TWI856429B - 增強富含血小板血漿及其製備方法與用途 - Google Patents
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Abstract
本發明關於一種增強富含血小板血漿及其製備方法與用途。增強富含血小板血漿之製備方法包含：離心一全血樣本以得到血漿；離心該血漿以得到富含血小板血漿及缺血小板血漿；加入CaCl
2以對該富含血小板血漿進行震盪活化；離心已活化之該富含血小板血漿以得到上清液；以及以該缺血小板血漿稀釋該上清液並進一步離心以得到該增強富含血小板血漿。
Description
本發明關於一種富含血小板血漿及其製備方法與用途，特別關於一種增強富含血小板血漿及其製備方法與用途。
在許多已發展和發展中國家，當人越活越久且老年人口快速成長，老年健康越來越重要。富含血小板血漿(Platelet-Rich Plasma, PRP)治療近期受到大量關注，能促進組織再生，相關研究聚焦於骨科、皮膚科、運動傷害、癌症生物學等。
不過，不同製備方法、活化方式或程度的富含血小板血漿有著不同的特性(例如內含的成長因子可能不同等等)，導致對不同細胞的功效或機轉也可能不同，許多機轉仍未被發現，因此富含血小板血漿的治療仍是老年醫學中極具潛力的工具。
一種增強富含血小板血漿之製備方法，包含：離心一全血樣本以得到血漿；離心該血漿以得到富含血小板血漿及缺血小板血漿；加入CaCl
2溶液以對該富含血小板血漿進行震盪活化，其中該富含血小板血漿的體積為CaCl
2溶液體積的3~5倍；離心已活化之該富含血小板血漿以得到上清液；以及以該缺血小板血漿稀釋該上清液並進一步離心以得到該增強富含血小板血漿。
於某些具體實施例中，上述製備方法進一步包含：真空冷凍乾燥該增強富含血小板血漿以得到粉狀之該增強富含血小板血漿。
於某些具體實施例中，該缺血小板血漿與該上清液之體積比為4:6至6:4。
本發明提供一種如前述製備方法製造之增強富含血小板血漿。
本發明提供一種包含前述增強富含血小板血漿之藥學組成物。
本發明提供一種上述增強富含血小板血漿之抗氧化用途。
本發明提供一種上述增強富含血小板血漿之抗老化用途。
本發明提供一種上述增強富含血小板血漿之粒線體代謝調控用途。
本發明提供一種粒線體代謝調控方法，包含：提供上述增強富含血小板血漿至一細胞以逆轉該細胞之粒線體代謝模式，其中該增強富含血小板血漿之濃度範圍在2 wt%與13 wt%之間。
於某些具體實施例中，當該細胞為纖維母細胞，該粒線體代謝模式由粒線體代謝轉向糖解代謝。
於某些具體實施例中，當該細胞為間質幹細胞，該粒線體代謝模式由糖解代謝轉向粒線體代謝。
本發明所提供之增強富含血小板血漿及其製備方法與粒線體代謝調控用途可以提供富含生長因子的增強富含血小板血漿，且針對不同細胞有不同的粒線體代謝調控用途，可以促進纖維母細胞之抗氧化，也可促進間質幹細胞之修復能力，對於老年醫學的發展有重大貢獻，例如抗衰老、關節修復、神經元再生、毛髮生長、各種慢性病治療…等。在臨床應用上，增強富含血小板血漿之凍乾粉末能有效保存其活性達到1-2年，使患者只需抽一次血取出100~120毫升血液就能接受完整的3~6個的抗衰老或組織修復等療程。
有關於本創作其他技術內容、特點與功效，在以下配合參考圖式之較佳實施例的詳細說明中，將可清楚的呈現。
本發明於第一方面提供了一種增強富含血小板血漿之製備方法，包含：離心一全血樣本以得到血漿；離心該血漿以得到富含血小板血漿及缺血小板血漿；加入CaCl
2溶液以對該富含血小板血漿進行震盪活化，其中該富含血小板血漿的體積為CaCl
2溶液體積的3~5倍；離心已活化之該富含血小板血漿以得到上清液；以及以該缺血小板血漿稀釋該上清液並進一步離心以得到該增強富含血小板血漿。於某些具體實施例中，該富含血小板血漿的體積為CaCl
2溶液體積的3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5倍。
於某些具體實施例中，在CaCl
2溶液中進一步加入玻璃珠以對該富含血小板血漿進行震盪活化。
於某些具體實施例中，該富含血小板血漿與該CaCl
2溶液之總體積和該玻璃珠之體積比為7:1至13:1，例如7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1。
於某些具體實施例中，上述製備方法進一步包含：真空冷凍乾燥該增強富含血小板血漿以得到粉狀之該增強富含血小板血漿。
於某些具體實施例中，該缺血小板血漿與該上清液之體積比為4:6至6:4，例如4:6、4.2:5.8、4.4:5.6、4.6:5.4、4.8:5.2、5:5、5.2:4.8、5.4:4.6、5.6:4.4、5.8:4.2、6:4。
於某些具體實施例中，CaCl
2溶液的濃度為5 wt% ~ 15wt%，例如5 wt%、6 wt%、7 wt%、8 wt%、9 wt%、10 wt%、11 wt%、12 wt%、13 wt%、14 wt%、15 wt%。
本發明於第二方面提供了一種如前述製備方法製造之增強富含血小板血漿。
本發明於第三方面提供了一種包含前述增強富含血小板血漿之藥學組成物。
本發明於第四方面提供了一種上述增強富含血小板血漿之抗氧化用途。
本發明於第五方面提供了一種上述增強富含血小板血漿之抗老化用途。
本發明於第六方面提供了一種上述增強富含血小板血漿之粒線體代謝調控用途。
本發明於第七方面提供了一種粒線體代謝調控方法，包含：提供上述增強富含血小板血漿至一細胞以逆轉該細胞之粒線體代謝模式。
於某些具體實施例中，該增強富含血小板血漿之濃度範圍在約2 wt%與約13 wt%之間，包含但不限於濃度約2 wt%、濃度約3 wt%、濃度約4 wt%、濃度約5 wt%、濃度約6 wt%、濃度約7 wt%、濃度8約wt%、濃度9約wt%、濃度約10 wt%、濃度約11 wt%、濃度約12 wt%、濃度約13 wt%。上述重量百分濃度係指以增強富含血小板血漿之粉末為溶質所調製的溶液濃度，溶劑包含但不限於水、培養液、生理食鹽水等。
