UA127258C2 - METHOD OF INHIBITING FIBRIN POLYMERIZATION - Google Patents
METHOD OF INHIBITING FIBRIN POLYMERIZATION Download PDFInfo
- Publication number
- UA127258C2 UA127258C2 UAA202002123A UAA202002123A UA127258C2 UA 127258 C2 UA127258 C2 UA 127258C2 UA A202002123 A UAA202002123 A UA A202002123A UA A202002123 A UAA202002123 A UA A202002123A UA 127258 C2 UA127258 C2 UA 127258C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- fibrin
- polymerization
- peptides
- ogen
- fragments
- Prior art date
Links
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 64
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 title claims abstract description 63
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 title claims abstract description 63
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229940099990 ogen Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 10
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 7
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 4
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 4
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940127217 antithrombotic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 1,1-Dichloroethane Chemical compound CC(Cl)Cl SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001147 pulmonary artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Винахід стосується способу інгібування полімеризації фібрину синтетичними пептидами, які імітують фрагменти суперспіральної ділянки фібрин(оген)у, в якому застосовують суміш синтетичних пептидів АВ91-103 MEILRGDFSSANN, В,126-135 QKRQKQVKDN, ,69-77 NPDESSKPN в еквімолярному співвідношенні.The invention relates to a method of inhibiting fibrin polymerization with synthetic peptides that imitate fragments of the superhelical section of fibrin(ogen), in which a mixture of synthetic peptides АВ91-103 MEILRGDFSSANN, В,126-135 QKRQKQVKDN, ,69-77 NPDESSKPN is used in an equimolar ratio.
Description
Винахід належить до галузі медицини та біотехнології і полягає в пригніченні внутрішньосудинного тромбоутворення шляхом інгібування полімеризації фібрину, сумішшю синтетичних пептидів -- структурних аналогів фрагментів суперспіральної області фібрин(оген)у; винахід може бути використаний при створенні ефективного антитромботичного препарату.The invention belongs to the field of medicine and biotechnology and consists in inhibition of intravascular thrombus formation by inhibiting fibrin polymerization with a mixture of synthetic peptides -- structural analogs of fragments of the superspiral region of fibrin(ogen); the invention can be used in the creation of an effective antithrombotic drug.
Патологічна активація системи зсідання крові яка призводить до внутрішньосудинного тромбоутворення шляхом появи фібрину в кров'яному руслі та його подальшої полімеризації з формуванням тривимірного каркасу тромбу, є основною причиною таких смертельно небезпечних захворювань, як гострий інфаркт міокарду, ішемічний інсульт, тромбоемболія легеневої артерії, тощо (1.Pathological activation of the blood coagulation system, which leads to intravascular thrombus formation through the appearance of fibrin in the bloodstream and its subsequent polymerization with the formation of a three-dimensional framework of a thrombus, is the main cause of such fatal diseases as acute myocardial infarction, ischemic stroke, thromboembolism of the pulmonary artery, etc. ( 1.
Тому пригнічення патологічного тромбоутворення є основною метою всіх існуючих антитромботичних засобів. Однак засобів, які б безпосередньо інгібували саме полімеризацію фібрину та формування тривимірного каркасу тромбу, існує небагато.Therefore, suppression of pathological thrombus formation is the main goal of all existing antithrombotic agents. However, there are few means that would directly inhibit the polymerization of fibrin and the formation of the three-dimensional framework of the thrombus.
Відомо способи інгібування полімеризації фібрину, які використовують низькомолекулярні сполуки (2-Methods of inhibiting fibrin polymerization are known, which use low-molecular compounds (2-
З). Ці способи мають ряд недоліків, а саме виготовлення сполук-інгібіторів шляхом хімічного синтезу передбачає використання вихідних сполук, а також появи сполук-інтермедіатів, які часто є токсичними та можуть у слідових кількостях знаходитись у кінцевому продукті. Такі сполуки мають низьку специфічність до молекули фібрину, можуть бути афінними як до цільового протеїну (фібрину), так і до інших протеїнів крові, що буде заважати їх нормальному функціонуванню.WITH). These methods have a number of disadvantages, namely the production of inhibitor compounds by chemical synthesis involves the use of starting compounds, as well as the appearance of intermediate compounds, which are often toxic and can be found in trace amounts in the final product. Such compounds have low specificity to the fibrin molecule, may be affine to both the target protein (fibrin) and other blood proteins, which will interfere with their normal functioning.
