UA13838U - Method for determining membrane-acting activity of cryoprotector - Google Patents
Method for determining membrane-acting activity of cryoprotector Download PDFInfo
- Publication number
- UA13838U UA13838U UAU200510378U UAU200510378U UA13838U UA 13838 U UA13838 U UA 13838U UA U200510378 U UAU200510378 U UA U200510378U UA U200510378 U UAU200510378 U UA U200510378U UA 13838 U UA13838 U UA 13838U
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- membranes
- probe
- determining
- cryoprotectant
- activity
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 10
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims abstract description 9
- GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N Thermopsosid Natural products O(C)c1c(O)ccc(C=2Oc3c(c(O)cc(O[C@H]4[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O4)c3)C(=O)C=2)c1 GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 claims abstract description 3
- 150000002212 flavone derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N vitamin p Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C=C1C1=CC=CC=C1 VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 38
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 35
- 230000000639 membranetropic effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 10
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 10
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 claims description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 7
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 5
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 abstract 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 5
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- -1 potassium ferricyanide Chemical compound 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 3
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 3
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 3
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 3
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000008150 cryoprotective solution Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000001362 electron spin resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- PYDZKXQLRMNQFK-UHFFFAOYSA-N 5-DOXYL-stearic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC1(CCCC(O)=O)OCC(C)(C)N1[O] PYDZKXQLRMNQFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150059870 Evi5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- HVQAJTFOCKOKIN-UHFFFAOYSA-N flavonol Chemical class O1C2=CC=CC=C2C(=O)C(O)=C1C1=CC=CC=C1 HVQAJTFOCKOKIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 150000002433 hydrophilic molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000001589 microsome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 239000001120 potassium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002311 subsequent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Description
Опис винаходуDescription of the invention
Корисна модель належить до галузі кріобіології і може бути використана для порівняльної експрес-оцінки 2 впливу кріопротекторів (КП) на стан ліпідного бішару штучних або природних (клітинних) мембран при підборі оптимального КП; при тестуванні нових речовин на здатність виступати в ролі КП; а також для визначення максимальних концентрацій КП, які можуть бути застосовані при кріоконсервуванні клітин.The useful model belongs to the field of cryobiology and can be used for a comparative express assessment 2 of the effect of cryoprotectants (CP) on the state of the lipid bilayer of artificial or natural (cellular) membranes when selecting the optimal CP; when testing new substances for their ability to act as KP; as well as to determine the maximum concentrations of KP that can be used in cryopreservation of cells.
Збереження біологічних мембран - одних з найбільш кріолабільних структур клітин, в процесі кріоконсервування клітин людини і тварин забезпечують за допомогою штучного введення в середовище 70 кріоконсервування захисних речовин - КП, які значною мірою послаблюють негативні наслідки дії низьких температур. В той же час, самі КП часто бувають неіндиферентними по відношенню до клітин. Багато з них здатні пошкоджувати мембрани клітин і виявляти цитотоксичну дію ще до заморожування, на етапі еквілібрації клітин в кріозахисних розчинах і, таким чином, сенсибілізувати їх до наступної дії зниження температури і супутніх факторів. З іншого боку, навіть один і той же КП може по-різному впливати на мембрани одного типу 72 клітин, але отриманих з різних тварин, що пов'язано з видовими розбіжностями білок-ліпідного складу їх цитоплазматичних мембран. Таким чином, як для тестування нових речовин - потенціальних КП, так і для оцінки ефективності КП по відношенню до певного виду клітин, необхідно оцінювати його вплив на структурний стан мембран клітин.Preservation of biological membranes - one of the most cryolabile structures of cells, in the process of cryopreservation of human and animal cells is ensured by the artificial introduction of 70 cryopreservation protective substances - KP, which significantly weaken the negative effects of low temperatures. At the same time, CPs themselves are often indifferent to cells. Many of them are able to damage cell membranes and exhibit a cytotoxic effect even before freezing, at the stage of equilibration of cells in cryoprotective solutions and, thus, sensitize them to the subsequent effect of lowering the temperature and associated factors. On the other hand, even the same KP can have different effects on the membranes of the same type of 72 cells, but obtained from different animals, which is associated with species differences in the protein-lipid composition of their cytoplasmic membranes. Thus, both for testing new substances - potential KPs, and for evaluating the effectiveness of KPs in relation to a certain type of cells, it is necessary to evaluate its effect on the structural state of cell membranes.
Відомі способи визначення мембранотропної активності речовин, що грунтуються на вимірюванні швидкості виходу з еритроцитів гемоглобіну в умовах дії кислоти або луги (кислотний або лужний гемоліз) |11).There are known methods of determining the membranotropic activity of substances based on measuring the rate of release of hemoglobin from erythrocytes under conditions of acid or alkali action (acidic or alkaline hemolysis) |11).
