промивної води (з 12,0 операції Ме11) шляхом охолодження до 52С, доведення 1М соляною кислотою до рн 4,65, фільтрації (фільтрат відкидають). Вага осаду 10 - 12г. 16. Друге осадження інгібітора шляхом суспендування отриманого осаду при 12,0 перемішуванні у 100мл води, охолодженої до 52С, додаванням по краплям 1М розчину гідроксиду натрію до повного розчинення осаду (рН не вище 6,4), нагріванні с прозорого розчину до 252С, титрування 1М соляною кислотою до слабого осаду, Ге) додаванням 2г супер-селу, фільтрації осаду, промивки на фільтрі водою; шляхом 0,5 об'єднання фільтрату та промивної води, охолодженням до 52, титрування до рн 4,65, фільтрації (фільтрат відкидають). Вихід осаду становить 8 - 10Гг. 17. Кристалізація шляхом розтирання осаду в 1Омл холодної води до отримання со суспензії, нагрівання до температури 352 С, додавання по краплям при ретельному перемішуванні О,5М розчину гідроксиду натрію до повного розчинення осаду і до рН Ф 5,2, кристалізації при 35 - 372С протягом 5 - бгод., відділення осаду за допомогою центрифугування. Ге) 18. Перекристалізація отриманого кристалічного осаду при розмішуванні у 12,0 подвійній кількості холодної води і титруванні О,5М розчином гідроксиду натрію « (рН 6,0) до отримання прозорого розчину, який нагрівають до 352 і титрують 0,5М10. Elution with pyridine and dialysis by stirring bentonite sediment in 270 ml 2.0 8.3. Elution of inhibitor 2.0 water, heating of the obtained suspension to 2520, addition with stirring of ZOml of trypsin acidified to pH 2.0 - pyridine. 2.5 with water or acidified water with the addition of 0.15 - 0.20M sodium chloride or 0.2 - 0.25M potassium chloride. 11. Filtration (several hours), washing the sediment on the filter with 200 ml of 595 solution 30 9. Washing the eluate with 1.0 pyridine in water, combining the filtrate with the washing liquid. electrodialysis or diafiltration followed by concentration. 70 12. Washing the eluate by dialysis with running water for 10 - 12 hours. at 10 - 12 /)10. Sterile filtration (for 0.5 cellophane tubes. injection or infusion solutions, or for sterile ointments and other sterile local medicines), filling in containers. 13. Removal of inert material from the dialyzed solution by bringing it to pH 0.5 14. Drying the product by | 36.0 5.3 with the addition of hydrochloric acid, followed by the addition with stirring of 4 g of lyophilization. a mixture of bentonite and super-silt. 14. Filtration under vacuum, washing the sediment with water (discard the sediment). 1.0 Trypsin inhibitor output Total is 8.0 - 10.0Og from 5kg 61 hours. raw materials (0.16 - 0.20)95. 15. The first precipitation of the inhibitor from the combined filtrate and washing water (from 12.0 Me11 operation) by cooling to 52C, adjusting with 1M hydrochloric acid to pH 4.65, filtering (discard the filtrate). The weight of the sediment is 10 - 12 g. 16. Second precipitation of the inhibitor by suspending the obtained precipitate at 12.0 stirring in 100 ml of water cooled to 52C, adding dropwise 1M sodium hydroxide solution until the precipitate is completely dissolved (pH not higher than 6.4), heating the clear solution to 252C, titration 1M hydrochloric acid to a weak sediment, Ge) adding 2 g of super-sel, filtering the sediment, washing the filter with water; by 0.5 combining filtrate and washing water, cooling to 52, titration to pH 4.65, filtration (filtrate is discarded). The output of sediment is 8 - 10 Hg. 17. Crystallization by grinding the precipitate in 1 ml of cold water until a suspension is obtained, heating to a temperature of 352 C, adding dropwise with thorough stirring 0.5 M sodium hydroxide solution until the precipitate is completely dissolved and to pH 5.2, crystallization at 35 - 372 C for 5 - bhd., separation of sediment using centrifugation. Ge) 18. Recrystallization of the resulting crystalline precipitate by stirring in 12.0 times the amount of cold water and titrating with 0.5M sodium hydroxide solution (pH 6.0) until a clear solution is obtained, which is heated to 352 and titrated with 0.5M