於某些具體實施例中，提供上述增強富含血小板血漿至一細胞之處理時間為8小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時、24小時、26小時、28小時。
於某些具體實施例中，當該細胞為纖維母細胞，該粒線體代謝模式由粒線體代謝轉向糖解代謝。在一具體實施例中，該增強富含血小板血漿之濃度範圍在約7 wt%與約13 wt%之間，更佳在約9 wt%與約11 wt%之間，包含但不限於濃度約9 wt%、濃度約10 wt%、濃度約11 wt%。纖維母細胞是一種存在於蜂窩組織或纖維結締組織中的梭形細胞，能夠分泌構成細胞外基質的結構蛋白和膠原蛋白的細胞，其與傷口癒合、纖維化、補充皮膚膠原蛋白抗皺…等生理學或病理學過程密切相關。
於某些具體實施例中，當該細胞為間質幹細胞，該粒線體代謝模式由糖解代謝轉向粒線體代謝。在一具體實施例中，該增強富含血小板血漿之濃度範圍在約2 wt%與約8 wt%之間，更佳在約4 wt%與約6 wt%之間，包含但不限於濃度約4 wt%、濃度約5 wt%、濃度約6 wt%。間質幹細胞能貼壁生長且能分化成中胚層組織，包含但不限於神經、骨骼、軟骨、脂肪、血管、肌肉等。間質幹細胞促進神經修復、骨骼及肌肉再生、血管新生、抗發炎、調控免疫提高器官、組織、細胞移植的成功率，減緩減輕病狀與增加存活率，例如神經退化性疾病、自體免疫疾病或庫隆氏疾病(Crohn’s disease：炎症性腸道疾病)、心肌梗塞、周邊血管堵塞及糖尿病。
除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域中的技術人員所通常理解相同的含義。
本文所使用的「約」、「大約」或「近乎」一詞實質上代表所述之數值或範圍位於1%以內，較佳為於0.5%以內，以及更佳者為於0.3%以內。於文中所提供之數字化的量為近似值，意旨若術語「約」、「大約」或「近乎」沒有被使用時亦可被推得。
如本文所用，術語「富含血小板血漿(Platelet-Rich Plasma, PRP)」泛指經離心血漿所得到血小板濃度較高之部分，包含但不限於血小板濃度在5×10
8cells/mL~5×10
9cells/mL，例如6×10
8cells/mL、7×10
8cells/mL、8×10
8cells/mL、9×10
8cells/mL、1×10
9cells/mL、2×10
9cells/mL、3×10
9cells/mL、4×10
9cells/mL、5×10
9cells/mL。術語「缺血小板血漿(Platelet-Poor Plasma, PPP)」係指經離心血漿所得到上層血小板濃度較低之部分。術語「經活化之富含血小板血漿」係指富含血小板血漿再經過CaCl
2(或進一步和玻璃珠一起震盪)處理而得的具有更多生長因子之富含血小板血漿。術語「增強富含血小板血漿(Platelet-Rich Plasma Plus, PRP-plus)」係指經活化之富含血小板血漿再經進一步離心或後續處理所得到之血小板血漿。
材料與實驗方法
本發明實施例中的「mRNA分離及即時定量系統實驗方法」如下述。使用GENEzol Pure 試劑盒（Geneaid Biotech Ltd. 目錄號 GZX200，台灣）將細胞中的所有RNA分離出來。在 30 µL 無核酸酶的水中洗脫後，純化的 RNA保存在-80 °C下。 使用 NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific 目錄號 ND2000CLAPTOP，美國）測定RNA濃度，且萃取的RNA的品質以A260/A230 和 A260/A280 的吸光度比測出分別在 1.9-2.3 和 1.8-2.0 的範圍內。 依照製造商的說明使用SensiFAST cDNA合成試劑盒（Bioline 目錄號 BIO-65054，美國田納西州)合成 cDNA。
使用了反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)擴增。所有引子組都設計為精確擴增包含每個基因外顯子的區域（表 S1）。使用SensiFAST SYBR Hi-ROX 試劑盒 (Bioline BIO-92005，英國)，並使用 StepOnePlus 即時PCR系統（Thermo Fisher Scientific，美國）檢測擴增。 2
−DDCt方法用於確定相對基因表達，數據歸一化為 EEF1A1 管家基因(內部控制基因)。
表S1 各基因相對應的前置引子(F)和反置引子(R)之序列號、NCBI參考序列、引子序列及其大小
| SEQ ID NO. | 基因名 | NCBI RefSeq | 引子序列 | 序列大小(bp) |
| 1 | PGC-1α | NM_001330751.2 | F :AGAGCGCCGTGTGATTTAT | 122 |
| 2 | R :CTCCATCATCCCGCAGATTTA | 122 | ||
| 3 | PGC-1β | NM_133263.4 | F :CCACATCCTACCCAACATCAA | 109 |
| 4 | R :GTGCTGTCCGCCTTAACA | 109 | ||
| 5 | OGG1 | NM_016829.3 | F:ATCGTACTCTAGCCTCCACTC | 102 |
| 6 | R:ACCGGAAAGATTGTCCAGAAG | 102 | ||
| 7 | Catalase | NM_001752.4 | F:CTGGAGCACAGCATCCAATA | 104 |
| 8 | R:TCATTCAGCACGTTCACATAGA | 104 | ||
| 9 | GPX1 | NM_001329455.2 | F:ACGCCAAGAACGAAGAGATT | 99 |
| 10 | R:CGTTCACCTCGCACTTCT | 99 | ||
| 11 | GSR | NM_001195102.3 | F:CGGTGCCAGCTTAGGAATAA | 102 |
| 12 | R:GCCATCTCCACAGCAATGTA | 102 | ||
