UA105276U - Method for the isolation of coxiella burnetii as q-fever agent - Google Patents

Method for the isolation of coxiella burnetii as q-fever agent Download PDF

Info

Publication number
UA105276U
UA105276U UAU201509098U UAU201509098U UA105276U UA 105276 U UA105276 U UA 105276U UA U201509098 U UAU201509098 U UA U201509098U UA U201509098 U UAU201509098 U UA U201509098U UA 105276 U UA105276 U UA 105276U
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
isolation
fever
dna
detection
pathogen
Prior art date
Application number
UAU201509098U
Other languages
Ukrainian (uk)
Inventor
Ольга Зіновіївна Зарічна
Олександра Олександрівна Тарасюк
Зенон Григорович Кушнір
Наталія Георгіївна Бек
Original Assignee
Державна Установа "Львівський Науково-Дослідний Інститут Епідеміології Та Гігієни Моз України"
Ольга Зіновіївна Зарічна
Олександра Олександрівна Тарасюк
Зенон Григорович Кушнір
Наталія Георгіївна Бек
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Державна Установа "Львівський Науково-Дослідний Інститут Епідеміології Та Гігієни Моз України", Ольга Зіновіївна Зарічна, Олександра Олександрівна Тарасюк, Зенон Григорович Кушнір, Наталія Георгіївна Бек filed Critical Державна Установа "Львівський Науково-Дослідний Інститут Епідеміології Та Гігієни Моз України"
Priority to UAU201509098U priority Critical patent/UA105276U/en
Publication of UA105276U publication Critical patent/UA105276U/en

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Спосіб виділення Coxiella burnetii, при якому при виділенні збудника для його ідентифікації використовують полімеразну ланцюгову реакцію в реальному часі з метою контролю кількості ДНК збудника гарячки Ку на етапі підбору оптимальної інфікуючої дози, виявлення С. burnetii в інфікованих жовточних мішках курячих ембріонів, в досліджуваному матеріалі експериментальних лабораторних тварин.A method of isolating Coxiella burnetii, in which the isolation of the pathogen to identify it using a real-time polymerase chain reaction to control the amount of DNA of the fever of Ku fever at the stage of selection of the optimal infectious dose, detection of C. burnetii in infected yolk sacs of chicken material laboratory animals.

Description

Корисна модель належить до мікробіології та стосується виділення С. ригпеїййї - збудника гарячки Ку для його подальшого вивчення, культивування, виготовлення діагностичних і профілактичних препаратів.The useful model belongs to microbiology and refers to the isolation of S. rigpeiyya - the causative agent of Ku fever for its further study, cultivation, and the production of diagnostic and prophylactic drugs.

Використання полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі при виділенні С. Бигпейії методами зараження курячих ембріонів, морських свинок і лабораторних білих мишей дозволяє проводити не лише якісне, але й кількісне визначення ДНК збудника гарячки Ку та ефективно збільшує діагностичні можливості його виявлення. Дослідження можна проводити як з чистими культурами збудника, так і безпосередньо в біотичних та абіотичних об'єктах дослідження на фоні іншої мікрофлори, при цьому відпадає необхідність виділення чистої культури збудника і її ідентифікації за фенотипічними ознаками. Основна ланка ПЛР в реальному часі - підбір чутливих і специфічних праймерів, зокрема, через міжнародний комп'ютерний банк данихThe use of polymerase chain reaction in real time in the isolation of S. bigpeiia by methods of infection of chicken embryos, guinea pigs and laboratory white mice allows not only qualitative, but also quantitative determination of the DNA of the causative agent of Ku fever and effectively increases the diagnostic possibilities of its detection. Research can be carried out both with pure cultures of the pathogen, and directly in biotic and abiotic objects of research against the background of other microflora, thus eliminating the need to isolate a pure culture of the pathogen and identify it by phenotypic characteristics. The main link of real-time PCR is the selection of sensitive and specific primers, in particular, through an international computer data bank