Зо розчином соляної кислоти (рН 5,1) до отримання слабого осаду, додавання 2г т) супер-селу, фільтрація; додавання до фільтрату затравки, витримування при температурі 36 - 372С на протязі 5 - бгод. (поступово утворюється густа суспензія кристалів); центрифугування; додавання розчину 0,2М соляної кислоти до рН 5,1, вводять затравку і розчин залишають ще на декілька годин при 36 - 3720 для « отримання додаткової порції кристалів, яку відділяють так, як описано вище (можна ще отримати кристали з кінцевого відстою, якщо його охолодити до 59С і - с додати 0,25 об'єму холодного 9595 спирту етилового, як описано у наступному розділі). и 19. Кристалізація з розбавленого спирту розмішуванням отриманих кристалів у и т п'ятикратному об'ємі холодної води і додаванням по краплям розчину 0,5М гідроксиду натрію до повного розчинення кристалів (рН не вище 6,6). Титрування 0,5 прозорого розчину 0,2М соляної кислоти (рН 5,2), додавання до утвореного осаду супер-селу з розрахунку 4г на 100мл розчину, відділення осаду, промивання його 1,0 1 на фільтрі водою; охолодження фільтрату до 52С, додавання 1/4 об'єму охолодженого 9595 спирту етилового для утворення осаду; додавання розчину 0,2М 2,0With a solution of hydrochloric acid (pH 5.1) until a weak sediment is obtained, adding 2 g t) super-silt, filtering; adding seeds to the filtrate, holding at a temperature of 36 - 372C for 5 - bhd. (a thick suspension of crystals gradually forms); centrifugation; addition of a solution of 0.2 M hydrochloric acid to pH 5.1, the seed is introduced and the solution is left for several hours at 36 - 3720 to obtain an additional portion of crystals, which is separated as described above (it is also possible to obtain crystals from the final sediment, if cool it to 59C and - with add 0.25 volume of cold 9595 ethyl alcohol, as described in the next section). and 19. Crystallization from diluted alcohol by mixing the obtained crystals in five times the volume of cold water and adding dropwise a solution of 0.5M sodium hydroxide until the crystals are completely dissolved (pH not higher than 6.6). Titration of 0.5 of a clear solution of 0.2M hydrochloric acid (pH 5.2), adding to the formed sediment super-sel at the rate of 4 g per 100 ml of solution, separating the sediment, washing it with 1.0 1 on the filter with water; cooling the filtrate to 52C, adding 1/4 volume of cooled 9595 ethyl alcohol to form a precipitate; addition of a 0.2M 2.0 solution
Сг» НСЇ до рН 5,0 і витримування суміші при 302С (аморфний осад перетворюється на протязі 2год. у кристалічний). Відстій розчину кожну годину декантують, доводять до (Се) розчином соляної кислоти до рН 5,0 і повертають до основної ємності. Так повторюють на протязі декількох годин до повного припинення появи осаду при рН 05 (се) 5,0; після цього суміш, яка кристалізується, витримують ще ЗОхв. при 30 2С).Sg» HCI to pH 5.0 and keeping the mixture at 302C (amorphous sediment turns into crystalline in 2 hours). The sediment of the solution is decanted every hour, adjusted to pH 5.0 with a solution of hydrochloric acid and returned to the main container. This is repeated over the course of several hours until the complete cessation of sediment appearance at pH 05 (se) 5.0; after that, the mixture, which crystallizes, is kept for another ЗОхв. at 30 2С).
