UA127678C2

UA127678C2 - Виділене антитіло, яке зв'язується з лептиновим рецептором людини

Info

Publication number: UA127678C2
Application number: UAA201906354A
Authority: UA
Inventors: Джеспер Громада; Панайотіс Стевіс; Панайотис Стевис; Джудіт Алтарехос; Джудит Алтарехос
Original assignee: Редженерон Фармасьютікалс, Інк.; Редженерон Фармасьютикалс, Инк.
Priority date: 2016-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2023-11-29
Also published as: US10550192B2; MX2019005397A; CL2020000549A1; JP2020504078A; IL272358B; CL2020001023A1; CN110167965A; KR102563568B1; MA45801B1; MY191256A; CL2019001263A1; IL272358A; US20200123264A1; CO2019004672A2; MX2023011233A; IL266426B; EP3538554A1; US20180127508A1; EA201991075A1; KR20190075133A

Abstract

Винахід стосується антитіла і антигензв'язуючого фрагмента антитіла, яке зв'язується з лептиновим рецептором (LEPR), і способів його застосування. Згідно з певними варіантами здійснення даного винаходу передбачено антитіло і антигензв'язуючий фрагмент антитіла, яке зв'язується з LEPR і проявляє антагонізм відносно передачі сигналу LEPR. Згідно з певними варіантами здійснення даного винаходу передбачено антитіло і антигензв'язуючий фрагмент антитіла, яке зв'язується з LEPR в присутності та за відсутності лептину. Згідно з іншими варіантами здійснення даного винаходу передбачено антитіло і антигензв'язуючий фрагмент антитіла, яке проявляє частковий агонізм відносно передачі сигналу LEPR. Антитіло і антигензв'язуючий фрагмент згідно з даним винаходом є застосовним для лікування різних станів, включаючи в себе без обмеження наступне: кахексія при застійній серцевій недостатності, легенева кахексія та ракова кахексія, аутоімунні порушення, такі як запальне захворювання кишечнику, червоний вовчак, розсіяний склероз, псоріаз, серцево-судинні захворювання, підвищений артеріальний тиск, нейродегенеративні порушення, депресія, рак, такий як нирковоклітинна карцинома, меланома, рак молочної залози, й інші захворювання та порушення, що асоційовані або викликані зниженою передачею сигналу лептину.

Description

здійснення даного винаходу передбачено антитіло і антигензв'язуючий фрагмент антитіла, яке зв'язується з ГЕРЕ і проявляє антагонізм відносно передачі сигналу ГЕРЕ.

Згідно з певними варіантами здійснення даного винаходу передбачено антитіло і антигензв'язуючий фрагмент антитіла, яке зв'язується з ЕРА в присутності та за відсутності лептину.

Згідно з іншими варіантами здійснення даного винаходу передбачено антитіло і антигензв'язуючий фрагмент антитіла, яке проявляє частковий агонізм відносно передачі сигналу ГЕРЕ.

Антитіло і антигензв'язуючий фрагмент згідно з даним винаходом є застосовним для лікування різних станів, включаючи в себе без обмеження наступне: кахексія при застійній серцевій недостатності, легенева кахексія та ракова кахексія, аутоїмунні порушення, такі як запальне захворювання кишечнику, червоний вовчак, розсіяний склероз, псоріаз, серцево-судинні захворювання, підвищений артеріальний тиск, нейродегенеративні порушення, депресія, рак, такий як нирковоклітинна карцинома, меланома, рак молочної залози, й інші захворювання та порушення, що асоційовані або викликані зниженою передачею сигналу лептину.

Попередній рівень техніки даного винаходу

Лептин являє собою поліпептидний гормон, що переважно експресується жировою тканиною та бере участь в регуляції обміну речовин, енергетичного балансу та споживання їжі.

Активність лептину опосередковується взаємодією з лептиновим рецептором і передачею сигналів за допомогою нього. Лептиновий рецептор (також відомий як "ЕРА", "М/5Х", "ОВ- рецептор", "ОВ-В" і "СО295") являє собою однопрохідний трансмембранний рецептор сімейства цитокінових рецепторів класу І з великим (що складається з 818 амінокислот) позаклітинним доменом. Підвищена експресія лептину, лептинового рецептора ОБ-К або їх обох може сприяти множинним порушенням, включаючи в себе без обмеження наступне: анорексія або інші психічні розлади харчової поведінки, кахексія при хронічному захворюванні нирок, інші кахексії, такі як кахексія при застійній серцевій недостатності, легенева кахексія, променева кахексія та ракова кахексія, аутоїмунні порушення, такі як запальне захворювання кишечнику, червоний вовчак, розсіяний склероз, псоріаз, серцево-судинні захворювання, підвищений артеріальний тиск, депресія, неалкогольний стеатоз печінки, нейродегенеративні розлади, депресія, рак, такий як нирковоклітинна карцинома, меланома та рак молочної залози.

Пропоновані терапевтичні підходи для вирішення проблеми високого рівня передачі сигналів лептину включають в себе застосування наступного:пептидні антагоністи лептинового рецептора й антагоністичні мутанти, такі як розчинні варіанти лептинового рецептора, конкурентні антагоністи І ЕРРЕ, такі як антитіло 9Е8 (Ра?геїї єї аї. (2006) У Іттипоїіодіса! МеїШйосав5 312, 190 200) або наноантитіла, що націлені на лептиновий рецептор (МеМигрнНу есеї аї!., Р О5

Опе (2014) 9(2)е89895), домени фібронектину ПІ, орексигенні речовини (наприклад, грелін і

МРУ), блокада нижчележачих медіаторів лептину (наприклад, рецептора меланокортину 4) і/або зміна способу життя. Проте, такі підходи в цілому показали обмежену ефективність. Таким чином, у даній галузі існує потреба в альтернативних підходах до лікування стійкості до лептину й інших станів, асоційованих з підвищеним вмістом лептину в сироватці талабо надлишковою передачею сигналу ГЕРВ.

Перелік послідовностей

Офіційна копія переліку послідовностей подана одночасно з описом винаходу в електронному вигляді за допомогою ЕЕ5-МУ/еб у вигляді відформатованого відповідно до АБСІЇ

Зо (Американського стандартного коду обміну інформацією) переліку послідовностей з назвою файлу 2017 11 08 10271М/001 5ЕО 1І5Т 5Т25.ТХТ, датою створення 8 листопада 2017 року та розміром, що становить 87,4 КВ. Перелік послідовностей, що міститься в цьому відформатованому згідно з А5СІЇ документі, є частиною даного опису винаходу та тим самим повністю включений в даний документ за допомогою посилання.

Стисле розкриття даного винаходу

Даний винахід відноситься до антитіл та їх антигензв'язуючих фрагментів, які зв'язуються з лептиновим рецептором людини (ГЕРВ). Антитіла згідно з даним винаходом являють собою антагоністичні антитіла; тобто зв'язування антитіл до І ЕРВ згідно з даним винаходом з ЕРА призводить до блокади або негативної регуляції передачі сигналу за допомогою лептинового рецептора в клітинах. Відповідно, згідно з різними варіантами здійснення антагоністичні антитіла згідно з даним винаходом проявляють слабку часткову агоністичну активність.

Навпаки, антитіла згідно з даним винаходом є застосовними, наприклад, для негативної регуляції біологічної активності лептину у суб'єкта. У зв'язку з цим, антитіла й антигензв'язуючі фрагменти згідно з даним винаходом є застосовними в терапевтичному лікуванні захворювань і порушень, асоційованих із підвищеною передачею сигналу лептину.

Антитіла згідно з даним винаходом можуть бути повнорозмірними (наприклад, антитіло да або Ід24) або можуть містити тільки антигензв'язуючу частину (наприклад, Бар, К(абр)2 або фрагмент 5еЕм) і можуть бути модифіковані, щоб вплинути на функціональність, наприклад, для усунення залишкових ефекторних функцій (Недау еї а!., 2000., У. Іттипої. 164:1925-1933).

Ілюстративні антагоністичні антитіла до ГЕРА згідно з даним винаходом наведені в таблицях 1 і 2 в даному документі. У таблиці 1 представлені ідентифікатори амінокислотної послідовності варіабельних областей важкого ланцюга (НСУР), варіабельних областей легкого ланцюга (СУМА), що визначають комплементарність областей важкого ланцюга (НСОНВІ1,

НОСОВ ї НСОВЗ) і визначають комплементарність областей легкого ланцюга (І СОН, І СОН? і

ЇСОВЗ) ілюстративних антагоністичних антитіл до І1ЕРА. У таблиці 2 представлені ідентифікатори послідовності нуклеїнової кислоти НСУВ, СУМА, НОСОВІ, НСОН2г, НСОВЗ,

ІЇСОВА1, 1 СОНВ82 і СОВЗ ілюстративних антагоністичних антитілдо І ЕРВ.

Даний винахід відноситься до антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, які специфічно зв'язуються з І ЕРЕ, що містять НСУРН, яка містить амінокислотну послідовність, що вибрана з 60 будь-якої з амінокислотних послідовностей НСУВ, перелічених у таблиці 1, або по суті схожою з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 96, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 9; ідентичності послідовності відносно них.

Даний винахід також відноситься до антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, які специфічно зв'язуються з І ЕРЕ, що містять І СУРН, яка містить амінокислотну послідовність, що вибрана з будь-якої з амінокислотних послідовностей І СУВ, перелічених у таблиці 1, або по суті схожої з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності відносно них.

Даний винахід також відноситься до антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, які специфічно зв'язуються з І ЕРВ, що містять пару амінокислотних послідовностей НСУВ і І СУВ (НСМА/Л СУ), яка містить будь-яку з амінокислотних послідовностей НСУРВ, перелічених у таблиці 1, що спарена з будь-якою з амінокислотних послідовностей І! СУВ, перелічених у таблиці 1. Згідно з певними варіантами здійснення даний винахід відноситься до антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, що містять пару амінокислотних послідовностей НСУВ/Л СУВ, яка міститься в межах будь-якого з ілюстративних антитіл до ГЕРВ, перелічених у таблиці 1.

Згідно з певними варіантами здійснення пара амінокислотних послідовностей НСУВ/Л СУ вибрана з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 2/10, 18/10, 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/10, 66/10 і 74/82.

Даний винахід також відноситься до антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, які специфічно зв'язуються з І! ЕРАФ, що містять СОВТ важкого ланцюга (НСОРВІ1), яка містить амінокислотну послідовність, що вибрана з будь-якої з амінокислотних послідовностей НСОНІ, перелічених у таблиці 1, або по суті схожої з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності.

Даний винахід також відноситься до антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, які специфічно зв'язуються з І! ЕРАФ, що містять СОВ2 важкого ланцюга (НСОВ2), яка містить амінокислотну послідовність, що вибрана з будь-якої з амінокислотних послідовностей НСОН2, перелічених у таблиці 1, або по суті схожої з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності.

Даний винахід також відноситься до антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, які специфічно зв'язуються з |! ЕРАФ, що містять СОВЗ важкого ланцюга (НСОВЗ), яка містить амінокислотну послідовність, що вибрана з будь-якої з амінокислотних послідовностей НСОНВЗ, перелічених у таблиці 1, або по суті схожої з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності.

Даний винахід також відноситься до антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, які специфічно зв'язуються з ЕРА, що містять СОВІ легкого ланцюга (СОВА), яка містить амінокислотну послідовність, що вибрана з будь-якої з амінокислотних послідовностей І СОН, перелічених у таблиці 1, або по суті схожої з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності.

Даний винахід також відноситься до антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, які специфічно зв'язуються з ЕРА, що містять СОНВ2 легкого ланцюга (ІСОВ2), яка містить амінокислотну послідовність, що вибрана з будь-якої з амінокислотних послідовностей І СОН, перелічених у таблиці 1, або по суті схожої з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності.

Даний винахід також відноситься до антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, які специфічно зв'язуються з ЕРА, що містять СОВЗ легкого ланцюга (ІСОВЗ3), яка містить амінокислотну послідовність, що вибрана з будь-якої з амінокислотних послідовностей І СОРВЗ, перелічених у таблиці 1, або по суті схожої з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності.

Даний винахід також відноситься до антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, які специфічно зв'язуються з ЕРА, що містять пару амінокислотних послідовностей НСОВЗ і бов!Зз (НСОВЗЛСОВЗ), яка містить будь-яку з амінокислотних послідовностей НСОВЗ, перелічених у таблиці 1, що спарена з будь-якою з амінокислотних послідовностей І СОРВЗ, перелічених у таблиці 1. Згідно з певними варіантами здійснення даний винахід відноситься до антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, що містять пару амінокислотних послідовностей 60 НОСОВЗ/ СОУ, яка міститься в межах будь-якого з ілюстративних антитіл до І ЕРВ, перелічених у таблиці 1. Згідно з певними варіантами здійснення, пара амінокислотних послідовностей

НСОВЗ/ СОВЗ вибрана з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 8/16, 24/16, 32/16, 40/16, 48/16, 56/16, 64/16, 72/16, 80/16 і 80/88.

Даний винахід також відноситься до антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, які специфічно зв'язуються з І ЕРВ, що містять набір з шести СОВ (тобто НСОВІ, НСОН2г, НСОНВЗ,

ІЇСОНВ1, 1 СОН і І СОН), який міститься в межах будь-якого з ілюстративних антитілдо ЕРВ, перелічених в таблиці 1. Згідно з певними варіантами здійснення набір амінокислотних послідовностей НСОВІ, НСОН2, НСОВЗ, 1СОВ1І, 1082 і ІСОАЗ вибраний з групи, що складається з 5ЕО ІЮО МО: 4, 6, 8, 12, 14, 16; 20, 22, 24, 12, 14, 16; 28, 30, 32, 12, 14, 16; 36, 38, 40, 12, 14, 16; 52, 54, 56, 12, 14, 16; 60, 62, 64, 12, 14, 16; 68, 70, 72, 12, 14, 16; і 76, 78, 80, 84, 86, 88.

Згідно зі схожим варіантом здійснення, даний винахід відноситься до антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, які специфічно зв'язуються з | ЕРВ, що містить набір з шести

СОВ (тобто НСОВІ, НСОВ2, НСОВЗ, І СОВІ1, І СОН і СО), який міститься в межах пари амінокислотних послідовностей НСУВ/! СУВ, як визначено будь-яким з ілюстративних антитіл до І ЕРЕ, перелічених у таблиці 1. Наприклад, згідно з даним винаходом передбачені антитіла або їх антигензв'язуючі фрагменти, які специфічно зв'язуються з ЕРА, що містять набір амінокислотних послідовностей НОСОВІ, НСОВ2, НСОВЗ, І СОВІ, 1С082 і ІСОВЗ, який міститься в межах пари амінокислотних послідовностей НСУВ/ЛСУВ, вибраної з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 2/10, 18/10, 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/10, 66/10 і 74/82. Способи та техніки ідентифікації СОВ в межах амінокислотних послідовностей НСМВ ії СМ добре відомі в даній галузі техніки і їх можна використовувати для ідентифікації СОВ в межах заданих амінокислотних послідовностей НСУВК і/або І СУВ, розкритих у даному документі. Ілюстративні угоди, які можна використовувати для ідентифікації меж СОВ, включають в себе, наприклад, визначення згідно з Кабвраї, визначення згідно з Споїйпіа і визначення АБМ. Загалом, визначення згідно з Кабаї базується на мінливості послідовності, визначення згідно з Споїніа базується на розташуванні областей структурної петлі, а визначення АБМ є компромісом між підходами Кабаї і Споїпіа. Див., наприклад, Кабраї, "Зедиепсев ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодіса! Іпієгеві", Маїопаї

ІпвіШйШшез ої Неапй, Веїпезаа, Ма. (1991); А!-І агікапі еї аї., у. Мої. Віої!. 273:927-948 (1997); і Мапіп

Зо еї аїЇ., Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА 56:9268-9272 (1989). Загальнодоступні бази даних також доступні для ідентифікації послідовностей СОК в межах антитіла.

Даний винахід також відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, що кодують антитіла до

Ї ЕРЕ або їх частини. Наприклад, даний винахід відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, що кодують будь-яку з амінокислотних послідовностей НСУВ, перелічених в таблиці 1; згідно з певними варіантами здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотидну послідовність, вибрану з будь-якої з послідовностей нуклеїнової кислоти НСУРН, перелічених у таблиці 2, або по суті схожої з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 95, щонайменше 9595, щонайменше 9895 або щонайменше 9995 ідентичністю послідовності відносно них.

Даний винахід також відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, що кодують будь-яку з амінокислотних послідовностей І! СУВ, перелічених в таблиці 1; згідно з певними варіантами здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотидну послідовність, вибрану з будь-якої з послідовностей нуклеїнової кислоти ЇСУВ, що перелічені в таблиці 2, або по суті схожої з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 9о, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичністю послідовності відносно них.

Даний винахід також відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, що кодують будь-яку з амінокислотних послідовностей НСОНІ, перелічених в таблиці 1; згідно з певними варіантами здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотидну послідовність, вибрану з будь-якої з послідовностей нуклеїнової кислоти НСОВІ, перелічених у таблиці 2, або по суті схожої з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 9о, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичністю послідовності відносно них.

Даний винахід також відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, що кодують будь-яку з амінокислотних послідовностей НСОН2, перелічених в таблиці 1; згідно з певними варіантами здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотидну послідовність, вибрану з будь-якої з послідовностей нуклеїнової кислоти НСОН2, перелічених у таблиці 2, або по суті схожої з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 9о, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичністю послідовності відносно них.

Даний винахід також відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, що кодують будь-яку з амінокислотних послідовностей НСОНВЗ, перелічених в таблиці 1; згідно з певними варіантами бо здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотидну послідовність, вибрану з будь-якої з послідовностей нуклеїнової кислоти НСОВЗ, перелічених у таблиці 2, або по суті схожої з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 9о, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичністю послідовності відносно них.

Даний винахід також відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, що кодують будь-яку з амінокислотних послідовностей І СОН, перелічених в таблиці 1; згідно з певними варіантами здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотидну послідовність, вибрану з будь-якої з послідовностей нуклеїнової кислоти І! СОВІ1, перелічених у таблиці 2, або по суті схожої з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 9о, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичністю послідовності відносно них.

Даний винахід також відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, що кодують будь-яку з амінокислотних послідовностей І СОН2, перелічених в таблиці 1; згідно з певними варіантами здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотидну послідовність, вибрану з будь-якої з послідовностей нуклеїнової кислоти !СОВ2, перелічених у таблиці 2, або по суті схожої з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 9о, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичністю послідовності відносно них.

Даний винахід також відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, що кодують будь-яку з амінокислотних послідовностей І! СОРВЗ, перелічених в таблиці 1; згідно з певними варіантами здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотидну послідовність, вибрану з будь-якої з послідовностей нуклеїнової кислоти І! СОВЗ, перелічених у таблиці 2, або по суті схожої з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 9о, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичністю послідовності відносно них.

Даний винахід також відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, що кодують НСМН, причому НСМУВ містить набір з трьох СОВ (тобто НСОВІ, НСОН2, НСОВЗ), причому набір амінокислотних послідовностей НСОВІ, НСОН2, НСОВЗ є таким, як визначено будь-яким з ілюстративних антитіл до ГЕРРЕ, перелічених у таблиці 1.

Даний винахід також відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, що кодують ІСУН, причому ЇСМА містить набір з трьох СОВА (тобто СОВІ, І СОН2, І СОВ3), причому набір амінокислотних послідовностей ЇСОВІ, 1082, 1СОНАЗ є таким, як визначено будь-яким з ілюстративних антитіл до І ЕРВ, перелічених у таблиці 1.

Даний винахід також відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, що кодують як НСМУН, так і Її СУМА, причому НСМЕ містить амінокислотну послідовність згідно з будь-якою з амінокислотних послідовностей НСУВ, перелічених в таблиці 1, і при цьому ЇСМА містить амінокислотну послідовність згідно з будь-якою з амінокислотних послідовностей І СУРН, перелічених у таблиці 1. Згідно з певними варіантами здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотидну послідовність, що вибрана з будь-якої з послідовностей нуклеїнової кислоти

НСМВ, перелічених у таблиці 2, або по суті схожа з ними послідовність, яка характеризується щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичністю послідовності відносно них, і полінуклеотидну послідовність, що вибрана з будь-якої з послідовностей нуклеїнової кислоти І СУРВ, перелічених у таблиці 2, або по суті схожої з ними послідовності, яка характеризується щонайменше 90 96, щонайменше 95 96, щонайменше 98 9о або щонайменше 99 95 ідентичністю послідовності відносно них. Згідно з певними варіантами здійснення, згідно з цим аспектом даного винаходу молекула нуклеїнової кислоти кодує НСМВ і

СМЕ, причому як НСМУРЕ, так і І СУВ походять з одного й того ж антитіла до І ЕРВ, переліченого в таблиці 1.

Даний винахід також відноситься до рекомбінантних експресійних векторів, здатних експресувати поліпептид, що містить варіабельну область важкого або легкого ланцюга антитіла до І ЕРЕ. Наприклад, згідно з даним винаходом передбачені рекомбінантні експресійні вектори, що містять будь-яку з молекул нуклеїнової кислоти, згаданих вище, тобто молекул нуклеїнової кислоти, що кодують будь-яку з послідовностей НСМА, СУА і/або СОР, як представлено в таблиці 1. Крім того, в межах обсягу винаходу передбачені клітини-хазяїни, в які були введені такі вектори, а також способи одержання антитіл або їх частин шляхом культивування клітин-хазяїнів за умов, які забезпечують одержання антитіл або фрагментів антитіл, і виділення антитіл і фрагментів антитіл, що одержані таким чином.

Згідно з іншим аспектом даний винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить рекомбінантне антитіло людини або його фрагмент, які специфічно зв'язуються з ГЕРВ, і фармацевтично прийнятний носій. Згідно зі схожим аспектом даний винахід відноситься до композиції, яка являє собою комбінацію антитіла до ГЕРВ ії другого терапевтичного засобу.

Згідно з одним варіантом здійснення другий терапевтичний засіб являє собою будь-який засіб, який сприятливо поєднується з антитілом до Г ЕРВ.

Згідно з ще одним аспектом, даний винахід відноситься до терапевтичних способів негативної регуляції або усунення передачі сигналу ГЕРВ з використанням антитіла до ЕРА або антигензв'язуючої частини антитіла згідно з даним винаходом. Терапевтичні способи згідно з цим аспектом даного винаходу передбачають введення терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить антитіло або антигензв'язуючий фрагмент антитіла згідно з даним винаходом, суб'єкту, який цього потребує. Передбачене для лікування порушення являє собою будь-яке захворювання або стан, який поліпшується, інтенсивність якого зменшується, пригнічується або запобігається за рахунок негативної регуляції або усунення передачі сигналу І ЕРЕ або блокування активності лептину.

Інші варіанти здійснення стануть очевидними з огляду подальшого докладного опису.

Стислий опис фігур

На фігурі 1 показана відсоткова зміна споживання їжі у мишей, які отримали лікування за допомогою 30 мг/кг антитіл до ЕРА Н4АНІ7322Р2, Н4і.НІ8457Р2 або Н4АНІ8464 або за допомогою ізотипового контрольного антитіла.

На фігурі 2 показана середня відсоткова зміна маси тіла мишей, які отримали лікування за допомогою 30 мг/кг антитіл до ЕРА Н4АНІ7322Р2, Н4іНІ8457Р2 або Н4АНІ8464 або за допомогою ізотипового контрольного антитіла.

На фігурі З показана середня маса жирової тканини мишей, які отримали лікування за допомогою 30 мг/кг антитіл до ЕРА Н4АНІ7322Р2, Н4іНІ8457Р2 або Н4АНІ8464 або за допомогою ізотипового контрольного антитіла.

Докладне розкриття даного винаходу

Перш ніж буде описаний даний винахід, слід розуміти, що даний винахід не обмежується конкретними способами й описаними експериментальними умовами, оскільки такі способи й умови можуть варіюватися. Також слід розуміти, що використовувана в даному документі термінологія призначена тільки для опису конкретних варіантів здійснення і не призначена для обмеження, оскільки обсяг даного винаходу буде обмежений лише формулою винаходу, що додається.

Якщо не зазначено інше, всі технічні та наукові терміни, що використовуються в даному документі, мають те ж значення, яке зазвичай мається на увазі фахівцем у даній галузі техніки, до якої відноситься даний винахід. Використовуваний в даному документі термін "приблизно" при використанні відносно конкретного наведеного числового значення означає, що значення може відрізнятися від наведеного значення не більше ніж на 1 95. Наприклад, використовуваний в даному документі вираз "приблизно 100" включає в себе 99 ії 101 їі всі значення між ними (наприклад, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 і т. д.).

Незважаючи на те, що будь-які способи та матеріали, що подібні або еквівалентні тим, які описані в даному документі, можна використовувати при практичному застосуванні або випробуванні даного винаходу, нижче описані переважні способи та матеріали. Всі згадані в даному описі патенти, заявки на видачу патенту та непатентні публікації повністю включені в даний документ за допомогою посилання.

Визначення

Вираз "лептиновий рецептор", що використовується в даному документі, "ГЕРВ" їі тому подібне відноситься до лептинового рецептора людини, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО: 89 (див. також ОпіРгоїкКВ/Зм/і55-Ргої, обліковий номер Р48357). Альтернативні назви для ЕРА, що використовуються в науковій літературі, включають в себе "ОВ-рецептор", "ОВ-В" і "бОр295". | ЕРА також називається "МУ5Х" (див., наприклад, патент США Мо 7524937). Вираз "ЕРА" включає в себе як мономерні, так і мультимерні (наприклад, димерні) молекули ЕРА. Вираз "мономерний ЕРА людини", що використовується в даному документі, означає білок І ЕРВ або його частину, які не містять або не мають будь-які домени мультимеризації та які існують при нормальних умовах у вигляді одиночної молекули ЕРА без прямого фізичного з'єднання з іншою молекулою ГЕРВ.

Ілюстративна мономерна молекула ЕРА являє собою молекулу, яка в даному документі називається "п ЕРА.ттиі", що містить амінокислотну послідовність згідно з 5ЕО 0 МО: 90 (див., наприклад, приклад З в даному документі). Вираз "димерний ЕРА людини", що використовується в даному документі, означає конструкт, який містить дві молекули ГЕРЕ, що з'єднані одна з однією за допомогою лінкера, ковалентного зв'язку, нековалентного зв'язку або за допомогою домену мультимеризації, такого як Ес-домен антитіла. Ілюстративна димерна молекула ГЕРЕ являє собою молекулу, яка в даному документі називається "ПІ ЕРА.тЕс", що містить амінокислотну послідовність згідно з 5ЕСО ІО МО: 91 (див., наприклад, приклад З у даному документі), або молекулу, яка в даному документі називається "НІ ЕРЕА.НЕс", що містить 60 амінокислотну послідовність згідно з 5ЕО ІЮ МО: 92. Використовувані в даному документі вирази, такі як "антитіло до І ЕРА", "антитіло, яке специфічно зв'язується з ЕРА", ""ЕРВ- специфічний зв'язуючий білок" і тому подібне, якщо спеціально не зазначене інше, відносяться до молекул, які зв'язуються з повнорозмірним ГЕРА людини, мономерним ЕРА людини, димерним ГЕРЕ людини або іншими конструктами, які містять позаклітинний домен ГЕРА або складаються з нього.

Мається на увазі, що всі посилання на білки, поліпептиди та білкові фрагменти в даному документі відносяться до версії відповідного білка, що відноситься до людини, поліпептиду або білкового фрагмента, якщо тільки явно не зазначено, що вони належать до виду, який не відноситься до людини. Таким чином, вираз "ЕРА" означає ГЕРЕ людини, якщо не зазначено, що він належить до виду, який не відноситься до людини, наприклад, "ЕРА миші", "ЕРА мавпи" і т. д.

Використовуваний в даному документі вираз "експресований на клітинній поверхні ГЕРВ" означає один або декілька білків (ЕРА або їх позаклітинний домен, які експресуються на поверхні клітини іп міго або іп мімо, так що щонайменше частина білка І ЕРЕ експонується на позаклітинній стороні клітинної мембрани і є доступною для антигензв'язуючої частини антитіла. "Експресований на клітинній поверхні ЕРА" може містити або складатися з білка І ЕРЕ, що експресується на поверхні клітини, яка за звичайних умов (наприклад, у нативному стані або стані дикого типу) експресує білок І ЕРВ. Альтернативно, "експресований на клітинній поверхні

ЕРВ" може містити або складатися з білка І ЕРВ, що експресується на поверхні клітини, яка за звичайних умов не експресує ГЕРЕ людини на своїй поверхні, але була штучно сконструйована, щоб експресувати І ЕРВ на своїй поверхні.

Використовувані в даному документі вирази, такі як "антитіло до І ЕРВ" або "антитіло, яке зв'язується з лептиновим рецептором людини", включають в себе як моновалентні антитіла з єдиною специфічністю, а також біспецифічні антитіла, що містять перше плече, яке зв'язується

ЗІ ЕРЕ, ї друге плече, яке зв'язується з другим (цільовим) антигеном, причому плече до ГЕРА містить будь-яку з послідовностей НСУВ/ СУК або СОР, як представлено в таблиці 1 у даному документі.

Використовуваний в даному документі термін "антитіло" означає будь-яку антигензв'язуючу молекулу або молекулярний комплекс, які містять щонайменше одну область (СОР), що

Зо визначає комплементарність, яка специфічно зв'язується або взаємодіє з конкретним антигеном (наприклад, ГЕРЕ). Термін "антитіло" включає в себе молекули імуноглобуліну, які містять чотири поліпептидні ланцюги, два важкі (Н) ланцюги та два легких (І) ланцюги, що з'єднані між собою дисульфідними зв'язками, а також їх мультимери (наприклад, ІМ). Кожний важкий ланцюг містить варіабельну область важкого ланцюга (яка скорочено в даному документі представлена як НСМА або Мн) і константну область важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга містить три домени, Сні, Снаг і Сн3. Кожний легкий ланцюг містить варіабельну область легкого ланцюга (яка скорочено в даному документі представлена як І СУА або Мі) і константну область легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга містить один домен (Сі1). Області Мн і Мі можна додатково підрозділити на області гіперваріабельності, які називаються областями (СОВ), що визначають комплементарність, які чергуються з областями, які є більше консервативними, які називаються каркасними областями (ЕВ). Кожна Мн і М. складається з трьох СОВ і чотирьох ЕВ, розташованих від аміно-кінця до карбокси-кінця в наступному порядку: ЕВІ, СОВІ, ЕН2, СОВ2, ЕВЗ, СОВЗ, ЕВ4. Згідно з різними варіантами здійснення даного винаходу ЕЕ антитіла до І ЕРВ (або його антигензв'язуючої частини) можуть бути ідентичними послідовностям зародкової лінії людини або можуть бути природно або синтетично модифікованими. Амінокислотну консенсусну послідовність можна визначити на основі паралельного аналізу двох або більше СОВ.

Використовуваний в даному документі термін "антитіло" також включає в себе антигензв'язуючі фрагменти повних молекул антитіла. Використовувані в даному документі терміни "антигензв'язуюча частина" антитіла, "антигензв'язуючий фрагмент" антитіла та тому подібне включають в себе будь-який поліпептид або глікопротеїн, що зустрічається в природі, одержаний ферментативно, синтетичний або генетично сконструйований, який специфічно зв'язується з антигеном з утворенням комплексу. Антигензв'язуючі фрагменти антитіла можна одержати, наприклад, з повних молекул антитіла з використанням будь-яких підходящих стандартних технік, таких як протеолітичне розщеплення або рекомбінантні техніки генної інженерії, що передбачають маніпуляції з ДНК і експресію ДНК, яка кодує варіабельні та необов'язково константні домени антитіла. Така ДНК відома та/або легко доступна, наприклад, з комерційних джерел, бібліотек ДНК (включаючи в себе, наприклад, фагові бібліотеки антитіл), або ж її можна синтезувати. ДНК можна секвенувати та впливати на неї хімічно або з 60 використанням технік молекулярної біології, наприклад, для розташування одного або декількох варіабельних і/або константних доменів в підходящу конфігурацію або для введення кодонів, створення цистеїнових залишків, модифікації, додавання або видалення амінокислот і т. д.

