JP4112236B2 - Method for separating and purifying lectin, animal plasma immobilization carrier and affinity column - Google Patents
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Description
【０００１】
【技術分野】
本発明は，新規な分離精製法を採用して，レクチンタンパク質を効率的に単離する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
レクチンは，糖鎖を認識するタンパク質の総称であり，血球や細胞表面等にある特定構造を有する糖鎖と特異的に結合し，その血球や細胞を凝集させる活性を有している。レクチンは，動物，植物及び微生物等生物界に広く存在している。これらのレクチンの中には，他のレクチンにはほとんどない特有の活性を有するものがある。
【０００３】
例えば，米ヌカ中に含まれる米ヌカレクチンは，細胞増殖を抑制する活性を有することが知られている。また，動物の生体中に広く存在するガレクチンは，リンパ球等のアポトーシスを誘導し，また，ガンの転移を抑制する効果を有することが知られている。このようなレクチンは，医学上非常に有用なものである。そのため，現在種々の個体から様々なレクチンが単離され，その機能が盛んに調べられている。
【０００４】
例えば，特開平０８−１１９９９４号公報には，キクイモ由来のマンノース／グルコース親和性レクチンをマルトースをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーによって分離精製する方法が開示されている。また，特表平１０−５０４２８７号公報には，ヤドリギの抽出物をラクトシルセファロース上でクロマトグラフィーを行い，ＭＬＩ型イソレクチンを単離する方法が開示されている。さらに，再表９５／０１８１４９号公報には，キリンザイ属に属する海藻から新規レクチンを分離精製して，大量に取得する方法が開示されている。
【０００５】
このように，レクチンを単離するための材料や方法には様々なものがある。これらレクチンは，その糖鎖結合特異性，血液型特異性，抗癌作用等を利用して，細胞分画試薬，臨床検査試薬，臨床治療薬等として利用することができる。
一方，生物界にはまだ明らかにされていない種々のレクチンが多数存在すると考えられている。他方，産業界では多様な目的に合う，新たな特徴をもつレクチンの開発が求められる。未開発のレクチンの特性をさらに明らかにし，産業的需要を開発していくためには，有用なレクチンを効率的で安価に分離精製する技術が必要である。
【０００６】
【解決しようとする課題】
しかしながら，従来のレクチンの分離精製方法は，多くのステップを含み煩雑であり，多大な時間を要する。また，比較的ステップ数の少ないアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法であっても，アフィニティーカラムを作製するために高価なタンパク質を担体に固定化する必要がある。また，この高価なタンパク質を用いてカラムを作製しても，所望のレクチンを得ることができるとは限らないため，対費用効果が低いという問題があった。
【０００７】
本発明は，かかる従来の問題点に鑑みてなされたもので，種々の生体材料からレクチンを簡単に短時間で分離精製することができるレクチンの分離精製方法を提供しようとするものである。
【０００８】
【課題の解決手段】
第１の発明は，アフィニティークロマトグラフィーを応用したレクチンの分離精製方法であって，
生体材料を水性媒体により抽出して抽出画分を得る抽出工程と，
担体に動物血漿を固定化してなる動物血漿固定化担体を具備するアフィニティーカラムに上記抽出画分に含まれるレクチンを吸着させる吸着工程と，
ハプテン糖を用いて上記アフィニティーカラムからレクチンを溶出させる溶出工程とからなることを特徴とするレクチンの分離精製方法にある（請求項１）。
【０００９】
本発明においては，上記抽出画分に含まれるレクチンを，担体に動物血漿を固定化した動物血漿固定化担体を具備するアフィニティーカラムに吸着させている（吸着工程）。
そのため，ブタ等の安い動物血漿を上記動物血漿固定化担体に固定化し，上記生体材料から安価にレクチンを分離精製することができる。ここで，上記動物血清は糖鎖を有するタンパク質，いわゆる糖タンパク質を多量に含有している。上記動物血漿固定化担体は，その表面に上記糖蛋白質を固定化している。そのため，上記抽出画分に含まれるレクチンは，動物血漿固定化担体の表面に固定化された糖タンパクの糖鎖と選択的に結合する。それ故，上記動物血漿固定化担体は，上記抽出画分に含まれるレクチンを選択的に吸着することができる。
【００１０】
また，上記分離精製工程においては，ハプテン糖を用いて上記アフィニティーカラムからレクチンを溶出させる。ここで，上記ハプテン糖は，上記吸着工程において動物血漿固定化担体とレクチンとの結合を解離する。
そのため，上記ハプテン糖を用いて，上記アフィニティーカラムからレクチンを簡単に回収することができる。
【００１１】
また，上記ハプテン糖は，その種類によって種々のレクチンを溶出させることができる。そのため，生体材料，動物血漿及びハプテン糖の種類を任意に決定することにより，様々なレクチンを得ることができる。即ち，本発明によれば，種々の生体材料から様々なレクチンを網羅的に取得することができる。
【００１２】
また，本発明は，上記抽出工程，吸着工程及び分離精製工程の工程からなる。そのため，上記３つの少ないステップで，簡単に生体材料からレクチンを分離精製することができる。
【００１３】
また，レクチンの分離精製に使用した上記動物血漿固定化担体は，４Ｍ尿素等のタンパク質変性剤を含む食塩溶液等で洗浄することによって，容易に再生することができる。これにより，１０回以上繰り返し使用することができる。そのため，レクチンの分離精製コストを低下させることができる。
【００１４】
このように，本発明によれば，種々の生体材料からレクチンを簡単に短時間で分離精製することができるレクチンの分離精製方法を提供することができる。
【００１５】
次に，第２の発明は，アフィニティークロマトグラフィーに用いる動物血漿固定化担体であって，上記動物血漿固定化担体は，担体に動物血漿を固定化してなることを特徴とする動物血漿固定化担体にある（請求項９）。
【００１６】
本発明において，上記動物血漿固定化担体は動物血漿を担体に固定化してなる。
そのため，上記動物血漿固定化担体は，その表面に，上記動物血漿に含まれる多様な構造の糖鎖を有する糖タンパクを結合している。それ故，糖鎖を認識し該糖鎖に結合するレクチンを選択的に結合することができる。したがって，上記動物血漿固定化担体は，例えば種々の物質を含有する生体材料等から糖鎖を認識するレクチンを選択的に単離するために用いることができる。なお，上記本発明は，上記第１の発明のレクチンの分離精製方法に用いる動物血漿固定化担体と同様のものである。
【００１７】
次に，第３の発明は，アフィニティークロマトグラフィーに用いるアフィニティーカラムであって，上記アフィニティーカラムは担体に動物血漿を固定化してなる動物血漿固定化担体を具備することを特徴とするアフィニティーカラムにある（請求項１１）。
【００１８】
本発明において，上記アフィニティーカラムは，担体に動物血漿を固定化してなる動物血漿固定化担体を具備している。
そのため，上記アフィニティーカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うと，生体材料等から糖鎖を認識するレクチンを選択的に単離することができる。なお，上記動物血漿固定化担体は，上記第２の発明（請求項９）と同じものである。
【００１９】
【発明の実施の形態】
上記第１の発明（請求項１）において，上記生体材料は，レクチンを含有する動物，植物及び微生物等の細胞，組織，器官等の生体材料を示す。このような生体材料の具体的な例としては，米ヌカ，タチナタマメ，小麦胚，エノキタケ，ヤドリギ，キクイモ，ダイズ，エンドウマメ，レンズマメ，リママメ，西洋キノコ，ピーナツ，ジャガイモ，インゲンマメ，トマト，ウナギ血清等がある。
【００２０】