| 13 | GSS | NM_000178.4 | F:GATGGACTTCAACCTGCTAGTG | 109 |
| 14 | R:GTCAAAGAGACGAGCGGTAAA | 109 | ||
| 15 | MnSOD | NM_001322819.2 | F : GGGTTGGCTTGGTTTCAATAAG | 120 |
| 16 | R:TGCTCCCACACATCAATCC | 120 | ||
| 17 | Cu/ZnSOD | NM_000454.5 | F:CTCAGGAGACCATTGCATCAT | 107 |
| 18 | R:TTCCAGCGTTTCCTGTCTTT | 107 | ||
| 19 | GPX4 | NM_001367832.1 | F:GGGAGTAACGAAGAGATCAAAGAG | 118 |
| 20 | R:GGATCTTCATCCACTTCCACAG | 118 | ||
| 21 | SIRT1 | NM_001142498.2 | F: AGTGGCAAAGGAGCAGATTAG | 138 |
| 22 | R:CTGCCACAAGAACTAGAGGATAAG | 138 | ||
| 23 | EEF1A1 | NM_001402.6 | F:GCTGGAAGATGGCCCTAAAT | 107 |
| 24 | R:CCAAAGGTGGATAGTCTGAGAAG | 107 |
本發明實施例中的「傷口劃痕實驗方法」如下述。將5 × 10
4個細胞接種到24孔板中的ibidi培養插管中（ibidi GmbH 目錄號 80209，德國）並允許生長過夜以評估 PRP-plus 如何影響細胞遷移。然後移除插管，並更換使用不含有PRP-plus或含有不同濃度PRP-plus之一般培養基。培養 24小時後，去除條件培養基，在移除培養基時（0 小時）和移除後24、48或72 小時對傷口劃痕進行顯微影像攝影。再以傷口劃痕區域被細胞覆蓋(傷口癒合區域)除以原傷口劃痕區域的比例進行雙因子變異數與Sidak多重比較分析。
本發明實施例中的「粒線體功能(耗氧率)試驗」如下述。將 PRP-plus 處理的細胞接種在 Seahorse XF96 細胞培養微孔板（Agilent 目錄號 102340-100，美國）中，接著在標準培養基中以每孔 1.2 × 10
4個細胞進行實驗。XFe24 FluxPaks實用板（Agilent 目錄號 102340-100，美國）裝有 1 mL Seahorse XF Calibrant（Agilent 目錄號 100840-000，美國），然後在不含 CO
2的 37
◦C 培養箱中培養過夜。第二天，將細胞培養基更換為 Seahorse 檢測培養基（Agilent DMEM培養基，目錄號 103575-100）。根據製造商的說明進行XF 細胞壓力測試（安捷倫目錄號 103015-100，美國），依序添加寡黴素(oligomycin)、FCCP (2-[2-[4-(trifluoromethoxy)phenyl]hydrazinylidene]-propanedinitrile)、魚藤素/抗黴素A(rotenone/antimycin A)處理細胞，並以Seahorse XFe24 分析器(Agilent，美國)量化代謝通量(耗氧率與細胞外酸化速率)。
細胞外酸化速率 (rate of extracellular acidification, ECAR) 表示細胞產生的乳酸量做為糖酵解的結果，而耗氧率 (rate of oxygen consumption, OCR) 表示線粒體呼吸速率。基礎呼吸(basal respiration)耗氧率用以評估粒線體於基礎狀態時的耗氧效率，也就是最低耗氧效率。備用呼吸容量(spare respiratory capacity)表示基礎狀態時的耗氧效率至最高耗氧效率的差距，用以評估粒線體所保留的潛力，也就是遇到變化可調整的彈性。氫離子滲漏(proton leak) 是沒有成功順著梯度回到粒線體內膜內的氫離子，反應粒線體雙層膜的完整性。ATP相關呼吸(ATP-linked respiration)代表加入ATP合成抑制劑寡黴素後產生的耗氧下降部分，用於驅動 ATP合成。
本發明實施例中的「細胞衰老檢測」如下述。將細胞以每孔 1 × 10
5個細胞的密度接種到 6 孔板中，經無PRP-plus、以濃度 5% PRP-plus或10% PRP-plus 處理24小時，根據製造商的說明將細胞在 PBS 中沖洗，並至少在室溫下用固定液固定 15 分鐘，在非 CO
2培養箱中再以β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)染色48小時或72小時後以顯微鏡拍攝細胞影像。使用 ImageJ 軟件 (National Institutes of Health，美國) 計算 β-半乳糖苷酶陽性細胞(染色細胞)的數量比例。
本發明實施例中的數據統計皆使用套裝軟體GraphPad Prism 8分析，且P＜0.05視為顯著，其中數據以獨立實驗的平均值 ± 平均值標準誤差表示。依照數據不同數據類型分別使用學生t檢驗、單因子變異數分析、雙因子變異數分析等統計方式(*
p＜0.05, **
p＜0.01, ***
p＜0.001, ****
p＜0.0001)。
實施例一
增強富含血小板血漿
(PRP-plus)
的製備方法
從健康參與者抽取110~150 mL全血至包含抗凝血劑(citrate phosphate dextrose adenine, CPDA-1)的密閉式血袋(JMS，日本廣島)中，並在無菌正壓環境中操作。離心步驟中，以720 ×
g離心5分鐘以得到三層產物：血漿、紅血球 (pack RBC)、含白血球和血小板之膚色血球 (buffy coat)。取1mL血漿使用自動血液分析定義其血小板濃度，將血漿以1440 ×
g離心10分鐘以得到懸浮在上層的缺血小板血漿(Platelet-Poor Plasma, PPP)以及沉積在下層的片狀沉澱(Pellet)，再將片狀沉澱與PPP依照定義的血小板濃度調整為1×10