Необмежуючі приклади антигензв'язуючих фрагментів включають в себе наступне: (і) фрагменти Раб; (ії) фрагменти Е (аб)2; (ії) фрагменти Га; (м) фрагменти Ем; (м) одноланцюгові молекули Ем (5сЕм); (мі) фрагменти АБ; і (мії) мінімальні розпізнавальні ланки, що складаються з амінокислотних залишків, які імітують гіперваріабельну область антитіла (наприклад, виділена область (СОР), що визначає комплементарність, така як пептид СОВЗ) або пептид з обмеженою конформаційною свободою ЕНЗ-СОНВЗ-ЕН4. Інші сконструйовані молекули, такі як домен- специфічні антитіла, однодоменні антитіла, антитіла з видаленими доменами, химерні антитіла,

СОВ-привиті антитіла, діатіла, триатіла, тетратіла, мініантитіла, наноантитіла (наприклад моновалентні наноантитіла, бівалентні наноантитіла і т. д.), імунофармацевтичні засоби на основі модульного білка малого розміру (ЗМІР) і варіабельні домени ІЯМАВ акули, що також передбачені використовуваним у даному документі виразом "антигензв'язуючий фрагмент".

Антигензв'язуючий фрагмент антитіла, як правило, буде містити щонайменше один варіабельний домен. Варіабельний домен може характеризуватися будь-яким розміром або амінокислотним складом і, як правило, буде містити щонайменше одну СОВ, яка є суміжною або розташована в одній рамці зчитування з однією або декількома каркасними послідовностями. В антигензв'язуючих фрагментах, що містять домен Мн, асоційований з доменом Мі, домени Мн і Мі можуть бути розташовані відносно один одного в будь-якому підходящому розташуванні. Наприклад, варіабельна область може бути димерною та може містити димери Мн-Мн, Мн-Мі або Мі-Мі. Альтернативно, антигензв'язуючий фрагмент антитіла може містити мономірний домен Мн або Мі.

Згідно з певними варіантами здійснення антигензв'язуючий фрагмент антитіла може містити щонайменше один варіабельний домен, що ковалентно зв'язаний щонайменше з одним константним доменом. Необмежуючі, ілюстративні конфігурації варіабельних і константних доменів, які можна виявити в межах антигензв'язуючого фрагмента антитіла згідно з даним винаходом, включають в себе наступне: (ї) Мн-Сні1; (ії) Мн-Сне; (іїї) Мн-СнЗ; (ім) Мн-Сні-Сне; (м) Мн-

Сні-Сн2г-Сна; (мі) Мн-Сн2-Сна; (мії) Мн-Сі; (мії) Мі-Сні; (їх) Мі-Сне; (х) Мі-Сн3з; (хі) Мі-Сн1-Сне; (хії)

Мі-Сн1-Сн2г-СнЗ; (хіїї) Мі-Сн2г-СнЗ і (хім) Мі-Сі. У будь-якій конфігурації варіабельних і константних

Зо доменів, включаючи в себе будь-яку з ілюстративних конфігурацій, що перелічені вище, варіабельні та константні домени можуть бути або безпосередньо зв'язані один з одним, або можуть бути зв'язані за допомогою повної або часткової шарнірної або лінкерної області.

Шарнірна область може складатися щонайменше з 2 (наприклад, 5, 10, 15, 20, 40, 60 або більше) амінокислот, що дає в результаті гнучке або напівгнучке з'єднання між суміжними варіабельними та/або константними доменами в одній поліпептидній молекулі. Більш того, антигензв'язуючий фрагмент антитіла згідно з даним винаходом може містити гомодимер або гетеродимер (або інший мультимер) будь-якій з конфігурацій варіабельних і константних доменів, перелічених вище, у нековалентній асоціації один з одним і/або з одним або декількома мономерними доменами Мн або Мі (наприклад, за допомогою дисульфідного(их) зв'язку(їв)).

Як і у випадку з повними молекулами антитіла, антигензв'язуючі фрагменти можуть бути моноспецифічними або мультиспецифічними (наприклад, біспецифічними). Мультиспецифічний антигензв'язуючий фрагмент антитіла, як правило, буде містити щонайменше два різних варіабельних домени, причому кожний варіабельний домен здатний специфічно зв'язуватися з окремим антигеном або з різним епітопом на одному й тому ж антигені. Будь-який формат мультиспецифічних антитіл, включаючи в себе ілюстративні формати біспецифічних антитіл, що розкриті в даному документі можна адаптувати для застосування в контексті антигензв'язуючого фрагмента антитіла згідно з даним винаходом з використанням стандартних технік, доступних у даній галузі техніки.

Згідно з певними варіантами здійснення даного винаходу антитіла до ГЕРЕ згідно з даним винаходом являють собою антитіла людини. Мається на увазі, що використовуваний в даному документі термін "антитіло людини" включає в себе антитіла з варіабельними та константними областями, що походять з послідовностей імуноглобуліну зародкової лінії людини. Антитіла людини згідно з даним винаходом можуть включати в себе амінокислотні залишки, які не кодуються послідовностями імуноглобуліну зародкової лінії людини (наприклад, мутації, що введені за допомогою випадкового або сайт-специфічного мутагенезу іп мйго або соматичної мутації іп мімо) наприклад, в СОВ і зокрема СОНВЗ. Проте, мається на увазі, що використовуваний в даному документі термін "антитіло людини" не включає в себе антитіла, в яких послідовності СОВ, що походять із зародкової лінії іншого виду ссавців, такого як миша, бо були привиті на каркасні послідовності людини.

Згідно з деякими варіантами здійснення антитіла згідно з даним винаходом можуть являти собою рекомбінантні антитіла людини. Мається на увазі, що використовуваний в даному документі термін "рекомбінантне антитіло людини" включає в себе всі антитіла людини, які одержують, експресують, створюють або виділяють за допомогою рекомбінантних способів, такі як антитіла, що експресовані із застосуванням рекомбінантного експресійного вектора, який трансфікований в клітину-хазяїна (описано додатково нижче), антитіла, що виділені з рекомбінантної, комбінаторної бібліотеки антитіл людини (описано додатково нижче), антитіла, що виділені з організму тварини (наприклад, миші), яка є трансгенною відносно генів імуноглобуліну людини (див., наприклад, Тауїог єї аї!. (1992) Мисі. Асідз Вев. 20:6287-6295) або антитіла, що одержані, експресовані, створені або виділені за допомогою будь-яких інших засобів, які включають в себе сплайсинг послідовностей генів імуноглобуліну людини з іншими послідовностями ДНК. Такі рекомбінантні антитіла людини містять варіабельні та константні області, що походять з послідовності імуноглобуліну зародкової лінії людини. Проте, згідно з певними варіантами здійснення такі рекомбінантні антитіла людини піддають іп міго мутагенезу (або, якщо використовують тварину, яка є трансгенною відносно послідовностей Ід людини, іп мімо соматичному мутагенезу) і, таким чином, амінокислотні послідовності областей Мн і М рекомбінантних антитіл являють собою послідовності, які, поряд з тим, що вони походять з послідовностей Мн і Мі зародкової лінії людини та відносяться до послідовностей Мн і Мі зародкової лінії людини, можуть не існувати в природі в межах репертуару антитіл зародкової лінії людини іп мімо.

Даний винахід відноситься до антитіл з однією або декількома мутаціями в шарнірній області, області Сн2 або Сн3, які можуть бути бажаними, наприклад, при одержанні, для поліпшення виходу потрібної форми антитіл.

Антитіла згідно з даним винаходом можуть являти собою виділені антитіла.

Використовуваний в даному документі термін "виділене антитіло" означає антитіло, яке ідентифікували та відокремили та/або витягли щонайменше з одного компонента його природного оточення. Наприклад, антитіло, яке відокремили або видалили щонайменше з одного компонента організму або з тканини або клітини, в яких антитіло існує в природі або виробляється в природі, являє собою "виділене антитіло" для цілей даного винаходу.

Виділене антитіло також включає в себе антитіло іп 5іш в рекомбінантній клітині. Виділені антитіла являють собою антитіла, що піддані щонайменше одній стадії очищення або виділення. Згідно з певними варіантами здійснення виділене антитіло може по суті не містити інший клітинний матеріал і/або хімічні сполуки.

Згідно з даним винаходом передбачені варіанти антитіл до ЕРА, розкритих в даному документі, що містять одну або декілька амінокислотних замін, вставок і/або делецій в каркасні області та/"або області СОВА варіабельних доменів важкого та легкого ланцюгів у порівнянні з відповідними послідовностями зародкової лінії, з яких походять антитіла. Такі мутації можна легко встановити шляхом порівняння амінокислотних послідовностей, розкритих у даному документі, з послідовностями зародкової лінії, що доступні, наприклад, із загальнодоступних баз даних послідовностей антитіл. Згідно з даним винаходом, передбачені антитіла та їх антигензв'язуючі фрагменти, які походять з будь-якої з амінокислотних послідовностей, розкритих у даному документі, причому одна або декілька амінокислот в межах одної або декількох каркасних областей і/або областей СОВ мутовані на відповідний(ї) залишок(залишки) послідовності зародкової лінії, з якої походить антитіло, або на відповідний(ї) залишок(залишки) іншої послідовності зародкової лінії людини або на консервативну амінокислотну заміну відповідного(их) залишку(ів) зародкової лінії (такі зміни послідовності узагальнено в даному документі називаються "мутації зародкової лінії"). Середній фахівець у даній галузі техніки, починаючи з послідовностей варіабельних областей важкого та легкого ланцюгів, розкритих у даному документі, може легко одержати різні антитіла і антигензв'язуючі фрагменти, які містять одну або декілька окремих мутацій зародкової лінії або їх комбінації. Згідно з певними варіантами здійснення всі залишки каркасної області та/або області СОВ в межах доменів Мн мМабо Мі піддають зворотній мутації до залишків, що зустрічаються у вихідній послідовності зародкової лінії, з якої походить антитіло. Згідно з іншими варіантами здійснення тільки певні залишки піддають зворотній мутації до вихідної послідовності зародкової лінії, наприклад, тільки мутовані залишки, що зустрічаються в межах перших 8 амінокислот ЕН1 або в межах останніх 8 амінокислот ЕВ4, або тільки мутовані залишки, що зустрічаються в межах СОВІ, СОВ2 або

СОВЗ. Згідно з іншими варіантами здійснення, один або декілька залишків каркасної області та/лабо області СОВА піддають мутації на відповідний() залишок(залишки) послідовності зародкової лінії, яка відрізняється, (тобто послідовності зародкової лінії, яка відрізняється від 60 послідовності зародкової лінії, з якої антитіло походить від самого початку). Більше того,

антитіла згідно з даним винаходом можуть містити будь-яку комбінацію з двох або більше мутацій зародкової лінії в межах каркасних областей і/або областей СОВ, наприклад, причому певні індивідуальні залишки мутовані на відповідний залишок конкретної послідовності зародкової лінії, при цьому інші певні залишки, які відрізняються від вихідної послідовності зародкової лінії зберігаються або піддаються мутації на відповідний залишок послідовності зародкової лінії, яка відрізняється. Після одержання антитіла й антигензв'язуючі фрагменти, які містять одну або декілька мутацій зародкової лінії, можна легко випробувати відносно однієї або декількох потрібних властивостей, таких як поліпшена специфічність зв'язування, збільшена афінність зв'язування, поліпшені або посилені антагоністичні або агоністичні біологічні властивості (в залежності від конкретної ситуації), знижена імуногенність і т. д. Антитіла і антигензв'язуючі фрагменти, що одержані цим загальним способом, передбачені даним винаходом.

Згідно з даним винаходом також передбачені антитіла до І ЕРВ, які містять варіанти будь- якої з амінокислотних послідовностей НСУН, І СМВ і/або СОВ, розкритих у даному документі, з однією або декількома консервативними замінами. Наприклад, згідно з даним винаходом передбачені антитіла до ЕРА з амінокислотними послідовностями НСМУН, І СУМА і/або СОВ, наприклад, з 10 або менше, 8 або менше, 6 або менше, 4 або менше і т. д. консервативними амінокислотними замінами відносно до будь-якої з набору амінокислотних послідовностей

НСМВ, ІСМВ і/або СОВ, представленого в таблиці 1 в даному документі. Згідно з певними варіантами здійснення даний винахід відноситься до антитіл до І ЕРРЕ, які містять варіантні амінокислотні послідовності НСУВ, І СМА і/або СОК відносно до послідовностей, представлених у таблиці 1 у даному документі (наприклад, що містять консервативні амінокислотні заміни), причому такі варіантні антитіла, проте, проявляють одну або декілька функцій і/або властивостей ілюстративних антитіл до ГЕРЕ, розкритих у даному документі.

Термін "епітоп" відноситься до антигенної детермінанти, яка взаємодіє зі специфічним сайтом зв'язування з антигеном у варіабельній області молекули антитіла, відомої як паратоп.

Окремий антиген може містити більше одного епітопу. Таким чином, різні антитіла можуть зв'язуватися з різними областями на антигені та можуть характеризуватися різними біологічними ефектами. Епітопи можуть бути або конформаційними, або лінійними.

Зо Конформаційний епітоп утворений просторово суміжними амінокислотами з різних сегментів нерозгалуженого поліпептидного ланцюга. Лінійний епітоп утворений суміжними амінокислотними залишками в поліпептидному ланцюгу. У певних випадках епітоп може включати в себе фрагменти сахаридів, фосфорильовані групи або сульфонільні групи на антигені.

Згідно з даним винаходом передбачені антитіла до І ЕРЕ і їх антигензв'язуючі фрагменти, які містять амінокислотні послідовності, які є по суті схожими або по суті ідентичними одній або декільком амінокислотним послідовностям варіабельного домену або СОН, що зустрічаються в будь-якому з ілюстративних антитіл до І ЕРЕ, розкритих у даному документі.

Застосовно до поліпептидів термін "суттєва схожість" або "по суті схожі" означає, що дві пептидні послідовності, при оптимальному вирівнюванні, наприклад, за допомогою програм

САР або ВЕБТРІТ з використанням штрафів за введення пропусків за замовчуванням, характеризуються щонайменше 95 95 ідентичністю послідовностей, навіть більше переважно щонайменше 98 95 або 99 95 ідентичністю послідовностей. Переважно положення залишків, які не є ідентичними, відрізняються консервативними амінокислотними замінами. "Консервативна амінокислотна заміна" являє собою заміну, в якій амінокислотний залишок заміщений іншим амінокислотним залишком, що містить бічний ланцюг (групу НА) зі схожими хімічними властивостями (наприклад, зарядом або гідрофобністю). Як правило, консервативна амінокислотна заміна по суті не буде змінювати функціональні властивості білка. У випадках, де дві або більше амінокислотних послідовностей відрізняються одна від одної консервативними замінами, ідентичність послідовностей у відсотках або ступінь схожості у відсотках можна скоригувати в сторону збільшення, щоб скоригувати консервативну природу заміни. Засоби для здійснення цього регулювання добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Див., наприклад,

Реагзоп (1994) Меїподз Мої. ВіоІ. 24: 307-331, що включений в даний документ за допомогою посилання. Приклади груп амінокислот, які містять бічні ланцюги зі схожими хімічними властивостями, включають в себе (1) аліфатичні бічні ланцюги: гліцин, аланін, валін, лейцин та ізолейцин; (2) аліфатично-гідроксильні бічні ланцюги: серин і треонін; (3) амідвмісні бічні ланцюги: аспарагін і глутамін; (4) ароматичні бічні ланцюги: фенілаланін, тирозин і триптофан; (5) основні бічні ланцюги: лізин, аргінін і гістидин; (б) кислотні бічні ланцюги: аспартат і глутамат, і (7) сірковмісні бічні ланцюги: цистеїн і метіонін. Переважними групами консервативних бо амінокислотних замін є наступні: валін-лейцин-ізолейцин, фенілаланін-тирозин, лізин-аргінін,

аланін-валін, глутамат-аспартат і аспарагін-глутамін. Альтернативно, консервативною заміною є будь-яка зміна, яка характеризується позитивним значенням у матриці логарифмічної правдоподібності РАМ250, що розкрита в Сюппеї єї а). (1992) Зсієпсе 256: 1443-1445, що включений в даний документ за допомогою посилання. "Помірно консервативна" заміна являє собою будь-яку зміну, що характеризується ненегативним значенням у логарифмічній матриці правдоподібності РАМ250.

Схожість послідовностей для поліпептидів, яку також називають ідентичністю послідовностей, як правило, вимірюють з використанням програмного забезпечення для аналізу послідовностей. Програмне забезпечення для аналізу білка зіставляє схожі послідовності з використанням показників схожості, присвоєних різним замінам, делеціям й іншим модифікаціям, включаючи в себе консервативні амінокислотні заміни. Наприклад, програмне забезпечення (2001 містить програми, такі як Сар і Везійї, які можна використовувати з параметрами за замовчуванням для визначення гомології послідовностей або ідентичності послідовностей між близько спорідненими поліпептидами, такими як гомологічні поліпептиди з різних видів організмів або між білком дикого типу і його мутеїном. Див., наприклад, СС версії 6.1. Поліпептидні послідовності також можна порівняти з використанням БЕАБбБТА з використанням параметрів за замовчуванням або рекомендованих параметрів, програма в СО версії 6.1. ЕАБТА (наприклад, ЕА5ТА?2 і ЕАБТАЗ) забезпечує вирівнювання й ідентичність послідовностей у відсотках областей найкращого перекриття між запитуваною послідовністю та послідовностями пошуку (Реагзоп (2000) раніше). Іншим переважним алгоритмом при порівнянні послідовності згідно з даним винаходом з базою даних, що містить велику кількість послідовностей з різних організмів, є комп'ютерна програма ВІ А5Т, особливо ВІ АЗТР або

ТВІА5ТМ, з використанням параметрів за замовчуванням. Дивись, наприклад, Аїйвеспи! еї аї. (1990) 9. Мої. Віої. 215: 403-410 і Анбспиї еї аї. (1997) Мисівїс Асіа5 Нез. 25: 3389-402, кожна з яких включена в даний документ за допомогою посилання.

Антитіла до І ЕРА, що містять Ес-варіанти

Згідно з певними варіантами здійснення даного винаходу передбачені антитіла до І ЕРВ, що містять Ес-домен, містять одну або декілька мутацій, які підсилюють або зменшують зв'язування антитіла з рецептором ЕсНп, наприклад, при кислому значенні рН в порівнянні з нейтральним значенням рН. Наприклад, згідно з даним винаходом передбачені антитіла до І ЕРЕ, що містять мутацію в області Сн2 або Сн3 Ес-домену, причому мутація(ї) збільшує(ють) афінність Ес- домену відносно до ЕсАп у кислому середовищі (наприклад, в ендосомі, де рН знаходиться в діапазоні від приблизно 5,5 до приблизно 6,0). Такі мутації можуть призводити до збільшення періоду напівжиття антитіла в сироватці при введенні тварині. Необмежуючі приклади таких Ес- модифікацій включають в себе, наприклад, наступне: модифікація в положенні 250 (наприклад,

Е або 0); 250 і 428 (наприклад, І або ЕР); 252 (наприклад, І /У/Е/ЛМ або Т), 254 (наприклад, 5 або

Т) і 256 (наприклад, 5/В/0/Е/О або Т); або модифікація в положенні 428 і/або 433 (наприклад,

НЛ/В/Б/Р/О або К) і/або 434 (наприклад, Н/Е або У); або модифікація в положенні 250 і/або 428; або модифікація в положенні 307 або 308 (наприклад, ЗО8Е, МЗО8Е) і 434. Згідно з одним варіантом здійснення модифікація містить наступне: модифікація 4281 (наприклад, М4281) і 4345 (наприклад М4345); модифікація 4281, 2591 (наприклад, М2591) і ЗО8Е (наприклад, УЗОВ8Е); модифікація 433К (наприклад, Н4АЗЗК) і 434 (наприклад, 434У); модифікація 252, 254 і 256 (наприклад, 252У, 2541 і 256Е); модифікація 2500 і 428 (наприклад, Т2500 і М4281); і модифікація 307 і/або 308 (наприклад, ЗО8Е або ЗО8Р).

Наприклад, згідно з даним винаходом передбачені антитіла до І ЕРВ, що містять Ес-домен, який містить одну або декілька пар або груп мутацій, вибраних з групи, що складається з: 2500) і 2481 (наприклад, Т2500 і М2481); 252У, 2541 і 256Е (наприклад, М252У, 52541 і Т256Е); 4281 і 4345 (наприклад, М428І і М4345); ії 433К ї 434Е (наприклад, Н4ЗЗК ії М434Р). Всі можливі комбінації наведених вище мутацій ЕРс-домену й інші мутації в межах варіабельних доменів антитіла, що розкриті в даному документі, передбачені обсягом даного винаходу.

Антитіла до ГЕРЕ згідно з даним винаходом можуть містити модифікований Ес-домен зі зниженою ефекторною функцією. Використовуваний в даному документі термін "модифікований

Ес-домен зі зниженою ефекторною функцією" означає будь-яку Ес-частину імуноглобуліну, яку піддали модифікації, мутації, усіченню та т. д. відносно до Ес-домену дикого типу, що зустрічається в природі, так, щоб молекула, яка містить модифікований Ес, проявляла зниження тяжкості або ступеня щонайменше одного ефекту, вибраного з групи, що складається з наступного: знищення клітин (наприклад, АОСС і/або СОС), активація комплементу, фагоцитоз і опсонизація, відносно до молекули порівняння, що містить версію Ес-частини дикого типу, яка зустрічається в природі. Згідно з визначеними варіантами здійснення "модифікований Ес-домен зі зниженою ефекторною функцією" являє собою Ес-домен зі зниженим або ослабленим зв'язуванням з Ес-рецептором (наприклад, Есуй).

Згідно з визначеними варіантами здійснення даного винаходу модифікований Ес-домен являє собою варіантний Ес ІдС1 або варіантний Ес Ідс4, що містить заміну в шарнірній області.

Наприклад, модифікований Ес для застосування в контексті даного винаходу може містити варіантний Ес Ід021, в якому щонайменше одна амінокислота шарнірної області Ес Ідс1 замінена відповідною амінокислотою з шарнірної області с /1/д(2. Альтернативно, модифікований Ес для застосування в контексті даного винаходу може містити варіантний Ес

Ід4с24, в якому щонайменше одна амінокислота шарнірної області Ес Ідс4 замінена відповідною амінокислотою з шарнірної області Ес Ід22. Необмежуючі, ілюстративні модифіковані Ес- області, які можна використовувати в контексті даного винаходу, представлені в публікації заявки на видачу патенту США Ме 2014/0243504, повне розкриття якої включено в даний документ за допомогою посилання, а також будь-які функціонально еквівалентні варіанти модифікованих Ес-областей, представлених в ній.

Інші модифіковані Рсо-домени та Ес-модифікації, які можна використовувати в контексті даного винаходу, включають в себе будь-яку з модифікацій, представлених у заявці на видачу патенту США Мо 05 2014/0171623; патенті США Мо 5 8697396; заявці на видачу патенту США

Мо 05 2014/0134162; міжнародній патентній публікації Мо МО 2014/043361, повне розкриття яких включено в даний документ за допомогою посилання. Способи конструювання антитіл або інших антигензв'язуючих злитих білків, що містять модифікований Ес-домен, як описано в даному документі, відомі в даній галузі техніки.

Біологічні характеристики антитіл

Згідно з даним винаходом передбачені антитіла і їх антигензв'язуючі фрагменти, які зв'язуються з | ЕРА людини та проявляють антагонізм відносно передачі сигналу ГЕРЕ. Такі антитіла можуть в даному документі називатися "антагоністичні антитіла". У контексті даного винаходу "антагоніст передачі сигналу ЕРА" означає антитіло або його фрагмент, які зв'язуються з І ЕРЕ та інгібують внутрішньоклітинний ефект, який при нормальних умовах є результатом взаємодії лептину з ЕРА в клітинах, які експресують І! ЕРА. Згідно з різними варіантами здійснення антагоністичні антитіла згідно з даним винаходом інгібують функцію

Зо агоністів І ЕРЕ і/або функцію часткових агоністів ГЕРЕ. Згідно з певними варіантами здійснення, "антагоністична дія відносно передачі сигналу І ЕРВ" означає інгібування стимульованої лептином транскрипційної активації «ТАТЗ3, що можна виявити з використанням будь-якого способу, який може вимірювати або ідентифікувати, безпосередньо або опосередковано, активність ЗТАТЗ, наприклад, з використанням міченої версії 5ТАТЗ, експресованої в репортерній клітинній лінії. Наприклад, згідно з даним винаходом передбачені антагоністичні антитіла та їх антигензв'язуючі фрагменти, які негативно регулюють передачу сигналу ГЕРВ в клітинному аналізі з використанням репортерних генів, як описано в прикладі 6, або по суті схожому аналізі. Згідно з даним винаходом також передбачені антагоністичні антитіла і їх антигензв'язуючі фрагменти, які демонструють повне інгібування індукованої лептином передачі сигналу ГЕРБ зі значеннями ІСбзо в діапазоні від 723 пМ до 1,8 нМ в аналізі згідно з прикладом 6 або по суті аналогічному аналізі. Клітинні аналізи зв'язування, які виявляють зв'язування антитіл з клітинами, які експресують ГЕРРВ, такі як аналіз, що описаний в прикладі 5 в даному документі, продемонстрували зв'язування з клітинами НЕК29З/1ЕРВ-СРІ з відношеннями зв'язування, які в 824-3187 разів відрізнялося від значення без лептину та в 398-3106 разів відрізнялося від значення в присутності 1 мкМ лептину. Виявлено, що антитіла згідно 3 даним винаходом зв'язуються з І ЕРЕ навіть в присутності надлишку лептину в концентрації 1 мкМ, що вказує на те, що антитіла до ГЕРВ згідно з даним винаходом зв'язуються з сайтами на ПЕРЕ, які не перекриваються з сайтами зв'язування лептину. Згідно з даним винаходом також передбачені антитіла до ГЕРЕ, які проявляють антагонізм відносно передачі сигналу лептину, але також стимулюють часткову передачу сигналу ГЕРА за відсутності лептину; такі антитіла також у даному документі називаються "часткові агоністи" або "антитіла, які виявляють агонізм відносно передачі сигналу ГЕРВ".

Згідно з певними ілюстративними варіантами здійснення даного винаходу передбачені антитіла до ГЕРЕ, які зв'язуються з димерним ЕРА людини (ПІ ЕРВА.пЕс, 5ЕО І МО: 92) в присутності та за відсутності лептину, при цьому жодне з антитіл згідно з даним винаходом не продемонструвало більше ніж 4095 блокаду взаємодії ЕРА: лептин, наприклад, з використанням формату аналізу, як визначено в прикладі 4 в даному документі, або по суті схожого аналізу.

Згідно з даним винаходом передбачені антитіла і їх антигензв'язуючі фрагменти, які 60 зв'язуються з мономірним ЕРА людини з високою афінністю. Наприклад, згідно з даним винаходом передбачені антитіла до ІЕРЕ, які зв'язуються з мономірним ГЕРА людини (наприклад, ННЕРА.ттий, ЗЕО ІЮ МО: 90) зі значенням Ко, що становить менше ніж приблизно 10 нМ, як виміряно за допомогою поверхневого плазмонного аналізу при 25 "С, або менше ніж приблизно 25 нМ, як виміряно за допомогою поверхневого плазмонного аналізу при 37 "С, наприклад, з використанням формату аналізу, як визначено в прикладі З в даному документі, або по суті схожого аналізу. Згідно з певними варіантами здійснення передбачені антитіла до

ГЕРЕ, які зв'язуються з мономерним ЕРА людини при 25 "С зі значенням Ко, що становить менше ніж приблизно 12 нМ, менше ніж приблизно 11 нМ, менше ніж приблизно 10 нМ, менше ніж приблизно 9 нМ, менше ніж приблизно 8 нМ, менше ніж приблизно 7 нМ, менше ніж приблизно 6 нМ, менше ніж приблизно 5 нМ, менше ніж приблизно 4 нМ, менше ніж приблизно З

НМ, менше ніж приблизно 2 нМ, менше ніж приблизно 1 нМ, менше ніж приблизно 900 пМ, менше ніж приблизно 800 пМ, менше ніж приблизно 700 пМ, менше ніж приблизно 600 пМ, менше ніж приблизно 500 пМ, менше ніж приблизно 400 пМ, менше ніж приблизно 300 пМ, менше ніж приблизно 200 пМ або менше ніж приблизно 100 пМ, як виміряно за допомогою поверхневого плазмонного аналізу, наприклад, з використанням формату аналізу, як визначено в прикладі З в даному документі, або по суті схожого аналізу.

Згідно з даним винаходом передбачені антитіла і їх антигензв'язуючі фрагменти, які зв'язуються з мономерним ГЕРВ людини (наприклад, ПНІ ЕРА.ттий, 5ЕО ІО МО: 90) зі значенням дисоціативного періоду напівжиття (12), що становить більше ніж приблизно 5 хвилин, як виміряно за допомогою поверхневого плазмонного аналізу при 25 "С, або більше ніж приблизно 1 хвилина, як виміряно за допомогою поверхневого плазмонного аналізу при 37 "С, наприклад, з використанням формату аналізу, як визначено в прикладі З в даному документі, або по суті схожого аналізу. Згідно з певними варіантами здійснення передбачені антитіла до ГЕРРЕ, які зв'язуються з мономерним ГЕРВА людини при 25 "С зі значенням Її, що становить більше ніж приблизно 5 хвилин, більше ніж приблизно 10 хвилин, більше ніж приблизно 20 хвилин, більше ніж приблизно 40 хвилин, більше ніж приблизно 50 хвилин або довше, як виміряно за допомогою поверхневого плазмонного аналізу, наприклад, з використанням формату аналізу, як визначено в прикладі З в даному документі, або по суті схожого аналізу.

Згідно з даним винаходом також передбачені антитіла і їх антигензв'язуючі фрагменти, які

Зо зв'язуються з димерним ЕРА людини (наприклад, ПЕРА.тЕс, 5ЕО І МО: 91) з високою афінністю. Наприклад, згідно з даним винаходом передбачені антитіла до ГЕРЕ, які зв'язуються з димерним ЕРА людини (наприклад, ПІ ЕРА.тЕс, 5ЕО ІЮ МО: 91) зі значенням Ко, що становить менше ніж приблизно 4 нМ, як виміряно за допомогою поверхневого плазмонного аналізу при 25 С або 37 "С, наприклад, з використанням формату аналізу, як визначено в прикладі З в даному документі, або по суті схожого аналізу. Згідно з певними варіантами здійснення передбачені антитіла до І ЕРЕ, які зв'язуються з димерним І ЕРА людини при 25 С зі значенням Ко, що становить менше ніж приблизно 15 НМ, менше ніж приблизно 10 нМ, менше ніж приблизно 9,0 нМ, менше ніж приблизно 8,0 нМ, менше ніж приблизно 7,0 нМ, менше ніж приблизно 6,0 нМ, менше ніж приблизно 5,0 нМ, менше ніж приблизно 4,0 нМ, менше ніж приблизно 3,0 нМ, менше ніж приблизно 2,0 нМ, менше ніж приблизно 1,0 нМ, менше ніж приблизно 900 пМ, менше ніж приблизно 800 пМ, менше ніж приблизно 700 пМ, менше ніж приблизно 600 пМ, менше ніж приблизно 500 пМ, менше ніж приблизно 400 пМ, менше ніж приблизно 300 пМ, менше ніж приблизно 200 пМ або менше ніж приблизно 100 пМ, як виміряно за допомогою поверхневого плазмонного аналізу, наприклад, з використанням формату аналізу, як визначено в прикладі З в даному документі, або по суті схожого аналізу.

Згідно з даним винаходом також передбачені антитіла і їх антигензв'язуючі фрагменти, які зв'язуються з димерним ГЕРВ людину днаприклад, ПГЕРА.тЕс, 5ЕО ІЮО МО: 91) зі значенням дисоціативного періоду напівжиття (ї 2), що становить більше ніж приблизно 10 хвилин, як виміряно за допомогою поверхневого плазмонного аналізу при 25 "С або 37 "С, наприклад, з використанням формату аналізу, як визначено в прикладі З в даному документі, або по суті схожого аналізу. Згідно з певними варіантами здійснення передодчені антитіла до ГЕРЕ, які зв'язуються з димерним ГЕРА людини при 25 "С зі значенням Її 2, що становить більше ніж приблизно 15 хвилин, приблизно 20 хвилин, більше ніж приблизно 30 хвилин, більше ніж приблизно 40 хвилин, більше ніж 50 хвилин, більше ніж приблизно 60 хвилин, більше ніж приблизно 70 хвилин, більше ніж 80 хвилин, більше ніж 90 хвилин, більше ніж 100 хвилин або довше, як виміряно за допомогою поверхневого плазмонного аналізу, наприклад, з використанням формату аналізу, як визначено в прикладі З в даному документі, або по суті схожого аналізу.