また，上記水性媒体としては，レクチンを溶解し，かつレクチンを変性，破壊させないものを用いることができる。このような水性媒体としては例えば，リン酸緩衝液，生理食塩水，トリス塩酸緩衝液等がある。
【００２１】
また，上記抽出工程において上記抽出画分を得る方法としては，例えば上記生体材料を粉砕又はホモジェナイズし，これを水性媒体中に懸濁した後，遠心分離して上清を抽出画分として得る方法等がある。
【００２２】
また，上記動物血漿としては，例えば，ブタ血漿，ウシ血漿，ヒト血漿，ウサギ血漿，ヤギ血漿，ヒツジ血漿，ウマ血漿，ラット血漿，マウス血漿等を用いることができる。
また，上記担体としては，例えばセファロース４Ｂ（登録商標）等の，粒子状に加工した多糖繊維からなるゲル状又はビーズ状の樹脂等を用いることができる。上記多糖繊維の成分としては，例えばアガロース，デキストラン，でんぷん，セルロース等がある。
【００２３】
また，上記担体は，動物血漿を固定化させる前に，アルカリ条件下で臭化シアンと反応させて，活性化担体としておくことが好ましい。この場合には，上記活性化担体に動物血漿を容易に固定化することができる。
【００２４】
また，上記動物血漿固定化担体は，モノエタノールアミンにより，ブロッキングしておくことが好ましい。
この場合には，上記担体と動物血漿との未反応部分にモノエタノールアミンが作用し，上記動物血漿固定化担体と生体材料との非特異的吸着を防止する，いわゆるブロッキングの効果を得ることができる。
【００２５】
また，上記ハプテン糖としては，Ｎ−アセチルグルコサミン溶液，メチルα−マンノシド溶液，ラクトース溶液，しょ糖溶液，グルコース溶液，メチルα−グルコシド溶液，メチルβ−グルコシド溶液，Ｎ−アセチルガラクトサミン溶液等がある。
【００２６】
また，本発明においては，上記溶出工程において得られるレクチン含有溶液を，上記吸着工程における抽出画分として再びアフィニティーカラムに吸着させ，続いて上記溶出工程と同様にレクチンを溶出させることができる。
この場合には，純度の高いレクチンを得ることができる。なお，上記のようにして，溶出工程において得られる溶出液をアフィニティカラムに吸着させ，溶出する操作を複数回繰り返して行うことによって，得られるレクチンの純度をさらに高めることができる。
【００２７】
次に，上記動物血漿は，ブタ血漿又はウシ血漿であることが好ましい（請求項２）。
この場合には，上記動物血漿固定化担体及びアフィニティーカラムを低コストに作製することができる。
【００２８】
次に，上記吸着工程と溶出工程との間に，上記アフィニティーカラム内に洗浄液を通して不純物を溶出除去する洗浄工程を有することが好ましい（請求項３）。
この場合には，上記レクチンを高純度に精製することができる。
【００２９】
次に，上記抽出工程と吸着工程との間に，硫酸アンモニウム沈殿法を用いて上記抽出画分を濃縮する濃縮工程と，該濃縮工程において濃縮した抽出画分を透析する透析工程とを有することが好ましい（請求項４）。
この場合には，上記濃縮工程において上記抽出画分を濃縮することができると共に，上記透析工程において抽出画分に含まれる塩等を除去することができる。そのため，上記動物血漿固定化担体へのレクチンの吸着率が向上し，生体材料からのレクチンの回収率が向上する。
【００３０】
次に，上記生体材料は米ヌカであり，上記ハプテン糖はＮ−アセチルグルコサミン溶液であることであることが好ましい（請求項５）。
この場合には，米ヌカから米ヌカレクチンを得ることができる。この米ヌカレクチンは，細胞増殖を抑制する効果を有する。そのため，ガン等に対する有効な治療薬となる可能性がある。
【００３１】
次に，上記生体材料はタチナタマメであり，上記ハプテン糖はメチルα−マンノシド溶液であることが好ましい（請求項６）。
この場合には，タチナタマメからタチナタマメレクチンを得ることができる。特にこの場合には，タチナタマメレクチンとして，タチナタマメのコンカナバリンＡを得ることができる。
【００３２】
次に，上記生体材料は小麦胚であり，上記ハプテン糖はＮ−アセチルグルコサミン溶液であることが好ましい（請求項７）。
この場合には，小麦胚から小麦胚レクチンを得ることができる。特にこの場合には，小麦胚レクチンとして，小麦胚アグルチニンを得ることができる。
【００３３】
次に，上記生体材料はエノキタケの水性媒体抽出物であり，上記ハプテン糖はラクトース溶液であることが好ましい（請求項８）。
この場合には，上記エノキタケからエノキタケレクチンを得ることができる。
【００３４】
次に，上記第２の発明（請求項９）において，上記担体及び動物血漿は，上記第１の発明と同様のものを用いることができる。
【００３５】
また，上記動物血漿は，ブタ血漿又はウシ血漿であることが好ましい（請求項１０）。
この場合には，安価なブタ血漿又はウシ血漿を用いて，低コストに上記動物血漿固定化担体を提供することができる。
【００３６】
次に，上記第３の発明（請求項１１）において，上記担体及び動物血漿は，上記第１の発明と同様のものを用いることができる。
【００３７】
また，上記動物血漿は，ブタ血漿又はウシ血漿であることが好ましい（請求項１２）。
この場合には，安価なブタ血漿又はウシ血漿を用いて，低コストに上記アフィニティーカラムを提供することができる。
【００３８】
【実施例】
（実施例１）
本例のレクチンの分離精製方法は，アフィニティークロマトグラフィーを応用したレクチンの分離精製方法である。本例の分離精製方法は，生体材料を水性媒体により抽出して抽出画分を得る抽出工程と，担体に動物血漿を固定化してなる動物血漿固定化担体を具備するアフィニティーカラムに上記抽出画分に含まれるレクチンを吸着させる吸着工程と，ハプテン糖を用いて上記アフィニティーカラムからレクチンを溶出させる溶出工程とからなる。
【００３９】
以下，本例につき詳細に説明する。
本例では，まず上記生体材料及び動物血漿として，米ヌカ及びブタ血漿をそれぞれ準備した。また，上記担体として，アマシャムファルマシア株式会社製のセファロース４Ｂを準備した。
【００４０】
上記担体１００ｇを水１００ｍｌに懸濁し，臭化シアン（和光純薬株式会社製）のジメチルホルムアミド溶液（１ｇ／ｍｌ）を２５ｍｌ加えた。さらに，４０％苛性ソーダを滴下して，ｐＨ１１に保ちながら２０℃で１２分間反応させた後，１．６％重炭酸ナトリウム水溶液で洗って上記活性化担体としての活性化セファロース４Ｂを作製した。続いて，この活性化セファロース４Ｂを２００ｍｌのブタ血漿中に浸し，２０℃にて１６時間穏やかに攪拌しながら上記活性化セファロース４Ｂにブタ血漿を固定化させ，動物血漿固定化担体を作製した。
【００４１】
次に，この動物血漿固定化担体を塩酸でｐＨ７．５に合わせた６％モノエタノールアミン溶液中に浸し，穏やかに攪拌させながら２０℃にて，２時間ブロッキングを施した。その後，この動物血漿固定化担体を日本バイオラッドラボラトリーズ株式会社製のカラム（商品名 エコノカラム）に充填し，アフィニティーカラムとした。なお，上記アフィニティーカラム中における動物血漿固定化担体のゲルベッドの体積は，１０ｍｌであった。
【００４２】
次に，米ヌカ２０ｇを上記水性媒体としてのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）１００ｍｌ中に加えて充分に攪拌した。その後，１３，０００×ｇにて１０分間遠心分離を行い，上清を上記抽出画分として採取した（抽出工程）。
さらに，この上清に７０％飽和になるように硫酸アンモニウム（和光純薬株式会社製）を加え，４℃にて１時間放置した。続いて，１３，０００×ｇにて１０分間遠心分離し，沈殿を回収した（濃縮工程）。この沈殿に５０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水を加えて沈殿を溶解し，透析を行った。透析後のサンプルを４℃，２１，０００×ｇにて１０分間遠心分離し，上清を回収してこれを最終的な抽出画分とした（透析工程）。
【００４３】
次に，上記吸着工程において，上記透析工程後の抽出画分を上記アフィニティーカラム内の動物血漿固定化担体に静かに重層し，自然落下により動物血漿固定化担体に通した（吸着工程）。上記抽出画分が完全に通過したら，リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）１００ｍｌを通し，アフィニティーカラム内を洗浄した（洗浄工程）。
【００４４】
