TWI846157B - 一種沙福芽孢桿菌(Bacillus safensis)及其用途 - Google Patents

一種沙福芽孢桿菌(Bacillus safensis)及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種沙福芽孢桿菌菌株(Bacillus safensis)，其係寄存於台灣新竹食品工業發產研究所，寄存編號為BCRC 911158。本發明之沙福芽孢桿菌菌株係分離自白蝦，該菌株對多種致病性弧菌具有抑制活性，並具有優異之環境耐受性、不溶血且對多種抗生素具敏感性，可作為一安全、有效的益生菌應用於水產養殖，預防或改善疾病感染之存活率。

Description

一種沙福芽孢桿菌(Bacillus safensis)及其用途
本發明係關於一種沙福芽孢桿菌( Bacillus safensis)及其用途，特別係關於一種沙福芽孢桿菌VQV8菌株，其對於致病性弧菌( Vibriospp.)具有抑制活性，並可應用於蝦類水產養殖。
弧菌屬( Vibrio)為革蘭氏陰性菌的一種，其所引起的相關疾病長久以來都是養殖產業的重大威脅之一。弧菌為海水中常見的細菌，海水及半淡鹹水養殖的魚種都可能受到弧菌的危害。在臺灣，養殖石斑及蝦類是主要的受害者，其次為吳郭魚、虱目魚及鱸魚等。弧菌主要以兩種途徑感染：(1) 透過寄主的表面感染及/或 (2) 攝取受汙染的水及/或飼料透過消化系統感染。
蝦類的水產養殖中，急性肝胰腺壞死病(Acute Hepatopancreas Necrosis Disease，AHPNS) 於2009年首次在中國傳出疫情後，迄今已在多個蝦類養殖大國爆發蝦類大規模死亡的情形，其中尤以中國、越南、馬來西亞與泰國等國的疫情最為嚴重，中國的蝦類養殖業損失近80%的產值，而根據越南、馬來西亞與泰國的報導顯示，自2009年後的2至5年內，蝦類總產量損失60%以上，據報導平均一年因AHPNS所造成的損失超過十億美元，此疾病已嚴重威脅全球蝦類養殖產業。一旦感染AHPNS，蝦苗放養後30日內即開始大量斃死，甚至發生全軍覆沒的慘烈災情，病蝦的肝胰腺會變白及萎縮，且此器官變得難以用手指搓碎，在組織切片檢驗下，肝胰腺細胞呈現壞死及脫落至肝胰腺小管外，亦有大量的血細胞侵入肝胰腺，造成嚴重的發炎反應。
已知副溶血弧菌( Vibrio parahaemolyticus)是引起AHPNS的主要病原菌，惟近期認為哈維弧菌( Vibrio harveyi)、溶藻弧菌( Vibrio alginolyticus)及創傷弧菌( Vibrio vulnificus)亦會引起白蝦( Penaeus vannamei) 的AHPNS。在弧菌中編碼Pir vp毒素基因(PirA vp及PirB vp)的質體被認為是致病的主要毒素因子，其中帶有毒素基因的質體可在弧菌的物種間轉移，這使得此疾病變得更加複雜與危險。
水產養殖業者在面臨養殖生物發生細菌性疾病時，常以抗生素或化學藥劑進行預防或治療處理，然而抗生素的濫用可能造成抗藥性菌株的散佈、生態環境的破壞及藥物殘留等問題，導致抗生素的效力減低，甚至危害人體健康。有鑒於此，開發抗生素的替代方式為水產養殖永續發展的重要課題。
益生菌被視為有前景的替代方案之一，其可以藉由改變微生物群落、抑制病原菌、分泌有用的化合物、甚至被宿主消耗的方式，達到促進生長、預防疾病、增強免疫反應及改善寄主健康的效果。
水產養殖產業迫切需要預防因過量使用抗生素而引起的新疾病與耐藥性病原體，其中副溶血弧菌引起的蝦類急性肝胰腺壞死病(AHPNS)在患病30天內的死亡率高達100%，因此其對全球蝦產量造成重大影響。
此外，在養殖蝦場中所使用的化學藥劑及抗生素會汙染地下水及沿海河口，而此等被汙染的地點為許多海洋生物的繁殖場，對環境造成重大危當。
本發明鑑於上述問題，目的在於提供一種安全、有效的益生菌，期望該菌株對多種致病性弧菌皆展現抑制活性，應用於蝦類水產養殖能夠預防或改善疾病感染，藉此替代抗生素及化學藥劑的使用。另外，由於水產養殖生物的生存環境具有水質、溫度、酸鹼度、鹽分以及共生微生物等複雜的環境變因，還必須考慮益生菌的環境耐受性等因素。