Згідно з даним винаходом також передбачені антитіла і їх антигензв'язуючі фрагменти, які зв'язуються з | ЕРА в комплексі з лептином людини (вираз ""ЕРА в комплексі з лептином людини" також може бути представлений виразом "лептин: ЕРА"). Наприклад, згідно з даним винаходом передбачені антитіла і їх антигензв'язуючі фрагменти, які здатні зв'язуватися з попередньо утвореним комплексом, що містить ПІ ЕРВ і лептин людини. Іншими словами, згідно з певними варіантами здійснення взаємодія між антитілами до !ЕРВА і ГЕРЕ не інгібується присутністю лептину в комплексі з І ЕРВ; аналогічно, взаємодія між лептином і ГЕРЕ згідно з даним аспектом даного винаходу не інгібується присутністю антитіла до ГЕРВ. Ілюстративний формат аналізу для визначення того, чи зв'язується антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент з ЕРА в комплексі з лептином людини, представлений в прикладі 4 в даному документі.

Згідно з даним винаходом також передбачені антитіла і їх антигензв'язуючі фрагменти, які зв'язуються з експресованим на клітинній поверхні І ЕРЕ в присутності та/або за відсутності лептину людини. Експресований на клітинній поверхні | ЕРА означає І ЕРВ або його частину (наприклад, позаклітинну частину ЕРА), що експресуються на поверхні клітини, або в природних умовах, або в сконструйованій клітинній лінії так щоб антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент були здатні зв'язуватися з молекулою І ЕРЕВ. Згідно з певними варіантами здійснення експресований на клітинній поверхні ГЕРЕ включає в себе рекомбінантні комплекси, що містять позаклітинний домен І ЕРЕ, з'єднаний з клітиною за допомогою мітки або якоря (наприклад, якоря СРІ, як проілюстровано в прикладі б в даному документі). Згідно з даним аспектом даного винаходу передбачені антитіла, які здатні зв'язуватися з експресованим на клітинній поверхні ГЕРЕ за відсутності лептину, а також здатні зв'язуватися з експресованим на клітинній поверхні (ЕРА в присутності лептину (тобто за умов, коли лептин здатний зв'язуватися з експресованим на клітинній поверхні І ЕРЕ). Іншими словами, згідно з певними варіантами здійснення взаємодія між антитілами до І ЕРВ і експресованим на клітинній поверхні

ГЕРЕ не інгібується присутністю лептину в комплексі з експресованим на клітинній поверхні

ГЕРЕА. Антитіла згідно з даним аспектом даного винаходу здатні утворювати тричленний комплекс на поверхні клітини, що містить антитіло, експресований на клітинній поверхні / ЕРЕ і лептин. Ілюстративний формат аналізу для визначення того, чи здатне антитіло або його

Зо антигензв'язуючий фрагмент зв'язуватися з експресованим на клітинній поверхні ЕРА в присутності та за відсутності лептину людини, представлений у прикладі 5 в даному документі.

Антитіла згідно з даним винаходом можуть мати одну або декілька вищезазначених біологічних характеристик або будь-яку їх комбінацію. Мається на увазі, що наведений вище перелік біологічних характеристик антитіл згідно з даним винаходом не є вичерпним. Інші біологічні характеристики антитіл згідно з даним винаходом стануть очевидні середньому фахівцю в даній галузі техніки з огляду даного розкриття, включаючи в себе демонстраційні приклади в даному документі.

Картування епітопів і споріднені технології

Епітоп, з яким зв'язуються антитіла згідно з даним винаходом, може складатися з окремої безперервної послідовності з З або більше (наприклад, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше) амінокислот білка І ЕРА. Альтернативно, епітоп може складатися з множини несуміжних амінокислот (або амінокислотних послідовностей) ЕРА. Згідно з деякими варіантами здійснення епітоп розташований на лептинзв'язуючому домені ЕРА або поблизу нього. Згідно з іншими варіантами здійснення епітоп розташований на області, віддаленій від лептинзв'язуючого домену І ЕРВ, наприклад, у положенні на поверхні І ЕРЕ, на якому антитіло, будучи зв'язаним з таким епітопом, не перешкоджає зв'язуванню лептину з

ІГЕРВ.

Різні техніки, що відомі середнім фахівцям у даній галузі техніки, можна використовувати для ідентифікації амінокислот у межах епітопу, що розпізнається конкретним антитілом.

Ілюстративні техніки включають в себе, наприклад, аналіз за допомогою аланін-скануючого мутагенезу, пептидний блотінг і аналіз розщеплення пептидів. Крім того, можна використовувати такі способи, як вирізання епітопів, екстракція епітопів і хімічна модифікація антигенів (Тотег (2000) Ргоївіп Зсієпсе 9:487-496). Іншим способом, який можна застосовувати для ідентифікації амінокислот у поліпептиді, з яким взаємодіє антитіло, є воднево-дейтерієвий обмін, що виявляється за допомогою мас-спектрометрії. Загалом, спосіб воднево-дейтерієвого обміну передбачає мічення дейтерієм білка, який являє інтерес, з подальшим зв'язуванням антитіла з білком, що мічений дейтерієм. Потім комплекс білок-антитіло переносять у воду, щоб дозволити відбутися обміну водню на дейтерій на всіх залишках, за винятком залишків, захищених антитілом (які залишаються міченими дейтерієм). Після дисоціації антитіла цільовий 60 білок піддають протеазному розщепленню та мас-спектрометричному аналізу, таким чином виявляючи мічені дейтерієм залишки, які відповідають конкретним амінокислотам, з якими взаємодіє антитіло. Див., наприклад, Енгіпа (1999) Апа|уїіса! Віоспетівігу 267(2):252-259; Епдеп апа Зтійй (2001) Апаї. Снет. 73:256А-265А. Рентгеноструктурний аналіз антитіла в комплексі з його антигеном також можна використовувати для ідентифікації амінокислот в межах поліпептиду, з яким взаємодіє антитіло.

Даний винахід додатково включає в себе антитіла до ГЕРЕ, які зв'язуються з тим же епітопом, що й будь-яке з конкретних ілюстративних антитіл, які описані в даному документі (наприклад, антитіл, що містять будь-яку з амінокислотних послідовностей, як представлено в таблиці 1 в даному документі). Аналогічно, згідно з даним винаходом також передбачені антитіла до ІЕРАЕ, які конкурують за зв'язування з ІЕРА з будь-яким із конкретних ілюстративних антитіл, що описані в даному документі (наприклад, антитіл, що містять будь-яку з амінокислотних послідовностей, як представлено в таблиці 1 в даному документі).

Можна визначити, чи зв'язується антитіло з тим же епітопом, що й еталонне антитіло до

ІЇЕРА, або чи конкурує за зв'язування з еталонним антитілом до ЕРА з використанням загальноприйнятих способів, відомих у даній галузі техніки та проілюстрованих в даному документі. Наприклад, для визначення того, чи зв'язується досліджуване антитіло з тим же епітопом, що еталонне антитіло до ЕРА згідно з даним винаходом, еталонному антитілу дозволяють зв'язатися з білком І ЕРА. Далі оцінюють здатність досліджуваного антитіла зв'язуватися з молекулою І ЕРА. Якщо досліджуване антитіло здатне зв'язуватися з І ЕРЕ після насичуючого зв'язування з еталонним антитілом до ЕРА, можна зробити висновок, що досліджуване антитіло зв'язується з іншим епітопом, ніж еталонне антитіло до І ЕРВ. З іншого сторони, якщо досліджуване антитіло не здатне зв'язуватися з молекулою ГЕРА після насичуючого зв'язування з еталонним антитілом до ГЕРЕ, то досліджуване антитіло може зв'язуватися з тим же епітопом, що й епітоп, з яким зв'язується еталонне антитіло до ЕРА згідно з даним винаходом. Додаткові загальноприйняті експерименти (наприклад, аналізи мутацій в пептиді й аналізи зв'язування) потім можна провести для підтвердження того, чи дійсно відсутність зв'язування, яке спостерігається, досліджуваного антитіла пов'язана зі зв'язуванням з тим же епітопом, що й у еталонного антитіла, або ж стеричне блокування (або інше явище) відповідає за відсутність зв'язування, яке спостігається. Експерименти такого роду

Зо можна виконати з використанням ЕГІЗА, ВІА, Віасоге, проточної цитометрії або будь-якого іншого кількісного або якісного аналізу зв'язування антитіл, доступного в даній галузі техніки.

Згідно з визначеними варіантами здійснення даного винаходу, два антитіла зв'язуються з одним і тим же (або таким, що перекривається) епітопом, якщо, наприклад, 1-, 5-, 10-, 20- або 100- кратний надлишок одного антитіла інгібує зв'язування іншого щонайменше на 50 95, але переважно на 7595, 9095 або навіть на 9995 згідно з виміром в аналізі конкурентного зв'язування (див., наприклад, Чипопапз еї аї. (1990) Сапсег Рез. 50:1495-1502). Альтернативно, вважається, що два антитіла зв'язуються з одним і тим же епітопом, якщо по суті всі амінокислотні мутації в антигені, які знижують або усувають зв'язування одного антитіла, знижують або усувають зв'язування іншого. Вважається, що два антитіла характеризуються "епітопами, що перекриваються", якщо тільки підгрупа амінокислотних мутацій, які знижують або усувають зв'язування одного антитіла, знижують або усувають зв'язування іншого.

Для визначення того, чи конкурує антитіло за зв'язування (або перехресно конкурує за зв'язування) з еталонним антитілом до ІГЕРЕ, описану вище методику зв'язування проводять у двох орієнтаціях. У першій орієнтації еталонному антитілу дозволяють зв'язатися з білюом | ЕРА при насичуючих умовах з подальшою оцінкою зв'язування досліджуваного антитіла з молекулою

ГЕРЕ. У другій орієнтації еталонному антитілу дозволяють зв'язатися з молекулою І ЕРА при насичуючих умовах з подальшою оцінкою зв'язування еталонного антитіла з молекулою ГЕРВ.

Якщо, в обох орієнтаціях, тільки перше (насичуюче) антитіло здатне зв'язуватися з молекулою

ІГЕРА, то можна зробити висновок про те, що досліджуване антитіло й еталонне антитіло конкурують за зв'язування з ЕРА. Середньому фахівцю в даній галузі техніки зрозуміло, що антитіло, яке конкурує за зв'язування з еталонним антитілом, може необов'язково зв'язуватися з тим же епітопом, що й еталонне антитіло, але може стерично блокувати зв'язування еталонного антитіла за рахунок зв'язування з таким, що перекривається, або суміжним епітопом.

Одержання антитіл людини

Антитіла до ЕРА згідно з даним винаходом можуть являти собою повністю людські антитіла. Способи одержання моноклональних антитіл, включаючи в себе повністю людські моноклональні антитіла, відомі в даній галузі техніки. Будь-які такі відомі способи можна використовувати в контексті даного винаходу для одержання антитіл людини, які специфічно зв'язуються з | ЕРА людини.

З використанням технології, наприклад, МЕ ОСІММИМЕ М або будь-якого іншого схожого відомого способу для створення повністю людських моноклональних антитіл спочатку виділяють високоафінні химерні антитіла до ЕРА з варіабельною областю людини та константною областю миші. Як і в розділі експериментів нижче, антитіла охарактеризовані та вибрані для потрібних характеристик, включаючи в себе афінність, активність блокування ліганду, селективність, епітоп і т. д. За необхідності константні області миші замінюють потрібною константною областю людини, наприклад, 401 або Ідс4 дикого типу або модифікованим Іда1 або Іда4 для створення повністю людського антитіла до І ЕРВ. У той час як вибрана константна область може варіюватися в залежності від конкретного застосування, характеристики високої афінності зв'язування антигена та цільової специфічності знаходяться у варіабельній області У певних випадках повністю людські антитіла до ЕРА виділяють безпосередньо з антигенпозитивних В-клітин.

Біоеквіваленти

Антитіла до ЕРА і фрагменти антитіл згідно з даним винаходом охоплюють білки з амінокислотними послідовностями, які можуть відрізнятися від амінокислотних послідовностей описаних антитіл, але які зберігають здатність зв'язуватися з ЕРА людини. Такі варіантні антитіла та фрагменти антитіл містять одну або декілька вставок, делецій або замін амінокислот у порівнянні з вихідною послідовністю, але проявляють біологічну активність, яка є по суті еквівалентною активності описаних антитіл. Аналогічно, послідовності ДНК, що кодують антитіло до ГЕРВ, згідно з даним винаходом охоплюють послідовності, які містять одну або декілька вставок, делецій або замін нуклеотидів у порівнянні з розкритою послідовністю, але які кодують антитіло до ЕРА або фрагмент антитіла, які є по суті біоеквівалентом відносно до антитіла до ЕРА або фрагмента антитіла згідно з даним винаходом. Приклади таких варіантних амінокислотних послідовностей і послідовностей ДНК обговорюються вище.

Два антигензв'язуючих білка, або антитіла, вважаються біоеквівалентними, якщо, наприклад, вони являють собою фармацевтичні еквіваленти або фармацевтичні альтернативи, швидкість і ступінь абсорбції яких не показують значної різниці при введенні в одній і тій же молярній дозі в аналогічних умовах експерименту, або у вигляді однієї дози, або у вигляді декількох доз. Деякі антитіла вважатимуться еквівалентами або фармацевтичними

Зо альтернативами, якщо вони еквівалентні за ступенем їх абсорбції, але не за швидкістю їх абсорбції, і все ж їх можна вважати біоеквівалентними, оскільки такі відмінності в швидкості абсорбції є навмисними та відображені на етикетці, не мають суттєвого значення для досягнення ефективних концентрацій лікарського засобу в організмі, наприклад, при постійному застосуванні, і вважаються з медичної точки зору незначними для конкретного досліджуваного лікарського засобу.

Згідно з одним варіантом здійснення два антигензв'язуючих білка є біоеквівалентними, якщо відсутні клінічно значущі відмінності в їх безпеці, чистоті й ефективності.

Згідно з одним варіантом здійснення два антигензв'язуючих білка є біоеквівалентними, якщо пацієнт може перемикатися один або декілька разів між еталонним продуктом і біологічним продуктом без очікуваного збільшення ризику несприятливих ефектів, включаючи в себе клінічно значущу зміну імуногенності або знижену ефективність, у порівнянні з продовженням терапії без такого перемикання.

Згідно з одним варіантом здійснення два антигензв'язуючих білка є біоеквівалентними, якщо обидва вони діють за допомогою загального механізму або механізмів дії для умови або умов використання, в тому ступеню, в якому такі механізми є відомими.

Біоеквівалентність можна продемонструвати за допомогою способів іп мімо та іп міо.

Вимірювання біоеквівалентності включають в себе, наприклад, (а) тест іп мімо у людей або інших ссавців, в якому концентрацію антитіла або його метаболітів вимірюють в крові, плазмі, сироватці або іншій біологічній рідині як функцію часу; (Б) тест іп міо, який був корельований з даними про біодоступність іп мімо у людини і є обгрунтовано прогностичним відносно цих даних; (с) тест іп мімо у людей або інших ссавців, в якому відповідний гострий фармакологічний ефект антитіла (або його мішені) вимірюють як функцію часу; і (4) добре контрольоване клінічне випробування, яке встановлює безпеку, ефективність або біодоступність або біоеквівалентність антитіла.

Біоеквівалентні варіанти антитіл до ГЕРВЕ згідно з даним винаходом можна сконструювати, наприклад, шляхом здійснення різних замін залишків або послідовностей або видалення кінцевих або внутрішніх залишків або послідовностей, які не є необхідними для біологічної активності. Наприклад, залишки цистеїну, що не є необхідними для біологічної активності, можна видалити або замінити іншими амінокислотами для запобігання утворення непотрібних бо або неправильних внутрішньомолекулярних дисульфідних містків при ренатурації. В інших контекстах біоеквівалентні антитіла можуть включати в себе варіанти антитіл до ГЕРВ, що містять амінокислотні заміни, які модифікують характеристики глікозилювання антитіл, наприклад, мутації, які усувають або видаляють глікозилювання.

Видова селективність і видова перехресна реактивність

Даний винахід згідно з певними варіантами здійснення відноситься до антитіл до ГЕРВ, які зв'язуються з ЕРА людини, але не з ЕРА інших видів. Згідно з даним винаходом також передбачені антитіла до І ЕРЕ, які зв'язуються з ГЕРЕ людини та з І ЕРВ одного або декількох видів, що не відносяться до людини. Наприклад, антитіла до І ЕРВ згідно з даним винаходом можуть зв'язуватися з І ЕРА людини та можуть зв'язуватися або не зв'язуватися, в залежності від обставин, з одним або декількома з наступного: | ЕРА миші, щура, морської свинки, хом'яка, піщанки, свині, кішки, собаки, кролика, кози, вівці, корови, коня, верблюда, яванського макака, мавпи, макаки-резус або шимпанзе. Відповідно до певних ілюстративних варіантів здійснення даного винаходу передбачені антитіла до І ЕРЕ, які специфічно зв'язують ЕРА людини та

Ї ЕРЕ яванського макака (наприклад, Масаса їазсісціагів5). Інші антитіла до ГЕРЕ згідно з даним винаходом зв'язуються з ЕРА людини, але не зв'язуються або слабо зв'язуються з ЕРА яванського макака.

Мультиспецифічні антитіла

Антитіла згідно з даним винаходом можуть бути моноспецифічними або мультиспецифічними (наприклад, біспецифічними). Мультиспецифічні антитіла можуть бути специфічними відносно різних епітопів на одному цільовому поліпептиді або можуть містити антигензв'язуючі домени, специфічні відносно більш одного цільового поліпептиду. Див., наприклад, Тий еї аї. (1991) 9. Іттипої. 147:60-69; Китег єї аї. (2004) Ттепавз ВіоїесНпої. 22:238- 244. Антитіла до І ЕРЕ згідно з даним винаходом можуть бути зв'язані з іншою функціональною молекулою або коекспресуватися з іншою функціональною молекулою, наприклад, іншим пептидом або білком. Наприклад, антитіло або його фрагмент може бути функціонально зв'язаним (наприклад, шляхом хімічного зв'язку, генетичного злиття, нековалентної асоціації або іншим чином) з однією або декількома іншими молекулярними сутностями, такими як інше антитіло або фрагмент антитіла, з одержанням біспецифічного або мультиспецифічного антитіла з другою специфічністю зв'язування.

Згідно з даним винаходом передбачені біспецифічні антитіла, в яких одне плече імуноглобуліну зв'язується з ЕРА людини, а інше плече імуноглобуліну є специфічним відносно другого антигена. | ЕРВ-зв'язуюче плече може містити будь-яку з амінокислотних послідовностей НСУВ/ СМЕ або СОВ, як представлено в таблиці 1 в даному документі.

Ілюстративний формат біспецифічних антитіл, який можна використовувати в контексті даного винаходу, передбачає застосування першого домену Сн3 імуноглобуліну (Ід) і другого домену Сн3 4, причому перший і другий домени СнЗ3 Ід відрізняються один від одного щонайменше однією амінокислотою, і при цьому щонайменше відмінність на одну амінокислоту знижує зв'язування біспецифічного антитіла з білком А в порівнянні з біспецифічним антитілом, в якому відсутня відмінність за амінокислотами. Згідно з одним варіантом здійснення перший домен СнЗ Ід зв'язується з білком А, а другий домен СнЗ3 Ід містить мутацію, яка знижує або усуває зв'язування з білком А, таку як модифікація НОБЕ (згідно з нумерацією екзонів ІМТ;

НаЗ5В згідно з нумерацією ЄЮ). Другий СнЗ3 може додатково містити модифікацію У96БЕ (згідно з

ІМОаТ; У436Е згідно з ЕШ). Додаткові модифікації, які можна виявити в межах другого СнЗ, включають в себе: О16Е, І 18М, М445, К52М, М57М ії У821 (згідно з ІМаТ; ОЗ56Е, І 358М, М3845,

КЗ92М, М397М і М4221 згідно з Е)) у випадку антитіл ІдС1; М445, КБ2М ї М82І (Мат; М3845,

КЗ92М і У4221 згідно з ЕМ) у випадку антитіл Ід(2; і 0158, М445, КБ2М, М57М, ВбОК, Е79О0 і У821 (згідно з ІМСТ; 03558, М3845, КЗ92М, У397М, Н409К, Е4190 і М4221І згідно з ЕМ) у випадку антитіл ІД24. Варіанти описаного вище формату біспецифічних антитіл передбачені обсягом даного винаходу.

Інші ілюстративні біспецифічні формати, які можна використовувати в контексті даного винаходу, включають в себе без обмеження, наприклад, біспецифічні формати, що основані на 5еЕм, або біспецифічні формати - діатіла, злиття Ід(-5сЕм, подвійний варіабельний домен (ОМ) -Ю, квадрома, виступи-у-западини, загальний легкий ланцюг (наприклад, загальний легкий ланцюг з виступами-у-западинами і т. д.), Сто55Мар, Сто55Рар, антитіло, що містить домен, сконструйований за допомогою заміни ланцюгів (5ЕЕО), лейцинова "блискавка", Юиобоау,

ІасиЛасіг, баб (ВАБ)-Іда подвійної дії і Мар» біспецифічні формати (див., наприклад, Ківїп еї аї. (2012) тАБре5 4: 6, 1-11, ї посилання, що процитовані в ній, для огляду наведених вище форматів). Біспецифічні антитіла також можна сконструювати з використанням кон'югування пептиду з нуклеїновою кислотою, наприклад, в якому неприродні амінокислоти з відмінною бо хімічною реакційною здатністю використовують для створення сайт-специфічних кон'югатів антитіла з олігонуклеотидом, які потім піддаються самозбірці в мультимерні комплекси із заданим складом, валентністю та геометрією. (Див., наприклад, Кагапе еї а!., У. Ат. Спет. бос.

ІЕриб: Оеєс. 4, 20121).

Терапевтичний склад і введення

Даний винахід відноситься до фармацевтичних композицій, що містять антитіла до І ЕРВ або їх антигензв'язуючих фрагментів згідно з даним винаходом. Фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом вводять у склад з підходящими носіями, допоміжними речовинами й іншими засобами, які забезпечують поліпшене транспортування, доставку, переносимість і тому подібне. Множину прийнятних складів можна знайти в рецептурному довіднику, відомому всім хімікам-фармацевтам: НКетіпаїоп'є Рпаптасеціїса! Зсієпсе5, Маск Рибіїзніпа Сотрапу, Еазіюп,

РА. Ці склади включають в себе, наприклад, порошки, пасти, мазі, желе, віск, олії, ліпіди, везикули, що містять ліпіди (катіонні або аніонні), (такі як ГПІРОРЕСТІМ "М, | Же ТесНпоіодієв,

Сапзрайд, СА), ДНК-кон'югати, безводні абсорбуючі пасти, емульсії олія-в-воді та вода-в-олії, емульсії карбовакс (поліетиленгліколі з різними молекулярними масами), напівтверді гелі та напівтверді суміші, що містять карбовакс. Див., також Ром/єї! еї аІ. "Сотрепаїцт ої ехсіріепів їог рагепіега! Топтиіайопв" РОСА (1998) ) Рнагт 5сі Теснпої! 52:238-311.

Доза антитіла, що вводиться пацієнту, може варіюватися в залежності від віку та розмірів пацієнта, цільового захворювання, станів, шляху введення і тому подібного. Переважну дозу, як правило, розраховують в залежності від маси тіла або площі поверхні тіла. У дорослого пацієнта, сприятливим є внутрішньовенне введення антитіла згідно 3 даним винаходом, як правило, в одноразовій дозі, що становить приблизно 0,01 - приблизно 20 мг/кг маси тіла, більше переважно приблизно 0,02 - приблизно 7, приблизно 0,03 - приблизно 5 або приблизно 0,05 - приблизно З мг/кг маси тіла. У залежності від тяжкості стану частота та тривалість лікування можуть бути скориговані. Ефективні дозування та схеми введення антитіл до ЕРА можна визначити дослідним шляхом; наприклад, прогресування пацієнта можна піддавати моніторингу шляхом періодичної оцінки, і дозу можна коригувати відповідним чином. Більше того, міжвидовий перерахунок дозувань можна виконати з використанням добре відомих способів у даній галузі техніки (наприклад, Могаепії єї аї. (1991) Рнаптасеці. Нев. 5:1351).

Відомі різні системи доставки, які можна використовувати для введення фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом, наприклад, інкапсуляція в ліпосоми, мікрочастинки, мікрокапсули, рекомбінантні клітини, що здатні експресувати мутантні віруси, опосередкований рецептором ендоцитоз (див., наприклад, Уми сеї аї. (1987) 9. Віої. Спет. 262:4429-4432). Способи введення включають в себе без обмеження внутрішньошкірні, внутрішньом'язові, інтраперитонеальні, внутрішньовенні, підшкірні, інтраназальні, епідуральні та пероральні шляхи.

Композицію можна вводити будь-яким зручним шляхом, наприклад, шляхом інфузії або болюсної ін'єкції, шляхом абсорбції крізь епітеліальні або слизові оболонки (наприклад, крізь слизову оболонку порожнини рота, слизову оболонку прямої кишки та кишечнику і т. д.) і можна вводити разом з іншими біологічно активними засобами. Введення може бути системним або місцевим.

Фармацевтичну композицію згідно з даним винаходом можна доставляти підшкірно або внутрішньовенно за допомогою стандартної голки та шприца. Крім того, відносно підшкірної доставки, пристрій доставки шприц-ручка легко знаходить застосування при доставці фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом. Такий пристрій доставки шприц-ручка може бути багаторазовим або одноразовим. У багаторазовому пристрої доставки шприц-ручка, як правило, використовують змінний картридж, який містить фармацевтичну композицію. Як тільки вся фармацевтична композиція в картриджі введена і картридж порожній, порожній картридж можна легко викинути та замінити новим картриджем, який містить фармацевтичну композицію. Після цього пристрій доставки шприц-ручку можна повторно використовувати. В одноразовому пристрої доставки шприці-ручці немає змінного картриджа. Навпаки, одноразовий пристрій доставки шприц-ручка поставляється попередньо заповненим фармацевтичною композицією, що міститься в резервуарі всередині пристрою. Як тільки резервуар спорожняється від фармацевтичної композиції, весь пристрій викидають.

Численні багаторазові пристрої доставки шприци-ручки і автоін'єктори знаходять застосування в підшкірній доставці фармацевтичної композиції згідно 3 даним винаходом.

Приклади включають в себе без обмеження наступне: АОТОРЕМ"М (Омжеп Митіога, Інс.,

МУоодвзіоскК, ШК) шприц-ручка ОІЗЕТВОМІСтТМ (Оівеїйгопіс МедісаІ бувієтве, Вигапаот,

Змїгепйапа), шприц-ручка НОМАГОСІ МІХ 75/25, шприц-ручка НОМАГОСтМ, шприц-ручка

НОМАСІМ 70/307м (Б (Шу апа Со., Іпаіапароїї5, Іпп.), МОМОРЕМ'М |, По ї Ш (Момо Могаївк,

Сорепнадеп, Оептаж), МОМОРЕМ ЗСОМІОВ М (Момо МогаїзкК, Сорепнадеп, Оєптагк), шприц- 60 ручка ВОМ (Весіюп бісКіпвоп, ЕгапКіїй Іакев5, М.).), ОРТІРЕМ"М, ОРТІРЕМ РВО "М, ОРТІРЕМ

ЗТАВІ ЕТ "М ї ОРТІСТІІК м (запоїїі-Амепіїз, Егапктший, Септапу), називаючи лише декілька з них.

Приклади одноразових пристроїв доставки шприц-ручка, що знаходять своє застосування в підшкірній доставці фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом, включають в себе без обмеження наступне: шприц-ручка БОЇ О5ТАНВ М (запоїї-амепіїв), ЕГЕХРЕМ М (Момо МогаївкК) і КМЛКРЕМ "М (ЕЇї І Шу), автоїн'єктор ОВЕС СКМ (Атдеп, Тпоизапа Оакз, Саїйї.), РЕМ ЕТ тм (Назе!твієг, еішйдап, Септапу), ЕРІРЕМ (Оєу, .Р.) ї шприц-ручка НОМІНА мМ (Аррої І абз»,

Аррої Рак, 111.), називаючи лише декілька з них.

У певних ситуаціях фармацевтичну композицію можна доставляти в системі контрольованого вивільнення. Згідно з одним варіантом здійснення можна використовувати насос (див. І апдег, раніше; Зейоп (1987) САС Сії. Неї. Віотей. Епд. 14:201). Згідно з іншим варіантом здійснення можна використовувати полімерні матеріали; див., Медіса! Арріїсайопв5 ої

Сопігоїїєд Реїеазе, І апдег апа М/ізе (єдз.) (1974) СВС Ргез., Воса Наюп, Ріогіда. Згідно з ще одним варіантом здійснення систему контрольованого вивільнення можна помістити в безпосередній близькості від мішені композиції, таким чином, знадобиться лише частка системної дози (див., наприклад, Сооазоп (1984) в Медіса! Арріїсайопе ої СопігоПей Реїєазе, раніше, мої. 2, рр. 115-138). Інші системи контрольованого вивільнення обговорюються в огляді

І апдег (1990) бсіепсе 249:1527-1533.

Ін'єкційні препарати можуть включати в себе лікарські форми для внутрішньовенних, підшкірних, внутрішньошкірних і внутрішньом'язових ін'єкцій, крапельних інфузій і т. д. Ці ін'єкційні препарати можна одержати загальновідомими способами. Наприклад, ін'єкційні препарати можна одержати, наприклад, шляхом розчинення, суспендування або емульгування описаного вище антитіла або його солі в стерильному водному середовищі або масляному середовищі, які зазвичай використовуються для ін'єкцій. Як водне середовище для ін'єкцій існує, наприклад, фізіологічний сольовий розчин, ізотонічний розчин, що містить глюкозу й інші допоміжні засоби і т. д., які можна використовувати в комбінації з підходящим солюбілізуючим засобом, таким як спирт (наприклад, етанол), багатоатомний спирт (наприклад, пропіленгліколь, полієтиленгліколь), неїоногенна поверхнево-активна речовина Інаприклад, полісорбат 80, НСО- 50 (поліоксіетиленовий (50 моль) аддукт гідрогенізованої касторової олії)| і т. д. Як масляне середовище використовують, наприклад, кунжутну олію, соєву олію і т. д., які можна

Зо використовувати в комбінації з солюбілізуючим засобом, таким як бензилбензоат, бензиловий спирт і т. д. Одержаною таким чином ін'єкцією переважно заповнюють відповідну ампулу.

Фармацевтичні композиції для перорального або парентерального застосування, що описані вище, переважно одержують у вигляді лікарських форм у стандартній дозі, яка відповідає дозі активних інгредієнтів. Такі лікарські форми в стандартній дозі включають в себе, наприклад, таблетки, пігулки, капсули, ін'єкції (ампули), супозиторії і т. д. Кількість вищезгаданого антитіла, що міститься, як правило, становить від приблизно 5 до приблизно 500 мг на лікарську форму в стандартній дозі; особливо в формі ін'єкцій переважно, щоб зазначене антитіло містилося в кількості, що становить від приблизно 5 до приблизно 100 мг і від приблизно 10 до приблизно 250 мг для інших лікарських форм.

Терапевтичні застосування антитіл

Згідно з даним винаходом передбачені способи, що передбачають введення суб'єкту, який потребує цього, терапевтичної композиції, що містить антагоністичне антитіло до ЕРВ (наприклад, антитіло до ГЕРВ, що містить будь-яку з послідовностей НСУВ/ СУВ або СОВ, як представлено в таблиці 1 в даному документі). Терапевтична композиція може містити будь-яке з антитіл до ЕРА, що розкриті в даному документі, або їх антигензв'язуючі фрагменти, та фармацевтично прийнятний носій або розріджувач.

Антитіла згідно з даним винаходом є застосовними, серед іншого, для лікування, профілактики та/або зменшення інтенсивності будь-якого захворювання або порушення, асоційованого або опосередкованого підвищеним вмістом лептину (гіперлептинемією) та/або підвищеною експресією лептинового рецептора ОВ-В, що призводить до надлишкової передачі сигналу І ЕРЕ. Згідно з різними варіантами здійснення захворювання або порушення вибране без обмеження з наступного: анорексія або інші психічні розлади харчової поведінки, кахексія при хронічному захворюванні нирок, інші кахексії, такі як кахексія при застійній серцевій недостатності, легенева кахексія, променева кахексія та ракова кахексія, аутоімунні порушення, такі як запальне захворювання кишечнику, червоний вовчак, розсіяний склероз, псоріаз, серцево-судинні захворювання, підвищений артеріальний тиск, депресія, нейродегенеративні порушення, рак, такий як нирковоклітинна карцинома, меланома та рак молочної залози.