Однак, ці способи застосовують лише для еритроцитів, і вони не можуть бути використані для клітин, які не вміщують гемоглобін. Крім того, гемоглобін є високомолекулярним білком і для його виходу з мембран у останніх повинні утворитися досить великі пори, які свідчать про суттєве порушення мембран клітин, тоді як порушення цілісності мембран, що супроводжується утворенням менших за розмірами дефектів, також може спричиняти негативний вплив на функціонування клітини. До того ж, гетерогенність розподілу еритроцитів за віком, в наявність і неоднакова кількість холестерину в індивідуальних зразках не дозволяють вважати цей метод універсальним для оцінки мембранотропних властивостей КП. Відомо також, що залежність ступеня гемолізу еритроцитів від концентрації малих гідрофільних молекул носить лінійний характер, тоді як для ліпофільних органічних молекул, до яких можна віднести частину КП, ця залежність носить нелінійний характер (21), що со значно ускладнює інтерпретацію і співставлення результатів при порівнянні мембранотропних властивостей КП, со які відносяться до різних класів хімічних речовин.However, these methods apply only to red blood cells, and they cannot be used for cells that do not contain hemoglobin. In addition, hemoglobin is a high-molecular protein, and for its exit from the membranes, fairly large pores must be formed in the latter, which indicate a significant violation of the cell membranes, while the violation of the integrity of the membranes, accompanied by the formation of smaller defects, can also cause a negative effect on the functioning cells In addition, the heterogeneity of the distribution of erythrocytes by age, presence and unequal amount of cholesterol in individual samples do not allow this method to be considered universal for evaluating the membranotropic properties of CP. It is also known that the dependence of the degree of hemolysis of erythrocytes on the concentration of small hydrophilic molecules is linear, while for lipophilic organic molecules, which can include part of CP, this dependence is non-linear (21), which greatly complicates the interpretation and comparison of results when comparing membranotropic properties of KP, which belong to different classes of chemical substances.
Існує спосіб визначення мембранотропної активності речовин, який грунтується на введенні в клітини со флуоресцеїн діацетату, що в клітинах гідролізується естеразами до вільного флуоресцеїна, який має гіршу со проникливість, що дозволяє використовувати його як маркер цілості плазматичної мембрани |ЗІ.There is a method of determining the membranotropic activity of substances, which is based on the introduction into cells of fluorescein diacetate, which is hydrolyzed in cells by esterases to free fluorescein, which has poorer permeability, which allows it to be used as a marker of the integrity of the plasma membrane.
Зо Однак, застосування цього методу також має ряд обмежень, серед яких можна відзначити залежність -- ферментативного перетворення флуоресцеїн діацетату у флуоресцеїн від активності внутрішньоклітинних естераз, на яку, в свою чергу, можуть впливати фактори, які порушують цілісність чи проникливість мембран, а також здатність флуоресцеіїна переноситись Через мембрани за допомогою специфічних каналів або « транспортних білків клітин печінки. В клітинах печінки, крім того, флуоресцеїн може метаболізуватись З Ммонооксигеназною системою мікросом. Все це може спотворювати результати вимірювань при роботі з с клітинами.However, the use of this method also has a number of limitations, among which we can note the dependence of the enzymatic conversion of fluorescein diacetate into fluorescein on the activity of intracellular esterases, which, in turn, can be affected by factors that violate the integrity or permeability of membranes, as well as the ability fluorescein is transported through membranes with the help of specific channels or transport proteins of liver cells. In liver cells, in addition, fluorescein can be metabolized by the Mmonooxygenase system of microsomes. All this can distort the results of measurements when working with cells.
