TWI842708B - 人源抗-(聚-ga)二肽重複序列(dpr)抗體 - Google Patents
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Abstract
提供了能夠結合C9orf72聚甘胺酸-丙胺酸DPR之新穎二肽重複序列(DPR)特異性抗體(例如,人源抗體)以及其合成變異體及生物技術衍生物,以及與其相關之方法及用途。本發明之抗體可用於醫藥及診斷組成物中,該等組成物用於靶向DPR蛋白之免疫療法及診斷。
Description
本發明一般係關於基於抗體之療法及診斷方法。特別地,本發明係關於新穎人源抗體以及其片段、衍生物及生物技術變異體,其特異性結合至非習用非ATG轉譯,特別是在染色體9開放閱讀框72(C9orf72)中發現之形成聚甘胺酸-丙胺酸(聚-GA)二肽重複序列(DPR)之六核苷酸重複序列,及包含此等DPR之抗原,該等抗體適用於治療及診斷分別由經聚集DPR及含有DPR之蛋白質誘導之疾病及病症。此外,本發明係關於包含該抗體及其變異體及其衍生物之醫藥及診斷組成物,其價值在於既可用作鑒別與DPR或其聚集物相關之疾病之診斷工具,亦可用作治療此類疾病之被動疫苗接種策略,該等疾病例如額顳葉變性(FTLD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、FTLD-ALS及脊髓小腦性失調症36型。
額顳葉變性(FTLD)屬於一組在臨床上、病理上及遺傳上完全不同的與大腦額葉及顳葉萎縮有關之疾病。該疾病為癡呆早發之第二大常見原因。認知症狀可變且包括癡呆、行為以及人格之變化、語言功能障礙及/或精神病,該等症狀由額葉及顳葉皮層之退化所導致。由於其症狀,FTLD可分為三組:(i)行為變異額顳葉癡呆(bvFTLD)、(ii)語義性癡呆(SD)、或(iii)進行性非流利性失語症(PNFA)。FTLD患者在症狀出現後5-10年死亡,因為無合適療法可用。然而,50% FTLD患者顯示具有陽性家族史,且與肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)相比似乎呈現疾病連續性,具有共同潛在發病機理。雖然兩種體染色體顯性病症均顯示在遺傳上及病理上完全不同,參見,例如, Vance等人, Brain 129 (2006), 868-876,但遺傳分析將位於C9orf72基因之非編碼外顯子1a及1b之間的經雜合擴增之六核苷酸重複序列(GGGGCC)鑒定為FTLD及ALS之最常見遺傳原因;參見例如DeJesus-Hernandez等人, Neuron 72 (2011), 245-256及Renton等人, Neuron 72 (2011), 257-268。特別地,已顯示在三個備選閱讀框中之有義轉錄物,亦即經擴增之六核苷酸重複序列之非習用非ATG轉譯導致三種不同多肽之產生、生成及聚集,各多肽由兩個胺基酸之重複單元(二肽重複,DPR)組成,亦即聚-(Gly-Ala;GA)、聚-(Gly-Pro;GP)及聚-(Gly-Arg;GR)。此外,對應反義轉錄物之轉譯導致聚-(Pro-Arg;PR)、聚-(Pro-Ala;PA)及聚-(Gly-Pro;GP)之產生。已顯示此等C9orf72-二肽重複(DPR)擴增為多達30% FTLD患者之、50% ALS患者及80% FTLD-ALS患者之原因,且在美國及歐盟高加索人群中觀察到最高突變頻率。此外,與患有其它形式之FTLD及/或ALS的患者相比,患有具有超過19個重複序列之C9orf72-DPR擴增之患者發病年齡較低,神經系統疾病發生率增加,且傾向於患精神病或幻覺;參見,例如, Harms等人, Neurobiol. Aging 34 (2013), e13-e19。
用於與二肽重複(DPR)擴增相關之疾病及/或病症之治療,例如減緩疾病進展之藥物為缺少的。迄今為止,醫療照護之主要焦點在於提供用於治療通常非常緊迫之伴隨症狀之藥物。
近期最突出之治療性靶向ALS、FTLD及其它神經退行性疾病之C9orf72之病理擴增之方法集中於反義寡核苷酸/RNA干擾(RNAi)策略及基因治療,該干擾策略藉由自重複序列轉譯二肽重複蛋白(DPR),或藉由自C9orf72擴增隱蔽RNA結合蛋白,使用小化合物來抵消由重複轉錄(焦點)所產生之RNA直接施加之毒性作用來進行,,該基因治療不僅用於使毒性RNA/蛋白質沉默,而且亦用於挽救由C9orf72編碼序列之轉錄減少或由RNA焦點隱蔽之RNA結合蛋白之可用性降低所造成之單倍體不足;關於綜述,參見,例如Misc. 等人, Mol. Neurobiol. 54 (2017), 4466-4476。
雖然考慮在具有C9orf72之六核苷酸重複擴增之患者腦中之DPR蛋白之抗體靶向可能為吸引人的,但迄今為止,似乎此方法尚未得到適當考慮或可能受到所採用之實際方法影響。例如,Edbauer等人之小組描述藉由用經聚集(GA)
10肽(SEQ ID NO:72)使小鼠免疫來產生針對由序列(Gly-Ala)之二肽重複序列組成之寡肽之抗體,其顯示結合至含有GA-DPR(GA)
15(SEQ ID NO:66)之GST-融合蛋白;參見國際申請案WO 2014/114660。已顯示稱為GA-5F2之彼等抗體中之一者在活體外共培養檢定及細胞萃取物中抑制C9orf72聚-GA二肽重複蛋白之傳遞及聚集;參見Zhou等人, EMBO Molecular Medicine 9 (2017), 687-702。
然而,除了小鼠單株抗體由於單株抗體針對人工抗原產生之事實而易於在人體內引發人抗小鼠抗體(HAMA)反應之缺點外,尚不清楚DPR-GA
15之結合是否轉化為針對來自存在於患有ALS、FTLD及其它神經變性疾病之患者腦中之C9orf72基因之DPR蛋白之對應特異性及親和力。
事實上,似乎學術界及工業界仍集中於C9orf72 ALS/FTLD之RNA靶向治療策略;參見,例如Simone等人, EMBO Molecular Medicine 10 (2018), 22-31之最新出版物及Schludi & Edbauer, EMBO Molecular Medicine 10 (2018), 4-6之評論,其報道了在表現GGGGCC重複序列之果蠅中靶向RNA G-四倍組合在活體外及活體內改善C9orf72 ALS/FTLD 病理學之有希望的結果。
然而,基於RNA之治療劑、小有機化合物及基因療法具有若干缺點,例如RNA之固有不穩定性、化合物之潛在免疫原性特性及需要遞送媒介物以有效轉運至靶細胞以及關於基因療法之應用的倫理問題仍存在。
因此,仍需要開發治療性靶向C9orf72之病理性擴增之新藥物,以用於治療ALS、FTLD及其它神經退行性疾病,該等藥物特異性針對由C9orf72基因之表現產物引起之疾病及病症,且視情況地屬於經過充分研究之一類藥物,且在人類中可耐受。
該技術問題藉由在申請專利範圍中表徵並在下文中進一步描述且在實例及附圖中說明之實施例解決。
本發明提供能夠結合由聚甘胺酸-丙胺酸(Gly-Ala;GA)重複序列組成之二肽重複序列(DPR)及含有DPR之蛋白質(DPR蛋白質)之人源單株抗體,以及等效DPR蛋白質結合分子,諸如本文例示之抗體之DPR結合片段、合成變異體及生物技術衍生物,其特別適用於預防性或治療性治療與DPR蛋白及其聚集形式相關之疾病及病症。
最近,已經描述了一類人源抗DPR抗體,該抗體對於在C9orf72-ALS及FTLD患者之治療中開發基於抗體之治療干預具有很大希望;參見國際申請案WO 2016/050822,其揭露內容以引用之方式併入本文。如其中所述,抗DPR蛋白抗體及其編碼可變區之cDNA已經分別自無神經系統及神經退行性疾病之症狀之患者中分離出來;參見WO 2016/050822之第3頁及其中之實例。在根據本發明進行之進一步實驗中,可鑒定且選殖抗聚-GA DPR抗體,其經命名為NI-308.5J10,且在下文中亦稱為「主題抗體」,該抗體可以顯示具有獨特結合特徵,如在不同結合檢定中且特別是在源自經選定人C9orf72-FTLD患者之腦組織中所判定;參見實例11及圖10。此外,如實例9及圖8所示,藉由參考抗聚-GA抗體(NI-mAb參考)與靶標之預先結合不會阻斷主題抗體與經聚集C9orf72聚-GA DPR(GA)
15(SEQ ID NO:66)之結合,而藉由主題NI-308.5J10抗體與靶標之預先結合消除了參考抗聚-GA抗體與C9orf72 DPR肽之結合。
因此,儘管主題NI-308.5J10抗體及參考抗聚-GA抗體已予以選擇且識別C9orf72聚-GA DPR蛋白或其聚集形式,但是主題抗體令人驚訝地似乎識別聚-GA肽上之其它構形抗原決定基。該特性使得抗體特別適合於在攜帶C9orf72六核苷酸重複擴增之患者中靶向C9orf72 DPR蛋白,因為聚-GA DPR蛋白聚集物通常與其它DPR蛋白及/或不相關之聚集蛋白諸如p62及hnRNP A3共聚集(Mori等人, Acta Neuropathol. 126 (2013), 881-893; Mann等人, Acta Neuropathologica. Communications (2013), 1:68. doi:10.1186/2051-5960-1-68; Davidson等人, Acta Neuropathologica Communications (2017); 5:31. doi:10.1186/s40478-017-0437-5)。
此外,在本發明範圍內進行之進一步實驗表明,CDR及框架區中易於脫醯胺或糖基化之胺基酸可經取代而不喪失主題抗體之必需結合特徵;參見實例12至15及圖11。
因此,本發明亦提供了原始人源抗DPR抗體之變異體及衍生物,其在CDR及/或框架區內含有一或多個胺基酸取代,該胺基酸取代允許改善抗體之可製造性,同時抗體之結合特徵及穩定性以同樣的方式保持不受影響或甚至得到改善;見實例15及16。此外,由於CDR及/或可變區中之僅微小修飾,預期原始NI-308.5J10抗體之主題變異體及衍生物在人類中基本上亦為非免疫原性的。
總之,本申請案揭示之本發明提供了人源抗聚GA抗體及其變異體及衍生物,其具有使其特別適用於在人腦中靶向C9orf72 DPR蛋白或其聚集形式之性質且因此適用於C9orf72 ALS/FTLD患者之免疫療法。
因此,本發明一般係關於以下實施例:
[1] 一種能夠結合自染色體9開放閱讀框72( C9orf72)基因轉譯之具有至少6個重複(GA)
6(SEQ ID NO:80)之聚甘胺酸-丙胺酸(GA)之二肽重複(DPR)之抗體或其DPR結合片段,其中該抗體或其DPR結合片段在其可變區中包含以下六個互補決定區(CDR):
(a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3(例如,包含SEQ ID NO:78)之VH-CDR1或其變異體,其中該變異體包含一或兩個胺基酸取代,
(b) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:4之VH-CDR2或其變異體,其中該變異體包含一或兩個胺基酸取代,
(c) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:5之VH-CDR3或其變異體,其中該變異體包含一或兩個胺基酸取代,
(d) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:8之VL-CDR1或其變異體,其中該變異體包含一或兩個胺基酸取代,
(e) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:9之VL-CDR2或其變異體,其中該變異體包含一或兩個胺基酸取代,
(f) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:10之VL-CDR3或其變異體,其中該變異體包含一或兩個胺基酸取代,
視情況其中該抗體為人源抗體,視情況其中該抗體為單株抗體,視情況其中該抗體為人源單株抗體。
[2] [1]之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含
(a) 包含SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列之可變重鏈(V
H)或其變異體,其中該變異體包含一或多個胺基酸取代;及
(b) 包含SEQ ID NO:7所示之胺基酸序列之可變輕鏈(V
L)或其變異體,其中該變異體包含一或多個胺基酸取代;視情況其中
V
H及V
L鏈胺基酸序列分別與SEQ ID NO:2及7至少90%相同。
[3] [1]或[2]之抗體或其DPR結合片段,其中
(a) CDR不含有易脫醯胺之天冬醯胺(N)及/或麩醯胺(Q);且/或
(b) V
H及/或V
L鏈胺基酸序列不含有佔據之糖基化位點。
[4] [1]至[3]中任一項之抗體或其DPR結合片段,其中該一、兩或更多個胺基酸取代係選自
(a) 用非易脫醯胺之胺基酸取代易脫醯胺之天冬醯胺(N)或麩醯胺(Q);
(b) 用較大胺基酸取代與易脫醯胺之N或Q直接相鄰之較小可撓性胺基酸,視情況其中相鄰胺基酸為甘胺酸(G);
(c) 至少一個胺基酸之導致糖基化位點移除之取代,視情況其中該至少一個胺基酸位於糖基化基序NXS或NXT內;及/或
(d) 一或多個胺基酸之取代,其為保守性胺基酸取代。
[5] [4]之抗體或其DPR結合片段,其中(a)及(b)之胺基酸取代存在於VH-CDR2中,且(c)之胺基酸取代存在於V
L鏈中。
[6] [5]之抗體或其DPR結合片段,其中
(i) 在VH-CDR2中,對應於SEQ ID NO:2之54位之天冬醯胺(N)及/或對應於55位之甘胺酸(G)經另一種胺基酸取代,視情況其中天冬醯胺(N)經絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)取代且/或其中甘胺酸(G)經絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)取代;及/或
(ii) 在V
L鏈中,對應於SEQ ID NO:
7之75位之天冬醯胺(N)經另一種胺基酸取代,視情況其中天冬醯胺(N)經天冬胺酸(D)取代。
[7] [1]至[6]中任一項之抗體或其DPR結合片段,其中該抗體或DPR結合片段對於聚-(GA)
8肽(SEQ ID NO:81)所具有之結合親和力對應於小於30 nM之K
D(解離常數),其中K
a(結合速率)小於5 x 10
5M
-1s
-1且K
d(解離速率)小於10 x 10
-3s
-1,如藉由表面電漿共振(SPR)所測定,視情況其中該DPR結合片段所具有之結合親和力對應於10 nM至30 nM之K
D(解離常數),其中K
a(結合速率)為1至5 x 10
5M
-1s
-1且K
d(解離速率)為2.5至10×10
-3s
-1,如藉由表面電漿共振(SPR)所測定。
[8] [1]至[7]中任一項之抗體或其DPR結合片段,其中其Fab片段具有分別在78-82℃範圍內,例如在約79-81℃範圍內之熱穩定性及解構溫度T
m,如藉由差示掃描量熱法(VP-DSC)測定。
[9] [1]至[8]中任一項之抗體或其DPR結合片段,其在可變區中包含
(i) 以下六個CDR:
(a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3(例如,包含SEQ ID NO:78)之VH-CDR1,
(b) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:13之VH-CDR2,
(c) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:5之VH-CDR3,
(d) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:8之VL-CDR1,
(e) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:9之VL-CDR2,
(f) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:10之VL-CDR3;
(ii) 以下六個CDR:
(a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3(例如,包含SEQ ID NO:78)之VH-CDR1),
(b) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:14之VH-CDR2,
(c) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:5之VH-CDR3,
(d) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:8之VL-CDR1,
(e) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:9之VL-CDR2,
(f) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:10之VL-CDR3;
(iii) 以下六個CDR:
(a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3(例如,包含SEQ ID NO:78)之VH-CDR1,
(b) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:19之VH-CDR2,
(c) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:5之VH-CDR3,
(d) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:8之VL-CDR1,
(e) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:9之VL-CDR2,
(f) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:10之VL-CDR3;
(iv) 以下六個CDR:
(a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3(例如,包含SEQ ID NO:78)之VH-CDR1,
(b) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:22之VH-CDR2,
(c) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:5之VH-CDR3,
(d) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:8之VL-CDR1,
(e) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:9之VL-CDR2,
(f) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:10之VL-CDR3;或
(v) 以下六個CDR:
(a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3(例如,包含SEQ ID NO:78)之VH-CDR1,
(b) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:4之VH-CDR2,
(c) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:5之VH-CDR3,
(d) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:8之VL-CDR1,
(e) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:9之VL-CDR2,
(f) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:10之VL-CDR3。
[9a] [1]至[8]中任一項之抗體或其DPR結合片段,其在其可變區中包含以下六個CDR:
(a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3(例如,包含SEQ ID NO:78)之VH-CDR1,
(b) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:13之VH-CDR2,
(c) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:5之VH-CDR3,
(d) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:8之VL-CDR1,
(e) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:9之VL-CDR2,及
(f) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:10之VL-CDR3。
[10] [1]至[9a]中任一項之抗體或其DPR結合片段,其在其可變區中包含
(i) 如SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:24所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
(ii) 如SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:24所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
(iii) 如SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:24所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
(iv) 如SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:24所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
(v) 如SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:24所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
(vi) 如SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:7所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
(vii) 如SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:7所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
(viii) 如SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:7所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
(ix) 如SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:7所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;或
(x) 如SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:7所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
[10a] [1]至[10]中任一項之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含V
H鏈,該V
H鏈包含與胺基酸序列SEQ ID NO:12至少90%相同之胺基酸序列。
[10b] [1]至[10a]中任一項之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含V
L鏈,該V
L鏈包含與胺基酸序列SEQ ID NO:24至少90%相同之胺基酸序列。
[10c] [1]至[10b]中任一項之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含V
H鏈,該V
H鏈包含與胺基酸序列SEQ ID NO:12至少95%相同之胺基酸序列。
[10d] [1]至[10c]中任一項之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含V
L鏈,該V
L鏈包含與胺基酸序列SEQ ID NO:24至少95%相同之胺基酸序列。
[10e] [1]至[10d]中任一項之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含V
H鏈,該V
H鏈包含與胺基酸序列SEQ ID NO:12至少99%相同之胺基酸序列。
[10f] [1]至[10e]中任一項之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含V
L鏈,該V
L鏈包含與胺基酸序列SEQ ID NO:24至少99%相同之胺基酸序列。
[10g] [1]至[10f]中任一項之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含V
H鏈,該V
H鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:12之變異體,該變異體相對於胺基酸序列SEQ ID NO:12具有1、2或3個添加、取代或缺失。
[10h] [1]至[10g]中任一項之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含V
L鏈,該V
L鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:24之變異體,該變異體相對於胺基酸序列SEQ ID NO:24具有1、2或3個添加、取代或缺失。
[10i] [1]至[10h]中任一項之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含V
H鏈,該V
H鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:12。
[10j] [1]至[10i]中任一項之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含V
L鏈,該V
L鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:24。
[11] [1]至[10j]中任一項之抗體或其DPR結合片段,其進一步包含異源多肽序列,該異源多肽序列視情況與CDR或V
H及V
L鏈胺基酸序列異源,視情況其中該異源多肽序列包含人恆定域,視情況為IgG類型,視情況為IgG1類別或同型。
[11a] [11]之抗體或其DPR結合片段,其中該異源多肽序列與CDR為異源的。
[11b] [11]之抗體或其DPR結合片段,其中該異源多肽序列與V
H及V
L為異源的。
[11c] [11]至[11b]中任一項之抗體或其DPR結合片段,其中該異源多肽序列為輕鏈恆定域,視情況為κ型。
[11d] [11]至[11b]中任一項之抗體或其DPR結合片段,其中該異源多肽序列為異源哺乳動物分泌信號肽。
[12] [1]至[11d]中任一項之抗體或其DPR結合片段,其視情況僅在重複數n≥6時與聚-GA肽結合。
[13] [1]至[12]中任一項之抗體或其DPR結合片段,其中該抗體識別聚-(GA)
15肽(SEQ ID NO:66)上之線性及構形抗原決定基。
[14] [1]至[13]中任一項之抗體或其DPR結合片段,其中該抗體以約(0.05-0.5 nM,視情況0.1-0.2 nM)之親和力K
D結合至聚-(GA)
15肽(SEQ ID NO:66),其中結合速率常數為(K
a= 0.5-5 x 10
5M
-1s
-1)且解離常數為(K
d= 1-5×10
-5s
-1),如藉由生物層干涉術測定。
[15] [1]至[14]中任一項之抗體或其DPR結合片段,其中該抗體以與對應疏水性塗佈肽基本相同之親和力結合至與BSA載體蛋白偶聯之聚-GA肽。
[16] [1]至[15]中任一項之抗體或其DPR結合片段,其與不相關之致澱粉樣蛋白基本上無交叉反應性或具有最小交叉反應性。
[17] [1]至[16]中任一項之抗體或其DPR結合片段,其中該抗體能夠結合C9orf72-FTLD患者小腦之顆粒細胞層中自C9orf72基因轉譯之含DPR蛋白質或其聚集形式。
[18] [1]至[17]中任一項之抗體或其DPR結合片段,若向基因轉殖C9orf72小鼠模型投與該抗體或片段,則其能夠改善C9orf72疾病之病理學標誌之至少一種症狀,例如神經元缺失、行為異常、運動缺陷及生存率下降。
[19] [1]至[18]中任一項之抗體,其係選自由單鏈Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段及F(ab')
2片段組成之群。
[20] [1]至[19]中任一項之抗體,其為嵌合鼠-人抗體或鼠源化抗體。
[21] 一或多種編碼[1]至[20]中任一項之抗體或其DPR結合片段或其免疫球蛋白V
H或V