Згідно з даним винаходом також передбачені антитіла до ГЕРВ їі їх антигензв'язуючі фрагменти, які є застосовними для антагоністичної дії відносно передачі сигналу ЕРЕ в бо клітинах, тканинах і органах, що експресують нормальний або високий вміст лептину.

Використовуваний в даному документі мутант ГЕРЕ, який проявляє посилену передачу сигналу в присутності лептину (в порівнянні з ЕРА дикого типу), називається "мутант ЕРА з посиленою передачею сигналу". Ілюстративна мутація ЕРА з посиленою передачею сигналу являє собою І ЕРА-О223ЗА (Спадпоп еї аї. (2009) Чоштпаї ої Сіїпіса! Епдосгіпоїоду є Меїабоїїзт 85(1):29-34). Таким чином, згідно з даним винаходом передбачені антитіла до ГЕРВ та їх антигензв'язуючі фрагменти, які є застосовними для лікування, профілактики та/або зменшення інтенсивності захворювань і порушень, викликаних або асоційованих з мутантами з посиленою передачею сигналу ГЕРВ.

У контексті способів лікування, описаних у даному документі, антитіла до ЕРА можна вводити як монотерапію (тобто у вигляді єдиного терапевтичного засобу) або в комбінації з одним або декількома додатковими терапевтичними засобами (приклади яких описані в іншому місці даного документа).

Види комбінованої терапії і склади

Згідно з даним винаходом передбачені композиції і терапевтичні склади, що містять будь- яке з антитіл до ЕРА, описаних у даному документі, в комбінації з одним або декількома додатковими терапевтично активними компонентами, та способи лікування, що передбачають введення таких комбінацій суб'єктам, які потребують цього.

Антагоністичні антитіла до І ЕРЕ згідно з даним винаходом можна спільно складати та/або вводити в комбінації з одним або декількома додатковими терапевтично активними компонентами, такими як, наприклад, фармацевтичні продукти, що прописані для лікування наступного: кахексія при застійній серцевій недостатності, легенева кахексія та ракова кахексія, аутоїмунні порушення, такі як запальне захворювання кишечника, червоний вовчак, розсіяний склероз, псоріаз, серцево-судинні захворювання, підвищений артеріальний тиск, нейродегенеративні порушення, депресія, рак, такий як нирковоклітинна карцинома, меланома, рак молочної залози, й інші захворювання та порушення, що асоційовані або викликані зниженою передачею сигналу лептину. Приклади таких додаткових терапевтично активних компонентів включають в себе без обмеження наприклад, наступне: інгібітори ангіотензинперетворюючого ферменту (наприклад, АСЕ, АСЕ-Ї, беназеприл, каптоприл, еналаприл, фозиноприл, лізиноприл, моексиприл, периндоприл, квінаприл, рамаприл,

Зо трандолаприл), блокатори рецепторів ангіотензину (наприклад, АВВ), міорелаксанти гладких м'язів (гідралазин), нітрати тривалої дії (наприклад, ізосорбіду динітрат, наприклад, з АСЕ-Ї і

АВВ або без них), діуретики (наприклад, петлеві діуретики, тіазидоподібні та калійзберігаючі діуретики), лікування залізодефіцитної анемії (наприклад, парентеральне залізо), бронхолітики тривалої або короткої дії (наприклад, (32 агоністи, такі як арформотерол, буфенін, кленбутерол, допексамін, епінефрин, фентотерол, формотерол, ізоетарін, ізопреналін, ізопротеренол, левосальбутамол, орципреналін, пірбутерол, прокатерол, ритодрин, сальбутамол, альбутерол, тербуталін, тіотропій), антихолінергічні засоби (наприклад, гиосциамін, атропін, фенобарбітал, скополамін, дицикломін, фенобарбітал, мепензолат і їх комбінації, такі як атропін, гиосциамин, фенобарбітал і скополамін), кортикостероїди (наприклад, гідрокортизон, гідрокортизон-17- валерат, гідрокортизон-17-бутират, преднізон, преднізолон, триамцинолону ацетонід, тріамцинолоновий спирт, бетаметазон, дексаметазон, флуокортолон, флунізолід, будесонід), антибіотики тривалої дії (наприклад, макроліди, такі як еритроміцин, азитроміцин і метилксантіни, такі як теофілін), нестероїдні протизапальні препарати (НПЗП) (наприклад, аспірин, целекоксиб, диклофенак, дифлунізал, етодолак, ібупрофен, індометацин, кетопрофен, напроксен, оксапрозин, піроксикам, сальсалат, суліндак, толметин і т. д.), 5-аміносаліцилові кислоти (5-АБА) (наприклад, месалазин), імунодепресанти (наприклад, преднізон, інгібітори

ТМЕ, азатіоприн, метотрексат, б-меркаптопурин), лікарські засоби для рецидивуюче- ремитуючого розсіяного склерозу (наприклад, інтерферон бета-Та, інтерферон бета-1б, глатирамер ацетат, мітоксантрон, наталізумаб, фінголімод, теріфлуномід, диметилфумарат, алемтузумаб, даклізумаб, моноклональні антитіла до СО20, такі як ритуксимаб, окрелізумаб і офатумумаб), місцеві засоби для лікування псоріазу (наприклад, місцеві засоби, такі як параамінобензойна кислота, кокосова олія, кам'яновугільна смола, дитранол, кортикостероїди, такі як дезоксіметазон, флуоцинонід, вітамін Оз й інші аналоги вітаміну 0, псорален і системні засоби, такі як метотрексат, циклоспорин, гідроксикарбамід, фумарати, такі як диметилфумарат і ретиноїди), антагоністи ТМЕ-са (наприклад, інфліксімаб, адалімумаб, голімумаб і цертолізумаб пегол), лікарські засоби для псоріазу, що націлені на Т-клітини (наприклад, ефалізумаб і алефацепт), лікарські засоби для гіпертензії і серцево-судинних захворювань (наприклад, аспірин, статини, такі як аторвастатин, флувастатин, ловастатин, мавастатин, пітавастатин, правастатин, розувастатин, симвастатин і їх комбінації, такі як симвастатин ж езетиміб, бо ловастатин ж ніацин і аторвастатин ж амлодипін), лікарські засоби для нейродегенеративних розладів (наприклад, дімебон і багатий пролином пептид (РЕР)-1), антидепресанти (наприклад, сертралін, циталопрам, флуоксетин, есциталопрам, тразодон, венлафаксин, бупропіон, дулоксетин, пароксетин, амітриптилін, венлафацин, десвенлафаксин і нортриптилін) і протиракові лікарські засоби (наприклад, сорафеніб, /Х-594, інтерлейкін-2, іпілімумаб (Мегуосу), ніволумаб (Ораїмо), пембролізумаб (Кеуїгида), вемурафеніб (7еїЇрогаї), дабрафеніб (Таїіпіак), траметиніб (Мекіпіві), антрацикліни, такі як доксорубіцин (АагатусіпФ), епірубіцин (ЕПепсеф), таксани, такі як паклітаксел (Тахо) і доцетаксел (Тахоїегеф), 5-фторурацил (5-ЕМ), циклофосфамід (СуїохапФ)), карбоплатин (РагаріайпФ)) або їх комбінація).

Схеми введення

Згідно з певними варіантами здійснення даного винаходу, множинні дози антагоністичного антитіла до ГЕРА (або фармацевтичної композиції, що містить комбінації антагоністичного антитіла до І ЕРЕ і будь-якого з додаткових терапевтично активних засобів, що згадані в даному документі) можна вводити суб'єкту протягом певного періоду часу. Способи згідно з даним аспектом даного винаходу передбачають послідовне введення суб'єкту множинних доз антитіла до ГЕРЕ згідно з даним винаходом. Використовуваний в даному документі термін "послідовне введення" означає, що кожну дозу антитіла до | ЕРА вводять суб'єкту в різні моменти часу, наприклад, у різні дні, що розділені заданими проміжками часу (наприклад, годинами, днями, тижнями або місяцями). Згідно з даним винаходом передбачені способи, які передбачають послідовне введення пацієнту однієї початкової дози антитіла до І ЕРЕ з подальшою однією або декількома вторинними дозами антитіла до ЕРА і необов'язково подальшою однією або декількома третинними дозами антитіладо ЕРВ.

Терміни "початкова доза", "вторинні дози" та "третинні дози" відносяться до тимчасової послідовності введення антитіла до І ЕРЕ згідно з даним винаходом. Таким чином, "початкова доза" являє собою дозу, яку вводять на початку схеми лікування (її також називають "вихідною дозою", "насичуючою дозою", "початковою дозою" і тому подібне)); "вторинні дози" являють собою дози, які вводять після початкової дози; та "третинні дози" являють собою дози, які вводять після вторинних доз. Початкова, вторинна та третинна дози можуть містити однакову кількість антитіла до ГЕРЕ, але, як правило, можуть відрізнятися одна від одної з точки зору частоти введення. Проте, згідно з певними варіантами здійснення кількість антитіла до ГЕРЕ, що міститься в початковій, вторинній і/або третинній дозах, варіюється відносно одна одної (наприклад, її коригують вище або нижче залежно від ситуації) протягом курсу лікування. Згідно з певними варіантами здійснення дві або більше (наприклад, 2, 3, 4 або 5) доз вводять на початку схеми лікування у вигляді "насичуючих доз", після яких вводять наступні дози, які вводять рідше (наприклад, "підтримуючі дози").

Діагностичні й аналітичні застосування антитіл

Антитіла до І ЕРВЕ згідно з даним винаходом також можна використовувати для виявлення та/або вимірювання ГЕРА або ІЕРЕ-експресуючих клітин у зразку, наприклад, для діагностичних цілей. Наприклад, антитіло до ЕРА або його фрагмент можна використовувати для діагностики стану або захворювання, що характеризується аберантною експресією (наприклад, надмірною експресією, недостатньою експресією, відсутністю експресії і т. д.)

ГЕРВ. Ілюстративні діагностичні аналізи відносно | ЕРА можуть включати в себе, наприклад, приведення в контакт зразка, що одержаний від пацієнта, з антитілом до ГЕРЕ згідно з даним винаходом, причому антитіло до ЕРА мітять міткою, яка виявляється, або репортерною молекулою. Альтернативно, немічене антитіло до ГЕРЕ можна використовувати в діагностичних цілях у комбінації з вторинним антитілом, яке саме є міченим міткою, яка виявляється. Мітка, яка виявляється, або репортерна молекула може являти собою радіоактивний ізотоп, такий як

ЗН, б, 82Р, 855 або 7125І: флуоресцентний або хемілюмінесцентний фрагмент, такий як ізотіоціанат флуоресцеїну або родамін; або фермент, такий як лужна фосфатаза, бета- галактозидаза, пероксидаза хрону або люцифераза. Конкретні ілюстративні аналізи, які можна використовувати для виявлення або вимірювання ГЕРА у зразку, включають в себе імуноферментний аналіз (ЕГІ5А), радіоїмуноаналіз (ВІА) і сортування клітин з активованою флуоресценцією (ГАС).

Зразки, які можна використовувати в діагностичних аналізах ЕРА відповідно до даного винаходу, включають в себе будь-який зразок тканини або рідини, що одержаний від пацієнта, який містить визначені кількості білка (ЕРА або його фрагментів за нормальних або патологічних умов. Як правило, вміст І ЕРА в конкретному зразку, що одержаний від здорового пацієнта (наприклад, пацієнта, який не страждає на захворювання або стан, пов'язаний з аномальними вмістом або активністю ГЕРЕ), вимірюватимуть для початкового встановлення вихідного, або стандартного вмісту І ЕРВ. Потім цей початковий вміст ЕРА можна порівняти з вмістом ГЕРВ, який виміряний в зразках, що одержані від осіб, у яких підозрюють наявність захворювання або стану, пов'язаного з ЕРВ.

Приклади

Наступні приклади представлені таким чином, щоб фахівці в даній галузі техніки мали повне розкриття і опис того, як реалізувати та застосувати способи та композиції згідно з даним винаходом, і не призначені для обмеження обсягу того, що автори даного винаходу вважають своїм винаходом. Були докладені зусилля для забезпечення точності відносно до використовуваних чисел (наприклад, кількостей, температури і т. д.), але слід враховувати деякі експериментальні помилки та відхилення. Якщо не зазначено інше, частини дані за масою, молекулярна маса являє собою середню молекулярну масу, температура представлена в градусах Цельсія, а тиск дорівнює атмосферному або близько до нього.

Приклад 1. Створення антигензв'язуючих білків, які специфічно зв'язуються з лептиновим рецептором (ГЕРА)

Антитіла до ЕРА одержували шляхом імунізації миші МЕ ОСІММОМЕФ (тобто сконструйованої миші, яка містить ДНК, що кодує варіабельні області важкого та каппа легкого ланцюга імуноглобуліну людини) за допомогою імуногену, що містить позаклітинний домен

ГЕРЕ. Імунну відповідь антитіла піддавали моніторингу за допомогою ГЕРВ-специфічного імуноаналізу. Повністю людські антитіла до ЕРА виділяли й очищували з використанням раніше описаних технік.

Певні біологічні властивості ілюстративних антитіл до | ЕРВ, що одержані відповідно до способів згідно з прикладом, описані детально в прикладах, представлених нижче.

Приклад 2. Амінокислотні послідовності та послідовності нуклеїнової кислоти варіабельних областей важкого та легкого ланцюгів

У таблиці 1 представлені ідентифікатори амінокислотної послідовності варіабельних областей важкого та легкого ланцюгів і СОМ вибраних антитіл до ЕРА згідно з даним винаходом. Відповідні ідентифікатори послідовностей нуклеїнової кислоти представлені в таблиці 2.

Таблиця 1

Ідентифікатори амінокислотної послідовності 11111111 5БО0ЮМо 77777711 нані7з2ара | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 | 714 | 16 наніваваР2 | 58 | 60 | 62 | 64 | 10 | 12 | 714 | 16 нанівавбра | 66 | 68 | 70 | 72 | 10 | 12 | 714 | 16 онантівовР2 | 74 | 76 | 78 | 80 | 82 | 84 | 86 | 88

Таблиця 2

Ідентифікатори послідовностей нуклеїнової кислоти 11111111 5БОЮМО ЇЇ 7711111 нані7заара | 1 |Юющз3з | 5 1 7 | 9 | 1 | їз | 5 наніва37Р2 | 17 | 19 | 21 | 23 | 9 | 1 | їз | 5 наніва3ора | 25 | 27 | 29 | з | 9 | 1 | їз | 5 нанівадорРа | 33 | 35 | 37 | 39 | 9 | 1 | їз | 5 наніва57Ра | 41 | 43 | 45 | 47 | 9 | 1 | їз | 5 наніваваРа | 49 | 51 | 53 | 55 | 9 | 71 | їз | 5 нанівавяР2 | 57 | 59 | 61 | 63 | 9 | 1 | їз | 75

Таблиця 2

Ідентифікатори послідовностей нуклеїнової кислоти нанівавбра | 65 | 67 | 69 | 7 | 9 | 1 | їз | 75

Антитіла, як правило, в даному документі називають згідно з наступною номенклатурою: приставка Ес (наприклад, "НА4Н", "НІМ", "Н2М" і т. д.) з подальшим числовим ідентифікатором (наприклад, "17322", "18457 " і т. д.), за яким йде суфікс "Р" або "М". Таким чином, відповідно до цієї номенклатури антитіло в даному документі може називатися, наприклад, "Н4НІ17322Р2", "НанНІ18457Р2" і т. д. Приставки Ес в позначеннях антитіл, використовуваних в даному документі (НЯН, НІМ ії Н2М), вказують на конкретний ізотип Ес-області антитіла. Наприклад, антитіло "НЯН" містить Ес Ідс4 людини, тоді як антитіло "НІМ" містить Гс ІДС21 миші (всі варіабельні області є повністю людськими, що позначено першої "Н" в позначенні антитіла). Середньому фахівцю в даній галузі техніки зрозуміло, що антитіло з конкретним ізотипом Ес можна перетворити в антитіло з іншим ізотипом Ес (наприклад, антитіло з Ес Ід21 миші можна перетворити в антитіло з Ідс4 людини і т. д.), але в будь-якому випадку варіабельні домени (включаючи в себе СОР), які зазначені за допомогою числових ідентифікаторів, показаних в таблицях 1 і 2, залишатимуться попередніми, і, як припускають, зв'язуючі властивості є ідентичними або по суті схожими незалежно від природи Ес-домену.

Антитіло порівняння. Антитіло порівняння, яке використовується в наступних прикладах, відноситься до Бар 9Е8, що описаний в Еа?еїї єї аї. (2006) У Іттипо!ї Меїйпоадв5 312:190-200 і

Сагрепівг вї аї. (2012) Бігисішге 20(3):487-97.

Приклад 3. Одержання за допомогою поверхневого плазменного аналізу значення афінності зв'язування та кінетичні константи моноклональних антитіл до | ЕРА людини

Константи рівноваги дисоціації (значення Ко) для зв'язування антигена з очищеними моноклональними антитілами до І ЕРЕ згідно з даним винаходом визначали з використанням біосенсора поверхневого плазмонного аналізу в режимі реального часу з використанням приладу Віасоге 4000. Всі дослідження зв'язування проводили в рухомому буфері, що містить 10 ММ НЕРЕЗБ, 150 мМ Масі, З мМ ЕОТА і 0,05 95 об'єм./об'єм. Поверхнево-активної речовини

Тмжееп-20, рН 7,4 (рухливий буфер НВ5-ЕТ) при 25"С і 37 "С. Поверхню сенсора Віасоге спочатку дериватизували шляхом амінного поєднання з моноклональним мишачим антитілом до Ес людини (СЕ, Мо за кат. ВА-1008-39) для захоплення моноклональних антитіл до І ЕРВ.

Реагенти ГЕРЕ, що досліджуються відносно зв'язування з моноклональними антитілами до | ЕРЕ, включали в себе рекомбінантний позаклітинний домен І ЕРЕ людини, експресований з С- кінцевою тус-тус-гексагістидиновою міткою (ПГЕРА.ММН; 5ЕО ІО МО: 90), рекомбінантний позаклітисний домен ЕРА яванскої макаки, експресований з С-кінцевою тус-тус- гексагістидиновою міткою (тії ЕРА.ММН; 5ЕО ІО МО: 93), рекомбінантний позаклітинний домен

ГЕРВ мишиії, експресований з С-кінневою тус-тус-гексагістидиновою міткою (ті ЕРА.ММН; 5ЕО

ІО МО: 94), рекомбінантний позаклітинний домен щура ГЕРВ, експресований з С-кінцневою тус- тус-гексагістидиновою міткою (ЕРА.ММН; 5ЕО ІО МО: 95), і рекомбінантний позаклітинний домен ГЕРЕ людини, експресований з С-кінцевою міткою Ес ІЇдс2а миші (ПІ ЕРА.тЕс; 5ЕО ІЮ

МО: 91). Конструкта ЕРА, які включають в себе мітки ММН, являють собою мономерні конструкти ГЕРВ, і конструкти І ЕРЕ, що включають в себе мітку тЕс, являють собою димерні конструкти І ЕРЕ. Різні концентрації реагентів ЕРА спочатку одержували в рухомому буфері

НВ5-ЕТ в кінцевих концентраціях, що знаходяться в діапазоні від 100 нМ до 3,7 нМ в З-кратних серійних розведеннях, і потім їх вводили на поверхню, що захоплена моноклональними антитілами до І ЕРЕ, протягом 4 хвилин з об'ємною швидкістю потоку, що становить 30 мкл/хв.

Дисоціацію зв'язаного з моноклональним антитілом реагенту ЕРА піддавали моніторингу протягом 10 хвилин в рухомому буфері НВ5Б-ЕТ. Кінетичні константи швидкості асоціації (Ка) і дисоціації (Ка) визначали шляхом апроксимації сенсограмм зв'язування в режимі реального часу до 1:1 моделі зв'язування з обмеженням перенесення маси з використанням програмного забезпечення для підбору апроксимуючої кривої бсгиррег 2.06 Константи рівноваги дисоціації для зв'язування (Ко) і дисоціативні періоди напівжиття 7) розраховували з кінетичних 5О оду нако ст аву ним ном: ка бо хка

Параметри кінетики зв'язування для зв'язування ПЕРВ-ММН, тії ЕРА-ММН, НПІЕРА.теЕс, т ЕРВ-ММН або ті ЕРВ-ММН з різними моноклональними антитілами до І ЕРВ згідно з даним винаходом при 25 "С і 37 "С показані в таблицях 3-13.

Таблиця З

Параметри кінетики зв'язування антитіл до І ЕРЕ, що зв'язуються з ПЕРВА-ММН при 2570

Рівень захоплення зв'язуван К Б . а

Захоплене тАр тА (ЕО, І ЕРВ- (1/мольгс) Ка (1/с) Ко (М) Ї (хв.) одиниці ММН (ЕС) відповіді)

НАНІ7322Р2 17851,2..| 66 | 4З8ЕнНО4 2,24Е-04 5,11Е-09

НАНІ8437Р2 17150,5 5,74ЕОЇ 3,75Е-03 6,53Е-08

НАНІ8439Р2 156:20,7 1.07Е-04 1,13Е-0З3 1,06Е-07

НАНІ8440Р2 170-0,5 4,23Е 04 4,97Е-04 1,18Е-0О8

НАНІ8457Р2 166:-0,9 2,55Е405 2,52Е-0З3 9,89Е-09

НАНІ8462Р2 175-0,6 68,79Е:04 7,65Е-03 1,13Е-07

НАНІ8464Р2 160-0,4 | 60 | 1,24Е05 1,13Е-03 9,09Е-09

НАНІ8466Р2 16150,5 2,84Е 04 5,11Е-03 1,94Е-07

НАНІТ8508Р2 180:51,5 1,76Е-05 1,67Е-03 9,53Е-09 поріВвнЯННЯ

Ізотипове контрольне 171-0,4 4 МВ" МВ" МВ" МВ" антитіло " МВ вказує на те, що зв'язування не спостерігалося в поточних умовах експерименту.

Таблиця 4

Параметри кінетики зв'язування антитіл до І ЕРЕ, що зв'язуються з ПГЕРВ-ММН при 37 "С

Реєнь Ген я

Захоплене тАБр | захоплення ПА БРВ. М а, Ка (1/с) Ко (М) 1/2 (хв.) тА (ЕС) 00 бумольо)

ММН (ЕС)

НАНІ7322Р2 22543 | 99 | 6,95ЕНОЇ4 8,12Е-04 | 1,17Е-0О8

НАНІТ8437Р2 21353 1,14Е 05 8,84Е-03 | 7,76Е-0О8

НАНІ8439Р2 180--1,5 2,32Е04 4,69Е-03 | 2,02Е-07

НАНІ8440Р2 207-412 6,34Е04 1,73Е-03 | 2,73Е-08

НАНІТ8457Р2 198:51,6 3,45Е05 8,55Е-03 | 2,48Е-0О8

НАНІ8462Р2 204521 4,58Е 404 1,14Е-02 | 2,48Е-07

НАНІ8464Р2 185:41,2.| 68 | 1,54Ен05 3,15Е-03 | 2,05Е-08

НАНІ8466Р2 18441,3 4,55Е04 6,74Е-03 | 1,48Е-07

НАНІТ8508Р2 20451,4 2,89Е:-05 6,88Е-03 | 2,55Е-08 поріВвнЯННЯ

Ізотипове контрольне 1932-1,5 МВ" МВ" МВ" МВ" антитіло " МВ вказує на те, що зв'язування не спостерігалося в поточних умовах експерименту.

Як показано в таблиці 3, при 25 "С всі моноклональні антитіла до І! ЕРЕ згідно з даним винаходом зв'язувалися з ПІ ЕРВ-ММН зі значеннями Ко, що знаходяться в діапазоні від 5,11

НМ до 194 НМ. Як показано в таблиці 4, при 37 "С всі моноклональні антитіла до І ЕРВ згідно з даним винаходом зв'язувалися з ПІ ЕРВА-ММН зі значеннями Ки, що знаходяться в діапазоні від 11,7 НМ до 248 НМ.

Таблиця 5

Параметри кінетики зв'язування антитіл до І ЕРВ, що зв'язуються з тії ЕРА-ММН при 257С

Реєнь Гб я

Захоплене тАб | захоплення ЯРА. у а, Ка (1/с) Ко (М) 1/2 (хв.) тА (ЕО) т - (Т/моль"с)

ММН (ЕС)

НАНІ7322Р2 177-0,5 7,02Е 04 2,92Е-04 | 4,16Е-09

НАНІ8437Р2 17150,3 68,87Е04 4,05Е-03 | 5,89Е-08

НАНІ8439Р2 15550,5 1,57Е404 1,52Е-03 | 9,63Е-08 | 8 («

НАНІ8440Р2 170-0,9 4,95Е04 2,88Е-03 | 5,41Е-08

НАНІ8457Р2 165:--0,4 2,13Е05 3,31Е-03 1,22Е-08

НАНІ8462Р2 174-0,4 7,А2ЕО4 1,33Е-02 1,79Е-07 | 0,9

НАНІ8464Р2 15920,4 3,82Е 104 2,31Е-03 | 6,04Е-0О8

НАНІ8466Р2 16150,5 4,50Е04 6,69Е-0З 1,48Е-07

НАНІ8508Р2 178520,4 2,04Е 05 1,83Е-03 | 8,00Е-09 поріВвнЯННЯ

Ізотипове контрольне 171-0,4 МВ" МВ" МВ" МВ" антитіло " МВ вказує на те, що зв'язування не спостерігалося в поточних умовах експерименту.

Таблиця 6

Параметри кінетики зв'язування антитіл до І ЕРЕ, що зв'язуються з тії ЕРВА-ММН при 37 "С

Рівень о зв'язуван Кк х

Захоплене тАр | захоплення ЯРА. у а Ка (1/с) Ко (М) 1/2 (хв.)

ТАБ (ЕО) т - (Т/моль"с)

ММН (ЕС)

НаАНІ73228Р2 21851,7 1,43Е 05 1110-03 1 07,72Е-09

НАНІ8437Р2 20741,4 8,69Е04 1,27Е-02 1472-07 | 09

НАНІ8439Р2 178521,4 4,69Е04 7,92Е-03 1,89Е-07

НАНІ8440Р2 20451 | 66 1 0 7,15Ен04 7,24Е-0З 1,01Е-07

НАНІ8457Р2 1955-1,4 3,АТЕНОБ 1,04Е-02 3,00Е-08

НАНІ8462Р2 19941,1 1.29Е405 3,37Е-02 2,81Е-07

НАНІ8464Р2 18350,6 3,92Е 104 8,41Е-ОЗ 2,15Е-07

НАНІ8466Р2 181-20,9 8,АЗЕ 04 1,38Е-02. 1,4Е-07 | 08

НАНІ8508Р2 20051 2,85Е205 7,89Е-03 2,77Е-08 поріВвнЯННЯ

Ізотипове контрольне 19051 1 МВ" МВ" МВ" МВ" антитіло " МВ вказує на те, що зв'язування не спостерігалося в поточних умовах експерименту.

Як показано в таблиці 5, при 25 "С всі моноклональні антитіла до І! ЕРЕ згідно з даним винаходом зв'язувалися з тії ЕРВ-ММН зі значеннями Ко, що знаходяться в діапазоні від 4,16

НМ до 179 нМ. Як показано в таблиці 6, при 37 "С всі моноклональні антитіла до І ЕРВ згідно з даним винаходом зв'язувалися з тії ЕРВ-ММН зі значеннями Ко, що знаходяться в діапазоні від 7,72 НМ до 261 НМ.

Таблиця 7

Параметри кінетики зв'язування антитіл до І ЕРА, що зв'язуються з ПІ ЕРВ-тЕс при 2570 . 100 нм

Рівень ' 1

Захоплене тАр | захоплення ЕВ у Ка ж Ка (1/с) Ко (М) А (хв.) тА (ЕС) 70) б/моль"с)

ММН (ЕС)

НАНІ7322Р2 17620,4 68,45Е04 1,14Е-04 | 1,77Е-09

НАНІ8437Р2 16951,1 1,02Е-05 5,38Е-04 | 5,27Е-09

НАНІ8439Р2 15550,2 4,87Е04 1.80Е-04 | 3,69Е-09

НАНІ8440Р2 16950,5 1,54Е05 6,82Е-05 | 4,43Е-10

НАНІ8457Р2 165:--0,8 4,91Е05 4,23Е-04 | 8,63Е-10

НАНІ8462Р2 17350,5. | 68 9,08Е04 2,96Е-04 | 3,26Е-09

НАНІ8464Р2 159-0,4 2,11Е:05 1.88Е-04 | 8,91Е-10

НАНІ8466Р2 160-0,2 3,97Е 04 492Е-04 | 1.19Е-08

НАНІ8508Р2 178520,4 2,21Е:-05 2,99Е-04 | 1,35Е-09 поріВвнЯННЯ

Ізотипове контрольне 17050,7 -2 МВ" МВ" МВ" МВ" антитіло "МВ вказує на те, що зв'язування не спостерігалося в поточних умовах експерименту.

Таблиця 8

Параметри кінетики зв'язування антитіл до І ЕРЕ, що зв'язуються з ПІ ЕРВА-тЕс при 37 "С

Рівень звязуван. СК х

Захоплене тАБр | захоплення ЕРА І М а Ка (1/с) Ко(М) 2 (хв.) тА (ЕС) | 0 бумольсо)

ММН (ЕС)

НАНІ7322Р2 21441,8 1,336: 105 4,А0Е-04 | 3,31Е-09

НАНІ8437Р2 202531,1 1.29Е-05 5,58Е-04 | 4,30Е-09

НАНІ8439Р2 17620,7 68,09Е04 9,23Е-04 1.51Е-08

НАНІ8440Р2 20041,4 2,12Е05 1,12Е-04 5,27Е-10

НАНІ8457Р2 19351 5,58ЕЕ05 7,04Е-04 1,27Е-09

НАНІ8462Р2 1962-0,9 1,28Е05 5,43Е-04 | 4,26Е-09

НАНІ8464Р2 18250,4 4,04Е05 5,17Е-04 1,28Е-09

НАНІ8466Р2 17951 5,87Е04 5,20Е-04 8,86Е-09

НАНІ8508Р2 19851 4,71Е05 1,02Е-ОЗ 2,16Е-09 поріВвнЯННЯ

Ізотипове контрольне 188:0,8 1 МВ" МВ" МВ" МВ" антитіло " МВ вказує на те, що зв'язування не спостерігалося в поточних умовах експерименту.

Як показано в таблиці 7, при 25 "С, всі моноклональні антитіла до ГЕРВ згідно з даним винаходом зв'язувалися з ПІ ЕРВ-тЕс зі значеннями Ко, що знаходяться в діапазоні від 443 пМ до 11,9 нМ. Як показано в таблиці 8, при 37 "С, всі моноклональні антитіла до ГЕРВЕ згідно з даним винаходом зв'язувалися з ПІ ЕРВ-тЕс зі значеннями Ко, що знаходяться в діапазоні від 527 ПМ до 15,1 нМ.

Таблиця 9

Параметри кінетики зв'язування могоклональних антитілдо ГЕРЕ, що зв'язуються з ті ЕРВ-ММН при 257С

Рівень зв'язуван Ка р

Захоплене тАбр | захоплення : ж Ка (1/с) Ко(м) | 172 (хв.)

ТАБ (ЕО) ті ЕРВ- (Т/моль"с)

ММН (ЕС) нані7згара | 176 177.0 | мВ | мв' | мВ | мВ / наніва37Р2 | 169 6 | 158Е04 | 4803 | 264Е07| 28 порівняння ше рез юр контрольне 169 -2 МВ" МВ" МВ" МВ" антитіло " МВ вказує на те, що зв'язування не спостерігалося в поточних умовах експерименту.

Таблиця 10

Параметри кінетики зв'язування антитіл до І ЕРЕ, що зв'язуються з ті ЕРВА-ММН при 37 7 рве Гек я

Захоплене тАбБ | захоплення уван. а, Ка (1/с) Ко (М) 1/2 (хв.)

ТАБ (ЕО) ті ЕРВ- (Т/моль"с)

ММН (ЕС) наніва37Р2 | 201 | 6 | 5Е04 | 193202 | 116Е06| 09

Я || | ж | ж | жі ж порівняння ше | рр контрольне 187 МВ" МВ" МВ" МВ" антитіло " МВ вказує на те, що зв'язування не спостерігалося в поточних умовах експерименту. х" ІС вказує на те, що зв'язування, яке спостерігається, було невизначеним і не могло відповідати даним відносно зв'язування в режимі реального часу в поточних умовах експерименту.

