UA46739C2 - Спосіб виробництва медикаменту для профілактики або лікування людей або тварин, які уражені ендотоксемією, фармацевтична композиція, вільна від білків та пептидів (варіанти) - Google Patents

Abstract

Описано метод лікування та профілактики токсичних станів, спричинених дією ендотоксинів. Для цього застосовують композиції які містять в своєму складі фосфоліпіди. Композиція не містить білків та пептидів, але може містити тригліцериди, інші полярні або нейтральні ліпіди, жовчні кислоти або їхні солі.

Description

Опис винаходу

Зта заявка - частичное продолжение заявки Мо 08/288 568, поданной 10 августа 1994 г., которая является частичньм продолжением заявки РСТ/О593/07453, поданной 9 августа 1993 г., которая является частичньім продолжением заявки США Мо 07/928930, поданной 12 августа 1992 г., по которой вьідан патент США Мо 5 344 822. Все зти заявки и патенть! использовань в зтом описаний путем ссьлок.

Изобретение относится к лечению зндотоксемии, вьізьіваемой зндотоксинами, в частности, к лечению при отравлениях зндотоксинами введением в организм различньїх составов, которне нейтрализуют и/или удаляют 70 зндотоксинь из организма, а также для профилактики с использованием зтих составов.

Обьічная сьворотка содержит некоторое количество частиц липопротеидов, которье различаются плотностью, а именно, хиломикроньії, ЛОНП (липопротеид очень низкой плотности), ЛНП (липопротеид низкой плотности), и ЛВП (липопротейд вьісокой плотности). Они содержат свободньй зтерифи-цированньй холестерин, триглицеридьі, фосфолипидь, некоторне другие второстепеннье липиднье компоненть!, и белок. 712 ДОНП переносит знергию, в форме триглицеридов, к клеткам тела для накопления и использования. При поступлений в клетки триглицеридов ЛОНП превращаєтся в ЛНП. ЛНІП переносит холестерин и другие растворимье липидами материаль! в клетки тела, а ЛВП переносит избьтточнье или неспособнье растворяться липидами материальй в печень для вьіведения из организма. Обьчно зти липопротеидь находятся в равновесии, обеспечивая собственно доставку и удаление растворимьїх липидами материалов. Иногда очень низкий уровень ЛВП может стать причиной многих заболеваний, а также может приводить к вторичньм осложнениям при других заболеваниях.

В нормальньїх условиях, природньій ЛВП - зто твердая частица, поверхность которой покрита моно слоем фосфолипида, окружающим гидрофобную сердцевину. Аполипротеийдь А-І и А-ІЇ прикрепляются к поверхности частицьі ЛВП в результате взаимодействия гидрофобной поверхности их альфа спиральньхх доменов. При с 75 возникновений или вьіделении зта частица имеет дискообразную форму и способна принимать свободньй (3 холестерин в свой бислой. Холестерин зтерифицируется лецитинхолестерол-ацилтрансферазой (ЛХАТ) и перемещаеєтся в центр диска. Движение сложного зфира холестерина к центру происходит из-за пространственной ограниченности и низкого козффициента растворимости внутри бислоя. По мере того, как холестерин зтерифицируется и движется к центру, частица ЛВП "раздуваєтся", приобретая сферическую б форму. Зфир холестерина и другие водо-нерастворимье липидьі), которье накапливаются в "раздутой со сердцевине" ЛВП затем вьіводятся печенью.

В публикации Апапіпагатаїйан, іп Зедгеві еї аіІ, Мей. Епгутої. 128:627-647 (1986) описан ряд пептидов, - образующих "спиральнье колеса", как результат взаимодействия аминокислот в пептиде. Такие спиральнье («о колеса в своей конфигурации имеют неполярную и полярную поверхности. В общем из зтого источника следует, 30 цто пептидь!ї могут замещать апопротейнь! в зтих частицах. т

В публикации допаз еї а!., Ме(й. Епгут. 128А: 553-582 (1986) показано получение большого разнообразия реконструированньїх частиц, подобньїх ЛВП. Для получения апо-ЛВП белков вьіделяют и делипидируют ЛВП стандартньми методами (см. работьі Наїсй еї аї., Адм.ьр.Кевз. 6:1-68 (1968); Зсапи еї аї., АпаІ.Віоспет.44а: « 576-588 (1971)). Апопротеиньї фракционируют и реконструируют фосфолипидом с холестерином или без него, З7З 70 используя диализ против моющего средства. с В публикации Маї; ейаї, 9У.ВіоЇ.Спет.257(8): 4535-4540 (1982), описана мицелла фосфатидилхолина с "з аполипопротеидом А-1. Приведеньї различньіе соотношения двух компонентов и вьісказано предположение, что описанньй метод может бьіть использован для получения других мицелл. Также вьісказано предположение, что мицелль! можно использовать в качестве субстрата, катализируемого ферментом, или модели для молекуль! 75 лВп. Однако, не рассмотрено применение мицелл для удаления холестерина и не дано никаких предложений те использовать их в диагностике или терапии. (Ге) В публикации УМіШатве еї аї!., Віоспет. 85 Віорпуз. Асіа 875: 183-194 (1986), касаются фосфолипидньмх липосом, вводимьїх в плазму, которая поглощает апобелки и холестерин. Описаньі липосомьі, которье сами ї поглощают апобелки іп мімо, а также холестерин, и вьісказано предположение, что поглощение холестерина (4) 50 усиливается в тех фосфолипидньх липосомах, которне взаймодействовали и поглотили апобелки.

В работе УМіПаттз еї а!., Регзр. Вісі. 5 Мед. 27(3): 417-431 (1984) рассматривают, лецитиновье липосомь! как шо средство удаления холестерина. В статье обобщеньї предшествующие работь! и показано, что липосомьї, которье содержат апобелки, удаляют холестерин из клеток іп мйго более зффективно, чем липосомь, которье не содержат их. Авторьі не рассматривают использование іп мімо апобелка, содержащего липосомь! или 59 мицелль, и советуют проявлять осторожность при работе іп мімо с липосомами.