9cells/mL的富含血小板血漿(PRP)。活化步驟中，使用10 wt% CaCl
2加入PRP中進行活化，收集的PRP與CaCl
2溶液之體積比為4:1，並再加入以上溶液總體積約1/10體積量的玻璃珠後，以200 rpm振盪3~4小時以進行活化，活化後再以1440 ×
g離心10分鐘取出上清液以得到已活化的PRP，此步驟能釋放更多生長因子。以相等體積的PPP稀釋已活化的PRP，再以2330 ×
g離心5分鐘取出上清液以得到增強富含血小板血漿(PRP-plus)，這樣能去掉多餘的纖維蛋白(fibrin，纖維蛋白過多會影響凍乾產品的回溶率)。最後以等份量沉積在無菌注射瓶中。最後，在凍乾步驟中，所有水分都藉由真空冷凍乾燥排出(約19~23小時)以得到PRP-plus之凍乾粉末。真空冷凍乾燥係先90分鐘預冷-30
oC，5分鐘冷凝-40
oC，5分鐘抽真空0.2Torr，最後以10
oC加熱乾燥成粉末。
實施例二
在纖維母細胞上的研究
人類纖維母細胞株CCD-966SK(生物資源保存及研究中心，台灣)皆在37
oC，5%CO
2下培養於最低限度必需培養基(Corning 目錄號 MT-10-010-CV，美國維珍尼亞州)，該培養基包含10 vol% 胎牛血清(Gibco™ Thermo Fisher Scientific 目錄號 10437028，美國麻薩諸塞州)並添加1 vol % 抗生素-抗黴劑(Corning 目錄號 MT-30-004-CI，美國紐約)、0.1 nM非必需胺基酸(Corning 目錄號 MT-25-025-CI)、1.5 g/L碳酸氫鈉(Corning 目錄號 MT-25-035-CI)及1 mM丙酮酸鈉(Corning 目錄號 MT-25-000-CI)。
每瓶PRP-plus凍乾粉末在滅菌條件下調製於1mL培養基中並以吸量管混合溶解所有粉末。依照實驗試驗需求將預定數量的纖維母細胞接種在培養盤上。次日，以不同劑量PRP-plus溶液(例如濃度5 wt %、濃度10 wt %、濃度15 wt %、濃度20 wt %、濃度25 wt %、濃度30 wt %、濃度40 wt %或濃度50 wt %)在37
oC、5%CO
2下將纖維母細胞共培養於條件培養基24小時或48小時。之後移除條件培養基並以磷酸鹽緩衝液(Corning 目錄號 MT-21-040-CM)沖洗細胞一次，接著加入適當體積的標準培養基供細胞生長以進行纖維母細胞相關的實驗。
2.1 PRP-plus
的促進生長特性
-
生長因子檢測
使用細胞激素晶片(目錄號 AAH-GF-1, RayBiotech，美國喬治亞州)依照製造商操作指引分別檢測PPP(控制組)、PRP(未活化)和PRP-plus(活化後)之人類生長因子的存在，晶片上有41種人類生長因子，並使用RayBiotech以微軟Excel為基礎的分析軟體工具進行自動分析。
如圖1A及圖1B所示，點圖表示偵測到之40種細胞激素，而且，表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)、似胰島素生長因子結合蛋白(insulin-like growth factor-binding protein, IGFBP)、血小板來源生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor, PDGF-R)、血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)在PRP-plus中含量較高，其中EGF、bFGF、 HGF、PDGF及VEGF可以促進葡萄糖代謝作用。CaCl
2活化的PRP比起使用膠原蛋白(collagen)活化的PRP能釋放更多生長因子，比起凝血酶(thrombin)活化的PRP有較稀疏的纖維蛋白基質，可以促進注射位置之血小板捕獲及細胞遷移。
2.2 PRP-plus
的促進生長特性
-
增殖能力試驗
為了測試PRP-plus對纖維母細胞的生長促進效果，將5×10
3個纖維母細胞/孔接種到 96 孔板中，在 37°C 、5% CO
2下分別培養於不存在PRP-plus和存在濃度5 wt % PRP-plus、濃度10 wt % PRP-plus、濃度15 wt % PRP-plus、濃度20 wt % PRP-plus、濃度25 wt % PRP-plus、濃度30 wt % PRP-plus、濃度40 wt % PRP-plus和濃度50 wt % PRP-plus之培養基24小時和48小時。使用CCK-8 試劑（Dojindo 目錄號 CK04-20，日本）及微量盤分析儀（Molecular Devices LLC. SpectraMax®® M2e，美國加州）在 450 nm 處測量吸光度。 OD值用於比較以PRP-plus 處理和未以PRP-plus處理之細胞存活率。如圖2A所示，以濃度5 wt %或10 wt % PRP-plus處理的纖維母細胞有顯著的存活率增加，但在濃度大於30%後存活率下降，顯示以濃度5 wt %或10 wt % PRP-plus處理纖維母細胞能提高增殖能力。
2.3 PRP-plus
的促進
ATP
生成特性
另外，將5×10
3個纖維母細胞/孔接種到 96 孔板中，在 37°C、5% CO
2下分別培養於不存在PRP-plus和存在濃度5 wt % PRP-plus、濃度10 wt % PRP-plus之培養基24小時或48小時。使用發光 ATP 檢測試劑盒（Abcam 目錄號ab113849，英國）依照製造商的操作步驟測定細胞內 ATP 水平，與未經PRP-plus處理的細胞相比得到的螢光強度用來計算相對細胞內 ATP 水平。如圖2B所示，相較於經PRP-plus處理48小時的纖維母細胞，在經濃度5 wt %及濃度10 wt % PRP-plus處理24小時的纖維母細胞中可見到ATP生成提高並有劑量倚賴性。
2.4 PRP-plus
的傷口修復特性
將5 × 10