Як показано в таблиці 9, при 25 "С два з 9 моноклональних антитіл до І ЕРЕ згідно з даним винаходом зв'язувалися з ті ЕРВ-ММН зі значеннями Ко, що становлять 218 НМ і 264 нМ. Як показано в таблиці 10, при 37 "С два з 9 моноклональних антитіл до І! ЕРЕ згідно з даним винаходом зв'язувалися з ті ЕРВ-ММН зі значеннями Ко, що становлять 205 НМ і 1,16 мкМ.

Таблиця 11

Параметри кінетики зв'язування антитіл до І ЕРЕ, що зв'язуються з "ї ЕРВ-ММН при 2570

Рівень зв'язуван Ка Б

Захоплене тАБ | захоплення І ж Ка (1/с) Ко (М) 1/2 (хв.) тА (ЕО) П ЕРВ- (Т/моль"с)

ММН (ЕО онаніва37Р2 | ї169жб2 | 13 | 421Е:404 | ї138Е-02 | 32807 | 08 онаніва57Ра | 164505 | 18 | 283Е:404 | 206Е-02 | 730207 | 06 онанвабєРО | л16ох06 | 5 | 2иОЕноЯ | ї98Е-02 | 943Е07 | 06 порівняння ше зт рожі контрольне 170-0,2 -1 МВ" МВ" МВ" МВ" антитіло " МВ вказує на те, що зв'язування не спостерігалося в поточних умовах експерименту. " ІС вказує на те, що зв'язування, яке спостерігається, було невизначеним і не могло відповідати даним відносно зв'язування в режимі реального часу в поточних умовах експерименту.

Таблиця 12

Параметри кінетики зв'язування антитіл до І ЕРЕ, що зв'язуються з Пї ЕРВ-ММН при 37 "С . 100 нм 1

З Рівень зв'язуван. Ка А ахоплене тАБб | захоплення ж Ка (1/с) Ко (М) тА (ЕО) П ЕРВ- (Т/моль"с) (хв.)

ММН (ЕС) онані?7з322р2 | 212203 | 9 | 932Е:04 | 328Е02 | 352Е07| 04 снантва37Р2 20050 | ло | 3072304 | 19302 | б29Е07| 06 нанвазеРа 0 17550,8 | 0 | МмВ' | МмВ' | мв' | ме нанівяєорРа 020001 | 0 | МВ | МмВ' | мв' | ме снаніваввро 0 17740,7 | 6 | 326Е04 | 252Е02 | 7,71Е07| 05 порівняння ше фер жо контрольне 186-0,1 МВ" МВ" МВ" МВ" антитіло " МВ вказує на те, що зв'язування не спостерігалося в поточних умовах експерименту. " ІС вказує на те, що зв'язування, яке спостерігається, було невизначеним і не могло відповідати даним відносно зв'язування в режимі реального часу в поточних умовах експерименту.

Як показано в таблиці 11, при 25 "С п'ять з 9 моноклональних антитіл до ГЕРЕ згідно з даним винаходом зв'язувалися з "Її ЕРВ-ММН зі значеннями Ко, що знаходяться в діапазоні від

328 НМ до 943 НМ. Як показано в таблиці 12, при 37 "С п'ять з 9 моноклональних антитіл до

ГЕРЕ згідно з даним винаходом зв'язувалися з г ЕРВА-ММН зі значеннями Ко, що знаходяться в діапазоні від 168 нМ до 771 нМ.

Приклад 4. Антитіла до І ЕРВЕ згідно з даним винаходом не блокують зв'язування ПІ ЕРВ-пЕсС з лептином людини

Здатність моноклональних антитіл до ІЕРА згідно з даним винаходом блокувати зв'язування димерного ГЕРА людини з його природним лігандом, лептином людини, вимірювали з використанням конкурентного сендвіч-формату ЕГІ5А.

Для ЕПІБА лептин людини (Пі еріїпй; НО бувієтве, Мо за кат. 398-І Р-01М) наносили в концентрації, що становить 5 мкг/мл в РВ5 на 96-лунковий титраційний мікропланшет протягом ночі при 4 "С. Неспецифічні сайти зв'язування згодом блокували з використанням 0,595 (мас./об'єм.) розчину В5А в РВ5. Постійна кількість частини білка І ЕРЕ, позаклітинного домену, який експресували з С-кінцевою міткою Ес людини (ПІ ЕРА.НЕс; 5ЕО ІЮ МО: 92), що становить 10 нМ, титровали з антитілами до ГЕРВ, білком - лептином людини (Пі еріїп) або ізотиповим контрольним антитілом, що знаходяться в діапазоні від 8,5 пМ до 500 нМ в серійному розведенні. Ці комплекси антитіло-білок або білок-білок потім інкубували протягом 1,5 год. при кімнатній температурі (ВТ). Комплекси потім переносили в титраційні мікропланшети, що покриті лептином людини й інкубували протягом 2 годин при НТ, лунки відмивали та пов'язаний з планшетом ПІ ЕРАВ-пЕс виявляли за допомогою поліклонального антитіла до ДС. людини, кон'югованого з пероксидазою хрону (Часкбвоп ІттипоНевеатгси Іпс, Ме за кат. 109-035-098).

Зразки проявляли за допомогою розчину ТМВ (ВО Віозсіепсев, Мо за кат. 555214; субстрат АВ, що змішані у співвідношенні 1:1 згідно з інструкціям виробника) для одержання колориметричної реакції і потім нейтралізували за допомогою 1М сірчаної кислоти до вимірювання поглинання при 450 нм на пристрій для прочитання планшетів Місіог Х5. Аналіз даних проводили з використанням сигмоїдальної моделі залежності відповіді від дози в програмному забезпеченні Ргізт'"мМм (СтарипРай). Відсоток блокади при максимальній концентрації досліджуваного антитіла розраховували як показник здатності антитіл блокувати зв'язування 10 нМ ПІ ЕРВ-НЕс з лептином людини на планшеті. У розрахунку сигнал зв'язування 10 нМ пГЕРВ-НЕс без присутності антитіла називали 100 95 зв'язування або 0 95 блокування; і

Зо вихідний сигнал буфера окремо без присутності ПН ЕРАВ-НЕс називали 0 95 зв'язування або 100 95 блокування. Дані відносно блокування в концентрації 500 нМ антитіла узагальнено представлені в таблиці 13.

Таблиця 13

Визначене за допомогою ЕЇГ І5А блокування антитілами до ГЕРВ зв'язування ПІ ЕРВ-НЕс з лептином людини

Блокування антитілами в концентрації 500 нм

Антитіло зв'язування 10 нМ ПГЕРВ-НЕс з лептином людини (9о блокади) онанівязРа 11111118

Контроліо 711111

Лептитлюдини.д ///7777711111111111111Ї1111111111111111111189911111сСс1С

Антитілопорівнянняд //77777111111111111111Ї1111111111111111111199111111сСс1С

Як показано в таблиці 13, жодне з антитіл до ЕРА згідно з даним винаходом не продемонструвало» 4095 блокади зв'язування ПІ ЕРВ-пЕс з поверхнею, покритою лептином людини. Проте, антитіло порівняння та лептин людини, як позитивний контроль, були здатні блокувати 99 95 зв'язування ПІ ЕРВ-НЕс з поверхнею, покритою лептином людини. Ізотипове контрольне антитіло не продемонструвало вимірюваного блокування в концентраціях аж до 500

НМ.

Приклад 5. Визначене за допомогою аналізу ЕАС5 зв'язування з клітинами НЕК293/Мусх2-

НГЕРЕ (екто) -ОРІ (експресуючими ектодомен НІ ЕРЕ, що прикріплений за допомогою СРІ)

Лептиновий рецептор, ЕРА, являє собою однопрохідний трансмембранний рецептор сімейства цитокінових рецепторів | класу з великим, що становить 818 амінокислот в довжину, позаклітинним доменом (Тапацдіїа (1997) 9. Віої Спет 7:272(10):6093-6). ЕРА може зв'язуватися з лептином, білком, що переважно експресується жировою тканиною, який бере участь в регуляції споживання їжі та метаболізму (Егієдтап (2014 року) У Епдостіпої 223 (1): Т1- 8). Існують різні ізоформи ГЕРЕ, що дають розчинні або мембранозв'язані форми рецептора, і мембранозв'язані форми розрізняються за довжиною свого внутрішньоклітинного домену.

Ізоформа з найдовшим внутрішньоклітинним доменом у високому ступені експресується в гіпоталамусі, важливому сайті дії лептину відносно ожиріння (Егієдтап апа Наїагах (1998) Машге 395 (6704): 763-70). ЕРА локалізується переважно в протопластах і в меншому ступені на клітинній поверхні. І ЕРА піддається індукованій лігандом інтерналізації, додаючи додатковий рівень регуляції передачі сигналів лептину (Змеєпеу (2002) Сеї! Зідпаї! 14 (8): 655-63).

Для оцінки зв'язування з клітинами антитіл до ГЕРЕ згідно з даним винаходом створювали клітинну лінію НЕК293 для стабільної експресії позаклітинного домену ЕРА людини (ПІ ЕРВ; амінокислоти 22-839 з облікового номера Мо Р48357, ізоформа В) з М-кінцевою міткою тус-тус і

С-кінцевою пептидною послідовністю людської карбоксипептидази М, яка спрямовує додавання глікозилфосфатидилінозитолу (СІРІ) (Магсіс еї аї. (2000) У Віої Спет. 275 (21): 16110-8) так, щоб білок міг прикріпитися за допомогою СРІ до мембрани. Оскільки НГ ЕРЕ в клітинній лінії не має внутрішньоклітинного домену, він не інтерналізується при зв'язуванні ліганду, що значно збільшує кількість ГЕРВ, доступного для зв'язування антитіла та/або ліганду. Селекцію клітинної лінії проводили в ОМЕМ, що містить 10 95 ЕВ5, МЕАА, пеніцилін/стрептоміцин і 500 мкг/мл Сс418, потім сортували відносно високого рівня експресії рецептора з використанням антитіла до Мус.

Одержану в результаті стабільну клітинну лінію, яка названа НЕК29З/Л ЕРВ-ОРІ, підтримували в середовищі ОМЕМ, що містить 10 95 ЕВ5, МЕАА і пеніцилін/стрептоміцин.

Для аналізу ГАС5 вихідні клітини НЕК293 і клітини НЕК29З/ЛІ ЕРВ-СРІ відокремлювали та висівали на 9б-лункові планшети з м-подібним дном з щільністю, що становить 5х109 клітин/лунку в РВ5, що містить 295 ЕВ5 (буфер ЕАС5). Щоб перевірити, чи залежить присутність антитіл до ПІ ЕРА, що зв'язуються з клітинами, від наявності лептину, буфер ЕАСЗ5 з 1 мкМ лептину людини або без нього (НО бувієтв, Мо за кат. 398-І Р) інкубували з клітинами протягом 30 хвилин при 4 "С з наступним додаванням антитіл до ГЕРВ або контрольних антитіл в концентрації 10 нМ в буфері ЕАС5. Потім клітини інкубували протягом 30 хвилин при 4 "с, після чого промивали і потім інкубували з 16 мкг/мл кон'югованого вторинного антитіла АІеха

ЕРіного-647 (Часкбоп ІттипоНезеагсі І арогайогіев Іпс., Ме за кат. 109-547-003) протягом 30 хвилин при 4 "С. Потім клітини фіксували з використанням ВО Суїогіх "м (Весіоп БбісКіпзоп, Мо за кат. 554655), фільтрували і аналізували на проточному цитометрі НурегСуї (Весктап Сошпег).

Незабарвлені та вторинні контрольні антитіла окремо також досліджували для всіх клітинних ліній. Результати аналізували з використанням програм Еогесуї (ІпіейїСую і Ріомо версії 10, щоб визначити геометричні середні значення флуоресценції для життєздатних клітин. Середнє геометричне значення флуоресценції для кожного зразка потім нормалізували до середнього геометричного значення для незабарвлених клітин для одержання відносного зв'язування для кожної умови, що називається "відношення зв'язування", і ці відношення зв'язування заносили в таблицю 14 для кожного досліджуваного антитіла.

Як показано в таблиці 14, 9 антитіл до ГЕРВ згідно з даним винаходом, що досліджені в концентрації 10 НМ, продемонстрували зв'язування з клітинами НЕК29З/ЛІЕРВ-ОРІ з відношеннями зв'язування, що знаходяться в діапазоні від 824-кратного до 3187-кратного без лептину та від 398-кратного до 3590-кратного в присутності 1 мкМ лептину. На основі схожості цих відношень зв'язування здатність антитіл до І ЕРВ згідно з даним винаходом зв'язуватися з

ГЕРЕ, що експресований на клітинах, очевидно, суттєво не залежить від присутності надлишку лептину в концентрації 1 мкМ, що дозволяє припустити, що сайти зв'язування антитіл до ГЕРА на ГЕРВ не перекриваються з сайтами зв'язування лептину на ГЕРРЕ. Антитіла до І ЕРЕ згідно з даним винаходом не демонструвати будь-якого значного зв'язування з вихідними клітинами

НЕК293 з відношеннями зв'язування з 1 мкМ лептину та без нього, які знаходяться в діапазоні від 1 до 9-кратного. Зв'язування антитіла порівняння з клітинами, що експресують (РІ- прикріплений ІЕРА, було значно знижено в присутності лептину. Зразки ізотипового контрольного антитіла та вторинного антитіла окремо також не продемонстрували значного зв'язування з клітинною лінією ні з лептином, ні без нього, при цьому відношення зв'язування знаходилися в діапазоні від 1- до б-кратного.

Таблиця 14

Зв'язування антитіл до ГЕРВЕ в концентрації 10 нм з клітинами НЕК29З/1І ЕРВ-СОРІ і вихідними клітинами НЕК293 -/-1 мкМ лептину людини 222000 Днях ук няння кожної клітинної лінії 11111111 | Бездоданоголептину. | їмкМм | лептину: вихідні СІ СІ наніязааРа 77777777 77117371 719307 | 7176 1771317 нанівазеРа 77777777 Ї77111741111717171111715337 |1716 11711247

Антитілопорівнянняд | 77/61 29349 | З | 2 шт 1 1121 1 2 4

ЇДИ людини людини окремо

Іс миші окремо

Приклад б. Антитіла до ІГЕРА згідно з даним винаходом продемонстрували повне інгібування передачі сигналу лептину в присутності лептину людини

Розробляли біологічний аналіз для виявлення транскрипційної активації 5ТАТЗ за допомогою активації ГЕРЕ з використанням репортерної клітинної лінії, яка стабільно експресує повнорозмірний ЕРА людини (ПІ ЕРЕ; амінокислоти 1-1165 облікового номера МР 0022942) спільно з люоциферазним репортером (5ТАТЗ-Ї ис; Оіадеп, Мо за кат. СІ 5-60281І) в клітинній лінії

ІМА-32, клітинна лінія нейробластоми людини. Одержану стабільну клітинну лінію, яка називається ІМА-32/5ТАТЗ-Ї ис/ПЕРЕ, виділяли та підтримували в середовищі МЕМ-Еаїї, що доповнено 1095 ЕВ5, МЕАА, 1 мкг/мл пуроміцину, 100 мкг/мл гігроміцину В ї сумішшю пеніциліну/стрептомщину/! -глутаміну (повне середовище).

Одержаний біоаналіз використовували для вимірювання ефекту антитіл до І ЕРЕ згідно з даним винаходом на передачу сигналу ГЕРА в присутності та за відсутності лептину. Для біоаналізу клітини ІМА-32/5ТАТЗ-Ї ис/ПІ ЕРВ поміщали на планшет з щільністю 20000 клітин/100 мкл/лунка для 9б-лункового формату в повному середовищі і потім на наступний день середовище замінювали відповідним об'ємом середовища Орії-МЕМ, доповненим 1 95 В5А і 0,1 95 ЕВ5 (аналітичний буфер) протягом 30 хвилин. Для вимірювання дії антитіл згідно з даним винаходом за відсутності лептину антитіла до І ЕРЕ або ізотипове контрольне антитіло серійно розбавляли напівлогарифмічно до кінцевих концентрацій в діапазоні від 100 нМ до 300 ФМ в аналітичному буфері та потім додавали до клітин і потім інкубували протягом ночі при 37 "С в 5 956 СО». Для вимірювання дії антитіл згідно з даним винаходом в присутності лептину, до клітин додали фіксовану концентрацію лептину людини (Пі еріїп; НО бЗузіетв, Мо за кат. 398-І Р) в 200

ПМ в аналітичному буфері, після чого відразу ж додали антитіла до ЕРА або ізотипове контрольне антитіло, які напівлогарифмічно серійно розводили до кінцевих концентрацій в діапазоні від 100 нМ до 300 ФМ. Потім зразки інкубували протягом ночі при 37 "С в 5 95 СО».

Потім до зразків додавали реагент Опесіо (Рготеда, Мо за кат. ЕбОБ51) і вимірювали активність

Зо люциферази на зчитувальному пристрої Епмізвіоп МийШаріє Ріаїє Неадег (РежЖіп ЄЕІте?г) в люмінесцентному режимі. Одержували значення відносних світлових одиниць (НІ) і результати аналізували з використанням нелінійної регресії за допомогою програмного забезпечення СтарпРай Р'гізт (СтарпРад). Максимальне значення ВШ, що одержане з ефекту дози Пі ерііп, визначали як 100 95 активація в аналізі ІМА-32/5ТАТЗ-І С/Г ЕРВ.

Як показано в таблиці 15, за відсутності лептину людини досліджувані антитіла до ЕРА продемонстрували слабку стимуляцію клітин ІМА-32/5ТАТЗ-Іис/Л/ ЕРА з максимальною активацією від 4 95 до 8 95, відповідно, максимальна активація, що одержана з ефекту дози лептину людини. Одне антитіло зі слабкою стимуляцією характеризувалося значенням ЕСвхо 1,27 нМ, в той час як інше з антитіл, НАНІТ8440Р2, що не характеризувалося вимірюваним значенням ЕСво. У присутності 200 пМ лептину людини три з досліджуваних антитіл до І ЕРА продемонстрували повне інгібування лептину в клітинах ІМА-32/5ТАТЗ-ІГис/ЛІЕРВ «зі значеннями ІСзо, що знаходяться в діапазоні від 723 пМ (антитіло НА4НІ1Т8457Р2) до 1,83 НМ (антитіло Н4НІ17322Р2) або 2,9 нМ (антитіло Н4НІ18464Р2). Шість з досліджуваних антитіл до

ГЕРЕ не продемонстрували будь-якого вимірюваного інгібування в присутності 200 пМ лептину людини. Ізотипове контрольне антитіло не продемонструвало будь-якої вимірюваної стимуляції клітин ІМА-32/5ТАТЗ-Ї ис/ПІГ ЕРВ в будь-якому з аналізів.

Таблиця 15

Активація й інгібування ПІ ЕРВ антитілами до ГЕРВА 11111111 ДІМА-З2ЛЕРВ без лептину людини ПМА-З2/. ЕРА з 200 пМ лептину людини! нані7з2ар2 1 1272-09 | -( 8 | 183209 | щ-- ло нанівавяєР2 1 1ЗОЕЛО | 6 | 296097 | Юлю х М/А позначає відсутність вимірюваного інгібування та/або активації в аналізі х|С позначає невизначений результат, який полягає в тому, що обчислене значення ЕСво не могло бути визначено.

Приклад 7. Досліджувана за допомогою Осієї перехресна конкуренція між різними моноклональними антитіламидо ЕРА

Конкуренцію зв'язування між панеллю різних моноклональних антитіл до ГЕРЕ визначали з використанням аналізу інтерферометри біошару без міток в реальному часі на біосенсорній платформі Осієї НТУ (Раї! ЕопевВіо Согр.). Весь експеримент проводили при 25 "С в буфері, що містить 10 мМ НЕРЕБ, 150 мМ Масі, З мМ ЕОТА ії 0,05 95 об'єм./об'єм. поверхнево-активної речовини Тугеєп-20, 1 мг/мл ВЗА, рН 7,4 (НВ5-ЕВТ) зі струшуванням планшета зі швидкістю, що становить 1000 об./хв.

Для оцінки того, чи здатні два антитіла конкурувати один з одним за зв'язування з рекомбінантним ЕРА людини, що експресований з С-кінцевою тус-тус-гексагістидиновою міткою (ПГЕРА.ММН; 5ЕО І: 90), приблизно 0,25 нМ ПНГЕРВ-ММН спочатку захоплювали на наконечниках біосенсора Осієї, покритих антитілами до пентагістидинової мітки (Ропебріо Іпс, Мо

Зо за кат. 18-5122), шляхом занурення наконечників біоссенсора протягом 5 хвилин у лунки, що містять 20 мкг/мл ПІ ЕРАВ-ММН. Наконечники біосенсора із захопленим антигеном потім насичували першим моноклональним антитілом до ГЕРЕ (яке потім називають тАбБ-1) шляхом занурення в лунки, що містять 50 мкг/мл розчину тАр-1, протягом 210 секунд. Потім наконечники біосенсора послідовно занурювали в лунки, що містять 50 мкг/мл розчину другого моноклонального антитіла до ГЕРА (яке потім називають тАр-2) на 150 секунд. Наконечники біосенсора відмивали в буфері НВО-ЕВТ між кожною стадією експерименту. Відповідь зв'язування в режимі реального часу піддавали моніторингу протягом всього експерименту та відповідь зв'язування в кінці кожної стадії реєстрували. Відповідь зв'язування тАбБ-2 з ПІ ЕРВ-

ММН, яка попередньо утворила комплекс з тАБр-1ї, порівнювали та визначали конкурентну/неконкурентну поведінку різних моноклональних антитіл до ГЕРЕ, як показано в таблиці 16.

Таблиця 16

Перехресна конкуренція між моноклональними антитілами до! ЕРА захопленим П'ЕРА-ММН конкурує з тАбБ-1

НаАНІТ8462Р2

НА4НІТ8437Р2

НанНІТ8457Р2 НанНІ8466Р2

НаАНІТ8508Р2

НаАНІТ8457Р2

НанНІТ8462Р2 НА4НІТ8437Р2

НаАНІ8466Р2

НаАНІТ8457Р2

НаАНІТ8437Р2 НаАНІТ8462Р2

НаАНІ8466Р2

НаАНІТ8457Р2

НаАНІТ8466Р2 НаАНІТ8462Р2

НАНІ8437Р2

Як показано в таблиці 16, антитіла Н4АНІ18439Р2 і Н4НІ18440Р2 конкурують один з одним за зв'язування зі своїми відповідними епітопами. Антитіла ЕРА НАНІТ8457Р2, Н4АНІ18462Р2,

НАНІТ8437Р2, Н4НІ18466Р2 і Н4.НІ18508Р2 конкурують один з одним за зв'язування зі своїми відповідними епітопами. Антитіла НАНІ17322Р2 і Н4НІ18464Р2 не конкурують за зв'язування з відповідними епітопами НА4НІ1Т8439Р2, Н4АНІ1Т8440Р2, Н4НІ18457Р2, Н4НІ18462Р2, НАНІ18437Р2 і

Нан18466Р2.

Приклад 8. Іп мімо випробування ефективності антагоністичних антитіл ЕРА у гуманізованих відносно ЕРА мишей

Ефекти трьох конкретних антагоністичних антитіл до ЕРА згідно з даним винаходом,

НаАнНІТ7322Р2, НАНІ18457Р2 і Н4Н1І18464Р2, на споживання їжі, масу тіла і ожиріння визначали у поміщених в клітини по одному, генетично сконструйованих І ЕРВНчУНи мишей, які експресують лептиновий рецептор, який складається з послідовності ектодомена ЕРА людини замість послідовності ектодомена І ЕРЕ миші.

Початкове добове споживання їжі вимірювали між 5 днем і 1 днем до початку лікування (дні -5 і -1). За чотири дні до лікування і через 6 днів після лікування (дні -4 і -6) склад тканин тіла, включаючи в себе ожиріння, кількісно визначали за допомогою мікрокомп'ютерної томографії. В день 0 32 самця І ЕРАНиНи мишей віком від 12 до 13 тижнів рандомізували на чотири групи по 8 мишей на основі маси тіла за 1 день до лікування (день -1). В день 0 кожна група отримувала за допомогою підшкірної ін'єкції одноразову дозу одного з наступного: доза ізотипового контрольного антитіла, що становила 30 мг/кг, Н4АН17322Р2, що складала 30 мг/кг, НАНІ18457 Р, що становила 30 мг/кг, або Н4Н18464Р2, що становила 30 мг/кг. Ізотипове контрольне антитіло не зв'язується з будь-яким відомим мишачим білком. Споживання їжі та масу тіла вимірювали протягом тривалості дослідження для кожної тварини. На фігурі 1 узагальнено представлена відсоткова зміна споживання їжі від середнього вихідного добового споживання їжі для кожної групи лікування в кожний момент часу. Відсоткова зміна маси тіла з дня 0 розраховували для

Зо кожної тварини в кожний момент часу. На фігурі 2 узагальнено представлена середня відсоткова зміна маси тіла для тварин у кожній групі лікування. На фігурі З узагальнено представлена середня маса жирової тканини для тварин у кожній групі лікування за допомогою антитіла, яка кількісно визначена за допомогою мікрокомп'ютерної томографії за 6 днів до і через 6 днів після лікування за допомогою антитіла. Всі результати виражені як середнє х 5ЕМ.

Як показано на фігурах 1 і 2, миші, які отримали лікування за допомогою антагоністичних антитіл до ГЕРЕ, продемонстрували збільшення відсоткової зміни споживання їжі та відсоткової зміни маси тіла. Це збільшення не спостерігали у випадку лікування за допомогою ізотипового контрольного антитіла. Як показано на фігурі 1, миші, які отримали лікування за допомогою

Н4іН1І7322Р2 в дозі 30 мг/кг, проявляли значне збільшення споживання їжі, починаючи з першого дня після лікування (день 1) і в наступні моменти часу в порівнянні з мишами, яким вводили ін'єкцію ізотипового контрольного антитіла. Миші, які отримали лікування за допомогою

Н4аАН1І8457Р2 в дозі 30 мг/кг, проявляли значне збільшення споживання їжі, починаючи з дня 2 і в наступні моменти часу в порівнянні з мишами, яким вводили ін'єкцію ізотипового контрольного антитіла. Миші, які отримали лікування за допомогою НАНІ18464Р2 в дозі 30 мг/кг, проявляли значне збільшення споживання їжі, починаючи з дня 2 і в наступні моменти часу, але не в день 4, в порівнянні з мишами, яким вводили ін'єкцію ізотипового контрольного антитіла. Як показано на фігурі 2, миші, які отримали лікування за допомогою Н4НІТ7322РА в дозі 30 мг/кг, проявляли значне збільшення відсоткової зміни маси тіла, починаючи з 4 днів після лікування (день 4) і в наступні моменти часу в порівнянні з мишами, яким вводили ін'єкцію ізотипового контрольного антитіла. Миші, які отримали лікування за допомогою Н4НІ18457Р2 в дозі 30 мг/кг, проявляли значне збільшення відсоткової зміни маси тіла, починаючи з дня З і в наступні моменти часу в порівнянні з мишами, яким вводили ін'єкцію ізотипового контрольного антитіла. Миші, які отримали лікування за допомогою НАНІ18464Р2 в дозі 30 мг/кг, проявляли значне збільшення відсоткової зміни маси тіла, починаючи з дня 4 і в наступні моменти часу в порівнянні з мишами, яким вводили ін'єкцію ізотипового контрольного антитіла. Як показано на фігурі З, відсутні відмінності в масі жирової тканини між групами до лікування (день -4). Миші, які отримали лікування за допомогою антитіла Н4Н17322Р2, Н4НІ8457Р2 і Н4НІ8464Р2 в дозі 30 мг/кг, продемонстрували значне збільшення маси жирової тканини через 6 днів після лікування (день 6) в порівнянні з ізотиповим контрольним антитілом. На закінчення, лікування за допомогою антагоністичного антитіла ЕРА, але не ізотипового контрольного антитіла, збільшувало споживання їжі, масу тіла і ожиріння у мишей.

Приклад 9. Визначення епітопів | ЕРА людини, з якими зв'язуються антитіла до І ЕРЕ згідно з даним винаходом

Для визначення епітопу ГЕРВ людини, з яким зв'язуються антитіла до І ЕРВ згідно з даним винаходом, використовували аналіз на основі проточної цитометрії Гитіпех Р'ЕХМАР (ЕМЗ00О, итіпехСогр) для характеристики взаємодії антитіл до ЕРА з рекомбінантними білковими

Зо доменами ЕРА людини. Для аналізу приблизно З мільйони карбоксильованих мікросфер

Місторіех В (І штіпех, Мо за кат. І С1000А) промивали, струшували і обробляли ультразвуком в 0,1 М МаРох», рн 6,2 (буфер для активації), потім центрифугували для видалення супернатанта.

Мікросфери ресуспендували в 120 мкл буфера для активації і карбоксилатні групи (-СООН) активували додаванням 15 мкл 50 мг/мл М-гідроксисукциніміду (МН, Тпепто 5сіепійіс, Мо за кат. 24500) З подальшим додаванням 15 мкл 50 мг/мл 1-етил-3-|3- диметиламінопропіл|карбодиїміду (ЕОС, Тнептовбсієпійіс, кат. Мо 22980) при 25 "С. Через 10 хвилин рН реакції знижували до 5,0 з додаванням 600 мкл 50 ММ МЕ5, рН 5 (буфер для зв'язування), і мікросфери струшували та центрифугували для видалення супернатанта.

Активовані мікросфери негайно змішували з 500 мкл 20 мкг/мл моноклональних антитіл до тус з ДС миші або Ід; людини в буфері для зв'язування й інкубували протягом двох годин при 25"С. Реакцію зв'язування гасили додаванням 50 мкл 1 М трис-НСІ, рН 8,0, і мікросфери швидко струшували, центрифугировали та промивали чотири рази за допомогою 1 мл ОРВ5 для видалення незв'язаних білків й інших компонентів реакції.

Транзієнтно експресовані білюи ЕРА, що включають в себе позаклітинний домен ЕРА людини, експресований з С-кінцевою тус-тус-гексагістидиновою міткою (ГЕРА-ММН людини,

ЗБЕО 10 МО: 89), (01) СВНІ ГЕРА людини, експресований з С-кінцевою тус-тус- гексагістидиновою міткою ((01)-ММН СВНІ ГЕРЕ людини, амінокислоти 1-208 згідно з БЕО ІЮ

МО: 89 з тус-тус-гексагістидиновою міткою, амінокислоти 209-236), домен (01, 02) СВНІ Г ЕРА людини, експресований з С-кінцевою тус-тус-гексагістидиновою міткою (01, 02)-ММН СЕАНІ1

БО ГЕРВ людини, амінокислоти 1-318 згідно з ФЕО ІЮ МО: 89 з тус-тус-гексагістидиновою міткою, амінокислоти 319-346), домен (01, 02, 03) СВНІ-Ід4 ГЕРВ людини, експресований з С-кінцневою тус-тус-гексагістидиновою міткою ((01, 02, 03)-ММН СВНІ ГЕРВ людини, амінокислоти 1-278 згідно з ФЕО ІЮ МО: 89 з тус-тус-гексагістидиновою міткою, амінокислоти 279-306), домен (02, 03) САНІ-Ід ГЕРА людини, експресований з С-кінцевою тус-тус-гексагістидиновою міткою (02, 03)-ММН СВАНІ-1Ід І ЕРЕ людини, амінокислоти 1-198 згідно з ФЕО ІЮО МО: 89 з тус-тус- гексагістидиновою міткою, амінокислоти 199-226), домен (03) Ід ГЕРА людини, експресований з

С-кінцевою Іпус-тус-гексагістидиновою міткою ((03)-ММН Ід ГЕРЕ людини, амінокислоти 1-88 згідно з ФЕО ІЮ МО: 89 з тус-тус-гексагістидиновою міткою, амінокислоти 89-116), домен САН2

ГЕРА людини, експресований з С-кінцевою тус-тус-гексагістидиновою міткою (СВН2-ММН 60 ГЕРВ людини, амінокислоти 1-207 згідно з ФЕО ІЮ МО: 89 з тус-тус-гексагістидиновою міткою,

амінокислоти 208-235), домен ЕМП ЕРА людини, експресований з С-кінцевою тус-тус- гексагістидиновою міткою (ЕМПІ- ММН ГЕРЕ людини, амінокислоти 1-204 згідно з ФБЕО ІЮ МО: 89 з тус-тус-гексагістидиновою міткою, амінокислоти 205-232), і домен І4-СВН2-ЕМІ ГЕРА людини, експресований з С-кінцевою тус-тус-гексагістидиновою міткою (Ід9-СВН2-ЕМП-ММН

ГЕРВ людини, амінокислоти 1-510 згідно з ФЕО ІЮ МО: 89 з тус-тус-гексагістидиновою міткою, амінокислоти 511-538), суспендували в безсироватковому середовищі СНО-5-5ЕМ ІІ (Тнетто

ЕРізпег, Мо за кат. 31033020) і потім освітлювали центрифугуванням. Аліквоти мікросфер з іммобілізованими моноклональними антитілами до тус, що одержані, як описано вище, додавали окремо до 1 мл кожного з цих білкових супернатантів. Мікросфери обережно перемішували, інкубували протягом двох годин при 25 "С, двічі відмивали за допомогою 1 мл

ОВРБ, центрифугували для видалення супернатанта і, нарешті, ресуспендували в 1 мл буфера

ОРВ5. 48 мкл мікросфер, зв'язаних з ЇдСї до тус, з окремих реакцій з повнорозмірним ЕРА людини та з кожним з білків домену І ЕРЕ людини відбирали і змішували разом в 3,6 мл РВ54-20 мг/мл В5А--0,05 95 азиду натрію (блокуючий буфер).