ГФ) Важно отметить, что между частицами согласно настоящему изобретению и липосомами и мицеллами, юю описанньми ранее, имеется четкая и значительная разница. Последние имеют бислойную структуру липидсодержащих молекул, которая окружает внутреннее водное центральное пространство. Однако структура липосом не допускает заполнение внутреннего пространства компонентами, растворимьми липидами, а любое 60 молекулярное поглощение компонентов, растворимьїх липидами, ограничено пространством между двумя липидньми слоями. В результате зтого обьем, где возможно поглощение и вьіделение таких материалов как холестерин и других растворимьїх липидами материалов значительно меньше, чем обьем для частиц согласно изобретению, которьій увеличивается подобно воздушному шару, заполняясь отобранньім материалом.

Зндотоксиновьй бактериально-токсический шок - зто состояние, часто с летальньм исходом, бо провоцируемое вьіделением липополисахарида (ЛПС) из наружной мембрань! большинства грамотрицательньх бактерий (например, ЕзсПегіспіа соїї: ЗаІтопейа їутрпітигішт). Структура бактериального ЛПС довольно хорошо обьяснена, а единственная молекула, названная липид А, связана с ацильньми цепями через свою глюкозаминовую цепь (см. Каєїг, Апп. Реу. Віоспет. 59: 129 -170 (1990)).

Молекула липида А служит мембранньм фиксатором структурьі липополисахарида (ЛПС), которьй участвует в развитии зндотоксинового шока. Следует указать, что молекульї ЛПС характеризуются структурой типа липида А и частью полисахарида. Зта часть может отличаться деталями у различньїх молекул ЛПС, но она сохраняет общую структурную основу зндотоксинов. Бьло бь! неверно говорить, что молекула ЛІПС одинаковая у всех бактерий (см. Каеї7, вьіше). Обьічно специалисть! назьівают различнье молекуль! ЛІС "зндотоксинами", 7/0 М зтот термин будет применяться далее для обозначения молекул ЛПС.

В патенте США Мо 5 128 318, описание к которому использовано путем ссьлки, указано, что реконструированнье частицьі, содержащие как аполипопротеид, ассоциированньй с ЛВП, так и липид, способньй связьівать зндотоксин для его инактивации, можно использовать как зффективнье материаль! для ослабления токсичности, вьізванной зндотоксинами.

В предшествующих заявках, которйе упомянутьії в разделе "Родственнье заявки" и использовань! в настоящем описаний путем ссьІлки, било указано, что для подавления токсичности, вьізванной зндотоксинами, можно использовать и другие материаль!. В частности, біло обнаружено, что аполипопротеидь! не требуются в реконструированньїх частицах, и что реконструированная частица может содержать пептид и липид, где пептид не является аполипопротеидом.

Изобретателями бьіло также обнаружено, что с токсичностью, вьізванной зндотоксинами, можно бороться последовательньм введением аполипопротеида или пептида, а затем липида. Последовательно введеннье компоненть!ї образуют реконструированную частицу, и становятся активньіми в вбіведений зндотоксинов.

Бьіло также обнаружено, что по меньшей мере некоторне пациентьї обладают естественньми уровнями аполипопротеида, которье вьіше нормальньїх и позволяют проводить зффективную терапию зндотоксемий с введением реконструированньх частиц, не содержащих аполипопротейд или пептид, но содержащих описанньй о липид.

Кроме того, изобретение, раскрьтое в зтих заявках, предполагает использование реконструированньх частиц и упомянутьїх компонентов для профилактики токсикации, вьізванной зндотоксинами, путем введения профилактически зффективного их количества субьектам профилактики. К таким субьектам относятся б зо инфицированнье пациентьі или вьіздоравливающие после хирургической операции. Зти пациенть! иногда имеют очень низкие уровни ЛВП плазмь! крови, снижающиеся до 20 95 нормальньїх уровней. В зтих случаях і, желательна ранняя профилактика с использованием ЛВП для компенсации зтих понижений. ї-

Бьіло неожиданно обнаружено, что фосфолипидьії можно использовать отдельно или в комбинации с дополнительньми материалами, такими как нейтральнье липидьі, холатьи и т.п., в качестве зффективного ісе) з5 средства для ослабления и/или предотвращения зндотоксемии. В частности, предпочитают использовать «г фосфатидилхолиньі (далее ФХ) как отдельно, так и в комбинации с другими фосфолипидами, такими как сфинголипидь, в композициях, которье по существу свободньі от опептидов и белков, например, аполипопротеинов или производнье от них пептидов. Нейтральнье липидь, такие как моно-, ди-, и триглицеридьії, можно смешивать с фосфолипидами, пока общее количество естественньїх липидов не станет « ниже определенного массового содержания в процентах при использований зтих составов в виде шариков для 7) с внутривенного введения. При других способах введения, например, внутривенно путем непрерьівного вливания, процентное отношение по массе не так важно, но желательно. ;» Особенно предпочтительнье примерьї воплощения изобретения предполагают применение змульсий, в которьїх желчную кислоту или ее соль используют вместе с фосфолипидом или нейтральньм липидом.

Показана зффективность желчньїх кислот и их солей - холатов, при лечений зндотоксемии. Зти желчнье ї5» кислотьі могут бьїть использованьь отдельно или в комбинации с одним или более фосфолипидом, и/или нейтральньі!м липидом, таким как фосфатидилхолин и/или триглицерид.

Ме. Более подробно изобретение описано далее. -І Краткое описание иллюстраций

На фиг.1 показано, как образуются реконструированнье частицьі, содержащие апо А-1, фосфолипид и о холат.

Ге) На фиг. 2 показано как реконструированнье частиць! поглощают молекуль! ЛПС.

На фиг.3 представлень! зксперименть, в которьїх пептид согласно изобретению использовали при изучений снижения токсичности, вьізванной зндотоксинами у модели мьіши. 5Б На фиг.4, относящейся к уровню техники, показано образование спиральньїх колес различньми пептидами.

См. Апапінагатаїйан вьіше.

Ф) На фиг.5А и 5Б показаньі результатьі, полученнье при испьтании различньїх составов в модели, где ка нейтрализацию зндотоксина определяли, вьіявляя вьіделение ФНН в модель цельной крови человека. На фиг.5А показано значение белка, а на фиг.5Б - фосфолипида. Испьтаннье составьі включали природнье бо липопротеидьі (ЛОНП, ЛНП, ЛВП), реконструированньй ЛВП (Р-ЛВП) и составьі ІМТРАЇІРІО Ф, а также змульсий, содержащие фосфолипид и белок.