Із» Відомий також спосіб визначення мембранотропної активності органічних сполук по зміні проникності мембран клітин для ферріціаніду калію |4). Для цього клітини насичують сумішшю ферріціаніду калію і парамагнітного іміноксильного радикала 2,2,6,6-тетраметіл-4-оксопіперідін-1-оксила, який здатний проникати всередину клітин в нормі, тоді як ферріціанід калію в непошкоджені клітини не проникає. При порушенні - нормальної проникності мембран клітин внаслідок дії на мембрани органічної сполуки, яка досліджується, оз ферріціанід калію починає входити всередину клітин і розширювати сигнал від молекул іміноксильного радикалу, які там знаходяться. Падіння інтенсивності ЕПР-сигналу від іміноксильного радикалу є індикатором появи бо дефектів в структурі мембран. До недоліків методу відноситься те, що він дозволяє визначати тільки такіAlso known is the method of determining the membranotropic activity of organic compounds by changing the permeability of cell membranes for potassium ferricyanide |4). To do this, the cells are saturated with a mixture of potassium ferricyanide and the paramagnetic iminoxyl radical 2,2,6,6-tetramethyl-4-oxopiperidine-1-oxyl, which is able to penetrate into cells normally, while potassium ferricyanide does not penetrate into undamaged cells. When the normal permeability of cell membranes is disturbed due to the action of the organic compound under investigation on the membranes, potassium ferricyanide begins to enter the cells and amplify the signal from the iminoxyl radical molecules that are there. A drop in the intensity of the EPR signal from the iminoxyl radical is an indicator of the appearance of defects in the membrane structure. The disadvantages of the method include the fact that it allows to determine only such
Ге) 20 пошкодження мембран, які призвели до утворення пор, і не дозволяє реєструвати порушення, спричинені дієюGe) 20 damage to the membranes that led to the formation of pores, and does not allow to register the disturbances caused by the action
КП на етапах, які ще не призводять до утворення пор. со Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб визначення мембранотропної активності речовин, оснований на реєстрації сигналів ЕПР від введених в мембрани парамагнітних зондів |5). Спосіб полягає в тому, що парамагнітний зонд (у відсутності або присутності КП) вводять в мембрани, які досліджуються, після чого на 29 ЕПР-спектрометрі реєструють спектр ЕПР зонда, виконують його математичну обробку і будують графік с залежності частоти обертальної дифузії зонда від концентрації КП, на підставі якого судять про мембранотропну активність речовини.KP at stages that do not yet lead to the formation of pores. The closest to the proposed method is the method of determining the membranotropic activity of substances, based on the registration of EPR signals from paramagnetic probes introduced into the membranes |5). The method consists in the fact that a paramagnetic probe (in the absence or presence of KP) is introduced into the membranes to be investigated, after which the EPR spectrum of the probe is recorded on the 29 EPR spectrometer, its mathematical processing is performed and a graph is drawn with the dependence of the rotational diffusion frequency of the probe on the concentration of KP , on the basis of which the membranotropic activity of the substance is judged.
До основних недоліків цього способу можна віднести такі: - недостатня чутливість, пов'язана з тим, що для отримання задовільного відношення сигнал/шум треба бо використовувати ЕПР-зонди в кінцевих концентраціях не менш ніж 4х10 7-5х10-9М (6). Такі концентрації є досить високими і самі по собі можуть спричинити негативний вплив на об'єкт дослідження - біомембрани. З іншого боку, при використанні менших концентрацій зондів необхідно застосовувати накопичення сигналів, яке подовжує час вимірювань; - складність інтерпретації результатів, яка полягає в тому, що навіть у випадку використання одного і бо того ж ЕПР-зонда, інтерпретація спектрів часто ускладнюється завдяки перетинанню спектрів ЕПР від молекул цього зонда, розташованих у водній фазі і в різних областях мембран; - великі затрати часу, зумовлені специфікою підготовки зразків для ЕПР-вимірювань, які потребують розміщення зразків в спеціальних скляних капілярах, юстировки в резонаторі спектрометра, настройки параметрів поля тощо. Для отримання адекватної інформації про стан різних областей бішару, звичайно застосовують по черзі (тобто, в окремих експериментах) декілька різних ЕПР-зондів, що збільшує час вимірювань, який для одного зразка знаходиться в межах 10-15хв. і подовжує термін обробки спектрів; - висока вартість ЕПР-зондів, які використовуються для досліджень.The main disadvantages of this method include the following: - insufficient sensitivity, due to the fact that in order to obtain a satisfactory signal/noise ratio, it is necessary to use EPR probes in final concentrations of at least 4x10 7-5x10-9M (6). Such concentrations are quite high and by themselves can cause a negative impact on the object of research - biomembranes. On the other hand, when using lower concentrations of probes, it is necessary to apply signal accumulation, which lengthens the measurement time; - the difficulty of interpreting the results, which consists in the fact that even in the case of using one and the same EPR probe, the interpretation of the spectra is often complicated due to the crossing of the EPR spectra from the molecules of this probe located in the aqueous phase and in different regions of the membranes; - large time costs due to the specifics of sample preparation for EPR measurements, which require placing samples in special glass capillaries, adjusting the spectrometer cavity, adjusting the field parameters, etc. To obtain adequate information about the state of different regions of the bilayer, several different EPR probes are usually used alternately (that is, in separate experiments), which increases the measurement time, which for one sample is within 10-15 minutes. and extends the spectrum processing period; - high cost of EPR probes used for research.
В основу корисної моделі поставлено задачу створення такого способу визначення мембранотропної /о активності КП, який, за рахунок використання іншого мембранного зонда, дозволить підвищити чутливість методу, поліпшити інтерпретацію результатів, знизити матеріальні і часові витрати.The basis of a useful model is the task of creating such a method of determining the membraneotropic activity of KP, which, due to the use of another membrane probe, will increase the sensitivity of the method, improve the interpretation of results, and reduce material and time costs.
Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення мембранотропної активності КП, який включає введення зонда в мембрани, що досліджуються, реєстрацію його спектра, математичну обробку спектральних даних і побудову графіка залежності знайдених спектральних параметрів від концентрації КП, згідно з корисною /5 Моделлю, в мембрани вводять флуоресцентний зонд, в якості якого використовуютьThe task is solved by the fact that in the method of determining the membranotropic activity of KP, which includes the introduction of a probe into the membranes under investigation, registration of its spectrum, mathematical processing of spectral data and plotting the dependence of the found spectral parameters on the concentration of KP, according to the useful /5 Model, in a fluorescent probe is introduced into the membrane, which is used
З-гідрокси-4-(М,М-диметиламіно)флавон (ФМЄ), на спектрофлуориметрі реєструють його спектр флуоресценції, після чого виконують математичну обробку спектральних даних, яка полягає в тому, що з спектрів визначають інтенсивності флуоресценції (ЕР) зонда на довжинах хвиль А і Б, де А знаходиться в межах 480-535нм, Б - в межах 540-650нм, будують графік залежності відношення інтенсивностей Е д/Рр від концентрації КП і за Зростанням відношення Е д/Рр у порівнянні з аналогічним параметром, обчисленим для даного виду мембран у відсутності КП, судять про мембранотропну активність КП.3-hydroxy-4-(M,M-dimethylamino)flavone (FME), its fluorescence spectrum is recorded on a spectrofluorimeter, after which mathematical processing of the spectral data is performed, which consists in determining the fluorescence intensities (ER) of the probe at lengths from the spectra waves A and B, where A is in the range of 480-535nm, B - in the range of 540-650nm, construct a graph of the dependence of the ratio of intensities E d/Pr on the concentration of KP and on the growth of the ratio E d/Pr in comparison with a similar parameter calculated for of this type of membranes in the absence of KP, judge the membranotropic activity of KP.
Мультипараметричний зонд ФМЄ належить до класу З-гідроксифлавонів. Зонди цього класу при електронному збудженні здатні до ізомеризації з утворенням нормальної (М") і таутомерної (17) форм 171.The multiparameter probe FME belongs to the class of 3-hydroxyflavones. Probes of this class under electronic excitation are capable of isomerization with the formation of normal (M") and tautomeric (17) forms of 171.
Положення і інтенсивність смуг емісії кожної з форм залежать не тільки від хімічної структури зонда, але й від параметрів оточення його молекул, таких як гливкість, полярність, і від здатності утворювати міжмолекулярні водневі зв'язки (8). В мембранах ФМЄ локалізується на межі полярної і неполярної областей т ліпідного бішару, що забезпечує його високу чутливість до початкових змін структури як полярної, так і неполярної зон бішару. При цьому, тільки молекули зонда, які локалізуються в мембрані, мають двосмугову форму спектра флуоресценції і набагато більшу інтенсивність у порівнянні з молекулами ФМЄ, які знаходяться у со зо розчині. Це дозволяє відрізняти сигнали флуоресценції ФМЄ, який знаходиться в мембранах та поза мембранами (у водному чи водно-кріопротекторному середовищі). оThe position and intensity of the emission bands of each of the forms depend not only on the chemical structure of the probe, but also on the parameters surrounding its molecules, such as viscosity, polarity, and the ability to form intermolecular hydrogen bonds (8). In membranes, FME is localized at the border of polar and nonpolar regions of the lipid bilayer, which ensures its high sensitivity to initial changes in the structure of both polar and nonpolar zones of the bilayer. At the same time, only the molecules of the probe, which are localized in the membrane, have a two-band form of the fluorescence spectrum and a much higher intensity compared to the FME molecules, which are in the aqueous solution. This makes it possible to distinguish the fluorescence signals of FME, which is located in the membranes and outside the membranes (in an aqueous or aqueous-cryoprotective environment). at