為達到上述目的，本發明提供以下技術手段。
在一態樣中，本發明提供一種沙福芽孢桿菌菌株(Bacillus safensis)，其係寄存於台灣新竹食品工業發產研究所，寄存編號為BCRC 911158。
在部分實施型態中，本發明之沙福芽孢桿菌菌株對多種致病性弧菌(Vibrio spp.)展現抑制活性。在部分實施型態中，本發明之沙福芽孢桿菌菌株對以下致病性弧菌(Vibrio spp.)之至少一種具有優異之抑制活性：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈維弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)及創傷弧菌(Vibrio vulnificus)。
在部分實施型態中，本發明之沙福芽孢桿菌菌株之溫度耐受範圍為25℃~45℃，較佳為25℃~37℃之間。在部分實施型態中，本發明之沙福芽孢桿菌菌株適於生長的溫度範圍為30℃~37℃，較佳為30℃左右。
在部分實施型態中，本發明之沙福芽孢桿菌菌株之pH值耐受範圍為3~10。在部分實施型態中，本發明之沙福芽孢桿菌菌株在pH值5~9生長為佳，較佳於pH值6~8。
在部分實施型態中，本發明之沙福芽孢桿菌菌株之鹽度耐受範圍可達NaCl濃度10%，較佳為NaCl濃度8%以下，進一步較佳為NaCl濃度7%以下。在部分實施型態中，本發明之沙福芽孢桿菌菌株在NaCl濃度0~3%之鹽度範圍內展現優異之生長活性。
在部分實施型態中，本發明之沙福芽孢桿菌菌株為γ溶血性(γ-hemolysis)，或稱為不溶血(non-hemolytic)。
在部分實施型態中，本發明之沙福芽孢桿菌菌株對多種抗生素具敏感性。在部分實施型態中，前述抗生素包含但不限於以下之至少一種：氨苄西林(ampicillin)、紅黴素(erythromycin)、鏈黴素(streptomycin)、四環黴素(tetracycline)及萬古黴素(vancomycin)。
在另一態樣中，本發明提供一種上述沙福芽孢桿菌菌株用於製備水產養殖飼料之用途，其特徵係該水產養殖飼料用於預防或改善蝦類感染急性肝胰腺壞死病(AHPND)之存活率。
在另一態樣中，本發明提供一種預防弧菌感染之蝦類飼料，其特徵係其包含本發明之沙福芽孢桿菌菌株。
生物防治法中，使用從自然界分離之益生菌，係對環境影響較小，且可減少抗藥性菌株產生之風險，為替代抗生素預防疾病的有效策略之一。本發明之沙福芽孢桿菌菌株係分離自白蝦，其作為益生菌，對多種致病性弧菌皆展現優異之抑制活性，甚至較習知的抗生素，例如氯黴素，展現更佳的抗菌活性，且該菌株不具溶血性，並對多種抗生素具敏感性，顯示其為安全、有效之益生菌，應用於蝦類或魚類的水產養殖能預防或改善疾病感染之存活率。
另外，本發明之沙福芽孢桿菌菌株具有廣泛之環境耐受性，例如溫度、pH值及鹽度耐受性，因此在水產養殖環境經常變動的情況下，仍能展現良好之生長活性，並發揮良好之抗菌效果。
下揭示本發明實施方式，其並非限制本發明必須以下述方式實施，而係為了闡釋本發明之詳細內容與實施之效果。
〔菌株分離〕
從屏東縣東港鎮的紅吳郭魚與白蝦共養池中隨機採集10隻白蝦，重量約17~22克，採樣點的鹽度為20 g/L，解剖前先將白蝦樣本浸入4℃冰中，並以70%酒精消毒蝦殼。
1.5 mL管中加入1 mL無菌Marine Broth (MB) (BD, USA)，並將10隻白蝦的腸道匯集於一管中，製備均質溶液，並以80℃加熱10分鐘殺死細菌的營養細胞，高溫加熱後殘留於該溶液中的主要為細菌的孢子，包含大部分可耐受高溫的芽孢桿菌屬的物種。將高溫加熱後的溶液10倍序列稀釋，塗佈於Marine Agar (MA) (BD, USA)瓊脂平板上，置於30℃培養24~48小時直到出現清晰的菌落，為了進行純化，各菌落至少繼代5次。 ［實施例］
實施例1：拮抗活性試驗
從上述高溫加熱後的白蝦腸道樣本共分離出398個菌株，檢測各個分離株對四種致病性弧菌的抑制活性，分別為副溶血弧菌( Vibrio parahaemolyticus)、哈維弧菌( Vibrio harveyi)、溶藻弧菌( Vibrio alginolyticus)及創傷弧菌( Vibrio vulnificus)。