Відомо способи для інгібування полімеризації фібрину на основі моноклональних антитіл або ГРар- фрагментів моноклональних антитіл, епітопи для яких перекриваються із сайтами полімеризації фібрину (4-6). Основними їх недоліками є значна молекулярна маса моноклональних антитіл (150 кОа) та їх Рар- фрагментів (40-45 кра), що обумовлює їхню потенційну імуногенність. Можливе індукування імунної відповіді суттєво ускладнює застосування Бар-фрагментів як антитромботичних засобів.There are known methods for inhibiting fibrin polymerization based on monoclonal antibodies or GRP fragments of monoclonal antibodies, the epitopes for which overlap with fibrin polymerization sites (4-6). Their main disadvantages are the significant molecular weight of monoclonal antibodies (150 kOa) and their Rar fragments (40-45 kA), which determines their potential immunogenicity. The possible induction of an immune response significantly complicates the use of Bar fragments as antithrombotic agents.
Відомо способи інгібування полімеризації фібрину на основі поліпептидів, які мають афінність до тих ділянок молекули фібрину, що містять сайти його полімеризації та сайти міжмолекулярних взаємодій, що обумовлюють самоскладання молекул фібрину. Зокрема існують засоби на основі окремих пептидів або нефракціонованої суміші таких пептидів чи низькомолекулярних фрагментів, одержаних шляхом плазмінового гідролізу молекули фібрин(оген)у (7-9). До недоліків таких способів належить, зокрема, використання фібриногену людини як джерела функціонально активних пептидів-інгібіторів, що є небезпечним через можливу контамінацію препаратів вірусами та пріонами. Також до недоліківThere are known methods of inhibiting fibrin polymerization based on polypeptides that have an affinity for those areas of the fibrin molecule that contain sites of its polymerization and sites of intermolecular interactions that determine the self-assembly of fibrin molecules. In particular, there are agents based on individual peptides or an unfractionated mixture of such peptides or low-molecular-weight fragments obtained by plasmin hydrolysis of the fibrin(ogen) molecule (7-9). The disadvantages of such methods include, in particular, the use of human fibrinogen as a source of functionally active inhibitor peptides, which is dangerous due to the possible contamination of drugs with viruses and prions. Also to the disadvantages
Зо застосування фрагментів фібрин(оген)у для інгібування полімеризації фібрину належить їхня потенційна імуногенність. ІНШИМ важливим недоліком є складність стандартизації процесу одержання триптичних фрагментів фібриногену через велику кількість факторів, що впливають на процеси протеолізу та хроматографічного розділення сумішей.Their potential immunogenicity is due to the use of fibrin(ogen) fragments to inhibit fibrin polymerization. ANOTHER important drawback is the difficulty of standardizing the process of obtaining tryptic fragments of fibrinogen due to the large number of factors affecting the processes of proteolysis and chromatographic separation of mixtures.
Відомо способи, які передбачають використання синтетичних антитромботичних пептидів. Зокрема, застосування пептиду ТКРЕРОР дозволяє знизити інтенсивність тромбоутворення (10). До недоліків цього засобу належать заявлені ефекти пептиду на компоненти системи фібринолізу та тромбоцити, що утруднює контроль за ефективністю його застосування.There are known methods that involve the use of synthetic antithrombotic peptides. In particular, the use of the TKREROR peptide allows to reduce the intensity of thrombus formation (10). The disadvantages of this tool include the declared effects of the peptide on the components of the fibrinolysis system and platelets, which makes it difficult to control the effectiveness of its use.
Відомо спосіб застосування пептиду ОРКР та його кон'югатів, що дозволяє блокувати центр полімеризації «а», запобігаючи фібриноутворенню (11). До недоліків такого засобу належить здатність пептиду взаємодіяти не тільки з фібрином, але й з фібриногеном, концентрація якого в плазмі крові дуже висока (у нормі - 2-4 г/л), внаслідок чого для досягнення антиполімеризаційного ефекту необхідне застосування високих концентрацій пептиду або його кон'югатів. Крім того, інібування цієї стадії полімеризації фібрину більш жорстко інгібує полімеризацію фібрину, що небезпечно в разі виникнення кровотеч.There is a known method of using the ORKR peptide and its conjugates, which allows blocking the polymerization center "a", preventing fibrin formation (11). The disadvantages of such a tool include the ability of the peptide to interact not only with fibrin, but also with fibrinogen, the concentration of which in the blood plasma is very high (normally 2-4 g/l), as a result of which the use of high concentrations of the peptide or its conjugates In addition, inhibition of this stage of fibrin polymerization more strongly inhibits fibrin polymerization, which is dangerous in the event of bleeding.