ГК) 20. Фільтрація осаду, висушування при кімнатній температурі протягом 24год. тн 21. Перекристалізація із спирту етилового сухих кристалів шляхом суспендування у 26 тридцятикратному об'ємі холодної води, витримування 5 - 1Охв і кристалізація з розбавленого спирту по операції Ме19. 29 Вихід інгібітора трипсину становить 1,0г з 1000г сировини (0,195). ВсьогоGC) 20. Filtration of sediment, drying at room temperature for 24 hours. tn 21. Recrystallization of dry crystals from ethyl alcohol by suspending them in 26 thirty times the volume of cold water, holding for 5 - 1 Okhv and crystallization from diluted alcohol according to operation Me19. 29 The yield of trypsin inhibitor is 1.0 g from 1000 g of raw material (0.195). In total
ГФ! 136, 2год. ко Виходячи з даних порівняльної таблиці, завдяки заявляємому способу одержання інгібітора трипсину вихід цільового продукту підвищується у 1,5 - 2,0 рази, кількість стадій технологічного процесу значно зменшується, бор тривалість у часі скорочується більше, ніж у 2 рази. Крім того, у заявляємому способі відсутні екологічно- та пожежонебезпечні розчинники, які є необхідними для здійснення способу-прототипу, наприклад, піридин, етиловий спирт, розчинники, що застосовуються для знежирення соєвої муки.GF! 136, 2h. Based on the data of the comparative table, thanks to the proposed method of obtaining the trypsin inhibitor, the yield of the target product increases by 1.5-2.0 times, the number of stages of the technological process is significantly reduced, and the duration is reduced by more than 2 times. In addition, the proposed method does not contain environmentally and fire-hazardous solvents, which are necessary for the implementation of the prototype method, for example, pyridine, ethyl alcohol, solvents used for degreasing soybean flour.
Результати доклінічних досліджень свідчать, що специфічна активність цільового продукту, одержаного по заявляємому способу з рослинної сировини, співвідносна з активністю препарату порівняння "Контрикал" на 65 основі сировини тваринного походження.The results of preclinical studies show that the specific activity of the target product obtained by the claimed method from plant raw materials is comparable to the activity of the comparative drug "Kontrykal" based on raw materials of animal origin.
Таким чином, у заявляємому винаході повністю виконується задача по створенню високоефективного способу одержання інгібітора трипсину з рослинної сировини.Thus, the proposed invention fully fulfills the task of creating a highly efficient method of obtaining a trypsin inhibitor from plant raw materials.
ЛІТЕРАТУРАLITERATURE
1. Авторское свидетельство СССР М 698623, кл. А 61 К 37/64. Опубл. 25.11.79. Бюл. "Открьтия, изобретения, промьішленнье образць, товарньсе знаки", М43. 2. Авторское свидетельство СССР Мо1162081, кл. А 61 К 35/78. Опубл. офиц. бюл, Открьтия, изобретения", 1985, Мо22. 3. Авторское свидетельство Мо1439782, кл. А 61 К 37/64. Опубл. офиц. бюл. Открьтия, изобретения", 1988,1. Author's certificate of the USSR M 698623, cl. A 61 K 37/64. Publ. 25.11.79. Bul. "Discoveries, inventions, production of samples, trademarks", M43. 2. Author's certificate of the USSR Mo1162081, cl. A 61 K 35/78. Publ. officer Bulletin, Discoveries, Inventions", 1985, Mo22. 3. Author's certificate Mo1439782, class A 61 K 37/64. Publ. Official Bulletin, Discoveries, Inventions", 1988,
Мо43. 70 4. Авторское свидетельство СССР Мо1412063, кл А 61 К 37/64. Опубл. офиц. бюл. "Открьїтия, изобретения", 1988, Мо27. 5. Сухинин В.Н., Березин В.А., Новиков Ю.Ф. и др. Очистка и некоторне свойства ингибитора трипсина из вегетативньїх органов люцернь. // Ж. Биохимия, 1981, Т. 46, вьп. 7, с. 1183 - 1187. 6. Зимачева А.В., Мосолов В.В. Ингибиторь! цистеиновьїх протейиназ из семян сои. Ж. Биохимия, 1995, Т. 60, /5 ВЬП. 1, с. 118 - 123. 7. Патент України Мо23548, кл. А 61 К 35/00. Опубл. офіц. бюл. "Промислова власність", 1998, Мо4, 8. Нортрон Д., Кунитц М., Хорриотт Р.М. Кристаллический ингибитор трипсина из соевьх бобов. // Кн.Mo43. 70 4. Author's certificate of the USSR Mo1412063, class A 61 K 37/64. Publ. officer Bull. "Discoveries, Inventions", 1988, Mo27. 5. Sukhinin V.N., Berezyn V.A., Novikov Y.F. etc. Purification and some properties of trypsin inhibitor from alfalfa vegetative organs. // Journal of Biochemistry, 1981, T. 46, issue 7, p. 1183 - 1187. 6. Zymacheva A.V., Mosolov V.V. Inhibitor! of cysteine proteinases from soybean seeds. J. Biochemistry, 1995, Vol. 60, /5 VBP. 1, p. 118 - 123. 7. Patent of Ukraine Mo23548, cl. A 61 K 35/00. Publ. officer Bull. "Industrial Property", 1998, Mo4, 8. Norton D., Kunitz M., Horriott R.M. Crystalline inhibitor of trypsin from soybeans. // Book
Кристаллические ферменть, - М.; Изд. "Иностранная литература", 1950. - С. 260 - 265 (прототип).Crystalline enzymes, - M.; Ed. "Foreign literature", 1950. - pp. 260 - 265 (prototype).