拮抗試驗前，將上述四種弧菌分別於MB培養基內培養24小時，根據波長600 nm的吸光值(OD600)，將病原菌的菌液濃度調整至約10 8CFU/mL，並均勻塗佈於MA瓊脂平板上。接著，將各個分離株的濃縮液接種在塗佈有弧菌的MA瓊脂平板上，全部398個分離株均進行三重複試驗，各點5 μL共3個點。另外，將三個含有30 μg氯黴素的紙錠置於平板的另一側作為正對照組。將平板置於30℃培養24小時後，接種位置周圍產生抑制圈的菌株即具拮抗活性，紀錄抑制圈的直徑，藉此篩選對致病性弧菌具有抗菌活性之潛力菌株。為了確認拮抗活性，對至少一種弧菌產生抑制圈的分離株重複該試驗至少兩次，最後篩選出對上述四種致病性弧菌均產生清晰抑制圈的潛力菌株，並進一步進行革蘭氏染色、運動性、過氧化氫酶及氧化酶的檢測。
試驗結果如圖1及表1所示，398個分離株中僅有41個分離株(10.3%)對至少一種弧菌具有抑制活性，其中篩選出8個分離株(2%)(以下簡稱VQV1~VQV8)對全部四種待測弧菌皆展現強烈的抑制活性。
[表1] 8個菌株對致病性弧菌的拮抗活性
編號 菌株 抑制圈直徑 ( 平均值 ± SD) (mm)
副溶血弧菌 哈維弧菌 創傷弧菌 溶藻弧菌
1 VQV1 11.0 ± 1.0 14.0 ± 0.0 22.3 ± 0.6 9.3 ± 0.6
2 VQV2 16.5 ± 0.5 17.0 ± 0.0 22.7 ± 0.6 21.3 ± 0.6
3 VQV3 19.3 ± 0.6 21.0 ± 0.6 24.0 ± 0.0 22.7 ± 0.6
4 VQV4 4.3 ± 0.6 8.5 ± 0.5 24.7 ± 0.6 5.0 ± 0.0
5 VQV5 18.3 ± 0.6 11.0 ± 0.0 19.7 ± 0.6 15.7 ± 0.6
6 VQV6 10.0 ± 0.0 10.0 ± 1.0 21.3 ± 0.6 9.3 ± 0.6
7 VQV7 17.3 ± 0.6 20.0 ± 0.0 21.7 ± 0.6 10.0 ± 0.0
8 VQV8 21.0 ± 1.0 21.7 ± 0.6 24.7 ± 0.6 19.7 ± 0.6
正對照組 30 μg氯黴素 20.3 ± 0.6 18.3 ± 0.6 0.0 ± 0.0 20.7 ± 1.5
VQV1至VQV8菌株的抑制圈直徑如表1所示，其中VQV8菌株對四種致病性弧菌展現最優異之抗菌活性，其次為VQV3菌株，當待測病原菌為創傷弧菌時，VQV4及VQV8菌株形成最大的抑制圈直徑24.7 ± 0.6 mm。其餘菌株亦顯示對四種致病性弧菌的高抗菌活性，特別係對氯黴素具有抗藥性的創傷弧菌，甚至展現最佳之拮抗活性。另外，菌株的特徵分析結果顯示，上述8個菌株均為具運動性之革蘭氏陽性菌，皆具有過氧化氫酶及氧化酶活性，並且皆能產生孢子。
〔菌株鑑定〕
個別刮取上述8個菌株的單一菌落，使用Allpure Bacteria Genomic DNA Kit (AllBio Science, Inc)抽取基因組DNA，接著進行16S rRNA、 gyrB核酸序列增幅，使用引子對27F (SEQ ID NO: 1)及1492R (SEQ ID NO: 2)擴增16S rRNA核酸序列，以及使用引子對UP-1 (SEQ ID NO: 3)及UP-2r (SEQ ID NO: 4)擴增 gyrB核酸序列，分別加入PCR各反應物，總反應體積50 µL，進行PCR反應。PCR反應條件設定如下：(1) 98℃預熱；(2) 95℃，6分鐘；(3) 95℃，30秒；(4) 55℃，1分鐘；(5) 72℃，1分鐘；(6) (2)至(5)步驟重複40個循環；(7) 72℃，10分鐘。
定序分析所得之專一性片段，再送至National Center for Biotechnology Information (NCBI) 資料庫中使用Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 系統進行序列的比對，鑑定分離株之物種，並分別將所得之16S rRNA及 gyrB序列與其他 Bacillusspp.序列進行親緣性分析。