L鏈之多核苷酸,視情況其中該多核苷酸為cDNA及/或可操作地連接至異源核酸。
[21a] 一種編碼[1]至[20]中任一項之抗體或其DPR結合片段之V
H鏈之多核苷酸,其中當與包含胺基酸序列SEQ ID NO:24之V
L鏈配對時,V
H鏈結合至自C9orf72基因轉譯之具有至少6個重複序列之聚-GA之DPR或其DPR結合片段,視情況其中該多核苷酸為cDNA及/或可操作地連接至異源核酸。
[21b] 一種編碼[1]至[20]中任一項之抗體或其DPR結合片段之V
L鏈之多核苷酸,其中當與包含胺基酸序列SEQ ID NO:12之V
H鏈配對時,V
L鏈結合至自C9orf72基因轉譯之具有至少6個重複序列之聚-GA之DPR或其DPR結合片段,視情況其中該多核苷酸為cDNA及/或可操作地連接至異源核酸。
[21c] [21]至[21b]中任一項之多核苷酸,其中該異源核酸為調節元件。
[21d] [21]至[21b]中任一項之多核苷酸,其中異源核酸為啟動子、增強子、核糖體結合位點或轉錄終止子,視情況其中該啟動子為細胞巨大病毒即刻早期啟動子。
[21e] [21]至[21b]中任一項之多核苷酸,其中該異源核酸編碼分泌信號肽,視情況其中該分泌信號肽為哺乳動物信號肽。
[22] 一或多種載體,其包含[21]至[21e]中任一項之多核苷酸。
[23] 一種宿主細胞,其包含[21]至[21e]中任一項之多核苷酸或[22]之載體。
[24] [21]至[21e]中任一項之多核苷酸、[22]之載體或[30]之宿主細胞用於產生抗DPR抗體之用途。
[25] 一種用於製備抗DPR抗體或其免疫球蛋白鏈之方法,該方法包含:
(a) 培養[23]之細胞;及
(b) 自培養物中分離該抗體或其免疫球蛋白鏈。
[26] 一種抗體或其DPR結合片段或免疫球蛋白鏈,其由[21]至[21e]中任一項之多核苷酸編碼或者可藉由[25]之方法或[24]之用途獲得。
[27] [1]至[20]或[26]中任一項之抗體或其DPR結合片段,其為
(i) 偵測用選自由酶、放射性同位素、螢光團、標誌、旗標及重金屬組成之群之標籤可偵測地標記;或
(ii) 連接至藥物。
[28] 一種組成物,其包含[1]至[20]、[26]或[27]中任一項之抗體或其DPR結合片段、[21]至[21e]中任一項之多核苷酸、[22]之載體或[23]之細胞。
[29] [28]之組成物,其係醫藥組成物且進一步包含醫藥學上可接受之載劑,視情況其中該組成物為疫苗。
[30] 一種製備醫藥組成物之方法,該醫藥組成物用於治療與含有DPR之蛋白質或其聚集形式相關或由其引起之病症,該方法包含:
(a) 培養[23]之細胞;
(b) 將來自培養物之抗體或其免疫球蛋白鏈純化至藥用級;及
(c) 將其抗體與醫藥學上可接受之載劑混合
[31] [28]之組成物,其係診斷組成物或套組,視情況進一步包含習用地用於基於免疫之診斷方法之試劑。
[32] [1]至[20]、[26]或[27]中任一項之抗體或其DPR結合片段、[21]之多核苷酸、[22]之載體或[23]之細胞用於預防性治療與含有DPR之蛋白質或其聚集形式相關或由其引起之疾病。
[32a] [1]至[20]、[26]或[27]中任一項之抗體或其DPR結合片段、[21]之多核苷酸、[22]之載體或[23]之細胞用於治療性治療與含有DPR之蛋白質或其聚集形式相關或由其引起之疾病。
[32b] [1]至[20]、[26]或[27]中任一項之抗體或其DPR結合片段、[21]之多核苷酸、[22]之載體或[23]之細胞用於預防性及治療性治療與含有DPR之蛋白質或其聚集物形式相關或由其引起之疾病。
[33] 用於根據[32]至[32b]中任一項之用途之抗體或其DPR結合片段、多核苷酸、載體或細胞,其中該疾病係選自由額顳葉變性(FTLD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)及FTLD-ALS組成之群。
[34] 用於根據[32]至[32b]及[33]中任一項之用途之抗體或其DPR結合片段、多核苷酸、載體或細胞,其中該抗體在向基因轉殖C9orf72小鼠模型投與時能夠改善C9orf72疾病之病理學標誌之至少一種症狀,例如神經元缺失、行為異常、運動缺陷及存活率降低。
[35] [1]至[20]、[26]或[27]中任一項之抗體或其DPR結合片段,用於在人或動物體內活體內偵測聚-GA DPR蛋白質例如經聚集聚-GA DPR蛋白質或向該蛋白質靶向輸送治療劑及/或診斷劑。
[36] 用於根據[35]之用途之抗體或其DPR結合片段,其中該活體內造影包含正電子發射斷層攝影術(PET)、單光子發射斷層攝影術(SPECT)、近紅外(NIR)、光學造影或磁共振造影(MRI)。
此外,本文提供了DPR Ab-1抗體或其片段。此外,本文提供了抗DPR抗體或其片段,其包含表12中所述之互補決定區(CDR)、重鏈序列、輕鏈序列、可變域序列及/或恆定域序列。在實施例中,抗DPR抗體或其片段包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:38之重鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO:42之輕鏈。
本文亦提供了核酸分子,其包含:
(i) 編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO:38之抗DPR抗體重鏈之核酸序列;及/或
(ii) 編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO:42之抗DPR抗體之輕鏈之核酸序列,視情況其中核酸序列(i)及(ii)設置於同一核酸分子上或單獨核酸分子上,
視情況地其中核酸分子包含cDNA及/或可操作地連接至異源核酸。
本文亦提供了包含核苷酸序列SEQ ID NO:51-58中之一或多者之核酸分子。
本文亦提供了一種載體,其包含本文所述核酸分子。
本文亦提供了一種宿主細胞,其包含(i)本文所述之核酸分子或(ii)本文所述之載體。
在一些態樣,本文提供了本文所述之核酸分子、載體或宿主細胞用於產生抗DPR抗體或其片段之用途。
在一些態樣,本文提供了一種產生抗DPR抗體或其片段之方法,其包含:(i)培養本文所述之宿主細胞;(ii)自培養物中分離抗體或其片段。
本文亦提供了一種組成物,例如醫藥組成物,其包含本文所述之抗DPR抗體或其片段、本文所述之核酸分子、本文所述之載體或本文所述之宿主細胞。在實施例中,醫藥組成物包含醫藥學上可接受之載劑。在實施例中,組成物為診斷組成物或套組,例如,進一步包含習用地用於基於免疫之診斷方法之試劑。
亦提供了一種治療有此需要之受試者中與含有DPR之蛋白質聚集物,例如含有C9ORF72 DPR之蛋白質聚集物相關或由其引起之病症(例如,肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、額顳葉變性(FTLD)或FTLD-ALS)之方法,該方法包含向該受試者投與本文所述之抗DPR抗體或其片段(例如,DPR Ab-1,例如,含有表12中所示之胺基酸序列),從而治療受試者中之病症(例如,ALS、FTLD或FTLD-ALS)。
亦提供了一種製備醫藥組成物之方法,該醫藥組成物用於治療與含有DPR之蛋白質或其聚集形式相關或由其引起之病症(例如,ALS、FTLD或FTLD-ALS),該方法包含:(i)培養本文所述之宿主細胞;(ii)自培養物中分離及/或純化抗體或其片段至藥用級;及(iii)將抗體或其片段與醫藥學上可接受之載劑混合。
本文提供了本文所述之抗DPR抗體或其片段(例如,DPR Ab-1,例如,含有表12中所示之胺基酸序列)、本文所述之核酸分子、本文所述之載體或本文所述之宿主細胞用於治療(例如,預防性及/或治療性治療)與含有DPR之蛋白質或其聚集形式相關或由其引起之病症(例如,ALS、FTLD或FTLD-ALS)。
本文提供了本文所述之抗DPR抗體或其片段(例如,DPR Ab-1,例如,含有表12中所示之胺基酸序列)、本文所述之核酸分子、本文所述之載體或本文所述之宿主細胞用於製備用以治療(例如,預防性及/或治療性地)與含有DPR之蛋白質或其聚集形式相關或由其引起之病症之藥物(例如,ALS、FTLD或FTLD-ALS)的用途。
根據以下描述及實例,本發明之其它實施例將係顯而易見的。
相關申請案之交叉引用
本申請案要求2018年4月27日提交之歐洲專利申請案第18169888.7號及2018年11月29日提交之美國臨時申請案第62/772,809號之優先權。兩個申請案之內容均以引用之方式整體併入本文。
序列表
本申請案含有序列表,該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且由此以引用之方式整體倂入。該ASCII複本於2019年4月24日創建,名為13751-0309WO1_SL.txt且大小為102,178位元組。
本發明一般係關於用於偵測與二肽重複(DPR)蛋白質及特別是其聚集形式之存在相關之疾病及病症之免疫療法及非侵入性方法。更具體地,本發明係關於重組人源單株抗體及其DPR結合片段,該抗體及片段基於自經選定人供體群體獲得之序列資訊而產生且能夠結合至此等DPR,特別是聚甘胺酸-丙胺酸(Gly-Ala;GA)-DPR及含有此等DPR之蛋白質。本發明之重組人源單株抗體以及其合成及生物技術衍生物之特徵有利地在於特異性結合至具有形成C9orf72-二肽重複序列(DPR)之經擴增六核苷酸重複序列之經改變C9orf72。如實例中所示,本發明之重組抗體作為用於偵測DPR及/或病理性C9orf72之診斷試劑具有高度特異性,而不會產生假陽性,且由於分別編碼至少可變區及CDR之序列之人來源及原始抗體在人體中之成熟,可以合理地預期作為治療劑為有效及安全的。
I. 定義
除非另有說明,否則本文使用之術語給出在the Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, 2000年修訂且2003年重印, ISBN 0 19 850673 2中提供之定義。此外,除非另有說明,否則本文中用於表徵本發明之術語及表述給出了在WO 2016/050822 A2中提供之定義,特別是在第26至53頁之小節「I.定義」中,包括第39及40頁之表1中之CDR定義,其揭露內容以引用之方式明確地併入本文。這同樣適用於WO 2016/050822 A2中揭示之關於抗體、多核苷酸等之一般實施例。
應注意,術語「一(個/種)」實體係指一或多個(種)該實體;例如,「一個抗體」應理解為表示一或多個抗體。因此,術語「一個(種)」、「一或多個(種)」及「至少一個(種)」在本文中可互換使用。
若未另外特別指出,則術語「DPR」,亦即「二肽重複」蛋白,在本文中用於具體指兩個胺基酸之重複單元,特別是由於基因中經擴增六核苷酸重複。術語「DPR」亦用於統指所有類型及形式之DPR,例如GA、GR、GP、PA、PR等。在下文中,本發明將主要針對特異性識別DPR之抗體來描述,該等DPR包含以下各者或由以下各者組成:GA,例如(GA)n(其中n為1、2、3、4、5、6或更大(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更大),例如,其中n在6與15之間,包括6及15,例如,其中n為15),例如具有15個重複序列(GA
15)(SEQ ID NO:66),GP,例如具有15個重複序列(GP
15)(SEQ ID NO:67),GR,例如具有15個重複序列(GR
15)(SEQ ID NO:68),或PR,例如具有15個重複序列(PR
15)(SEQ ID NO:70)或PA,例如具有15個重複序列(PA
15)(SEQ ID NO:69),該等DPR通常在患有FLTD或ALS之患者腦組織中發現之C9ORF72-DPR蛋白中觀察到。在實施例中,本文所述之抗DPR抗體特異性結合至包含GA重複之DPR。儘管抗-C9ORF72-DPR抗體代表較佳實施例,但本發明一般提供抗DPR蛋白抗體及對應實施例。因此,需要強調,除非僅特別適用於抗-C9ORF72-DPR,否則原則上本文揭示且在實例及附圖中所示之任何實施例及對應特徵一般亦適用於任何抗DPR蛋白抗體。
DPR相關疾病之另一個實例為脊髓小腦性失調症36型、緩慢進展性神經退行性疾病及體染色體顯性小腦性失調症1型(ADCA 1型)之亞型,其特徵在於成人發作之步態及肢體失調症、下肢痙攣、發音不良、肌肉震顫、舌頭萎縮及反射增強。一些患病個體亦可能出現聽力損失;參見,例如, Garcia-Murias等人, Brain 135 (2012), 1423-1435。已顯示脊髓小腦性失調症36型係由染色體20p13上NOP56基因之內含子GGCCTG六核苷酸重複之雜合擴增引起的;參見,例如, Garcia-Murias等人, Brain 135 (2012), 1423-1435. Ikeda等人, Neurology 79 (2012), 333-341, Kobayashi等人, Am. J. Hum. Genet. 89 (2011), 121-130。
若未另外特別指出,術語「C9ORF72」係指染色體9開放閱讀框72(C9ORF72)之經改變形式。術語「C9ORF72」亦通常用於識別C9ORF72六核苷酸擴增,該等擴增產生C9ORF72-二肽重複(DPR)。因此,該術語亦用於表示C9ORF72-DPR。術語「C9ORF72」亦用於統指C9ORF72之所有類型及形式,例如經突變C9ORF72。在術語C9ORF72前面添加之字母用於表示特定異種同源物所來源之生物體,例如,人C9ORF72之hC9ORF72或鼠類來源之mC9ORF72。
本文揭示之抗DPR抗體視情況結合C9ORF72-二肽重複序列(DPR)及其抗原決定基。例如,本文揭示了特異性結合經病理改變之C9ORF72種類或其片段之抗體,亦即自經擴增內含子C9ORF72六核苷酸重複序列之C9ORF72轉錄物非習用轉譯之二肽重複序列,以及C9ORF72-DPR之聚集形式或其片段。本文使用術語(病理學上) 經聚集C9ORF72-DPR/其聚集物來具體係指上述形式。如本文所用之術語(病理學)「聚集形式」或「聚集物」描述了由於經擴增內含子C9ORF72六核苷酸重複序列之C9ORF72轉錄物之C9ORF72錯誤/病理轉譯導致之積累或群集形成之產物。此等聚集物、積累物或群集形式可以為C9ORF72-DPR蛋白及/或其片段、基本上由其組成或由其組成。如本文所用,提及「特異性結合」、「選擇性結合」或「優先結合」C9ORF72-DPR之抗體係指不結合其它不相關蛋白之抗體。本發明之抗體基本上不識別選自由以下項組成之群之不相關澱粉樣蛋白形成蛋白:成對螺旋長絲(PHF)-τ、TAU、轉移活性反應性DNA結合蛋白43(TDP-43)、轉甲狀腺素(TTR)、全長澱粉樣蛋白前體蛋白(flAPP)及/或亨廷頓蛋白(HTT)。
在一個實例中,本文揭示之C9ORF72-DPR抗體可以結合DPR及/或C9ORF72-DPR或其抗原決定基,且對於其它蛋白質不顯示高於約2倍背景之結合。「特異性結合」或「選擇性結合」DPR及/或C9ORF72-DPR蛋白變異體之抗體係指不結合C9ORF72-DPR蛋白之所有變異體之抗體,亦即不結合至少一種其它C9ORF72構形異構物之抗體。例如,本文揭示了可以在活體外及在組織中優先結合至顯示形成DPR之經擴增六核苷酸重複序列之C9ORF72形式之抗體,該等組織獲自患有與C9ORF72相關之疾病或處於患上與C9ORF72相關之疾病之風險之患者。
術語「肽」應理解為在其含義內包括術語「多肽」及「蛋白質」(有時,在本文中可互換使用)。類似地,亦考慮了蛋白質及多肽之片段,且在本文中可稱為「肽」。然而,術語「肽」視情況地表示包括至少5個連續胺基酸,例如至少10個連續胺基酸,例如至少15個連續胺基酸,例如至少20個連續胺基酸,例如至少25個連續胺基酸之胺基酸聚合物。此外,根據本發明之肽通常具有不超過100個連續胺基酸,例如,少於80個連續胺基酸或少於50個連續胺基酸。
如本文所用,術語「多肽」意欲涵蓋單個「多肽」以及複數個「多肽」,且係指由藉由醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性連接之單體(胺基酸)構成之分子。術語「多肽」係指具有兩個或超過兩個胺基酸之任何一或多條鏈,且不係指特定長度的產物。因此,「肽」、「二肽」、「三肽」、「寡肽」、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或用以指具有兩個或兩個以上胺基酸之一或多條鏈之任何其它術語包括在「多肽」之定義內,且可使用術語「多肽」替代任何此等術語或可與任何此等術語互換使用。
術語「多肽」亦意欲指代多肽之表現後修飾之產物,其包括但不限於醣化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護基/阻隔基之衍生化、蛋白水解裂解或藉由非天然存在胺基酸之修飾。多肽可源於天然生物來源或藉由重組技術產生,但未必自指定核酸序列轉譯。其可以任何方式產生,包括藉由化學合成。
本發明之多肽可具有約3或更多、5或更多、10或更多、20或更多、25或更多、50或更多、75或更多、100或更多、200或更多、500或更多、1,000或更多、或2,000或更多胺基酸之大小。多肽可具有經限定之三維結構,但它們不一定具有此結構。具有經限定三維結構之多肽稱為折疊的,且不具有經限定之三維結構之多肽反而可以採用大量不同之構形,且稱為未折疊的。如本文所用,術語糖蛋白係指與至少一個碳水化合物部分偶聯之蛋白質,該碳水化合物部分經由胺基酸殘基(例如絲胺酸殘基或天冬醯胺殘基)之含氧或含氮側鏈連接至蛋白質。
「經分離」多肽或其片段、變異體或衍生物係指不在其天然環境中之多肽。不要求特定純化程度。例如,經分離多肽可自其原生或天然環境移除。出於本發明之目的,在宿主細胞中表現之重組產生之多肽及蛋白質被視為經分離,已藉由任何適合技術分離、部分分離、或部分或實質上純化之天然或重組多肽亦視為經分離。
「重組肽、多肽或蛋白質」係指藉由重組DNA技術產生之肽、多肽或蛋白質,亦即自藉由編碼融合蛋白(包括所要肽)之外源重組DNA表現構築體來轉型之細胞、微生物或哺乳動物產生的。在大多數細菌培養物中表現之蛋白質或肽通常將不含聚糖。在酵母中表現之蛋白質或多肽可具有不同於在哺乳動物細胞中表現之糖基化模式。
作為本發明之多肽,包括前述多肽之片段、衍生物、類似物或變異體以及合成或生物變異體及其任何組合。術語「片段」、「變異體」、「衍生物」及「類似物」包括具有與天然肽之胺基酸序列足夠相似之胺基酸序列之肽及多肽。術語「足夠相似」係指第一胺基酸序列相對於第二胺基酸序列含有足夠或最小數量之相同或等效胺基酸殘基,使得第一胺基酸序列及第二胺基酸序列具有共同域及/或共同功能活性。例如,包含至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或至少約100%相同之共同結構域之胺基酸序列在本文中定義為足夠相似。視情況地,變異體將與本發明之較佳肽之胺基酸序列足夠相似,特別是經改變C9ORF72蛋白,例如病理性C9ORF72-DPR以及單獨的DPR蛋白、其任一者之變異體、衍生物或類似物。此等變異體通常保留了本發明之肽之功能活性。變異體包括分別藉由一或多個胺基酸缺失、添加及/或取代在胺基酸序列上與天然肽及野生型(wt)肽不同之肽。此等變異體可為天然存在變異體以及經人工設計之變異體。
此外,當提及本發明之抗體或抗體多肽時,術語「片段」、「變異體」、「衍生物」及「類似物」包括保留對應天然結合分子、抗體或多肽之至少一些抗原結合特性之任何多肽。除了本文其它地方論述之特異性抗體片段之外,本發明之多肽之片段亦包括蛋白水解片段以及缺失片段。本發明之抗體及抗體多肽之變異體包括如上所述之片段以及胺基酸序列因胺基酸取代、缺失或插入而發生改變之多肽。變異體可以天然存在或非天然存在。非天然存在之變異體可使用此項技術已知之突變誘發技術來產生。變異體多肽可包含保守或非保守胺基酸取代、缺失或添加。DPR蛋白特異性結合分子,例如本發明之抗體及抗體多肽之衍生物為已經改變以顯示天然多肽上未發現之其它特徵之多肽。實例包括融合蛋白。變異體多肽在本文中亦可稱為「多肽類似物」。如本文所用,結合分子或其片段、抗體或抗體多肽之「衍生物」係指具有一或多個藉由功能性側基之反應而化學衍生之殘基的主題多肽。「衍生物」亦包括含有二十種標準胺基酸之一或多個天然存在胺基酸衍生物之彼等肽。例如,4-羥基脯胺酸可以取代脯胺酸;5-羥離胺酸可以取代離胺酸;3-甲基組胺酸可以取代組胺酸;高絲胺酸可以取代絲胺酸;且鳥胺酸可以取代離胺酸。
測定分子之相似性及/或同一性:
藉由比較一種肽之胺基酸序列與第二種肽之序列來測定兩種肽之間之「相似性」。若胺基酸為相同的或保守性胺基酸取代,則一個肽之胺基酸與第二個肽之對應胺基酸相似。保守取代包括在以下文獻中描述之彼等:Dayhoff, M.O.編, The Atlas of Protein Sequence and Structure 5, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. (1978), 及Argos, EMBO J. 8 (1989), 779-785。例如,屬於以下組中之一者之胺基酸代表保守性變化或取代: -Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr;-Cys、Ser、Tyr、Thr;-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe;-Lys、Arg、His;-Phe、Tyr、Trp、His;及-Asp、Glu。
藉由比較一種多核苷酸之核酸序列與多核苷酸之序列來測定兩種多核苷酸之間之「相似性」。若核酸為相同的,則一種多核苷酸之核酸與第二種多核苷酸之對應核酸相似,或者若核酸為編碼序列之一部分,則包含該核酸之對應三聯體編碼相同之胺基酸或編碼保守性胺基酸取代。
視情況使用Karlin及Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877之數學演算法完成兩個序列之間的同一性或相似性百分比之測定。此演算法被併入Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410之BLASTn及BLASTp程式中,其可在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cge)獲得。
使用用於BLAST多核苷酸搜索之BLASTn程式及用於BLAST蛋白質搜索之BLASTp程式之標準參數進行同一性或相似性百分比之測定,該等參數如在NCBI網頁上及在「BLAST程式選擇指南」中關於具體長度及構成之序列來推薦的。
用BLASTn程式進行BLAST多核苷酸搜索。
對於一般參數,「最大靶標序列」框可以設置為100,「較短查詢」框可以勾選,「預期臨界值」框可以設置為1000,且「字大小」框可以設置為7,如在NCBI網頁上對於短序列(少於20個鹼基)所推薦。對於較長之序列,「預期臨界值」框可以設置為10,「字大小」框可以設置為11。對於評分參數,「匹配/不匹配評分」可以設置為1、-2且「空位罰分」框可以設置為線性。對於過濾及掩蔽參數,「低複雜度區域」框可以不勾選,「種類特異性重複」框可以不勾選,「僅用於查找表之掩碼」框可以勾選,「DUST過濾設置」可以勾選,且「掩蔽小寫字母」框可以不勾選。通常,在提供大多數上述設置之此方面中,可以使用「搜索短的近似精確的匹配」。有關此方面之更多資訊,請參見NCBI網頁上公佈之「BLAST程式選擇指南」。
使用BLASTp程式進行BLAST蛋白質搜索。對於一般參數,「最大靶標序列」框可以設置為100,「較短查詢」框可以勾選,「預期臨界值」框可以設置為10,且「字大小」框可以設置為「3」。對於評分參數,「矩陣」框可以設置為「BLOSUM62」,「空位罰分」框可以設置為「存在:11擴展:1」,「組成調整」框可以設置為「條件性組成評分矩陣調整」。對於過濾及掩蔽參數,「低複雜度區域」框可以不勾選,「僅用於查找表之掩碼」框可以不勾選,且「掩蔽小寫字母」框可以不勾選。
根據在NCBI網頁上以HTML及PDF版本發佈之「BLAST程式選擇指南」中之推薦來執行兩個程式之修改,例如關於所搜索序列之長度。
多核苷酸:
術語「多核苷酸」意欲涵蓋單數個核酸以及複數個核酸且係指經分離之核酸分子或構築體,例如傳訊RNA (mRNA)或質體DNA (pDNA)。多核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵,諸如見於肽核酸(PNA)中)。術語「核酸」係指存在於多核苷酸中之任一或多個核酸鏈段,例如DNA或RNA片段。「經分離」核酸或多核苷酸意欲為已自原生環境移除之核酸分子DNA或RNA。舉例而言,出於本發明之目的,載體中所含之編碼抗體之重組多核苷酸被視為經分離多核苷酸。經分離多核苷酸之其它實例包括保持在異源宿主細胞中之重組多核苷酸或溶液中之經純化(部分或實質上)多核苷酸。經分離RNA分子包括本發明之多核苷酸之活體內或活體外RNA轉錄物。根據本發明之經分離多核苷酸或核酸進一步包括以合成方式產生的此等分子。另外,多核苷酸或核酸可為或可包括調節元件,例如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。
如本文所用,「編碼區」為核酸之一部分,其由轉譯成胺基酸之密碼子組成。儘管「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)通常不轉譯成胺基酸,但其可視為編碼區之一部分,但任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子及其類似序列)不為編碼區之一部分。本發明之兩個或兩個以上編碼區可存在於單一多核苷酸構築體中,例如在單一載體上,或存在於各別多核苷酸構築體中,例如在各別(不同)載體上。此外,任何載體可以含有單個編碼區,或者可以包含兩個或更多個編碼區,例如,單個載體可以分別編碼免疫球蛋白重鏈可變區及免疫球蛋白輕鏈可變區。此外,本發明之載體、多核苷酸或核酸可編碼融合或未融合於編碼結合分子、抗體、或其片段、變異體或衍生物之核酸之異源編碼區。異源編碼區包括但不限於專門化元件或基元,諸如分泌信號肽或異源功能域。
在某些實施例中,多核苷酸或核酸為DNA。在DNA情況下,包含編碼多肽之核酸之多核苷酸通常可包括啟動子及/或與一或多個編碼區可操作地締合之其它轉錄或轉譯控制元件。可操作締合為基因產物(例如多肽)之編碼區以一種方式與一或多種調節序列締合,使得基因產物之表現受到調節序列之影響或控制的情況。若啟動子功能之誘導導致編碼所要基因產物之mRNA之轉錄,且若兩個DNA片段之間之連接性質不會干擾表現調控序列引導基因產物表現之能力或干擾DNA模板轉錄之能力,則兩個DNA片段(例如多肽編碼區及與其締合之啟動子)為「可操作地締合的」或「可操作地連接的」。因此,若啟動子能夠實現該核酸之轉錄,則啟動子區域可操作地與編碼多肽之核酸締合。啟動子可以為僅在預定細胞中引導DNA之實質轉錄之細胞特異性啟動子。除啟動子之外的其它轉錄控制元件,例如增強子、操縱子、阻遏子及轉錄終止信號,亦可與多核苷酸可操作地締合以引導細胞特異性轉錄。本文揭示了合適啟動子及其它轉錄控制區。
多種轉錄控制區域為熟習此項技藝者已知的。此等轉錄控制區包括但不限於在脊椎動物細胞中起作用之轉錄控制區,諸如但不限於來自細胞巨大病毒(即刻早期啟動子,連同內含子-A一起)、猿猴病毒40(早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))之啟動子及增強子鏈段。其它轉錄控制區包括源於脊椎動物基因,諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β-球蛋白之彼等控制區,以及能夠控制真核細胞中之基因表現之其它序列。其它適合轉錄控制區包括組織特異性啟動子及增強子,以及淋巴介質誘導性啟動子(例如,可由干擾素或介白素誘導之啟動子)。
類似地,各種轉譯控制元件為一般熟悉此項技藝者已知的。此等轉譯控制元件包括但不限於核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子、及源自小核糖核酸病毒之元件(特別是內部核糖體進入位點或IRES,亦稱為CITE序列)。
在其它實施例中,本發明之多核苷酸為RNA,例如,呈傳訊RNA(mRNA)形式。
本發明之多核苷酸及核酸編碼區可以與編碼分泌或信號肽之其它編碼區締合,該等其它編碼區引導由本發明之多核苷酸編碼之多肽之分泌。根據信號假設,哺乳動物細胞分泌之蛋白質具有信號肽或分泌前導序列,一旦逐漸增長之蛋白質鏈開始跨粗糙內質網輸出,該信號肽或分泌前導序列即自成熟蛋白質裂解。一般熟悉此項技藝者應瞭解由脊椎動物細胞分泌之多肽通常具有融合於多肽之N端之信號肽,其自完全或「全長」多肽裂解以產生多肽之分泌或「成熟」形式。在某些實施例中,使用天然信號肽,例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽,或使用該序列之功能性衍生物,其保留引導可與其可操作地締合之多肽之分泌之能力。或者,可以使用異源哺乳動物信號肽或其功能衍生物。例如,野生型前導序列可以經人組織纖溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶之前導序列取代。
在本發明上下文中使用之「結合分子」主要係關於抗體及其片段,但亦可以係指結合二肽重複(DPR)蛋白之其它非抗體分子,其視情況地結合至經改變C9ORF72,尤其(病理學上)經改變C9ORF72-DPR,包括但不限於激素、受體、配體、主要組織相容性複合物(MHC)分子、分子伴護蛋白如熱休克蛋白(HSP)以及細胞-細胞黏附分子諸如鈣黏蛋白、整合素、C型凝集素及免疫球蛋白(Ig)超家族之成員。因此,僅為了清楚起見而不限制本發明之範圍,關於抗體及抗體樣分子論述了大多數以下實施例,該等抗體及抗體樣分子代表用於開發治療劑及診斷劑之較佳結合分子。
抗體:
術語「抗體」及「免疫球蛋白」在本文中可互換使用。抗體或免疫球蛋白係結合分子,其至少包含重鏈之可變域,且通常至少包含重鏈及輕鏈之可變域。脊椎動物系統中之基本免疫球蛋白結構相對好理解;參見,例如, Harlow等人, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 1988)。
如下文將更詳細論述的,術語「免疫球蛋白」包含可在生物化學上區分之各種廣泛類型之多肽。熟習此項技藝者將理解,重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε,其中有一些子類(例如,γ1-γ4)。該鏈之性質將抗體之「類別」分別判定為IgG、IgM、IgA IgG或IgE。免疫球蛋白亞類(同型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等得以充分表徵且已知可賦予功能專門化。鑒於本揭露內容,熟習此項技藝者容易辨別此等類別及同型中每一者之修飾形式,且因此,該等形式在本發明之範圍內。所有免疫球蛋白類別顯然皆在本發明之範圍內,以下論述通常將係關於IgG類免疫球蛋白分子。關於IgG,標準免疫球蛋白分子包含分子量為約23,000道爾頓之兩個相同輕鏈多肽及分子量為53,000-70,000之兩個相同重鏈多肽。四條鏈通常由二硫鍵連接成「Y」組態,其中輕鏈托住起始於「Y」組態之開口處之重鏈,且繼續穿過可變區。
輕鏈分類為κ或λ。各重鏈類別可與κ或λ輕鏈結合。通常,輕鏈及重鏈彼此共價鍵合,且當免疫球蛋白由雜交瘤、B細胞或基因工程化宿主細胞產生時,兩條重鏈之「尾部」部分藉由共價二硫鍵或非共價鍵彼此鍵合。在重鏈中,胺基酸序列自Y組態之叉形末端之N端延伸至每條鏈之底部之C端。
輕鏈及重鏈皆分為結構及功能同源性區域。術語「恆定」及「可變」在功能上使用。在此方面,應當理解,輕鏈(V
L)及重鏈(V
H)部分之可變域決定了抗原識別及特異性。相反,輕鏈(CL)及重鏈(CH1、CH2或CH3)之恆定域賦予重要生物學性質,例如分泌、經胎盤移動性、Fc受體結合、補體結合及其類似性質。按照慣例,恆定區域之編號隨著它們遠離抗體之抗原結合位點或胺基端而增加。N端部分為可變區,且C端部分為恆定區;CH3及CL域實際上分別包含重鏈及輕鏈之羧基端。
如上所述,可變區允許抗體選擇性識別且特異性結合抗原上之抗原決定基。亦即,抗體之V
L域及V
H域或互補決定區(CDR)之子集組合形成限定三維抗原結合位點之可變區。該四級抗體結構形成存在於Y之各臂末端之抗原結合位點。更具體地,抗原結合位點由V
H及V
L鏈中之每一者上之三個CDR限定。含有足以特異性結合至DPR,尤其結合至形成C9ORF72-DPR之經改變C9ORF72之結構的任何抗體或免疫球蛋白片段,在本文中可互換地表示為「結合片段」或「免疫特異性片段」。
在天然存在抗體中,抗體包含存在於各抗原結合域中之六個高變區,有時稱為「互補決定區」或「CDR」,該等高變區為較短的非連續胺基酸序列,其經特異性定位以便在抗體在水性環境中呈現其三維組態時形成抗原結合域。「CDR」之側翼為四個相對保守之「框架」區域或「FR」,其顯示出較小分子間可變性。框架區主要採用β-折疊構形,且CDR形成連接β-折疊結構之環,且在一些情況下形成β-折疊結構之一部分。因此,框架區用於形成藉由鏈間非共價相互作用將CDR定位在正確之方向上之支架。由經定位CDR形成之抗原結合域限定了與免疫反應性抗原上之抗原決定基互補之表面。該互補表面促進抗體與其同源抗原決定基之非共價結合。對於任何給定重鏈或輕鏈可變區,分別包含CDR及構架區之胺基酸可由一般熟悉此項技藝者容易地鑒定,因為它們已被精確定義;參見 「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」 Kabat, E.,等人, U.S. Department of Health and Human Services, (1983);及Chothia及Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917,此等文獻之全部內容以引用之方式併入本文。
在此項技術內使用及/或接受之術語存在兩個或更多個定義之情況下,除非明確說明相反情況,否則本文使用之術語之定義意欲包括所有此等含義。具體實例為使用術語「互補決定區」(「CDR」)描述在重鏈及輕鏈多肽之可變區內發現之非連續抗原結合位點。該特定區域已由Kabat等人, U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」 (1983)及Chothia及Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917描述,此等文獻以引用之方式併入本文,其中定義包括當彼此比較時胺基酸殘基之重疊或子集。然而,應用任一定義指示抗體或其變異體之CDR意欲在本文定義及使用之術語之範圍內。在下表1中闡述涵蓋如上文引用之參考文獻各自所定義之CDR之適當胺基酸殘基以便比較。涵蓋特定CDR之確切殘基數將根據CDR之序列及大小而變化。在給定抗體可變區胺基酸序列之情況下,熟習此項技藝者可以常規地判定哪些殘基包含抗體之人IgG亞型之特定高變區或CDR。
表 1 :CDR定義
1
1表1中所有CDR定義之編號係根據Kabat等人提出之編號慣例(見下文)。
Kabat | Chothia | |
VH CDR1 | 31-35 | 26-32 |
VH CDR2 | 50-65 | 52-58 |
VH CDR3 | 95-102 | 95-102 |
VL CDR1 | 24-34 | 26-32 |
VL CDR2 | 50-56 | 50-52 |
VL CDR3 | 89-97 | 91-96 |
Kabat等人亦定義了適用於任何抗體之可變域序列之編號系統。一般熟悉此項技藝者可以明確地將該「Kabat編號」系統指定給任何可變域序列,而不依賴於序列本身之外的任何實驗資料。如本文所使用,「Kabat編號」係指由Kabat等人, U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」 (1983)提出之編號系統。除非另有說明,否則提及本發明之抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物中特定胺基酸殘基位置之編號係根據Kabat編號系統,然而該編號系統為理論上的且可能不同等地適用於本發明之各種抗體。例如,取決於第一CDR之位置,後續CDR可以在任一方向上移位。
本發明之抗體或其片段(例如,抗原結合片段或免疫特異性片段)、其變異體或衍生物包括但不限於多株、單株、多特異、人、人源化、靈長類化、鼠源化或嵌合抗體、單鏈抗體、抗原決定基結合片段,例如Fab、Fab'及F(ab')2、Fd、Fvs、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、經二硫鍵連接之Fvs(sdFv)、包含VL或VH域之片段、藉由Fab表現文庫產生之片段及抗獨特型(抗Id)抗體(包括例如本文揭示之抗體的抗Id抗體)。ScFv分子為此項技術中已知的且描述於例如美國專利5,892,019中。本發明之免疫球蛋白或抗體分子可為任何類型(例如,IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何類別(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)、或任何子類之免疫球蛋白分子。
在一個實施例中,本發明之抗體不是IgM或其具有五價結構之衍生物。特別地,在本發明之特定應用,尤其是治療用途中,IgM不如IgG及其它二價抗體或對應結合分子有用,因為由於其五價結構及缺乏親和力成熟,IgM通常顯示出非特異性交叉反應性及非常低的親和力。在一特別較佳實施例中,本發明之抗體不是多株抗體,亦即它基本上由一個特定抗體種類組成,而非自血漿免疫球蛋白樣品中獲得之混合物。
抗體片段,包括單鏈抗體,可以包含單獨的可變區或者與以下全部或一部分組合之可變區:鉸鏈區、CH1、CH2及CH3域。本發明亦包括DPR結合片段,其包含可變區與鉸鏈區、CH1、CH2及CH3域之任何組合。本發明之抗體或其免疫特異性片段可來自任何動物來源,包括鳥類及哺乳動物。視情況地,抗體為人、鼠、驢、兔、山羊、豚鼠、駱駝、美洲駝、馬或雞抗體。在另一個實施例中,可變區可以為軟骨魚(condricthoid)來源(例如,來自鯊魚)。
如本文所用,術語「重鏈部分」或「重鏈」或「重鏈區」包括衍生自免疫球蛋白重鏈之胺基酸序列。包含重鏈部分之多肽包含以下項中之至少一者:CH1域、鉸鏈(例如,上、中及/或下鉸鏈區)域、CH2域、CH3域,或其變異體或片段。例如,用於本發明之結合多肽可包含:包含CH1域之多肽鏈;包含CH1域、至少一部分鉸鏈域及CH2域之多肽鏈;包含CH1域及CH3域之多肽鏈;包含CH1域、至少一部分鉸鏈域及CH3域之多肽鏈,或包含CH1域、至少一部分鉸鏈域、CH2域及CH3域之多肽鏈。在另一個實施例中,本發明之多肽包含含有CH3域之多肽鏈。此外,用於本發明之結合多肽可缺少至少一部分CH2域(例如,全部或部分CH2域)。如上所述,一般熟悉此項技藝者將理解,可以修飾此等域(例如重鏈部分),使得它們在胺基酸序列上與天然存在之免疫球蛋白分子不同。
在本文揭示之某些抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物中,多聚體之一條多肽鏈之重鏈部分與多聚體之第二條多肽鏈上之重鏈部分相同。或者,本發明之含重鏈部分之單體不相同。例如,各單體可包含不同靶結合位點,形成例如雙特異性抗體或雙抗體。
在另一個實施例中,本文揭示之抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物由單一多肽鏈如scFv組成,且將在細胞內表現(胞內抗體)以用於潛在活體內治療及診斷應用。
用於本文揭示之診斷及治療方法中之結合多肽之重鏈部分可以衍生自不同免疫球蛋白分子。例如,多肽之重鏈部分可包含衍生自IgG1分子之CH1域及衍生自IgG3分子之鉸鏈區。在另一個實例中,重鏈部分可包含部分衍生自IgG1分子且部分衍生自IgG3分子之鉸鏈區。在另一個實例中,重鏈部分可包含部分衍生自IgG1分子且部分衍生自IgG4分子之嵌合鉸鏈。
如本文所用,術語「輕鏈部分」或「輕鏈」或「輕鏈區」包括衍生自免疫球蛋白輕鏈之胺基酸序列。視情況地,輕鏈部分包含VL或CL域中之至少一者。
抗體之肽或多肽抗原決定基之最小尺寸被認為是約4至5個胺基酸。肽或多肽抗原決定基視情況含有至少7個,視情況至少9個,或視情況至少約15至約30個胺基酸。由於CDR可以識別三級形式之抗原肽或多肽,因此包含抗原決定基之胺基酸不需要是連續的,且在一些情況下,甚至可能不在相同肽鏈上。在本發明中,由本發明之抗體識別之肽或多肽抗原決定基含有在C9ORF72-DPR中發現之DPR例如GA
15(SEQ ID NO:66)之至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、視情況至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、或約15至約30個之間的連續或非連續胺基酸之序列。換言之,本發明之抗體或其生物技術衍生物視情況識別具有例如3至50、視情況10至40、視情況15至30、或視情況15之重複數目之二肽之DPR,該二肽由兩種不同胺基酸X及X'(XXX及XXX';XaaXaa')組成。因此,由本發明之抗體或其生物技術衍生物識別之抗原決定基或抗原(若由重複數為15之DPR組成)通常可以指定為(XX')
15。
藉由本文可互換使用之「特異性結合」或「特異性識別」,通常意指結合分子(例如抗體)藉由其抗原結合域結合至抗原決定基,且該結合需要抗原結合域與抗原決定基之間之一些互補性。根據該定義,當抗體藉由其抗原結合域結合至抗原決定基比它結合至隨機不相關抗原決定基更容易時,認為抗體「特異性結合」至該抗原決定基。術語「特異性」在本文中用於限定某種抗體結合至某種抗原決定基之相對親和力。例如,抗體「A」可以被認為對於給定抗原決定基具有比抗體「B」更高之特異性,或者抗體「A」可以被認為以比其對於相關抗原決定基「D」之特異性更高之特異性結合至抗原決定基「C」。
當存在時,術語「免疫結合特徵」或抗體與抗原之其它結合特徵,在其所有語法形式下皆係指抗體之特異性、親和力、交叉反應性及其它結合特徵。
「優先結合」意指結合分子(例如抗體)比結合至相關的、相似的、同源的或類似的抗原決定基更容易地特異性結合至抗原決定基。因此,「優先結合」至給定抗原決定基之抗體更可能結合至該抗原決定基而非結合至相關抗原決定基,即使此抗體可能與相關抗原決定基交叉反應。
作為非限制性實例,若結合分子例如抗體結合至第一抗原決定基之解離常數(KD)小於抗體對於第二抗原決定基之KD,則可認為其優先結合該第一抗原決定基。在另一個非限制性實例中,若抗體結合至第一抗原決定基之親和力比抗體對於第二抗原決定基之KD低至少一個數量級,則可以認為抗體優先結合第一抗原。在另一個非限制性實例中,若抗體結合第一抗原決定基之親和力比抗體對於第二抗原決定基之KD低至少兩個數量級,則可以認為抗體優先結合第一抗原。
在另一個非限制性實例中,若結合分子(例如抗體) 結合第一抗原決定基之解離速率(k(off)) 低於抗體對於第二抗原決定基之k(off),則可以認為結合分子優先結合第一抗原決定基。在另一個非限制性實例中,若抗體結合第一抗原決定基之親和力比抗體對於第二抗原決定基之k(off)低至少一個數量級,則可以認為抗體優先結合第一抗原。在另一個非限制性實例中,若抗體結合第一抗原決定基之親和力比抗體對於第二抗原決定基之k(off)低至少兩個數量級,則可以認為抗體優先結合第一抗原。
可以認為本文揭示之結合分子,例如抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物結合DPR或其片段、變異體或特定構形之解離速率(k(off))小於或等於5 x 10
-2s
-1、10
-2s
-1、5 x 10
-3s
-1或10
-3s
-1。視情況地,可以認為本發明之抗體結合DPR蛋白或其片段、變異體或特定構形之解離速率(k(off))小於或等於5 x 10
-4s
-1、10
-4s
-1、5 x 10
-5s
-1或10
-5s
-1、5 x 10
-6s
-1、10
-6s
-1、5 x 10
-7s
-1或10
-7s
-1。在特別較佳實施例中,DPR為與C9ORF72相關之DPR,亦即C9ORF72-DPR。
可以認為本文揭示之結合分子,例如抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物結合DPR或其片段、變異體或特定構形之結合速率(k(on))大於或等於10
3M
-1s
-1、5 x 10
3M
-1s
-1、10
4M
-1s
-1或5 x 10
4M
-1s
-1。視情況地,可以認為本發明之抗體結合DPR或其片段、變異體或特定構形之結合速率(k(on))大於或等於10
5M
-1s
-1、5 x 10
5M
-1s
-1、10
6M
-1s
-1或5 x 10
6M
-1s
-1或10
7M
-1s
-1。在一個實施例中,可以認為結合分子結合C9ORF72-DPR,或其片段、變異體或特定構形之結合速率(k(on))以大於或等於10
3M
-1s
-1、5 x 10
3M
-1s
-1、10
4M
-1s
-1或5 x 10
4M
-1s
-1。視情況地,可以認為本發明之抗體結合C9ORF72-DPR或其片段、變異體或特定構形之結合速率(k(on))大於或等於10
5M
-1s
-1、5 x 10
5M
-1s
-1、10
6M
-1s
-1或5 x 10
6M
-1s
-1或10
7M
-1s
-1。
若結合分子例如抗體在阻斷參照抗體與抗原決定基之結合的程度上優先結合至抗原決定基,則認為該結合分子競爭性地抑制參照抗體與該給定抗原決定基之結合。競爭性抑制可以藉由此項技術中已知之任何方法判定,例如競爭ELISA檢定。可以認為抗體競爭性地抑制參照抗體與給定抗原決定基之結合至少90%、至少80%、至少70%、至少60%或至少50%。
如本文所用,術語「親和力」係指單個抗原決定基與結合分子(例如免疫球蛋白分子)之CDR之結合強度的量度;參見,例如, Harlow等人, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 (1988) 第27-28頁。如本文所用,術語「親合力」係指免疫球蛋白群與抗原之間的複合物之總體穩定性,亦即免疫球蛋白混合物與抗原之功能性結合強度;例如,參見Harlow之第29-34頁。親合力與群體中之個體免疫球蛋白分子與特定抗原決定基之親和力以及免疫球蛋白及抗原之效價有關。例如,二價單株抗體與具有高度重複抗原決定基結構之抗原(例如聚合物)之間的相互作用將為高親合力之相互作用。抗體對抗原之親和力或親合力可以使用任何合適方法在實驗上測定;參見,例如Berzofsky等人, 「Antibody-Antigen Interactions」,Fundamental Immunology, Paul, W. E.編, Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992),及本文描述之方法。用於量測抗體對抗原之親和力之一般技術包括ELISA、RIA及表面電漿共振。若在不同條件,例如鹽濃度、pH下量測,則特定抗體-抗原相互作用之經量測親和力可以變化。因此,親和力及其它抗原結合參數(例如KD、IC
50)之量測視情況地使用抗體及抗原之標準化溶液及標準化緩衝液進行。
亦可以描述或指定本發明之結合分子,例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之交叉反應性。如本文所用,術語「交叉反應性」係指對一種抗原具有特異性之抗體與第二種抗原反應之能力;兩種不同抗原物質之間之相關性之度量。因此,若抗體結合至除誘導其形成之抗原決定基之外的抗原決定基,則該抗體為交叉反應的。交叉反應性抗原決定基通常包含許多與誘導抗原決定基相同的互補結構特徵,且在一些情況下,實際上可能比原始抗原決定基表現更好。
例如,某些抗體具有一定程度的交叉反應性,因為它們結合相關但不相同的抗原決定基,例如與參考抗原決定基具有至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%、及至少50%同一性(使用此項技術中已知及本文所述之方法計算)之抗原決定基。若抗體不結合與參考抗原決定基具有小於95%、小於90%、小於85%、小於80%、小於75%、小於70%、小於65%、小於60%、小於55%、小於50%同一性(使用此項技術中已知及本文所述之方法計算)之抗原決定基,則可以認為抗體幾乎無交叉反應性或無交叉反應性。若抗體不結合抗原決定基之任何其它類似物、異種同源物或同源物,則可認為該抗體對某些抗原決定基具有「高度特異性」。
亦可以描述或指定本發明之結合分子,例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物對DPR及/或顯示C9ORF72-DPR及/或其片段之突變C9ORF72物質之結合親和力。較佳結合親和力包括具有小於5 x 10
-2M、10
-2M、5 x 10
-3M、10
-3M、5 x 10
-4M、10
-4M、5 x 10
-5M、10
-5M、5 x 10
-6 M、10
-6M、5 x 10
-7M、10
-7M、5 x 10
-8M、10
-8M、5 x 10
-9M、10
-9M、5 x 10
-10M、10
-10M、5 x 10
-11M、10
-11M、5 x 10
-12M、10
-12M、5 x 10
-13M、10
-13M、5 x 10
-14M、10
-14M、5 x 10
-15M或10
-15M之解離常數或Kd之彼等者。
如前所述,各種免疫球蛋白類之恆定區之亞基結構及三維組態為熟知的。如本文所用,術語「VH域」包括免疫球蛋白重鏈之胺基端可變域,術語「CH1域」包括免疫球蛋白重鏈之第一(最鄰近胺基端)恆定區域。CH1域與VH域相鄰,且在免疫球蛋白重鏈分子之鉸鏈區之胺基端。
如本文所用,術語「CH2域」包括重鏈分子之一部分,該部分使用習用編號方案例如自抗體之約殘基244延伸至殘基360(殘基244至360,Kabat編號系統;及殘基231-340,EU編號系統;參見Kabat EA等人,同上)。CH2域為獨特的,因為其未與另一域緊密配對。更確切地,兩條N連接之分支碳水化合物鏈插入完整原生IgG分子之兩個CH2域之間。亦充分證明CH3域自CH2域延伸至IgG分子之C端且包含約108個殘基。
如本文所用,術語「鉸鏈區」包括將CH1域連接至CH2域之重鏈分子部分。該鉸鏈區包含約25個殘基且為可撓性的,因此允許兩個N-端抗原結合區獨立地移動。鉸鏈區可以細分為三個不同域:上部、中部及下部鉸鏈域;參見Roux等人, J. Immunol. 161 (1998), 4083-4090。
如本文所用,術語「二硫鍵」包括在兩個硫原子之間形成之共價鍵。胺基酸半胱胺酸包含可以與第二硫醇基形成二硫鍵或橋之硫醇基。在大多數天然存在之IgG分子中,CH1區與CL區藉由二硫鍵締合且兩條重鏈藉由兩個二硫鍵在對應於239及242之位置處締合,該等位置係使用Kabat編號系統(位置226或229,EU編號系統)。
如本文使用,術語「經連接」、「經融合」或「融合」可互換使用。此等術語係指藉由無論何種手段包括化學偶聯或重組手段將兩個更多個元件或組分連接在一起。「框內融合」係指以保持原始ORF之正確轉譯閱讀框之方式連接兩個或更多個多核苷酸開放閱讀框(ORF)以形成連續的較長ORF。因此,重組融合蛋白為含有兩個或兩個以上鏈段之單一蛋白,該等鏈段對應於由原始ORF編碼之多肽(該等鏈段本質上在正常情況下並非如此連結)。儘管閱讀框因此在整個融合鏈段中成為連續的,但是鏈段可以藉由例如框內接頭序列在實體上或空間上分開。例如,編碼免疫球蛋白可變區之CDR之多核苷酸可以框內融合,但可以藉由編碼至少一個免疫球蛋白框架區或其它CDR區之多核苷酸分開,只要「經融合」CDR作為連續多肽之一部分而共轉譯。
如本文所用,術語「表現」係指基因藉以產生生物化學品(例如RNA或多肽)之過程。該過程包括細胞內基因之功能性存在之任何體現,包括但不限於基因敲除以及瞬時表現及穩定表現。它包括但不限於將基因轉錄成傳訊RNA(mRNA)、轉移RNA(tRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、小干擾RNA(siRNA)或任何其它RNA產物,以及將mRNA轉譯成多肽。若最終所要產物為生物化學品,則表現包括產生該生物化學品及任何前體。基因之表現產生「基因產物」。如本文所用,基因產物可為核酸,例如藉由基因轉錄產生之傳訊RNA或自轉錄物轉譯之多肽。本文所述之基因產物進一步包括具有轉錄後修飾(例如多腺苷酸化)之核酸或具有轉譯後修飾(例如甲基化、糖基化、脂質之添加、與其它蛋白質亞基之締合、蛋白水解切割及其類似修飾) 之多肽。
如本文所用,術語「樣品」係指自受試者或患者獲得之任何生物材料。在一個態樣,樣品可包含血液、腹膜液、CSF、唾液或尿液。在其它態樣,樣品可包含全血、血漿、血清、自血液樣品富集之B細胞、及經培養之細胞(例如,來自受試者之B細胞)。樣品亦可包括生檢或組織樣品,包括神經組織。在其它態樣,樣品可包含全細胞及/或細胞裂解物。血液樣品可以藉由此項技術中已知之方法收集。
疾病:
除非另有說明,否則術語「病症」及「疾病」在本文中可互換使用,且包括受試者、動物、經分離器官、組織或細胞/細胞培養物中之任何不期望的生理變化。
額顳葉變性(FTLD)為與大腦額葉及顳葉萎縮相關之發病機制。此外,50% FTLD患者亦顯示出具有陽性家族史,且與肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)相比較。如上所述,發病機理之共同潛在原因似乎是位於FTLD及ALS患者之C9ORF72中之雜合經擴增之六核苷酸重複。特別地,已顯示兩種胺基酸之所得重複單元(二肽重複,DPR)。
然而,在幾種其它疾病及/或病症中亦報道了經擴增之六核苷酸重複,其導致兩種胺基酸(DPR)之重複。該等疾病包括但不限於額顳葉變性(FTLD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、FTLD-ALS及/或脊髓小腦性失調症36型、及其中之相關症狀。
在本發明之一個實施例中,本發明之抗體、具有與其任一者基本相同之結合特異性之結合分子、本發明之多核苷酸、載體或細胞用於製備用以預防性及/或治療性治療與DPR相關聯之疾病之醫藥或診斷組成物、用於監測疾病進展及/或治療反應、及用於診斷與DPR澱粉樣變性相關之疾病,包含額顳葉變性(FTLD)、肌萎縮性側索硬化症(ALS)、FTLD-ALS、及/或脊髓小腦性失調症36型。
在一些實施例中,本發明之抗體結合至FTLD患者中之病理性C9ORF72-二肽重複蛋白或其聚集形式。因此,在本發明之一個實施例中,抗體、具有與其任一者基本相同之結合特異性之結合分子、本發明之多核苷酸、載體或細胞用於製備用以預防性及/或治療性治療與C9ORF72-DPR相關聯之疾病之醫藥或診斷組成物、用於監測疾病進展及/或治療反應、及用於診斷與C9ORF72-DPR或其聚集形式相關之疾病,包含額顳葉變性(FTLD)、肌萎縮性側索硬化(ALS)及/或FTLD-ALS、及其中之相關症狀。
治療:
如本文使用,術語「治療(treat及treatment)」係指治療性治療及防治性或預防性措施,其中目標係防止或減緩(減輕)不需要之生理學改變或病症,諸如心氣虛之發展。有益或所要臨床結果包括但不限於減輕症狀、減弱疾病程度、穩定疾病病況(亦即不惡化)、延遲或減緩疾病發展、改善或舒緩疾病病況、及好轉(無論部分或全部),不論可偵測到或不可偵測到。「治療」亦可意指與在不接受治療情況下預期之存活相比使存活延長。需要治療者包括已患有病狀或病症者、以及傾向於患有病狀或病症者或欲預防病狀或病症症狀者。
若未另外說明,則術語「藥物」、「藥品」或「醫藥」在本文中可互換使用,且應包括但不限於所有(A)內部或外部使用之物品、藥品及製劑,以及意欲用於診斷、治癒、緩解、治療或預防人或其它動物疾病之任何物質或物質之混合物;及(B)意欲影響人或其它動物身體之結構或任何功能之物品、藥品及製劑(食物除外);及(C)意欲用作(A)及(B)條款所指明之任何物品之組成部分之物品。術語「藥物」、「藥品」或「醫藥」應包括意欲用於人或其它動物之製劑之完整配方,含有一或多種「藥劑」、「化合物」、「物質」或「(化學)組成物」且在其它一些情形中亦含有其它醫藥學上無活性之賦形劑,如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、黏合劑,或確保「藥物」、「藥品」或「醫藥」在人或其它動物體內之預定靶標位置,例如在皮膚、胃或腸中易於運輸、崩解、解聚、溶解及生物利用度。術語「藥劑」、「化合物」或「物質」在本文中可互換使用,且在更具體之情形中應包括但不限於所有藥理學活性劑,亦即誘導所要生物學或藥理學作用之藥劑或藉由本發明之方法研究或測試誘導該可能的藥理學作用之能力之藥劑。
「受試者」或「個體」或「動物」或「患者」或「哺乳動物」係指需要診斷、預後、預防或治療之任何受試者,特別是哺乳動物受試者,例如人類患者。
醫藥載劑:
醫藥學上可接受之載劑及給藥途徑可以自熟習此項技藝者已知之對應文獻中獲得。本發明之醫藥組成物可以根據此項技術中熟知之方法調配;參見例如 Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000),the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472, Vaccine Protocols 第2版,Robinson等人, Humana Press, Totowa, New Jersey, USA, 2003;Banga, Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems. 第2版,Taylor and Francis. (2006), ISBN: 0-8493-1630-8。合適醫藥載劑之實例為此項技術中熟知的,且包括磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)、各種類型之潤濕劑、無菌溶液等。包含此類載劑之組成物可藉由熟知之習用方法調配。此等醫藥組成物可以合適劑量投與至受試者。合適組成物之投與可以藉由不同方式實現。實例包括藉由口服、鼻內、直腸、局部、腹膜內、靜脈內、肌肉內、皮下、真皮下、經真皮、鞘內及顱內方法投與含有醫藥學上可接受之載劑之組成物。氣溶膠調配物諸如鼻噴霧調配物包括活性劑與防腐劑及等滲劑之經純化水溶液或其它溶液。視情況將此等調配物調節至與鼻黏膜相容之pH及等滲狀態。在本發明中亦設想用於口服投與之醫藥組成物,例如單域抗體分子(例如,「nanobodies™」)等。此等口服調配物可為錠劑、膠囊、散劑、液體或半固體形式。錠劑可包含固體載劑,例如明膠或佐劑。用於直腸或陰道投與之調配物可以作為具有合適載劑之栓劑存在;亦參見O'Hagan等人, Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003), 727- 735。適用於各種類型投與之調配物之進一步指導可見於Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 第17版(1985)及對應更新中。有關藥物輸送方法之簡要回顧,參見Langer, Science 249 (1990), 1527-1533。
II. 本發明之抗體