СепВапкК, оскільки саме вони забезпечують можливість ампліфікації та індикації специфічної нуклеотидної послідовності даного виду збудника. Набори праймерів для виявлення різних генів рикетсій відомі та можуть використовуватися в будь-якій лабораторії за наявності відповідного обладнання та кваліфікованого персоналу (Наказ МОЗ України від 24.01.2008 Мо 26 "Про затвердження державних санітарних норм і правил "Організація роботи лабораторій при дослідженні матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти Т-ІМ груп патогенності молекулярно-генетичними методами").SepVapkK, because they provide the possibility of amplification and indication of the specific nucleotide sequence of this type of pathogen. Primer sets for the detection of various rickettsia genes are known and can be used in any laboratory with the availability of appropriate equipment and qualified personnel (Order of the Ministry of Health of Ukraine dated 24.01.2008 Mo 26 "On approval of state sanitary norms and rules "Organization of work of laboratories in the study of material that contains biological pathogenic agents of T-IM pathogenicity groups by molecular genetic methods").

Задача корисної моделі полягає у виділенні збудника гарячки Ку - С. ригпеїйї з біотичних та абіотичних об'єктів.The task of a useful model is to isolate the causative agent of Ku fever - S. rigpeii from biotic and abiotic objects.

Поставлена задача вирішується шляхом кількісного визначення специфічних нуклеотидних послідовностей його ДНК на етапі підбору оптимальної інфікуючої дози та виявлення С. ригпеїїйї в інфікованих жовточних мішках курячих ембріонів чи в патологічному матеріалі від лабораторних тварин.The task is solved by quantitative determination of specific nucleotide sequences of its DNA at the stage of selection of the optimal infecting dose and detection of S. rigpeii in infected yolk sacs of chicken embryos or in pathological material from laboratory animals.

Прототипом запропонованого способу є виділення С. ригпеїйй із застосуванням традиційних методів ідентифікації збудника - мікроскопії та специфічної імунодетекції.The prototype of the proposed method is the isolation of S. rigpeii using traditional methods of identification of the pathogen - microscopy and specific immunodetection.

Матеріалом для досліджень на гарячку Ку можуть бути: 1) біотичні об'єкти а) від хворих чи підозрілих на захворювання людей - кров, мокрота, промивні води бронхів,The material for research on Ku fever can be: 1) biotic objects a) from sick or suspected people - blood, sputum, bronchial lavage water,

Зо спинномозкова рідина, ексудати; б) трупний матеріал - кров, ексудати, кусочки органів (легень, серця, ін.); в) матеріал від тварин (кров, послід, навколоплідні води та ін.); 2) абіотичні об'єкти а) продовольча сировина та продукти тваринного походження (молоко, сир та і п.); б) об'єкти оточуючого середовища (гризуни, кліщі, пил з повітря, грунт, підстилка, вода та ін.).From cerebrospinal fluid, exudates; b) corpse material - blood, exudates, pieces of organs (lungs, hearts, etc.); c) material from animals (blood, droppings, amniotic fluid, etc.); 2) abiotic objects a) food raw materials and products of animal origin (milk, cheese, etc.); b) environmental objects (rodents, ticks, dust from the air, soil, litter, water, etc.).

