UA13838U - Method for determining membrane-acting activity of cryoprotector - Google Patents

Description

Опис винаходу

Корисна модель належить до галузі кріобіології і може бути використана для порівняльної експрес-оцінки 2 впливу кріопротекторів (КП) на стан ліпідного бішару штучних або природних (клітинних) мембран при підборі оптимального КП; при тестуванні нових речовин на здатність виступати в ролі КП; а також для визначення максимальних концентрацій КП, які можуть бути застосовані при кріоконсервуванні клітин.

Збереження біологічних мембран - одних з найбільш кріолабільних структур клітин, в процесі кріоконсервування клітин людини і тварин забезпечують за допомогою штучного введення в середовище 70 кріоконсервування захисних речовин - КП, які значною мірою послаблюють негативні наслідки дії низьких температур. В той же час, самі КП часто бувають неіндиферентними по відношенню до клітин. Багато з них здатні пошкоджувати мембрани клітин і виявляти цитотоксичну дію ще до заморожування, на етапі еквілібрації клітин в кріозахисних розчинах і, таким чином, сенсибілізувати їх до наступної дії зниження температури і супутніх факторів. З іншого боку, навіть один і той же КП може по-різному впливати на мембрани одного типу 72 клітин, але отриманих з різних тварин, що пов'язано з видовими розбіжностями білок-ліпідного складу їх цитоплазматичних мембран. Таким чином, як для тестування нових речовин - потенціальних КП, так і для оцінки ефективності КП по відношенню до певного виду клітин, необхідно оцінювати його вплив на структурний стан мембран клітин.

Відомі способи визначення мембранотропної активності речовин, що грунтуються на вимірюванні швидкості виходу з еритроцитів гемоглобіну в умовах дії кислоти або луги (кислотний або лужний гемоліз) |11).

Однак, ці способи застосовують лише для еритроцитів, і вони не можуть бути використані для клітин, які не вміщують гемоглобін. Крім того, гемоглобін є високомолекулярним білком і для його виходу з мембран у останніх повинні утворитися досить великі пори, які свідчать про суттєве порушення мембран клітин, тоді як порушення цілісності мембран, що супроводжується утворенням менших за розмірами дефектів, також може спричиняти негативний вплив на функціонування клітини. До того ж, гетерогенність розподілу еритроцитів за віком, в наявність і неоднакова кількість холестерину в індивідуальних зразках не дозволяють вважати цей метод універсальним для оцінки мембранотропних властивостей КП. Відомо також, що залежність ступеня гемолізу еритроцитів від концентрації малих гідрофільних молекул носить лінійний характер, тоді як для ліпофільних органічних молекул, до яких можна віднести частину КП, ця залежність носить нелінійний характер (21), що со значно ускладнює інтерпретацію і співставлення результатів при порівнянні мембранотропних властивостей КП, со які відносяться до різних класів хімічних речовин.

Існує спосіб визначення мембранотропної активності речовин, який грунтується на введенні в клітини со флуоресцеїн діацетату, що в клітинах гідролізується естеразами до вільного флуоресцеїна, який має гіршу со проникливість, що дозволяє використовувати його як маркер цілості плазматичної мембрани |ЗІ.

Зо Однак, застосування цього методу також має ряд обмежень, серед яких можна відзначити залежність -- ферментативного перетворення флуоресцеїн діацетату у флуоресцеїн від активності внутрішньоклітинних естераз, на яку, в свою чергу, можуть впливати фактори, які порушують цілісність чи проникливість мембран, а також здатність флуоресцеіїна переноситись Через мембрани за допомогою специфічних каналів або « транспортних білків клітин печінки. В клітинах печінки, крім того, флуоресцеїн може метаболізуватись З Ммонооксигеназною системою мікросом. Все це може спотворювати результати вимірювань при роботі з с клітинами.

Із» Відомий також спосіб визначення мембранотропної активності органічних сполук по зміні проникності мембран клітин для ферріціаніду калію |4). Для цього клітини насичують сумішшю ферріціаніду калію і парамагнітного іміноксильного радикала 2,2,6,6-тетраметіл-4-оксопіперідін-1-оксила, який здатний проникати всередину клітин в нормі, тоді як ферріціанід калію в непошкоджені клітини не проникає. При порушенні - нормальної проникності мембран клітин внаслідок дії на мембрани органічної сполуки, яка досліджується, оз ферріціанід калію починає входити всередину клітин і розширювати сигнал від молекул іміноксильного радикалу, які там знаходяться. Падіння інтенсивності ЕПР-сигналу від іміноксильного радикалу є індикатором появи бо дефектів в структурі мембран. До недоліків методу відноситься те, що він дозволяє визначати тільки такі

Ге) 20 пошкодження мембран, які призвели до утворення пор, і не дозволяє реєструвати порушення, спричинені дією

КП на етапах, які ще не призводять до утворення пор. со Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб визначення мембранотропної активності речовин, оснований на реєстрації сигналів ЕПР від введених в мембрани парамагнітних зондів |5). Спосіб полягає в тому, що парамагнітний зонд (у відсутності або присутності КП) вводять в мембрани, які досліджуються, після чого на 29 ЕПР-спектрометрі реєструють спектр ЕПР зонда, виконують його математичну обробку і будують графік с залежності частоти обертальної дифузії зонда від концентрації КП, на підставі якого судять про мембранотропну активність речовини.