Найближчим аналогом способу, що заявляється, є спосіб для інгібування полімеризації фібрину за допомогою пептидів, одержаних із Ю-фрагмента фібрину людини шляхом його гідролізу та подальшого хроматографічного очищення, зокрема з застосуванням пептидів, що містять амінокислотні послідовності: ТЕМ УЗМККТТМКІИРЕМЕТІСЕСООННІ ОСАКОАдОВБУ,The closest analogue of the claimed method is a method for inhibiting fibrin polymerization with the help of peptides obtained from the U-fragment of human fibrin by its hydrolysis and subsequent chromatographic purification, in particular with the use of peptides containing amino acid sequences: TEM UZMKKTTMKIIREMETISESOONNI OSAKOAdOVBU,
ОСАСОМ та Х- ОДОБУ, де Х є АК або К |121. Вказаний з спосіб має ряд недоліків, зокрема у ньому використовуються пептиди значної молекулярної маси, через що вони можуть бути імуногенними. Відсутні описані умови стандартизації препарату, створеного на основі суміші пептидів. Оскільки пептиди одержують із О-фрагменту людини, є ризик контамінації препарату пептидів вірусами та пріонами, що є досить небезпечним при застосуванні в медицині.OSASOM and X- ODOBU, where X is AK or K |121. This method has a number of disadvantages, in particular, it uses peptides of a significant molecular weight, due to which they can be immunogenic. There are no described conditions for the standardization of a drug created on the basis of a mixture of peptides. Since the peptides are obtained from the human O-fragment, there is a risk of contaminating the peptide preparation with viruses and prions, which is quite dangerous when used in medicine.
Задачею винаходу, що заявляється, є створення способу для ефективного та безпечного інгібування полімеризації фібрину з використанням суміші низькомолекулярних неімуногенних пептидів відомого складу, яка ефективно та безпечно інгібує формування тривимірної сітки фібрину - каркасу тромбу.The object of the claimed invention is to create a method for effective and safe inhibition of fibrin polymerization using a mixture of low molecular weight non-immunogenic peptides of a known composition, which effectively and safely inhibits the formation of a three-dimensional fibrin network - the framework of a thrombus.
Задачу вирішують шляхом застосування суміші пептидів - структурних аналогів окремих областей суперспіральної ділянки молекули фібрин(оген)у Аа91-103 МЕПКСОГЕЗБАММ, ВДВ126- 60 135 ОККОКОМКОМ, уб9-77 МРОЕБЗЗКРМ, які мають синергічну інгібувальну дію на процеси полімеризації фібрину та при цьому інгібують лише стадію латеральної асоціації протофібрил, що не виключає можливість захисного тромбоутворення при пораненні, є неїмуногенними та безпечними в плані ризику контамінації вірусами або пріонами.The task is solved by using a mixture of peptides - structural analogs of individual regions of the superspiral section of the fibrin(ogen) molecule Aa91-103 MEPKSOGEZBAMM, VDV126-60 135 OKKOKOMKOM, уб9-77 MROEBZZKRM, which have a synergistic inhibitory effect on fibrin polymerization processes and at the same time inhibit only the stage lateral association of protofibrils, which does not exclude the possibility of protective thrombus formation during injury, are non-immunogenic and safe in terms of the risk of contamination with viruses or prions.
Пептиди, структурні аналоги фрагментів суперспіральної області молекули фібрин(оген)у, Аа91-103Peptides, structural analogs of fragments of the superhelical region of the fibrin(ogen) molecule, Aa91-103
МЕІСВСаОРББЗАММ, ВВ126-135 ОККЕОКОМКОМ, убео-77 МРОЕБЗКРМ синтезують за стандартною методикою (|14), характеризують за допомогою МАГСОІ-ТОЕ аналізу (15) та ліофільно висушують.MEISVSaORBBZAMM, VV126-135 OKKEOKOMKOM, ubeo-77 MROEBZKRM are synthesized according to the standard method (|14), characterized using MAGSOI-TOE analysis (15) and freeze-dried.
Молекулярні маси пептидів є низькомолекулярними: Аа91-103 МЕ! ВО рЕБЗАММ (1453 ба), ВВ126- 135 ОКАОКОМКОМ (1270 ба), уб9-77 МРОЕЗ5КРМ (986 ба), завдяки чому пептиди неімуногенні.The molecular weights of the peptides are low molecular weight: Aa91-103 ME! VO rEBZAMM (1453 ba), BB126-135 OKAOKOMKOM (1270 ba), ub9-77 MROEZ5KRM (986 ba), due to which the peptides are non-immunogenic.