Найбільш репрезентативним методом підтвердження рикетсійної етіології захворювання є виділення С. ригпеїїйї з біотичних об'єктів з застосуванням ПЛР в реальному часі. Проведення реакції включає три основні етапи: підготовка досліджуваної проби і виділення ДНК, власне ампліфікація та детекція амгагіфікованої ДНК, облік та інтерпретація результатів реакції. Для виділення ДНК-зразків на практиці, як правило, використовують комерційні набори реактивів, призначені для дослідження різного виду біологічного матеріалу з дотриманням техніки проведення процедури та вимог інструкцій виробника. Ефективність та надійність виявлення С. ригпеїй в досліджуваних зразках забезпечується детекцією з використанням двох наборів праймерів (один - для детекції консервативних фрагментів для визначення приналежності потенційного патогену до роду Кіскейвіа, другий - для детекції видоспецифічних фрагментів з метою етіологічної ідентифікації збудника) і флуоресцентно-мічених олігонуклеотидних зондів або інтеркалюючих барвників (наприклад, 5УВЕК Огееп І). Ампліфікацію проводять в режимі послідовно зв'язаних програм, з врахуванням температури плавлення олігонуклеотидів, на ампліфікаторі для ПЛР в реальному часі (КоїогОспе, АВІРгізт 7000, іСусісг і) та іп.), особливістю яких є можливість детектувати флуоресценцію. Для забезпечення високої ефективності аналізу рекомендується використовувати концентрації зонда 250 пМ, праймерів 50-900 пМ. Облік і інтерпретація результатів реакції здійснюється автоматично за допомогою програмного забезпечення, що поставляється із ПЛР-детектором. Вимірюється інтенсивність флуоресценції і результат реакції виноситься на екран монітора у вигляді графіка залежності флуоресценції від кількості циклів в реакції.The most representative method of confirming the rickettsial etiology of the disease is the isolation of S. rigpeii from biotic objects using real-time PCR. Conducting the reaction includes three main stages: preparation of the test sample and DNA isolation, actual amplification and detection of agglutinated DNA, accounting and interpretation of the reaction results. To isolate DNA samples in practice, as a rule, commercial sets of reagents are used, designed for the study of various types of biological material in compliance with the technique of conducting the procedure and the requirements of the manufacturer's instructions. The efficiency and reliability of detection of S. rigpeii in the studied samples is ensured by detection using two sets of primers (one for the detection of conservative fragments to determine whether the potential pathogen belongs to the Kiskeyvia genus, the second for the detection of species-specific fragments for the purpose of etiological identification of the pathogen) and fluorescently labeled oligonucleotides probes or intercalating dyes (for example, 5UVEK Ogeep I). Amplification is carried out in the mode of sequentially connected programs, taking into account the melting temperature of oligonucleotides, on an amplifier for real-time PCR (KoyogOspe, AVIRgizt 7000, iSusisg) and IP.), the feature of which is the ability to detect fluorescence. To ensure high analysis efficiency, it is recommended to use probe concentrations of 250 pM, primers of 50-900 pM. The calculation and interpretation of reaction results is carried out automatically using the software supplied with the PCR detector. The intensity of fluorescence is measured and the result of the reaction is displayed on the monitor screen in the form of a graph of the dependence of fluorescence on the number of cycles in the reaction.

При культивуванні С. Бигпейї по методу Кокса (Учение о риккетсиях и риккетсиозах / П.Ф.When cultivating S. Bigpeia according to Cox's method (Learning about rickettsiae and rickettsioses / P.F.

Здродовский, Н.М. Голиневич. Москва.: Медицина, 1972. - 494 с.) для попереднього інкубування використовують свіжі запліднені яйця. Яйця поміщають у електричний інкубатор з хорошою бо вентиляцією, де витримують протягом 6-7 днів при температурі 37 "С. Після інкубації яйця перед зараженням піддають овоскопії для відбору нормально розвинутих ембріонів. При цьому олівцем відмічають межі повітряної камери та розміщення ембріона.Zdrodovsky, N.M. Golynevych. Moscow.: Medicine, 1972. - 494 p.) fresh fertilized eggs are used for pre-incubation. The eggs are placed in an electric incubator with good ventilation, where they are kept for 6-7 days at a temperature of 37 "C. After incubation, before infection, the eggs are subjected to ovoscopy to select normally developed embryos. At the same time, the boundaries of the air chamber and the placement of the embryo are marked with a pencil.