З цього змішаного пулу 75 мкл мікросфер висівали на лунку на 96-лунковий фільтруючий планшет (Мійроге, номер за каталогом: МОВММ1250) і змішували з 25 мкл окремих моноклональних антитіл до ЕРА людини (0,5 або 5 мкг/мл), інкубували протягом двох годин при 25 "С і потім двічі відмивали за допомогою 200 мкл ОРВ5 з 0,05 95 Туеєп 20 (відмивочний буфер). Для виявлення та кількісного визначення кількості вмісту антитіл до І ЕРРВ, які зв'язані з окремими мікросферами, або 100 мкл 2,5 мкг/мл кон'югованого з В-фікоеритрином козячого

Кабр)2 антитіла до каппа-ланцюга людини (ЗоціїНетгп Віоїеси, Мо за кат. 2063-09) в блокируючому буфері, або 100 мкл 1,25 мкг/мл кон'югованого з В-фікоеритрином (аб) АНіпіРите в блокируючому буфері, або 100 мкл 1,25 мкг/мл кон'югованого з В-фікоеритрином Е(ар)2 фрагмента АпйіпіРите козячого антитіла до Ід миші, специфічного відносно Е(аб)2 фрагмента (Часквоп Іттипогезеагсі, Мо за кат. 115-116-072) в блокуючому буфері, додавали й інкубували протягом 30 хвилин при 25 "С. Через 30 хвилин зразки відмивали двічі за допомогою 200 мкл відмивочного буфера та ресуспендували в 150 мкл відмивочного буфера. Медіанну інтенсивність флуоресценції (МЕ) мікросфер вимірювали в аналізаторі І итіпех.

Результати аналізу на основі І Штіпех зведені в таблицю 17. Інтенсивності сигналу МРЕЇ

Гитіпех вказують на те, що дев'ять антитіл до І ЕРЕ згідно з даним винаходом зв'язувалися з повним позаклітинним доменом І ЕРА людини. Антитіла до І ЕРА, Ні4Н18439Р2 і Н4НІ18440Р2, зв'язувалися з епітопами в межах домену 02 СВНІ ГЕРА людини. Антитіла до ГЕРЕ,

НанІ7322Р2 і СОМРЗ551, що зв'язані з епітопами в межах домену СВН2 ГЕРА людини.

Антитіла до ГЕРВ, Н4А4Н8В437Р2, Н4АНІ8457Р2, Н4АНІ8508Р2, НАНІ8466Р2 і Н4аАНІ18462Р2, зв'язувалися з епітопами в межах домену ЕМП ЕРА людини. Антитіло до ЕРА, НАНІ18464Р2, зв'язувалося з епітопами в межах домену Ід (03) ГЕРЕ людини.

Таблиця 17

Одержаний за допомогою І итіпех сигнал МРЕЇ зв'язування антитіл до ГЕРА з повнорозмірним позаклітинним доменом І ЕРВ людини та виділеними доменами І ЕРВ людини, які мічені міткою тус с Повно- Можли-

ВНІ-І9 ІД- розм. лм

Антитіло тв (в ог) (01,02, (203, (03) сво |РМИ САНО-| поза- зува. " 03) " ЕМІЇЇ клітин, ННЯ домен онаніва4оР2 | 8 (19337) 8245 | 9165 | 14 | 17 | 10 | 32 | 7035 |(Свнт г онантвав2Р2 615 | 665 | 461 | 25 |л10| 8 )/|229|11153| з6і0 | єм

Таблиця 17

Одержаний за допомогою І итіпех сигнал МРЕЇ зв'язування антитіл до ГЕРА з повнорозмірним позаклітинним доменом І ЕРВ людини та виділеними доменами І ЕРВ людини, які мічені міткою тус порівняння х Антитіло, що досліджується в концентрації 0,5 мкг/мл замість 5 мкг/мл.

Обсяг даного винаходу не обмежений конкретними варіантами здійснення, що описані в даному документі. Дійсно, різні модифікації згідно з даним винаходом в доповнення до описаних у даному документі стануть очевидними фахівцям у даній галузі техніки з попереднього опису та доданих фігур. Мається на увазі, що такі модифікації підпадають під обсяг формули винаходу, яка додається.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 Невепегоп Реаптасеніїсвів, Іс.

Сголтана, Зезрег

ЗЕечіє, Рапауютіе

АнНагетюз, ЛИЙ «120» Антигензв'язуючі белки, які проявляють антагонізм відносно лептинового рецептора «1305 ЦО ЦАУОСІ «15 ТВО «141» 2017-11-05 «150х 62410052 «151 2085-11-08 «18502 55 «1» Раїептів версія 3.5 чаї» 1 «911» 378 «217» МА «13» Штучна послілевність «Аа «й» синтетична «НИЗ і1 савстЕсаисідсареасісверсссявва сіреісвавссМНсекарасссірдісссіє 50 ассідсаств КІСіБвівс сін татсавс авіавісвИ МТасЕЕЕвЕ сіЕнаїссвс 19 савссссгад вЕаавевісі прарійсай досевівісі ВИ агарівс дваїасстає 156 тасваєссєві сссіссзвав і сривЕсСЯсс вія ссвізв асасвіссве вБаяісавис 0 240 їесієваксівавсі Ві Бассвосдсв васасивстн ві тв івсЕВрасає 0 ЗО сИпВіванНа сн сЕвЕв асп тісрісвавовні те Вата івврви ссвареваса ЗО агервісвссв КС Нса ЗуУк «230 8 «31» 125 «12» РЕТ «3135 Штучна пежлідовність «а «вага» сантетична «Ще а бізвієс бівіви іп сію бег Оу го Су іеи Маг ух Рго Зет 3іц 1 З 10 15

ТНгівц Зегівц Пн Су5 ТВг Уві Зег Су Аа 5ег Не Зег зер бег 7а 25 ЗО

Ага Ве тТуг СУ Сх То Ме Ага іп го Рто біу і тує сіу фе

Тер Не бух Азо Це Туг Ту Зег біу Аг ТНК Тут Тут Демо Рго бер во

Іеш сій 5Зехт Аге ув! ТВ Пе Зег Уа! Ар ТНЕ бег уз Акп бій РНе 655 7а ув що

Зерівеціучі ви бєеї зег Уві Ту Ага Аа Ахо Пи Ав Ма! Тує Туг 8 во а

Суз Дів Аге Нізіви Ме Ме Ту БНесіу іх в ец Ме уві сін ту ще 5 па рве хр Пе То Ту іп Ту ТЕ Ме маї ТНе Уді бег бег 115 120 125 «310» З «21їз За «таз ЩА «еі3У ПП тучна послідовність «вах «ваЗ» синтетична «цю 3

ЕБТНЄСТСВВ ісярдсавіад са НТ ас За «Ах 4 «І 10 «В1Зх РТ «еІї3» Штучна послідовність «т» «ах» сентетична «ие 4 іх Дія Бех Це бег бег бег Ага РНе Тут 1 З 10 «10» 5 «її» 21 «12» МА кі» Штучна послідовність се «гаї» сянтетична «ще 5 ас тайага єгрввааіасг 21 «а В «11х Я «12 РТ

«913» Штучна послідовність «Ва «Вайх синтетична «85 Б

Пе Туг Туг ет Бім Ав ТП 1 2 «8105 7 «8115 54 «12» МА «Д1і3х Штучна послідовність «Яд» «252 сянтетична «00

Есвавасаєс Пагванас ЕЕ рЕВа СП ВІСБІСЕ ЕВ ва ЇВ Ба «Ії» В «211 185 «212» РНТ «913» Штучна послідовність «аз «23» синтетична «ще 8

АВ Аге Нізїец Меї Пе Тр Ре сік біу ен Пе Уді бін сту Рве 1 з 10 15

Ар Не «2105 З «11з 324 «212 МА «2135 Штучна послідовність «а «832 синтетична «до» 8

Басаїссарва ївасссарісіссвіссісс стві ЕсВі сідізЕвара саравісаєс БО аісасцесс вЕЕсгзавісе вавсацавс арстаййтза айсвовіса всзвваацсся 120

ЄБнааанссоссізавсіссівнісатвсівстіссади грозазвівс ввіссснісі ЗО акЕнсавіє дсавіввац іБЕБасзвя і Нсасі са ссаісавсво МТЕсанс 380

БавЕВЕНіІв садсійоасіа сірісласар авіїасавіа ссссіссват сасспсвиє ОЗ сдаковасає васівсада! їаза з «2105 10

А

«М ОВ «212» РНТ «із» ННучна послідовність «ЗІ» «егй» синтетична «0» 10

Азо Ме біт Ме Пн іп бег Рго 5ег бегівео бег Аа Бет Ма! іх 1 З то 15

Ар ге Уві Пт Не Тпг Су Ате Дів Зег бів Зег Це бе бе Туг 20 а Зо іей Ази Тер Тут іп біпіує Рго біу ух діа го узівціви Не

З5 30 Я

Туг Авіа Дід бег Зегівн віп Зег Су Уві Рго бег Аг РБебег С за 55 ща ет ому его ТП А5о Ре Пк ієец ТЕ Пе зегЗегівц бів рго я 5 0 бів Ахо ЕНе бів Те тує Туг Су іп бів бет Туг зе Ту Рто Рго 85 зо 5

ПетбеРВе сія сів су ТВг Ат вен бів Не ув о ць «а її «211» 15 «212» ЧА «213» Штучна послідовність «ва» «й синтетична «ще її савврсаєарсавнаї їх «ен 12 «РЕ» Б «212» РН «13» Штучна послідовність «ка» «23 синтетична «що 12 сіп Бех Не бег Зег Тут 1 5 «ЕН 13 каіїїх З «Різ» МА «їз» Штучна послідонність «ла «дах» синтетична «Вп 13 всдсаКс і; «го» 14 «112 3 «8122 ВНТ «213» Штучна послідовність «20» «223» синтетична «аю 14

Дів Дід Зег 3 кір» 15 «вії» ЗО «12» ЩА «і3» Пітучна послідовність сей «23» синтетична

«ие 15 савсававії асарідс сс іссватсаєє З «20 16 «2115 1 «ій» РЕ «213» Штучна тилідонність «га» «ай» синтетична «це 16 св іп зег Тук Зекг Тог Рго Рго Ме Тбг 1 З 10 ка 17 «211» За «19» ОМА «135 Штучна послідовність «КМ «ага х синтетична «щи 17 сакеінсасіввіЕваВіІСсідЕнрЕавес БІНвіссавссівввадніссствавасіє 50 1ССТВЕБсСав соте гасцісавЕ авсіаєврсв ссвсіввеєссвсосависї 32

«саБЕСсВавЕ ресів астЕ ЕЕЇСЕсВвИ агаїсвінів агреазніаа базатастаї 180 дсавасіссв дааЕрЕсон Висассаісіссадараєсав айссванна сасрсімає 240 сідсавніра асарссірав арсіварвас асрЕсівтні анасіютрсвававвйста З

МІНЕЕаЕЕеЕНнаїса сві ЕвЕс ві іРЕКвссаавеБассасЕВІСассВвіС 0 ЗБ їссвса зо «10» 18 «211» 122 «312» РТ «135 Штучна послідовність «й «ай» синтетична «МЮ» 18 с Уві Сіпісн Уві сну бег ім Зіу сту Уві Ма! бів Рко су те 1 5 тд 15

Зегіви Агтвіви Бек уз Аа із зе Су РБе Ту Рне бач зег Тут 5 за хж Не Ніє Ттр Уві Ага сів Аа Рго зі і ух біу вч о то уд! ла 45 діа ма Пе Зег Туг Азо Оу Доп Азп уз Тут Туг Ав Абр зе уд! з Бо і ув іу Апи Ре ТВ Пе 5ег Ага Або Аза Зегіух Дал Пгівгв ТУуг во 70 72 и іги іп МеєАзпобегівн Ате Аів Оіц Ар Тег Аа Уві Тут Тут Сує во «а а5

Аізіу«Азрвіву РНеїгви бій Тр гени Ре Ні Сіу Ме ої Уаїттр що 105 1

От бів Оу ТЕ Тв Ма! ТБ Уа! Хет бе 135 120 «10» 19 «812з ЩА «їз» Штучна послідовність «2 «3» синтетична «В» 19

ЕЕВИ Сас Єсядіавсіа Їсес А

«ам «ії» В «212» РТ «2135 Штучна послідовність «А» «га» синтетична «ДО» о су вне Тік РНе Зег Заг Тут Сіу ї а «аа 21 «11 й «212з МА «13» Штучна послідовність «аа «ва3» синтетична «Ой» 21 втдЕсаїатіс вісдаааїтна їаая 4 «НІ» 25 «вії» 8 «12» РТ «213» Штучна послідевність

«ех «ай» синтетична «ЩЮ»

Ме зЗет тТуг Ар Бу за Аз і ув 1 З «05 23 «21їх 45 «12 МА «13» Штучна послідовність «г2дх «вай синтетична «щю 23 вБсеЗазрвіс сані тЕва БТЕНН Я сасЕЕТВТЕв всвіЄ 45 «Оз 24 «ії» 15 «гі2з ВТ «213» (течна послідовність «г2дх «ах» синтетична «ЮА

Аівіуч«Азвіви Рреївци с Пріги Рле Ні Су Ме сту Ма

1 5 15 15 «й1оз 5 «ії» 37 «ій» ВМЧА «іх» Штучна послідовність «Ах «вий» синтетична «АЮ» 35 савсівсавстдсзвванісвЕЕсссвЕна сбзвідаавс спвдрдаквасссівносю БО ассівсап р Сів вірЕ свасвісвссавіавіарій айрсісвва сідраєїссвс ОО сардсссссзе ЕБаспрЕЕсіЕраріввай вЕнавіаісі с нізіавідк падсассави ЗВО їасавсссрі сссісваран КК Еавісвсабзіссайтає асасріссза вадссавіїс 890 їсссіБаарсідавВі ві Бассвосвса висисЕвсТв ПП айасівівсваваняа КО

Маса сасвнісзававватає пра вв Ессавев аассстЕніс ОО вссвістссі са 372 сао» 26 «вії» 174 «2122 РТ «213 Штучна послідовність кагох «йЗ»х синтетична «ВІ ав

Оівівнюпіви бій ін Зег Оу Рго біхівец Уві ух Бго бета і 2 10 15

ТВгівнЗегівн ТНг Сує Це Уві Бех бі біу Або Пе Ту бек бег за аз 30

Баг Тут Туг Тгр Ап Тр Ме Аге бів Різ Рго Зіу у Біківи Сі 35 й 45

Тто Не су Ди Пе Тут Туг бе біс ет ТП Ал Туг Аа Різ зе щі З що іеніузбегАге Уа! Пн ее ет Пе Абр Тег бегіух бег бій ВНе бо КО В 8

Зекієцніфз ви АгЕ ет Уа Пт Ав Ав Або Пп Аа Ма Гук Гук

ЗО 5

Суз Аа Атвіецієц Аг Туг Ре Дер Ігр Зегі ух Сх Тугівєц Ар що 3105 ії

ТугТтр бік бів Оу Твгіео Уа! Те Уві ет бег 115 120 «2305 57 «11» 30 «212» ВМА «213» Штучна послідовність «Ох «ва8» синтетична «А» 27

ЕВІЕЕСваса бсассаніве яр ага 30 кщі1ох 28 «2115 «їх» РЕТ «аі5» Штучна послідовність «аа «свй» сентетична сі су Авр Пе Тр берег бе Туг Тут 1 5 ІП «2310» 28

«23» 21 «212» МА -213»5 Штучна послідовність «вий» «ВЗ» сентетична «ВО» га

ВстаНнагзвірраяавсвсс і «гід» 30 «2115 7 «215» РТ «із» Штучна послідовність «ау» ка» синтетична «ВО» ЗО

Ве Тук Туг бег іх Заг ТВ 1 2 «23105 31 «21ї1з 48 «2122 ВМА «213» Штучна послідовність «АІдх «айа» синтетична

«що ді воваванатідсваєат насе БІса аапревіасс ПЕастає ча «Аз 32 «а 16 «12» ЕТ «213 Штучна послідовність «ай «вай» синтетична «Із 82

АїшАтієеніви АгЕ Туг РНе Яр ТП» бегіух Біу Тугієи Азр Тут 1 з 10 15 «вх 33 «1» ЗБ «та» ВОВНА «2ї3з Штучна послідовність «ву» «аа» сянтетична «з 33 савЕтвсавсівсісвавісісвродасес асврвісвавссївсадивісссірадасіс 0 ісстієсне ссісівваії сасс у сасі васбиніаівівавєівваї ссвосавиої 1920 ссакевааее вітрсавіс ванісасає вітав та сіврівасассатабаєтає 180 всевасів гЕВарЕнсся віїсассаіс іссаринисв асрссяарав Псасівтяї 70

Ненаавіва зсоадасірар здасраррасасряссвіаі анасіасвадарацак /-З00 тодеаїВіїв астарізав візснрівів васвісірев дссварвваг сасввіснос 0 ЗБО дісіосієв 353 «е» З «з 123 «212 ВАГ «213» Штучна послідовність «ВЕ «вай» синтетична «аю За сів ув сілієн У Сію зе СУ СНУ СНУ МТ Уа уз Рго біжу у 1 5 1б 15

Зегівєюн Аг ви бег Суз Аа Дів баг у РНе ТП РВе бе Азро Туг за 25 за

Ту Меї ет То Не Ат Зіп Аа Рг січ 1 ух бімівн он гр Не аз ек Ні Не Зет Че ТБг бу Хек Те Не Тух Тут Ав Ахо ех Уві - З Бо

Гу су Дте Ре ТВ Не 5ег Аг Азо Ап Аа і уз Ап Зегі ви Туг 55 й 75 я ів Бі Мег Ап Агві ен Але Ар ін бю Ту дів Уві Тег Ту Суб щі ча

Тк Ага Абрізіц Рго Авр Пе Увії ву Мі Ате тугу Меї Ар Уа 1 105 1

Тр біу біп су Те ТВг Уа! Те Уві бег 5ег 115 120 «210» 35 «1» 74 «212» ОМА «813» Штучна послідовність «аа» «в» синтетична «а» 35

БЕНСВОСЇ бсевіваств ст ей

«а зо «211» В «21аз ВНТ «213» ШНучна послідовність сао» «ЯЗ» синтетична «а» 35 сСіу Ре Пг Ре зех А5р Тук Туг ї Ко «10» 3 «511» 24 «212 ОМА «гії» КНучна послідовність сег «33» синтетична «ЩЕ: 37 аЧавіана стветавсас саів за «10» ЗВ «і» 8 «213» ВНТ «213» Штучна послідовність

«иа «вай» синтетична «а» Зк

Пе Хек Не Тня біу Зег Ту бе «10» 39 «211 48 «21У5 МА -213»5 Штучна послідовність «а Ох «ва» синтетична сах За асрававаів вяссвратаі Грізстарія ареіасевіа їенасвіс В «аз 40 «вії» 15 «212» ВЕК «213х Штучна послідовність «ау» «аа» синтетична «Вк» 40

Тін Аге Авр і Рго дер Пе Уві во Ма! Ага Тут Су Мет Азро Уві

1 5 10 15 «2ЇО05 81 «ВК» ЗМІ «212» МА «215» Штучна послідовність «22» «25» синтетична «Ох 91

БАЕБІНСОЕС НЕТ ЕВаВІС ТЕЕБеЕеВЕї БівніВсввс СствЕнвавіс ссвадасіс БО іссівірдсар сів сасаНівраї ВІН ННврса вадсіввві ссвесвавсї 130

СссаБРЕНаСЕ ВЕСІрБаВіВ ЕП дні мав ВіДБІвЕсВі Сасзвіаї 150 всавиніст; їЕВваррЕсов ЗИ сассрісіссвиарасзасрссавива тоссівіаї АВ сдсвачіва асадііраванссвавввс асЕвссссє Вас двсвававсоссві З

ІагЕЕТЕнсСе совасіасія вевссяЕвва воссівві ся сові В аБі «205 85 «211» 117 «2ї2» РЕК «йї15е Штучна послідовність «220» «23» синтетична

«вро 42 сів ма сів вен У о зекоїу сіу бег Ма! Ма! Атв Рго ож Зі 1 З то 15

ЗегіемАтиіїви 5егСуз Аів Дід зех Бі РНе ТЕ РНе Ар Ахо Тут га 25 зо су Ме 5ег Тго Уві Аге СЯп Аа Рго біуіує сі івев іш То Уві да 45

Зег СЯу Пе заг Тр Ал у у Не ТП Ма! Туг Дів дер бе Уді 5а за БО ув зіх Ате пе ТНго Уві бег Ате Ар Ап Аа уз ха бетіви Тут 70 75 8 ігш оп Мег Ап Зегіви Аго Дія Бін Ар Пн Діві ен Тук Ні Сух

З ЗО З

Аа Ага Аа Аг Гук су сну Аа Яр Бут То Оу біп бу Твгіво 1 105 1

Уаї Тиг Уа бЗег Зег бо вн: «ЕЮ» 43 «?112 94 «212 А «813» Штучна послідовність «вх «га» синтетична «щюЮ» 43

ЕБаНсасаї Нраївана їряс та «А 44 «РІ» 8 «212 РВТ «ІЗ» Пітучна послідовність «иа «823» синтетична «Чи 44 сСіх РНе Тк Ре Ар Ар Тут сіу ї з «НІ 85 «211 28 «І» ЧА

«13» Штучна послідовність «ВЕ» «ей3» синтетична «ДО» 45 анавнвев агесівесаї сага 28 «10» 46 «ії» 8 «213 РК «213» Штучна послідовність «ак «З синтетична «ке 45

Ме бег Тр Ал СТУ су Не ТОГ 1 х «1» 47 «211» ЗО «213 ОМА «813х Штучна послідавність «У «ВЗ» синтетична «Щи» 47

ЕсрараксосвиагввідиЕ свессвасіяс за «10» 88 «й1їз 10 «фі» РЕК «із» ННучна послідовність «их «2252 синтетична «щи» 85 діа Аге Аа Аге Тук Оу БУ Аа Ахро Тут 1 5 10 «210 49 «931» 355 «212: МА «213» Штучна послідовність «Рад «ваВ» синтетична «щюЮ» 45 нарвівсСевс ввів вавісікрсввавас Месіасавссідвшсрвіс ссівараєіс бо осісірсав ссістерай скоепіарсавБіИівссаіравсіврвіссвссависї 120 ссарЕнавЕе васівсадіс ввісісаавісісввівніа віврінабаа схсвіасівс 180 дОЗЕВСТ СВ іБаЕЕЕСсЕ ЕнсассВісіссарадаса зіссввазаїасвняаї 0290 сТЕснатціва асавсстдад зЕссравБас асеЕссвнт ас вс Евсвдас 0 ЗОЮ

НИСЕБЕВ ЕНН ісса ГЕН Ідаі вІСТВЕВЕСс аасдвасаві вдісаєсвіс ЗВО їснса Зо «о 50 «2115 125 «вІйз ВНІ «гід Штучна послідавність «Ах ка25» синтетична «Аз бів Уві сілівн Уа оо без Зіж Оу Азов ви Уві Їли Ргонаіу Аге 1 5 З 15

Зегіен Агріец Зег Суз Дів Ав 5ет Бу Ре Тр Ре бек бег Ре за

Ав Мег5егтто Ме Аг сп Ав го су Ага Зм іен бін го Ма! зо 45

Зегбегівн бег Аво Зег бі Азр Або ТВ БУГ Тут Ага Ахо бег Уві

Гуз дтв РНа ТП Пе Зег Аг Ахо Ав Зегі ух Аза Пе гео тут

Бо 7о 72 а іє бів Меї Ап Абпівн Ат Дів Зі Азо ТП Аза Уві Тут Туг Сух 5 да ох

ДівіузАзвіви РНе бег сіу Пе Ве Ніх су Ре Або Маг

НК: 105 то сі віп у Тег Ме уві Пре Уві 5ек Зег 115 120 «ах Бі «аїї1з 24 «2122 ОМА «їх» Пітучна послідовність «Ап «ах» синтетична «що Бі

БЕВМсассЄ гавані їв за «102 52

«11» 8 «12» РЕ «213» Штучна послідовність «Ко «43 синтетична «Ко 52 сі РНе Тбк Не бет Заг Ре Ада ї 5 «ох а «її 24 «зах МА «2Ї3» Штучна послідовність «ай» «ах» синтетична «ща» 53 ссавіваіа вівніваївя сася а «із 54 «гії» 5 «21722 РК «213» Штучна послідовність «220» «ах» синтетична

«що Б івц Зег Ар бек у АБО Дав тіж 1 З «10» 55 «и1ї» 45 «2125 МА «135 Штучна послідовність «ей» «23» синтетична «ап 55

ЕсСваваєвіс НАСЕ СЕ вів нанс сатевініє вірїс ах «5 5Б «211» 15 «й1аз РТ «213» Штучна послідовність «ах «Ей» смнтвтИичНна «АЮ 56

Аіаіуз Азрівєв Рве 5ег БіуУ Повен Ре Ні Су Не Або ма 1 5 16 15

«ВН 5 «211» 351 «212» МА «2135» Штузна послідовність «Ду» «аж» синтетична «А» 5 саБвНсавсіввідсавісіввасідав віравазаассіввевссісавіравввіс Б

ІСпвіЗави вінтрвНа сассіініссіврвівірвавісаксіввайссвасарвос 120 ссідввсасе вссцеВаг Віва ївЕ Вісавсясії ссарієвіааіасазвВНЕ 180 всагаваарр іссяввесар асісассаге ассасаваса свіскасрад'іасявсстяс 240

Вівваксіва прадесівнс зісідвсвасасрвс Ні ап асівідсєнсласвдив НОЮ весен разів еЕ врессавввя всоссірвіся сесія 351 «А В «а» 117 «2195» ВЕК «213» Штучна послідовність «ВАХ» «вай» синтвтична «ще 58

Сів Мві біпієн Уві біп бе Бу го Бім Уві і м у Рко су дів 1 5 Не 15

Зег Уа вує Ма! бег Сух Гуз Су Бе РУ Бут ТВк Ре зе Тр о гуг 20 25 Зо

Су Пе бе ігр Не Агр Сп Аа Бгто ЗУ Ні іє біб то Меї 35 40 45

Оу та Пе бег Ав бе бек біу Ахл 1 Ві Ага РНе дія іп ух Уа! 50 58 БО бів сіу Ага Ген Пи Ме Пре ТІ дер ТВгбег ТНгзег Пе Аа Гук б5 70 75 що

Ме бінівги Аге бЗегівн дя Зех Авр Дер ТВ Аа Уві Тут туг Сух а що да

Аа Аг Пн бу Ге Ате Бгто Не Ар Тут Прр'ізу бів Оу Пгіву т 105 1ю

Уві ТАНЕ Уві Бех бег

«а: 53 «115 34 «2125 ОМА саї3»х Штучна послідовність «а? «да3» синтетична сер вен асасі ССівБЕа Ера 8 «з 5 «2119 8 «212» РЕТ «13» Штучна послідовність «А «лад» синтетична «нюх Б су Туг Пк РНе бег Тгр Туг Оу 1 З «М Бі «2115 74 «2175 МА «2135 Штучна послідовність

273» синтетична «по» Бі вісавсясії ссавінвіза такси за «21п5 да «ії В «312» РЕТ сеї1й» Штучна послідовність «дах сей» синтетична «щюх 62

І 5ег дів бег зе Оу Ази Тіт 1 5 «21йо КЗ «215 0 «2125: ПВА «152 Штучна послідовність сей «иа» смнтетична «по» 653 всЕСЕВЗасее ЕвасіСЕВоС СпІваськІ за

«310 ВА «91315 10 «8125 ВАТ «213з Штучна песлідовність «Й «ей синтетична «ню» Б

Аа Ага Та Оу ТБ Агя Рга Ре Азо ТуУг 1 З 1 «2105 655 «2131 ЗББ «2122 ПА «13» Нітучна послідовність «Раз» синтетична «щЮ» Ба

БаБЕТДКавсС ревниві ів авес рвісснЕс вер ввісС ссідвнисіс БО їСЕЇасав ССТЕБВТ сасспеаБЕЯВСВТеНіСІБСаСіРБЕі ссБОсаЕВс 120 ссВЕБРЗааке васіврааїн ів Ніснаві ніацісаба ніссекріад адатанаї 180

ЕКОБаСТСІр ТЕааЕЕЕсаЕ Вся ссвістссаваБаса я сранева Сас 0240 сПсзазівв всевосісва вестраввас аіресівНИ яНасієтвсдававанЯс 0 ЗО

ПІНесваві ЕН са ВЕНИ раї зісівєввессаарряасваїсвісассвіс 360 їНске оо «2» Б5 «211» 122 «їй ВЕ «13» Штучна послідовність «ва «вай» синтетична «ЦЮ» Бе сі Уа сіпівєн Уя ох Зег бу су Оуен мя й Рго су спу 1 з Те; 15 5егівги Аге Ге ет Су Пт Ав Зег Бі Ре ТВі РНе бе хе Тут 23 25 Зо біжіви НЕ Тго Ма Аг С дів Ріо зіу уз бі івен бін Туг Уа! ай 45 зек Зег Пе Ази Ні Аспооіу біу бег ух Туг Туг дів Акр Бех Ма! я з 50

Ї че Су Ате Рне ТП Не ет Аг Азо Ав ет ув Ап ТП ген Ре бз 7 Ка о

Ігин бів Месбіу бегієціув Пи ос Ар Мет Ага Ма! Кут Туг Сух 85 БІ 95

АЇВАгтАзвієй Ріеівц сів Прієн РНе Ні Сіу Ре Азо Не Тр щи 195 зо сіу сій у ТбгМеї Уві ТР Уві бат Заг 315 120 «за» 57 «115 24 «12» ОМА «13» Штучна послідовність «ах «2й3» синтетична «апа» 57

БЕВЗ СВсгі їсаріанста Гевї 24 «а 55 «Її 8 «12 ВНТ

«213» Штучна послідовність «аг ка?3» синтетична «ап» ца

Сі еНе Тег РНе 5ег 5ег Тут (іт 1 З «810» ща «2112 28 «12» МА «їз» Штучна послідовність ках «ага» синтетична «ан» о внадісаєа відЕсевіаЕ ана а «10» 7 «1їх 8 «212 РТ «а1а» Птучна послідовність «вад «вазу синІтични «Ах 70

Не Ап Ні Акп зу Су Зет у 1 З «о 7 «11 45 «12» МА «13» Штучна послідовність «аа «ага» синтетична «з Я вЕсвакарціє СН ев вівЕ Мане савани е зівіс ЯЗ «о» 72 «2112 15 «иі2» ВИТ «їй» Штучна послідовність «Ох «айв» синтетична «НЮ» діа Аг Ахріги Бе Те сін Тріги Рне Ніх Зіу РБе Ар Пе ї 5 10 15 «230 73

«211з 35 «212з МА «213» Штучна послідовність «Це «283» синтетична «ДОК УЗ сасрірсавсівЕсареанісврЕсссавва с їрвіразос сисасарає сеїрісссіс 0 ВО ассівнцсїв ЕЕ рБірв сісспідавс свв сп аспстввас ПП реаіссвс 190 сарсзсссар ЕЕБавБвссі вва ЕВи пЕВіасації ага євв звасастіас 180 ізсазіссві сестсвававсвавнНасс ам тавасасвістаа взассадіїс 0 ісссівававсіравсісісі дасівссБеЕ васасвЕссВ ІВ Насівівєсвавааві З вайеваавії сова ссастврирс савеврасссіввісассві стссігса 357 «в 74 «211» 118 «213» РЕТ «13» Штучна послідовність «а «З» синтетична «ДО УЯ