本發明一般係關於抗DPR,視情況抗C9orf72-DPR抗體及DPR結合,亦即DPR結合片段以及其生物技術變異體及衍生物,其視情況地展現對於本文描述之抗體所概述之(例如在實例中所示之)免疫結合特徵及/或生物學特性。在一些實施例中,抗DPR抗體為人或人源抗體。在一些實施例中,抗DPR抗體為人單株抗體。在一些實施例中,抗DPR抗體為人源單株抗體。根據本發明,對聚-GA DPR具有特異性之人單株抗體已自健康人受試者庫中選殖。在根據本發明進行之實驗過程中,已評估了源自原始自身抗體之重組IgG抗體結合DPR及其它蛋白質(包括牛血清白蛋白(BSA))之能力;參見實例3至9以及圖2至8。如上所述,在源自選定人C9orf72-FTLD患者之腦組織中可以顯示主題抗體結合DPR蛋白或其聚集形式;參見實例11及圖10。此外,如實例9及圖8所示,藉由參考抗聚-GA抗體(NI-mAb參考)與靶標之預先結合不會阻斷主題抗體與經聚集C9orf72聚-GA DPR(GA)
15(SEQ ID NO:66)之結合,這表明抗體識別聚-GA DPR聚集物上之構形抗原決定基之能力,該構形抗原決定基亦可以在具有其它DPR蛋白及/或致澱粉樣蛋白形成蛋白之共聚集物中接近。
此外,可優化抗DPR抗體、其DPR結合片段、合成或生物技術衍生物或變異體以具有改善之藥物動力學、可製造性及穩定性特性。因此,CDR或可變區中易於進行選自由糖基化、氧化、脫胺、肽鍵裂解、異天冬胺酸形成及/或未配對半胱胺酸組成之群之修飾之至少一個胺基酸經缺乏此改變之突變胺基酸取代,或其中至少一個碳水化合物部分經缺失或以化學或酶促方式添加到抗體中,參見,例如Liu等人, J. Pharm. Sci. 97(7) (2008), 2426-2447;Beck等人, Nat. Rev. Immunol. 10 (2010), 345-352;Haberger等人, MAbs. 6 (2014), 327-339。
為了研究可能使原始抗體更穩定及/或改善可製造性同時保持親本主題抗體之必需結合特徵之胺基酸取代,製備並分析了具有聚(GA)
8肽(SEQ ID NO:81)之主題NI-308.5J10抗體之Fab片段之晶體結構;參見實例12-16及圖11及12。為了監測原始NI-308.5J10抗體之不同變異體之結合親和力,產生Fab片段並對其進行測試以定量內在單價親和力,而無來自多價相互作用之複雜情況。由於經修飾之Fab片段基本上保留了親本抗體之Fab片段之親和力,因此預期對應完整IgG抗體對於聚-(GA)
15肽(SEQ ID NO:66)具有與親本抗體基本相同之結合親和力;參見條款[14]及所附實例。
因此,本發明一般係關於重組人源單株抗DPR抗體及其DPR結合片段、合成及生物技術衍生物及變異體,其中該抗體或其DPR結合片段在其可變區中包含以下六個互補決定區(CDR):
(a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3(例如,包含SEQ ID NO:78)之VH-CDR1或其變異體,其中該變異體包含一或兩個胺基酸取代,
(b) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:4之VH-CDR2或其變異體,其中該變異體包含一或兩個胺基酸取代,
(c) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:5之VH-CDR3或其變異體,其中該變異體包含一或兩個胺基酸取代,
(d) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:8之VL-CDR1或其變異體,其中該變異體包含一或兩個胺基酸取代,
(e) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:9之VL-CDR2或其變異體,其中該變異體包含一或兩個胺基酸取代,
(f) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:10之VL-CDR3或其變異體,其中該變異體包含一或兩個胺基酸取代;
其中該抗體或其DPR結合在所附實例及附圖中顯示對於主題NI-308.5J10抗體及其特異性變異體所示之任一種性質,視情況其中該抗體或其DPR結合具有如條款[1]至[36]概述之一或多種性質,視情況以組合形式,如藉由條款彼此之依賴性所指示的。例如,在一個實施例中,抗體或其DPR結合能夠結合自染色體9開放閱讀框72(C9orf72)基因轉譯之具有至少6個重複序列(GA)
6(SEQ ID NO:80)之聚甘胺酸-丙胺酸(GA)之二肽重複序列(DPR)。主題NI-308.5J10之合成或生物技術衍生物或變異體可含有如本文所述之一種、兩種、三種、四種、五種或六種變異體CDR。例如,合成或生物技術衍生物或變異體抗體或其DPR結合可含有三個、視情況兩個或視情況僅一個變異體VH-CDR,而VL-CDR保持不變或僅一個VL-CDR代表變異體,反之亦然。另外或另選地,本發明之抗體或其DPR結合片段在其可變區中包含
(a) 包含SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列之可變重鏈(V
H)或其變異體,其中該變異體包含一或多個胺基酸取代;及
(b) 包含SEQ ID NO:7所示之胺基酸序列之可變輕鏈(V
L)或其變異體,其中該變異體包含一或多個胺基酸取代;視情況其中
V
H及V
L鏈胺基酸序列分別與SEQ ID NO:2及7至少90%相同。
用於選擇用以取代及CDR內之位置的合適胺基酸之較佳標準示於圖1中,且在圖1之圖例中解釋,如上所述。
如實例12至16所示,已鑒定出NI-308.5J10 hIgG1抗體之轉譯後修飾,亦即輕鏈糖基化及重鏈Asn54脫醯胺,該等修飾已藉由對應胺基酸取代來移除。因此,在本發明之抗體或其DPR結合片段之一個實施例中,CDR不含有易脫醯胺之天冬醯胺(N)及/或麩醯胺(Q)且/或V
H及/或V
L鏈胺基酸序列不含已佔據之糖基化位點。在一個實施例中,V
H及/或V
L鏈胺基酸序列中之一或多個糖基化位點已經突變為不能是已佔據之糖基化位點。
在較佳實施例中,抗體或其DPR結合片段中之一、兩或更多個胺基酸取代係選自
(a) 用非易脫醯胺之胺基酸取代易脫醯胺之天冬醯胺(N)或麩醯胺(Q);
(b) 用較大胺基酸取代與易脫醯胺之N或Q直接相鄰之較小可撓性胺基酸,視情況其中相鄰胺基酸為甘胺酸(G);
(c) 至少一個胺基酸之取代,該取代導致糖基化位點之移除,視情況其中至少一個胺基酸在糖基化基序NXS或NXT內;及/或
(d) 一或多個胺基酸之取代,該取代為保守胺基酸取代;視情況地其中(a)及(b)之胺基酸取代存在於VH-CDR2中,且(c)之胺基酸取代存在於V
L鏈中。
此外,在旨在分別改善主題抗體及其DPR結合片段之穩定性及可製造性之情況下,根據上述考慮因素視情況選擇用於取代之胺基酸。視情況地,根據實例,在VH-CDR2中,對應於SEQ ID NO:2之54位之天冬醯胺(N)及/或對應於55位之甘胺酸(G)經另一種胺基酸取代,視情況其中天冬醯胺(N)經絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)取代且/或其中甘胺酸(G)經絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)取代;及/或在V
L鏈中,對應於SEQ ID NO:
7之75位之天冬醯胺(N)經另一種胺基酸取代,視情況其中天冬醯胺(N)經天冬胺酸(D)取代。
視情況地,抗-DPR抗體、其DPR結合片段或生物技術衍生物或其變異體在以IgG(視情況地IgG1)之形式分析時具有結合親和力,對於結合DPR蛋白(GA)
6(SEQ ID NO:80),該結合親和力對應於≤15 nM之EC
50(半數最大有效濃度)值(參見實例7),且/或對於結合DPR蛋白(GA)
10(SEQ ID NO:79)、(GA)
15(SEQ ID NO:66)及/或(GA)
20(SEQ ID NO:82),該結合親和力對應於≤5 nM,視情況≤2 nM、視情況≤1 nM、或視情況≤0.5 nM之EC
50值;參見實例3、4及7以及圖2及6。在一個實施例中,僅當重複數n≥6時,主題抗體才結合至聚-GA肽;參見實例7及圖6。另外或另選地,至少呈IgG形式之抗體以約(0.5-2.0 nM)之親和力KD結合至聚-(GA)
15(SEQ ID NO:66),視情況以約(0.05-0.5 nM)之KD及視情況約(0.1-0.2 nM)之KD結合至聚-(GA)
15肽(SEQ ID NO:66),其中結合速率常數為(K
a= 0.5-5×10
5M
-1s
-1) 且解離常數為(K
d= 1-5×10
-5s
-1),如藉由生物層干涉術測定;參見實例8及圖7。
因此,對於高親和力及所提及之EC
50及KD值,抗DPR抗體、其DPR結合片段或生物技術衍生物或變異體視情況地進一步包含多肽序列,該多肽序列視情況地與CDR或V
H及V
L鏈胺基酸序列異源,視情況其中該多肽序列包含人恆定域,視情況地為IgG型,視情況地為IgG1類別或同型。
另一方面,主題NI-308.5J10抗體之DPR結合片段,尤其是Fab片段證明特別適用於設計及研究合成及生物技術衍生物或變異體,視情況在具有較小之聚GA重複序列,亦即(GA)
8(SEQ ID NO:81)之情況下;參見實例13至16及圖11及12。因此,在另一實施例中,本發明之抗體或其DPR結合片段對於聚-(GA)
8肽(SEQ ID NO:81)所具有之結合親和力對應於小於30 nM之K
D(解離常數),其中K
a(結合速率)小於5 x 10
5M
-1s
-1且K
d(解離速率)小於10 x 10
-3s
-1,如藉由表面電漿共振(SPR)所測定,視情況地其中DPR結合片段所具有之結合親和力對應於10 nM至30 nM之K
D(解離常數),其中K
a(結合速率)為1至5 x 10
5M
-1s
-1且K
d(解離速率)為2.5至10×10
-3s
-1,如藉由表面電漿共振(SPR)所測定。另外或另選地,該抗體或其DPR結合片段之特徵視情況在於其Fab片段具有分別在78-82℃範圍內,視情況在約79-81℃範圍內之熱穩定性及解構溫度T
m,如藉由差示掃描量熱法(VP-DSC)所測定;參見實例16。
一些抗體能夠結合多種生物分子,例如蛋白質。如熟習此項技藝者將理解的,術語特異性在本文中用於表示除DPR之外之其它生物分子不顯著結合至本發明之抗體。視情況地,與除DPR之外之生物分子之結合水準所導致之結合親和力為對於DPR之親和力之至多僅20%或更低、10%或更低、僅5%或更低、僅2%或更低、或僅1%或更低(亦即至少低5倍、10倍、20倍、50倍或100倍,或超過該值之任何值)。特別地,如上文所述且在實例及附圖中說明,根據本發明,抗DPR抗體或其DPR結合片段或其生物技術衍生物或變異體視情況顯示一個、兩個、三個、四個或全部五個以下結合特徵:(i)識別聚(GA)
15肽(SEQ ID NO:66)上之構形抗原決定基,亦即在先前結合不同抗聚-GA DPR抗體之後仍能夠結合聚-GA DPR聚集物(實例9及圖8);(ii) 結合至偶聯於BSA載體蛋白之聚-GA肽,其親和力與對應疏水塗覆之肽基本相同(實例3及4以及圖2及3);(iii)與不相關致澱粉樣蛋白基本上無交叉反應性或具有最小交叉反應性,至少在實例5中測試及在圖4中顯示之彼等者;(iv)能夠結合包含自C9orf72-FTLD患者小腦顆粒細胞層中之C9orf72基因轉譯之含DPR蛋白質之聚集物(實例11及圖10)。
如前所述,DPR蛋白聚集物在大腦額葉及顳葉中之積聚為神經退行性疾病FTLD之標誌。在小腦顆粒細胞層中之神經元細胞質包涵體、神經元核內包涵體及營養不良神經突中具有DPR聚集物之患者通常表現出改變之認知功能。特別地,FTLD患者表現出癡呆、行為以及人格之變化、語言功能障礙及/或精神病是由於額葉及顳葉皮層之退化,如上所述。因此,在一個實施例中,本發明之抗體或其DPR結合片段可用於治療與DPR相關之疾病及/或病症。在一較佳實施例中,本發明之抗體或其DPR結合片段可用於治療FTLD及其症狀。本發明之主題抗體或其DPR結合片段之治療效用可以在細胞檢定中驗證,例如背景技術部分中所述之彼等者(亦參見實例17),且視情況使得在向基因轉殖C9orf72小鼠模型投與時,抗體能夠改善C9orf72疾病之病理學標誌之至少一種症狀,例如神經元缺失、行為異常、運動缺陷及存活率降低(實例18)。
編碼上述可變區之對應核苷酸序列列出於下表2中。V
H及V
L鏈之胺基酸序列之示範性CDR組描繪於圖1A-F中之任一者中。因此,本發明提供了一類新穎抗DPR抗體,以一種抗體或其DPR結合片段舉例說明,該抗體在其可變區中包含
(i) 以下六個CDR:
(a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3(例如,包含SEQ ID NO:78)之VH-CDR1,
(b) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:13之VH-CDR2,
(c) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:5之VH-CDR3,
(d) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:8之VL-CDR1,
(e) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:9之VL-CDR2,
(f) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:10之VL-CDR3;
(ii) 以下六個CDR:
(a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3(例如,包含SEQ ID NO:78)之VH-CDR1,
(b) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:14之VH-CDR2,
(c) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:5之VH-CDR3,
(d) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:8之VL-CDR1,
(e) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:9之VL-CDR2,
(f) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:10之VL-CDR3;
(iii) 以下六個CDR:
(a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3(例如,包含SEQ ID NO:78)之VH-CDR1,
(b) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:19之VH-CDR2,
(c) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:5之VH-CDR3,
(d) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:8之VL-CDR1,
(e) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:9之VL-CDR2,
(f) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:10之VL-CDR3;或
(iv) 以下六個CDR:
(a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3(例如,包含SEQ ID NO:78)之VH-CDR1,
(b) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:22之VH-CDR2,
(c) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:5之VH-CDR3,
(d) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:8之VL-CDR1,
(e) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:9之VL-CDR2,
(f) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:10之VL-CDR3;
視情況地其中該抗體或DPR結合片段在其可變區中包含
(i) 如SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:24所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
(ii) 如SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:24所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
(iii) 如SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:24所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
(iv) 如SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:24所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
(v) 如SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:24所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
(vi) 如SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:7所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
(vii) 如SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:7所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
(viii) 如SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:7所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列;
(ix) 如SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:7所示之V
H及V
L鏈胺基酸序列。
然而,如上所述,熟習此項技藝者充分意識到如下事實:另外或另選地,在CDR2及CDR3之情況下,可以使用胺基酸序列與圖1A-F中之任一者所示之CDR相差一個、兩個或甚至更多個胺基酸之CDR。因此,在一個實施例中,提供了本發明之抗體、生物技術衍生物及變異體抗DPR抗體及其DPR片段,在其可變區中包含如圖1A-F中之任一者所示之CDR,其中一個多個、視情況不超過一或兩個CDR包含一或多個,視情況不超過兩個胺基酸取代;亦參見上文。
如實例中所示,VH-CDR2中之一或兩個胺基酸取代不影響原始抗體之結合親和力及特徵。分別關於CDR及可變重鏈及輕鏈胺基酸序列內之進一步或其它胺基酸取代,視情況例如根據最頻繁交換之胺基酸進行保守胺基酸取代,如Mirsky等人, Mol. Biol. Evol. 35 (2014), 806-819分析及描述;參見Mirsky等人之第813頁之圖6。在此情況下,對具有相似及不同結合特徵之其它人源抗-聚-GA DPR抗體之CDR之初步分析揭示了主題抗體之CDR內之某些位置且預期與VH-CDR2相似之胺基酸取代可能以同樣方式使抗體之獨特結合特性不受影響。CDR內較佳胺基酸取代之對應位置在圖1中以
粗體及
斜體表示,包括在VH-CDR2中僅以
粗體進行之彼等取代。
特別地,在VH-CDR1內,D可以經S取代,且/或S可以經T取代;在VH-CDR3內,V可以經E取代,T可以經S取代,且/或M可以經V取代;在VL-CDR1內,R可以經K取代,P可以經S取代,R可以經E取代,S可以經G取代,T可以經取代;在VL-CDR2內,S可以經A取代,且/或A可以經G取代;且在VL-CDR3中,G可以經A取代,L可以經I取代,且P可以經S取代,而S可以經P取代。如上所述,視情況選擇在Mirsky等人(2014),同上之圖6中所示之任一模型或視情況兩種模型LG及AB中屬於相同類別之胺基酸取代,其中LG模型對於保持胺基酸性質之傾向為較佳的,且其中視情況選擇胺基酸取代使得原始胺基酸之生理化學性質基本上得以保持,亦即疏水、極性或帶電荷性質,或例如,在進行兩或更多個胺基酸取代之情況下,它們相互補償以便一起提供表面之物理化學性質。
本文提供了抗DPR抗體或其片段,例如DPR Ab-1。DPR Ab-1之胺基酸序列資訊如表12所示。在一些實施例中,抗DPR抗體或其抗原結合片段結合至本文所述之DPR,例如染色體9開放閱讀框72(C9orf72)二肽重複(DPR)蛋白。在一些實施例中,DPR蛋白包含聚甘胺酸-丙胺酸(GA)重複,例如聚(GA)n重複,其中n為1、2、3、4、5、6或更大(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更大)。在一些實施例中,DPR蛋白包含聚(GA)n重複,其中n在6與15之間,包括6及15,例如,其中n為15。在實施例中,抗DPR抗體或其片段包含DPR Ab-1或其片段(例如,抗原結合片段)。在一些實施例中,表12中之斜體天冬醯胺殘基為糖基化的;在其它實施例中,表12中之斜體天冬醯胺殘基為未糖基化的。
表 12- DPR Ab-1 之胺基酸序列資訊
胺基酸序列 | SEQ ID NO: | |
具有信號肽之重鏈胺基酸序列(在一些實施例中,斜體天冬醯胺為糖基化的;在其它實施例中,斜體天冬醯胺為未糖基化的)(CDR用下劃線標出) | MGWSLILLFLVAVATRVLSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSNHAMHWVRQAPGKGLEWVA VISYDGENTYYADSIEGRFTISRDNFKNTLFLQMYSLTADDTAMYFCAR GGRRGHFTSYYLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 37 |
重鏈胺基酸序列(成熟,無信號肽)(CDR加下劃線) | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSNHAMHWVRQAPGKGLEWVA VISYDGENTYYADSIEGRFTISRDNFKNTLFLQMYSLTADDTAMYFCAR GGRRGHFTSYYLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 38 |
重鏈恆定域胺基酸序列 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 39 |
重鏈可變區胺基酸序列(CDR加下劃線) | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSNHAMHWVRQAPGKGLEWVA VISYDGENTYYADSIEGRFTISRDNFKNTLFLQMYSLTADDTAMYFCAR GGRRGHFTSYYLDYWGQGTLVTVSS | 40 |
具有信號肽之輕鏈胺基酸序列(CDR加下劃線) | MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQNIDKYLNWYQQIPGKAPKLLIY AASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFAIYYC QQSYSSFRTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 41 |
輕鏈胺基酸序列(成熟,無信號肽)(CDR加下劃線) | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQNIDKYLNWYQQIPGKAPKLLIY AASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFAIYYC QQSYSSFRTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 42 |
輕鏈恆定域胺基酸序列 | RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 43 |
輕鏈可變區胺基酸序列(CDR加下劃線) | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQNIDKYLNWYQQIPGKAPKLLIY AASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFAIYYC QQSYSSFRTFGQGTKLEIK | 44 |
重鏈CDR 1 | GFTFSNHAMH | 45 |
重鏈CDR 2 | VISYDGENTYYADSIEG | 46 |
重鏈CDR 3 | GGRRGHFTSYYLDY | 47 |
輕鏈CDR 1 | RASQNIDKYLN | 48 |
輕鏈CDR 2 | AASSLHS | 49 |
輕鏈CDR 3 | QQSYSSFRT | 50 |
在表12中,指示框架(FR)及互補決定區(CDR),其中CDR加下劃線。使用Kabat編號方案 (參閱http://www.bioinf.org.uk/abs/;Kabat等人, U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」 (1983),其在所提到之網路參考文獻中提及且在WO 2016/050822 A2第39及40頁之表1中給出,其以引用之方式併入本文)。除非另有說明,否則提及本發明之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物中特定胺基酸殘基位置之編號係根據Kabat編號系統,然而其該編號系統為理論上的且可能不同等地適用於本發明之各種抗體。例如,取決於第一CDR之位置,後續CDR可以在任一方向上移位。因此,在關於表12及/或序列表中之CDR指示之任何不經意之錯誤或不一致之情況下,基於本申請案之揭露內容,亦即抗體DPR Ab-1之可變重(VH)及可變輕(VL)鏈胺基酸序列,熟習此項技藝者很好地根據Kabat來判定正確CDR序列,該編號系統將用於定義要求保護之抗體及其DPR結合片段。
本文提供了包含抗DPR(例如,抗-C9ORF72 DPR)抗體或其片段(例如,其結合,例如,特異性地及/或以高親和力結合至聚-(GA)n重複序列,例如,本文所述之聚-(GA)n重複序列)之組成物,其中該抗DPR抗體或其片段包含:
(i) 重鏈,該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:37或38(或與SEQ ID NO:37或38至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列) 、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈包含長度不超過123個胺基酸之重鏈可變區胺基酸序列;
(ii) 包含重鏈恆定域之重鏈,該重鏈恆定域包含胺基酸序列SEQ ID NO:39(或與SEQ ID NO:39至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列) 、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈包含長度不超過123個胺基酸之重鏈可變區胺基酸序列;
(iii) 包含重鏈可變區之重鏈,該重鏈可變區包含SEQ ID NO:40 (或與SEQ ID NO:40至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列) 、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈包含長度不超過123個胺基酸之重鏈可變區胺基酸序列;
(iv) 重鏈可變區胺基酸序列,該重鏈可變區胺基酸序列包含SEQ ID NO:40(或與SEQ ID NO:40至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中重鏈可變區胺基酸序列長度不超過123個胺基酸;
(v) 輕鏈,該輕鏈包含SEQ ID NO:41或42(或與SEQ ID NO:41或42至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列) 、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中輕鏈胺基酸序列(例如,輕鏈成熟序列)之長度不超過214個胺基酸,且/或輕鏈包含長度不超過107個胺基酸之輕鏈可變區胺基酸序列;
(vi) 包含輕鏈恆定域之輕鏈,該輕鏈恆定域包含SEQ ID NO:43(或與SEQ ID NO:43至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中輕鏈胺基酸序列(例如,輕鏈成熟序列)之長度不超過214個胺基酸,且/或輕鏈包含長度不超過107個胺基酸之輕鏈可變區胺基酸序列;