Приклад. 1.Example. 1.
Для підтвердження інгібувальної дії суміші пептидів, структурних аналогів фрагментів суперспіральної області молекули фібрин(оген)уу, Асе1-103 МЕ КООРЕБЗБЗАММ, ВрВ126-135To confirm the inhibitory effect of a mixture of peptides, structural analogs of fragments of the superspiral region of the fibrin(ogen) molecule, Ase1-103 ME KOOREBZBZAMM, VrB126-135
ОККОКОМКОМ, уб9-77 МРОЕЗБКРМ, визначають їхній ефект на полімеризацію фібрину в системі фібриноген-тромбін із використанням комбінації методів турбідиметрії та електронної мікроскопії (13). Суміш цих пептидів, що не містять домішок, в еквімолярному співвідношенні розчиняють у буферному розчині (рН 7,4) з 0,15 М Масі. До лунки планшету вносять розчин суміші вказаних пептидів об'ємом 30 мкл (кінцева концентрація кожного становить 0,33 мМ), донорську плазму крові людини (70 мкл), АЧТЧ-реагент (70 мкл) та інкубують протягом З хв при температурі 25 "С. Потім до лунки вносять 130 мкл розчину 25 мМ Сасі» у 0,02 М НЕРЕ5 буферному розчині (рН 7,4) із 0,15 М Масі. Формування фібринового згустку фіксують за зміною мутності середовища інкубації на автоматичній системі вимірів у мікропланшетах за довжини хвилі 405 нм. Вимірювання проводять протягом 10 хв. Інгібування полімеризації фібрину фіксують за подовженням Іад-періоду формування фібринового згустку - часу з моменту внесення до середовища інкубації розчину СасСі» до початку фази експоненційного зростання мутності середовища.OKKOKOMKOM, уб9-77 MROEZBKRM, determine their effect on fibrin polymerization in the fibrinogen-thrombin system using a combination of turbidimetry and electron microscopy methods (13). The mixture of these peptides, which do not contain impurities, is dissolved in an equimolar ratio in a buffer solution (pH 7.4) with 0.15 M Mass. A solution of a mixture of the specified peptides in a volume of 30 μl (the final concentration of each is 0.33 mM), donor human blood plasma (70 μl), APTC reagent (70 μl) is added to the well of the tablet and incubated for three minutes at a temperature of 25 °C . Then 130 μl of a solution of 25 mM Sasi" in 0.02 M HERE5 buffer solution (pH 7.4) with 0.15 M Masi is added to the well. The formation of a fibrin clot is recorded by the change in the turbidity of the incubation medium on an automatic measurement system in microplates for lengths waves of 405 nm. Measurements are carried out within 10 minutes. Inhibition of fibrin polymerization is recorded by lengthening the Iad period of fibrin clot formation - the time from the moment of introduction of the SaCl" solution into the incubation medium until the beginning of the phase of exponential growth of the turbidity of the medium.
Внесення кожного з досліджуваних пептидів окремо призводить до подовження Іад-періоду полімеризації в 1,3-1,4 рази (фіг. 1). Водночас виявлена синергічна дія суміші пептидів -- структурних аналогів суперспіральної області молекули фібрин(оген)у (Аса91-103The introduction of each of the studied peptides separately leads to a lengthening of the Iad period of polymerization by 1.3-1.4 times (Fig. 1). At the same time, a synergistic effect of a mixture of peptides - structural analogs of the superhelical region of the fibrin(ogen) molecule (Asa91-103
МЕ! КСОЕББЗАММ, ВВ126-135 ОККОКОМУКОМ, убео-77 МРОЕЗЗКРМ), яка в еквімолярному співвідношенні викликає гальмування самоскладання фібрину та подовження Іад-періодуME! KSOEBBZAMM, VV126-135 OKKOKOMUKOM, ubeo-77 MROEZZKRM), which in an equimolar ratio causes inhibition of fibrin self-assembly and prolongation of the Iad period
Зо полімеризації в 2-2,2 рази (фіг. 1).From polymerization in 2-2.2 times (Fig. 1).
Приклад 2.Example 2.