До основних недоліків цього способу можна віднести такі: - недостатня чутливість, пов'язана з тим, що для отримання задовільного відношення сигнал/шум треба бо використовувати ЕПР-зонди в кінцевих концентраціях не менш ніж 4х10 7-5х10-9М (6). Такі концентрації є досить високими і самі по собі можуть спричинити негативний вплив на об'єкт дослідження - біомембрани. З іншого боку, при використанні менших концентрацій зондів необхідно застосовувати накопичення сигналів, яке подовжує час вимірювань; - складність інтерпретації результатів, яка полягає в тому, що навіть у випадку використання одного і бо того ж ЕПР-зонда, інтерпретація спектрів часто ускладнюється завдяки перетинанню спектрів ЕПР від молекул цього зонда, розташованих у водній фазі і в різних областях мембран; - великі затрати часу, зумовлені специфікою підготовки зразків для ЕПР-вимірювань, які потребують розміщення зразків в спеціальних скляних капілярах, юстировки в резонаторі спектрометра, настройки параметрів поля тощо. Для отримання адекватної інформації про стан різних областей бішару, звичайно застосовують по черзі (тобто, в окремих експериментах) декілька різних ЕПР-зондів, що збільшує час вимірювань, який для одного зразка знаходиться в межах 10-15хв. і подовжує термін обробки спектрів; - висока вартість ЕПР-зондів, які використовуються для досліджень.

В основу корисної моделі поставлено задачу створення такого способу визначення мембранотропної /о активності КП, який, за рахунок використання іншого мембранного зонда, дозволить підвищити чутливість методу, поліпшити інтерпретацію результатів, знизити матеріальні і часові витрати.

Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення мембранотропної активності КП, який включає введення зонда в мембрани, що досліджуються, реєстрацію його спектра, математичну обробку спектральних даних і побудову графіка залежності знайдених спектральних параметрів від концентрації КП, згідно з корисною /5 Моделлю, в мембрани вводять флуоресцентний зонд, в якості якого використовують

З-гідрокси-4-(М,М-диметиламіно)флавон (ФМЄ), на спектрофлуориметрі реєструють його спектр флуоресценції, після чого виконують математичну обробку спектральних даних, яка полягає в тому, що з спектрів визначають інтенсивності флуоресценції (ЕР) зонда на довжинах хвиль А і Б, де А знаходиться в межах 480-535нм, Б - в межах 540-650нм, будують графік залежності відношення інтенсивностей Е д/Рр від концентрації КП і за Зростанням відношення Е д/Рр у порівнянні з аналогічним параметром, обчисленим для даного виду мембран у відсутності КП, судять про мембранотропну активність КП.

Мультипараметричний зонд ФМЄ належить до класу З-гідроксифлавонів. Зонди цього класу при електронному збудженні здатні до ізомеризації з утворенням нормальної (М") і таутомерної (17) форм 171.

Положення і інтенсивність смуг емісії кожної з форм залежать не тільки від хімічної структури зонда, але й від параметрів оточення його молекул, таких як гливкість, полярність, і від здатності утворювати міжмолекулярні водневі зв'язки (8). В мембранах ФМЄ локалізується на межі полярної і неполярної областей т ліпідного бішару, що забезпечує його високу чутливість до початкових змін структури як полярної, так і неполярної зон бішару. При цьому, тільки молекули зонда, які локалізуються в мембрані, мають двосмугову форму спектра флуоресценції і набагато більшу інтенсивність у порівнянні з молекулами ФМЄ, які знаходяться у со зо розчині. Це дозволяє відрізняти сигнали флуоресценції ФМЄ, який знаходиться в мембранах та поза мембранами (у водному чи водно-кріопротекторному середовищі). о