(vii) 包含輕鏈可變區之輕鏈,該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:44(或與SEQ ID NO:44至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中輕鏈胺基酸序列(例如,輕鏈成熟序列)長度不超過214個胺基酸,且/或其中輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;
(viii) 輕鏈可變區胺基酸序列,該)輕鏈可變區胺基酸序列包含SEQ ID NO:44(或與SEQ ID NO:44至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;
(ix) 包含重鏈可變區之重鏈,該重鏈可變區包含CDR1胺基酸序列SEQ ID NO:45(或與SEQ ID NO:45至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列);CDR2胺基酸序列SEQ ID NO:46(或與SEQ ID NO:46至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),及CDR3胺基酸序列SEQ ID NO:47(或與SEQ ID NO:47至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
(x) 重鏈可變區,該重鏈可變區包含CDR1胺基酸序列SEQ ID NO:45(或與SEQ ID NO:45至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列);CDR2胺基酸序列SEQ ID NO:46(或與SEQ ID NO:46至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),及CDR3胺基酸序列SEQ ID NO:47(或與SEQ ID NO:47至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),
視情況地其中重鏈可變區胺基酸序列長度不超過123個胺基酸;
(xi) 包含輕鏈可變區之輕鏈,該輕鏈可變區包含CDR1胺基酸序列SEQ ID NO:48(或與SEQ ID NO:48至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、CDR2胺基酸序列SEQ ID NO:49(或與SEQ ID NO:49至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、及CDR3胺基酸序列SEQ ID NO:50(或與SEQ ID NO:50至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),
視情況地其中輕鏈胺基酸序列(例如,輕鏈成熟序列)長度不超過214個胺基酸,且/或輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;
(xii) 輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含CDR1胺基酸序列SEQ ID NO:48(或與SEQ ID NO:48至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、CDR2胺基酸序列SEQ ID NO:49(或與SEQ ID NO:49至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、及CDR3胺基酸序列SEQ ID NO:50(或與SEQ ID NO:50至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),
視情況地其中輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;及/或
(xiii) 重鏈及輕鏈,該輕鏈包含輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含CDR1胺基酸序列SEQ ID NO:48(或與SEQ ID NO:48至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、 CDR2胺基酸序列SEQ ID NO:49(或與SEQ ID NO:49至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、及CDR3胺基酸序列SEQ ID NO:50(或與SEQ ID NO:50至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈包含長度不超過123個胺基酸之可變區胺基酸序列,且/或視情況地其中輕鏈胺基酸序列之長度不超過214個胺基酸,且/或其中輕鏈可變區胺基酸序列之長度不超過107個胺基酸。
在一個實施例中,本文提供視情況連接至異源核酸之多核苷酸,其中(i)多核苷酸編碼具有本文所述VH-CDR之免疫球蛋白可變重鏈,且其中該免疫球蛋白可變重鏈當與包含表12中列出之胺基酸序列之免疫球蛋白可變輕鏈配對時,能夠 (例如,特異性地及/或以高親和力) 結合至本文所述之DPR(例如,聚-(GA)n),且/或(ii)該多核苷酸編碼具有本文所述VL-CDR之免疫球蛋白可變輕鏈,且其中該免疫球蛋白可變輕鏈當與包含表12中列出之胺基酸序列之免疫球蛋白可變重鏈配對時,能夠(例如,特異性地及/或以高親和力) 結合至本文所述之DPR(例如,聚-(GA)n)。
在一些態樣,本文提供了在N端包含信號肽之抗體或其片段。在一些實施例中,信號肽包含胺基酸序列MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO:59)或與SEQ ID NO:59至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。在其它實施例中,信號肽包含胺基酸序列MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC(SEQ ID NO:60)或與SEQ ID NO:60至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100 %相同之胺基酸序列。
在實施例中,其重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基。在實施例中,其重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸。
在實施例中,重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)長度不超過452個胺基酸(例如,長度為452個胺基酸)。在實施例中,重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基。在實施例中,重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸。在實施例中,重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸(例如,長度為123個胺基酸)。在實施例中,輕鏈胺基酸序列之長度不超過214個胺基酸(例如,長度為214個胺基酸)。在實施例中,輕鏈可變區胺基酸序列之長度不超過107個胺基酸(例如,長度為107個胺基酸)。
在一些實施例中,本文所述之抗體或其片段包含具有IgG1同型,例如人IgG1(hIgG1)同型之重鏈。在實施例中,重鏈包含異型G1m1,17。
在一些實施例中,本文所述之抗體或其片段包含具有κ同型,例如人κ同型之輕鏈。在實施例中,輕鏈包含異型Km3。
在一些實施例中,本文所述之抗體或其片段連接至藥物;或者用標籤可偵測地標記,該標籤例如酶、放射性同位素、螢光團、標記、重金屬及/或旗標。
本發明之抗體可為人源的,特別是用於治療應用。或者,本發明之抗體為齧齒動物抗體、齧齒動物化抗體或嵌合齧齒動物-人抗體,視情況為鼠抗體、鼠源化抗體或嵌合鼠-人抗體或大鼠抗體、大鼠化抗體或嵌合大鼠-人抗體,該抗體特別適用於診斷方法及動物研究。在一個實施例中,本發明之抗體為嵌合齧齒動物-人抗體或齧齒動物化抗體。
如上所述,本發明之抗體可以除完整抗體外之多種形式存在;包括例如Fv、Fab及F(ab)
2以及單鏈;參見例如國際申請案WO 88/09344。因此,在一個實施例中,提供了本發明之抗體,該抗體係選自由單鏈Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段及F(ab')
2片段組成之群。
本發明之抗體或其對應免疫球蛋白鏈可以使用此項技術中已知之習用技術進一步修飾,例如藉由單獨或組合使用胺基酸缺失、插入、取代、添加及/或重組及/或此項技術中已知之任何其它修飾進行修飾。用於根據免疫球蛋白鏈之胺基酸序列在DNA序列中引入此類修飾之方法為熟習此項技藝者公知的;參見,例如, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. 及Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)。本發明抗體之修飾包括在一或多個組成型胺基酸處之化學及/或酶促衍生,包括側鏈修飾、主鏈修飾及N-端及C-端修飾,包括乙醯化、羥基化、甲基化、醯胺化及碳水化合物或脂質部分之連接、輔因子及其類似修飾。同樣地,本發明包括嵌合蛋白之產生,該嵌合蛋白在胺基端包含所述抗體或其某些片段,該抗體或其片段在羧基端融合至異源分子例如免疫刺激配體;例如,參見國際申請案WO00/30680以獲得對應技術細節。
如一般熟悉此項技藝者已知的,本發明之抗體或其DPR結合片段、合成或生物技術變異體或衍生物可包含介導一或多種效應子功能之恆定區。舉例而言,補體之C1組件結合於抗體恆定區可活化補體系統。在細胞病原體之調理及溶解中,補體活化為重要的。補體活化亦刺激發炎性反應且亦可涉及自體免疫過敏性。此外,抗體經由Fc區結合於各種細胞上之受體,其中抗體Fc區上之Fc受體結合位點結合於細胞上之Fc受體(FcR)。存在許多對不同類抗體具有特異性之Fc受體,包括IgG (γ受體)、IgE (ε受體)、IgA (α受體)及IgM (μ受體)。抗體結合於細胞表面上之Fc受體引發許多重要且多樣之生物反應,包括由殺手細胞(稱為抗體依賴性細胞介導性細胞毒性或ADCC)吞噬及破壞抗體塗佈粒子、清除免疫複合物、溶解抗體塗佈目標細胞,釋放發炎性介體、胎盤轉移及控制免疫球蛋白產生。
因此,本發明之某些實施例包括抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物,其中一或多個恆定區域中之至少一部分已缺失或另外改變以便提供所要生物化學特徵,諸如當與具有大約相同免疫原性之完整未改變抗體相比時,效應功能減小、非共價二聚之能力、在DPR蛋白聚集及沉積之位點處定位之能力提高、血清半衰期減少或血清半衰期增加。舉例而言,用於本文所述之診斷及治療方法之某些抗體為域缺失抗體,其包含類似於免疫球蛋白重鏈之多肽鏈,但缺乏一或多個重鏈域之至少一部分。舉例而言,在某些抗體中,經修飾抗體之恆定區之一個完整域將會缺失,例如CH2域之全部或部分將會缺失。在其它實施例中,用於本文所述之診斷及治療方法之某些抗體具有恆定區,例如IgG重鏈恆定區,該恆定區經改變以消除糖基化,在本文別處稱為非糖基化或「無糖基化(agly)」抗體。此「無糖基化(agly)」抗體可以酶促製備,亦可以藉由對恆定區中之共同糖基化位點進行工程改造來製備。儘管不受理論約束,但咸信「無糖基化」抗體可具有經改良之活體內安全性及穩定性概況。產生具有所要效應功能之非糖基化抗體之方法例如在國際申請案WO2005/018572中找到,該申請案以引用之方式整體併入。
在本文所述之某些抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物中,可使用此項技術中已知之技術使Fc部分突變以降低效應功能。例如,恆定區域之缺失或失活(藉由點突變或其它方式)可以降低循環修飾抗體之Fc受體結合,從而增加DPR蛋白定位。在其它情況下,符合本發明之恆定區修飾可能使補體結合緩和,因此減少偶聯細胞毒素之血清半衰期及非特異性締合。然而,恆定區之其它修飾可用以修飾二硫鍵或寡糖部分,其因抗原特異性或抗體可撓性增大而允許局部化增強。修飾之所得生理學概況、生物可用性及其它生物化學作用(諸如DPR蛋白局部化、生物分佈及血清半衰期)可使用熟知免疫學技術在無不當實驗之情況下來輕易量測及定量。
在本文所述之某些抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物中,Fc部分可以突變或交換成替代蛋白質序列以增加抗體之細胞攝取,例如藉由經由Fcγ受體、LRP或Thy1受體來增強受體介導之抗體內吞作用或藉由據說可以使抗體穿梭進入活細胞而不會傷害該等細胞之『SuperAntibody技術』 (Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241)來進行。例如,可以使用在此項技術中已知之技術來工程改造抗體結合區與細胞表面受體之同源蛋白配體之融合蛋白或具有結合至DPR之特定序列以及細胞表面受體之雙特異性或多特異性抗體之產生。
在本文所述之某些抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物中,Fc部分可以突變或交換成替代蛋白質序列,或者抗體可以經化學修飾以增加其血腦屏障穿透性。
本發明之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物之修飾形式可以使用此項技術中已知之技術由完整前體或親本抗體製備。本文更詳細地論述了示範性技術。本發明之抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可以使用此項技術中已知之技術製備或製造。在某些實施例中,抗體分子或其片段為「重組產生」,亦即使用重組DNA技術產生。用於製備抗體分子或其片段之示範性技術在本文別處更詳細地論述。
本發明之抗體或其DPR結合片段、生物技術變異體或衍生物亦包括例如藉由將任何類型之分子共價連接至抗體使得共價連接不會阻止抗體特異性結合至其同源抗原決定基而經修飾之衍生物。例如但不限於,抗體衍生物包括已例如藉由糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、由已知保護基/阻隔基之衍生化、蛋白水解切割、連接至細胞配體或其它蛋白質等而經修飾之抗體。可以藉由已知技術進行許多化學修飾中之任一種,該等技術包括但不限於特定化學裂解、乙醯化、甲醯化、衣黴素之代謝合成等。另外,衍生物可含有一或多種非經典胺基酸。
識別特定抗原決定基之抗體片段可以藉由已知技術產生。舉例而言,Fab及F(ab')
2片段可以重組方式或藉由使用酶諸如木瓜蛋白酶(產生Fab片段)或胃蛋白酶(產生F(ab')
2片段)使免疫球蛋白分子發生蛋白水解裂解而產生。F(ab')
2片段含有重鏈之可變區、輕鏈恆定區及CH1域。此等片段足以用於例如免疫診斷程序,包括將免疫球蛋白之免疫特異性部分偶聯到偵測試劑如放射性同位素上。
本發明之抗體可以藉由此項技術中已知用於合成抗體之任何方法產生,特別是藉由化學合成或視情況地藉由如本文所述之重組表現技術產生。
在一個實施例中,本發明之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物包含合成恆定區,其中一或多個域為部分或完全缺失(「域缺失之抗體」)。在某些實施例中,相容性經修飾之抗體將包含域缺失之構築體或變異體,其中整個CH2域已經移除(ΔCH2構築體)。對於其它實施例,短連接肽可以取代缺失之域,以為可變區提供可撓性及運動自由度。熟習此項技藝者將理解,由於CH2域對抗體分解代謝速率之調節特性,此構築體為特別較佳的。可以使用編碼IgG
1人恆定域之載體來衍生域缺失之構築體,參見例如國際申請案WO 02/060955及WO 02/096948A2。工程改造該載體以缺失CH2域且提供表現域缺失之IgG
1恆定區之合成載體。
在某些實施例中,本發明之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物為微抗體。可以使用此項技術中描述之方法製備微抗體,參見例如美國專利5,837,821或國際申請案WO 94/09817。
在一個實施例中,本發明之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物包含具有少數或甚至單個胺基酸之缺失或取代之免疫球蛋白重鏈,只要其允許單體亞基之間之締合即可。例如,CH2域之選定區域中單個胺基酸之突變可足以顯著降低Fc結合,從而增加DPR蛋白定位。類似地,可能需要簡單地缺失一或多個恆定區域之控制待調節之效應功能(例如,補體結合)之彼部分。恆定區之此等部分缺失可以改善抗體之選定特徵(血清半衰期),同時保持與主題恆定區域相關之其它所需功能完整。此外,如上所述,所揭示之抗體之恆定區可以通過一或多個胺基酸之增強所要構築體之特徵之突變或取代而合成。在此方面,有可能破壞由保守性結合位點提供之活性(例如Fc結合),同時基本上保持經修飾抗體之構型及免疫原性概況。其它實施例包括向恆定區添加一或多個胺基酸以增強所需特徵(例如效應功能)或提供更多細胞毒素或碳水化合物連接。在此等實施例中,可能需要插入或複製衍生自選定恆定區域之特定序列。
III. 編碼本發明之抗體之多核苷酸
本發明亦係關於編碼上文第II部分中描述之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物中之任一者之一或多種多核苷酸。編碼抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物之多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸組成,改多核苷酸可以為未經修飾之RNA或DNA或經修飾之RNA或DNA。例如,編碼抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物之多核苷酸可由以下項組成:單鏈及雙鏈DNA、作為單鏈及雙鏈區域之混合物之DNA、單鏈及雙鏈RNA、及作為單鏈及雙鏈區域之混合物之RNA、包含可以為單鏈或更通常地為雙鏈或作為單鏈及雙鏈區域之混合物之DNA及RNA之雜合分子。另外,編碼抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物之多核苷酸可由包含RNA或DNA或RNA及DNA兩者之三鏈區組成。編碼抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物之多核苷酸亦可含有一或多個經修飾之鹼基或為了穩定性或其它原因而經修飾之DNA或RNA骨架。「經修飾之」鹼基包括例如三苯甲基化鹼基及不常見鹼基,例如肌苷。可對於RNA及DNA產生各種修飾;因而「多核苷酸」包括化學、酶促或代謝修飾形式。
編碼衍生自免疫球蛋白(例如,免疫球蛋白重鏈部分或輕鏈部分)之多肽之非天然變異體之經分離多核苷酸可以藉由在免疫球蛋白之核苷酸序列中引入一或多個核苷酸取代、添加或缺失,使得一或多個胺基酸取代、添加或缺失被引入經編碼蛋白質中而產生。突變可藉由標準技術,諸如定點誘變及PCR介導誘變來引入。視情況地,在一或多個非必需胺基酸殘基處進行保守性胺基酸取代。
眾所周知,RNA可以藉由標準技術自原始B細胞、雜交瘤細胞或其它轉型細胞中分離,該等標準技術例如異硫氰酸胍萃取及沉澱及隨後離心或層析。需要時,可以藉由標準技術例如寡聚dT纖維素上之層析法自總RNA中分離mRNA。合適技術為此項技術中熟悉的。在一個實施例中,編碼抗體之輕鏈及重鏈之cDNA可以根據熟知之方法使用反轉錄酶及DNA聚合酶同時或單獨製備。PCR可基於公開之重鏈及輕鏈DNA及胺基酸序列藉由共同恆定區引子或藉由更特異性引子來啟始。如上所論述,PCR亦可用於分離編碼抗體輕鏈及重鏈之DNA純系。在此情況下,可藉由共同引子或較大同源探針(諸如人恆定區探針)來篩檢文庫。
DNA通常為質體DNA,可以使用此項技術中已知之技術自細胞中分離,根據例如在關於重組DNA技術之前述參考文獻中詳細闡述之標準、熟知之技術進行限制性定位及測序。當然,根據本發明,DNA可以在分離過程或隨後分析過程中之任何時候點合成。在此情況下,本發明亦係關於至少編碼本發明抗體之免疫球蛋白鏈之結合域或可變區之多核苷酸。
在本發明之一較佳實施例中,多核苷酸包含具有如表2中所示之抗DPR抗體之V
H或V
L區之多核苷酸序列之核酸、基本上由其組成或由其組成。在此方面,熟習此項技藝者將容易理解,至少編碼輕鏈及/或重鏈之可變域之多核苷酸可編碼兩種免疫球蛋白鏈或僅一種鏈之可變域。因此,在一個實施例中,多核苷酸包含具有如表2中所示之抗DPR抗體及/或其片段之V
H及V
L區之多核苷酸序列之核酸、基本上由其組成或由其組成。
表 2 :識別聚-GA DPR,視情況C9orf72-(聚-GA)-DPR之抗體及抗體變異體之V
H及V
L區之核苷酸序列。
抗體 | 可變重鏈 (V H) 及可變輕鏈 (V L) 之核苷酸序列 |
NI-308.5J10 V H | caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacttacactgtcttaggtggctccgtcagtgattactactggagctgcatccggcagcccgccgggaagggactggagtggattgggcgaacatatactaacgggaagaccacttacacttacaacccctccctcgagagtcgactcagtttgtctatagacacgtccatgaaccaattctccctgaagttgacctctgtgacggccgcggacacggccgtctattactgcgcgagatggggggcggtgactggtgactactactacggtatggacgtctggggcccaggcaccctggtcaccgtctcctcg SEQ ID NO: 1 |
NI-308.5J10 V K | gaaattgtgctgactcagtctccactctccctgtccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctcctcggagccttctacatactaatggatatacatatttggactggtacctacaaaggccagggcagtctccacaactcctgatctttttggcttctaatcgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagcggatcaggcacaaattttacactgagaatcagcggagtggaggctgacgatgttggagtttattactgcatgcaaggtctacaaccttcgtggacgttcggccaggggaccaaggtggaaatcaaa SEQ ID NO: 6 |
NI-308.5J10 V H–N54S | Caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacttacactgtcttaggtggctccgtcagtgattactactggagctgcatccggcagcccgccgggaagggactggagtggattgggcgaacatatactagcgggaagaccacttacacttacaacccctccctcgagagtcgactcagtttgtctatagacacgtccatgaaccaattctccctgaagttgacctctgtgacggccgcggacacggccgtctattactgcgcgagatggggggcggtgactggtgactactactacggtatggacgtctggggcccaggcaccctggtcaccgtctcctcg SEQ ID NO: 11 |
NI-308.5J10 V H– N54T | CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACTTACACTGTCTTAGGTGGCTCCGTCAGTGATTACTACTGGAGCTGCATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGCGAACATATACTACCGGGAAGACCACTTACACTTACAACCCCTCCCTCGAGAGTCGACTCAGTTTGTCTATAGACACGTCCATGAACCAATTCTCCCTGAAGTTGACCTCTGTGACGGCCGCGGACACGGCCGTCTATTACTGCGCGAGATGGGGGGCGGTGACTGGTGACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCG SEQ ID NO: 14 |
NI-308.5J10 V H–G55S | CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACTTACACTGTCTTAGGTGGCTCCGTCAGTGATTACTACTGGAGCTGCATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGCGAACATATACTAACAGCAAGACCACTTACACTTACAACCCCTCCCTCGAGAGTCGACTCAGTTTGTCTATAGACACGTCCATGAACCAATTCTCCCTGAAGTTGACCTCTGTGACGGCCGCGGACACGGCCGTCTATTACTGCGCGAGATGGGGGGCGGTGACTGGTGACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCG SEQ ID NO: 17 |
NI-308.5J10 V H–G55T | CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACTTACACTGTCTTAGGTGGCTCCGTCAGTGATTACTACTGGAGCTGCATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGCGAACATATACTAACACCAAGACCACTTACACTTACAACCCCTCCCTCGAGAGTCGACTCAGTTTGTCTATAGACACGTCCATGAACCAATTCTCCCTGAAGTTGACCTCTGTGACGGCCGCGGACACGGCCGTCTATTACTGCGCGAGATGGGGGGCGGTGACTGGTGACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCG SEQ ID NO: 20 |
NI-308.5J10 V K–N75D | GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGTCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTCCTCGGAGCCTTCTACATACTAATGGATATACATATTTGGACTGGTACCTACAAAGGCCAGGGCAGTCTCCACAACTCCTGATCTTTTTGGCTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGCGGATCAGGCACAGACTTTACACTGAGAATCAGCGGAGTGGAGGCTGACGATGTTGGAGTTTATTACTGCATGCAAGGTCTACAACCTTCGTGGACGTTCGGCCAGGGGACCAAGGTGGAAATCAAA SEQ ID NO: 23 |
DPR Ab-1抗體或其片段之胺基酸序列可以由各種核苷酸序列編碼。例如,可以優化密碼子以最大化多肽之表現。編碼DPR Ab-1之一組示範性核苷酸序列顯示在下表13中。
表 13- 編碼 DPR Ab-1 之核苷酸序列
核苷酸序列 | SEQ ID NO: | |
具有信號肽之重鏈核苷酸序列 | ATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTGTTTCTTGTCGCTGTTGCTACGCGTGTCCTGTCGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTAGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTGTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAATCATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGCGAGAACACATATTATGCAGACTCCATTGAGGGCCGATTCACCATTTCCAGAGACAATTTCAAGAACACACTCTTTCTACAAATGTACAGCCTGACAGCTGATGACACGGCTATGTACTTCTGTGCGAGAGGGGGCCGTCGGGGGCACTTCACCTCATACTACCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCTAGTACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCCGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAGACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAAAAAAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGTTGA | 51 |