Використання флуоресцентного зонда ФМЄ і відношення інтенсивностей його смуг флуоресценції Е д до ЕБ со для визначення мембранотропної активності КП дозволяє: - підвищити чутливість способу за рахунок використання на порядок більш низької (10 ЗМ), у порівнянні з о методом ЕПР, концентрації флуоресцентного зонда; «- - поліпшити інтерпретацію результатів за рахунок того, що флуоресценцію ФМЄ можна спостерігати майже цілком з мембран, а в водному чи водно-кріопротекторному розчині вона незначна і не заважає аналізу спектральних даних; « - скоротити час вимірювань до їхв. і знизити трудомісткість методу за рахунок зміни зонда, способу 70 реєстрації спектрів, спрощення процедури підготовки зразка і математичної обробки результатів у порівнянні з - с методом ЕПР, а також за рахунок використання одного зонда, чутливого до структурних змін як поверхневої, так й і неполярної областей мембрани; "» знизити вартість визначення за рахунок використання флуоресцентного зонда, вартість якого на З порядки нижче за вартість ЕПР-зондів. Так, наприклад, вартість зонда ФМЕ становить біля ФБ за г, вартість флуоресцентного зонда флуоресцеїн діацетату (номер за каталогом Е7378) складає Ф3.88 за 1г (9), тоді як - вартість поширеного мембранного ЕПР-зонду 5-доксил стеаринової кислоти (номер за каталогом 25,363-4), складає 550600 за 1г (10). о Спосіб здійснюють таким чином. (ее) Флуоресцентний зонд ФМЄ, у вигляді спиртового розчину з початковою концентрацією 5х10 7-0,5х10 М, с 50 додають в кількості 2-10мкл до 2-Змл суспензії штучних або природних мембран (які не містять КП). Кінцева концентрація зонда в суспензії мембран становить при цьому 0,5-5х10 УМ. Після 10-15хв. інкубації суспензії со мембран з зондом реєструють його спектр флуоресценції, обравши довжину хвилі збудження в області 380-44О0нм. З отриманого спектру флуоресценції знаходять значення інтенсивностей Е А і ЕрБ, які виміряють на довжинах хвиль А і Б, де А заходиться в межах 480-535нм, а Б знаходиться в межах 540-65Онм і обчислюють відношення Е Д/Ер. Аналогічні вимірювання виконують для зразків суспензії мембран, які додатково вміщують с різні концентрації КП. По знайденим значенням інтенсивностей флуоресценції будують залежність Е д/Ер від концентрації КП і за зростанням нахилу графіка у бік осі ординат у порівнянні з контролем судять про мембранотропну активність КП.The use of the fluorescent probe FME and the ratio of the intensities of its fluorescence bands E d to EB so to determine the membranotropic activity of KP allows: - to increase the sensitivity of the method due to the use of an order of magnitude lower (10 ZM), compared to the EPR method, concentration of the fluorescent probe; "- - to improve the interpretation of the results due to the fact that the fluorescence of FME can be observed almost entirely from the membranes, and in an aqueous or aqueous-cryoprotective solution it is insignificant and does not interfere with the analysis of spectral data; "- to reduce the time of measurements to their and to reduce the complexity of the method due to the change of the probe, the method of 70 registration of spectra, the simplification of the sample preparation procedure and mathematical processing of the results in comparison with the EPR method, as well as due to the use of a single probe sensitive to structural changes in both surface and non-polar regions membranes; "» reduce the cost of detection by using a fluorescent probe, the cost of which is an order of magnitude lower than the cost of EPR probes. So, for example, the cost of the FME probe is about FB per g, the cost of the fluorescent probe fluorescein diacetate (catalog number E7378) is Ф3. 88 per 1g (9), while the cost of the common membrane EPR probe of 5-doxyl stearic acid (catalogue number 25,363-4) is 550,600 per 1g (10). o The method is carried out as follows. (ee) Fluorescent probe FME , in the form of an alcohol solution with an initial concentration of 5x10 7-0.5x10 M, s 50 is added in an amount of 2-10 μl to 2-3 ml of a suspension of artificial or natural membranes (which do not contain KP). The final concentration of the probe in the membrane suspension is 0 ,5-5x10 UM. After 10-15 minutes of incubation of the membrane suspension with the probe, its fluorescence spectrum is recorded, choosing an excitation wavelength in the range of 380-44O0nm. From the obtained fluorescence spectrum, the values of the intensities of EA and ErB are found, which measure n and wavelengths A and B, where A falls within the range of 480-535 nm, and B is within the range of 540-65 Ohm, and calculate the ratio E D/Er. Analogous measurements are performed for membrane suspension samples, which additionally contain different concentrations of KP. Based on the found values of fluorescence intensities, the dependence of E d/Er on the concentration of KP is plotted and the membranotropic activity of KP is judged by the increase in the slope of the graph towards the ordinate axis in comparison with the control.