Дію суміші пептидів, структурних аналогів фрагментів суперспіральної області молекули фібрин(іоген)уу Аа91-103 МЕП КСОЕ5БЗАММ, ВВ126-135 ОККОКОМКОМ, уб9-77 МРОЕБЗЗКРМ, в еквімолярному співвідношенні на полімеризацію фібрину визначають методом трансмісійної електронної мікроскопії негативно контрастованих зразків (13). Як негативний контрастер використовують 1 95 водний розчин уранілацетату. Сітки для електронного мікроскопу вкривають шаром 0,3 95 розчину формвару в дихлоретані та закріплюють розпиленням вуглецю за допомогою вакуумного випарювача. Для приготування зразків до стерильної скляної пробірки послідовно вносять 0,3 мг/мл фібриногену людини, 0,025 М Сасіг у 0,05 М амоній-форміатному буферному розчині (рН 7,9), загальний об'єм проби 220 мкл. Полімеризацію фібрину ініціюють внесенням тромбіну до кінцевої концентрації 0,25 МіІН/мл. Через 90 та 180 с із полімеризаційного середовища відбирають аліквоти, які розводять до кінцевої концентрації фібриногену - 7 мкг/мл, розчин якого по 10 мкл переносять на вкриті вуглецем гратки, які через 2 хв обробляють 1 95 розчином уранілацетату. Після інкубації протягом 5 хв сітку промивають спочатку 100 мМ амоній-ацетатним буферним розчином (рн 7,9), потім 10 мМ амоній-ацетатним буферним розчином (рН 8,5). Далі сітку накладають на краплину контрастера, попередньо нанесену на поверхню тефлонового блоку й через 1 хв контрастер видаляють за допомогою водноструменевого насосу. За допомогою електронного мікроскопу Н-600 при 75 КМ при збільшені 20000-50000 одержують електронно-мікроскопічні зображення середовищ, у яких відбувається полімеризація фібрину: через 60 с після внесення тромбіну в контрольній пробі спостерігають формування протофібрил фібрину та їхню латеральну асоціацію (фіг. 2), через 180 с спостерігають зрілу фібрилу (фіг. 3), за присутності трьох пептидів, структурних аналогів фрагментів суперспіральної області молекули фібрин(оген)уу Ас91-103 МЕІГВареЕББЗАММ,The effect of a mixture of peptides, structural analogs of fragments of the superspiral region of the fibrin(iogen) molecule Aa91-103 MEP KSOE5BZAMM, VV126-135 OKKOKOMKOM, уб9-77 MROEBZZKRM, in an equimolar ratio, on fibrin polymerization is determined by the method of transmission electron microscopy of negatively contrasted samples (13). A 1 95 aqueous solution of uranyl acetate is used as a negative contrast agent. Grids for the electron microscope are covered with a layer of 0.3 95 formvar solution in dichloroethane and fixed by spraying carbon using a vacuum evaporator. To prepare samples, 0.3 mg/ml human fibrinogen, 0.025 M Sasig in 0.05 M ammonium formate buffer solution (pH 7.9) are successively added to a sterile glass tube, the total sample volume is 220 μl. Polymerization of fibrin is initiated by introducing thrombin to a final concentration of 0.25 MiIN/ml. After 90 and 180 s, aliquots are taken from the polymerization medium, which are diluted to the final concentration of fibrinogen - 7 μg/ml, 10 μl of which solution is transferred to carbon-covered grids, which are treated with 1 95 uranyl acetate solution after 2 minutes. After incubation for 5 min, the grid is washed first with 100 mM ammonium-acetate buffer solution (pH 7.9), then with 10 mM ammonium-acetate buffer solution (pH 8.5). Next, the grid is placed on a drop of contrast agent previously applied to the surface of the Teflon block, and after 1 minute the contrast agent is removed using a water jet pump. With the help of an electron microscope H-600 at 75 KM at a magnification of 20,000-50,000, electron microscopic images of the environments in which fibrin polymerization takes place are obtained: 60 s after the introduction of thrombin in the control sample, the formation of fibrin protofibrils and their lateral association are observed (Fig. 2) , after 180 s a mature fibril is observed (Fig. 3), in the presence of three peptides, structural analogs of fragments of the superhelical region of the fibrin(ogen) molecule As91-103 MEIGVareEBBZAMM,
ВВ126-135 ОККОКОМУКОМ, уб9-77 МРОЕЗЗКРМ, через 180 с у цьому ж середовищі виявляють поодинокі протофібрили (фіг. 5), що свідчить про ефективне інгібування самоскладання фібрину під дією суміші пептидів в еквімолярному співвідношенні завдяки їхній синергічній дії.ВВ126-135 OKKOCOMUKOM, уб9-77 МРОЕЗЗКРМ, after 180 s in the same medium, individual protofibrils are detected (Fig. 5), which indicates effective inhibition of fibrin self-assembly under the action of a mixture of peptides in an equimolar ratio due to their synergistic action.