На офигбА и 6бБ показано сравнительное значение триглицерида (нейтрального липида) и фосфатидилхолина, фосфолипида в той же модели.

На фиг.7 представлена информация о токсичности при введений различньх ФХ и ФХ/Г композиций в 65 Модель мьіши, используя модель, зараженную ЛПС Ес.соїї. с летальньім исходом 55905.

На фиг.8 приведеньі даннье, сравнимье с данньіми, полученньми вьіше, при испьстаний модели цельной крови человека, но при использований фосфолипида с незтерифицированньім холестерином, сфингомиелином или смесью последних вместо триглицеридов.

На фиг.9А и 9Б показаньі результатьї, сравнимье с показанньми на фиг.5А и 5Б, причем в зтом случає фосфолипид, незтерифицированньй холестерин и/или сфингомиелин смешивают с триглицеридами или зтерифицированньїм холестерином в качестве нейтрального липида.

На фиг.10 представлено сравнение результатов, полученньїх от введения змульсий, содержащих зфир холестерина и триглицерид, в модели мьішей т мімо.

На фиг.11 показана диаграмма теоретического количество триглицеридов, вьіделяемьх в кровь после /о введения различньїх ТГ-содержащих составов, с порогами токсичности. Аббревиатура "ОПП" означаєт "общее парентеральное питание", а "СИ" - составь! согласно изобретению.

Подробное описание примеров воплощения изобретение

Пример 1

Для определения уровня вьїживаемости мьішей, зараженньїх зндотоксинами 5утрпітигійт, беспородньім /5 бамцам мьіши линии Зм/із5-УУерзіег вводили солевой раствор (20 мьішей), реконструированнье частиць! ЛВП (40 мьішей), или реконструированньй пептид 18А (20 мьшей) путем иньекции в вену хвоста. Вводимье материаль! приготовили следующим образом: а. частицьі ЛВП

Частицьі приготовили из апо-Ни-ЛВП (8595 А; 15956 А-П и апо С), реконструированного яичньм фосфатидилхолином (2:11 по массе), очищенньм на 95 956 диализом, против моющего средства согласно известному методу, описанному в публикации Маї? еї! а)/., У.ВіоІ. Спет. 257: 4535-4540 (1982) и в патенте США Мо 5 128 318, описание которого использовано путем ссьІлки. б. пептиднье частиць

Пептид 18А имеет следующую аминокислотную последовательность: су

Авр-Ттр-І ец-ІГ уз-АІа-РНе-Туг-Азвр-І уз-МаІ-АІа-с1у-Г ув-І ец-І уз-С1ІШ-АІа-РНе.

Образцьі пептидов смешали и реконструировали чистьім яичньмм фосфатидилхолином (2:11 по массе) 9590 о очистки по виішеуказанному методу (Маї? еї аї., 9У.ВіоЇ. Спет. 257: 4535-4540 (1982) и патент США Мо 5 128 318), также используя диализ против моющего средства. Полученнье в результате частиць! идентичнь!ї описанньм в пат. США Мо 5 128 318, за исключением того, что вместо апо-ЛВП (Маїх еї аї., 9У.Віої. Спет. 257: 4535-4540. ду (1982) и ссьілки на патентную литературу) присутствовал пептидньйй компонент.

В течение 15мин. после введения реконструированного материала мьшам ввели ЛПС ЗаїЇтопега, і. внутрибрюшинно ЛОмг/кг массьй тела. Критерием оценки бьла вьживаемость. На фиг.З представлень р результать! зксперимента, где показатели почти в 4 раза вьіше, чем в контрольной группе с использованием солевого раствора. Синтетический пептид почти также зффективен, как и реконструированнье частиць, ее, содержащие апо-ЛВП. «І

Пример 2

Факторь), которне влияют на стимуляцию ФНН- 9 посредством ЛПС при сохранениий целостности взаймодействия белков плазмь), и клеточньх злементов крови, могут бьть соответствующим образом « исследовань іп міго на системе цельной крови человека. Такую систему использовали для определения того, какие из липопротеидньїх компонентов важнь!ї при нейтрализации ЛПС. - с Испьітьівали следующие материаль!: ц реконструированньій вьісокоплотньій липопротеид (Р-ЛВП), природнье липопротеидь! (ЛОНП, ЛНП, ЛВП) "» плазмь!ї крови, сьіворотку с недостатком липопротеидов (СНЛП) и насьщенную триглицеридом змульсию 2090

ІМТРАГІРІО Ф (смесь триглицеридов и фосфолипидов).

Кровь собирали в гепаринизированную пробирку, разбавляли сбалансированньім солевьм раствором Хзнка ьч (далее ССРХ) или заливали испьітуемьй материал, растворенньій в ССРХ. Полученньій материал разлили в пробирки Штарштедта (250мкл/пробирка). ЛПС растворили в апирогенном солевом растворе, содержащем 10

Ф ММ ГЕПЕСбуфера и добавили (2,5мкл) до конечной концентрации 1Онг/мл. После инкубации в течение 4-х часов -І при 37"С пробирки охладили до 4"С, после чего центрифугировали при 10000 х д в течение 5 минут. Надосадочную жидкость слили и с помощью известного ферментного иммуносорбентного анализа (ЕГІЗА) о определяли ФНН-о, іЧе) В таблице 1 приведеньїй сравнительнье даннье составов испьтуемьх материалов. На фиг5А и 5Б представлень! результать. Даннье представлень в виде графиков зависимости количества произведенного

ФНН-о от концентрации добавленного белка (фиг.5А) и фосфолипида (фиг.5Б). Чтобьі показать широкий диапазон использованньїх концентраций, использовали логарифмическую шкалу, где 10" соответствуют 1 мг/мл. о Все инкубированньюе системьі цельной крови содержали 1Онг/мл Е.соїї 0111:84 ЛПС, дополненнье одним из составов, в качестве зкспликации к фиг.5А и 5Б. їмо) То, что зффективность материалов различна в случає нанесения на график содержания белка (фиг.5А) и подобна при нанесений содержания фосфолипида (фиг.5Б), говорит о том, что фосфолипид является важньм бо компонентом. Зто подтвердил и тот факт, что не содержащая белка липидная змульсия более зффективна, чем природньй ЛВП, но менее зффективна, чем Р-ЛВП. Белок оказьівается не столь важен для нейтрализации. вв лонп «1006! 22| 53 18 7 лвл;роловалаю ві во2,во вв лова 30390 пи: оо НЕ НС НАС НЄ НАНУ (о инталимд! 77777771) ва| во

Пример З

В данном примере не содержащие белок липиднье змульсии, содержащие разное количество нейтрального /о липида, испьтали на цельной крови человека. При зтом использовали такой же анализ, как и при исследований іп міго цельной крови человека в Примере 2.

