UA132026U

UA132026U - METHOD OF DNA EXTRACTION FROM CULTURE BACTERIA EXPRESS METHOD

Info

Publication number: UA132026U
Application number: UAU201808655U
Authority: UA
Inventors: Олексій Сергійович Солодянкін; Ольга Сергіївна Константиновська; Борис Тимофійович Стегній; Петро Іванович Потейко; Марія Володимирівна Рекротчук; Антон Павлович Герілович
Original assignee: Національний Науковий Центр "Інститут Експериментальної І Клінічної Ветеринарної Медицини"
Priority date: 2018-08-13
Filing date: 2018-08-13
Publication date: 2019-02-11

Abstract

Спосіб екстракції ДНК з культур бактерій експрес-методом включає чотири етапи: відбір зразка, лізис клітин, відмивка діоксиду кремнію та елюювання ДНК. Діоксид кремнію, який є адсорбентом нуклеїнових кислот, наносять на пластиковий шпатель, яким одночасно проводять відбір зразка та сорбцію молекул ДНК.The method of DNA extraction from bacterial cultures by the express method involves four steps: sample collection, cell lysis, washing of silica and elution of DNA. Silicon dioxide, which is an adsorbent of nucleic acids, is applied to a plastic spatula, which is simultaneously sampled and sorbed by DNA molecules.

Description

Корисна модель належить до галузі медицини, ветеринарії та біології, а саме до способу виділення ДНК з культур мікроорганізмів експрес-методом, і може використовуватися у мікробіологічних лабораторіях медичного, ветеринарного та біологічного профілю, а також при роботі в польових умовах при проведенні молекулярно-генетичних досліджень.The useful model belongs to the field of medicine, veterinary medicine and biology, namely to the method of extracting DNA from cultures of microorganisms by an express method, and can be used in microbiological laboratories of a medical, veterinary and biological profile, as well as when working in the field during molecular genetic research .

При проведенні молекулярно-генетичних досліджень базовим етапом є екстракція ДНК.When conducting molecular genetic research, the basic stage is DNA extraction.

Одним із факторів отримання якісного препарату ДНК для молекулярно-генетичного дослідження є своєчасне транспортування зразка в лабораторію зі зберіганням температурних режимів, що обумовлено дією ферментів, які руйнують нуклеїнові кислоти (дезоксирибонуклеаза та інші). Особливо це стосується проб мокротиння і фекалій, які містять велику кількість різноманітних ферментів. Своєчасне транспортування зразків часто ускладняється при експедиційних дослідженнях, що може призвести до псування біологічного матеріалу.One of the factors of obtaining a high-quality DNA preparation for molecular genetic research is the timely transportation of the sample to the laboratory with temperature storage, which is due to the action of enzymes that destroy nucleic acids (deoxyribonuclease and others). This especially applies to samples of sputum and feces, which contain a large number of various enzymes. Timely transportation of samples is often difficult during expedition research, which can lead to spoilage of biological material.

Існує спосіб екстракції нуклеїнових кислот за допомогою фенолу та хлороформу (СтанатThere is a method of nucleic acid extraction using phenol and chloroform (Stat

О.Е. Те Івоїайоп ої Нідп Моїесшаг У/еідні ОМА їот УУпоїеє Огдапізт5 ог І агде Тіввие Мазз5езв.O.E. Te Ivoyiop oi Nidp Moiesshag U/eidni OMA iot UUpoieye Ogdapizt5 og I agde Tivvie Mazz5ezv.

Апаї!. Віоспет. 1978. Мої. 85, М 2. Р. 609-613). Недоліком цього способу є токсичність реагентів, які використовуються при екстракції, що значно зменшує можливості його використання.Apai!. Viospet. 1978. Mine. 85, M 2. R. 609-613). The disadvantage of this method is the toxicity of the reagents used during extraction, which significantly reduces the possibilities of its use.

Одним із класичних методів екстракції ДНК є сорбентний метод, запропонований РічардомOne of the classical methods of DNA extraction is the sorbent method proposed by Richard