4個纖維母細胞依照「傷口劃痕實驗方法」使用不含有PRP-plus、含有濃度5 wt% PRP-plus或濃度10 wt % PRP-plus之培養基處理過24小時，以評估會如何影響纖維母細胞遷移。如圖2C所示，纖維母細胞經濃度5 wt% 和10 wt % PRP-plus處理後，傷口癒合區域在24小時內就能達到80%~90%。上述研究顯示因PRP-plus富含生長因子，可以幫助纖維母細胞增殖並修復傷口。
2.5 PRP-plus
的粒線體相關基因調控能力
依照「mRNA分離及即時定量系統實驗方法」檢測粒線體生成相關基因之mRNA表現水平，例如過氧化體增生活化受體γ共激活因子1α (PGC-1α)與γ共激活因子1β (PGC-1β)。纖維母細胞經濃度5 wt% 和10 wt % PRP-plus處理24小時後，在24小時、48小時及72小時量測PGC-1α和PGC-1β mRNA表現水平，統計數據以Tukey多重比較和雙因子變異數分析，並以控制組作為倍數基準。PGC-1α和PGC-1β是PGC-1家族的轉錄共同活化因子，在粒線體生成和呼吸功能調控上扮演重要角色。如圖3A和圖3B所示，PRP-plus顯著可以向下調控PGC-1α和PGC-1β基因表達，顯示可能因此限制粒線體生成及需氧呼吸。
2.6 PRP-plus
的抗氧化用途
纖維母細胞經濃度5 wt% 和10 wt % PRP-plus處理24小時後，再經過24小時依照「mRNA分離及即時定量系統實驗方法」檢測抗氧化酵素之mRNA表現水平，例如8-氧代-鳥嘌呤DNA糖基化酵素-1(OGG1)、銅和鋅的超氧化物歧化酵素(Cu/ZnSOD)、錳超氧化物歧化酵素(MnSOD)、過氧化氫分解酵素(CAT)、穀胱甘肽過氧化酵素1(GPX1)、穀胱甘肽過氧化酵素4(GPX4)、穀胱甘肽還原酵素(GSR)以及穀胱甘肽合成酵素(GSS)。統計數據以Tukey多重比較和雙因子變異數分析，並以控制組作為倍數基準。
如圖4所示，與未經PRP-plus處理之纖維母細胞的抗氧化酵素之mRNA表現為一倍基礎，纖維母細胞經濃度5 wt% 和10 wt % PRP-plus處理的抗氧化酵素之mRNA表現水平部分，OGG1、CAT、GPX1、GSR和GSS等抗氧化酵素表現有上調的趨勢，特別是OGG1和GSS顯著較高，顯示抗氧化活性被調高，PRP-plus能提高纖維母細胞的抗氧化能力。
2.7
粒線體質量降低與
ROS
減少
關於流式細胞分析，使用Attune NxT 流式細胞儀（Thermo Fisher Scientific，美國）和 FlowJo 軟件 (Ashland Tree Star，美國)。未使用PRP-plus處理纖維母細胞或使用上述PRP-plus處理纖維母細胞後，1×10
6纖維母細胞於 37°C 培養 15、30 和 60 分鐘於正常 MEM 中，於MEM 中使用2.5 µM 粒線體螢光探針NAO（Thermo Fisher Scientific 目錄號A1372，美國）或5 µM螢光探針CellROX green（Thermo Fisher Scientific 目錄號 C10444，美國）以分別檢測壬基吖啶橙(Nonyl acridine orange, NAO)與活性氧類(ROS)。染色後，用牛血清白蛋白緩衝液（pH 7.2，0.5%）洗滌細胞3 次，在 1500 × g離心 5 分鐘。通過前向散射 (FSC) 和側向散射 (SSC) 信號對活細胞進行圈選後，每個樣本收集 1 × 10
4個事件用於流式細胞分析，以量測代表粒線體質量的平均螢光密度及代表ROS的平均螢光密度，並以單因子變異數分析統計數據。
如圖5A所示，流式細胞儀檢測壬基吖啶橙(Nonyl acridine orange, NAO)螢光密度顯著降低，顯示纖維母細胞中經過PRP-plus處理後，其粒線體質量顯著降低，呼應前述2.5中PRP-plus可以顯著向下調控PGC-1α和PGC-1β的結果，可以推測PRP-plus會抑制粒線體生成和需氧呼吸。如圖5B所示，CellROX探針在還原態時無螢光或呈現弱螢光，流式細胞儀檢測CellROX平均螢光密度，纖維母細胞中經過PRP-plus處理後，平均螢光密度顯著低於未經PRP-plus處理的組別，顯示ROS大幅減少。呼應前述2.6中的抗氧化酵素表現，可見PRP-plus處理可以活化抗氧化防衛系統大幅消除細胞內ROS。
2.8 PRP-plus
對粒線體功能的調控
將未經PRP-plus處理的纖維母細胞與經10 wt% PRP-plus 處理的纖維母細胞進行「粒線體功能(耗氧率)試驗」。如圖6A所示，經10 wt% PRP-plus 處理的纖維母細胞之粒線體呼吸耗氧率都低於未經PRP-plus處理的纖維母細胞。如圖6B至圖6E所示，經10 wt% PRP-plus 處理的纖維母細胞之基礎呼吸(basal respiration)耗氧率、備用呼吸容量(spare respiratory capacity)耗氧率、氫離子滲漏(proton leak)耗氧率以及ATP相關呼吸耗氧率都低於未經PRP-plus處理的纖維母細胞。
上述結果顯示，當細胞遭受氧化壓力會需要較多ATP來應付壓力，因此會需要有較高的備用呼吸容量耗氧率，但因PRP-plus處理調高抗氧化酵素來抵抗氧化壓力，因此也就不需要太高的備用呼吸容量耗氧率。此外，氫離子滲漏減少可以減少ROS累積。PRP-plus處理能使纖維母細胞減少粒線體呼吸，因此耗氧量少於未經PRP-plus處理的纖維母細胞，並能將纖維母細胞之能量代謝方式從粒線體代謝轉為糖酵解代謝，有利於處理內部快速能量消耗和外來氧化還原壓力，能提高抗老效果。
2.9 PRP-plus
的抗老化特性
將纖維母細胞以經無PRP-plus、濃度 5% PRP-plus和 10% PRP-plus 處理24小時，進行「細胞衰老檢測」以β-半乳糖苷酶染色48 和 72 小時後，如圖7A所示，經PRP-plus處理的纖維母細胞中與衰老相關之β-半乳糖苷酶活性顯著降低，且具有劑量倚賴性，因此PRP-plus能抑制纖維母細胞之衰老。
將纖維母細胞以經無PRP-plus、濃度 5% PRP-plus和 10% PRP-plus 處理24小時後，在24小時、48小時及72小時以「mRNA分離及即時定量系統實驗方法」量測