定序結果顯示，8個菌株(VQV1至VQV8)的16S rRNA核酸序列相同，代表此等菌株應屬同一物種，因此僅對VQV8菌株的16S rRNA序列進行親緣性分析。VQV8菌株的16S rRNA核酸序列的GenBank編號為ON989744(SEQ ID NO: 5)，以BLAST程式與網路基因庫進行比對，發現與 Bacillus safensis的MT2菌株具有相同同源性，相似度99.65%為最高，其次為 B. safensisFO-36b、 B. safensisMN149及 B. pumilusDFs1420三個菌株，有相同相似度99.58%。如圖2所示，16S rRNA序列的親緣樹狀圖顯示，VQV8菌株與 B. safensis及 B. pumilus位於同一群集(cluster)，但最接近 B. safensisMT2。
進一步將VQV3菌株及 VQV8菌株的 gyrB核酸序列進行定序分析，結果顯示此兩個菌株的序列相同，進一步確定該等菌株屬於同一物種。 gyrB序列的親緣性分析分法如上所述，VQV8菌株的 gyrB核酸序列的GenBank編號為ON986415 (SEQ ID NO: 6)，BLAST比對結果顯示前四個具有最高相似度的物種均為 B. safensis，界於96.90%至96.92%，接著為 B. pumilus(＜96.82%)， gyrB核酸序列的親緣樹狀圖如圖3所示。因此，證實VQV8菌株為沙福芽孢桿菌 Bacillus safensis。
實施例2：環境耐受性分析
由於水產養殖生物的生存環境具有水質、溫度、酸鹼度、鹽分以及共生微生物等複雜的環境變因，必須考慮益生菌的環境耐受性等因素，以下在不同培養條件下，例如溫度、pH值及鹽度，檢測本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株的生長情形。
〔溫度耐受性分析〕
試驗前將本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株培養於MB培養基24小時，接著稀釋菌液並將OD600調整至0.01，濃度約10 6CFU/mL，各個培養溫度的處理組(分別為25℃、30℃、37℃及45℃)有四組重複，以分光光度計測定在培養 0小時、4小時、8小時、12 小時及 24 小時後，不同溫度條件下的OD600，並繪製生長曲線。試驗結果如圖4所示，本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株之溫度耐受範圍為25℃~45℃，並且於25℃~37℃之間具有較佳生長活性。
〔pH值耐受性分析〕
試驗前將本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株培養於MB培養基24小時，以1 M NaOH及1 M HCl將MB培養基的pH值分別調整為3、4、5、6、7、8、9 及 10，加入菌液並將OD600調整至0.01，各個pH值的處理組有四組重複，在培養 0小時、4小時、8小時、12 小時及 24 小時的時間點，測定不同pH值條件下的OD600，並繪製生長曲線。試驗結果如圖5所示，本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株之pH值耐受範圍為3~10，在極端的pH值下仍具生長活性，因此能耐受消化道中低至pH值3的環境，顯示本發明之菌株可經由口服投予。
〔鹽度耐受性分析〕