重鏈核苷酸序列(成熟,無信號肽) | CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTAGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTGTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAATCATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGCGAGAACACATATTATGCAGACTCCATTGAGGGCCGATTCACCATTTCCAGAGACAATTTCAAGAACACACTCTTTCTACAAATGTACAGCCTGACAGCTGATGACACGGCTATGTACTTCTGTGCGAGAGGGGGCCGTCGGGGGCACTTCACCTCATACTACCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCTAGTACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCCGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAGACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAAAAAAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGTTGA | 52 |
重鏈恆定域核苷酸序列 | GCTAGTACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCCGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAGACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAAAAAAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGTTGA | 53 |
重鏈可變區核苷酸序列 | CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTAGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTGTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAATCATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGCGAGAACACATATTATGCAGACTCCATTGAGGGCCGATTCACCATTTCCAGAGACAATTTCAAGAACACACTCTTTCTACAAATGTACAGCCTGACAGCTGATGACACGGCTATGTACTTCTGTGCGAGAGGGGGCCGTCGGGGGCACTTCACCTCATACTACCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG | 54 |
具有信號肽之輕鏈核苷酸序列 | ATGGACATGCGGGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTAGATGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGCCAGAACATAGACAAGTACTTAAATTGGTATCAGCAGATACCGGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCGAGTTTGCACAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCTCTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAATTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTTCCTTCCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA | 55 |
輕鏈核苷酸序列(成熟,無信號肽) | GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGCCAGAACATAGACAAGTACTTAAATTGGTATCAGCAGATACCGGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCGAGTTTGCACAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCTCTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAATTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTTCCTTCCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA | 56 |
輕鏈恆定域核苷酸序列 | CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA | 57 |
輕鏈可變區核苷酸序列 | GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGCCAGAACATAGACAAGTACTTAAATTGGTATCAGCAGATACCGGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCGAGTTTGCACAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCTCTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAATTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTTCCTTCCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGAGATCAAA | 58 |
本發明亦包括本發明多核苷酸之片段,如別處所述。此外,本發明亦考慮了編碼如本文所述之融合多核苷酸、Fab片段及其它生物技術衍生物之多核苷酸。
在一個實施例中,本發明係關於視情況連接至異源核酸之多核苷酸,其中(i)該多核苷酸編碼具有前述條款[1]至[10]中任一項所定義之VH-CDR之免疫球蛋白可變重鏈,且其中免疫球蛋白可變重鏈當與包含SEQ ID NO:7或24所示胺基酸序列之免疫球蛋白可變輕鏈配對時,顯示如實例中所述及前述條款[1]至[36]中任一項所述之主題抗體之結合特徵,且/或(ii)該多核苷酸編碼具有前述條款[1]至[10]中任一項所定義之VL-CDR之免疫球蛋白可變輕鏈,且其中免疫球蛋白可變輕鏈在與包含SEQ ID NO:2、12、15、18或21中任一項所示胺基酸序列之免疫球蛋白可變重鏈配對時,顯示如實例中所述及前述條款[1]至[36]中任一項所述之主題抗體之結合特徵。
此外,本發明係關於一或多種包含彼等多核苷酸中之一或多者之載體,視情況其中載體為表現載體,且一或多種多核苷酸可操作地連接至表現控制序列。此外,本發明係關於包含一或多種多核苷酸或本發明之一或多種載體之宿主細胞,以及一種產生抗-聚-(GA)-DPR抗體或其DPR結合片段之方法,該方法包含在允許表現抗DPR抗體或其DPR結合片段之條件下培養本發明之宿主細胞;及自培養物中分離該抗DPR抗體或其DPR結合片段。
可以藉由此項技術中已知之任何方法生產或製造多核苷酸。例如,若抗體之核苷酸序列為已知的,則編碼抗體之多核苷酸可以由化學合成之寡核苷酸組裝,例如,如在Kutmeier等人, BioTechniques 17 (1994), 242中所描述,簡言之,該文獻係關於合成含有編碼抗體之部分序列之重疊寡核苷酸、退火及連接彼等寡核苷酸,然後藉由PCR擴增經連接之寡核苷酸。
或者,可以自合適來源之核酸產生編碼抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物之多核苷酸。若含有編碼特定抗體之核酸之純系不可獲得,但抗體分子序列為已知的,則編碼抗體之核酸可經化學合成或藉由使用可雜交至序列之3’ 端及5’端之合成引子之PCR擴增或藉由使用寡核苷酸探針之選殖由合適之來源(例如,自表現DPR特異性抗體之任何組織或細胞,諸如經選擇來表現抗體之B細胞中產生之抗體cDNA文庫或cDNA文庫或由其中分離之核酸,較佳為聚A
+RNA)獲得,該寡核苷酸探針對於特定基因序列具有特異性以便識別例如來自編碼該抗體之cDNA文庫之cDNA純系。隨後,藉由PCR生成之擴增核酸可使用此項技術中熟知之任何方法選殖至可複製選殖載體中。
一旦判定了抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物之核苷酸序列及對應胺基酸序列,就可以使用此項技術中熟知之用於操縱核苷酸序列之方法操縱其核苷酸序列,例如重組DNA技術、定點誘變、PCR等(參見例如Sambrook等人, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) 及Ausubel等人編, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998)中描述之技術,此等文獻皆以引用之方式整體併入本文),以產生具有不同胺基酸序列之抗體,例如以產生胺基酸取代、缺失及/或插入。
IV. 本發明之抗體多肽之表現
在操縱經分離遺傳物質以提供本發明之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物後,通常將編碼抗體之多核苷酸插入表現載體中以便引入可用以產生所要量之抗體之宿主細胞中。本文描述了結合至靶標分子之抗體或其片段、衍生物或類似物(例如抗體之重鏈或輕鏈)之重組表現。一旦獲得了編碼本發明之抗體分子或抗體之重鏈或輕鏈或其部分(視情況含有重鏈或輕鏈可變域)之多核苷酸,用於產生抗體分子之載體即可以使用此項技術中熟知之技術藉由重組DNA技術產生。因此,本文描述了用於藉由表現含有編碼抗體之核苷酸序列之多核苷酸來製備蛋白質之方法。可以使用熟習此項技藝者熟知之方法構建含有抗體編碼序列及適當轉錄及轉譯控制信號之表現載體。此等方法包括例如活體外重組DNA技術、合成技術及活體內基因重組。因此,本發明提供了可複製載體,該等載體包含編碼本發明之抗體分子、或其重鏈或輕鏈、或重鏈或輕鏈可變域、可操作地連接至啟動子之核苷酸序列。此類載體可包括編碼抗體分子恆定區之核苷酸序列(參見例如國際申請案WO 86/05807及WO 89/01036;及美國專利第5,122,464號),且可以將抗體之可變域選殖到此載體中用於表現整個重鏈或輕鏈。
本文所用之術語「載體」或「表現載體」意指根據本發明用作用於引入細胞中且在該細胞中表現所要基因之媒介物之載體。如熟習此項技藝者已知,此等載體可輕易選自由質體、噬菌體、病毒及反轉錄病毒組成之群。一般而言,與本發明相容之載體將包含選擇標記、適當限制位點,以便有助於對所要基因之選殖及進入真核細胞或原核細胞中及/或在其中進行複製之能力。出於本發明之目的,可採用眾多表現載體系統。舉例而言,一個種類之載體利用源自動物病毒之DNA元件,該等動物病毒諸如為牛乳突狀瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘瘡病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其它表現載體涉及使用具有內部核糖體結合位點的多順反子系統。另外,可藉由引入一或多個允許選擇經轉染宿主細胞之標記來選擇已將DNA整合於其染色體中之細胞。標記可提供營養缺陷宿主之原養型、殺生物劑抗性(例如抗生素)或抗重金屬(諸如銅)性。可選標記基因可直接連接至待表現DNA序列,或藉由共轉型引入相同細胞中。亦可能需要其它元件來最佳合成mRNA。此等元件可包括信號序列、剪接信號、以及轉錄啟動子、增強子及終止信號。
在尤其較佳實施例中,將經選殖之可變區基因連同如以上所討論之重鏈及輕鏈恆定區基因(較佳為人類)插入表現載體中。在一個實施例中,此使用Biogens,Inc.之專有表現載體(稱為NEOSPLA且在美國專利第6,159,730號中揭示)實現。該載體含有細胞巨大病毒啟動子/增強子、小鼠β球蛋白主要啟動子、SV40複製起點、牛生長激素聚腺苷酸化序列、新黴素磷酸轉移酶外顯子1及外顯子2、二氫葉酸還原酶基因及前導序列。已發現,該載體在併入可變區及恆定區基因、在CHO細胞中轉染隨後在含G418之培養基中選擇並進行甲胺喋呤擴增後以極高水準表現抗體。當然,任何能夠在真核細胞中引發表現之表現載體皆可以用於本發明。合適載體之實例包括但不限於質體pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1及pZeoSV2 (可自Invitrogen, San Diego, CA獲得)、及質體pCI (可自Promega, Madison, WI獲得)。通常,針對表現適當高水準之免疫球蛋白重鏈及輕鏈之細胞篩選大量轉型細胞為習用實驗,該等實驗例如可以藉由機器人系統進行。載體系統亦在美國專利第5,736,137號及第5,658,570號中教示,該等專利各自均以引用之方式整體併入本文。此系統提供高表現水準,例如> 30 pg/細胞/日。其它示範性載體系統揭示於例如美國專利第6,413,777號中。
在其它較佳實施例中,本發明之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物可以使用多順反子構築體表現,例如美國專利申請公佈第2003-0157641 A1號中揭示之彼等構築體且該專利之全部內容併入本文。在此等表現系統中,諸如抗體之重鏈及輕鏈之相關多基因產物可自單一多順反子構築體製得。此等系統有利地使用內部核糖體入口位點(IRES)以提供相對較高水準之抗體。相容性IRES序列揭示於美國專利第6,193,980號,該專利亦併入本文中。熟習此項技藝者應瞭解,此等表現系統可用以有效製得本申請案中揭示之整套抗體。因此,在一個實施例中,本發明提供了載體,其包含編碼至少抗體之免疫球蛋白鏈之結合域或可變區之多核苷酸,該多核苷酸視情況與編碼該結合分子之另一免疫球蛋白鏈之可變區之多核苷酸組合。
更一般而言,一旦製備出編碼抗體之單體亞基之載體或DNA序列,即可將該表現載體引入適當宿主細胞中。可以藉由熟習此項技藝者熟知之各種技術將質體導入宿主細胞。此等技術包括但不限於轉染,包括使用例如Fugene®或lipofectamine之脂質轉染、原生質體融合、磷酸鈣沉澱、與包膜DNA之細胞融合、顯微注射及完整病毒感染之注射。通常,質體藉由標準磷酸鈣共沉澱方法引入宿主中。使具有表現構築體之宿主細胞在適於產生輕鏈及重鏈之條件下生長,且檢定重鏈及/或輕鏈蛋白質合成。示範性檢定技術包括酶聯結免疫吸附劑檢定(ELISA)、放射免疫檢定(RIA)或螢光活化細胞分選器分析(FACS)、免疫組織化學及其類似技術。
藉由習用技術將表現載體轉移至宿主細胞,然後藉由習用技術培養經轉染之細胞以產生用於本文所述方法之抗體。因此,本發明包括宿主細胞,其包含編碼本發明之抗體、或其重鏈或輕鏈、或至少其免疫球蛋白之結合域或可變區之多核苷酸,其視情況可操作地連接至異源啟動子。另外或另選地,本發明亦包括宿主細胞,其包含如上文所定義之載體,該載體包含編碼至少抗體之免疫球蛋白鏈之結合域或可變區之多核苷酸,該多核苷酸視情況與編碼該結合分子之另一個免疫球蛋白鏈之可變區之多核苷酸組合。在較佳實施例中,為了表現雙鏈抗體,編碼重鏈及輕鏈兩者之單一載體或多個載體可在宿主細胞中共表現以便表現整個免疫球蛋白分子,如下詳述。
宿主細胞可用兩種本發明之表現載體共轉染,第一載體編碼重鏈源性多肽且第二載體編碼輕鏈源性多肽。該兩種載體可含有相同可選標記,該等標記使得能夠相等表現重鏈及輕鏈多肽。或者,可使用編碼重鏈及輕鏈多肽之單一載體。在此等情況下,輕鏈有利地放置在重鏈之前,以避免過量無毒重鏈;參見Proudfoot, Nature 322 (1986), 52;Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 2197。用於該等重鏈及輕鏈之編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。
如本文所用,「宿主細胞」係指包含使用重組DNA技術構建且編碼至少一種異源基因之載體之細胞。在自重組宿主分離抗體之方法之描述中,除非另外明確規定,否則術語「細胞」與「細胞培養物」可互換使用以表示抗體來源。換言之,自「細胞」回收多肽可意指自短暫離心之全細胞或自含有培養基與懸浮細胞之細胞培養物回收。
多種宿主表現載體系統可用於表現用於本文所述方法之抗體分子。該等宿主-表現系統表示可用於產生相關編碼序列且隨後進行純化之媒介物,而且表示當用適當核苷酸編碼序列轉型或轉染時可原位表現本發明抗體分子之細胞。此等宿主表現系統包括但不限於微生物,諸如經含有抗體編碼序列之重組噬菌體DNA、質體DNA或黏接質體DNA表現載體轉型之細菌(例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌);經含有抗體編碼序列之重組酵母表現載體轉型之酵母(例如酵母菌、畢赤酵母);經含有抗體編碼序列之重組病毒表現載體(例如桿狀病毒)感染之昆蟲細胞系統;經重組病毒表現載體(例如花椰菜嵌紋病毒CaMV;菸草嵌紋病毒TMV)感染或經含有抗體編碼序列之重組質體表現載體(例如Ti質體)轉型之植物細胞系統;或具有重組表現構築體之哺乳動物細胞系統(例如COS、CHO、NSO、BLK、293、3T3細胞),該等構築體含有源於哺乳動物細胞之基因組之啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或源於哺乳動物病毒之啟動子(例如腺病毒晚期啟動子;牛痘病毒7.5K啟動子)。視情況,尤其用於表現完整重組抗體分子之細菌細胞諸如大腸桿菌或視情況真核細胞用於表現重組抗體分子。例如,哺乳動物細胞諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,連同載體諸如來自人類細胞巨大病毒之主要中間早期基因啟動子元件為抗體之有效表現系統;參見,例如Foecking等人, Gene 45 (1986), 101;Cockett等人, Bio/Technology 8 (1990), 2。
用於蛋白質表現之宿主細胞株通常為哺乳動物起源;咸信熟習此項技藝者有能力優先判定最適於在其中表現所要基因產物之特定宿主細胞株。示範性宿主細胞株包括但不限於CHO(中國倉鼠卵巢)、DG44及DUXB11(中國倉鼠卵巢株,DHFR-)、HELA(人宮頸癌)、CVI(猴腎株)、COS(CVI與SV40 T抗原之衍生物)、VERY、BHK(幼倉鼠腎)、MDCK、WI38、R1610(中國倉鼠纖維母細胞)BALBC/3T3(小鼠纖維母細胞)、HAK(倉鼠腎臟株)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛內皮細胞)、RAJI(人淋巴細胞)及293(人腎)。CHO及293細胞為特別較佳的。宿主細胞株通常可自商業服務、美國組織培養收藏中心(American Tissue Culture Collection)或自公開文獻得到。
此外,可選擇宿主細胞株,其調節經插入序列之表現或以所要之特定方式修飾及加工基因產物。蛋白產物之該等修飾(例如糖基化)及加工(例如裂解)對於蛋白之功能可至關重要。不同宿主細胞具有關於蛋白及基因產物之轉譯後加工及修飾之特有且特定機制。可選擇適當細胞株或宿主系統以確保所表現之外來蛋白的正確修飾及加工。為此,可使用具有用於原始轉錄物之適當加工、基因產物之糖基化及磷酸化之細胞機構的真核宿主細胞。
關於重組蛋白之長期、高產率產生,穩定表現為較佳的。例如,穩定地表現抗體分子之細胞株可經工程改造。與其使用含有病毒複製起點之表現載體,宿主細胞可經藉由適當表現控制元件(例如啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)控制之DNA及可選標記轉型。在引入外來DNA後,可使經工程改造之細胞在富集培養基中生長持續1-2天,且接著轉換至選擇培養基。重組質體中之可選標記賦予選擇抗性且允許細胞將該質體穩定整合至其染色體中且生長以形成焦點,該等焦點又可經選殖且擴增至細胞株中。此方法可有利地用於工程改造穩定表現抗體分子之細胞株。
可以使用許多選擇系統,包括但不限於單純皰疹病毒胸苷激酶 (Wigler等人, Cell 11 (1977), 223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶 (Szybalska及Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1992), 202),且腺嘌呤磷酸核糖轉移酶 (Lowy等人, Cell 22 (1980), 817) 基因可分別用於tk-、hgprt-或aprt-細胞中。此外,抗代謝物性可用作以下基因之選擇基礎:dhfr,其賦予對甲胺蝶呤之抗性 (Wigler等人, Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 357;O'Hare等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527);gpt,其賦予對黴酚酸之抗性 (Mulligan及Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072);neo,其賦予對胺基糖苷類G-418之抗性 Goldspiel等人, Clinical Pharmacy 12 (1993), 488-505;Wu及Wu, Biotherapy 3 (1991), 87-95;Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993), 573-596;Mulligan, Science 260 (1993), 926-932;及Morgan及Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993), 191-217;TIB TECH 11 (1993), 155-215;及hygro,其賦予對潮黴素之抗性 (Santerre等人, Gene 30 (1984), 147。可以使用之重組DNA技術領域中公知之方法描述於Ausubel等人(編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993);Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990);及第12章及第13章,Dracopoli等人(編), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994);Colberre-Garapin等人, J. Mol. Biol. 150:1 (1981),該等文獻之全部內容以引用之方式併入本文。
抗體分子之表現水準可藉由載體擴增來增加,關於回顧;參見Bebbington及Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, 第3卷(1987)。當表現抗體之載體系統中之標記可擴增時,存在於宿主細胞培養物中之抑制劑的水準之增加將增加標記基因之複本的數目。由於經擴增之區域與抗體基因相關,抗體之產生亦將增加;參見Crouse等人, Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 257。
活體外產生允許按比例擴大以得到大量所要多肽。用於在組織培養條件下培養哺乳動物細胞之技術在此項技術中為已知的,且包括均勻懸浮培養,例如在氣升式反應器中或在連續攪拌反應器中的均勻懸浮培養;或固定或截留細胞培養,例如在中空纖維、微囊中、在瓊脂糖微珠或陶瓷匣筒上之培養。若必要及/或需要,可以藉由習用層析方法純化多肽溶液,該等方法例如凝膠過濾、離子交換層析、經DEAE-纖維素之層析或(免疫)親和層析,例如,在合成鉸鏈區多肽之優先生物合成後或在本文所述之HIC層析步驟之前或之後。
編碼本發明之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物之基因亦可以在非哺乳動物細胞,例如細菌或昆蟲或酵母或植物細胞中表現。容易吸收核酸之細菌包括以下項之成員:腸桿菌科,例如大腸桿菌或沙門氏菌之菌株;芽孢桿菌科,諸如枯草芽孢桿菌;肺炎球菌;鏈球菌及流感嗜血桿菌。另外,應理解,當在細菌中表現時,異源多肽通常變為包涵體之一部分。異源多肽必須經分離、純化且接著組裝入功能分子中。當需要四價形式之抗體時,亞基將接著自組裝成四價抗體;參見例如國際申請案WO 02/096948。
在細菌系統中,表現載體之數目可取決於所表現抗體分子之預定用途來有利地選擇。例如,當欲產生大量該蛋白時,關於抗體分子之醫藥組成物的產生,可需要指導高水準的容易經純化之融合蛋白產物之表現的載體。此類載體包括但不限於大腸桿菌表現載體pUR278 (Ruther等人, EMBO J. 2 (1983), 1791),其中抗體編碼序列可以與lacZ編碼區一起單獨連接到載體中,從而產生融合蛋白;pIN載體 (Inouye及Inouye, Nucleic Acids Res. 13 (1985), 3101-3109;Van Heeke及Schuster, J. Biol. Chem. 24 (1989), 5503-5509);及其類似載體。pGEX載體亦可用於將外來多肽表現為與麩胱甘肽S-轉移酶(GST)之融合蛋白。通常,此等融合蛋白為可溶的且可藉由吸附並結合至基質麩胱甘肽瓊脂糖珠粒,隨後在自由麩胱甘肽存在下溶離來由裂解細胞中容易地純化。該等pGEX載體經設計以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位點,使得經選殖之靶標基因產物可自GST部分釋放。
除原核生物外,亦可使用真核微生物。啤酒酵母菌(
Saccharomyces cerevisiae)或常見焙用酵母(baker's yeast)在真核微生物中為最常用的,但通常可用許多其它菌株,例如畢赤酵母(
Pichia pastoris)。為在酵母菌中表現,常用例如質體YRp7 (Stinchcomb等人, Nature, 282 (1979), 39;Kingsman等人, Gene 7 (1979), 141;Tschemper等人, Gene 10 (1980), 157)。此質體已含有TRP1基因,該基因為缺乏在色胺酸中生長之能力之酵母突變株(例如ATCC編號44076或PEP4-1)提供選擇標記(Jones, Genetics 85 (1977), 12)。作為酵母宿主細胞基因組之一特徵的trpl損傷之存在則提供用於偵測藉由在色胺酸不存在下之生長所進行之轉型的有效環境。
在昆蟲系統中,苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)通常用作載體以表現外來基因。該病毒在草地貪夜蛾細胞中生長。抗體編碼序列可個別地選殖入病毒之非必要區域(例如多角體基因)中且置於AcNPV啟動子(例如多角體啟動子)之控制下。
一旦重組表現本發明之抗體分子,即可以根據此項技術之標準程序純化本發明之完整抗體、其二聚體、個別輕鏈及重鏈或其它免疫球蛋白形式,包括例如藉由層析法(例如,離子交換、親和力(特別是藉由蛋白A後特異性抗原之親和力)、及篩分柱層析)、離心、差異溶解度(例如硫酸銨沉澱)、或藉由用於純化蛋白質之任何其它標準技術;參見,例如Scopes, 「Protein Purification」, Springer Verlag, N.Y. (1982)。或者,在美國專利公佈2002-0123057 A1中揭示了用於增加本發明抗體之親和力之較佳方法。因此,在一個實施例中,本發明亦提供了用於製備抗DPR抗體或識別經突變及/或經聚集C9orf72-DPR物質之抗體及/或其片段或其免疫球蛋白鏈之方法,該方法包含:
(a) 培養如上文所定義之宿主細胞,該細胞包含如上文所定義之多核苷酸或載體;及
(b) 自培養物中分離該抗體或其免疫球蛋白鏈。
此外,本發明亦係關於抗體或其免疫球蛋白鏈,其由上文定義之多核苷酸編碼,或者可藉由用於製備抗DPR抗體或識別突變及/或經聚集C9orf72-DPR物質之抗體及/或其片段或其免疫球蛋白鏈之方法獲得。
V. 本發明之融合蛋白及偶聯物
在某些實施例中,抗體多肽包含通常不與抗體締合之胺基酸序列或一或多個部分。以下更詳細地描述示範性修飾。例如,本發明之單鏈Fv抗體片段可以包含可撓性接頭序列,或者可以經修飾以添加功能部分(例如,PEG、藥物、毒素或標記,例如螢光、放射性、酶、核磁、重金屬及其類似標記)。
本發明之抗體多肽可包含融合蛋白、基本上由其組成或由其組成。融合蛋白為嵌合分子,其包含例如具有至少一個靶標結合位點之免疫球蛋白DPR結合域、及至少一個異源部分,亦即其本質上在天然情況下不連接之部分。胺基酸序列通常可以存在於單獨蛋白質中,該等單獨蛋白質一起聚集在融合多肽中,或者它們通常可以存在於同一蛋白質中,但是在融合多肽中以新的排列方式存在。融合蛋白可例如藉由化學合成或藉由產生並轉譯肽區以所要關係編碼之多核苷酸來產生。