次に，上記アフィニティーカラム内に２５０ｍＭのＮ−アセチルグルコサミン５０ｍｌを通し，米ヌカレクチンを含む溶出液を５０ｍｌ取得した（溶出工程）。この溶出液を試料Ｅ１とした。
上記試料Ｅ１に含まれる米ヌカレクチンの濃度を日本バイオラッドラボラトリーズ株式会社製のプロテインアッセイ試薬を用いる方法により測定したところ，濃度は８０μｇ／ｍｌであり，その収量は４ｍｇであった。
【００４５】
試料Ｅ１は，分離精製の方法からレクチンを含有すると考えられる。これを検証するために，下記のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び赤血球凝集活性の測定を行った。
【００４６】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
１０μｌの上記試料Ｅ１をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により，電気泳動した。電気泳動後のゲルをクマーシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色し，電気泳動像を写真撮影した。その結果を図１に示す。
なお，ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いるマーカータンパク質としては，シグマアルドリッチジャパン株式会社製の標準混合物（３０−２００ｋＤａ）を用いた。また，電気泳動像の各バンドの位置は本明細書作成の都合上，鮮明に表示できないため，各バンドの位置を点線で囲って示してある。
【００４７】
図１において，レーン１はマーカータンパク質の電気泳動像を示し，レーン２は試料Ｅ１の電気泳動像を示す。図１より知られるごとく，試料Ｅ１の電気泳動像は，単一バンドではなく３０ｋＤａ以下の位置にスメア状の像として示された。そのため，試料Ｅ１は３０ｋＤａ以下のタンパク質の混合物であると考えられる。そこで，上記試料Ｅ１が米ヌカレクチンであることを確認するために以下の実験を行った。
【００４８】
（赤血球凝集活性の測定）
まず，ウサギ赤血球を採取し，この赤血球を４枚のプレートに播いた。
次に，この４枚のプレートに最終濃度がそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌ，５０ｎｇ／ｍｌ，２５ｎｇ／ｍｌ，０ｎｇ／ｍｌとなるように試料Ｅ１を添加し，これらをそれぞれ試料ｅ１，試料ｅ２，試料ｅ３，試料ｃ１とした。
この試料ｅ１〜ｅ３及び試料ｃ１を２５℃にて４時間静置し，血球の形態を写真撮影した。その結果を図２に示す。
【００４９】
図２より知られるごとく，試料ｅ１及び試料ｅ２においては，赤血球は凝集しプレート底部全面に沈殿していた。一方，試料ｅ３については，赤血球の凝集はほとんど観察されず，赤血球がプレート底部の一点に集まり，試料ｃ１に至っては，赤血球の凝集は全く観察されなかった。このことから上記試料Ｅ１は，５０ｎｇ／ｍｌという極めて低い濃度で赤血球凝集活性を示し，上記試料Ｅ１はレクチンの１種であることが確認された。
【００５０】
また，米ヌカレクチンは細胞増殖抑制効果，及び動物実験においてガン細胞を移植したマウスの延命効果を有することがすでに確認されている。上記試料Ｅ１もこれらの効果を有しているかということを確認するため，試料Ｅ１及び市販の米ヌカレクチンについての細胞増殖抑制効果の比較，及び動物実験を以下のようにして行った。
【００５１】
（細胞増殖抑制効果）
まず，４８ウェルマルチプレート（住友ベークライト株式会社製）の横２列（８×２列の合計１６ウェル）に培養液に懸濁したヒト単球性白血球病Ｕ９３７細胞（Ｕ９３７細胞）を２×１０4個ずつ播いた。次に，添加物として上記試料Ｅ１及び市販の米ヌカレクチン（和光純薬株式会社製，商品名 米ヌカアグルチニン）を最終濃度０〜４０μｇ／ｍｌとなるように，段階希釈法により培養液中に添加した。
【００５２】
このプレートを３７℃，５％ＣＯ2条件下にて２４時間培養した。２４時間培養後，各ウェルの細胞数を測定し，添加物を添加していない細胞数に対する相対細胞数を以下の式により算出した。その結果を図３に示す。尚，図３において，○は添加物として試料Ｅ１を用いた結果を示し，△は添加物として市販の米ヌカレクチンを用いた結果を示す。
【００５３】
（式１）
相対細胞数＝（添加物を含む培養液で培養したときの細胞数）×１００／（添加物を含まない培養液で培養したときの細胞数）
【００５４】
図３より知られるごとく，実施例１で得られた試料Ｅ１は，市販米ヌカレクチンと同程度の細胞増殖抑制効果を有し，濃度依存的にＵ９３７細胞の増殖を抑制した。
また，本明細書中には示していないが，ヒト胃ガンＭＫＮ４５細胞（ＭＫＮ４５細胞）を用いて上記と同様の実験を行ったところ，上記試料Ｅ１は，ＭＫＮ４５細胞についても市販米レクチンと同様に増殖抑制効果を有していた。
【００５５】
（動物実験）
まず，Ｃ５７ ＢＬ／６マウス１０匹の腹腔内に，それぞれ１×１０6個のマウスルイス肺ガン３ＬＬ細胞（３ＬＬ細胞）を移植した。次に，３ＬＬ細胞を移植したマウスの内５匹のマウスには，濃度１０μｇ／ｍｌの試料Ｅ１を０．２ｍｌ投与し，これを実験マウス群とした。一方，残り５匹のマウスには生理食塩水を０．２ｍｌ投与し，これをコントロールマウス群とした。そして，これら実験マウス群及びコントロールマウス群のマウスが死亡するまでの日数を計測した。なお，上記実験マウス群及びコントロールマウス群へのそれぞれ試料Ｅ１，生理食塩水の投与は二日おきに行った。
その結果を表１に示す。
【００５６】
【表１】
表１より知られるごとく，実験マウス群はコントロールマウス群よりも生存日数が長く，有意差が認められた。このように，上記試料Ｅ１は，従来より知られる米ヌカレクチンと同様の性質を有しており，上記試料Ｅは，米ヌカレクチンであることが確認された。
したがって，本例によれば，種々の生体材料からレクチンを簡単に短時間で分離精製することができるレクチンの分離精製方法を提供することができる。
【００５８】
（実施例２）
本例では，タチナタマメからレクチンを取得する例を示す。
まず，２０ｇの市販のタチナタマメ粉砕物（シグマアルドリッチジャパン株式会社製，商品名 タチナタマメミール）を準備した。このタチナタマメ粉砕物から，実施例１と同様にして，抽出画分を抽出，濃縮，透析し（抽出工程，濃縮工程，透析工程），該抽出画分を，ブタ血漿を固定化した生体材料固定化担体を具備する上記アフィニティーカラムに吸着させ（吸着工程），該アフィニティーカラムを洗浄液にて洗浄した（洗浄工程）。
【００５９】
次に，上記アフィニティーカラム内に５００ｍＭのメチルα−マンノシド溶液を５０ｍｌ通し，タチナタマメレクチンを含む溶出液を取得した。これを試料Ｅ２とした。
上記試料Ｅ２に含まれるタチナタマメレクチンの濃度を実施例１と同様の方法により測定したところ，濃度は１６０μｇ／ｍｌであり，その収量は，８ｍｇであった。
【００６０】
次に，実施例１と同様に，１０μｌの試料Ｅ２をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により，電気泳動した。その結果を図４に示す。
なお，ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いるマーカータンパク質としては，シグマアルドリッチジャパン株式会社製の標準混合物（３０−２００ｋＤａ）を用いた。また，電気泳動像の各バンドの位置は本明細書作成の都合上，鮮明に表示できないため，各バンドの位置を点線で囲って示してある。
【００６１】
図４より知られるごとく，試料Ｅ２は，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像で，単一なバンドを示し，充分に精製されていた。
この試料Ｅ２に含まれるタンパク質を同定するために，以下に示す方法により，該タンパク質のアミノ酸配列を決定した。
【００６２】
まず，上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したタンパク質を電気的にロシュ・ダイアグノスティック株式会社製のＰＶＤＦ膜（ポリビニリデン・ジフルオライド膜，商品名 ＰＶＤＦ ウエスタンブロッティング メンブレン）に写し取った（ウエスタンブロッティング）。次に，このＰＶＤＦ膜に写し取られたタンパク質を日本アプライドバイオシステムズ株式会社製のプロテインシーケンサー（製品名 プロサイス モデル４９１ プロテインシーケシング システム）によって分析した。