Бумом (Раріа апа вітріє теїнод ог ригіїісайноп ої писівїс асід5. А. Воот еї аї. У. Сіїп. Місгобіо|. 1990. МоІ.28. М 3. Р. 495-503, патенти на способи екстракції ДНК 55234809 та ЕРОЗ89063), який оснований на адсорбції нуклеїнових кислот на діоксиді кремнію в розчинах з високим вмістом іонів та подальшою елюцією в гіпоїзотонічний розчин (ТЕ-буфер). Суть способу полягає в проведенні лізису біологічного зразка за допомогою розчину гуанідіну тіоцианату, з подальшим додаванням діоксиду кремнію у вигляді силікагелю, який осаджується центрифугуванням та відмивається розчинами етанолу та ацетону.Bumom (Raria apa vitrie teinod og rigiiiisainop oi pisivis asid5. A. Voot ei ai. U. Siip. Misgobio|. 1990. MoI. 28. M 3. R. 495-503, patents for methods of DNA extraction 55234809 and EROZ89063), which is based on the adsorption of nucleic acids on silicon dioxide in solutions with a high content of ions and subsequent elution into a hypoisotonic solution (TE-buffer). The essence of the method is to carry out lysis of a biological sample using a solution of guanidine thiocyanate, followed by the addition of silicon dioxide in the form of silica gel, which is precipitated by centrifugation and washed with solutions of ethanol and acetone.

Це рішення може бути найближчим аналогом.This solution may be the closest analogue.

Суттєвим недоліком є те, що для екстракції ДНК використовують силікагель, для відмивки якого потрібне спеціальне обладнання, таке як центрифуги та вакуумні відсмоктувачі, що впливає на швидкість аналізу.A significant disadvantage is that silica gel is used for DNA extraction, which requires special equipment such as centrifuges and vacuum cleaners to wash, which affects the speed of the analysis.

Задачею корисної моделі є спрощення процедури екстракції ДНК при проведенніThe task of a useful model is to simplify the procedure of DNA extraction when carried out

Зо молекулярно-генетичних досліджень.From molecular genetic studies.

В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб екстракції ДНК з культур бактерій експрес-методом, що включає чотири етапи: відбір зразка, лізис клітин, відмивку діоксиду кремнію та елюювання ДНК, шляхом нанесення діоксиду кремнію, який є адсорбентом нуклеїнових кислот, на пластиковий шпатель, яким одночасно проводять відбір зразка та сорбцію молекул ДНК.The useful model is based on the task of developing a method of extracting DNA from bacterial cultures using an express method, which includes four stages: sample selection, cell lysis, silicon dioxide washing and DNA elution, by applying silicon dioxide, which is an adsorbent of nucleic acids, to a plastic spatula. with which sample selection and sorption of DNA molecules are carried out simultaneously.

Експрес-екстракцію ДНК з культур клітин проводять наступним чином.Express extraction of DNA from cell cultures is carried out as follows.

Для приготування лізуючого буферу змішують гуанідін тіоционат Си5СМ, 0,1 М Ттгів-НОЇ, 0, 2М ЕОТА та Тійоп.To prepare the lysing buffer, mix guanidine thiocyanate Si5SM, 0.1 M Ttgiv-NOI, 0.2 M EOTA and Thiop.

Для приготування розчину для відмивання, що представляє собою 70 95 розчин етанолу з додаванням Масі, змішують 95 95 розчин етанолу, розчин 4 М Масі та дистильовану воду.To prepare the washing solution, which is a 70 95 ethanol solution with the addition of Masi, mix a 95 95 ethanol solution, a 4 M Masi solution and distilled water.

Для приготування пластикового шпателя на малих мікробіологічних петлях за допомогою клею на основі цианоакрілату закріплюють діоксид кремнію (5іїса). Через 1 хвилину петлі промивають у дистильованій воді двічі, намагаючись звільнити петлі від надлишку діоксиду кремнію.For the preparation of a plastic spatula, silicon dioxide (5iisa) is fixed on small microbiological loops with the help of cyanoacrylate-based glue. After 1 minute, the loops are washed twice in distilled water, trying to free the loops from excess silica.

Наповнюють пробірки типу епендорф розчинами для екстракції: в окремі пробірки вносять по 300 мкл лізуючого розчину, по 300 мкл розчину для відмивання, по 200 мкл дистильованоїEppendorf tubes are filled with extraction solutions: 300 μl of lysing solution, 300 μl of washing solution, 200 μl of distilled

НО, вільної від нуклеаз.BUT, free from nucleases.

На петлю відбирають частину культури чи біологічний матеріал, петлю переносять у пробірки з лізуючим розчином. Інкубують протягом 5 хвилин за кімнатної температури, періодично перемішуючи ручкою петлі. Петлі переносять у пробірки в розчином для відмивання.A part of the culture or biological material is selected for the loop, the loop is transferred to tubes with a lysing solution. Incubate for 5 minutes at room temperature, periodically stirring with a loop handle. The loops are transferred to test tubes in a washing solution.