Використання флуоресцентного зонда ФМЄ і відношення інтенсивностей його смуг флуоресценції Е д до ЕБ со для визначення мембранотропної активності КП дозволяє: - підвищити чутливість способу за рахунок використання на порядок більш низької (10 ЗМ), у порівнянні з о методом ЕПР, концентрації флуоресцентного зонда; «- - поліпшити інтерпретацію результатів за рахунок того, що флуоресценцію ФМЄ можна спостерігати майже цілком з мембран, а в водному чи водно-кріопротекторному розчині вона незначна і не заважає аналізу спектральних даних; « - скоротити час вимірювань до їхв. і знизити трудомісткість методу за рахунок зміни зонда, способу 70 реєстрації спектрів, спрощення процедури підготовки зразка і математичної обробки результатів у порівнянні з - с методом ЕПР, а також за рахунок використання одного зонда, чутливого до структурних змін як поверхневої, так й і неполярної областей мембрани; "» знизити вартість визначення за рахунок використання флуоресцентного зонда, вартість якого на З порядки нижче за вартість ЕПР-зондів. Так, наприклад, вартість зонда ФМЕ становить біля ФБ за г, вартість флуоресцентного зонда флуоресцеїн діацетату (номер за каталогом Е7378) складає Ф3.88 за 1г (9), тоді як - вартість поширеного мембранного ЕПР-зонду 5-доксил стеаринової кислоти (номер за каталогом 25,363-4), складає 550600 за 1г (10). о Спосіб здійснюють таким чином. (ее) Флуоресцентний зонд ФМЄ, у вигляді спиртового розчину з початковою концентрацією 5х10 7-0,5х10 М, с 50 додають в кількості 2-10мкл до 2-Змл суспензії штучних або природних мембран (які не містять КП). Кінцева концентрація зонда в суспензії мембран становить при цьому 0,5-5х10 УМ. Після 10-15хв. інкубації суспензії со мембран з зондом реєструють його спектр флуоресценції, обравши довжину хвилі збудження в області 380-44О0нм. З отриманого спектру флуоресценції знаходять значення інтенсивностей Е А і ЕрБ, які виміряють на довжинах хвиль А і Б, де А заходиться в межах 480-535нм, а Б знаходиться в межах 540-65Онм і обчислюють відношення Е Д/Ер. Аналогічні вимірювання виконують для зразків суспензії мембран, які додатково вміщують с різні концентрації КП. По знайденим значенням інтенсивностей флуоресценції будують залежність Е д/Ер від концентрації КП і за зростанням нахилу графіка у бік осі ординат у порівнянні з контролем судять про мембранотропну активність КП.

Приклад 1 6о Флуоресцентний зонд ФМЄ розчиняли в етиловому спирті до концентрації 3х10 ЗМ. 1Омкл спиртового розчину ФМЕ додавали до 2,Омл суспензії ліпосом, приготованих з яєчного фосфатиділхоліну (з вмістом ліпідів 2,О0мг/мл), інкубували 7Охв. і реєстрували спектр флуоресценції зонда в області 410-650нм на спектрофлуориметрі Магіап Сагу Есіїірзе (США) при ширині щілин монохроматорів збудження і флуоресценції 5 і

Бнм, відповідно, та довжині хвилі збудження 405нм. Після цього з отриманого спектру знаходили максимуми бо флуоресценції зонда на довжинах хвиль А і Б, які обирали при 515 і 575нм, відповідно. обчислювали відношення інтенсивностей флуоресценції Евів/Ев75. Воно дорівнювало 0,57. Аналогічні виміри проводили для зразків мембран, які крім ФМЕ вміщували 5, 10, 20, 30 і 40 об. 95 диметілсульфоксіду (ДМСО). За знайденими значеннями інтенсивностей флуоресценції ФМЕ при 515 і 575нм будували залежність відношення РЕ ві5/Ев75 від

Концентрації ДМСО і по різкому нахилу графіка в бік осі ординат визначали початкову концентрацію ДМСО, яка спричиняє порушення упаковки мембран. Вона становила 12 об. 95.

Приклад 2

Флуоресцентний зонд ФМЕ розчиняли в етанолі до концентрації 3,5хХ10 ЗМ. 1О0мкл спиртового розчину ФМЕ додавали до 2,О0мл суспензії ліпосом, приготованих з сумарних ліпідів сперматозоїдів півня (з вмістом ліпідів 70. ,Омг/мл), інкубували 15хв. і реєстрували спектр флуоресценції зонда, як описано в прикладі 1. Визначали відношення інтенсивностей флуоресценції зонда на довжинах хвиль А і Б, які обирали при 515 і 575нм, відповідно. Відношення Е515/Ев75 становило 0,57. Аналогічні вимірювання проводили для зразків, що вміщують, крім ФМЕ, 5, 10, 20, 30 ї 40 об.95 диметілформаміду (ДМФА). За визначеними значеннями інтенсивностей флуоресценції будували графік залежності Еві5/Евт5 від концентрації ДМФА і за різким нахилом графіка в бік 75 осі ординат визначали початкову концентрацію ДМФА, яка спричиняє порушення упаковки мембран. Вона становила 7,5 об. 90.