試驗前將本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株培養於MB培養基24小時，使用TSB培養基(NEOGEN，UK)配製不同NaCl濃度，分別為0%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%及12%，加入菌液並將OD600調整至0.01，各個鹽度的處理組有四組重複，在培養 0小時、4小時、8小時、12 小時及 24 小時的時間點，測定不同鹽度條件下的OD600，並繪製生長曲線。試驗結果如圖6所示，本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株具有廣泛之鹽度耐受性，甚至可生存在NaCl濃度10%的環境中。本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株在NaCl濃度0~3%之鹽度範圍內具有較佳生長活性，當NaCl濃度上升至4~5%時，菌株的生長情形略受影響。在NaCl濃度6%及7%的處理組中，培養24小時後的OD600值減少近40%，當NaCl濃度上升至8%~10%時，本發明之菌株仍能緩慢生長。然而，在NaCl濃度11%及12%的處理組中，VQV8菌株培養4個小時後已低於檢測水平。
由於本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株於廣泛之鹽度範圍皆保有生長活性，顯示能應用於淡水魚種及海洋魚種。
實施例3：溶血性分析
將8個菌株(VQV1至VQV8)分別接種於血基瓊脂培養皿，30℃培養24小時後觀察溶血現象，分為α、β、γ三種溶血性，α溶血性的菌落呈現深綠色，又稱不完全溶血性或部分溶血性，β溶血性又稱完全溶血性，菌落呈現瓊脂的原色，即半透明的黃色，γ溶血性又稱不溶血，血基培養基不會改變，各個菌株進行三重複試驗以確保再現性。分析結果顯示，8個菌株均未改變血基培養基的顏色，因此本發明之菌株為γ溶血性，對紅血球不溶血，可安全地應用於水產養殖產業。
實施例4：抗生素敏感性分析
透過紙錠擴散試驗，分析本發明之沙福芽孢桿菌菌株對抗生素之敏感性，將MA平板上的單一菌落稀釋至MB培養液中，將菌液的OD600調整為0.5，待測的抗生素及其濃度如下：30 μg/ml萬古黴素、15 μg/ml紅黴素、30 μg/ml四環黴素、10 μg/ml鏈黴素、10 μg/ml氨苄西林、30 μg/ml卡納黴素、30 μg/ml氯黴素。將前述菌液均勻塗佈於MA瓊脂平板上，將紙錠放置於平板表面並加入對應之待測抗生素，以不含抗生素的紙錠作為對照組，進行三重複試驗。平板於30℃培養24小時後觀察試驗結果，並測量抑制圈的直徑。
試驗結果如表2所示，本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株對多種抗生素具敏感性，包含氨苄西林、紅黴素、鏈黴素、四環黴素及萬古黴素。在氯黴素的試驗組中，形成約15至18 mm的抑制圈，略低於對氯黴素具有抗性的標準，但本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株可完全抵抗卡納黴素。
[表2] 最小抑制圈直徑的標準及本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株的抗生素敏感性檢測
抗生素 濃度 最小抑制圈直徑 (mm)
敏感性 抗藥性 VQV8 菌株
(μg/ml) ≥ ＜ 平均值 ± SD
氨苄西林 10 21 16 23.3 ± 1.2
氯黴素 30 23 19 17.0 ± 1.7
紅黴素 15 22 17 25.3 ± 1.2
卡納黴素 30 17 15 0.0 ± 0.0
鏈黴素 10 15 13 15.2 ± 0.3
四環黴素 30 19 17 25.3 ± 1.2
萬古黴素 30 17 X 18.0 ± 0.0
【生物材料寄存】
TW中華民國、食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心、2022/11/10、BCRC 911158
無