Все описаннье здесь частиць! бьли полученьі согласно той же процедуре, которая предусматривает смешивание фосфолипида, сфингомиелина или фосфатидилхолина, триолеина, и/или зфира незтерифицированного холестерина, растворенньїх в хлороформе, и взвешивание их до помещения в колбу.

Витамин Е (0,0295 масса/обьем) добавили в качестве антиоксиданта. Затем приготовили сухую липидную' пленку, продувая газообразньій азот или аргон над образцом. Затем в колбу добавили апирогенньій солевой раствор и после зтого содержимое колбьі перемешивали в вихревом смесителе до сус-пендирования всего липида. Затем раствор гомогенизировали в гомогенизаторе вьісокого давления. Образцьі, содержащие фосфатидилхолин (ФХ), с триолейном или без него, циклически пропускали через гомогенизатор 10 раз при го давлений 137895 кПа (20 000 фунтов на кв. дюйм). Образцьії, содержащие зфир холестерина с одним или несколькими другими липидами, циклически пропускали 15-20 раз при давлениий 206842 кПа (30 000 фунтов на кв. дюйм). Гомогенизированнье растворьї профильтровали с помощью шприца с фильтр-насадкой, имеющей порьі 0,45мкм, фильтрат оставили при комнатной температуре (на З дня) до использования. На фиг. бА и 6Б приведеньї результать! зтих исследований, где данньіе о продуцирований ЛІПС-зависимого ФНН-о, зависят от сч Концентрации добавленного триглицерида (фиг.бА) или фосфолипида (фиг.бБ). Составь), как показано в зкспликации, содержали 795 триглицерида (ТГ), 4595 ТГ, 8995 ТГ, 9495 ТГ, Р-ЛВП или фосфолипид без ТГ і) (показанньій только на фиг.б6Б). Состав с 8995 ТГ содержит 1095 ІМТРАГІРІО Ф, а 94951 - 2095 ІМТРАГІРІОЮ. Во всех остальньїх опьітах использовали яичньій фосфатидилхолин (ФХ) и триолеийн.

Зти результать! показьвают, что не содержащие белков композиции по содержанию триглицерида очень (33 зо разнятся, но они очень подобнь! при исследований с учетом содержания фосфолипида (ФХ). Зто подтверждает роль фосфолипида, так как только фосфолипид зффективен, хотя в меньшей степени, чем змульсии, і содержащие до 45905 ТГ. М

Пример 4

Далеє зксперименть! бьіли продолжень! іп мімо на модели мьши, которую вьібрали в качестве надежной /-« з5 системь для предсказания зффективности действия на людей. «

В зтих зкспериментах мьішам вводили, в виде шариков, достаточное количество составов, описанньх в примере 3, а также другие составь! (чистьій фосфатидилхолин, 7905 ТГ, 25905 ТГ, 4595 ТГ, 7190 ТГ, 8190 ТГ, 9495 ТГ) или контрольньій соляной раствор, с дозами фосфолипида (200мг/кг или 40Омг/кг), вместе с 25 мг/кг Е.соїї 0111:84 ЛПС. Контрольной группе ввели внутривенно физиологический раствор в обьеме, соответствующем « обьему змульсии. Вьіживаємость после 72 часов показана на фиг.7. Из 344 животньїх контрольной группь ств) с вьіжили 155.

Применение только ФХ дало умеренньй защитньй зффект, статистически незначительньй при з доверительном уровне 9595, в то время как составьі), содержащие 790, 4596 и 71906 ТГ существенно повьісили вьживаемость. Составьі, содержащие 8095 и 8995 ТГ, обеспечили минимальньйй зффект, а содержащие 9495 ТГ

Вьживаемость снизили. ї5» Когда дозьії увеличили до 400мг/кг ФХ, то змульсиий с содержанием 8995 и 9496 ТГ существенно сократили время жизни, вероятно из-за отравляющего действия ТГ, пояснение которого следует.

Ме Пример 5 -І В примерах 2-4 установлено, что фосфолипидьі являются активньім средством подавления зндотоксемии.

Тот факт, что неполярнье липидьі, вместо триглицеридов, могут образовьівать змульсий с фосфолипидами, а о не с ФХ, позволяет предположить, что можно применять и другие вещества, например, сфингомиелин (другой

Ге фосфолипид), незтерифицированньй холестерин (полярньїй нейтральньй липид) и их смеси. Могут бьіть также использованьії зтерифицированньій холестерин (неполярньй зфир), сквален (углеводород) и витамин Е (неполярньїй антиоксидант). Для испьітания зтих веществ бьіл проведен ряд зкспериментов, с анализом модели цельной крови человека по примеру 2 и вьїживаемости мьішей по примеру 4.

Бьіли приготовлень! змульсийи как описано вьіше, из чистого фосфати-дилхолина, фосфатидилхолина с 1090 (Ф) (в массовом отношений) незтерифицированного холестерина, 1095 (в массовом отношений) сфингомиелина или ка всего 1096 смеси незтерифицированного холестерина и сфингомиелина. Змульсиий добавили в цельную кровь при концентрации 10Омг/дл в отношений ФХ и 1Онг/мл ЛПС. Смесь инкубировали и измерили вьіделенньй во ФНН-о.

Результатьі зкспериментов приведеньй на фиг.8. Вьіделение ФНН-о бьло существенно снижено при использований только ФХ. Змульсии, содержащие незтерифицированньій холестерин, сфингомиелин или их смесь, также подавляли вьіделение ФНН-о.