【００６３】
その結果，Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−という配列が得られ，この配列は既知のレクチンの１種であるコンカナバリンＡの配列と一致した。これより，試料Ｅ２はタチナタマメのコンカナバリンＡであることが確認された。
【００６４】
（実施例３）
本例では，上記動物血漿としてウシ血漿を用いて，タチナタマメからレクチンを取得する例を示す。
まず，実施例１と同様にして，上記活性化担体としての活性化セファロース４Ｂを作製した。続いて，この活性化セファロース４Ｂを２００ｍｌのウシ血漿中に浸し，２０℃にて１６時間穏やかに攪拌した。これにより，上記担体にウシ血漿が固定化し，動物血漿固定化担体を得た。また，実施例１と同様に，上記動物血漿固定化担体を塩酸でｐＨ７．５に合わせた６％モノエタノールアミン溶液中に浸し，穏やかに攪拌させながら２０℃にて，２時間ブロッキングを施した。その後，実施例１と同様に，この動物血漿固定化担体を日本バイオラッドラボラトリーズ株式会社製のカラム（商品名 エコノカラム）に充填し，アフィニティーカラムとした。なお，上記アフィニティーカラム中における動物血漿固定化担体のゲルベッドの体積は，１０ｍｌであった。
【００６５】
次に，実施例２と同様にして，タチナタマメ粉砕物２０ｇから抽出画分を得た（抽出工程，濃縮工程，透析工程）。この抽出画分を上記アフィニティーカラム中に通した（吸着工程）。続いて，実施例１と同様にしてアフィニティーカラムを洗浄し（洗浄工程），実施例２と同様にして５００ｍＭのメチルα−マンノシド溶液で溶出した（溶出工程）。ここで得られた溶出液を試料Ｅ３とした。
その結果，試料Ｅ３は，実施例２と同様にタチナタマメのコンカナバリンＡであった。
【００６６】
（実施例４）
本例では，小麦胚からレクチンを取得する例を示す。
まず，市販の小麦胚（シグマアルドリッチジャパン株式会社製，商品名 小麦胚）を粉砕し，上記生体材料としての２０ｇの小麦胚粉砕物を得た。この小麦胚粉砕物から実施例１と同様にして，抽出画分を抽出し（抽出工程，濃縮工程，透析工程），該抽出画分を，ブタ血漿を固定化した生体材料固定化担体を具備する上記アフィニティーカラムに吸着させ（吸着工程），該アフィニティーカラムを洗浄液にて洗浄した（洗浄工程）。
【００６７】
次に，上記アフィニティーカラム内に２５０ｍＭのＮ−アセチルグルコサミン溶液を５０ｍｌ通し，小麦胚を含む溶出液を取得した。これを試料Ｅ４とした。
上記試料Ｅ４に含まれる小麦胚レクチンの濃度を実施例１と同様の方法により測定したところ，濃度は１２０μｇ／ｍｌであり，その収量は，６ｍｇであった。
【００６８】
次に，実施例１と同様に，１０μｌの上記試料Ｅ４をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により，電気泳動した。その結果を図５に示す。なお，マーカータンパク質としては，シグマアルドリッチジャパン株式会社製のダルトンマークVII−Ｌを用いた。また，電気泳動像の各バンドの位置は本明細書作成の都合上，鮮明に表示できないため，各バンドの位置を点線で囲って示してある。
【００６９】
図５より知られるごとく，試料Ｅ４は，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像で，単一なバンドを示し，充分に精製されていた。
この試料Ｅ４に含まれるタンパク質を同定するために，以下に示す方法により，該タンパク質のアミノ酸配列を決定した。
【００７０】
即ち，まず試料Ｅ４に含まれるタンパク質１ｍｇを７０％のギ酸２００μｌに溶かし，１０ｍｇの臭化シアン（和光純薬株式会社）を加えて２０℃で１６時間反応させ，臭化シアン分解を行った。臭化シアン分解は，タンパク質中のメチオンニン残基のところでペプチド結合を切断する方法である。上記臭化シアン分解後，４ｍｌの水を加え，凍結乾燥により乾燥させた。次に，ポリペプチドに分解した試料Ｅ４をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより，ポリペプチド断片に分離した。このポリペプチド断片を電気的にロシュ・ダイアグノスティック株式会社製のＰＶＤＦ膜（商品名 ＰＶＤＦ ウエスタンブロッティング メンブレン）に写し取った。このＰＶＤＦ膜に写し取られたポリペプチド断片を，実施例２と同様にして，プロテインシーケンサーによって分析した。
【００７１】
その結果，Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｎ−（Ｘは不明）という配列が得られた。この配列は，既知のレクチンの１種である小麦胚アグルチニン中のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−という配列と非常に類似している。
したがって，試料Ｅ４は小麦胚アグルチニンであることが強く示唆された。
【００７２】
（実施例５）
本例では，エノキタケからレクチンを取得する例を示す。
まず，上記生体材料としての市販のエノキタケ５０ｇから，実施例１と同様にして抽出画分を抽出した（抽出工程，濃縮工程，透析工程）。続いて，該抽出画分を，ブタ血漿を固定化した生体材料固定化担体を具備する上記アフィニティーカラムに吸着させ（吸着工程），さらに該アフィニティーカラムを洗浄液にて洗浄した（洗浄工程）。
【００７３】
次に，上記アフィニティーカラム内に２００ｍＭのラクトース溶液を５０ｍｌ通し，エノキタケレクチンを含む溶出液を取得した。これを試料Ｅ５とした。
上記試料Ｅ５に含まれるエノキタケレクチンの濃度を実施例１と同様の方法により測定したところ，濃度は４０μｇ／ｍｌであり，その収量は，２ｍｇであった。
【００７４】
次に，実施例１と同様に，１０μｌの上記試料Ｅ５をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により，電気泳動した。その結果を図６に示す。なお，マーカータンパク質としては，実施例４と同様のものを用いた。また，電気泳動像の各バンドの位置は本明細書作成の都合上，鮮明に表示できないため，各バンドの位置を点線で囲って示してある。
【００７５】
図６より知られるごとく，試料Ｅ５は，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像で，単一なバンドを示し，充分に精製されていた。
また，実施例１と同様にして，試料Ｅ５について赤血球凝集活性を調べたところ，試料Ｅ５は２００ｎｇ／ｍｌという低い濃度で赤血球凝集活性を示した。その結果，試料Ｅ５はレクチンであることが確認された。
【００７６】
以上実施例１〜実施例５に示すごとく，本例のレクチンの分離精製方法は，米ヌカ，タチナタマメ等の生体材料からレクチンを簡単に短時間で分離精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１にかかる，米ヌカレクチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像を示す説明図。
【図２】実施例１にかかる，赤血球凝集活性測定の結果を示す説明図。
【図３】実施例１にかかる，細胞増殖抑制試験の結果を示す説明図。
【図４】実施例２にかかる，タチナタマメレクチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像を示す説明図。
【図５】実施例４にかかる，小麦胚レクチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像を示す説明図。
【図６】実施例５にかかる，エノキタケレクチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像を示す説明図。[0001]
【Technical field】
The present invention relates to a method for efficiently isolating a lectin protein by employing a novel separation and purification method.