Засіб для інгібування полімеризації фібрину, що заявляється, одночасно має наступні переваги: - інгібувальна дія на латеральну асоціацію протофібрил, а не на утворення протофібрил, що 60 робить терапевтичне використання цієї суміші пептидів більш безпечним, запобігаючи патологічному тромбоутворенню, але не блокуючи можливості захисного тромбоутворення, наприклад, при кровотечі; - синергічна інгібувальна дія на полімеризацію фібрину еквімолярної суміші пептидів, що суттєво підвищує ефективність її застосування; - неїмуногенність порівняно з природними аналогами; - неможливість контамінації вірусами та пріонами.The agent for inhibiting fibrin polymerization, which is claimed, simultaneously has the following advantages: - an inhibitory effect on the lateral association of protofibrils, and not on the formation of protofibrils, which 60 makes the therapeutic use of this mixture of peptides safer, preventing pathological thrombus formation, but not blocking the possibilities of protective thrombus formation, for example, with bleeding; - synergistic inhibitory effect on fibrin polymerization of an equimolar mixture of peptides, which significantly increases the effectiveness of its use; - non-immunogenic compared to natural analogues; - impossibility of contamination with viruses and prions.
Таким чином, спосіб, що заявляється, дозволяє ефективно та безпечно |інгібувати полімеризацію фібрину за допомогою суміші синтетичних пептидів - структурних аналогів фрагментів суперспірального регіону молекули фібрин(оген)уу Аса91-103 МЕ! ВареЕББЗАММ,Thus, the claimed method allows effective and safe inhibition of fibrin polymerization using a mixture of synthetic peptides - structural analogs of fragments of the superhelical region of the fibrin(ogen) molecule Asa91-103 ME! VareEBBZAMM,
ВВ126-135 ОККОКОМУКОМ, убо-77 МРОЕБЗ5КРМ, які є субстанцією для створення нового ефективного антитромботичного препарату.BB126-135 OKKOCOMUKOM, ubo-77 MROEBZ5KRM, which are the substance for creating a new effective antithrombotic drug.
Спосіб, що заявляється, розроблено та апробовано в відділі структури і функції білкаThe claimed method was developed and tested in the Department of Protein Structure and Function
Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.Institute of Biochemistry named after O.V. Paladin of the National Academy of Sciences of Ukraine.
Перелік використаних джерел інформації 1. Г пдоузКоу ЕМ, МаКодопепКо ЕМ, Котізагепко 5М. МоїІєсшаг теспапівт5 ої Топтаїййоп апа девігисіоп ої їБбгіп. Ківєм: МайКома ЮиткКа, 2013. 230 р. 2. Раї. 05 90494А1. Арг. 11, 2013. 3. Раї. 5 8906421 В2. Оес. 9, 2014. 4. Раї. ВО 2152801 С2 20.07.2000. 5. Раї. ЕА 023477 В1. 2016.06.30. 6. Раї. 5 5487892 А. дап. 30, 1996. 7. Раї. 05 6413931 В1. ди. 2, 2000. 8. Раї. 05 .977705482. 03.10.2017. 9. Раї. 05 53766314А. 27.12.1994. 10. Раї. ВО 2290195 С1. 27.12.2006. 11. Раї. МО 2011/006069. 13.01.2011. 12. Раї. О054455290А. 19.06.1984. 13. ГидомеКоу Е.М., СпіївепКо Р.а., Коіезпікома І.М., Гидоме5Кауа М.Е., Котізагепко 5.М. А пеоапіїдепіс деїептіпапі іп соїеа сої тедіоп ої пПитап ПїБгіп реїа-спаіп. ТиготьЬ Нев. 2009; 123(5): 765-770. 14. Андреєв С.М., Самойлова Н.А., Давидович Ю.А., Рогожин С.В. Полимерньєе реагенть! в синтезе пептидов. Усп. хим., 1987; 56: 629-655. 15. Спнартап У.В. Мав55 5ресіготеїгу ої Ргоївїн5 апа Рерііде5. Нитапа Ргев5, 2000. 538.List of used sources of information 1. G pdouzKou EM, MakodopepKo EM, Kotizagepko 5M. MoiIesshag tespapivt5 oi Toptaiyyop apa devigisiop oi iBbgip. Kyiv: MaiKoma Yuitka, 2013. 230. 2. Rai. 05 90494A1. Arg. 11, 2013. 3. Rai. 5 8906421 B2. Oes. 9, 2014. 4. Rai. VO 2152801 C2 07/20/2000. 5. Paradise. EA 023477 B1. 2016.06.30. 