Зараження яєць проводять в стерильних боксах для уникнення бактерійних забруднень. Для дезінфекції тупий кінець яєць спочатку протирають невеликим марлевим тампоном, змоченим 50 96 етиловим спиртом. Після підсихання операційне поле над повітряною камерою змазують 596 спиртовим розчином йоду, потім змочену спиртом поверхню проводять над полум'ям.Eggs are infected in sterile boxes to avoid bacterial contamination. For disinfection, the blunt end of the eggs is first wiped with a small gauze swab moistened with 50 96 ethyl alcohol. After drying, the operating field above the air chamber is smeared with 596 alcohol solution of iodine, then the alcohol-moistened surface is held over the flame.

Підготовка яєць для зараження завершується пробуравленням отвору в шкаралупі над верхівкою повітряної камери для вводу голки шприца. Отвори ці роблять спеціальним буравчиком або бормашиною.Preparation of eggs for infection is completed by drilling a hole in the shell above the top of the air chamber for inserting a syringe needle. These holes are made with a special drill or drill.

Адаптовані до курячих ембріонів штами С. Бригпеїї добре розмножуються в жовточних мішках. Інфекційну рідину в об'ємній дозі 0,1-0,5 мл вводять в порожнину жовточного мішка уколом голки шприца через повітряну камеру на глибину приблизно 2,0-2,5 см. Для цього яйце беруть лівою рукою так, щоб тупий його кінець з відміченою повітряною камерою був направлений вперед при розміщенні відмітки ембріона внизу. Після цього голку виймають і отвір в шкаралупі над повітряною камерою герметизують розплавленим стерильним парафіном (із пастерівської піпетки), а на кожному яйці роблять олівцем відповідні написи. Після кожного серійного зараження яєць необхідно проводити контрольні посіви на бактерійну стерильність того матеріалу, яким проводять зараження (посіви в бульйон, на косий агар і в напіврідкий агар).Strains of S. brygpeii adapted to chicken embryos reproduce well in yolk sacs. Infectious fluid in a volumetric dose of 0.1-0.5 ml is injected into the cavity of the yolk sac with a needle of a syringe through the air chamber to a depth of approximately 2.0-2.5 cm. For this, the egg is taken with the left hand so that its blunt end with the marked air chamber was directed forward while placing the embryo mark at the bottom. After that, the needle is removed and the hole in the shell above the air chamber is sealed with melted sterile paraffin (from a Pasteur pipette), and appropriate inscriptions are made with a pencil on each egg. After each serial infection of eggs, it is necessary to carry out control cultures for bacterial sterility of the material used for infection (cultures in broth, on oblique agar and in semi-liquid agar).

Продуктивність культивування С. Бигпеїйї в пасажах на курячих ембріонах багато в чому залежить від обраної інфікуючої дози. Для проведення пасажів інфікуючу дозу підбирають з таким розрахунком, щоб викликати максимальну загибель ембріонів на 8-9-ту добу після зараження. Тому для кожного виду рикетсій та для кожного їх штаму необхідно визначати інфікуючи дозу шляхом титрування, тобто попереднього інфікування партії ембріонів (не менше 5) різними розведеннями маточної суспензії з врахуванням загибелі ембріонів та накопичення рикетсій. Застосування методу ПЛР в реальному часі дозволяє проводити не тільки детекцію накопичених продуктів ампліфікації, а й вести кількісний облік ДНК збудника даного виду. При цьому використовують відповідні ДНК-стандарти для побудови калібрувальних кривих після проведення реакції, що дозволяє вирахувати невідому вихідну кількість копій ДНК у зразках. У зв'язку з тим що С. ригпеїййї надзвичайно стійкі до виливу факторів зовнішнього середовища, приProductivity of cultivation of S. Bigpeiia in passages on chicken embryos largely depends on the selected infecting dose. To carry out the passages, the infectious dose is selected in such a way as to cause the maximum death of the embryos on the 8th-9th day after infection. Therefore, for each type of rickettsia and for each of their strains, it is necessary to determine the infecting dose by titration, i.e. preliminary infection of a batch of embryos (at least 5) with different dilutions of the uterine suspension, taking into account the death of embryos and the accumulation of rickettsia. The use of the PCR method in real time allows not only the detection of accumulated amplification products, but also the quantitative accounting of the DNA of the causative agent of this species. At the same time, appropriate DNA standards are used to construct calibration curves after the reaction, which allows you to calculate the unknown initial number of DNA copies in the samples. In connection with the fact that S. rigpeiiyi is extremely resistant to the effusion of environmental factors, with