Приклад 1 6о Флуоресцентний зонд ФМЄ розчиняли в етиловому спирті до концентрації 3х10 ЗМ. 1Омкл спиртового розчину ФМЕ додавали до 2,Омл суспензії ліпосом, приготованих з яєчного фосфатиділхоліну (з вмістом ліпідів 2,О0мг/мл), інкубували 7Охв. і реєстрували спектр флуоресценції зонда в області 410-650нм на спектрофлуориметрі Магіап Сагу Есіїірзе (США) при ширині щілин монохроматорів збудження і флуоресценції 5 іExample 1 6o Fluorescent probe FME was dissolved in ethyl alcohol to a concentration of 3x10 ZM. 1 μl of FME alcohol solution was added to 2.0 ml of a suspension of liposomes prepared from egg phosphatidylcholine (with a lipid content of 2.00 mg/ml), incubated for 7 hours. and recorded the fluorescence spectrum of the probe in the 410-650nm range on a Magiap Sagu Essiiirze (USA) spectrofluorimeter at a slit width of excitation and fluorescence monochromators of 5 and
Бнм, відповідно, та довжині хвилі збудження 405нм. Після цього з отриманого спектру знаходили максимуми бо флуоресценції зонда на довжинах хвиль А і Б, які обирали при 515 і 575нм, відповідно. обчислювали відношення інтенсивностей флуоресценції Евів/Ев75. Воно дорівнювало 0,57. Аналогічні виміри проводили для зразків мембран, які крім ФМЕ вміщували 5, 10, 20, 30 і 40 об. 95 диметілсульфоксіду (ДМСО). За знайденими значеннями інтенсивностей флуоресценції ФМЕ при 515 і 575нм будували залежність відношення РЕ ві5/Ев75 відBnm, respectively, and the excitation wavelength is 405nm. After that, the probe fluorescence maxima were found from the obtained spectrum at wavelengths A and B, which were chosen at 515 and 575 nm, respectively. calculated the ratio of fluorescence intensities Eviv/Ev75. It was equal to 0.57. Analogous measurements were made for membrane samples, which, in addition to FME, contained 5, 10, 20, 30, and 40 vol. 95 dimethyl sulfoxide (DMSO). Based on the found values of the fluorescence intensities of FME at 515 and 575 nm, the dependence of the РЕ ві5/Ев75 ratio on
Концентрації ДМСО і по різкому нахилу графіка в бік осі ординат визначали початкову концентрацію ДМСО, яка спричиняє порушення упаковки мембран. Вона становила 12 об. 95.The concentration of DMSO and the sharp slope of the graph in the direction of the ordinate axis determined the initial concentration of DMSO, which causes a violation of membrane packing. It was 12 volumes. 95.
Приклад 2Example 2
Флуоресцентний зонд ФМЕ розчиняли в етанолі до концентрації 3,5хХ10 ЗМ. 1О0мкл спиртового розчину ФМЕ додавали до 2,О0мл суспензії ліпосом, приготованих з сумарних ліпідів сперматозоїдів півня (з вмістом ліпідів 70. ,Омг/мл), інкубували 15хв. і реєстрували спектр флуоресценції зонда, як описано в прикладі 1. Визначали відношення інтенсивностей флуоресценції зонда на довжинах хвиль А і Б, які обирали при 515 і 575нм, відповідно. Відношення Е515/Ев75 становило 0,57. Аналогічні вимірювання проводили для зразків, що вміщують, крім ФМЕ, 5, 10, 20, 30 ї 40 об.95 диметілформаміду (ДМФА). За визначеними значеннями інтенсивностей флуоресценції будували графік залежності Еві5/Евт5 від концентрації ДМФА і за різким нахилом графіка в бік 75 осі ординат визначали початкову концентрацію ДМФА, яка спричиняє порушення упаковки мембран. Вона становила 7,5 об. 90.The fluorescent probe FME was dissolved in ethanol to a concentration of 3.5xX10 ММ. 100 μl of alcoholic solution of FME was added to 2.00 ml of a suspension of liposomes prepared from the total lipids of rooster spermatozoa (with a lipid content of 70.0 mg/ml), incubated for 15 minutes. and recorded the fluorescence spectrum of the probe, as described in example 1. Determined the ratio of the fluorescence intensities of the probe at wavelengths A and B, which were chosen at 515 and 575 nm, respectively. The E515/Ev75 ratio was 0.57. Analogous measurements were performed for samples containing, in addition to FME, 5, 10, 20, 30, and 40 vol.95 dimethylformamide (DMF). Based on the determined values of the fluorescence intensities, a graph of the dependence of Evi5/Evt5 on the DMF concentration was plotted, and the initial concentration of DMF, which causes disruption of membrane packing, was determined based on the sharp slope of the graph towards the 75 axis of the ordinate. It was 7.5 volumes. 90.