Сіп Уві біп бен бів біб бегбну Рго бітіву Увії ух Рго бег бій

1 З в 15

ТНгіви зегівн Пі Су Зег Ма! бег у СТУ Хег Це Авп Те Оу аа 30 зег Тут Не Тгтр По Ме дл бай НО» Рго Зі бін су їез бів ча 45

Тов Не бу Туг Пе Буг Тут Ал ЗУ Азр Ту Туг Туг Аза го 5ег бо

Гецпіувбег Ат Ма! ТБгіги бегієц Дер Пи бегі ух Ах бій РНе 55 з ТБ я

ЗегіеціузієцАзпобегіви ТВ Аа у Аво ТП Аа Уві Гуг Ту

Сух Діз Агя бег Азр тр Ап бегі ви Ре Ар Нів То іх бів Оу

Мо 105 по

ТВгіен Уві Тбг Узі Зет Зег 115 «210з 75

«її» 30 «їз МА «рї32 Штучна посліваовність «ие «223» синтетична «ще З

ЕБІНЕСІСсСя Тааасасівв насе 30 «230бх Уб «11 30 «212 РКК «її» Штучна послідовність «ие «23» синтетична «АК» 75 іх ОБіу зет Не доп Твг о біу зег Тут Не «230х 77 «211» 931 «212» МА «Ії» Шучна послідовність «ДУ» «аЗ» синтетична

«40 77 вВісіанвса шдравасас с З1 «105 й «11» у «?12» РТ «213» Штучна послідовність «аа каз» синтетична «Ап» В

Я тує Туг Асп У Ар ТВг ії З «105 7 «11» 33 «212» МА «їх» Штучна послідовність ках «ей» синтетична «ка» 79 вСЕЗБВаБТЕ асідваасіє СН пає гас 33 «ць я

«ії» 11 «212» РНК «1» Штучна послідовність «Ах «да» синтетична «Аз що

Аа Аге Зег Ар Тр Азп бегівц Ре Ар НЕ 1 З 10 «а ві «й1ї» 338 «212 МА «ЗІЗ» Ннучна послідовність «ЗАТ» «ей3» синтетична сю Ві навайвівіігасвсавісіссневсасс сТВісСНВЕсіссаБЕЕБа зададстоє БО «с Босівса ЕБЕссавіса вавів анс авсарсіастіардссідвізссавсарада 1205 ссідЕссавЕ сісссЗБЕсі состав відсвісся дсВЕдессясідесвістса 180 внсавЕй ся відесавіне кісісрвяса васіісясісісассайве сарасісвяня ОО ссіаавай Несавідія Песівісве сеБіВівніа всісассН я ВасБНСВЕЄ ЗО сааБЕнасса аЕетЕЕваці свай 324 «Нв 82 «її» 308 «25125 РКК «213» Ніучна послідовність «зах «За» синтетична «Нюх 852 сі Пе уві ви Тк бій 5ет Рго бу Тбгіеноегівц его ЗУ 1 5 1 15

Оіш Аги Лів ТНгіви Зак Суз ге Дія бе бег Уві бег баг 5ег 725 Зп

Тугієн Аіз Тр Туг Сів біз ух Роз Біб сій Аа го Агрієціви

Бе угону Дів Зег 5ег Аге Да Ту Оу Не Рго Авр Ат Ре баг 53 Бо

Оу бег су бег іу ТВ Ако РНе То тен ТБ Це Зег Агвівц сін

Уа т о

Его іш Азо РНе Аів Уві Тут Тут Су бів ло Буг Оу Баг баг го

Те Пг РБе сі біпізу Пі ух уві і ее ух що 1605 «210» 83 «211» 21 «212» МА «аї3и Штучна послідовність «20» «вад» синтетична «ДІЮ» 83 сававієНа всавсарсів С 21 «йо «11 7 «12» РЕ «2їЗ» Штучна послідовність «ах «ага» синтетична «ще ща сСіпбег Уві Зет Зет бе Туг

1 5 «а З «Із З «Ваз ОМА «213» Штучна послідовність «вах «аа» синтетична «де з

ЕЕЇЕСВІСС з «а» 86 «1» 3 «а3з РК «2135 Штучна послідовність ках к«й23» синтетична «до Ве су Аа 5ет «а НИ «Із 37 «212 Пд

«аї3»У Штучна послідовність «вас «ой синтетична ее савсавізія віарсісяос НЕБасЕ 7 «АТО я «11» 8 «гї2» РЕТ «ї13» Нітучна послідовність «20 «йод» синтетична «Од 88

Сів сіл Тут су бег бек Рго тр Ту 1 З «АТ» ЩО «Р1ї1з 11655 «РІ1з» РЕ «ї13» Нітучна послідовність «кла «вза» ВІЕРА РАВІ5У «дод» ЩО

Мет йесух зіпіуа Ре Сух Маї Майівенівн Ні Таз Сів Ре Ме 1 5 10 15

Туг Уа Це Ту Аг Ре Ахпієц бег Рут Рго Пе ТП Рго Тр Аг а 8 зо

РНеїувівци зег Гуз Меї Бл Рго Азп бес ТНг Буг а5роїУ РБеівен 35 Б 45 івеп рго ів су іги бегіуз Ави Тит ет Ахп бег йха Оу Ніє Тут що 55 во сни ТВ АЇв ув о Рг 1 у Ре Аво Зег Бег Бім ВЕ НЕ Ре бег 53 70 їв що

Авпівц бегіме ТВ ТІ Не Ніз Су Сух РНе Дге бек ів сів Аво 5 55

АТЕ Ап Суз бБегіен ух Аа Ар Абп Не біб бу ух ТЕ Рве Уві оо 105 з зе Пт Уві доп Зегівнв Уа РНе бів сів Не Азо Дів Ап го Ада 115 770 125

Це бівсує нрісціух Су Асрівціузі ги ВНе Пе Су Рг Уві 130 135 150 сій 5егівц РпеіухАзпіви Ре Аге Ап Тут Ази Туг ух Уві) Ні 145 150 155 1650 івпіви Тут Майї ес Рго біб Уа гей Ох Азр бе го ем уві Рго 185 17 175 сій і уз Сіу зег Ре сію Ме Уві Ніх Сух Ап Сує зет Ма! Ні СИ 180 і55 50

Суз Су о Сухіви Маг Рто Ма! Ряз Пн Ав іузі ви Аза Ар ТЕ 195 а а іецієц МегСузівцімх йе Тнг ек су біб Уві Бе ЕНе бів бе 2 215 220 тав ес Меєбег Уві сіл Рго Ме Асп Ме Уві ух Рго Дер Рго Рго 225 230 235 за ів уівц Ні Меє о Не Пе Азр Ахр у Ахпівц уз Ме баг 245 250 з55 їтрзегбегрРтоРгоіги Уві то Ре гої бій Гуго увагу

Бо 265 га

Тук Зег бін дхо ек ПТН Пі Уді Не Ате біб Аа Абр і уз Пе Уд! 275 во 285

Зег Ав Ну Зегівніви Уві Ар бе Неїги Рго сіу зе бе Тут 290 295 з сни Уа! біп Маг Ате Оу ух Агро ем йо у Рго ау Йе то бег зо5 зій 315 2

Авов Тго Зег ТП Рога Аг Ма! Рпе ТП ТВг о Ар я Не Тут Ре а25 33 335

Рто гої у Пеївен ТНгбег Уві Су заг Акп Уві бег Ре Ніх Сух зо 45 з5а

Метїугіузіує и Азпіух Не Уа Рго зЗет і ух іш Пе Уві тр заз з6о0 Зо

То Меї Азпіви дів Сі і ух Не Рго сів хех бій ТугАзро Ма! Уді з 375 зви

БЗег Ар Ніє Уві баг ув Ма! ТВ РБе ве бхпіви Ав сію Твгі ух зва 390 з що

Рго Агв біз ма Ре Пе Буг Ар Аз Уа Тут Су Сух Ал НІВ ще що ліз

С Сув Ні Ніз Ате Ту Аа бів Тут Уві Ме Ахр Уві Ахо Не я 425 430

Азп Пе зе Су Ти ТА бер ву тугі ем Тк вуз Має Тбг Су Ат «35 ва 5

Тгр беї ТП бег Пи Пе сій Зегіво Аз бів зе Твгівц сіпіви 45 що Бо

АтЕ Тук Ні Дгв бегЗегі ви Тут Сух зег Ар Не Рго Зег Пе Ні: зба ж 475 АяО

Рго Ме Зег Он Ра уз Ав Сух Гу Бен поет Ар їх РНе Тут 85 490 55 сш Суз Не Ре біп Різ Пе Рпеівцієц бегізіу Гу ТЕГ Ме тр

Зо 5-5 ЗІ

Пе Аг Пе Аоп Ні бегієц сік бегі ву бер бе то Ро ТЕ Суб і5 2 зг5

Магец Рго Або бег Уа! Мафіуз Ро ес Рго Роз бет бе Ма ух зай 35 ЗАП

АБ сін Пе Ті Пе Ап Пе сі іецвеціує Не зе Тр ів їув

З ззо з50

Рго ма вне Рго Оіц дп Ап ен іп РНе бій Ме Аг Тут Сі іео зуУй 5

Зег Оу ув біб Маг сій Тр іує Ме Рут зів ма! Тут Ар Ав 1 ув

ЗВО 5 ча бегіухзЗег Уві зегігн Рто Ма! Ро Аввіви Су Аів Уві Гут Дів за 5 оо

Ма біз Маг Ат СузіузАтіви Азріїміви Оу Тут Тгр баг Аа

Бі Біб зай

Тв бат Азп Бгто Ав Туг Піно Уві Ма! Ме Азр Це уз Уа Ро Меї 035 ЗО 235 Ба

Агв'у Рго біс Не Тго Ате Не Ме дев Су Ар ТБ Мет уз ух

Бо щоо 55

Сішіуз Ап Уві ТБгівенівц Теріуз Ргоївгн Меї Гуз Ап Авр ет їги Суб бе Уві іп Аг Тут Уві Пе Дал Ні Ніх Пт бег Суз Азп 675 БО во

Сіх Те Тео Зех бін дер Уві БІК Ахо НІ ТНг г ух Ре Те Ре без

БИ 695 ща

То ТВг би оп Айва Ніз Пе Уві Те Уайт ев Дів Пе Ал Зег Не 75 7і0й 71 72И

Ох Дів баг Уаї Дія Ап Ре Аспіви Пр РНе бе тр Рг Меї бет 7У25 730 7За ух Уа! Аби Пе ча Сів бегіец бек Аа Тук Ргаїец Ап бег Зег 780 а 7

Суз Уві Пе Уа! Зег тр Ме іво бег Роз ет Ахр Тугіузі ен Меї 755 БО 755

ТугРНе Не Це біб їтаіує й5лієн Ап ОТ Ар у ін ві ув 7 Тв во

Твіги Ап Це бе бе бег Ма уз'іуз Туг Гук Не Ні Аз Ні тез ча уча ве ве Пе Рго Пе бініух Туг біо Рне Зег еп Тут Рто Ме РБе Меї

Из кі ЩІ сіб Уві ОЇ ух Рго уз Пе Не Ахо бе Не ТЕ оо Ар Авр ай 35 53

Пе бін ух Ні сів Зег Ахр Аа січ ен Туг Ма Ме Ма! Рто Уа! яко 845

Пе Не бек бе бе Пе івцівєціво ОВУ Пгівціви Не бе Ні: ви 55 бо сСівАт Месіузіу«й ве Ре Тер и АБ Уві Рго Аба Рго ух Ап оо вл 85 Б

Сух 5ег ітр Ав біп сі ву Асв Ре біп у Рто ОБ Ти Ре сію ваз в що

Ніз ги Ре Пе і ух Ніз Те бів бет Ма Ту Су іх Ро іецієц

Геш о Рго іч Тег Не ет і Ар Не 5ег Уві Ар ТВ зег гр 815 В аз іує Д5п гу хо сін Меї Ме Рго Пе ТР Уа Уві зегігніви бег

ТВі те Азріви бійці уз біу бе Уа Суз Не 5ег Абр бір Бе Аза

Заг Уві Авп Ре Зег О1Н Аа Си су Пе ОВ Ма! ТЕ тує СПО Авр обо ЗУ У сін зег іа Агро іп Рг Рпе Уа і ух Тук Дів ТВгівн Не бек Акл що ЗВ аа

Зегіу5 Рг Бе Б ТВг Ом Сів оїпаїМмівн ів Аква бег бег ща щщюЮ МО

Уа ТВк уз Су РБе бе бе уз Азп бег Бгто ів ух Айр Зег що 15 1030

Ре бат Абп заг бек Преїн Песни Айва бій Авіа Ре Ре Че

М що 1035 іешбег Азр бів Ніз Рг Дхп Не Ме бе чо Нв Гео НН Ре о 15 1050 5екгбіц сікбієч Ахрііви епі вц сін Су Азп РБе то 155 1во 1055

ОВ сій еп Аби Аеріувіух Зекг Пе тую егівн сту Уді Тег

М 1075 ідо

Бек Не Гуз Акр інет Сію У евіви ТВг Дер ух Бех 185 цк 155

Дгв Ма! Зег ух Рто Бе Ро Аа Різ Сузівек Ре ТВ Ар бе оо 15 ло

Аг Ма ен бій Ар ЗегСуз бег Ні Ре Ма он. лей Або Не 115 120 1125

Ахпієн СУ ВІ Бегбетіуз ї ух Те РНе Аа чег Тут Ме Рго 1130 1135 їв св ВНе біп Тр Сух Зег тіж бів Тег Нізіух Ве Ме об Аза 1145 150 1153 іу« Меї Суз Азвієц ТНг Уві 11650 11655 «Ха» 90 «24ї» щЯ5 «212» РТ «Іа» Нігучна послідовність «ЦП «аа НЕЕРА-пгой ад 1-18: Е22-ПЯЗО ої РЯВЗ5Я ва 819-846: тус-птус-вехавійнопе їде «Я ЧО

Ріе Азпіви бег Тут Бгто Не Те Рго гро Аге Ре уз ео бег Сух 1 5 10 15

Ме то Ріо Ах Зег Пи Ба Ар Туг РНеівсціви Бо Аа бі ги

КО 25 за бегу5 Ася ПН Зег Азп бег А5п бу НІ Тук Оін ТНе Аа Уві бів о 45

Рогу Ре Ах бег баг СТУ Пе Ні» Ре бег Ахпіви бегіуо ТВГ в. за БО

ТВі Аве Ніх Су Су Ре Атге Зег сін бів Ар Атр Аби Суз бегівв

Бо 7 т що

Суб Дів Аво Аво Ме сну сіу уз ТВ Не ма зег но Узі А5а 5ег 85 90 Зо

Іги Уві РБе бів сій Не Азр АВ Аби То Ази Пе біп бує порів 100 195 о іух Бім Ахрівціузівец Ре Не Суз Тут Ма! бів бегівм Ре уз 115 129 125

Азпігин Ве Ага Ази Пи Або тугі Уа Нкісвівц Ту Уві те

Іо 135 140

Рго сін Уаіївен Бі Ар бег то 1 ен уд Ро іп ух у Зет Ре 145 15 155 15

Сів Ме Ма! Нік су Ден Суз Зет Уя НІХ Си Су Сук ОВ Сухівн то туп 175

Уві Рго Уві Ро Тіт АЇзіузівнАєп Ав Пгісніви Меєгузіви їв ї185 190 ух Не Тв зегізіх Сіу Ма! Пе РБе бів бет гої гц Ме бек Уві 195 зо 205

Зі Рто Ме Ап Ме Уві г ув Рг Ахр Рго Ро іги бу їв Не Мет 210 215 я

Сію Це ГНг Азр Ар іу Авпієц і у Ме 5ег Тго бе Зег Рго Ро 225 ЗО 3 ад іІги Ма! Рго Рпе боіви бій Тут бів Уві ух Туг зе си Ап бег 785 250 255

Ті т уві Не Аг сін Аве Азр ух Не Уві бег Дід Пгбегівн зо 255 а ів ма! Або Зег Пеівн Рго сту Зег бег Туг бін У Оіп Уві Аг 275 280 зва

Січ іу5 Агтівен Ар Зх го Оу Ме Тго баг Ар то бег ТВ Ро

КА: 295 зо

Аге Уві БВе Ті Пн сів Або Ма Не Тут Не Рго Рго б у Пе їв

З Зв ЗІЗ за

ТВгбег Уа Оу ет Аби Ма 5ет РНе Ні Сув Пе Тут ув Гу бЇН 33 335

Аєпіує Не Уві Рго Зегі у Сіц Не Уві Ттр го МеєАхлпієен дів за5 за сініуз Не го сій бет іп Тут Азр Уві Уві Зег Азо Ніз Уві бет

За ЗО Зо іу5 Мві Те ВНе Ре Азпіви Дхл осів Пн ує Рго Аг сім уз Ре 370 375 зо

ТВЕ Тут Ар Ав Мі Тут Сух Су Ап Би Ні о Су Ні Ніз ДЕ 355 390 55 щю

Туг Аївбішією Туг Уві Не Авр У Азп Не Ази Пе бет Суз ЛІ 05 410 ЗІЗ

ТЕгАзріу тугі ТВгіув Ме тіксСує Ате Тгр ет Ті бе Тв я Я Аза

Ме сів бекгівн Ав і; бе Пт ієц Біпівн Аге Туг Ніз Аге 5ег 435 Зо дз

Зегівни Туг Сує 5ег Азо Пе Рго ет Пе Ніз Ро Пе Зег біб го «50 455 4650

І у Аво Сує Тег іє біп Зег Азо ох ВНе Тут НН Сух Це Ре бій

Зв ай 475 ав

Рго Пе Ре ецієв бегєну Тут Ну Мет То Пе Атв Ме Ап Ні» 48о а 455

Зегіецоію бегієцс Або бег Бгто то Пі Су Маг еи Бгто ДАхро Зег

ЗО 5 що

Ма! Май ух Ргої ен ко Рго баг бег уві і ув Аа Си Не Те Пе зі5 А зав

Ачюи Пебічівенівціує Не бег Пгрізіні ув Рго Ма) Ре Рго із 530 535 5

Дяп Азпіги Сіп РБе бів Не Атр Тут Оу івц бег біу ух бів Ма! зво заз Зо сів трів Ме Туг сю МагТут АхроАїя Гуз Зегі ув бе У бег

ЗБ 57 575 івец го Уді Рг Ахрівн Сує Аа Уві Ту Аів Уві бій Ма Ага бух що 55 5ЧО іу5Агріви Ар біхієн іу Буг Тр зе Ап їгроЗег деп Ро Ав 595 БОЮ БО5

Туг Тбг Уві Уа Ме Азо Пе ух Уві Рго Ме Аге у Ро сі вне 510 віз во

Тр Ат Не Пе Аза ціх Ар ТВ Мебфіузіух б іує Аза Уві ТЕ 525 Зо 5З3З ї-5щва ієчіви Нріуз Ргоївци Меїіух Ахлп Авр бег ен Суз Зег Уві бій 645 Б5о 555

Агв Тут Ма Пе Ахп Ні Ніє Тк бег уз Аза У ТР тко Бек о

БИ БО в/

Авроуаногу Аз Ні ТК щує Ре Те Ре бен Таз ТВ бю бів АВ аг ца

Ні тт Уві т Уві ео Аа Не Ахо ет Не біу Ав Бег Уві Ав

БО аа яю

Ап Не Ахпівн Пи Ре бег тр Ро Меї бекіух Уві Дер Пе Уві

У то 715 а сСіпзегівн зег Ав Тугргоівц Азп зег бе Сує Уві Ме Уві бе 725 730 3

Тр НеїенбегРго бег Ахр Тугіуз ген Меї Тут Рне Ме Це С 740 745 750

Тгтріухазпіви Ахо Сі Аор сім З Неіїує Прієц Аг Ме бег

Я5а 75 їв бЗег ет Уві усі уз Тк Тут Ме Ні Авро Ні Ре Ме Рго Не бін 775 77 780

Іуз Гук ій Ре бегіви Тут Рго Не Ре Мей біс бі Уа! біуіує 785 о 795 яю го уз Не Ше Ав бег РНе Тк біп Ар Аза Не 516 ув Ні сп 8І0 8І5 зег дер сіпіузі єн Не баг ств З Абрієс СІЮ БУ СЮ Вій г 85 830 іхвівец Ме бег сів Ох Азвівгци Ні НІХ НЕ Ні НІ Ні яко 8545 «105 31 «11» 1051 «212 ВАК «13» Штучна послідовність «о» «Ваз» ВІЕРН-пагс за 1-88: 22-83 из РЗ8357 ва В1Я-ТОБИ: вбоа міння

ГТЕО8-КЗЗО из РОТНЕЗІ «ад І

Ре Ахпіви бет Тук Рго Не ТЕ Рто го Ате Ре уз іен бег Суб 1 5 10 із

Ме Рго Ріс Ап зег Тйт Тут Азр Тут Вбеївеціви Рго Дів Вії и 2 25 30 бегіуз за ТП зе Ахп бег Ах у Нія Тут ів Ту Аза Уа за чо 45

Вга вуз РнНе Доп ех Бех біу ТП Ні РВе хегАхпівц Баг і м ТВ з За во

ТЕ ВНе Ніє Сух Сух Ре Аго баг бід іп Азов Аге Доп Сух бегі вн 70 75 я

Суз Аіз Азр Авл Ме бів обу уз Тег РНе Маг бет Те У Ави бет що си 9 іен Уві РНе іп бій Не Азр Аїд Ази Тгр Аза Ме бій Суз рів)

То 15 110 ту сіу Ахрвівціузігн вве Пе Су Тут Ма! бів бегієц РБе Гуз о 13 135 депіви Ре Атя Азп Тут Азп Тутіу« Уві Нізігєнівму Туг Уа ев 1535 140

Рго сін Уайіво Б Ар бе Раз ви Мві Бгто біл уз бік бе Не 15 150 15 185 сій Ме уаї Ніз Суб Авп Єує Зег Уві НО бін Суз Су Си Сухівцй 155 1 175

Уа Бгто уві ро Пе Діву ен Асп Азот і ввівец Ме Сузівн

180 185 ще

Ту Не Тк Бек чу Су Уа! Не Ре сів ех Рго ен Меї Заг Уді 195 з га бів Рго Не Аза Ме Уаг уз Ро Де Ра гої ен сім і во Ні Меї 210 215 22 іш Ме твгАхр Аза БУ Азпіви уз Не Зег гр Бе 5вг Рго Рго 325 230 235 ЗА івц уві Рго Не Бгто бен бів Ту бій Увії у Таб бег 39 Аза баг 485 253 255

ТЕ тв Ма! Не Ага бів діа Авріуз Не Уві бе Дів Ті бегівн 250 255 270 ів Уві Азр Зех Мети Рго бі Зег бек Тер ші УВО Уа АгЕ уз 250 253

Сіуіуз дтвігн Ази у Ро Зіу Пе то бегАхо Тр бег Тв ра 290 295 Зк

Аг маг Бе Тл 1 Оп Ар уві Ме Тут Ре Рго Рг ух Неї г

З05 310 315 35

ТНкБег Уві бу чег Ахи Ма! бек РНе Ні Суз Ме Тут Був у 325 330 335

Аклітз Не Уа Ріо бег уз о Пе Ма! Тго Тр оМеї Ахпівн Ав зда 345 за сін ух Не Рло бій Бех бій Туг Ахр Уві Уа! хет Азо Ні Ма! Заг 355 зо 355 іув уві Те Рбе РНе б5п і ев Аха б ПВгіув Раз Ар Оу ух ВНе 370 375 зяо0

ТАг тує Азр дів Уді Тук Су Сує опти НІ СЮ Суз НЕ Ні Ат з85 з90 395 до

Ту АВ бівівн Туг Уа Ше Азро Уві Аза Не Ази Пе бек Су СИ дО 410 515

ТНЕАЗріу Тугівєн ТВгіуз Меї тн Сух Аг Тор ех Ту бек Те

Аз 425 430

Песій бегівц Ав іо Зег Пгієц сій тен Агв Тує Ніз Ага баг

35 45 45

Черіви Туг Сух Зег Ахо Ме Рго ет Пе Ні Рто Че бег Б Рга лаз ЗБ

Ку Азову Бут ец іп Зег Азроіу ВНе Тук ів Сух Це Ре бів заз 370 уз АВ

РгоНевпвівціви бег бу Тут ТП Меї їго Не Ате Пе Ап Ні

З85 ща ща

ЗекІіем СВ ех Те Азр бе Бгто Рг ВГ Суз Маііец Ро Азр баг ща за що ча! уві фу Рго ген Рго Рго ет бег Уа! уз Ав и Не ТБ Не вій в ЗАЗ

Азп Це біу генів уз Не бег Тр Бін уз Ро Уві РБе Рго БЦ 5 за З

Азп а5пігвги віп Ре бір Це Ага Тугоіуівец бе оіу уз Сн Уа! 545 250 553 з сп тгріуз Ме тугі Уві Туг Ар із ух бегіух бат Уві Хек

5Оо 5 зів іегн го чаї Рто й5рівц Сує Дід Маї Тут Ага Мі ої Уа! Ат Сух -5 5

Іу«Агдігв Ар сім т ец чу Тут Ттрозег бал Тр бег Ахп Рго ДЗ 593 Ощю що

ТугТВг Уві Уаї Ме Ахр Пе ух Ма! Ето Меї Аге (іу то сів Ре 51310 55 во

То Атр Че Не Ах Ву Ар Тв Адебіує уз СВ ух Ази Уві ТЬг

БІБ БО вза щ-о ієчівн трі Ртоіївч Месіуз Азп АЗо бегівен Су бег Ма ОВ 545 Б5о 555

Ат Тут Уві Не Ази Ні Ні ТК бег Суз Авп у ТВ го бек ів

Ар Уві бік Адм Ні ТНг уз Бе Ту ВНеїви Тто Гн си Ов Ав

Бу БНО Я

Ніз Те Уві Тк Уа!гги Ав Че Авп Хег Пе бу Айва ет Уві Ав

659 БчЧЬ ОО деп Ре Аспіви тіж Ре бег Тр Рго Мб бегіух Уві Ап Пе Уа! 75 та 715 яд

СіпЗегієц бек Аа Тук Рто а Ахп бет Бех Сух Уві Ме Ма! Зег

У25 ва 35

Тв Неівно5акРго бе АхрІкіу«гі во Ме Ре рве Не Не бів

АД 45 ВЗ

Трвіуз деп і ех Ася Біб Ар су зів Ме ух Птрівн Ате Це баг

Ба 755

Зегбег Уа і усі тує Гуг Тут Не Ніз Ар НІ Ре Ме Ру Ме сію

ВН ть Во іу«Тугсно пе беківи Тук Рго Пе Ре Мет бід бі Маг іч іув 785 та УФ ВОЮ

Вго ух Ме Не Ахп бек РБе Тк біп Я5р Ар Пе сш ух Ні СТВ я ІВ 15

Зег Ахор Ві Рг Аг Оу Рез ТВ Не ух Ро уз Рго го Сузіув я 525 3

Су Рго Дів Ето Аепівгцієц Сім (ЗУ Рга бех Уві Ре Не РНе Бгто 3 о Зав

Ргзіуз Меіуз Ахр Уа і ец Месіє Зегіви бег Ро Ме Мат Ту щоз БО

Суб Уві в! Уві Ар Уа бег ОїНн Ар Авр Рго Азр Маї бів Не бе 5 5/0 5/5 що

Тр Рене уві Аза Ахп ува 1 Уві Ні Те Аа сій ТО с ТП НЕ

Бо що ка5

Агв сіб зо Туг деп бек ТНгієен Агро Уа! Уві бег Аівіви Рго Не во 5 в сів Ніє об Азр о тгр Меї бе біжу ОВ РНє уєСуві мк Уаї Ап ч5 до пов

АвпіузАзвієц Рго Дів Рго Пе ОВ: Ате Те Пе бегіух го уз о 35 о сх бег Уві Аге Аа Рго віп Уві Тут Ма! тен Рг Рго Рго сф С:

5 Зо а сін Мей Пн іузіує бій Уа! Пн іец Пи Су Меї Уві ІН Ар РНе ов5 з 5/5

МеєРго сіб Азр Пе Тут Уа або То ТУ Аа Азп бу у Те бін що око З іє Ап Тугіуз Ап Пи біб Різ Уві іец Азрозег бо біуЗегту оч кю ще

РНе Меї ТугбегіуєсієцАгт Уві бініузіув Ап Тго Ма! бір 1010 115 4050

АгЕАбп бег Тут ЗегСує зег Уві Уа! Ні бі у Гец Ні Азл

МОо5 1530 195

НН Пи ТргіухбегРНе зе Аге Пі бга су вух що 155 150 «Ще чі «211» 1085 «19» РЕТ «213» Штучна послідовність

«А» «3932 ВНЕЕВВ-АНЕС аа 1-818: Б22-28З9 мз РЯНЗаХ ва В19-НМ У ні человека

Т1М-К330 мз РОТЕБУЇ «що» 92

РБе деп ен бег Тут Рго Пе Тв Рго Тгрдга РБеїузівн бег Су 1 5 я; 15 їМеї Рг Рго Доп зе Пі Тут Або Тук Рбеівціги Рго Діз Зікієц 20 25 30

Зетіу5 деп Пн Зех деп заг Ал обу Ніє Туг Об ТВ Аа Уві сів 35 й 45

Рго ух Ре Ап бег бет 1 Пе Ніх Ре бегдопівци бегіув ТЕ

Зо зо во

Тк Ве Ні Су Сух Ре Атр бе Сіц бій дор Аге Азп Сух Зеківн

Б 7 75 я

Суз дів Ахо Ап Пе і Оу ух ТП ле Уві ет ТК Уві Аза бег

Івб ма! ВНе іп сію Не Ар Аа Аза То Азп Пе біп був нрівий 305 ії іме У Аврівніузієц пе Не Суз Тут Ма! бід бегісн Ре 1у5 115 120 125

Азпівн Рне Ага Ази Туг Азп Тугіує Ма Нізієнівв Туг Уві і ец 130 135 140

Рго Зіц Уа! ен бів Азо бег Рго в ви Ма Рго іп у Су бек Бе 145 ії і55 15

Ой Меї Уа! Ніз Су Ап Суз зег Уа! Ні ін Сух Суз ОЇц Сухіви 1855 172 175

Ма Рко Уві то Пе Аа узівги доп Ав Ббгієнівго Ме СучІеп 150 155 190 іух Ме Тег баг іх СУ Ма! Пе РНе бій бег Різ їви Меї ет Уа 155 200 205

Сів Рго Не Ахв Меї Ма! у Ро хр Рго Ро і ви біуіви Ніс Меї о 2153 22

Си Це Ті Ар Або Оу Аопівні ух Ме Зах То Зег бег Рго Рг з3а 280 іви Уа! Рго ББе Ето тен ов Тут Оп Уа! ух Туг бет ОВО зп бег 283 з 25

Тег тт Уві Ме Ате бі Ава Арі ух Пе Уві бег Аа Ті бегівь 253 «55 291 їгн Уві Ахр зег Ме їеи Рго біу Зег Зег Туг бів Май іп Уа Аг ла 280 285

ОіЇЖіУз Агоівен Авою ОЇУ Ргз Су Це го Зехг Аа Тр бег Тк го 290 га5 Зп

Ага Ма! Ре ТВг Те бів Авр уві Пе Тут Ре Рго Рго ув Ме їен

Зо зід 355 330

Тік зег узі Сіу 5ег Азп Ма! бе РНе Нів Суз Ме Гук у Гу Сів 325 330 335

Ап іуз Пе Уві Рто Зак ув Оі6 Не Уві то пре Азпівю Дів

Зо 3485 350 сш ух Бе Рго бій бек бій Туг Ар Уа! Уа! ет Або Ніх Ма! бек 355 353 зБ5 іу5 Уві Пи Рре РБе Абпіви Аби бів ТВгіує Рго Ат іу у Бе 3Уй 375 зво