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UA2002064738A UA54993C2 (en) | 2002-06-10 | 2002-06-10 | Method for producing trypsin inhibitor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UA2002064738A UA54993C2 (en) | 2002-06-10 | 2002-06-10 | Method for producing trypsin inhibitor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA54993C2 true UA54993C2 (en) | 2006-12-15 |
Family
ID=37605849
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2002064738A UA54993C2 (en) | 2002-06-10 | 2002-06-10 | Method for producing trypsin inhibitor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA54993C2 (en) |
-
2002
- 2002-06-10 UA UA2002064738A patent/UA54993C2/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20160316794A1 (en) | Method for the preparation of a protein peptide, a protein peptide and use thereof | |
| Hagihara et al. | CRYSTALLINE CYTOCHROME C III. CRYSTALLIZATION OF FISH CYTOCHROME C AND A THIRD METHOD OF PURIFICATION | |
| JP4416188B2 (en) | Method for isolating proteinase inhibitor protein from potato tubers | |
| WO2005094602A2 (en) | Purified extract of an alpha-amylase inhibitor from phytoemagglutinin-essentially free beans, process for its extraction and compositions containing it | |
| DE2363201B2 (en) | Process for the isolation and purification of kallikrein from biological material | |
| US5070076A (en) | Thymus-gland preparation and method for producing same | |
| CN102174495A (en) | Method for extracting chymocotrypsin | |
| JPH0247966B2 (en) | ||
| UA54993C2 (en) | Method for producing trypsin inhibitor | |
| JPH1129594A (en) | Angiotensinase inhibitory substance, its production and hypotensive agent using the same | |
| US20020169294A1 (en) | Method of purifying calcium ion-binding protein | |
| EP2511288A1 (en) | The method of obtaining inhibitors of cysteine peptidases with an electrophoretic purity from biological materials | |
| SU1404513A1 (en) | Method of producing ovomucoid | |
| JPS5840472B2 (en) | Method for removing kinin-degrading enzyme from kallikrein-containing solution | |
| KR920008369B1 (en) | Method for purification of protease | |
| KR20230027696A (en) | Extraction Method of high purity Poly Deoxy Ribo Nucleotide from meats of Salmonid fish | |
| RU2129438C1 (en) | Method of preparing ovoinhibitor | |
| JPH01313498A (en) | Novel peptide &m:a peptide of the formula. | |
| JPS62286926A (en) | Collagenase inhibitor | |
| JP4112236B2 (en) | Method for separating and purifying lectin, animal plasma immobilization carrier and affinity column | |
| JP3108767B1 (en) | Method for producing chib2 type chitinase | |
| RU2492868C2 (en) | Method for preparing and cleaning placental alkaline phosphatase | |
| JP2000086530A (en) | New trypsin inhibitor | |
| CN116041486A (en) | Extraction and purification method of aprotinin | |
| EP0085254A1 (en) | Proteins and their extraction |