Приклад ЗExample C
Флуоресцентний зонд ФМЄ розчиняли в етанолі до концентрації 0,7х10 ЗМ. 20мкл спиртового розчину ФМЄ додавали до 2,0мл суспензії мікросомальних мембран, вилучених з печінки щура (вміст загального білка в зразках становив 0,75мг/мл), інкубували 15хв. і реєстрували спектр флуоресценції зонда, як описано в прикладі 1. Обчислювали відношення інтенсивностей флуоресценції зонда на довжинах хвиль А і Б, які обирали при 515 і 575нм, відповідно. Воно становило 0,45. Аналогічні вимірювання виконували для зразків, які вміщували, крімThe fluorescent probe FME was dissolved in ethanol to a concentration of 0.7x10 ММ. 20 μl of an alcoholic solution of FME was added to 2.0 ml of a suspension of microsomal membranes extracted from a rat liver (the total protein content in the samples was 0.75 mg/ml), incubated for 15 minutes. and recorded the fluorescence spectrum of the probe, as described in example 1. Calculated the ratio of fluorescence intensities of the probe at wavelengths A and B, which were chosen at 515 and 575 nm, respectively. It was 0.45. Analogous measurements were performed for samples containing, except
ФМЕ, також 5, 10, 20, ЗО і 40 об.95 ДМСО. За знайденими значеннями інтенсивностей флуоресценції будували графік залежності відношення Е в5і15/Евт5 від концентрації ДМСО і за різкою зміною нахилу кривої в бік осі ординат визначали концентрацію ДМСО, яка спричиняє порушення упаковки мікросомальних мембран. Вона З становила 12 об. 90.FME, also 5, 10, 20, ZO and 40 vol.95 DMSO. Based on the found values of fluorescence intensities, a graph of the dependence of the ratio of E v5i15/Evt5 on the concentration of DMSO was constructed, and the concentration of DMSO, which causes disruption of the packaging of microsomal membranes, was determined based on a sharp change in the slope of the curve towards the ordinate axis. She Z was 12 vol. 90.
Джерела інформації: 1. Иванов И.Т. Сравнение механизмов кислотного и щелочного гемолиза зритроцитов человека // Биофизика. - 2001. - Т. 46, вьпп. 2. - С. 281-290. с 2. Черницкий Е.Б., Сенькович О.Б., Козлова Н.М. Гетерогенность пор, образуемьїх в мембране зритроцитов липофильньїми гемолитиками // Биофизика, - 1996, Т. 41, вьп. 6. - С. 1270-1275. о 3. Бондаренко В.А., Коптелов В.А., Лежанин С.Н., Олейник О.А., Рамазанов В.В., Середа Т.П. Зависимость с интенсивности транспорта флуоресцеина от температурь! средь // Проблемь! криобиологии. - 2001. - Мо1. - б. с 3-7. 4. Пат. Мо14072, Україна, С0О1М 24/10, 1997. ч 5. Иванов Л.В., Ляпунов Н.А., Цьімбал Л.В. и др. Влияние состава двухкомпонентньїх растворителей на биологические мембрань // Хим.-фарм. журнал. - 1988. - Мо1. - С. 1437-1443. б. Цьмбал Л.В., Нардид Я.О. Проницаемость мембран зритроцитов, модифицированньїх вьісокими « температурами и сульфгидрильньми реагентами Актуальнье проблемь! медицинь и биологиий // Сб. научн. тр., 70 Киев, 2004. - С. 185-189. - с 7. Зепдиріа Р.К. апа Казпа М. ЕЄЕхсіей віаїе ргоіоп-ігапзїег зресігозсору ої З-пудгохуПпамопе апа а дциегсеїт // Спет. РпПувз. І ей. - 1979. - Мої. 68. - Мо2-3. - Р. 382-385. ,» 8. Рімомагепко М.б., Тидапома А.М., КіутспепКо А.5., ЮОетспепко. А.Р. РіамопоЇїв аз тодеїв їог Пиогевзсепі тетбгапе ргобев. 1. Те гезропзе о Ше спагде ої тісеїПев// СешШаг 5 Моїіесшіаг Віоіоду І еЧЦегв. - 1997. - Мо 2.-Р. 355-364. - 9. Каталог "Реактивь! для биохимии и исследований в области естественньх наук" (Зідта), 1999. С. 2196. с 10. Каталог "Реактивь! для биохимии и исследований в области естественньмх наук" (Зідта), 1999. С. 451. (ее)Sources of information: 1. Ivanov I.T. Comparison of mechanisms of acid and alkaline hemolysis of human erythrocytes // Biophysics. - 2001. - T. 46, vpp. 2. - P. 281-290. p 2. Chernytskyi E.B., Senkovich O.B., Kozlova N.M. Heterogeneity of pores formed in the membrane of erythrocytes by lipophilic hemolytics // Biophysics, - 1996, Vol. 41, vol. 6. - pp. 1270-1275. o 3. V.A. Bondarenko, V.A. Koptelov, S.N. Lezhanyn, O.A. Oleynyk, V.V. Ramazanov, T.P. Sereda. Dependence of the intensity of fluorescein transport on temperatures! Wednesday // Problem! cryobiology. - 2001. - Mo1. - b. with 3-7. 4. Pat. Mo14072, Ukraine, С0О1М 24/10, 1997. h 5. Ivanov L.V., Lyapunov N.A., Tsymbal L.V. et al. Influence of the composition of two-component solvents on biological membranes // Khim.