Пример 6 65 Анализ цельной крови использовали также для определения влияния незтерифицированного холестерина и/или сфингомиелина на змульсии, содержащие нейтральньій липид. Кроме того, использовали змульсий при

10Омг/дл ФХ. Различньсе составь (в массовом отношений) представлень! в следующей таблице ; о

На фиг.9А и 9Б представлень! результатьі зксперимента. Змульсий ФХ, приготовленнье с нейтральньм /5 Липидом в присутствий полярньх липидов или без них проявили ингибирующую способность. Кроме того, концентрация ЛІС составляла 1Онг/мл, т.е. клинически релевантная концентрация зндотоксина. Змульсии, содержащие зфир холестерина, бьіли менее зффективньї, чем змульсии, содержащие ТГ, тогда как змульсии, содержащие незтерифицированньій холестерин, не подавляли ФНН- о, также как и змульсии, которье не содержат холестерин. Добавление сфингомиелина в озмульсий приводило к повьішению подавления го продуцирования ФНН-о.

Пример 7

Змульсии, содержащие зфир холестерина, испьітьівали іп мімо на модели, использованной в примере 4, с летальной дозой зндотоксинов. Бвіли приготовленьі змульсий из ФХ, ТГ или ФХ и зфира холестерина (ЗХ) введеньії единичной дозой 200мг/кг ФХ в виде шарика вместе с 25мг/кг Е.соїї 0111 : 84 ЛПС (летальная доза) в с ов вену хвоста. Контрольной группе ввели внутривенно физиологический раствор в обьеме, соответствующем обьему змульсии. о

На фиг.10 даньі сравнительнье результатьі действия змульсий, содержащих ФХ и ТГ. Одну и другую змульсий испьітали минимум в двух зкспериментах, используя 16 или более животньх.

Как видно на иллюстрации, змульсий, содержащие 795 или 45956 ЗХ по массе, существенно повьшали /(Фдзу зо Вьживаемость. Зти результать», рассматриваемье совместно с результатами в примере 6, показьівают, что ЗХ может бьїіть заменой для ТГ при созданий змульсий, которне нейтрализуют зндотоксинь. Ше

Пример 8 ч-

Не содержащие белка змульсий фосфолипида с триглицеридом зффективно блокируют продуцирование

ФНН-о, в цельной крови, активированньій с помощью ЛПС. Теоретически зти змульсийи могут бьіть зффективнь! ісе) также на живьх обьектах, если их можно будет безопасно ввести в дозах, которье обеспечивают защитнье «ф концентрации фосфолипида в плазме. Наши предьідущие зксперименть! с Р-ЛВП позволяют предположить, что минимальная доза фосфолипида - примерно 200Омг/кг. Используя зту дозу и обьем плазмь! 4,595 массь! тела, можно о рассчитать концентрацию триглицерида, ожидаемую в плазме после введения змульсий с последовательно повнішающимся содержанием триглицерида. Результат показан на фиг.11 в виде плавной « линии, изгибающейся вверх при повьішениий содержания ТГ (906 по массе). Концентрации ТГ в плазме редко - с превьішают 100Омг/дл у здоровьїх взросльїх людей даже после приема жирной пищи. По клиническим данньм й панкреатит возникает у пациентов с концентрацией ТГ в плазме вьіше 2000 мг/дл (Рагтег, еї аї!., Атег. У. Мед. и"? 54: 161-164 (1973); Кгайзев, еї аі,, Атег. 9. Мей 62: 144-149 (1977); СІцесК, еї аї., 9. Іар. Сіїп. Мей. 123: 59-61). Концентрация ТГ в плазма вьіше 400Омг/дл случаєтся чрезвьічайно редко и становится причиной серьезной обеспокоенности. На фиг.10 два последних порога показань! горизонтальньми линиями. При «г» введений 1095 или 2095 ІМТРАГІРІО 2 для получения дозьі с содержанием 200мг/кг фосфолипида ожидается значительное повьішение концентраций ТГ в плазме (см. два контурньїх кружка) за безопаснье предель!. В

Фо противоположность зтому, введение змульсий, содержащих 7905, 45 95, 7195 или 7895 (сплошнье квадратики -і слева направо) повьішаєт концентрацию ТТГ в плазме соответственно до 136, 477, 1300 или 200Омг/дл. Ожидаєется, что змульсий с содержанием ТГ до -50905 не будут токсичнь из-за присутствия ТГ. о Пример 9

Ге) Зффективность комбинаций фосфолипида и желчной кислоть, т.е. холата натрия, испьітали в зксперименте, подобном описанному в предьідущих примерах. Однако методика, по которой приготавливали составь, вводимье для испьтания на животньїх, имела отличие. В зтом и последующих примерах композиции приготавливали, используя гомогенизатор вьсокого давления "Місгойчіділег. Зтот аппарат облегчаєт масштабирование.

Ф, Жидкий триолейн или жидкий соевьій триглицерид растворяли в соответствующем по массе количестве ко водь или водьі с ММ, 18мММ или ЗбмМ холата натрия. Твердьій гранулированньй фосфатидилхолин взвешивали на бумаге, а затем медленно добавляли в раствор при помешиваниий. При зтом требуется бо примерно 3З-бмин. для диспергирования липида. После диспергирования полученньій материал влили в гомогенизатор вьісокого давления. В зтом устройстве используют гидравлическое давление для включения насоса, которьій в свою очередь, встречно направляет две противоположнье струи образцов. Давление может достигать 172,4кПа (25000 фунтов на кв. дюйм). При соударений струи под давлением проходят в крестовидное отверстие, таким образом гомогенизируя образец. 65 Образец пропускали через гомогенизатор несколько раз, при зтом "один проход" - зто время, необходимое для прокачки всего образца через устройство. Образцьі пропускали 20 раз для достижения необходимого уровня гомогенизации. Декстрозу добавляли до конечной 590-концентрации.

Зндотоксин, очищенньй от Е.соїї 0111:84 (40мг/к), и змульсию, оописанную ниже (200мг фосфатидилхолин/кг), смешали при комнатной температуре и сразу ввели мьішам линии С57ВІ 6/) (масса 19 -

ЗОг) путем внутривенной иньекции в вену хвоста. Тем мьішам, которье приняли только холат, ввели обьеемную дозу холата натрия, равную дозе препарата холат/ЕМІ (змульсимй), при той же концентрации холата.