SIRT1之mRNA表現水平，統計數據以Tukey多重比較和雙因子變異數分析，並以控制組作為倍數基準(N=3)。如圖7B所示，經PRP-plus處理之纖維母細胞向上調控
SIRT1的mRNA表現水平。
SIRT1的向下調控與老化有關，因此PRP-plus能阻止
SIRT1表現以延緩老化。
實施例三
在間質幹細胞上的研究
人類臍帶間質幹細胞(Human Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells, Human Wharton's Jelly MSC) (來源：財團法人食品工業發展研究所，台灣)係以培養基DMEM/F12和5%人類血小板裂解濃縮液(human Platelet Lysate, hPL)進行培養。依照實驗試驗需求將預定數量的間質幹細胞接種在培養盤上。次日，以不同劑量PRP-plus溶液(例如濃度5 wt %、濃度10 wt %)在37
oC、5%CO
2下將間質幹細胞共培養於條件培養基24小時或48小時。之後移除條件培養基並以磷酸鹽緩衝液(Corning 目錄號 MT-21-040-CM)沖洗細胞一次，接著加入適當體積的標準培養基供細胞生長以進行間質幹細胞相關的實驗。
3.1 PRP-plus
的促進
ATP
生成特性
另外，將5×10
3個間質幹細胞/孔接種到 96 孔板中，在 37°C 、5% CO
2下分別培養於不存在PRP-plus和存在濃度5 wt % PRP-plus、濃度10 wt % PRP-plus之培養基24小時或48小時。使用發光 ATP 檢測試劑盒（Abcam 目錄號ab113849，英國）依照製造商的操作步驟測定細胞內 ATP 水平，與未經PRP-plus處理的細胞相比得到的螢光強度用來計算相對細胞內 ATP 水平。如圖8所示，相較於經PRP-plus處理48小時的間質幹細胞，在經濃度5 wt %及濃度10 wt % PRP-plus處理24小時的間質幹細胞中可見到ATP生成提高，特別是濃度5 wt %有最高的ATP生成。
3.2 PRP-plus
的抗氧化用途
間質幹細胞經濃度5 wt% 和10 wt % PRP-plus處理24小時後，再經過24小時依照「mRNA分離及即時定量系統實驗方法」檢測抗氧化酵素之mRNA表現水平，例如8-氧代-鳥嘌呤DNA糖基化酵素-1(OGG1)、銅和鋅的超氧化物歧化酵素(Cu/ZnSOD)、錳超氧化物歧化酵素(MnSOD)、過氧化氫分解酵素(Catalase)、穀胱甘肽過氧化酵素1(GPX1)、穀胱甘肽過氧化酵素4(GPX4)、穀胱甘肽還原酵素(GSR)以及穀胱甘肽合成酵素(GSS)。統計數據以Tukey多重比較和雙因子變異數分析，並以控制組作為倍數基準。
如圖9所示，以未經PRP-plus處理之間質幹細胞的抗氧化酵素之mRNA表現為一倍基礎，間質幹細胞經濃度5 wt% 和10 wt % PRP-plus處理的抗氧化酵素之mRNA表現水平在OGG1、Cu/ZnSOD、MnSOD、CAT、GPX1、GPX4、GSR以及GSS等抗氧化酵素表現都有上調的趨勢，顯示抗氧化活性被調高，PRP-plus能提高間質幹細胞的抗氧化能力。
3.3 PRP-plus
的抗老化特性
將間質幹細胞未經PRP-plus處理和以10% PRP-plus 處理24小時，進行「細胞衰老檢測」以β-半乳糖苷酶染色48小時後觀察染色細胞的細胞數量，如圖10A所示，經PRP-plus處理的間質幹細胞中與衰老相關之β-半乳糖苷酶陽性細胞數降低，因此PRP-plus能抑制間質幹細胞之衰老。
將間質幹細胞未經PRP-plus處理(Ctrl)和以5% PRP-plus和以10% PRP-plus 處理24小時，再照射150 mJ/cm
2之紫外線B(UVB)1小時，進行「細胞衰老檢測」以β-半乳糖苷酶染色72小時後觀察染色細胞的細胞數量。如圖10B所示，經PRP-plus處理的間質幹細胞中與衰老相關之β-半乳糖苷酶陽性細胞數顯著降低，因此PRP-plus能抑制間質幹細胞因紫外線B造成之衰老。
3.4 PRP-plus
對粒線體功能的調控
將未經PRP-plus處理的間質幹細胞與經濃度5 wt%和10 wt% PRP-plus 處理的間質幹細胞進行粒線體功能(耗氧率)試驗。如圖11A所示，經5 wt%和10 wt% PRP-plus 處理的間質幹細胞之粒線體呼吸耗氧率都高於未經PRP-plus處理的間質幹細胞，其中濃度5 wt% PRP-plus處理的組別之粒線體呼吸耗氧率最高。如圖11B至圖11E所示，經PRP-plus 處理的間質幹細胞之基礎呼吸(basal respiration)耗氧率、備用呼吸容量(spare respiratory capacity)耗氧率、氫離子滲漏(proton leak)耗氧率以及ATP相關呼吸耗氧率都高於未經PRP-plus處理的間質幹細胞，特別是經濃度5 wt% PRP-plus處理的間質幹細胞之基礎呼吸(basal respiration)耗氧率、備用呼吸容量(spare respiratory capacity)耗氧率、氫離子滲漏(proton leak)耗氧率以及ATP相關呼吸耗氧率都高於經濃度10 wt% PRP-plus處理的間質幹細胞。
上述結果顯示PRP-plus可能促進間質幹細胞中的粒線體活性，也有可能是間質幹細胞本身較仰賴糖酵解代謝，PRP-plus使細胞重新調整內部的能量代謝方式轉變為粒線體代謝，能獲得更多的ATP，進而可以提高細胞修復能力，例如脂肪、骨骼、軟骨、肌肉、靭帶甚至神經、血管、心臟、胰臟、腎臟之細胞修復。
本發明實施例所提供的PRP-plus針對纖維母細胞及間質幹細胞都能增加抗氧化酵素的表現，以阻斷細胞內形成有害自由基，進而延緩細胞老化。然而，PRP-plus在纖維母細胞及間質幹細胞的代謝調控方法則不一樣，PRP-plus能重置細胞的代謝趨向，例如PRP-plus能使纖維母細胞從粒線體代謝模式轉向糖解代謝，使間質幹細胞從糖解代謝轉向粒線體代謝。PRP-plus所觸發的代謝調節路徑是促使成纖維母細胞和間質幹細胞的代謝逆程式化(metabolic reprogramming)，同為幫助細胞保持氧化還原平衡和增進傷口癒合，以及抗衰老過程所需的合成代謝路徑。