-Pharm. magazine. - 1988. - Mo1. - P. 1437-1443. b. Tsmbal L.V., Nardyd Y.O. Permeability of erythrocyte membranes modified by high temperatures and sulfhydryl reagents Actual problems! Medicine and Biology // Sat. scientific tr., 70 Kyiv, 2004. - P. 185-189. - p 7. Zepdyria R.K. apa Kazpa M. EEEhsiei viaie rgoiop-igapzieg zresigozsoru oi Z-pudgohuPpamope apa a dciegseit // Spet. RpPuvz. And hey. - 1979. - Mine. 68. - Mo2-3. - R. 382-385. ,» 8. Rimomagepko M.b., Tidapoma A.M., KiutspepKo A.5., YuOetspepko. A.R. RiamopoYiv az todeiv yoog Piogevzsepi tetbgape rgobev. 1. Te gezropze o She spagde oi tiseiPev// SeshShag 5 Moiiesshiag Vioiodu I eChCegv. - 1997. - Mo 2.-R. 355-364. - 9. Catalog "Reagent! for biochemistry and research in the field of natural sciences" (Zidta), 1999. P. 2196. p 10. Catalog "Reagent! for biochemistry and research in the field of natural sciences" (Zidta), 1999. P. 451. (ee)
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU200510378U UA13838U (en) | 2005-11-03 | 2005-11-03 | Method for determining membrane-acting activity of cryoprotector |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU200510378U UA13838U (en) | 2005-11-03 | 2005-11-03 | Method for determining membrane-acting activity of cryoprotector |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA13838U true UA13838U (en) | 2006-04-17 |
Family
ID=37457340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAU200510378U UA13838U (en) | 2005-11-03 | 2005-11-03 | Method for determining membrane-acting activity of cryoprotector |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA13838U (en) |
-
2005
- 2005-11-03 UA UAU200510378U patent/UA13838U/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sivandzade et al. | Analysis of the mitochondrial membrane potential using the cationic JC-1 dye as a sensitive fluorescent probe | |
| US5314805A (en) | Dual-fluorescence cell viability assay using ethidium homodimer and calcein AM | |
| Determann et al. | Ultraviolet fluorescence excitation and emission spectroscopy of marine algae and bacteria | |
| Kuner et al. | A genetically encoded ratiometric indicator for chloride: capturing chloride transients in cultured hippocampal neurons | |
| EP2312943B1 (en) | Method for assessing viable cells and the use of n-(7-dimethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)-maleimide (dacm) or n-(9-acridinyl)maleimide (nam) for assessment of apoptosis. | |
| Ozaki | Medical application of Raman spectroscopy | |
| Shapiro | Cell membrane potential analysis | |
| US4423153A (en) | Methods and compositions for the detection and determination of cellular DNA | |
| Kim et al. | A ratiometric two-photon probe for Ca2+ in live tissues and its application to spinal cord injury model | |
| Rogers et al. | Intracellular pH and free calcium changes in single cells using quene 1 and quin 2 probes and fluorescence microscopy | |
| Nanadikar et al. | O2 affects mitochondrial functionality ex vivo | |
| DK157264B (en) | AGENT FOR THE INVESTIGATION OF BIOLOGICAL TISSUE AND / OR LIQUID | |
| Sun et al. | The effects of different fluorescent indicators in observing the changes of the mitochondrial membrane potential during oxidative stress-induced mitochondrial injury of cardiac H9c2 cells | |
| Busche et al. | Continous, non-invasive monitoring of oxygen consumption in a parallelized microfluidic in vitro system provides novel insight into the response to nutrients and drugs of primary human hepatocytes | |
| JP4755587B2 (en) | Method for evaluating substances that change the membrane potential of mitochondria | |
| Teodoro et al. | The evaluation of mitochondrial membrane potential using fluorescent dyes or a membrane-permeable cation (TPP+) electrode in isolated mitochondria and intact cells | |
| Lugli et al. | Polychromatic analysis of mitochondrial membrane potential using JC‐1 | |
| Thahouly et al. | Bovine chromaffin cells: culture and fluorescence assay for secretion | |
| UA13838U (en) | Method for determining membrane-acting activity of cryoprotector | |
| Voznesenskiy et al. | Biosensors based on micro-algae for ecological monitoring of the aquatic environment | |
| Zakeri et al. | Chapter Fifteen Detection of Autophagy in Cell Death | |
| CN101636658A (en) | Fluorescence-based assay for detecting compounds for modulating the sodium-calcium exchanger (NCX) in 'forward mode' | |
| Shapiro | Estimation of membrane potential by flow cytometry | |
| Kaur et al. | Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons | |
| Murray et al. | Glutathione localization by a novel o-phthalaldehyde histofluorescence method |