UA149378U - Спосіб кріоконсервування еритроцитів собак - Google Patents
Спосіб кріоконсервування еритроцитів собак Download PDFInfo
- Publication number
- UA149378U UA149378U UAU202103696U UAU202103696U UA149378U UA 149378 U UA149378 U UA 149378U UA U202103696 U UAU202103696 U UA U202103696U UA U202103696 U UAU202103696 U UA U202103696U UA 149378 U UA149378 U UA 149378U
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- erythrocytes
- cryopreservation
- dmso
- phosphate buffer
- sucrose
- Prior art date
Links
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims abstract description 17
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 11
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 abstract 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 9
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 8
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 101100115801 Streptomyces mobaraensis daip gene Proteins 0.000 description 2
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 1
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Спосіб кріоконсервування еритроцитів собак шляхом заморожування клітин до -196 °C з використанням кріоконсерванта, що містить 10 % диметилсульфоксиду (ДМСО), 50 мМ NaCl, 200 мМ сахарози та 10 мМ фосфатного буфера.
Description
Корисна модель належить до області кріобіології, зокрема до кріоветеринарії, і може бути використана при розробці методів тривалого низькотемпературного зберігання еритроцитів собак для створення банків крові.
Останнім часом все частіше застосовується переливання крові собакам при терапії різних захворювань, що обумовлено зростанням у цих тварин гематологічних, паразитарних і хірургічних захворювань, а також різного роду травм. Для трансфузій зазвичай використовують донорську кров. Однак запасів крові в ветеринарних лікарнях в Україні зазвичай не існує, що пояснюється відсутністю спеціальних донорів і складністю відбору крові за фенотипічними ознаками.
В даний час зростає зацікавленість до кріоконсервування саме еритроцитів тварин.
Зберігання еритроцитів при наднизьких температурах зупиняє метаболізм і, отже, запобігає прогресуючому порушенню структури і функцій ізольованих клітин. В умовах рідкого азоту еритроцити можна зберігати протягом декількох років, що дозволяє створювати запаси консервованої донорської крові різних груп і різних порід собак.
Відомий спосіб кріоконсервування еритроцитів собак (Спосіб кріоконсервування еритроцитів собак, патент України Мо 1102681рРІ/. передбачає застосування як кріопротектора гідроксіетилкрохмалю в концентрації 17,5 95. Іншим відомим способом є |1| використання як кріопротектора поліетиленгліколю в концентрації 15 95. Недоліком даних способів є наявність прихованих ушкоджень в деконсервованих еритроцитах, що проявляється в зниженні осмотичної стабільності при їх перенесенні до ізотонічного середовища, що зумовлює їх малу ефективність.
Відомим аналогом є спосіб кріоконсервування еритроцитів людини, згідно з яким еритроцити заморожують у кріозахисному середовищі ЦОЛІПК 11, що містить 30 95 гліцеролу, 4 95 маніту, 0,7 ую Масі, 0,03 95 Маг"НРО-12НоО, до температури -196 "С шляхом занурення контейнера у рідкий азот (21. Відігрівають зразки на водяній бані при температурі 42-44 "С. Недоліком аналога є низька збереженість еритроцитів собак (гемолізує близько 50 95 клітин) (1). Це пов'язано з низьким коефіцієнтом проникності гліцеролу до еритроцитів тварин |З).
Найбільш близьким за суттю до способу, що заявляється, є спосіб кріоконсервування еритроцитів собак з використанням як кріопротектора 10 95 диметилсульфоксиду (ДМСО) 0,9 95
Зо МасСі; 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,4 ПП). Кріопротектор додавали до еритроцитів при кімнатній температурі в співвідношенні 1:11 (по об'єму). Суспензію клітин заморожували в стандартних алюмінієвих контейнерах ЦНІІГПК об'ємом 10 мл. Заморожування здійснювали до температури -196"С шляхом швидкого занурення контейнера в рідкий азот. Відтавання проводили на водяній бані при температурі 42-44 "С при постійному погойдуванні контейнера.
Заявлений спосіб і найближчий аналог мають спільні суттєві ознаки, а саме: використання як кріопротектора 10 95 ДМСО та режим "швидкого" заморожування.