本發明已透過上述之實施例揭露如上，僅是本發明部分較佳的實施例選擇，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此一技術領域具有通常知識者，在瞭解本發明前述的技術特徵及實施例，並在不脫離本發明之精神和範圍內所做的均等變化或潤飾，仍屬本發明涵蓋之範圍，而本發明之專利保護範圍須視本說明書所附之請求項所界定者為準。
無
圖1A為本發明實施例二使用之人類生長因子檢測抗體陣列對照圖及其對應PPP、PRP、PRP-plus的檢測結果點陣圖。圖1B為圖1A之PPP、PRP、PRP-plus中人類生長因子含量的熱圖，以激素蛋白的相對表現量(Row Z-Score)表示。
圖2A分別為實施例二中未以PRP-plus處理、以濃度5 wt% PRP-plus、濃度10 wt% PRP-plus、濃度15 wt% PRP-plus、濃度20 wt% PRP-plus、濃度25 wt% PRP-plus、濃度30 wt% PRP-plus、濃度40 wt% PRP-plus和濃度50 wt% PRP-plus處理纖維母細胞24小時或48小時之細胞存活率折線圖(未以PRP-plus處理之細胞存活率視為100%與其他組別進行比較)。圖2B分別為實施例二中未以PRP-plus處理(NC組)、以濃度5 wt% PRP-plus、濃度10 wt% PRP-plus處理纖維母細胞24小時或48小時之ATP相對水平的改變折線圖。圖2C分別為實施例二中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度5 wt% PRP-plus、濃度10 wt% PRP-plus處理纖維母細胞24小時後，在傷口劃痕實驗於24小時、48小時及72小時之傷口癒合區域比例長條圖。
圖3A和圖3B分別為實施例二中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度5 wt% PRP-plus、濃度10 wt% PRP-plus處理纖維母細胞24小時後，在移除PRP-plus後24、48、72小時檢測PGC-1α基因(圖3A)以及PGC-1β基因(圖3B)表現水平差異倍數折線圖 (n=5，*表示不同組別間的統計差異，#表示24小時與48小時數據間的差異)。
圖4依序分別為實施例二中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度5 wt% PRP-plus、濃度10 wt% PRP-plus處理纖維母細胞24小時後，在移除PRP-plus後24小時檢測OGG1、Cu/ZnSOD、MnSOD、catalase (CAT)、GPX1、GPX4、GSR以及GSS之基因表現水平差異倍數長條圖 (n=5，*
p＜0.05)。
圖5A分別為實施例二中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度5 wt% PRP-plus、濃度10 wt% PRP-plus處理纖維母細胞24小時後，NAO之平均螢光密度長條圖；圖5B分別為實施例二中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度5 wt% PRP-plus、濃度10 wt% PRP-plus處理纖維母細胞24小時後，CellROX之平均螢光密度長條圖 (n=2，*
p＜0.05，****
p＜0.0001)。
圖6A為實施例二中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度10 wt% PRP-plus處理纖維母細胞24小時後，纖維母細胞之粒線體呼吸耗氧率折線圖。圖6B為實施例二中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度10 wt% PRP-plus處理纖維母細胞24小時後，纖維母細胞之基礎呼吸耗氧率長條圖。圖6C為實施例二中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度10 wt% PRP-plus處理纖維母細胞24小時後，纖維母細胞之備用呼吸容量耗氧率長條圖。圖6D為實施例二中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度10 wt% PRP-plus處理纖維母細胞24小時後，纖維母細胞之氫離子滲漏耗氧率長條圖。圖6E為實施例二中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度10 wt% PRP-plus處理纖維母細胞24小時後，纖維母細胞之ATP相關呼吸耗氧率長條圖。
圖7A為實施例二中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度5 wt% PRP-plus、濃度10 wt% PRP-plus處理纖維母細胞24小時後，染色48小時及72小時後分別得到的β-半乳糖苷酶染色活性強度之差異倍數長條圖；圖7B為實施例二中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度5 wt% PRP-plus、濃度10 wt% PRP-plus處理纖維母細胞24小時後，經24、48、72小時所檢測
SIRT1的mRNA表現水平之差異倍數折線圖，以控制組作為倍數基準。
圖8分別為實施例三中未以PRP-plus處理(NC組)、以濃度5 wt% PRP-plus、濃度10 wt% PRP-plus處理間質幹細胞24小時或48小時之ATP相對水平的改變折線圖。