6. Paradise. 5 5487892 A. add. 30, 1996. 7. Rai. 05 6413931 B1. d. 2, 2000. 8. Rai. 05.977705482. 03.10.2017. 9. Paradise. 05 53766314А. 27.12.1994. 10. Paradise. VO 2290195 C1. 27.12.2006. 11. Paradise. MO 2011/006069. 13.01.2011. 12. Paradise. О054455290А. 19.06.1984. 13. HydomeKou E.M., SpiyvepKo R.a., Koiezpikoma I.M., Hydome5Kaua M.E., Kotizagepko 5.M. A peoapiidepis deieptipapi ip soiea soi tediop oi pPytap PiBgip reia-spaip. Tygot Nev. 2009; 123(5): 765-770. 14. Andreev S.M., Samoilova N.A., Davidovych Yu.A., Rogozhyn S.V. Polymeric reagent! in the synthesis of peptides. Usp. chemistry, 1987; 56: 629-655. 15. Spnartap U.V. Mav55 5resigoteigu oi Rgoivin5 apa Reriide5. Nytapa Rhev5, 2000. 538.
Підписи до фігур креслень 1. Подовження Іад-періоду полімеризації фібрину в плазмі крові, активованої АЧТЧ- реагентом, за індивідуальної присутності пептидів (0,33 мМ), які імітують фрагменти суперспіральної області фібрин(оген)у вВ125-135 (ОКАОКОМКОМ), Аа91-103 (МЕІП'!СОЕ5ЗАММ), уб9-77 (МРОЕЗЗКРМ), та еквімолярної суміші цих пептидів. К - контроль за відсутності пептидів-інгібіторів. 2. Електронно-мікроскопічне зображення середовища, у якому відбувається полімеризація фібрину, за відсутності пептидів-інгібіторів, через 60 секунд після ініціації полімеризації фібрину тромбіном. 3. Електронно-мікроскопічне зображення середовища, у якому відбувається полімеризація фібрину, за відсутності пептидів-інгібіторів, через 180 секунд після ініціації полімеризації фібрину тромбіном. 4. Електронно-мікроскопічне зображення середовища, у якому відбувається полімеризація фібрину за присутності еквімолярної суміші пептидів, які імітують фрагменти суперспіральної області фібрин(оген)уу: ВВ125-135 (ОКВАОКОМУКОМ), Аса91-103 (МЕІП'КЕСОЕ5БАММ) та убо-77 (МРОЕЗ5БКРМ) через 60 секунд після ініціації полімеризації фібрину тромбіном. 5. Електронно-мікроскопічне зображення середовища, у якому відбувається полімеризація фібрину за присутності еквімолярної суміші пептидів, які імітують фрагменти суперспіральної області фібрин(оген)уу: ВВ125-135 (ОКВАОКОМУКОМ), Аса91-103 (МЕІ/'!СОБ5ЗАММ) та убо-77 (МРОЕЗ5БКРМ) через 180 секунд після ініціації полімеризації фібрину тромбіном.Captions to the figures in the drawings 1. Extension of the Iad period of fibrin polymerization in blood plasma activated by the AChT-reagent in the individual presence of peptides (0.33 mM) that imitate fragments of the superhelical region of fibrin(ogen) in B125-135 (OKAOKOMKOM), Aa91 -103 (MEIP'!SOE5ZAMM), ub9-77 (MROEZZKRM), and an equimolar mixture of these peptides. K - control in the absence of peptide inhibitors. 2. Electron microscopic image of the environment in which fibrin polymerization occurs, in the absence of peptide inhibitors, 60 seconds after the initiation of fibrin polymerization by thrombin. 3. Electron microscopic image of the environment in which fibrin polymerization occurs, in the absence of peptide inhibitors, 180 seconds after the initiation of fibrin polymerization by thrombin. 4. Electron microscopic image of the medium in which fibrin polymerization takes place in the presence of an equimolar mixture of peptides that imitate fragments of the superhelical region of fibrin(ogen): BB125-135 (OKVAOKOMUKOM), Asa91-103 (MEIP'KESOE5BAMM) and ubo-77 ( MROEZ5BKRM) 60 seconds after initiation of fibrin polymerization by thrombin. 5. Electron microscopic image of the environment in which fibrin polymerization takes place in the presence of an equimolar mixture of peptides that imitate fragments of the superhelical region of fibrin(ogen): BB125-135 (OKVAOKOMUKOM), Asa91-103 (MEI/'!СОБ5ЗАММ) and ubo- 77 (MROEZ5BKRM) 180 seconds after initiation of fibrin polymerization by thrombin.