[0002]
[Prior art]
A lectin is a generic name for proteins that recognize sugar chains, and has an activity of specifically binding to a sugar chain having a specific structure on blood cells, cell surfaces, etc., and aggregating the blood cells and cells. Lectins are widely present in the biological world such as animals, plants and microorganisms. Some of these lectins have unique activities that are rarely found in other lectins.
[0003]
For example, it is known that rice bran lectin contained in rice bran has an activity of suppressing cell growth. In addition, galectins that are widely present in animal bodies are known to induce apoptosis of lymphocytes and the like, and to suppress cancer metastasis. Such lectins are very useful in medicine. Therefore, various lectins have been isolated from various individuals and their functions are being actively investigated.
[0004]
For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 08-119994 discloses a method for separating and purifying potato-derived mannose / glucose affinity lectin by affinity chromatography using maltose as a ligand. Japanese Patent Publication No. 10-504287 discloses a method for isolating MLI-type isolectin by chromatography of mistletoe extract on lactosyl sepharose. Furthermore, Table 95/018149 discloses a method for separating and purifying novel lectins from seaweeds belonging to the genus Kirinzai and obtaining them in large quantities.
[0005]
Thus, there are various materials and methods for isolating lectins. These lectins can be used as cell fractionation reagents, clinical laboratory reagents, clinical therapeutic agents, etc. by utilizing their sugar chain binding specificity, blood group specificity, anticancer action and the like.
On the other hand, it is thought that there are many various lectins that have not yet been clarified in the living world. On the other hand, the industry needs to develop lectins with new characteristics that meet various purposes. In order to further clarify the characteristics of undeveloped lectins and develop industrial demand, technology for separating and purifying useful lectins at low cost is necessary.
[0006]
[Problems to be solved]
However, the conventional method for separating and purifying lectins is complicated and involves many steps, and requires a lot of time. Even in the method using affinity chromatography with relatively few steps, it is necessary to immobilize an expensive protein on a carrier in order to produce an affinity column. Moreover, even if a column is produced using this expensive protein, a desired lectin cannot always be obtained, so that there is a problem that the cost effectiveness is low.
[0007]
The present invention has been made in view of such conventional problems, and an object of the present invention is to provide a method for separating and purifying lectins that can easily separate and purify lectins from various biological materials in a short time.
[0008]
[Means for solving problems]
A first invention is a method for separating and purifying lectin using affinity chromatography,
An extraction step of extracting a biomaterial with an aqueous medium to obtain an extracted fraction;
An adsorption step of adsorbing the lectin contained in the extracted fraction on an affinity column comprising an animal plasma immobilization carrier obtained by immobilizing animal plasma on a carrier;
A method for separating and purifying lectins, comprising an elution step of eluting lectins from the affinity column using hapten sugars (Claim 1).
[0009]
In the present invention, the lectin contained in the extracted fraction is adsorbed on an affinity column having an animal plasma immobilization carrier in which animal plasma is immobilized on a carrier (adsorption step).
Therefore, cheap animal plasma such as pigs can be immobilized on the animal plasma immobilization carrier, and lectin can be separated and purified from the biomaterial at low cost. Here, the animal serum contains a large amount of a protein having a sugar chain, so-called glycoprotein. The animal plasma immobilization carrier has the glycoprotein immobilized on the surface thereof. Therefore, the lectin contained in the extracted fraction selectively binds to the sugar chain of the glycoprotein immobilized on the surface of the animal plasma immobilization carrier. Therefore, the animal plasma immobilization carrier can selectively adsorb the lectin contained in the extracted fraction.
[0010]
In the separation and purification step, lectin is eluted from the affinity column using hapten sugar. Here, the hapten sugar dissociates the bond between the animal plasma immobilization carrier and the lectin in the adsorption step.
Therefore, lectins can be easily recovered from the affinity column using the hapten sugar.
[0011]
The hapten sugar can elute various lectins depending on the type. Therefore, various lectins can be obtained by arbitrarily determining the type of biomaterial, animal plasma, and hapten sugar. That is, according to the present invention, various lectins can be comprehensively acquired from various biomaterials.
[0012]
Further, the present invention includes the above-described extraction process, adsorption process, and separation / purification process. Therefore, lectins can be easily separated and purified from biomaterials in the above three steps.
[0013]
The animal plasma immobilization carrier used for the separation and purification of lectins can be easily regenerated by washing with a saline solution containing a protein denaturant such as 4M urea. Thereby, it can be used repeatedly 10 times or more. Therefore, the cost for separating and purifying lectins can be reduced.
[0014]
Thus, according to the present invention, it is possible to provide a method for separating and purifying lectins that can easily separate and purify lectins from various biological materials in a short time.
[0015]
Next, the second invention is an animal plasma immobilization carrier used for affinity chromatography, wherein the animal plasma immobilization carrier is obtained by immobilizing animal plasma on a carrier. (Claim 9).
[0016]
In the present invention, the animal plasma immobilization carrier is formed by immobilizing animal plasma on a carrier.
Therefore, the carrier for immobilizing animal plasma has glycoproteins having sugar chains of various structures contained in the animal plasma bound to the surface thereof. Therefore, a lectin that recognizes a sugar chain and binds to the sugar chain can be selectively bound. Therefore, the animal plasma immobilization carrier can be used for selectively isolating a lectin that recognizes a sugar chain from, for example, biomaterials containing various substances. The present invention is the same as the animal plasma immobilization carrier used in the lectin separation and purification method of the first invention.
[0017]
Next, a third invention is an affinity column used for affinity chromatography, wherein the affinity column includes an animal plasma immobilization carrier formed by immobilizing animal plasma on a carrier. (Claim 11).
[0018]
In the present invention, the affinity column includes an animal plasma immobilization carrier formed by immobilizing animal plasma on a carrier.
Therefore, when affinity chromatography is performed using the affinity column, a lectin that recognizes a sugar chain can be selectively isolated from a biomaterial or the like. The animal plasma immobilization carrier is the same as that of the second invention (invention 9).