如應用於多核苷酸或多肽之術語「異源」意指該多核苷酸或多肽源於與其所比較之其餘實體不同之實體。例如,如本文所用,欲與抗體或其抗原結合片段、變異體或類似物融合之「異源多肽」衍生自相同物質之非免疫球蛋白多肽或不同物質之免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
如本文別處更詳細論述,本發明之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物可進一步與異源多肽在N端或C端重組融合或與多肽或其它組成化學偶聯(包括共價及非共價偶聯)。例如,抗體可以重組融合或偶聯至可用作偵測檢定中之標記之分子及效應分子,例如異源多肽、藥物、放射性核素或毒素;參見例如國際申請案WO 92/08495;WO 91/14438;WO 89/12624;美國專利第5,314,995號;及歐洲專利申請案EP 0 396 387。
本發明之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物可以由藉由肽鍵或經修飾肽鍵彼此連接之胺基酸組成,亦即肽等排物,且可以含有除20種經基因編碼胺基酸之外之胺基酸。抗體可以藉由天然過程(例如轉譯後加工)修飾或藉由此項技術中熟知之化學修飾技術修飾。此等修飾在基礎教科書及更詳細之專著以及大量研究文獻中得到充分描述。修飾可以發生在抗體中之任何位置,包括肽骨架、胺基酸側鏈及胺基端或羧基端、或在諸如碳水化合物之部分上。應當理解,相同類型之修飾可以在給定抗體之若干位點處以相同或不同程度存在。而且,給定抗體可包含許多類型之修飾。抗體可以為分支的,例如,由於泛素化之結果,且它們可以為環狀的,有或無支化。環狀、分支及分支環狀抗體可以由轉譯後天然過程產生,或者可以藉由合成方法產生。修飾包括乙醯化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、黃素之共價連接、血基質部分之共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物之共價連接、脂質或脂質衍生物之共價連接、磷脂醯肌醇之共價連接、交聯 、環化、二硫鍵形成、去甲基化、共價交聯之形成、半胱胺酸之形成、焦麩胺酸之形成、甲醯化、γ-羧化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻醯化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒醯化、硫酸化、轉移-RNA介導之胺基酸添加到蛋白質(諸如精胺酸化)、及泛素化;參見例如, Proteins-Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 第2版, (1993);Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson編, Academic Press, New York, (1983) 1-12;Seifter等人, Meth. Enzymol. 182 (1990), 626-646;Rattan等人, Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992), 48-62)。
如本文其它地方所論述的,本發明之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物可以與異源多肽融合以增加多肽之活體內半衰期或用於使用此項技術中已知之方法之免疫檢定。例如,在一個實施例中,PEG可以與本發明之抗體偶聯以增加其活體內半衰期;參見例如Leong等人, Cytokine 16 (2001), 106-119;Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531;或Weir等人, Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512。
此外,本發明之抗體或其DPR結合片段、合成變異體或生物技術衍生物可以與標記序列(例如肽)融合以促進其純化或偵測。在較佳實施例中,標記胺基酸序列為六組胺酸肽(HIS) (SEQ ID NO: 84),諸如為在pQE載體中提供之標籤(QIAGEN公司, 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311)及其它標籤,其中許多為市售的。如Gentz等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 821-824中所述,舉例而言,六組胺酸為融合蛋白提供便利純化。可用於純化之其它肽標籤包括但不限於「HA」標籤,其對應於源自流感血凝素蛋白之抗原決定基(Wilson等人, Cell 37 (1984), 767)、GST、c-myc及「旗標」標籤;參見例如Bill Brizzard, BioTechniques 44 (2008) 693-695以獲得抗原決定基標記技術之回顧,且其中第694頁上之表1列出了本發明中可用之最常見抗原決定基標籤,該等文獻之主題以引用之方式明確地併入本文。
可以使用此項技術中熟知之方法製備融合蛋白;例如,參見美國專利第5,116,964號及第5,225,538號。可以憑經驗選擇進行融合之精確位點以優化融合蛋白之分泌或結合特徵。然後將編碼融合蛋白之DNA轉染到宿主細胞中以便進行表現,其如上文所述進行。
本發明之抗體可以非偶聯形式使用或可與多種分子中至少一者偶聯,例如以改良分子之治療性質、以有助於目標偵測、或用於患者之造影或療法。當進行純化時,可以在純化之前或之後標記或偶聯本發明之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物。特定言之,本發明之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物可與治療劑、前藥、肽、蛋白質、酶、病毒、脂質、生物反應修飾藥、醫藥劑或PEG偶聯。
熟習此項技藝者將理解,取決於待偶聯之所選試劑,亦可使用多種技術組裝偶聯物。例如,具有生物素之偶聯物例如藉由使DPR結合多肽與生物素之活化酯諸如生物素N-羥基琥珀醯亞胺酯反應來製備。類似地,具有螢光標記之偶聯物可以在偶合劑(例如本文列出之彼等偶合劑)存在下製備,或藉由與異硫氰酸酯(視情況為異硫氰酸螢光素)反應來製備。以類似方式製備本發明之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物之偶聯物。
本發明進一步包括與診斷劑或治療劑偶聯之本發明之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物。抗體可以在診斷上用於例如證明存在DPR以指示患上與DPR相關,視情況地與形成DPR之突變C9orf72,亦即C9orf72-DPR相關之疾病或病症之風險,以監測此疾病之發展或進展,亦即顯示DPR或其聚集形式之出現或與其相關之疾病,或作為臨床測試程序之一部分,例如判定給定治療及/或預防方案之功效。因此,在一個實施例中,本發明係關於可偵測地經標記之抗體。此外,在一個實施例中,本發明係關於連接至藥物之抗體。可以藉由將抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物偶聯至可偵測物質來促進偵測。可偵測物質或標籤通常可以是酶;重金屬,視情況為金;染料,視情況為螢光或發光染料;或放射性標籤。可偵測物質之實例包括各種酶、輔成基、螢光材料、發光材料、生物發光材料、放射性材料、使用各種正電子發射斷層攝影術之正電子發射金屬、及非放射性順磁金屬離子;關於可與抗體偶聯以用作根據本發明之診斷劑之金屬離子,參見例如美國專利第4,741,900號。適合酶之實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶;適合輔成基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素;適合螢光物質之實例包括繖酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、玫瑰紅 (rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素;發光物質之實例包括流明諾(luminol);生物發光物質之實例包括螢光素酶、螢光素及水母發光蛋白(aequorin);且適合放射性物質之實例包括
125I、
131I、
111In或
99Tc。因此,在一個實施例中,本發明提供經可偵測標記之抗體,其中可偵測標籤係選自由酶、放射性同位素、螢光團及重金屬組成之群。
抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物亦可藉由將其偶聯至化學發光化合物而經可偵測地標記。然後藉由偵測化學反應過程中產生之發光之存在來判定經化學發光標記之抗體之存在。特別有用之化學發光標記化合物之實例為流明諾、異流明諾、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶鹽及草酸酯。
可以可偵測地標記抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物之方式之一為藉由將其連接至酶且在酶免疫檢定(EIA)中使用經連接產物 (Voller, A., 「The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)」 Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7);Voller等人, J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520;Butler, Meth. Enzymol. 73 (1981), 482-523;Maggio, (編), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980);Ishikawa,等人, (編), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981)。結合至抗體之酶將以一種方式與合適受質(視情況為生色受質)反應,以產生可以例如藉由分光光度法、螢光測定法或藉由視覺手段偵測之化學部分。可用於可偵測地標記抗體之酶包括但不限於蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-甾體異構酶、酵母醇脫氫酶、α-甘油磷酸酯、脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、天冬醯胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖澱粉酶及乙醯膽鹼酯酶。另外,可以藉由比色方法完成偵測,該方法使用酶之生色受質。亦可以藉由與類似製備之標準品相比,目測比較受質之酶促反應程度來完成偵測。
亦可以使用多種其它免疫檢定中之任一種免疫檢定來完成偵測。例如,藉由放射性標記抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物,可以通過使用放射免疫檢定法(RIA)偵測抗體(參見例如Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (March, 1986)),該文獻以引用之方式併入本文)。放射性同位素可以藉由包括但不限於γ計數器、閃爍計數器或自動放射攝影術之手段來偵測。
亦可以使用螢光發射金屬如
152Eu或其它鑭系元素可偵測地標記抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物。可以使用諸如二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)之金屬螯合基團將此等金屬連接到抗體上。
用於將各種部分與抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物偶聯之技術為熟知的,參見例如Arnon等人, 「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld等人 (編), 第243-56頁 (Alan R. Liss, Inc. (1985);Hellstrom等人, 「Antibodies For Drug Delivery」, Controlled Drug Delivery (第2版), Robinson等人 (編), Marcel Dekker, Inc., (1987) 623-53;Thorpe, 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」, Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera等人 (編), (1985) 475-506;「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」, Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin等人 (編), Academic Press (1985) 303-16,及Thorpe等人, 「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」, Immunol. Rev. 62 (1982), 119-158。
如上所述,在某些實施例中,可以將增強結合分子(例如結合多肽,例如抗體或其免疫特異性片段)之穩定性或功效之部分加以偶聯。舉例而言,在一實施例中,PEG可與本發明之結合分子偶聯以增加其活體內半衰期。Leong等人, Cytokine 16 (2001), 106;Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531;或Weir等人, Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512。
VI. 本發明之組成物及使用方法
本發明係關於組成物,其包含本發明之上述DPR結合分子,例如抗體或其DPR結合片段、變異體或生物技術衍生物,或如上文中定義之本發明之多核苷酸、載體或細胞。在一個實施例中,本發明之組成物為醫藥組成物,且進一步包含醫藥學上可接受之載劑。此外,取決於醫藥組成物之預期用途,本發明之醫藥組成物可包含其它藥劑,例如白介素或干擾素。為了用於治療顯示DPR或其聚集形式(尤其C9orf72-DPR)之出現或與其相關之疾病或病症,例如FTLD,其它藥劑可係選自由小有機分子、抗-DPR抗體及其組合組成之群。因此,在一特別較佳實施例中,本發明係關於本發明之DPR結合分子(例如本發明之抗體或其DPR結合片段或具有與其任一者基本相同之結合特異性之結合分子)、多核苷酸、載體或細胞,用於製備用以預防性及治療性治療與DPR蛋白相關之疾病或病症、監測與DPR蛋白及/或經聚集C9orf72相關之疾病或病症之進展或受試者中之對DPR治療之反應或用以判定受試者患上與DPR蛋白及/或經聚集C9orf72-DPR相關之疾病或病症之風險之醫藥或診斷組成物之用途。
因此,在一個實施例中,本發明係關於治療特徵在於DPR及DPR蛋白(例如由於C9orf72-DPR而導致的經聚集C9orf72)之異常積聚及/或沉積之疾病或病症之方法,該方法包含向有需要之受試者投與治療有效量之本發明之前述DPR結合分子、抗體、多核苷酸、載體或細胞中之任一者。
本發明治療方法之一特定優點在於如下事實,本發明之重組抗體源自無疾病跡象或症狀(例如攜帶一或多個無症狀突變、顯示DPR或其聚集形式之出現或與其相關)之健康人受試者之B細胞或記憶B細胞,且因此在某種可能性下能夠預防與DPR(例如具有經擴增六核苷酸重複之突變C9orf72,其導致在C9orf72蛋白中形成二肽重複(DPR)之且由於C9orf72-DPR而形成聚集C9orf72)相關之臨床表現疾病,或者能夠降低臨床表現疾病或病症之發生風險,或者能夠延遲臨床表現疾病或病症之發作或進展。通常,本發明之抗體亦已經成功經歷體細胞成熟,亦即藉由抗體可變區之體細胞變異優化了在與靶DPR分子之高親和力結合中之選擇性及有效性。
此類細胞在活體內(例如在人體中)未藉由相關或其它生理學蛋白質或細胞結構在自身免疫或過敏反應意義上來活化之知識亦具有重要醫學意義,因為此意味著成功經受臨床測試階段之機會顯著增加。簡言之,在至少一位人受試者中預防性或治療性抗體之臨床前及臨床開發之前已經證明了效率、可接受性及耐受性。因此可以預期本發明之人源抗DPR抗體,其作為治療劑之高靶結構特異性親和力及其副作用概率減小顯著增加其臨床成功概率。
本發明亦提供了醫藥及診斷包裝或套組,其包含一或多個裝有一或多種上述成分之容器,該等成分例如本發明之抗DPR抗體、結合片段、生物技術衍生物或其變異體、多核苷酸、載體或細胞。此類容器可附有管理藥物或生物製品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式之須知,該須知反映了該機構對製造、使用或銷售以供人類投藥之批准。另外或另選地,套組包含用於適當診斷檢定之試劑及/或說明書。本發明之組成物(例如,套組)當然特別適用於伴有DPR之存在之疾病或病症之風險評估、診斷、預防及治療,且特別適用於治療通常以存在DPR為特徵之病症。特別地,該組成物可用於治療與DPR聚集有關之病症,例如具有經擴增六核苷酸重複之突變C9orf72,導致由於C9orf72-DPR而形成經聚集C9orf72。與DPR相關之疾病及/或病症包括但不限於額顳葉變性(FTLD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、FTLD-ALS及/或脊髓小腦性失調症36型。
可以根據此項技術中熟知之方法調配本發明之醫藥組成物;參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000),the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472。合適醫藥載劑之實例為此項技術中熟知的,且包括磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)、各種類型之潤濕劑、無菌溶液等。包含此類載體之組成物可藉由熟知之習用方法調配。此等醫藥組成物可以合適劑量向受試者投與。合適組成物之投藥可以藉由不同方式進行,例如藉由靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、鼻內、局部或皮內投藥或脊髓或腦遞送。氣溶膠調配物諸如鼻噴霧調配物包括活性劑與防腐劑及等滲劑之純化水溶液或其它溶液。視情況將此等調配物調節至與鼻黏膜相容之pH及等滲狀態。用於直腸或陰道投藥之調配物可以作為具有合適載體之栓劑存在。
劑量方案將由主治醫師及臨床因素判定。如醫學技術中所熟知,用於任一患者之劑量取決於許多因素,包括患者之體型、身體表面積、年齡、所投與之特定化合物、性別、投與時間及途徑、一般健康狀況及同時投與之其它藥物。典型劑量可以為例如0.001至1000 μg(或在該範圍內用於表現或抑制表現之核酸);然而,設想低於或高於該示範性範圍之劑量,特別是考慮到上述因素。通常,劑量可以為例如約0.0001至100 mg/kg,且更通常為0.01至5 mg/kg(例如,0.02 mg/kg、0.25 mg/kg、0.5 mg/kg、0.75 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg等)之宿主體重。例如,劑量可以為1 mg/kg體重或10 mg/kg體重或在1-10 mg/kg範圍內,視情況為至少3、10或30 mg/kg。在上述範圍內之中間劑量亦旨在處於本發明之範圍內。受試者可每天、按天交替地、每週或根據由經驗分析判定之其它時程來投與該等劑量。示範性治療需要以多劑量形式經延長的時間(例如至少六個月)進行投與。其它示範性治療方案需要每兩週投與一次或一月投與一次或每3至6個月投與一次。示範性劑量時程包括連續或隔天1-10 mg/kg或15 mg/kg或每週30 mg/kg;亦參見實例18。在一些方法中,同時投與兩種或兩種以上具有不同結合特異性之單株抗體,在該情況下,各抗體之投與劑量可屬於指定範圍內。可以藉由定期評估來監測進展情況。用於非經腸投與之製劑包括無菌水溶液或非水溶液、懸浮液、及乳液。非水溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液,包括鹽水及緩衝介質。非經腸媒介物包括磷酸鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖及氯化鈉、乳酸化林格氏液或不揮發油。靜脈內媒介物包括流體及營養素補充劑、電解液補充劑(諸如基於林格氏右旋糖之物)、及其類似物。亦可存在防腐劑及其它添加劑,諸如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體及其類似物。此外,取決於醫藥組成物之預期用途,本發明之醫藥組成物可包含其它藥劑,例如多巴胺或精神藥理學藥物。
此外,在本發明之一較佳實施例中,例如在本發明之醫藥組成物包含用於被動免疫之抗DPR抗體或其DPR結合片段、或合成或生物技術變異體或衍生物時,醫藥組成物可以調配成疫苗。如背景技術部分所述,經聚集DPR物質為諸如FTLD及ALS之疾病及/或病症之主要觸發因素。因此,謹慎預期用本發明之人源抗DPR抗體及等效DPR結合分子之被動免疫將有助於規避主動免疫治療概念之若干不利影響且導致DPR聚集減少。因此,本發明之抗DPR抗體及其等效物特別可用作預防或改善疾病或病症之疫苗,該等疾病或病症顯示DPR或其聚集形式(特別是C9orf72-DPR)之存在或由其引起,例如FTLD。
在一個實施例中,使用本發明抗體之重組Fab(rFab)及單鏈片段(scFv)可為有益的,其可更容易穿透細胞膜。舉例而言,提前在線公佈之Robert等人, Protein Eng. Des. Sel. (2008) ; S1741-0134描述了單株抗體WO-2之嵌合重組Fab(rFab)及單鏈片段(scFv)之用途,其識別Aβ之N-端區域中之抗原決定基。經工程改造片段能夠(i)防止澱粉樣蛋白原纖維化,(ii)解聚預先形成之Aβ1-42原纖維且(iii)在活體外與完整IgG分子一樣有效抑制Aβ1-42寡聚體介導之神經毒性。使用缺乏效應功能之小Fab及scFv工程改造抗體形式之感知優點包括更有效地穿過血腦屏障且使引發炎性副反應之風險最小化。此外,除了scFv及單域抗體保留全長抗體之結合特異性,它們可以作為單個基因表現,且在細胞內在哺乳動物細胞中作為胞內體表現,具有改變其靶標之折疊、相互作用、修飾或亞細胞定位之可能;關於回顧,參見例如Miller及Messer, Molecular Therapy 12 (2005), 394–401。
在不同方法中,Muller等人, Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241描述了一種技術平台,即所謂『SuperAntibody技術』,據稱其能夠使抗體穿梭進入活細胞而不會傷害該等細胞。此類細胞穿透抗體打開了新的診斷及治療窗口。術語『TransMab』已經創造用於此等抗體。
在另一個實施例中,可能需要共同投與或依次投與可用於治療與DPR(特別是經聚集DPR諸如C9orf72-DPR)之出現相關之疾病、病症或症狀之其它抗體。在一個實施例中,在本發明之醫藥組成物中包含另外的抗體。可用於治療受試者之抗體之實例包括但不限於靶向CD33、SGLT2、IL-6及IL-1之抗體。
在另一個實施例中,可能需要共同投與或順序投與可用於治療與DPR(特別是經聚集DPR,例如突變C9orf72,亦即C9orf72-DPR)相關之疾病、病症或症狀之其它藥劑。在一個實施例中,在本發明之醫藥組成物中包含另外的藥劑。可用於治療受試者之藥劑之實例包括但不限於:靶向無意識肌肉運動之VMAT2抑制劑,例如抗炎劑,例如二色素、皮質類固醇、2-(2,6-二氯苯胺基)苯乙酸(雙氯芬酸)、異丁基-丙酸-酚酸(布洛芬);利尿劑、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、鹽酸黴法蘭、地塞米松、硼替佐米、硼替佐米-黴法蘭、硼替佐米-地塞米松、黴法蘭-地塞米松、硼替佐米-黴法蘭-地塞米松;抗抑鬱藥、抗精神病藥、精神抑制藥、抗癡呆藥(例如NMDA-受體拮抗劑美金剛)、乙醯膽鹼酯酶抑制劑(例如多奈哌齊、HCI、卡巴拉汀、加蘭他敏)、麩胺酸 (glutamat)拮抗劑及其它促智藥血壓藥(例如二氫拉嗪、甲基多巴)、細胞抑制劑、糖皮質激素、血管緊張素轉換酶(ACE)抑制劑;抗炎劑或其任何組合。
治療有效劑量或量係指活性成分足以改善症狀或病症之量。此等化合物之治療功效及毒性可藉由細胞培養物或實驗動物中之標準藥學方法測定,例如ED
50(在50%群體中治療有效之劑量)及LD
50(對50%群體致死之劑量)。在治療作用及毒性作用之間之劑量比率為治療指數且其可表示為比率LD
50/ED
50。
自前述內容可以明顯看出,本發明涵蓋至少包含上述抗體及其變異體之CDR之DPR結合分子之任何用途,特別是用於診斷及/或治療與DPR(特別是經聚集DPR物質,諸如C9orf72-DPR)相關之疾病或病症,諸如FTLD。視情況地,該結合分子為本發明之抗體或其生物技術衍生物。
在另一個實施例中,本發明係關於診斷組成物,其包含本發明之上述DPR結合分子、抗體、DPR結合片段、多核苷酸、載體或細胞中之任一者及視情況合適偵測手段,例如習慣用於基於免疫或核酸之診斷方法之試劑。例如,本發明之抗體適用於免疫檢定,其中該等抗體可以在液相中使用或與固相載體結合。可以利用本發明之抗體之免疫檢定之實例為直接或間接形式之競爭性及非競爭性免疫檢定。此類免疫檢定之實例為放射免疫檢定(RIA)、夾心(免疫計量檢定)、流式細胞術及西方墨點檢定。本發明之抗體可以與許多不同之載體結合,且用於分離與其特異性結合之細胞。熟知載體之實例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龍、直鏈澱粉、天然及改性纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖及磁鐵礦。出於本發明之目的,載體之性質可以為可溶的或不可溶的。一般熟悉此項技藝者已知許多不同之標記及標記方法。可用於本發明之標記類型之實例包括酶、放射性同位素、膠體金屬、螢光化合物、化學發光化合物、及生物發光化合物;亦參見上文論述之實施例。
藉由另一個實施例,DPR結合分子(特別是本發明之抗體)亦可以用於診斷個體之疾病或病症之方法中,該方法藉由自受試之個體獲得體液樣品,該體液樣品可以為血液樣品、血漿樣品、血清樣品、淋巴樣品或任何其它體液樣品,例如唾液或尿液樣品;及在能夠形成抗體-抗原複合物之條件下使體液樣品與本發明之抗體接觸。然後藉由此項技術中已知之方法測定此類複合物之水準,該水準顯著高於對照樣品中形成之水準,表明受試之個體中之疾病或病症。以相同之方式,亦可以使用由本發明之抗體結合之特異性抗原。因此,本發明係關於活體外免疫檢定,其包含結合分子,例如本發明之抗體或其DPR結合片段。
在本發明之另一個實施例中,DPR結合分子(特別是本發明之抗體)亦可以用於藉由自受試個體獲得生檢物而診斷個體疾病或病症之方法中。在此情況下,本發明亦係關於專門為此目的而設計之裝置。例如,可以使用基於抗體之陣列,其例如裝載有特異性識別DPR之本發明之抗體或等效DPR結合分子。微陣列免疫檢定之設計概述於Kusnezow等人, Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696中。因此,本發明亦係關於裝載有本發明之DPR結合分子之微陣列。
在一個實施例中,本發明係關於在受試者中診斷與DPR(特別是經聚集DPR物質諸如C9orf72-DPR)相關之疾病或病症之方法,該方法包含用至少一種本發明之抗體、其DPR結合片段或具有與其任一者基本相同之結合特異性之DPR結合分子在來自待診斷受試者之樣品中分別判定DPR及經聚集DPR之存在,其中DPR或其病理聚集形式(視情況為C9orf72-DPR)之存在指示FTLD及/或ALS,且與生理學C9orf72(亦即,其不顯示重複區域轉譯成DPR蛋白質)之水準相比,DPR或其病理學聚集形式(特別是C9orf72-DPR)之水準增加,指示該受試者中FTLD及/或ALS之進展。
待診斷受試者可能對於該疾病而言為無症狀或臨床前的。視情況地,對照受試者患有與DPR、經聚集DPR及/或視情況C9orf72-DPR相關之疾病,例如,如上所述之FTLD、ALS及FTLD-ALS等,其中DPR(例如,經聚集C9orf72-DPR)之水準與參考標準之間之相似性表明待診斷受試者患有FTLD、ALS及/或FTLD-ALS或具有患上與DPR聚集相關之疾病及/或病症之風險。或者或另外作為第二對照,對照受試者不具有DPR聚集,其中生理學C9orf72或如同突變C9orf72基因及/或經聚集C9orf72-DPR一般,由於其基因突變而易於插入DPR之另一種蛋白質之水準與參考標準之間之差異,表明待診斷受試者患有與DPR相關之疾病及/或病症(例如FTLD、ALS及/或FTLD-ALS),或具有患上與DPR相關之疾病及/或病症之風險。視情況地,待診斷受試者與對照受試者為年齡匹配的。待分析之樣品可以為疑似含有病理性DPR蛋白(例如經聚集C9orf72-DPR)之任何體液,例如血液、血漿、血清、尿液、腹膜液、唾液或腦脊髓液(CSF)。