Claims (1)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAA202002123A UA127258C2 (en) | 2020-03-30 | 2020-03-30 | METHOD OF INHIBITING FIBRIN POLYMERIZATION |
| PCT/UA2021/000030 WO2021201813A1 (en) | 2020-03-30 | 2021-03-29 | The method of inhibiting of the fibrin polymerization |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAA202002123A UA127258C2 (en) | 2020-03-30 | 2020-03-30 | METHOD OF INHIBITING FIBRIN POLYMERIZATION |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA127258C2 true UA127258C2 (en) | 2023-06-28 |
Family
ID=88790050
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA202002123A UA127258C2 (en) | 2020-03-30 | 2020-03-30 | METHOD OF INHIBITING FIBRIN POLYMERIZATION |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA127258C2 (en) |
-
2020
- 2020-03-30 UA UAA202002123A patent/UA127258C2/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhou et al. | Discovery of exosomes from tick saliva and salivary glands reveals therapeutic roles for CXCL12 and IL-8 in wound healing at the tick–human skin interface | |
| JPS60136597A (en) | Desulfatohirudine, manufacture and pharmaceutical composition | |
| US10646556B2 (en) | Methods for treatment of and prophylaxis against inflammatory disorders | |
| KR20010049991A (en) | Process for the preparation in pure form of the protease activating blood clotting factor VII, its proenzyme or a mixture of both proteins by means of affinity chromatography | |
| DD296960A5 (en) | THERAPEUTIC AGENT | |
| WO2016081475A1 (en) | Compositions and methods for preventing or treating diseases, conditions, or processes characterized by aberrant fibroblast proliferation and extracellular matrix deposition | |
| US11597777B2 (en) | Antibodies for the prevention or the treatment of bleeding episodes | |
| US20090311258A1 (en) | Medicament for lct poisoning | |
| Vermylen et al. | Platelet‐Aggregating Activity in Neuraminidase‐Treated Human Cryoprecipitates: Its Correlation with Factor‐VIII‐Related Antigen | |
| UA127258C2 (en) | METHOD OF INHIBITING FIBRIN POLYMERIZATION | |
| Drummond et al. | Fibrinogen clotting and fibrino-peptide formation by staphylocoagulase and the coagulase-reacting factor | |
| Shen et al. | Viper venoms drive the macrophages and hepatocytes to sequester and clear platelets: Novel mechanism and therapeutic strategy for venom-induced thrombocytopenia | |
| Macfarlane | The action of soya-bean trypsin inhibitor as an anti-thromboplastin in blood coagulation | |
| UA143853U (en) | METHOD OF INHIBITION OF FIBRIN POLYMERIZATION BY SYNTHETIC PEPTIDES SIMULATING FRAGMENTS OF THE SUPERSPIRAL FIBRIN (OG) SECTION | |
| EP3260133B1 (en) | Antibodies against mac-1 | |
| WO2021201813A1 (en) | The method of inhibiting of the fibrin polymerization | |
| JPH02180833A (en) | Production of protein-containing composition | |
| Busfield et al. | Inhibition by adenosine diphosphate of the thrombocytopenia induced in rabbits by collagen or thrombin | |
| EP3812772A1 (en) | Method for diagnosing fibrinolytic insufficiency related to neutrophil extracellular traps | |
| Goldman et al. | Serum-mediated cleavage of Bacillus anthracis Protective Antigen is a two-step | |
| JP2022551566A (en) | Heparin Insensitivity Assay for Factor XIa | |
| Kline et al. | Purification of components of the plasmin system | |
| Nakahara | Effects of t-AMCHA and EACA on the plasma kallikrein system | |
| Jiang et al. | Dual Inhibition of Factor XIIa and Factor XIa Produces a Synergistic Anticoagulant Effect | |
| Zhu et al. | Relative purity of different bovine thrombin preparations |