[0019]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the first invention (invention 1), the biomaterial is a biomaterial such as cells, tissues, organs, etc. of animals, plants and microorganisms containing lectins. Specific examples of such biomaterials include rice bran, red bean, wheat embryo, enokitake, mistletoe, mushroom, soybean, pea, lentil, lima bean, western mushroom, peanut, potato, kidney bean, tomato, eel serum, etc. There is.
[0020]
In addition, as the aqueous medium, one that dissolves lectin and does not denature or destroy lectin can be used. Examples of such an aqueous medium include phosphate buffer, physiological saline, Tris-HCl buffer, and the like.
[0021]
In addition, as a method for obtaining the extracted fraction in the extraction step, for example, the biomaterial is pulverized or homogenized, suspended in an aqueous medium, and then centrifuged to obtain a supernatant as the extracted fraction. Etc.
[0022]
Examples of the animal plasma that can be used include porcine plasma, bovine plasma, human plasma, rabbit plasma, goat plasma, sheep plasma, horse plasma, rat plasma, and mouse plasma.
Moreover, as said support | carrier, gel-like or bead-like resin etc. which consist of polysaccharide fiber processed into particles, such as Sepharose 4B (trademark), can be used, for example. Examples of the components of the polysaccharide fiber include agarose, dextran, starch, and cellulose.
[0023]
The carrier is preferably used as an activated carrier by reacting with cyanogen bromide under alkaline conditions before immobilizing animal plasma. In this case, animal plasma can be easily immobilized on the activated carrier.
[0024]
The animal plasma immobilization carrier is preferably blocked with monoethanolamine.
In this case, monoethanolamine acts on an unreacted portion between the carrier and animal plasma, and a non-specific adsorption between the animal plasma-immobilized carrier and the biological material can be obtained. it can.
[0025]
Examples of the hapten sugar include N-acetylglucosamine solution, methyl α-mannoside solution, lactose solution, sucrose solution, glucose solution, methyl α-glucoside solution, methyl β-glucoside solution, N-acetylgalactosamine solution and the like.
[0026]
In the present invention, the lectin-containing solution obtained in the elution step can be adsorbed again on the affinity column as an extraction fraction in the adsorption step, and then the lectin can be eluted in the same manner as in the elution step.
In this case, a highly pure lectin can be obtained. As described above, the purity of the lectin obtained can be further increased by adsorbing the eluate obtained in the elution step to the affinity column and repeating the elution operation a plurality of times.
[0027]
Next, the animal plasma is preferably porcine plasma or bovine plasma (claim 2).
In this case, the animal plasma immobilization carrier and affinity column can be produced at low cost.
[0028]
Next, it is preferable to have a washing step between the adsorption step and the elution step by eluting and removing impurities through the washing liquid in the affinity column.
In this case, the lectin can be purified with high purity.
[0029]
Next, between the extraction step and the adsorption step, a concentration step for concentrating the extracted fraction using an ammonium sulfate precipitation method, and a dialysis step for dialysis of the extracted fraction concentrated in the concentration step may be provided. Preferred (claim 4).
In this case, the extracted fraction can be concentrated in the concentration step, and salts and the like contained in the extracted fraction can be removed in the dialysis step. Therefore, the adsorption rate of the lectin to the animal plasma immobilization carrier is improved, and the recovery rate of the lectin from the biomaterial is improved.
[0030]
Next, it is preferable that the biomaterial is rice bran and the hapten sugar is an N-acetylglucosamine solution.
In this case, rice bran lectin can be obtained from rice bran. This rice nucleectin has the effect of suppressing cell growth. Therefore, it may be an effective treatment for cancer.
[0031]
Next, it is preferable that the biomaterial is tachinama bean and the hapten sugar is a methyl α-mannoside solution (claim 6).
In this case, the red bean lectin can be obtained from the red bean. In particular, in this case, concanavalin A of red bean lectin can be obtained as the red bean lectin.
[0032]
Next, it is preferable that the biomaterial is a wheat embryo and the hapten sugar is an N-acetylglucosamine solution.
In this case, a wheat embryo lectin can be obtained from the wheat embryo. Particularly in this case, wheat germ agglutinin can be obtained as the wheat germ lectin.
[0033]
Next, it is preferable that the biomaterial is an aqueous medium extract of enokitake and the hapten sugar is a lactose solution.
In this case, enokitake lectin can be obtained from the enokitake.
[0034]
Next, in the second invention (invention 9), the same carrier and animal plasma as in the first invention can be used.
[0035]
The animal plasma is preferably porcine plasma or bovine plasma (claim 10).
In this case, the animal plasma immobilization carrier can be provided at low cost by using inexpensive pig plasma or bovine plasma.
[0036]
Next, in the third invention (invention 11), the same carrier and animal plasma as in the first invention can be used.
[0037]
The animal plasma is preferably porcine plasma or bovine plasma (claim 12).
In this case, the affinity column can be provided at low cost using inexpensive porcine plasma or bovine plasma.
[0038]
【Example】
(Example 1)
The lectin separation and purification method in this example is a lectin separation and purification method using affinity chromatography. In the separation and purification method of this example, the extraction fraction is obtained by extracting the biomaterial with an aqueous medium to obtain an extract fraction, and an affinity column comprising an animal plasma immobilization carrier obtained by immobilizing animal plasma on a carrier. An adsorption step for adsorbing the lectin contained in the solution, and an elution step for eluting the lectin from the affinity column using hapten sugar.
[0039]
Hereinafter, this example will be described in detail.
In this example, rice bran and swine plasma were prepared as the biomaterial and animal plasma, respectively. Further, Sepharose 4B manufactured by Amersham Pharmacia Co., Ltd. was prepared as the carrier.
[0040]
100 g of the carrier was suspended in 100 ml of water, and 25 ml of a dimethylformamide solution (1 g / ml) of cyanogen bromide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. Furthermore, 40% caustic soda was added dropwise, and the mixture was reacted at 20 ° C. for 12 minutes while maintaining pH 11. Then, it was washed with 1.6% sodium bicarbonate aqueous solution to prepare activated Sepharose 4B as the activated carrier. Subsequently, this activated Sepharose 4B was immersed in 200 ml of porcine plasma, and the porcine plasma was immobilized on the activated Sepharose 4B while gently stirring at 20 ° C. for 16 hours to prepare an animal plasma immobilization carrier.
[0041]
Next, this animal plasma immobilization carrier was immersed in a 6% monoethanolamine solution adjusted to pH 7.5 with hydrochloric acid and blocked at 20 ° C. for 2 hours with gentle stirring. Thereafter, this animal plasma immobilization carrier was packed into a column (trade name Econo Column) manufactured by Nippon Bio-Rad Laboratories Co., Ltd. to obtain an affinity column. The volume of the gel bed of the animal plasma immobilization carrier in the affinity column was 10 ml.
[0042]
Next, 20 g of rice bran was added to 100 ml of phosphate buffered saline (pH 7.5) as the aqueous medium and stirred sufficiently. Thereafter, centrifugation was performed at 13,000 × g for 10 minutes, and the supernatant was collected as the extracted fraction (extraction step).
Furthermore, ammonium sulfate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the supernatant so as to be 70% saturated, and left at 4 ° C. for 1 hour. Subsequently, the mixture was centrifuged at 13,000 × g for 10 minutes to collect the precipitate (concentration step). 50 ml of phosphate buffered saline was added to the precipitate to dissolve the precipitate, followed by dialysis. The dialyzed sample was centrifuged at 4 ° C., 21,000 × g for 10 minutes, and the supernatant was collected to obtain the final extracted fraction (dialysis step).