圖9依序分別為實施例三中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度5 wt% PRP-plus、濃度10 wt% PRP-plus處理間質幹細胞24小時後，在移除PRP-plus後24小時檢測OGG1、Cu/ZnSOD、MnSOD、CAT、GPX1、GPX4、GSR以及GSS之基因表現水平差異倍數長條圖。
圖10A為實施例三中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度10 wt% PRP-plus處理間質幹細胞24小時後，染色48小時後分別得到的β-半乳糖苷酶陽性細胞數長條圖。圖10B為實施例三中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度5 wt% PRP-plus、濃度10 wt% PRP-plus處理間質幹細胞24小時後進行1小時紫外光照射，再染色48小時後分別得到的β-半乳糖苷酶陽性細胞數長條圖。
圖11A為實施例三中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度5 wt%和10 wt% PRP-plus處理間質幹細胞24小時後，間質幹細胞之粒線體呼吸耗氧率折線圖。圖11B為實施例三中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度5 wt%和濃度10 wt% PRP-plus處理間質幹細胞24小時後，間質幹細胞之基礎呼吸耗氧率長條圖。圖11C為實施例三中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度5 wt%和濃度10 wt% PRP-plus處理間質幹細胞24小時後，間質幹細胞之備用呼吸容量耗氧率長條圖。圖11D為實施例三中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度5 wt%和濃度10 wt% PRP-plus處理間質幹細胞24小時後，間質幹細胞之氫離子滲漏耗氧率長條圖。圖11E為實施例三中未以PRP-plus處理(Ctrl組)、以濃度5 wt%和濃度10 wt% PRP-plus處理間質幹細胞24小時後，間質幹細胞之ATP相關呼吸耗氧率長條圖。
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Claims (11)
- 一種增強富含血小板血漿之製備方法，包含：以720×g離心一全血樣本5分鐘，以得到血漿；以1440×g離心該血漿10分鐘，以得到富含血小板血漿及缺血小板血漿；加入CaCl2溶液以對該富含血小板血漿進行震盪活化，其中該富含血小板血漿的體積為該CaCl2溶液體積的3~5倍；以1440×g離心已活化之該富含血小板血漿10分鐘，以得到上清液；以及以該缺血小板血漿稀釋該上清液並進一步以2330×g離心5分鐘，其中該缺血小板血漿與該上清液之體積比為4：6至6：4，以得到該增強富含血小板血漿。
- 如請求項1之製備方法，其進一步包含：真空冷凍乾燥該增強富含血小板血漿以得到粉狀之該增強富含血小板血漿。
- 如請求項1之製備方法，其中在該CaCl2溶液中進一步加入玻璃珠進行震盪活化。
- 一種增強富含血小板血漿，其係以如請求項1至3中任一項之製備方法製造。
- 一種藥學組成物，其包含：如請求項4之增強富含血小板血漿。
- 一種如請求項4之增強富含血小板血漿在製備抗氧化之醫藥組合物的用途。
- 一種如請求項4之增強富含血小板血漿在製備抗老化之醫藥組合物的用途。
- 一種如請求項4之增強富含血小板血漿在製備粒線體代謝調控之醫藥組合物的用途。
- 如請求項8之用途，其中該增強富含血小板血漿係逆轉該細胞之粒線體代謝模式，其中該增強富含血小板血漿之濃度範圍在2 wt%與13 wt%之間。
- 如請求項9所述之用途，其中當該細胞為纖維母細胞，該粒線體代謝模式由粒線體代謝轉向糖解代謝。
- 如請求項9所述之用途，其中當該細胞為間質幹細胞，該粒線體代謝模式由糖解代謝轉向粒線體代謝。
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| TW111144623A TWI856429B (zh) | 2022-11-22 | 增強富含血小板血漿及其製備方法與用途 | |
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| TW111144623A TWI856429B (zh) | 2022-11-22 | 增強富含血小板血漿及其製備方法與用途 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006023911A2 (en) | 2004-08-20 | 2006-03-02 | Alberto Gorrochategui Barrueta | Biological tissue regenerative agent and method for preparing and using same |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006023911A2 (en) | 2004-08-20 | 2006-03-02 | Alberto Gorrochategui Barrueta | Biological tissue regenerative agent and method for preparing and using same |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 期刊 Deborah Chicharro-Alcántara et al. Platelet Rich _New Insights for Cutaneous Wound Healing Management_ 2018; 9(1):10. J. Funct. Biomater. |
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