Приклад З

Флуоресцентний зонд ФМЄ розчиняли в етанолі до концентрації 0,7х10 ЗМ. 20мкл спиртового розчину ФМЄ додавали до 2,0мл суспензії мікросомальних мембран, вилучених з печінки щура (вміст загального білка в зразках становив 0,75мг/мл), інкубували 15хв. і реєстрували спектр флуоресценції зонда, як описано в прикладі 1. Обчислювали відношення інтенсивностей флуоресценції зонда на довжинах хвиль А і Б, які обирали при 515 і 575нм, відповідно. Воно становило 0,45. Аналогічні вимірювання виконували для зразків, які вміщували, крім

ФМЕ, також 5, 10, 20, ЗО і 40 об.95 ДМСО. За знайденими значеннями інтенсивностей флуоресценції будували графік залежності відношення Е в5і15/Евт5 від концентрації ДМСО і за різкою зміною нахилу кривої в бік осі ординат визначали концентрацію ДМСО, яка спричиняє порушення упаковки мікросомальних мембран. Вона З становила 12 об. 90.

Джерела інформації: 1. Иванов И.Т. Сравнение механизмов кислотного и щелочного гемолиза зритроцитов человека // Биофизика. - 2001. - Т. 46, вьпп. 2. - С. 281-290. с 2. Черницкий Е.Б., Сенькович О.Б., Козлова Н.М. Гетерогенность пор, образуемьїх в мембране зритроцитов липофильньїми гемолитиками // Биофизика, - 1996, Т. 41, вьп. 6. - С. 1270-1275. о 3. Бондаренко В.А., Коптелов В.А., Лежанин С.Н., Олейник О.А., Рамазанов В.В., Середа Т.П. Зависимость с интенсивности транспорта флуоресцеина от температурь! средь // Проблемь! криобиологии. - 2001. - Мо1. - б. с 3-7. 4. Пат. Мо14072, Україна, С0О1М 24/10, 1997. ч 5. Иванов Л.В., Ляпунов Н.А., Цьімбал Л.В. и др. Влияние состава двухкомпонентньїх растворителей на биологические мембрань // Хим.-фарм. журнал. - 1988. - Мо1. - С. 1437-1443. б. Цьмбал Л.В., Нардид Я.О. Проницаемость мембран зритроцитов, модифицированньїх вьісокими « температурами и сульфгидрильньми реагентами Актуальнье проблемь! медицинь и биологиий // Сб. научн. тр., 70 Киев, 2004. - С. 185-189. - с 7. Зепдиріа Р.К. апа Казпа М. ЕЄЕхсіей віаїе ргоіоп-ігапзїег зресігозсору ої З-пудгохуПпамопе апа а дциегсеїт // Спет. РпПувз. І ей. - 1979. - Мої. 68. - Мо2-3. - Р. 382-385. ,» 8. Рімомагепко М.б., Тидапома А.М., КіутспепКо А.5., ЮОетспепко. А.Р. РіамопоЇїв аз тодеїв їог Пиогевзсепі тетбгапе ргобев. 1. Те гезропзе о Ше спагде ої тісеїПев// СешШаг 5 Моїіесшіаг Віоіоду І еЧЦегв. - 1997. - Мо 2.-Р. 355-364. - 9. Каталог "Реактивь! для биохимии и исследований в области естественньх наук" (Зідта), 1999. С. 2196. с 10. Каталог "Реактивь! для биохимии и исследований в области естественньмх наук" (Зідта), 1999. С. 451. (ее)

Claims (1)

1. Формула винаходу о 50 с Спосіб визначення мембранотропної активності кріопротектора, що включає введення зонда в досліджувані мембрани, реєстрацію його спектра, математичну обробку спектральних даних і побудову графіка залежності знайдених спектральних параметрів від концентрації кріопротектора, який відрізняється тим, що в мембрани вводять флуоресцентний зонд, за який використовують З-гідрокси-4 -(М,М-диметиламіно)флавон, на спектрофлуориметрі реєструють його спектр флуоресценції, після чого виконують математичну обробку с спектральних даних, яка полягає в тому, що з спектрів визначають інтенсивності флуоресценції (ЕР) зонда на довжинах хвиль А і Б, де А знаходиться в межах 480-535 нм, Б - в межах 540-650 нм, будують графік залежності відношення інтенсивностей Е А/ЕРр від концентрації кріопротектора і за зростанням відношення Е Д/Ер, У бо порівнянні з аналогічним параметром, обчисленим для даного виду мембран у відсутності кріопротектора, судять про мембранотропну активність кріопротектора.

   Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2006, М 4, 15.04.2006. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і 65 науки України.