[0043]
Next, in the adsorption step, the extracted fraction after the dialysis step was gently layered on the animal plasma immobilization carrier in the affinity column, and passed through the animal plasma immobilization carrier by natural fall (adsorption step). When the extracted fraction passed completely, 100 ml of phosphate buffered saline (pH 7.5) was passed through to wash the inside of the affinity column (washing step).
[0044]
Next, 50 ml of 250 mM N-acetylglucosamine was passed through the affinity column to obtain 50 ml of an eluate containing rice nukalectin (elution step). This eluate was designated as Sample E1.
When the concentration of rice lectin contained in the sample E1 was measured by a method using a protein assay reagent manufactured by Nippon Bio-Rad Laboratories Co., Ltd., the concentration was 80 μg / ml and the yield was 4 mg.
[0045]
The sample E1 is considered to contain lectin from the separation and purification method. To verify this, the following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and hemagglutination activity were measured.
[0046]
(SDS-PAGE)
10 μl of the sample E1 was electrophoresed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The gel after electrophoresis was stained with Coomassie Brilliant Blue (CBB), and an electrophoretic image was photographed. The result is shown in FIG.
In addition, as a marker protein used for SDS-PAGE, a standard mixture (30-200 kDa) manufactured by Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd. was used. In addition, the position of each band in the electrophoretic image cannot be clearly displayed for the convenience of preparing this specification, and therefore the position of each band is shown surrounded by a dotted line.
[0047]
In FIG. 1,
[0048]
(Measurement of hemagglutination activity)
First, rabbit erythrocytes were collected, and the erythrocytes were spread on four plates.
Next, sample E1 was added to these four plates so that the final concentrations were 100 ng / ml, 50 ng / ml, 25 ng / ml, and 0 ng / ml, and these were added to sample e1, sample e2, sample e3, respectively. Sample c1 was obtained.
The samples e1 to e3 and the sample c1 were allowed to stand at 25 ° C. for 4 hours, and the blood cell morphology was photographed. The result is shown in FIG.
[0049]
As can be seen from FIG. 2, in the samples e1 and e2, red blood cells were aggregated and precipitated on the entire bottom surface of the plate. On the other hand, for sample e3, red blood cell aggregation was hardly observed, red blood cells gathered at one point on the bottom of the plate, and no red blood cell aggregation was observed at sample c1. From this, the sample E1 showed hemagglutination activity at a very low concentration of 50 ng / ml, and it was confirmed that the sample E1 is a kind of lectin.
[0050]
In addition, it has been already confirmed that rice nucleectin has a cell growth inhibitory effect and a life prolonging effect in mice transplanted with cancer cells in animal experiments. In order to confirm whether or not the sample E1 also has these effects, a comparison of the cell growth inhibitory effects of the sample E1 and the commercially available rice nucurectin and animal experiments were performed as follows.
[0051]
(Cell growth inhibitory effect)
First, human monocytic leukemia U937 cells (U937 cells) suspended in a culture solution in 2 horizontal rows (8 × 2 rows, total 16 wells) of a 48-well multiplate (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) 2 × 10 Four Sowing one by one. Next, the above sample E1 and commercially available rice nectar lectin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., trade name: rice nukaaglutinin) were added as an additive to the culture solution by a serial dilution method so that the final concentration was 0 to 40 μg / ml. .
[0052]
The plate is 37 ° C, 5% CO 2 Cultured for 24 hours under the conditions. After culturing for 24 hours, the number of cells in each well was measured, and the relative number of cells relative to the number of cells to which no additive was added was calculated by the following formula. The result is shown in FIG. In FIG. 3, ◯ indicates the result obtained using the sample E1 as an additive, and Δ indicates the result obtained using a commercially available rice nectar lectin as the additive.
[0053]
(Formula 1)
Relative number of cells = (number of cells when cultured in a culture solution containing additives) × 100 / (number of cells when cultured in a culture solution containing no additives)
[0054]
As can be seen from FIG. 3, the sample E1 obtained in Example 1 had a cell growth inhibitory effect similar to that of commercially available rice nucleectin, and suppressed the growth of U937 cells in a concentration-dependent manner.
Although not shown in the present specification, when the same experiment as described above was performed using human gastric cancer MKN45 cells (MKN45 cells), the sample E1 was also the same as the commercially available rice lectin for MKN45 cells. It had a growth inhibitory effect.
[0055]
(Animal experimentation)
First, in each abdominal cavity of 10 C57 BL / 6 mice, 1 x 10 6 Mouse Lewis lung cancer 3LL cells (3LL cells) were transplanted. Next, 0.2 ml of the sample E1 having a concentration of 10 μg / ml was administered to 5 mice out of the mice transplanted with 3LL cells, and this was used as an experimental mouse group. On the other hand, 0.2 ml of physiological saline was administered to the remaining 5 mice, and this was used as a control mouse group. The number of days until the mice in the experimental mouse group and the control mouse group died was measured. The sample E1 and physiological saline were administered to the experimental mouse group and the control mouse group every two days.
The results are shown in Table 1.
[0056]
[Table 1]
As is known from Table 1, the experimental mouse group had longer survival days than the control mouse group, and a significant difference was observed. Thus, it was confirmed that the sample E1 has the same properties as the conventionally known rice lectin, and the sample E is a rice nuclein.
Therefore, according to this example, it is possible to provide a method for separating and purifying lectins that can easily separate and purify lectins from various biological materials in a short time.
[0058]
(Example 2)
In this example, an example in which a lectin is obtained from a red bean is shown.
First, 20 g of commercially available ground bean pulverized material (manufactured by Sigma Aldrich Japan Co., Ltd., trade name: Tachinama bean meal) was prepared. The extracted fraction is extracted, concentrated, and dialyzed from this ground bean pulverized product in the same manner as in Example 1 (extraction process, concentration process, dialysis process), and the extracted fraction is fixed to a biological material on which porcine plasma is immobilized. It was made to adsorb | suck to the said affinity column which comprises a fluorination support | carrier (adsorption process), and this affinity column was wash | cleaned with the washing | cleaning liquid (washing process).
[0059]
Next, 50 ml of a 500 mM methyl α-mannoside solution was passed through the affinity column to obtain an eluate containing a red bean lectin. This was designated as Sample E2.
When the concentration of red bean lectin contained in the sample E2 was measured by the same method as in Example 1, the concentration was 160 μg / ml and the yield was 8 mg.
[0060]
Next, as in Example 1, 10 μl of sample E2 was electrophoresed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The result is shown in FIG.
In addition, as a marker protein used for SDS-PAGE, a standard mixture (30-200 kDa) manufactured by Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd. was used. In addition, the position of each band in the electrophoretic image cannot be clearly displayed for the convenience of preparing this specification, and therefore the position of each band is shown surrounded by a dotted line.
[0061]
As can be seen from FIG. 4, sample E2 showed a single band in the SDS-PAGE electrophoresis image and was sufficiently purified.
In order to identify the protein contained in this sample E2, the amino acid sequence of the protein was determined by the following method.
[0062]
First, the protein separated by SDS-PAGE was electrically copied onto a PVDF membrane (polyvinylidene difluoride membrane, trade name: PVDF Western blotting membrane) manufactured by Roche Diagnostics Co., Ltd. (Western blotting). Next, the protein copied on the PVDF membrane was analyzed by a protein sequencer (product name: Procise Model 491 Protein Sequencing System) manufactured by Nippon Applied Biosystems.