Контрольньмм мьшам ввели такую же дозу 5БУо-раствора декстрозьй для обеспечения соответствия осмоляльности плазмь!.

Результать! зксперимента приведень! в таблице ниже. В зтом случае использовали змульсию, содержащую 7/0 фосфатидилхолин и 795 триглицерида, описанную в предьідущих примерах. Холат натрия добавляли при указанной концентрации к исходньім материалам до получения змульсии. тет лвммхк ровів вів 81111118 ер яв ві1111111111в|ві пт ЕТ НЕТ ТЕ ОО ПО НУ тв рів ввіовв1111тв

Содержание змульсий по массе бьіло следующим. При использованиий 9ММ холата процентное содержание сч об по массе в змульсий составляло: 79Уо холата, 6,196 триглицерида и 86,9 фосфатидилхолина; при 18мМ холата: 13,196 холата, 5,790 триглицерида и 81,295 фосфатидилхолина; при ЗбмМ холата: 23,290 холата, 590 (о) триглицерида и 71,8 фосфатидилхолина.

Следует заметить, что количество ЛПС, вводимого в зтих зкспериментах (4Омг/кг), - значительно вьіше, чем количество, использованное при исследований летальности в предьддущих примерах. Цель введения зтих Фо

Зо повьшенньх доз заключалась в том, чтобьії подавить любой защитньй зффект фосфатидилхолина и/или триглицерида. Таким образом, из зтих зкспериментов следуєт вьівод, что соль желчной кислоть!, т.е. холат ( натрия, обладают защитнь!м свойством. їч-

Здесь не описань! зксперименть! с другими солями желчной кислоть! и таурина, содержащего соли желчньх кислот. Среди желчньх кислот следует отметить, например: аллодезоксихолевую, литохолевую, « з5 ПМодезоксихолевую, гиохолевую кислоть, о, р, 0 с - мурихолевье кислоть, муродезоксихолевую, « урсодезоксихолевую, урсохолевую кислотьі и все их соли, такие, как натриевье соли или таурин или сопряженньсе глициньї. См. Ноїйтапп ниже.

Пример 10

Далее бьли проведень зксперименть, в первом из которьїх исследовали вьживаемость мьшей, « 70 Использованньх в качестве подопьітньїх животньх. 2 с При зтом их разделили на 4 группьії. Первой группе - контрольной ввели 595-раствор декстрозьі. Второй ввели змульсию, содержащую 9395 (по массе) фосфатидилхолина и 795 (по массе) триглицерида и ;» приготовленную как описано вьіше. Зта змульсия содержала 595 декстрозьі и соевне фосфолипидь! с примерно

Бомг/мл липида.

Третьей и четвертой группам животньїх ввели змульсию, подобную змульсии, введенной второй группе, с ї5» добавлением 18мМ холата натрия или 18мММ дезоксихолата натрия. В зтом зксперименте использовали ту же процедуру, как и в примере 9.

Ме, Вьживаемость определяли через 72 часа после заражения; данньіе обобщень! в следующей таблице. -І о со пи ПИ ПОЗ ПО ПО Є р вждвюрю 30000004 з ПИ сс НОСА ПОЛ НО НОЯ 8 | 111111 Холатнатияєтьть 16177714) бос ооо о 4) Дисколхолатнатрияє тт 8/5) ооо) ооооот мо іме) "М - неприемлемо во Заметим, что статистическую значимость сравнений вьїживаемости групп животньїх проверяли по методу

Вилкокса с использованием компьютерной программь». Сравнительнье даннье с контрольной группой 1 помещень под индексом "1", сравнение с группой 2, животньім которой ввели 790-змульсию - "2", и сравнение с группой З животньх, которьім ввели змульсию с холатом натрия - "3".

Как вьіживаемость (90), так и статистический анализ отражают определенное, неожиданное прейимущество составов, содержащих соли желчной кислоть. б5 Пример 11

Вторую группу зкспериментов проверяли на модели кролика. В зтой модели бьло определено вьіделение

ФНН (фактор некроза новообразований)-о.

Кроликов разделили на З группьі и ввели 59о-раствор декстрозьі, змульсию фосфолипида и триглицерида (9390 /795), описаннье вьіше, или ту же змульсию, но с 18ММ холевой кислоть!. Все змульсии скорректировали по 595-раствору декстрозьї, как в примере 10. Кроликам предварительно ввели шарик змульсии и через 2 часа - 10Омкг. Е.соїї 0111: 84 ЛПС. В дополнение к шарику змульсиий внутривенно непрерьівно вливали состав из расчета 5О0мг липида на килограмм массь! тела в час. Внутривенное вливание вели в течение З часов после контрольного заражения. 70 Кровь брали у кроликов в области линии, разделяющей свод и основание черепа, через 30 минут после предварительного введения шарика и каждьй час в течение 5 часов после введения.

В следующей таблице представленьі максимальнье значения ФНН-со. Они зарегистрировань! через 2 часа после введения зндотоксина.

Статистическую значимость показателей определяли, пользуясь известньмм критерием Стьюдента. Как 75 Видно из таблиць, показатели ФНН-о, значительно снизились после введения 18мММ холевой кислоть. гном м 0 вдеютодююроими тю 9 с

Зти примерьї подробно раскрьвают изобретение, которое предполагает одной из целей ослабление или о предотвращение зндотоксемии путем введения пациенту зффективного количества фосфолипида, с которь!мМ ассоциируются зндотоксинь. Ассоциации фосфолипида и зндотоксинов затем удаляются из организма пациента в результате обьічньїх биологических процессов, хорошо известньїх тем, кто знаком с процессами удаления частиц липопротеидов. Фосфолипид подавляет зндотоксин в ассоциации с ним. Ге»)

Из зтих примеров видно, что введение любой из холановьїх кислот или солей холановьїх кислот таких, как желчная кислота или ее соль, могут также бьіть использованьі вместо фосфолипидов для достижения того же о зффекта, те. ослабления или предотвращения зндотоксемии. Таким образом, составь),, не содержащие - пептидов и белков, но содержащие только желчную кислоту или соль желчной кислоть или то и другое, а также фосфо-липид, могут бьть использованьії для лечения от зндотоксемии. Описание холановьїх кислот (см. ї-о например, статью Ноїтапп, Нерайіоду 4 (5): 45 - 145 (1984)) введень в зтот текст путем ссьілки, в частности, «Ж страница 55, фиг.1 и 2, где показань!ї характернье структурь! холановьх кислот.