ЧТ туг Або Ав Ма! Тут Су Сух Дев Сп Ніх ОЇ Сув Ні Ніх Аге 35 зоб КО чо

ТугАасшіви Ту Уві! Пе бхр Ма! Ап Не Аа Пе бек Суз Сі 05 ЗІ 315

ТНЕАва сх Тут тей Тогіує Ме тт Су Ат Та баг ТВЕ бе Пг 23 425 Ящ

НПебіпбегіви дів Сб бег Пн івци біпівн Ага Тут Ніз Аго Зег 435 443 445

ЗехЕви Тук Сух бег Азо ПЦе Рг бет Це Нів Рго Це бЗег ш Рга 455 ЗБ

ІувАзр Сух туги сп Зег Або Су Не пу о Сух Не Ре сп зо 45 475 яко

Рго Пе Рреієніви бегсїх гуг Не Ме То Не Аге Не Авп Ні чо ще що

Зегівн зі бегівц Ар зе Бо Бгто ТВі Су Уа ви Роз Ар зе

Зю 505 щі чаї Уві туз Ргоївгцу Рго Рго Зеї Зег Уа туз Аа Си Пе Те Пе 5і5 5 525

Ап Пе спуівеиівціух Не бег Тр біб ух Рго Уві бНе Рго СВ 230 535 5

АспАєпіви іп РБе бій Не Дтв Тут біуіги бе бі уз Си Уві мо 5 щ--ео -ео сів зі Меєтуг біо Ма ТугАзо Дів ух бегіух ет У Зег зва з Зо

ІЇевб бго Маг Рто Дер і ец Суз Аа Маї Туг Аа Ух бій Уві Ат Суб

ЗВО 55 ща іу«Агкі го Ахріху ен Ти Тр зе йап то бег Акл Рго Дід за БОС БО

Ту Те уві маг мМеї Ар Пе ух Уа! Рго Ме Аг Оу Рго сів РБе 610 ві 5 ігр Аге Не Че Асп біу Або Пи Мейіузіу5 сініух А5п Уа ТВг 525 6030 635 ово ігцієц Тріух«Рівівги Мегіу5 Ап Ар егі ги Суз бег Ма От

Б зо баз

Аге Тут Уві Пе Авп Не Нів Те 5ег Сух Авп бі; ТЯ Тго Зег Бін

БО бо Бл

Аза Уві см Аза Ні Пн у Бе тв Рнеїви Та Пт і ів Ав щз БО Бо

Нів ТВ Уаі ТВ Уві Бе Ав Пе Азп бек Не Оу Ав бе Уа Ав

БЮ Ба кю

Азп Не Аблівец ТЕ РНе бе Ітро Рго Ме хегі ув Уві Азп Пе Ма! ль о Кв: ап бів зегіви зег Ав Туг Рога їв Авп бе ет Сух Ма! Ме Уві бек 725 ЗИ 735

То Ввівен яв Рто бегАвр Тугіує ен Ме туг РНе Це Не біб о 745 5

Тизіух йзпівц Ап зі дер сх бів Неіуз Пріви Ате Це бег 53 во 55 зегбег Уві уві ух Туг Тут Не Ні Азо Ні Ре Пе го Не Бій 7 я5 УО іу5 Тут оп Рпебегіги Тут Рго Не Ре АлЛеє оц Оу Маї Су Гуз 85 тва 755 ВОД

Ріо ух Не Не Асп бек РБе Тр бів Аяр Або Ме сіб 1 у Ніх бів

ВОЗ 10 ві зег Ахзрв двух ТП Ні ТВг Су Рго Ро Су Рго Аа чо сівівн я 8 ве іен Зі» бік Рго бек Ма! РБеїеци Ре Рго Рго ух Ро ух Ахо ТВг що о іен Меї Не бег Аге Тр Рго сід Уаї Тег Су» Маг а Уа Або Ма 5 850 зек Ні ін Ар го сів Уа! тує РНе двп То Туг Уві Авр Бу Уві оз ЗЕ 875 ВО сш ма! Ні Аєп Аба Гу ТВг ух Рго Аг СВО бій Туг Асп бег що 50 вко

ТНК ТугАтги Уві Ма! бЗег Увіїеци ТП Уа ген Ні сіп Азр Трієц що 5 жо

Ахп Бу ев біб Туг ух Сузіуз Ма! Зег Азлп ух Аівіви го Лід 915 о по5 го Не олії ух Пн Ме Зегі ух Дів ух С3у вів Ро Ат о Рго 930 935 ве) сій Уа! Ту Пгіец ро Ро бег Ат Аза бів іец ТП уз да бій 945 950 955 ЗБО

ЧУаібегіви Тк Сус гео ма ує СТУ РБе Тут Рго Хег Ар Ме Дів о 25 325

Уві Си Тер бів 5ег деп Бу сів Рго Сів Ап Абп Бугу ТК ПЬЄ чо 55 Ба

Рг Рго маг ен Аерооег хр собу зе Ре РНеїву Тут бегічувівц «а і Ох

Тег Ма! Аері чув ет Дте Тр бів біз Ох вп уві РБе Зег Су о 105 3030

БЗег Уа! Меє Ні Сі Аїхіви Ні Аби НЕ Буг Бу опіум ет 25 іо 1035 івибег іі ви бет Рго бір іує о іме «2305 93 «вії» вай «ій» РЕ «213» Штучна послідовність «аа 2223» МНЕРВ-ттй ва 1-81: Масаса Тазсісніатіз ГЕРН (Е22-Ю0837 из

ХР 00531941 із заміною І27Арав в157-ИА: птус-тує-тексагістидинова мітка «В» 93

Рне Ахп ви бБег Тук Рго Пе Пн Рез то Ага Рпебухіву Зег Су 1 5 10 15

Меї Рга Бгто дев Заг ТНт Туг А5о тТУк РНеїенієц Ме дів оіхіви за зо

Зетіух Авп ПТН бет Авпіви Азп Ох НІВ Туг Ва ТЕ Вів Уві ов аа я ав

РНе Ап ех бек Авр Пг Ні пе бе Ап ец бегі уз Пе ТЕ РБе щі з ОО

Ні Сух Суз Рпе Агро бет ої бій Ар Аг Ап бух ет і ец Су Дів 70 75 ВО

Авр дп Пе сін Оу е5 ТЕ РБе Уві Зег Пе Уа! Азп бе Зег Ма! 85 до 95 рве біп Сів Меї Су дів Дол То Аза Ме біп Суб Терівціуз Оу

ІН) нь що

А5рівніувіви Ре Не Суз Тут Уві бій бетігви РНе Гу Азп Рго 115 123 125

Ре уз Депо Туг уз Нізїуз Уві Ні еціви Тут УМайієц Ро бін 130 155 150

Уа ен бі Авр бег Рг ен ув Рто бів уз Сі Зег Ре іп Мей 155 153 153 150

Ма Ні Суз Аза Су зе Уві Ніз ін бгр Суб січ Суб івн Уа! Бо 155 170 175

Ма Рго Тк Аівіує в ец бул Аза Пгівеціво МегСухзівніує Не іо 155 що

ТНЕ чек Оу ОМ Уві Пе бе біп бег Ро гео Ме бег Уві (зп Рго

ІЗ5 200 205

Пе Абп Ме Уві Гуз Бгто АБО го Рго ев біжі ви Ага Ме іш Пе в 15 го

ТНгАзв Ав ох Ахмівеці уз Ме ет Тр 5ег бег Рго Рго бер уві 725 230 235 280

Рго ре Ргоіїгецізій Гуго Майіуз Тут бек сі Азп бег ТАК ТВг 245 з50 255

Уа пе Аг Біб Аів Ахріух Ве Уа бег Аа Тк бегівцівс Уві

Бо 265 РІ

Авро Су Пеіви Бгто Су бет бег Тут бій ма! іп Ма! Ате Зі Гру їз 90 285

Ат ей Азо СУ Рго су Пе Тгр бег Або Таз ет Те Рго Ні Уа! що 295 зо

Впе Ти ТВг бів Ар Уві Це Тек Рве Рго Рго уз Пе Гео ТВ бе

З Зо 35 за

Уа! біб бег Авп Ма! бег РНе Ні Суз Це Гуг у Авп о А5п і ух 325 35 335

Ме Уаї бек бе ух ус Це Ма! тр То Ме А5півць Ав бім ух здо ЗАЗ з

Пе Русів 5ет бів їуг Або Маї Ма 5ег Азр Ні Маг бегіуз Уа! 355 3650 зо

ТВЕР Бе Бе А5півц Ахп си ТП ух Ро Аге у ух Ве ТП туг

ЗУц 375 зво

Аза Дід ма! Гук Су Су Депо Ні бін Су Ні Ніз Ат Тут Дів

З ЗО 395 я сошіец тує Ма Не Ар Уві Ап Ме Доп Пе Зег Сух 0 ТВ Ахр яд5 що ща су Ніхївц Твгіуз Меї НН Суб Аге Тр бег Пи Азп Пт Не бій до 425 з30

Зегіви Ага сну бег Тигіви біпівц Аге Тут Аг Ага бегбегіви з35 340 45

Туг Сух Ре Ар Не Рго бег Ме Ніх Рг Пе Зегі ух Рго уз Ар о 40 яо0

Суз Тугівц біп бег Ар іх Ре Туг Я Су Ма) ве зів го Пе 805 ай 473 ЗО

Рнеїєнівгв бек сту Тут ТВ Ме тп Пе Аге Ме Ав Ніз Ро їв аВ5 450 ад

СНУ Бегієн Ар бег Ро Рго ТВ Сух Май ео Рго Ар зе Ма! Уві

Ж ще з іуз Рта ем Рго Рус бег Зег Увії уз Аба сім Це Пе у Аби Не зі 52 553 сі гецієціух Ме бек Тр об ух Бо Уа! Бе Рго оби Ас Авп зда з35 Зо

Тен ов Ре бів Ме тв Тут Сіміво бег обу уз бін Пе бів тго з45 -щО 553 50 іме МЕС Бут Авр У Тут Ахр Ада ух Зегі ух бе Уві бегівц Рго з з 5/Ь

Уві Рго Ар Ре Сук Аа Ма Туг Аз Ма а Маг Ате Су ук АгЕ

За 5Ва що зегАсо Біуіви Зіжі ви Тер Бег Ап Тго бег Ап Рго Ав Тут ТВ я 505

Уві Уа Мет Ахр Пе уз УвЕРто Мег Ага Оу го Сів Ре То АтгЕ о 515 Бай

Ме пе Аспосіу Або Пе Мебєіузіув сів уз Авп Уі гіецієц

Ба в 535 Бо

Тріуз Рів вець Мегіуз Ахп Азрбегіви Су зег Уві іп Ага ТУ щї5 ЗО Ба

Уві Не Ап Ні Ніз Ту бег бух Аза Оу Пн оТко Зег Он А5о ув!

Бай БОБ 5

Сх Ази Ніз ТВгі уз Ре Тег РБеїец Тор Те іш сів Аа Ні Тг у5 ко Бо чаї Бе Уа ен Аа Пе Ао Зег Пе Су Ав бет Ма) Дів Абп РНе оз дю

Аспівци Пе РНе бек То Рго Ме бЗегіує Ма) Ддхп Пе Уа бів Зег яв о 715 72

Іги Зег Ав Тут Рез іви Аяпбег зер бує Ма! Меїви бе Тр Це 725 230 735 івибет Рго бег Абр Тугіуз в ец Меї Туг РБе Пе Не Сі Ттріух ад 45 та

Аєпіви Ахп Зір бер у бід Пеїуз Ппрівн Аге Не бег бе 5ег 735 ОО 75 чаївуз ік Туг Гуг Не Ніз а5о Ні РНе Пе Рго Пе сі ув Тук

ЕЕ 75 тва бів Ре бегівиу Тук Рго Ме РБе Мет біц Оу Уа су уз Ро 1 уз

У85 а У795 В

Ле Не Ап бег Ре Дія іп Азов Аа Пи он ух Ні бій Аа до 505 81 Щ15 сін біпіузіви Не зег біз ві Азрівєн зіу сіу сіб сСіпіузіви вл 5 вза йЙе его сії Азріви НІХ Нв Ніє Ніх Ні: Ні: вай «а» За саїї» ВАВ «12» РТ «213» Штучна послідовність «а» «2232 пі ЕРК-потй за 1818: мамнішачий ЕРА 25-0839 з МЕ 6б6258.9) за

ВІЧЕ: тус-піує-тексагістидинова мітка «щи іч б5півн Аа Ту Рго Пе бег Рго Тгріуї Рнеїубзієм РНе Суз ї З 10 15 су Рго Рго Аа Пи ТВ Азр Азо Зет РВеї ви баг Рго дів су Дів а а зо

Рто Або Абп Аа Зег Аа їеніуз сіу Дів 5ег сін Аа Ме Уа! ОЇ 3з Б 45

Дідаіух Ре Абзп бег Зег бі Пе Тут Ма! Бгто Зіцівн бегіує ТВ

З Зо БО

Ма! Ре Ніз Суз Се Ре Оу Ав бін біп Оу іп Азо Суз ет дів 7 75 о ієц ТнЕ Ар Азп ТОВ ОМ уз Ті ес Аа бег Уві Уа! уз Дів о ща 85

Заг Ма! Ре Аг біпівц у Уві Ап Тгр Авр Ве ін Сух Ттр Меї що 105 ії іуз сіж Ахрівц тк тео РНе Пе Су Нія Мет бін Рг еи Ро ух 5 о 125

Аза го Ре уз йхп Гуг Ахр епі ух Уві Нізієціви Тут Авбрівц 130 і135 150

Рте бій ві Не дер Азор бег га г ес Рго Ро і ен уз Аер бе РБе 145 150 155 15

«ій т Уа бів Су Аа Суб его Аг сіх Сух СВЬ Сух Ні Уа! 1855 173 175

Рг Ма Ро Аге лід увів Аза Туг Аідіецівн Мет Тугівц бін 189 1855 ї15а

Ме Тіт бек Ав бі Ма бек Бе бів Зег Різ Тео Ме бегіву сій 15 в 205

Ріо Месіви Мар У і ух Рго Ахо Бгто Рго ги біківци Ні Меє сів 21 15 290

Маї ТП Або Азр біу Азпівніух Не Хег Ітр А5р бе іп Пк Ме а3а Аг

Ав ге Ре Ргоївц бій Туг іп Уві тує тугі СН Ав бег Ту 845 5 255

Ме маг Аге сі Аа Айва Со Пе Ма! бе Аа Тгбегівцієв Уві

БО 2655 270

Азов зе Уа фец то Бу бег бетг Ту Вів Ма! біп Ма Атге бег ух 7 КО зщ5

Атіги Ар Оу Зег оїх Ма! Тгр зег Азр Тр зе Зет го біп Уаї зап 295 Зд0

Ре ТПВ оп Або Маі Уа! Тут Ре Рго Рго ух Неївгц Пі Зег зп зі 315 320

Уа т Зег Ал дів беї Ре Ні Сух Це Туг і у Ап ою доп зів аг з30 зЗа5

Ме Пе Бех бегі ух сів Це ма! Тр» То АгЕ Ахпіви АВ Біб у зб 345 з

Пе Ро сн Не бій Туг ех Не Маї ет Ар Атя Уві бегі ух Уві 355 зво 365

ЧТ Рене бег Аєпівні уз Аа Ти Ага Рго Ага су чо Ре ТЕ Тут

З 375 З

Ар Ав Уві Тут Су Сує Ахп ів іп Ав Су Ні Ні5 лев Тут Дід 385 за зах А сбіцівц тут ма Не Ахр Уа Ахп Не Аєв Це бег Суз Од ТВ Дер 305 410 415

СУ туге т 5 Ме ТвгСує Ага Тер ет Рго бег ТА Це іп 433 425 ве

Зегівєц Ма Сі Бех ТП Маг біпівц Ате мг Ні Аге Ати бегіви 435 40 445

Тук Су5 Ро Ар Зег Рго 5єї Це Ні Рго ТогоЗег Зі Рго ух Ап 450 я55 50

Су Уві Тец біп Ат Авр оіу Ре Тут іш Суз Уа РБе бір Рго Не ад З 4/5 ав

Ріеівцівиь зегоїх Тут Пт Меї Но Пе Ага Пе Ап Нів ет іеи 485 о 495 сСіузегівн Або Хег Рго Рго Пи Суз Уві т ец рго Авр Хе Уві Уві що 5

Іуз Ртаїгви Рго Рго зег ла Уві вуз Дів сін Не Тв уві Ал ТЕ зі5 520 525

Сіюівенівц ух Уа! ет Трої уз Рго Уа! Ре Рго СВІ Ап Аг а з3з В іви бій Ре біп Це Ага Тут Оу ів бег Оу ув Бо Пе біп Ттр заз 55 зв збо іу5 ТВг Ні Сію Ма! Ре Ар Дів Гуз Берг уз бег Дів бегівцієн

Зо 57 Був

Уагбегдхрією Сух Ав Уа Тук Уві Ма! оів Ма! Ат Суз Ага Аг

ЗВО зва м ієн Ав ооіуївв біу Туг Тр зег Або Тр бег бег Рго вів Тут Та -95 БО 505 іїви Ма! Меї др уві г уз Уа! Рго Ме Але Оу Ро З Ре гр Ат

Ба БІ пад іує Меї Ар Сі зр Ма! Тгіуз ув Бін Ат Асп Уві Пн іввіву

БІ 30 535 Ба

Тівіує Рга бен То ує Ахп Або бегіви Сух бег Мі Агов Агро Туг роо Бо

Уві май уз НЕ Але ТІ Аа НЕ дов Су ТЕ Тго бегзію Ахр Уві

БО оо Бл

Оу Ап Ага ТВЕР Ап ес ТВ Ве їви тро Тв ів Рго Ав Ні ТБ в о ща

Маїтіж Уві ец Ав Уві Ап оегі ви Су Дів Зегівгн Уві Азп Ре що ра то

Азпіви г Ре бе Пр Ро Меї бегі уз Ма) 5ег Аів Уві си бег ло 715 720 іІгиЗег А Тут Ргзієц Зег бет бе Сух Ма! Неїви бе То ТП 725 ЯЗ За івцпбег Рг Ав Азов Тугбегівнієм Тутгієц Уві Пе Зі тріух тай 745 75

Меіїви Азп Он Абр Ар Біу Мегі у грін Аге Не Рго бег А5п ува то 55

Мах іух не Тут Не Ніх Ах йхо РНе Пе Рго Це БВ ув ук г из ТБ о Ре бегівн тугРго Уа! Ре Мессі Оу Уа Су ух Ро і ув тв о 795 ВО

Пе Пе Авп сну Не Те Гу Азов Аа Пе Азо ув Сів іп Ап йо ще що 515

Аа біу Спи Оіпіухвец Не баг спи Сів Ар ги Сі Оу іш віп яд 535 вк

Іухвец Не бег сі бів Азріе Нів Ні Ні Ніх НІХ Ні 535 як ВАЗ «10 чо «2112 846 «212» РАТ «13» КІтучна послідовність «а» «23» п ЕРК-пап да 1-18: 1 БЕРН щури 122-839 мз МР 0367381 аа

Бі: вустуєтенсапстидинова мітна «ЩЕ чо іє Ахпіви діа Туг Рго Ту баг Рго Тв Ага Ре узі ви РнНе Сух 1 З 1 15

Дів Вго Рго бек Пн ТП Азр Азо ес Рпеїен зег Ро Аід Су Уві а а зо

Ркго Азп Ахо ТЕ БеїБегіву уз Ру Аа Зег ої Дівієц Уві Бі

З5 чо 4йз

Ав Ре Ап баг Тг Оу Не Тут уві баг бішієц Зегі ух Ту ща За БО

Пе РБе Ніх Су«х Сух Рпе біх Аха би іп Су іп Ал Суз бег Ав

НА! її 8 іє ТПг сту Або Те он сім і ує Пі ви Аа баг Ма! Май ух Рго яз Зо з іви Уа! РБе Ага сілівцн сту Уві Ап то Ар Пе За Су» То Меї 1 нь що іч5 (у дрів гг еи Ре Пе Су Ні Ме Зін Ріо їенівецікх 115 13 125

Авп Бгто Ре уз Ахп Туг А5р Зегіуя Уві Нізієцівн Тут Азр ев їз 135 150

Рга ів Ма! Не Азр Ахвівн тов Рго га їенічх йзр бег РНе 145 ї150 155 150

Сів Пе Маї сій Суз Аза Суз Зег Ма! Ага спи Сух О0е Сух Ні Уві 155 17 175

Рга Уві Рго Ате вів Гуз Уві Азп тТук Аз Гецівн Мет Тугівн сіб

Іяо і55 190

Ме Тнг бег Аа Су Уві зег Ре біп ет Рго г ец Ме бегі ги бів 195 200 5

Ра Мекієн Уа Ярі ух Рго Ахр Ра го Ге бі ви Апе Ме он 215 га

Ма тт Азр Ахо у Аопіви і уз Не бек То Ар Хе біп ТВгіув 225 230 233 гад

Аа го Ре Рг ген сій ТугОіп Уві! у Тут ео біб Авп бек ТЕ а 255

Пе Уві Аг ти віз Аза би Пе Уві бег Ахр Тім зегівцієв Уві за 255 279 хро Магіец Рго Оу бе бет Гуго Ма іп Уві Але бекіув 275 25О ва

Агеі гц Ар їх 5ег Ну Маг Трр Зег Авр Пр зегігн то віпівц 90 га5 З

Рве тік Тег оп Аво ма! Ме Туг РНе Рго Ро ух Меіви ТНг5ег зда З10 з5 з2о

У су ек Ап Аа 5ет Ре Су Сух Не Туг ух вар 5 Ахи ЗВ 325 зо заз

ТЕ ее бегб5егіує бій Це Ма Тгротгр мМегАзпівн Аа бівіух за за 3

Ме Бо бів Пе сів Гуго ТВт Уві Хег Азо Ніє Пе бегі е Уві 353 збо зЗ05

ТЕ внНе бегАзпівніко Дія ПЕ Аге Ро Ага сі ух Ре п тує зу Зо

Аво іа Уві Тут Суз Сув Ап іш іп Аа Су Ні Ні5 Ате Тут Аз зво вч З а сів ви Тут Ма! Пе Або Уві Ап Не Ап Пе баг Су 36 ТАг Аз 05 о 15 сх тугі ву Пух Меє Тр Су Ага то бег Рго бек ПА Пе св

Зо 825 430

Зегієвм Уа! біу Зег Пг Уа! ОН г ец Аг Тут Ніж Аг Агов бегієн 35 40 5

Тут Су Рго Ар Аза Рго бет Пе Аге Рго Ту его івціув Абл 50 455 я

Суз Майї ге бів ТЕ Аза Оу Ре Туг бін Суз Маї Ре бів Рго Це

З85 4 ау ако

Рреїеціви бебі. Тук Пи Ме Тер Пе Аге Пе Ах Нізбегіви ща Я 5

Оіу Зегієн Або зе Ро Рго ТА Суб Ма) Гео Рго Азо Зег Уві чаї ю ща зів їує Рго ен Ро Рго ет Аеа Уві Туз Ав Сію Це ТВ Не Аза ТНК зів АВ лаз сСіхієцівціуз Уві ет Тр бін ух Ро Маг Ре Рго сів Ах Ахп за5 5 іеш бів РБе біп Не Агте Тут бі ів Азп о біу ух Зб Пе бів Тер за заз 5

Ту ПВ Ніх сь Уві Ре Ар Ав уз бе і ув бег Ав бегіви Рго

Зо вл 5/З

Уа! Зег Аврівц Сух Аів Уві Тут Уві Ма! біл Ма Ага Суз Агр дев

ЗО 585 5-8 іенАво Сх ец біу Туг то зег Азп тр Бег бет Рго Дів Тут ТВ ко БИ БО іви Уа Ме Ар Уві! у Ма! Рго Ме Аге Зіу Рго би РНе Тр Ат 516 віз 6520

Пе Мет Абзр Су Азо Пе Пе 1 узіуз Сі Ат Азл Уві Тбгіенієд 525 5 35 що

Твіу«бгогіви Мегіух Ап Ан бегівци Су бег Уві Де Ат Тут во воз

Маг маг ув Ніх Ага Тк Ав Ніз Аво бі ТП Тгр его Ар мні

БО 6бБо БА

«ФУ Авп ов Тв Авпіви Те РНе ер Тер Аа сін бег Ава Ні ТВ

Був щяо 585

Уві Тк Уагіен Аа Це Або бег Пе Сіу Аід бег ви Уві Ав Бе 63 БО 20

Азпівги ТВ РБе зек їго Рго Меїбегіух Уві Азл Аза Ма! Ор Хе 75 710 5 720 ігибег Ав ТугРгоіви бер баг бе у Ма! Цеіви 5ег Тр т 735 730 735 іеи бек Ріо Азп Авр ТугЗегієчівн Тукіецч Мві бе Бію Ттріу 740 тА У дзпіви Азп Азр Ахр Азр Бу Мегі уз Трівн Ате Пе Руо Хеїт доп

За 750 755

Уві Авліуз Туг Тує Пе Ні Азр Ав Не Пе Рго Не ів Єуе Тут 7 Та ва іп ве бегіги Тугрго Уві Ре Меси су Уа сім і ух Рго ув тва 20 795 БО

Зе Ве Ап іх Рпе ТУ ух Ар Азо Не діа ух бів Бій Ал зр 85 ВІ ящі5

Ав ім ібн біпіув бе Ме бег біб і Ар бе іх бу ої бій в 825 5 іух ве Не чег бін сн Авріви Ні Ні Ні Ні Ні Ні 835 во ща5

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Виділене антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, що зв'язується з лептиновим рецептором людини (ГЕРЕ), причому антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент містить наступне: (а) області, що визначають комплементарність (СОР) варіабельної області важкого ланцюга (НСУР), що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО, вибрану з групи, що складається з БЕО І МО: 2, 5ЕО ІЮ МО: 42 і БЕО ІЮ МО: 58; і (Ю) СОВ варіабельної області легкого ланцюга (І СУР), що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІО МО: 10.

2. Виділене антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, причому антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить варіабельну область легкого ланцюга, що містить: І СОНТ, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 12; ІГСОК2, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 14; і ІГСОКЗ, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 16; і варіабельну область важкого ланцюга, що містить: () НОСОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 4; НОоОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 6; і НОСОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 8; (її) НОСОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 44; НОоОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 46; і НОСОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 48; або (ії) НОСОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 60; НОоОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 62; і Зо НОСОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 64.

3. Виділене антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 2, який є повним антитілом, що містить варіабельну область важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 2, і варіабельну область легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 10.

4. Виділене антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 2, що є повним антитілом, що містить варіабельну область важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 42, і варіабельну область легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 10.

5. Виділене антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 2, що є повним антитілом, що містить варіабельну область важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 58, і варіабельну область легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 10.

6. Фармацевтична композиція, що містить антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп. 1-5 і фармацевтично прийнятний носій або розріджувач.

7. Застосування фармацевтичної композиції за п. б для приготування лікарського засобу для лікування захворювання, асоційованого з або викликаного передачею сигналу лептину, у суб'єкта, який цього потребує.

8. Застосування за п. 7, при якому захворювання або стан, асоційований або викликаний передачею сигналу лептину, вибрано з групи, що складається з наступного: анорексія, психічні розлади харчової поведінки, кахексія, кахексія при хронічному захворюванні нирок, кахексія при застійній серцевій недостатності, легенева кахексія, променева кахексія, ракова кахексія, аутоїмунне порушення, запальне захворювання кишечнику, червоний вовчак, розсіяний склероз, псоріаз, серцево-судинні захворювання, підвищений артеріальний тиск, депресія, неалкогольний стеатоз печінки, нейродегенеративні розлади, депресія, рак, нирковоклітинна карцинома, меланома та рак молочної залози.

9. Застосування фармацевтичної композиції за п. 6 для приготування лікарського засобу для лікування захворювання або стану, асоційованого або викликаного активуючою ГЕРЕ мутацією, у суб'єкта, який цього потребує.

10. Застосування за п. 9, при якому мутація І ЕРЕ являє собою ГГ ЕРЕ О223Б.

11. Застосування за п. 9 або 10, при якому захворювання або стан, асоційований або викликаний активуючою ГЕРК мутацією, являє собою кахексію.

12. Застосування за будь-яким з пп. 7-11, при якому композиція терапевтично поєднується з другим терапевтичним засобом і додатково передбачає введення композиції суб'єкту, та причому другий терапевтичний засіб вибраний із антидепресантів, стимуляторів апетиту, лікарського засобу для лікування анорексії і кахексії, інгібітору СОХ-2, НПЗП, лікарського засобу для усунення втрати м'язової маси, м'язової функції і/або м'язової сили з кахексією або без неї, лікарського засобу для лікування неалкогольного стеатозу печінки (МАРІО), лікарського засобу для лікування інфекції ВІЛ/СНІД, блокатора продукції ТМЕ-альфа, антиоксиданту, антагоніста фактора некрозу пухлини (ТМЕ), стимулятора В-лімфоцитів, інгібітору ангіотензинперетворюючого ферменту (АСЕ), інгібітору кінази та хіміотерапевтичного засобу.

13. Антитіло за п. 3, причому варіабельна область важкого ланцюга зв'язана з людським дві

Ес.

14. Антитіло за п. 4, причому варіабельна область важкого ланцюга зв'язана з людським Ідс4

Ес.

15. Антитіло за п. 5, причому варіабельна область важкого ланцюга зв'язана з людським дві

Ес.

16. Фармацевтична композиція, що містить антитіло за п. 13 та фармацевтично прийнятний носій або розріджувач.

17. Фармацевтична композиція, що містить антитіло за п. 14 та фармацевтично прийнятний носій або розріджувач.

18. Фармацевтична композиція, що містить антитіло за п. 15 та фармацевтично прийнятний носій або розріджувач.

19. Виділене антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, причому антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить: варіабельну область легкого ланцюга, що містить: ІГСОН, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 12; ГСОК2, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 14; і ІГСОКЗ, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 16; Зо і варіабельну область важкого ланцюга, що включає: НОСОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 4; НОоОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 6; і НОСОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 8.

20. Виділене антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, причому антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить: варіабельну область легкого ланцюга, що містить: ІГСОН, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 12; ІГСОК2, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 14; і І СОВЗ, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 16; і варіабельну область важкого ланцюга, що містить: НОСОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 44; НОоОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 46; і НОСОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 48.

21. Виділене антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, причому антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить: варіабельну область легкого ланцюга, що містить: ІГСОН, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 12; ІГСОК2, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 14; і БО ІСОКЗ, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 16; і варіабельну область важкого ланцюга, що містить: НОСОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 60; НОоОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 62; і НОСОК, який містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІО МО: 64.

22. Антитіло за п. 13, причому варіабельна область легкого ланцюга зв'язана з константним доменом каппа легкого ланцюга каппа.

23. Антитіло за п. 14, причому варіабельна область легкого ланцюга зв'язана з константним доменом каппа легкого ланцюга.

24. Антитіло за п. 15, причому варіабельна область легкого ланцюга зв'язана з константним доменом каппа легкого ланцюга.

25. Ізольований полінуклеотид, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга та варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла або антигензв'язуючого фрагмента за будь-яким із пп. 1-5.

26. Полінуклеотид за п. 25, що містить нуклеотидну послідовність, викладену в ЗЕО ІЮО МО: 41 їі

9.

27. Ізольований вектор, що містить полінуклеотид за п. 26.

28. Клітина-хазяїн, що містить вектор за п. 27.

29. Спосіб лікування захворювання, пов'язаного або спричиненого сигналізацією лептину, у суб'єкта, що включає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості антитіла або антигензв'язуючого фрагмента за будь-яким із пп. 1-5.

30. Спосіб за п. 29, причому захворюванням є анорексія, психічний розлад харчової поведінки, кахексія при хронічних захворюваннях нирок, кахексія, кахексія при застійній серцевій недостатності, легенева кахексія, радіаційна кахексія, ракова кахексія, аутоїмунний розлад, запальне захворювання кишечнику, червоний вовчак, розсіяний склероз, псоріаз, серцево- судинні захворювання, підвищений артеріальний тиск, депресія, неалкогольна жирова хвороба печінки, нейродегенеративні розлади, депресія, рак, гепатоцелюлярна карцинома, меланома та рак молочної залози.

31. Спосіб лікування захворювання або стану, пов'язаного або спричиненого активуючою мутацією ГЕРЕ, у суб'єкта, що включає введення антитіла або антигензв'язуючого фрагмента за будь-яким із пп. 1-5 суб'єкту, який цього потребує.

32. Спосіб за п. 31, причому мутація ГЕРК є ГЕРК О223К.

33. Спосіб за п. 31 або 32, причому захворюванням або станом, асоційованим з мутацією, що активує ГЕРЕ, або спричиненим нею, є кахексія.