[0063]
As a result, the sequence of Ala-Asp-Thr-Ile-Val-Ala-Val-Glu-Leu-Asp- was obtained, and this sequence was consistent with the sequence of Concanavalin A, one of the known lectins. From this, it was confirmed that the sample E2 is the concanavalin A of the red bean.
[0064]
(Example 3)
In this example, bovine plasma is used as the animal plasma, and a lectin is obtained from the red bean.
First, in the same manner as in Example 1, activated Sepharose 4B was produced as the activated carrier. Subsequently, this activated Sepharose 4B was immersed in 200 ml of bovine plasma and gently stirred at 20 ° C. for 16 hours. As a result, bovine plasma was immobilized on the carrier, and an animal plasma-immobilized carrier was obtained. In the same manner as in Example 1, the animal plasma immobilization carrier was immersed in a 6% monoethanolamine solution adjusted to pH 7.5 with hydrochloric acid and blocked at 20 ° C. for 2 hours with gentle stirring. . Thereafter, in the same manner as in Example 1, this animal plasma-immobilized carrier was packed into a column (trade name Econocolumn) manufactured by Nippon Bio-Rad Laboratories Co., Ltd. to obtain an affinity column. The volume of the gel bed of the animal plasma immobilization carrier in the affinity column was 10 ml.
[0065]
Next, in the same manner as in Example 2, an extracted fraction was obtained from 20 g of ground peas (extraction process, concentration process, dialysis process). This extracted fraction was passed through the affinity column (adsorption step). Subsequently, the affinity column was washed in the same manner as in Example 1 (washing step), and eluted in the same manner as in Example 2 with a 500 mM methyl α-mannoside solution (elution step). The eluate obtained here was designated as Sample E3.
As a result, the sample E3 was concanavalin A, which was the same as in Example 2.
[0066]
Example 4
In this example, a lectin is obtained from a wheat embryo.
First, commercially available wheat embryo (Sigma Aldrich Japan Co., Ltd., trade name: wheat embryo) was pulverized to obtain 20 g of pulverized wheat embryo as the biomaterial. Extracted fractions are extracted from the pulverized wheat embryo in the same manner as in Example 1 (extraction step, concentration step, dialysis step), and the extracted fractions are provided with a biomaterial-immobilized carrier on which porcine plasma is immobilized. The affinity column was adsorbed (adsorption step), and the affinity column was washed with a washing solution (washing step).
[0067]
Next, 50 ml of a 250 mM N-acetylglucosamine solution was passed through the affinity column to obtain an eluate containing wheat embryos. This was designated as Sample E4.
When the concentration of the wheat embryo lectin contained in the sample E4 was measured by the same method as in Example 1, the concentration was 120 μg / ml, and the yield was 6 mg.
[0068]
Next, in the same manner as in Example 1, 10 μl of the sample E4 was electrophoresed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The result is shown in FIG. As the marker protein, Dalton Mark VII-L manufactured by Sigma Aldrich Japan Co., Ltd. was used. In addition, the position of each band in the electrophoretic image cannot be clearly displayed for the convenience of preparing this specification, and therefore the position of each band is shown surrounded by a dotted line.
[0069]
As known from FIG. 5, the sample E4 showed a single band in the SDS-PAGE electrophoresis image and was sufficiently purified.
In order to identify the protein contained in this sample E4, the amino acid sequence of the protein was determined by the following method.
[0070]
That is, first, 1 mg of protein contained in sample E4 was dissolved in 200 μl of 70% formic acid, 10 mg of cyanogen bromide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and the mixture was reacted at 20 ° C. for 16 hours to perform cyanogen bromide decomposition. Cyanogen bromide degradation is a method of cleaving peptide bonds at methionine residues in proteins. After the above cyanogen bromide decomposition, 4 ml of water was added and dried by lyophilization. Next, the sample E4 decomposed into polypeptides was separated into polypeptide fragments by SDS-PAGE. This polypeptide fragment was electrically copied onto a PVDF membrane (trade name: PVDF Western blotting membrane) manufactured by Roche Diagnostics. The polypeptide fragment copied on the PVDF membrane was analyzed by a protein sequencer in the same manner as in Example 2.
[0071]
As a result, a sequence of Gly-Gly-Asp-Tyr-Xaa-Gly-Lys-Gly-Xaa-Gln- (X is unknown) was obtained. This sequence is very similar to the sequence Gly-Gly-Asp-Tyr-Cys-Gly-Lys-Gly-Cys-Gln- in wheat germ agglutinin, one of the known lectins.
Therefore, it was strongly suggested that sample E4 was wheat embryo agglutinin.
[0072]
(Example 5)
In this example, a lectin is obtained from enokitake mushroom.
First, an extraction fraction was extracted from 50 g of commercially available enokitake as the biomaterial in the same manner as in Example 1 (extraction step, concentration step, dialysis step). Subsequently, the extracted fraction was adsorbed on the affinity column including the biological material-immobilized carrier on which porcine plasma was immobilized (adsorption step), and the affinity column was further washed with a washing solution (washing step).
[0073]
Next, 50 ml of a 200 mM lactose solution was passed through the affinity column to obtain an eluate containing enokitake lectin. This was designated as Sample E5.
When the concentration of enokitake lectin contained in the sample E5 was measured by the same method as in Example 1, the concentration was 40 μg / ml, and the yield was 2 mg.
[0074]
Next, in the same manner as in Example 1, 10 μl of the sample E5 was electrophoresed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The result is shown in FIG. In addition, as a marker protein, the same protein as in Example 4 was used. In addition, the position of each band in the electrophoretic image cannot be clearly displayed for the convenience of preparing this specification, and therefore the position of each band is shown surrounded by a dotted line.
[0075]
As is known from FIG. 6, sample E5 showed a single band in the SDS-PAGE electrophoresis image and was sufficiently purified.
Moreover, when the hemagglutination activity of the sample E5 was examined in the same manner as in Example 1, the sample E5 showed the hemagglutination activity at a low concentration of 200 ng / ml. As a result, it was confirmed that sample E5 was a lectin.
[0076]
As described above in Examples 1 to 5, the method for separating and purifying lectins of this example can easily separate and purify lectins from biomaterials such as rice bran and rice bean in a short time.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is an explanatory diagram showing an SDS-PAGE electrophoretic image of rice nectar lectin according to Example 1.
FIG. 2 is an explanatory diagram showing the results of hemagglutination activity measurement according to Example 1.
FIG. 3 is an explanatory diagram showing the results of a cell growth inhibition test according to Example 1.
FIG. 4 is an explanatory diagram showing an SDS-PAGE electrophoresis image of a red bean lectin according to Example 2.
5 is an explanatory diagram showing an SDS-PAGE electrophoresis image of wheat embryo lectin according to Example 4. FIG.
6 is an explanatory view showing an SDS-PAGE electrophoresis image of enokitake lectin according to Example 5. FIG.
Claims (12)
生体材料を水性媒体により抽出して抽出画分を得る抽出工程と，
担体に動物血漿を固定化してなる動物血漿固定化担体を具備するアフィニティーカラムに上記抽出画分に含まれるレクチンを吸着させる吸着工程と，
ハプテン糖を用いて上記アフィニティーカラムからレクチンを溶出させる溶出工程とからなることを特徴とするレクチンの分離精製方法。A method for separating and purifying lectins using affinity chromatography, comprising:
An extraction step of extracting a biomaterial with an aqueous medium to obtain an extracted fraction;
An adsorption step of adsorbing the lectin contained in the extracted fraction on an affinity column comprising an animal plasma immobilization carrier obtained by immobilizing animal plasma on a carrier;
A method for separating and purifying lectins, comprising an elution step of eluting lectins from the affinity column using hapten sugar.
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