Зо їх масовому культивуванні можна заготовляти концентровану (в розведенні 1:10) маточну суспензію в якості стандартного посівного матеріалу, зберігаючи її протягом тривалого часу в рефрижераторі при температурі нижче -20 "С, або використовувати стандартний ліофілізований посівний матеріал.From their mass cultivation, it is possible to prepare a concentrated (1:10 dilution) queen suspension as a standard inoculum, storing it for a long time in a refrigerator at a temperature below -20 "C, or use a standard lyophilized inoculum.

Заражені яйця інкубують при температурі 37 "С. Ембріони, що загинули протягом перших 3- 4-х діб після зараження, відбраковують. Починаючи з 5 діб проводять щоденну овоскопію. Після 8 діб (до 13 діб) можна вскривати живі ембріони. Тупий кінець яйця, відібраного для вскриття, змащують 5 95 спиртовим розчином йоду, потім шкаралупу яйця надколюють профламбованим пінцетом приблизно на рівні нижньої межі повітряної камери та циркулярно надламують на тому ж рівні. Максимальна загибель ембріонів при правильно вибраній інфікуючій дозі переважно спостерігається на 7-9-ту добу після зараження. Після вскриття яєць відбирають жовточні мішки та проводять їх дослідження паралельно мікроскопією та методом ПЛР в реальному часі, що дозволяє встановити кількісний рівень накопичення збудника даного виду.Infected eggs are incubated at a temperature of 37 "С. Embryos that died during the first 3-4 days after infection are rejected. Starting from 5 days, daily ovoscopy is performed. After 8 days (up to 13 days), live embryos can be dissected. The blunt end of the egg , selected for opening, is smeared with 5 95 alcohol solution of iodine, then the egg shell is punctured with flamed tweezers approximately at the level of the lower border of the air chamber and circularly broken at the same level. The maximum death of embryos with a correctly selected infectious dose is mostly observed on the 7-9th day after infection After opening the eggs, the yolk sacs are selected and their research is carried out in parallel by microscopy and real-time PCR, which allows to establish the quantitative level of accumulation of the causative agent of this species.

При накопиченні отриманого ізоляту проводять пасажування на морських свинках та/або лабораторних білих мишах з метою відтворення експериментальних форм гарячки Ку у тварин.When the obtained isolate is accumulated, passaging is carried out on guinea pigs and/or laboratory white mice with the aim of reproducing experimental forms of Q fever in animals.

Постановка серологічних реакцій дає позитивні результати тільки при наявності достатньої концентрації антитіл у сироватці крові лабораторних тварин (через 2-3 тижні). Принциповою особливістю ПЛР в реальному часі с кількісне визначення ДНК С. Бигпеїййї на будь-якій стадії інфекційного процесу.The setting of serological reactions gives positive results only if there is a sufficient concentration of antibodies in the blood serum of laboratory animals (after 2-3 weeks). The principal feature of real-time PCR is the quantitative determination of S. Bigpeiyya DNA at any stage of the infectious process.

Запропонований нами спосіб рекомендується використовувати при виділенні С. Бигпеїййї з метою культивування, накопичення збудника, бактеріологічної діагностики гарячки Ку, що є необхідною ланкою вивчення циркулюючих штамів та основою для приготування як діагностичних, так і профілактичних препаратів.The method proposed by us is recommended for the isolation of S. Bigpeiyya for the purpose of cultivation, accumulation of the causative agent, bacteriological diagnosis of Ku fever, which is a necessary link in the study of circulating strains and the basis for the preparation of both diagnostic and prophylactic drugs.