Недоліком способу за найближчим аналогом є достатньо високий рівень пошкодження клітин (до ЗО Об).
Заявлений нами спосіб усуває недоліки найближчого аналога і забезпечує високу ефективність використання кріопротектора 10 956 ДМСО з додаванням сахарози.
В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалення способу кріоконсервування еритроцитів собак, у якому за рахунок введення в середовище кріоконсервування сахарози та зниження концентрації МасСі забезпечується підвищення збереження клітин при кріоконсервуванні та підвищується осмотична і механічна їх стабільність.
Поставлена задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування еритроцитів собак шляхом їх заморожування до -196"С в середовищі кріоконсервування, в якому міститься низькомолекулярний кріопротектор 1095 ДМСО, Масі, 10 мМ фосфатного буфера і вода дистильована, відповідно до корисної моделі, знижують концентрацію МасСі до 50 мМ та додатково додають 200 мМ сахарози.
Сахароза є природним дисахаридом, який сприяє зниженню порушення осмотичної рівноваги клітин при дії факторів низькотемпературного консервування.
При проведені патентно-інформаційного пошуку авторами і заявником виявлено технічне рішення |1|), що містить суттєві ознаки, спільні із заявленим рішенням: одержання еритроцитів, осадження еритроцитів центрифугуванням, відділення плазми, обробку еритроцитів кріопротектором, заморожування, зберігання у рідкому азоті, відмивання.
Але наявність зазначених ознак, спільних із найближчим аналогом, не забезпечує технічний результат, що досягають заявленим способом.
Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали із заявленим, не виявлено.
Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію 60 корисної моделі - "новизна".
У патентній і науково-технічній інформації не знайдено технічних рішень, в яких були б описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від найближчого аналога і забезпечують досягнення технічного результату тим, що кріоконсервант містить 10 956 ДМСО, 50
ММ масі, 200 мМ сахарози та 10 мМ фосфатного буфера.
Заявлена корисна модель належить до галузі кріобіології, зокрема до кріоветеринарії і може бути використана при розробці методів тривалого низькотемпературного зберігання еритроцитів собак, а тому відповідає критерію корисної моделі - "промислова придатність".
Таким чином, заявлене технічне рішення є новим та промислово придатним, тобто відповідає всім умовам патентоспроможності корисної моделі відповідно до статті 7 розділу 2
Закону України "Про охорону прав на винаходи і корисні моделі" Мо 1771-111, 2000 р.
Реалізацію заявленого способу здійснюють наступним чином: еритроцити собак заморожують шляхом швидкого занурення до рідкого азоту (-196С) під захистом кріоконсерванта, який містить 10 956 ДМСО, 50 мМ Масі, 200 мм сахарози та 10 мм фосфатного буфера.
Ефективність заявленого способу і його переваги над найближчим аналогом підтверджена прикладом конкретного його виконання.
Кров заготовляли на глюкозо-цитратному консерванті та зберігали не більше 48 годин при 5 "С до проведення експериментів. Еритроцити одержували методом центрифугування цільної крові при 750 д протягом 5 хв. з подальшим видаленням плазми і лейкотромбоцитарного шару.
Після цього еритроцити тричі відмивали в 4-кратному об'ємі ізотонічного сольового розчину (150
ММ масі, 10 мМ фосфатний буфер, рН 7,4).
Одержані еритроцити обробляють кріоконсервантом, який містить 10 95 ДМСО, 50 мМ масі, 200 мМ сахарози та 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,4. Кріоконсервант було додано до суспензії еритроцитів у співвідношенні 1:11 за об'ємом. Тривалість інкубації еритроцитів у середовищі кріоконсервування перед заморожуванням становила 20 хв. при 22 "С (кімнатна температура). Зразки заморожували в кріопробірках об'ємом 10 мл (Еррепаогї, Гамбург,
Німеччина) шляхом занурення в рідкий азот (протокол швидкої заморозки). Швидкість охолодження в таких умовах становить 2,57 С/сек. Відтавання зразків проводили шляхом перенесення контейнера з рідкого азоту у водяну ванну 40-42 "С) з постійним струшуванням.