〔圖1〕透過抑制圈試驗，檢測各個分離株對哈維弧菌之拮抗活性，平板右側為同一待測菌株的三組重複，平板左側以氯黴素作為正對照組，三個紙錠均含有30 μg氯黴素。 〔圖2〕本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株以接近完整的16S rRNA序列進行Neighbour-joining演化樹分析所得與各 Bacillus屬細菌間之親緣樹，下方尺規表示各位點之核苷酸取代數為2之親緣距離。 〔圖3〕本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株以gyrase B次單元( gyrB基因)的基因序列進行Neighbour-joining演化樹分析其與各 Bacillus屬細菌間之親緣樹，下方尺規表示各位點之核苷酸取代數為0.01之親緣距離。 〔圖4〕不同培養溫度下，本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株的生長曲線圖，不同英文字母顯示同一時間點的不同溫度處理組之間具有顯著差異，P ＜ 0.05。 〔圖5〕不同pH值下，本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株的生長曲線圖，不同英文字母顯示同一時間點的不同pH值處理組之間具有顯著差異，P ＜ 0.05。 〔圖6〕不同鹽度下，本發明之沙福芽孢桿菌VQV8菌株的生長曲線圖，不同英文字母顯示同一時間點的不同鹽度處理組之間具有顯著差異，P ＜ 0.05。
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Claims (10)

  1. 一種沙福芽孢桿菌菌株(Bacillus safensis)，其係寄存於台灣新竹食品工業發產研究所，寄存編號為BCRC 911158；該沙福芽孢桿菌菌株對創傷弧菌(Vibrio vulnificus)之抑制活性優於氯黴素。
  2. 如請求項1所述之沙福芽孢桿菌菌株，其中，該菌株對創傷弧菌以外的致病性弧菌(Vibrio spp.)亦展現抑制活性。
  3. 如請求項2所述之沙福芽孢桿菌菌株，其中，該致病性弧菌(Vibrio spp.)包含以下群組之至少一種：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈維弧菌(Vibrio harveyi)及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之沙福芽孢桿菌菌株，其中，該菌株之溫度耐受範圍為25℃~45℃。
  5. 如請求項1至3中任一項所述之沙福芽孢桿菌菌株，其中，該菌株之pH值耐受範圍為3~10。
  6. 如請求項1至3中任一項所述之沙福芽孢桿菌菌株，其中，該菌株之鹽度耐受範圍為NaCl濃度10%以下。
  7. 如請求項1至3中任一項所述之沙福芽孢桿菌菌株，其中，該菌株不具溶血性。
  8. 如請求項1至3中任一項所述之沙福芽孢桿菌菌株，其中，該菌株對抗生素具敏感性，該抗生素包含選自以下群組之至少一種：氨苄西林(ampicillin)、紅黴素(erythromycin)、鏈黴素(streptomycin)、四環黴素(tetracycline)及萬古黴素(vancomycin)。
  9. 一種請求項1至8中任一項所述之沙福芽孢桿菌菌株用於製備水產 養殖飼料之用途，其特徵係該水產養殖飼料用於預防或改善蝦類感染急性肝胰腺壞死病(AHPND)之存活率。
  10. 一種預防弧菌感染之蝦類飼料，其特徵係包含請求項1至8中任一項所述之沙福芽孢桿菌菌株。
TW111144455A 2022-11-21 一種沙福芽孢桿菌(Bacillus safensis)及其用途 TWI846157B (zh)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103387948B (zh) 2013-08-02 2015-03-11 国家海洋局第三海洋研究所 沙福芽孢杆菌在对虾养殖中的应用

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Saleh et al. Isolation and Characterization of Micrococcus luteus from Oreochromis niloticus in Egypt