Claims (1)

ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІUSEFUL MODEL FORMULA Спосіб виділення СохієїЇа Бигпеїй, який відрізняється тим, що при виділенні збудника для його ідентифікації використовують полімеразну ланцюгову реакцію в реальному часі з метою контролю кількості ДНК збудника гарячки Ку на етапі підбору оптимальної інфікуючої дози, виявлення С.The method of isolation of Sochieia Bigpeii, which differs in that when isolating the pathogen for its identification, polymerase chain reaction is used in real time in order to control the amount of DNA of the causative agent of Ku fever at the stage of selecting the optimal infectious dose, detection of C. Бигпеїйїї в інфікованих жовточних мішках курячих ембріонів, в досліджуваному бо матеріалі експериментальних лабораторних тварин.Bigpeiyii in infected yolk sacs of chicken embryos, in the studied material of experimental laboratory animals.
UAU201509098U 2015-09-21 2015-09-21 Method for the isolation of coxiella burnetii as q-fever agent UA105276U (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
UAU201509098U UA105276U (en) 2015-09-21 2015-09-21 Method for the isolation of coxiella burnetii as q-fever agent

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
UAU201509098U UA105276U (en) 2015-09-21 2015-09-21 Method for the isolation of coxiella burnetii as q-fever agent

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA105276U true UA105276U (en) 2016-03-10

Family

ID=55699094

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAU201509098U UA105276U (en) 2015-09-21 2015-09-21 Method for the isolation of coxiella burnetii as q-fever agent

Country Status (1)

Country Link
UA (1) UA105276U (en)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Forsgren et al. Standard methods for European foulbrood research
Spackman et al. Avian influenza virus isolation, propagation, and titration in embryonated chicken eggs
Luce-Fedrow et al. Strategies for detecting rickettsiae and diagnosing rickettsial diseases
Haake Hamster model of leptospirosis
Neyen et al. Methods to study Drosophila immunity
Woolcock Avian influenza virus isolation and propagation in chicken eggs
Mori et al. Critical aspects for detection of Coxiella burnetii
Jacobsen et al. Embryonated chicken eggs as alternative infection model for pathogenic fungi
Hiett et al. Direct polymerase chain reaction detection of Campylobacter spp. in poultry hatchery samples
Spackman et al. Avian influenza virus isolation, propagation, and titration in embryonated chicken eggs
CN105602945B (en) Detection primer group, detection kit and detection method a kind of while that detect three kinds of pathogenic bacteria of seawater fish
Guy Isolation and propagation of coronaviruses in embryonated eggs
CN113136445B (en) LAMP primer and loop-mediated isothermal amplification detection kit for pet zoonosis chlamydia psittaci
Çelebi et al. A comparative study of detecting Chlamydophila psittaci in pet birds using isolation in embryonated egg and polymerase chain reaction
UA105276U (en) Method for the isolation of coxiella burnetii as q-fever agent
Charlton et al. Comparison of a Salmonella Enteritidis-specific polymerase chain reaction assay to delayed secondary enrichment culture for the detection of Salmonella Enteritidis in environmental drag swab samples
Villarreal Diagnosis of infectious bronchitis: an overview of concepts and tools
Punom et al. Isolation and molecular-based identification of bacteria from unhatched leftover eggs of ducks in selected mini-hatcheries of Kishoreganj, Bangladesh
Emancipator Animal Models of Ig A Nephropathy
CN110157819B (en) LAMP kit for rapidly detecting Salmonella indiana in livestock and poultry feces
Chambers et al. Equine influenza culture methods
Anzabi et al. Evaluation of contamination of cattle’s raw milk to Johne’s disease in farms of Kaleybar region
Upadhyay Testing viral infections
ES2375141T3 (en) SPECIFIC DETECTION OF THE GENOTYPE OF CHLAMYDOPHILA PSITTACI.
RU2354706C2 (en) Feeding medium for detecting h influenzae and method of its obtaining