Зо Зразки повністю відтавали приблизно за 50-60 с. Видалення кріопротектора проводили послідовними етапами центрифугування при 750 д: 1 етап - відмивання рівним об'ємом розчину 600 мМ Масі, 10 мМ фосфатним буфером, рнН 7,4; етапи 2 й З - відмивання рівними об'ємами розчином 150 мМ Масі, 10 мМ фосфатного буферу, рН 7 4.
Збереженість еритроцитів визначали методом спектрофотометрії (СФ-46, Росія) за кількістю гемоглобіну, який вийшов з клітин. Кількість гемоглобіну виражали у відсотках по відношенню до 10095 гемолізу еритроцитів. Оцінювали сумарний гемоліз після відігрівання заморожених еритроцитів і відмивання від кріозахисного середовища.
Для порівняння оцінювали стійкість еритроцитів до механічного стресу за рівнем гемолізу під впливом дрібних кульок, які переміщуються в суспензії відповідно до описаного методу |4|.
Деконсервовані еритроцити (1 мл) переносили у розчин 150 мМ Масі, 10 мМ фосфатного буферу, рН 7,4 (5 мл) в пластикових стаканчиках (кінцевий гематокрит приблизно 15 95). У стаканчики обережно вносили пластикові кульки (діаметр 5 мм, вага 1,5 г) в кількості 50 штук і магнітну паличку. Суспензію еритроцитів з пластиковими кульками перемішували за допомогою магнітної мішалки ММ-5 (Україна) 200 об./хв. протягом 30 хвилин. Для визначення гемолітичних ушкоджень аліквоти клітин центрифугували при 750 9 і відбирали супернатант, де визначали рівень гемолізу як описано вище.
Осмотичну крихкість визначали методом (5), оцінюючи стабільність клітин в гіпотонічних розчинах Мас! в діапазоні від 0,1 до 0,995. Індекс осмотичної крихкості визначали як концентрацію Масі, коли відбувається 50 95-й гемоліз.
Результати наведені у таблиці. З таблиці видно, що гемоліз еритроцитів тварин після кріоконсервування заявленим способом на 10,83 95 менше, ніж у найближчого аналога. При механічному стресі гемоліз на 6,58 95 нижче, ніж у найближчого аналога. Індекс крихкості менше на 0,05, ніж у найближчого аналога.
Таблиця 11111111 | Найближчийаналогї | Кориснамодель.:-:.:ь:К:|:К 10 956 ДМСО, 0,9 95 Масі, 10| 10 95 ДМСО, 50 мМ Масі, 200 мМ
Середовище кріоконсервування | мМ фосфатний буфер, рН | сахарози та 10 мМ фосфатного 7.4 буфера, рн 7.4. ролі після кріоконсервування, 27035519 16,22,31
Гемоліз при механічному стресі 15,7845,33 923,37 протягом 30 хвилин, 90 0,5250,07 0,4750,03
Отже, проведеними дослідженнями встановлено, що запропонований спосіб кріоконсервування еритроцитів собак дозволяє підвищити ступінь збереження еритроцитів після кріоконсервування та їх механічну та осмотичну стійкість при використанні кріоконсерванта, що містить 10 96 ДМСО, 50 мМ Масі, 200 мМ сахарози та 10 мМ фосфатного буфера, рН 7 4.
Таким чином, результати досліджень, одержані у прикладі конкретного виконання способу, підтверджують його ефективність.
Джерела інформації: 1. Денисова О.Н. Криоконсервированиє зритроцитов животньїх под защитой диметилсульфоксида, полизтиленгликоля, глицерина / О.Н. Денисова, Г.Ф. Жегунов, Л.А.
Бабійчук. // Проблемь криобиологии. - 2005. - Мо 2. - С. 195-201. 2. Усовершенствованиє криоконсервирования зритроцитов при ультранизких температурах / ФР. Виноград-Финкель, Л.М. Федорова, Н.В. Семенова, и др. / Проблемь! гематологи и переливания крови. - 1980. - Мо 9. - С. 19-23.