Перемішуючи, інкубують протягом 5 хвилин за кімнатної температури. Для елюювання ДНК петлі переносять у пробірки з дистильованою Нео, інкубують протягом 10 хвилин, перемішуючи.While stirring, incubate for 5 minutes at room temperature. For DNA elution, the loops are transferred to tubes with distilled Neo, incubated for 10 minutes, stirring.

Після цього видаляють петлі з пробірок, а одержаний розчин нуклеїнових кислот використовують для молекулярно-генетичного аналізу.After that, the loops are removed from the test tubes, and the resulting solution of nucleic acids is used for molecular genetic analysis.

Ефективність способу розкривається в прикладах:The effectiveness of the method is revealed in examples:

Приклад 1. Для екстракції ДНК використовували 40 ізолятів культур клітин, які були одержані з мокротиння пацієнтів з підозрою на туберкульоз легень. Екстракцію проводили за протоколом, описаним вище. Після екстракції загальна концентрація екстрагованої ДНК складала від 7,24 до 12,07 нг/мкл, коефіцієнти показника поглинання 260/280 складали від 1,70 до 2,41. Після 60 екстракції ДНК була проведена ПЛР з праймерами 1658МАМус (5Ніп 5.9. еї аї, 2010), що фланкують ділянку гену субодиниці 165 РНК довжиною 484 пар нуклеотидів. За результатами електрофорезу у 34 (85,095) випадках зафіксовано наявність специфічного фрагменту довжиною 484 пар нуклеотидів, що свідчило про наявність геномної ДНК бактерій родуExample 1. For DNA extraction, 40 cell culture isolates were used, which were obtained from the sputum of patients with suspected pulmonary tuberculosis. Extraction was performed according to the protocol described above. After extraction, the total concentration of the extracted DNA ranged from 7.24 to 12.07 ng/μl, the coefficients of the absorbance index 260/280 ranged from 1.70 to 2.41. After 60 DNA extraction, PCR was carried out with primers 1658MAMus (5Nip 5.9. ei ai, 2010), flanking the region of the 165 RNA subunit gene with a length of 484 nucleotide pairs. According to the results of electrophoresis, in 34 (85,095) cases, the presence of a specific fragment with a length of 484 pairs of nucleotides was recorded, which indicated the presence of genomic DNA of bacteria of the genus

Мусобасіетіит у досліджуваних культурах клітин.Musobasietiitis in the investigated cell cultures.

Приклад 2. При огляді приватного подвір'я було виявлено теля віком 1 місяць з симптомами сальмонельозу. З калових мас була відібрана проба з подальшою екстракцією ДНК на місці за описаним вище протоколом. Проба ДНК була доставлена до лабораторії для підтвердження діагнозу через З доби після екстракції та використана для проведення ПЛР з застосуванням праймерів ЗаІт3-5ЗаІ/т4 для ідентифікації ЗаІтопеїІа 5рр. (ЕРегтейі єї аї, 2001), що фланкують ділянку гена іпмА довжиною 389 пар нуклеотидів. Результати електрофоретичного аналізу показали наявність специфічної смужки, яка відповідала амплікону цієї довжини, що дозволило лабораторно підтвердити попередній діагноз сальмонельоз.Example 2. When inspecting a private yard, a 1-month-old calf with symptoms of salmonellosis was found. A sample was taken from the fecal masses with subsequent DNA extraction on the spot according to the protocol described above. The DNA sample was delivered to the laboratory for confirmation of the diagnosis three days after the extraction and was used for PCR using primers ZaIt3-5ZaI/t4 to identify ZaItopeiIa 5yr. (Eregteyi Yei Ai, 2001), flanking a region of the ipmA gene with a length of 389 pairs of nucleotides. The results of the electrophoretic analysis showed the presence of a specific band that corresponded to the amplicon of this length, which allowed laboratory confirmation of the preliminary diagnosis of salmonellosis.

Таким чином, розроблений метод екстракції ДНК дозволяє скоротити час досліджень та проводити екстракцію ДНК в умовах з обмеженим доступом до спеціалізованого лабораторного обладнання.Thus, the developed method of DNA extraction allows to reduce the time of research and carry out DNA extraction in conditions with limited access to specialized laboratory equipment.

Claims

USEFUL MODEL FORMULA A method of extracting DNA from bacterial cultures by an express method, which includes four steps: sample selection, cell lysis, silica washing and DNA elution, which is distinguished by the fact that silica, which is an adsorbent of nucleic acids, is applied to a plastic spatula, with which sample selection and sorption of DNA molecules are carried out simultaneously.