Изобретение может бьть использовано предпочтительно для лечения людей, но не исключено его использование в ветеринарии. «

Термин "ослабление", использованньй здесь, означает лечение для снижения тяжести проявления зндотоксемии, вьізванной любьм из зндотоксинов, продуцируемьх, например, грамотрицательньми бактериями /-- с (5.лутрпітігішт, Е.соїї, еїс.). Профилактику можно проводить введением соответствующего средства в тот ц момент, когда возникла или предполагается опасность отравления зндотоксинами. Классический пример - "» хирургическая операция. Так пациенту, которого готовят к хирургической операций можно ввести активньй ингредиент.

Зфофективное количество фосфолипида и желчной кислотьї, необходимое для лечения пациента, может г» бьїть различньм. Обьічно доза общей массой примерно 200-800мг фосфолипида на килограмм массь! тела -предпочтительна, хотя зто количество может больше или меньше в зависимости от тяжести зндотоксемийи или

Ф степени риска при профилактике. Применяемая доза холановьїх кислот и солей, например, желчньх кислот и их - І солей, содержит примерно 10-300мг на килограмм массьі тела, более предпочтительно примерно 275мг на Ккилограмм массь! тела. мні Желательно вводить желчную кислоту/ее соль и фосфолипидь с нейтральньми липидами, но зто не (Че) обязательно, так как предусмотрено введение также и змульсий фосфолипидов, не содержащих нейтральньмх липидов. Целесообразность комбинированного введения фосфолипидов обусловлена тем, что нейтральнье липидьї и фосфолипидьі обьединяются в частицьї, которье сходньі! с липопротеидами, но отличаются от них тем, что не содержат белка пептидньїх компонентов, которье конечно всегда присутствует в липопротеидах.

Особенно желательньй такие формь лечения, где фосфолипид представлен фосфатидилхолином, о например, фосфатидилхолином яичного желтка, соевьім фосфатидилхолином или сфинголипидом. В качестве іме) желчной кислоть/ее соли предпочтительньі холевая кислота и/или ее соли, такие, как холат натрия, дезоксихолат натрия и хенодезоксихолат натрия. Что касается нейтральньїх липидов, то предпочтительно бо использовать зфир холестерина или триглицерид, но можно также использовать другие нейтральнье липидь, например, сквален или другие углеводородньіе масла, ди- и моно- глицеридь и антиоксиданть!, такие, как витамин Е.

Формь! для введения могут бьіть разньмми, причем шаровиднье или другие для внутривенного введения - особенно предпочтительньі. При использований шаровидной формь!, например, с триглицеридом, необходимо 65 проявлять осторожность при назначений дозьі. Хорошо известно, что триглицеридь! токсичнь, если их вводить в слишком большом количестве. Но специалист может легко подобрать такой состав, чтобьі устранить или снизить опасность отравления триглицеридом. Обьічно, при использований шаровидной формь! массовая доля триглицерида или другого нейтрального липида должна бьіть приблизительно не более 8095, предпочтительно не более 7095. Более предпочтительно массовая доля нейтрального липида в шарике должна бьіть примерно не более 50965.

Однако, когда применяют не шаровиднье формьї, например, другие формь! для внутривенного введения, то риск отравления уменьшается. Тем не менее, предель, описаннье вьіше, предпочтительньі! для внутривенного или других способов введения, хотя очевидно, что они не обязательньі. Дозьі желчньїх кислот и их солей предпочтительно составляют примерно от 25мг/кг до 50Омг/кг массь! тела и более, предпочтительно - примерно 7 от Б5Омг/кг до 10Омг/кг массь! тела. Предпочтительнье дозьї фосфолипидов предпочтительно составляют от 10Омг/кг до 1000 мг/кг массь! тела. Здесь приведеньї общие дозь, однако, они будут изменяться в зависимости от пациента и способа введения.

Как указано вьіше, в композициях, не содержащих белков и пептидов, необходимь!ї по меньшей мере один фосфолипид или желчная кислота/ее соль. Из фосфолипидов предпочтительно присутствие по меньшей мере 7/5 одного нейтрального липида, например, триглицерида, диглицерида или моно-глицерида. Зти композиции могут включать дополнительнье материаль, например, стериньі (например, холестерин, Я-ситостерин), зтерифицированнье или незтерифицированнье липидьі (например, зфир холестерина /- или незтерифицированньій холестерин), углеводороднье масла, такие, как сквален, антиоксиданть!, такие как витамин Е, но они не обязательньі. Нет сомнения, что любая такая рецептура может включать более одного фосфолипида и/или более одного нейтрального липида. При использований комбинации нейтрального липида и фосфолипида, нейтральньій липид должен присутствовать в количестве примерно от 395 до 5095 по массе относительно общего количества липида в композиции.

Желчную кислоту или ее соли можно использовать отдельно или совместно в комбинации с фосфолипидом, нейтральньім липидом. Что касается дополнительньїх материалов (например, фосфолипидов или нейтральньх с пипидов), предпочтительнь их видь, упомянутьсе вьіше.

Частично согласно изобретению предложень также композиции для лечения зндотоксемии. Один из і) примеров воплощения изобретения - композиция, содержащая по меньшей мере одну из желчньїх кислот/ее соль, фосфолипид и нейтральньій липид, в котором в целом содержится активньій ингредиент в количестве, ослабляющем проявление зндотоксемии. Зта композиция преимущественно содержит примерно от 595 до 3090 Ге! зр по массе желчной кислоть/ее соли, примерно от 395 до 5095 по массе нейтрального липида и примерно от 1090 до 9595 по массе фосфолипида. Особенно предпочтительнь! составьі, содержащие примерно 10-1595 по массе і, желчной кислотьі/ее соли, примерно от 595 до 1095 по массе нейтрального липида, а остальное составляет ч- фосфолипид.