З. Жегунов Г.Ф. Проницаемость зритроцитов млекопитающих для молекул глицерина и
ДМСО и степень сохранности клеток после замораживания / Г.Ф. Жегунов, О.Н. Денисова. //
Доповіді Національної академії наук України. - 2010. - Мо 2. - б. 139-143. 4. Пат. 52701, Україна, МПК 8 501Мм33/48. Спосіб деструкції еритроцитів / Н.М. Шпакова,
Н.В. Орлова, Д.І. Александрова; заявник і патентовласник - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної академії наук України. - Мо и201000983; заявл. 01.02.2010; опубл. 10.09.2010, бюл. Мо 17. 5. даїп М.С. О5тоїйс їадіїну ої егуїпгосуїез ої додз апа саїв іп пеайй апа іп сегіаїп петацо!одіс дізогаеєгз / даїп. // Согпеїї. Меї. - 1973. - Мо 63 (3). - б. 411-423.
Claims (1)
- ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб кріоконсервування еритроцитів собак шляхом заморожування клітин до -1967С з використанням кріоконсерванта, що містить 10 96 диметилсульфоксиду (ДМСО), масі та 10 мМЗо фосфатного буфера, який відрізняється тим, що в кріоконсервант вводять Масі концентрацією мМ та додатково додають 200 мМ сахарози.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU202103696U UA149378U (uk) | 2021-06-29 | 2021-06-29 | Спосіб кріоконсервування еритроцитів собак |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU202103696U UA149378U (uk) | 2021-06-29 | 2021-06-29 | Спосіб кріоконсервування еритроцитів собак |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA149378U true UA149378U (uk) | 2021-11-10 |
Family
ID=78720002
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAU202103696U UA149378U (uk) | 2021-06-29 | 2021-06-29 | Спосіб кріоконсервування еритроцитів собак |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA149378U (uk) |
-
2021
- 2021-06-29 UA UAU202103696U patent/UA149378U/uk unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Naing et al. | Effect of sugars on characteristics of Boer goat semen after cryopreservation | |
| Scott et al. | Biopreservation of red blood cells: past, present, and future | |
| AU2009228056B2 (en) | Materials and methods for hypothermic collection of whole blood | |
| RU2396748C2 (ru) | Среда для хранения клеток | |
| US3940943A (en) | Multistage freezing system for preservation of biological materials | |
| RU2317703C1 (ru) | Способ криоконсервирования спермы осетровых рыб | |
| EP2811827A1 (en) | Cryopreservation of cells in absence of vitrification inducing agents | |
| Jahan et al. | Current and future perspectives for the cryopreservation of cord blood stem cells | |
| Tsai et al. | Sugars as supplemental cryoprotectants for marine organisms | |
| Fahy et al. | A. Vitrification: an overview | |
| Cohen et al. | Platelet preservation. II. Preservation of canine platelet concentrates by freezing in solutions of glycerol plasma | |
| UA149378U (uk) | Спосіб кріоконсервування еритроцитів собак | |
| RU2639892C1 (ru) | Способ криоконсервирования ядросодержащих клеток крови человека при температуре минус 80оС | |
| Hvozdiuk et al. | Physicochemical properties and cryoprotective action of solutions of polyvinyl alcohol, glycerol and media based on their combinations during freezing of red blood cells | |
| Lionetti et al. | Factors affecting the stability of cryogenically preserved granulocytes | |
| Balint et al. | for cryopreservation | |
| RU2563117C1 (ru) | Комбинированный криопротектор "диметилсульфоксид/реополиглюкин" для криоконсервации стволовых клеток и способ их криоконсервации для клинического применения | |
| Maffei et al. | Freezing and freeze-drying: the future perspective of organ and cell preservation | |
| Ulizko et al. | Cryopreservation of animals′ erythrocytes | |
| Denysova et al. | Cryopreservation of canine erythrocytes using dimethyl sulfoxide, polyethylene glycol and sucrose | |
| Kim et al. | Application of phosphoenolpyruvate into canine red blood cell cryopreservation with hydroxyethyl starch | |
| Zhegunov et al. | Blood Hypothermic Storage and Erythrocyte Cryopreservation in Dogs | |
| KR101101308B1 (ko) | 인간 유래 단핵세포의 냉동보존용 배지 조성물 | |
| RU2744614C1 (ru) | Способ снижения токсичности криоконсервирующего раствора на основе диметилсульфоксида после размораживания гемопоэтических стволовых клеток | |
| Golovina et al. | Hypothermic storage of ovine erythrocytes |