Следует заметить, что зти массовье доли относятся к композициям, содержащим три компонента. При ісе) комбинирований трехкомпонентной системьй с, например, носителем, адьювантом, факультативньми «г ингредиентами, подобньми описанньм вьіше, указаннье массовье доли относительно всего состава будут ниже. Следует иметь ввиду, что во всех случаях такие терапевтические композиции не содержат белков и пептидов.

Если композиции, не содержащие белков и пептидов, также не содержат желчной кислоть или ее соли, то в « них можно ввести предпочтительно по меньшей мере примерно от 3956 до примерно 5095 по массе нейтрального 7-3) с липида, остальное - по меньшей мере один фосфолипид. Нейтральньй липид -зто преиймущественно

Й триглицерид, или любье дополнительнье нейтральнье липидьі, описаннье вьіше. Кроме того, фосфолипид - а зто преимущественно фосфатидилхолин. Другие аспекть! изобретения яснь! специалисту и нет необходимости их повторно приводить здесь.

Понятно, что описание и примерь! служат в качестве иллюстрации изобретения и не ограничивают обьем, а ї5» специалист может предложить и другие вариантьії воплощения изобретения, не вбіходящие за предель! его сущности и обьема. (22)

Ше

Claims (30)

1. Формула винаходу о 50 Ге 1. Способ производства медикамента для профилактики или лечения людей или животньїх, страдающих зндотоксемией, олличающийся тем, что готовят фармакологическую композицию, которая содержит холановую кислоту или соль холановой кислоть!, фосфолипид и нейтральньй липид.
2. 2. Способ по п. 1, олличающийся тем, что композиция содержит не больше чем приблизительно 8095 массь нейтрального липида. (Ф)
3. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что композиция содержит не более чем 7095 массьі нейтрального ГІ липида.
4. 4. Способ по одному из пп. 1-3, олличающийся тем, что композиция содержит не более чем приблизительно во 5095 массь! нейтрального липида.
5. 5. Способ по одному из пп. 1-4, олличающийся тем, что композиция содержит от З до приблизительно 5095 массьї нейтрального липида относительно общей массь! липида в композиции.
6. 6. Фармацевтическая композиция, лишенная белков и пептидов, которая пригодна для внутривенного использования, при зтом композиция содержит холановую кислоту или соль холановой кислоть!, фосфолипид и 65 нейтральньй липид, причем содержание нейтрального липида составляет приблизительно 3-5095 от общей массьї липида.
7. 7. Фармацевтическая композиция по п.б, отличающаяся тем, что холановая кислота или соль холановой кислотьі является желчной кислотой или солью желчной кислоть.
8. 8. Фармацевтическая композиция по одному из пп.б6-7, отличающаяся тем, что фосфолипидом является фосфатидилхолин.
9. 9. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 6-8, олличающаяся тем, что фосфолипидом является сфинголипид.
10. 10. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 6-9, отличающаяся тем, что нейтральньім липидом является триглицерид. 70
11. 11. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 6-9, отличающаяся тем, что нейтральньім липидом является сложньій зфир холестерина.
12. 12. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 7-11, о7личающаяся тем, что соль желчной кислоть! вьібирают из холата натрия, дезоксихолата натрия и хенодезоксихолата натрия.
13. 13. Фармацевтическая композиция по п.12, олличающаяся тем, что соль желчной кислоть! является холатом /5 натрия.
14. 14. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 6-8, 10 и 13, отличающаяся тем, что содержит фосфатидилхолин, триглицерид и холат натрия.
15. 15. Фармацевтическая композиция по п. 14, отличающаяся тем, что соотношение мас фосфатидилхолин:триглицерид составляет 93:7.
16. 16. Фармацевтическая композиция по п.14, олгличающаяся тем, что общее соотношение масс холата натрия, фосфатидилхолина и триглицерида составляет 13,1:81,2:5,7 соответственно.
17. 17. Фармацевтическая композиция по любому из пп.б6-16, отличающаяся тем, что ее используют при производстве медикамента для профилактики и лечения людей или животньїх, страдающих от зндотоксемии.
18. 18. Фармацевтическая композиция, лишенная белка и пептида, которая является змульсией, содержащая с ов Желчную кислоту/соль желчной кислоть!, фосфолипид и нейтральньй липид, при зтом композиция содержит приблизительно 5-30 мас.9о желчной кислотьусоли желчной кислоть!, приблизительно 3-50 мас.9о нейтрального і) липида и приблизительно 10-95 мас.9о фосфолипида.
19. 19. Фармацевтическая композиция по п.18, олличающаяся тем, что содержит приблизительно 10-15 мас.9о желчной кислотьисоли желчной кислоть, приблизительно 5-10 мас.7о нейтрального липида, а баланс ду зо Композиции создан фосфолипидом.
20. 20. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 18 или 19, отличающаяся тем, что пригодна для о внутривенного использования. ї-
21. 21. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 18-20, олличающаяся тем, что фосфолипидом является фосфатидилхолин. ісе)
22. 22. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 18-20, отличающася тем, что фосфолипидом является «Е сфинголипид.
23. 23. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 18-22, отличающаяся тем, что нейтральньм липидом является триглицерид.
24. 24. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 18-22, отличающаяся тем, что нейтральньм липидом « является сложньй зфир холестерина. в с
25. 25. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 18-24, отличающаяся тем, что соль желчной кислоть вьібирают из холата натрия, дезоксихолата натрия и хенодезоксихолата натрия. ;»
26. 26. Фармацевтическая композиция по п.25, отличающаяся тем, что соль желчной кислоть! является холатом натрия.
27. 27. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 18-21, 23 и 26, отличающаяся тем, что содержит ї5» фосфатидилхолин, триглицерид и холат натрия.
28. 28. Фармацевтическая композиция по п.27, отличающаяся тем, что соотношение масс Ме, фосфатидилхолин:триглицерид составляет 93:7. -І
29. 29. Фармацевтическая композиция по п.27, отличающаяся тем, что общее соотношение масс холата натрия, фосфатидилхолина и триглицерида составляет 13,1:81,2:5,7 соответственно. о
30. 30. Фармацевтическая композиция по любому из пп.18-29, отличающаяся тем, что ее используют при Ге производстве медикамента для профилактики и лечения людей или животньїх, страдающих от зндотоксемии. Ф) іме) 60 б5