生理學C9orf72或類似蛋白質及/或經聚集DPR諸如C9orf72-DPR之水準可以藉由此項技術中已知之任何合適方法評估,該等方法包含例如藉由一或多種技術分析DPR及/或摻入DPR之蛋白質諸如C9orf72,該等技術係選自西方墨點、免疫沉澱、酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、放射免疫檢定(RIA)、螢光活化細胞分選(FACS)、雙向凝膠電泳、質譜(MS)、基質輔助雷射解吸/電離飛行時間-MS(MALDI-TOF)、表面增強雷射解吸電離-飛行時間(SELDI-TOF)、高效液相層析(HPLC)、快速蛋白液相層析(FPLC)、多維液相層析(LC)及後續串聯質譜(MS/MS)、及雷射光密度測定法。視情況地,DPR之該活體內造影包含閃爍掃描、正電子發射斷層攝影術(PET)、單光子發射斷層攝影術(SPECT)、近紅外(NIR)光學造影或磁共振造影(MRI)。
因此,在一個實施例中,提供上文定義之本發明之抗體、多核苷酸、載體或細胞或包含其任一者之醫藥或診斷組成物,用於預防性治療、治療性治療、及/或監測與DPR蛋白或其聚集形式相關之疾病或病症之進展或對治療之反應。因此,本發明亦係關於診斷或監測受試者中與DPR蛋白相關之疾病或病症(例如FTLD及ALS)之進展之方法,該方法包含用至少一種本發明之抗體或具有與其任一者基本相同之結合特異性之DPR結合分子判定來自待診斷受試者之樣品中DPR蛋白之存在,其中例如在突變C9orf72及經聚集C9orf72-DPR物質中DPR之存在指示疾病或病症。在一個實施例中,提供了診斷或監測受試者中DPR相關疾病及/或病症之進展之該方法,該方法包含用至少一種本發明之抗體判定來自待診斷受試者之樣品中DPR(例如以突變C9orf72及其聚集形式)之存在,其中DPR(諸如突變C9orf72及/或經聚集C9orf72-DPR)之存在指示與DPR相關之症狀發生前、有前驅症狀或臨床疾病及/或病症,與不含DPR之生理學C9orf72之水準相比或與來自健康對照受試者之參考樣品或來自同一受試者之對照樣品相比DPR聚集物(特別是C9orf72-DPR)之水準增加指示了與DPR相關之症狀發生前、有前驅症狀或已建立之疾病及/或病症(例如FTLD及ALS)之進展。熟習此項技藝者可以理解,在一個實施例中,該方法亦用於診斷或監測來自如上文所述之分別與DPR及包含DPR之蛋白質相關之疾病之組之任何其它疾病或病症之進展。
如上所述,本發明之抗體不僅可以在活體外使用,亦可以在活體內使用,其中除了診斷之外,亦可以進行治療應用。因此,在一個實施例中,本發明亦係關於DPR結合分子,其包含本發明之抗體之CDR,用於製備用以在人或動物體內活體內偵測DPR(視情況地C9orf72-DPR)或向該CDR靶向輸送治療劑及/或診斷劑之組成物。潛在治療劑及/或診斷劑可係選自可用於治療與DPR相關之疾病及/或病症之治療劑及如上所述之潛在標記之非窮舉性列舉。關於活體內造影,在一較佳實施例中,本發明提供了包含本發明抗體之CDR之該DPR結合分子,其中該活體內造影包含閃爍掃描、正電子發射斷層攝影術(PET)、單光子發射斷層攝影術(SPECT)、近紅外(NIR)光學造影或磁共振造影(MRI)。在另一實施例中,本發明亦提供了包含本發明抗體之CDR之該DPR結合分子或用於製備用以上述指定活體內造影方法之組成物之該分子,用於診斷或監測受試者中與DPR蛋白相關之疾病或病症之進展之方法中,如上文所定義。
在此情況下,本發明亦係關於可用於診斷或監測與DPR及含有DPR之蛋白質相關之疾病及/或病症之進展之套組,該套組包含至少一種本發明之抗體或具有與其任一者基本相同之結合特異性之DPR結合分子、分別如上文所定義之多核苷酸、載體或細胞及/或肽,視情況地連同試劑及/或使用說明書。
本文提供由以下編號段落描述之組成物、方法及/或用途:
1. 一種抗DPR抗體或其片段,包含
(i)具有胺基酸序列SEQ ID NO:38(或與SEQ ID NO:38至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列) 之重鏈;及
(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO:42 (或與SEQ ID NO:42至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列) 之輕鏈。
1a. 一種抗DPR抗體或其片段(例如結合至,例如特異性地及/或以高親和力結合至聚-(GA)n重複序列,例如本文所述之聚-(GA)n重複序列,例如聚-(GA)
6-15)(SEQ ID NO:83),其中抗DPR抗體或其片段包含:
(i) 重鏈,該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:37或38(或與SEQ ID NO:37或38至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
(ii) 重鏈恆定域,該重鏈恆定域包含胺基酸序列SEQ ID NO:39(或與SEQ ID NO:39至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
(iii) 重鏈可變區胺基酸序列,該重鏈可變區胺基酸序列包含SEQ ID NO:40(或與SEQ ID NO:40至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
(iv) 輕鏈胺基酸序列,該輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO:41或42(或與SEQ ID NO:41或42至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中輕鏈胺基酸序列長度不超過214個胺基酸,且/或輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;
(v) 輕鏈恆定域胺基酸序列,該輕鏈恆定域胺基酸序列包含SEQ ID NO:43(或與SEQ ID NO:43至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中輕鏈胺基酸序列長度不超過214個胺基酸,且/或輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;
(vi) 輕鏈可變區胺基酸序列,該輕鏈可變區胺基酸序列包含SEQ ID NO:44(或與SEQ ID NO:44至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中輕鏈胺基酸序列長度不超過214個胺基酸,且/或其中輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;
(vii) 重鏈可變區,該重鏈可變區包含CDR1胺基酸序列SEQ ID NO:45(或與SEQ ID NO:45至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列);CDR2胺基酸序列SEQ ID NO:46(或與SEQ ID NO:46至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),及CDR3胺基酸序列SEQ ID NO:47(或與SEQ ID NO:47至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
及/或
(viii) 輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含CDR1胺基酸序列SEQ ID NO:48(或與SEQ ID NO:48至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、CDR2胺基酸序列SEQ ID NO:49(或與SEQ ID NO:49至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、及CDR3胺基酸序列SEQ ID NO:50(或與SEQ ID NO:50至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列長度不超過123個胺基酸,且/或視情況地其中輕鏈胺基酸序列長度不超過214個胺基酸,且/或其中輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸。
1b. 如段落1-1e中任一項之抗DPR抗體或其片段,其包含異源序列,例如與重鏈、輕鏈、重鏈可變區、重鏈恆定區、輕鏈可變區、輕鏈恆定域、可變重鏈CDR、及/或可變輕鏈CDR異源之異源序列。
1c. 如段落1b之抗DPR抗體或其片段,其中該異源序列包含免疫球蛋白重鏈恆定區、免疫球蛋白輕鏈恆定區或異源哺乳動物分泌信號肽。
1d. 如段落1-1c中任一項之抗DPR抗體或其片段,其包含聚乙二醇或可偵測標記,例如酶、放射性同位素、螢光化合物、化學發光化合物、生物發光化合物、或重金屬。
1e. 如段落1-1d中任一項之抗DPR抗體或其片段,其中抗體或其片段係選自由Fab、Fab'、F(ab')
2、Fc、Fv、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、及經二硫鍵連接之Fv(sdFv)組成之群。
2. 一種核酸分子,包含:
(i) 編碼抗-DPR抗體之重鏈之核酸,該重鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:38(或與SEQ ID NO:38至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列);及
(ii) 編碼抗-DPR抗體之輕鏈之核酸,該輕鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:42(或與SEQ ID NO:42至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),視情況地其中核酸序列(i)及(ii)置於同一核酸分子上或單獨核酸分子上,
2a. 如段落2之核酸分子,其中該核酸分子包含cDNA且/或可操作地連接至異源核酸,例如異源信號肽(例如分泌信號肽,例如哺乳動物分泌信號肽,例如本文所述之分泌信號肽)或異源調節元件(例如,異源增強子、核糖體結合位點、轉錄終止子或異源啟動子(例如,細胞巨大病毒、猿猴病毒40或反轉錄病毒啟動子))。
2b. 一種編碼以下(i)-(viii)中之一或多者之核酸分子:
(i) 重鏈,該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:37或38 (或與SEQ ID NO:37或38至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列) 、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
(ii) 重鏈恆定域,該重鏈恆定域包含胺基酸序列SEQ ID NO:39(或與SEQ ID NO:39至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列) 、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
(iii) 重鏈可變區胺基酸序列,該重鏈可變區胺基酸序列包含SEQ ID NO:40(或與SEQ ID NO:40至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列) 、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
(iv) 輕鏈胺基酸序列,該輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO:41或42(或與SEQ ID NO:41或42至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中輕鏈胺基酸序列長度不超過214個胺基酸,且/或輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;
(v) 輕鏈恆定域胺基酸序列,該輕鏈恆定域胺基酸序列包含SEQ ID NO:43(或與SEQ ID NO:43至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中輕鏈胺基酸序列長度不超過214個胺基酸,且/或輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;
(vi) 輕鏈可變區胺基酸序列,該輕鏈可變區胺基酸序列包含SEQ ID NO:44(或與SEQ ID NO:44至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中輕鏈胺基酸序列長度不超過214個胺基酸,且/或其中輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;
(vii) 重鏈可變區,該重鏈可變區包含CDR1胺基酸序列SEQ ID NO:45(或與SEQ ID NO:45至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列);CDR2胺基酸序列SEQ ID NO:46(或與SEQ ID NO:46至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),及CDR3胺基酸序列SEQ ID NO:47(或與SEQ ID NO:47至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
及/或
(viii) 輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含CDR1胺基酸序列SEQ ID NO:48(或與SEQ ID NO:48至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、CDR2胺基酸序列SEQ ID NO:49(或與SEQ ID NO:49至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、及CDR3胺基酸序列SEQ ID NO:50(或與SEQ ID NO:50至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列長度不超過123個胺基酸,且/或視情況地其中輕鏈胺基酸序列長度不超過214個胺基酸,且/或其中輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸。
3. 一種 包含核苷酸序列SEQ ID NO:51-58(或與SEQ ID NO:51-58至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100 %相同之胺基酸序列) 中之一或多者之核酸分子。
3a. 一或多種編碼如段落1-1e中任一項之抗體或其片段之核酸分子。
3b. 一種包含如段落2-3a中任一項之核酸分子之cDNA。
3c. 一種包含編碼以下項之多核苷酸之cDNA:
(i) 重鏈,該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:37或38(或與SEQ ID NO:37或38至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
(ii) 重鏈恆定域,該重鏈恆定域包含胺基酸序列SEQ ID NO:39(或與SEQ ID NO:39至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
(iii) 重鏈可變區胺基酸序列,該重鏈可變區胺基酸序列包含SEQ ID NO:40(或與SEQ ID NO:40至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
(iv) 輕鏈胺基酸序列,該輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO:41或42(或與SEQ ID NO:41或42至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中輕鏈胺基酸序列長度不超過214個胺基酸,且/或輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;
(v) 輕鏈恆定域胺基酸序列,該輕鏈恆定域胺基酸序列包含SEQ ID NO:43(或與SEQ ID NO:43至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中輕鏈胺基酸序列長度不超過214個胺基酸,且/或輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;
(vi) 輕鏈可變區胺基酸序列,該輕鏈可變區胺基酸序列包含SEQ ID NO:44(或與SEQ ID NO:44至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中輕鏈胺基酸序列長度不超過214個胺基酸,且/或其中輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;
(vii) 重鏈可變區,該重鏈可變區包含CDR1胺基酸序列SEQ ID NO:45(或與SEQ ID NO:45至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列);CDR2胺基酸序列SEQ ID NO:46(或與SEQ ID NO:46至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),及CDR3胺基酸序列SEQ ID NO:47(或與SEQ ID NO:47至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
及/或
(viii) 輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含CDR1胺基酸序列SEQ ID NO:48(或與SEQ ID NO:48至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、CDR2胺基酸序列SEQ ID NO:49(或與SEQ ID NO:49至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、及CDR3胺基酸序列SEQ ID NO:50(或與SEQ ID NO:50至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列長度不超過123個胺基酸,且/或視情況地其中輕鏈胺基酸序列長度不超過214個胺基酸,且/或其中輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;及/或
(ix) 重鏈,該重鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:38(或與SEQ ID NO:38至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列);及/或
(x) 輕鏈,該輕鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:42(或與SEQ ID NO:42至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)。
4. 一種包含如段落2-3a中任一項之核酸分子或如段落3b-3c中任一項之cDNA之載體。
4a. 如段落4之載體,其中該載體為可操作地連接至多核苷酸之表現載體,其中該多核苷酸編碼以下一或多者:
(i) 重鏈,該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:37或38(或與SEQ ID NO:37或38至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
(ii) 重鏈恆定域,該重鏈恆定域包含胺基酸序列SEQ ID NO:39(或與SEQ ID NO:39至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
(iii) 重鏈可變區胺基酸序列,該重鏈可變區胺基酸序列包含SEQ ID NO:40(或與SEQ ID NO:40至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
(iv) 輕鏈胺基酸序列,該輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO:41或42(或與SEQ ID NO:41或42至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中輕鏈胺基酸序列長度不超過214個胺基酸,且/或輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;
(v) 輕鏈恆定域胺基酸序列,該輕鏈恆定域胺基酸序列包含SEQ ID NO:43(或與SEQ ID NO:43至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中輕鏈胺基酸序列長度不超過214個胺基酸,且/或輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;
(vi) 輕鏈可變區胺基酸序列,該輕鏈可變區胺基酸序列包含SEQ ID NO:44(或與SEQ ID NO:44至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、由其組成或基本上由其組成,
視情況地其中輕鏈胺基酸序列長度不超過214個胺基酸,且/或其中輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;
(vii) 重鏈可變區,該重鏈可變區包含CDR1胺基酸序列SEQ ID NO:45(或與SEQ ID NO:45至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列);CDR2胺基酸序列SEQ ID NO:46(或與SEQ ID NO:46至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),及CDR3胺基酸序列SEQ ID NO:47(或與SEQ ID NO:47至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列之長度不超過123個胺基酸;
及/或
(viii) 輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含CDR1胺基酸序列SEQ ID NO:48(或與SEQ ID NO:48至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、CDR2胺基酸序列SEQ ID NO:49(或與SEQ ID NO:49至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)、及CDR3胺基酸序列SEQ ID NO:50(或與SEQ ID NO:50至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列),
視情況地其中重鏈胺基酸序列(例如,重鏈成熟序列)之長度不超過452個胺基酸,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端不包含離胺酸殘基,且/或其中重鏈在其胺基酸序列之C-端具有甘胺酸,且/或其中重鏈可變區胺基酸序列長度不超過123個胺基酸,且/或視情況地其中輕鏈胺基酸序列長度不超過214個胺基酸,且/或其中輕鏈可變區胺基酸序列長度不超過107個胺基酸;及/或
(ix) 重鏈,該重鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:38(或與SEQ ID NO:38至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列);及/或
(x) 輕鏈,該輕鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:42(或與SEQ ID NO:42至少95%,例如95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列)。
4b. 如段落4-4a中任一項之載體,其中載體包含如段落3b-3c中任一項之cDNA。
4c. 如段落4-4b中任一項之載體,其中載體包含啟動子(例如異源啟動子、例如細胞巨大病毒(例如細胞巨大病毒即刻早期啟動子)、猿猴病毒40或反轉錄病毒啟動子)。
5. 一種宿主細胞,其包含(i)如段落2-3a中任一項之核酸分子;(ii)如段落3b-3c中任一項之cDNA;或(iii)如段落4-4c中任一項之載體,
視情況地其中該宿主細胞為哺乳動物宿主細胞(例如,中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HEK 293細胞或NS0細胞)。
6. 如段落2-3a中任一項之核酸分子、如段落3b-3c中任一項之cDNA、如段落4-4c中任一項之載體或如段落5之宿主細胞用於產生抗DPR抗體或其片段之用途。
7. 一種產生抗DPR抗體或其片段之方法,包含:(i)培養如段落5之宿主細胞;及(ii)自培養物中分離抗體或其片段。
8. 一種組成物,例如醫藥組成物,其包含如段落1-1e中任一項之抗DPR抗體或其片段、如段落2-3a中任一項之核酸分子、如段落3b-3c中任一項之cDNA、如段落4-4c中任一項之載體、或如段落5之宿主細胞,
視情況地其中醫藥組成物包含醫藥學上可接受之載劑,
視情況地其中醫藥組成物適用於鞘內腔投與。
9. 一種治療有需要之受試者中與含有DPR之蛋白質或其聚集形式相關或由其引起之病症(例如,肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、額顳葉變性(FTLD)或FTLD-ALS)之方法,包含向該受試者投與本文所述之抗DPR抗體或其片段(例如,如段落1-1e中任一項之抗DPR抗體或其片段),從而治療受試者之病症(例如,ALS、FTLD或FTLD-ALS)。
10. 一種製備醫藥組成物之方法,該醫藥組成物用於治療與含有DPR之蛋白質或其聚集形式相關或由其引起之病症(例如,ALS、FTLD或FTLD-ALS),該方法包含:(i)培養如段落5之宿主細胞;(ii)自培養物中分離及/或純化抗體或其片段至藥用級;及(iii)將抗體或其片段與醫藥學上可接受之載劑混合。
11. 如段落1-1e中任一項之抗DPR抗體或其片段、如段落2-3a中任一項之核酸分子、如段落3b-3c中任一項之cDNA、如段落4-4c中任一項之載體或如段落5之宿主細胞,用於治療(例如,預防性及/或治療性治療)與含有DPR之蛋白質或其聚集形式相關或由其引起之病症(例如,ALS、FTLD或FTLD-ALS)。
12. 一種用於活體內偵測腦中之DPR(例如,聚-GA DPR)沉積物之方法,該方法包含:
向受試者(例如,人受試者)投與如段落1-1e中任一項之抗DPR抗體或其片段,其中該抗體或其片段連接至可偵測標記(例如,酶、放射性同位素、螢光團、及/或重金屬);及
偵測受試者腦中之可偵測標記,從而偵測受試者腦中之DPR沉積物,視情況地其中該DPR沉積物藉由正電子發射斷層攝影術(PET)、單光子發射斷層攝影術(SPECT)、近紅外(NIR)、光學造影或磁共振造影(MRI)來偵測。
序列
表 14.序列之選擇
SEQ ID NO | 描述 | 序列 |
3 | NI-308.5J10 VH-CDR1 | DYYWS |
4 | NI-308.5J10 VH-CDR2 | RTYTNGKTTYTYNPSLES |
5 | NI-308.5J10 VH-CDR3 | WGAVTGDYYYGMDV |
8 | NI-308.5J10 VL-CDR1 | RSPRSLLHTNGYTYLD |
9 | NI-308.5J10 VL-CDR2 | LASNRAS |
10 | NI-308.5J10 VL-CDR3 | MQGLQPSWT |
13 | NI-308.5J10 VH-CDR2 序列 - N54S 突變 | RTYTSGKTTYTYNPSLES |
14 (核酸) | NI-308.5J10 可變重鏈 (VH) 序列 - N54T 突變 | caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacttacactgtcttaggtggctccgtcagtgattactactggagctgcatccggcagcccgccgggaagggactggagtggattgggcgaacatatactaccgggaagaccacttacacttacaacccctccctcgagagtcgactcagtttgtctatagacacgtccatgaaccaattctccctgaagttgacctctgtgacggccgcggacacggccgtctattactgcgcgagatggggggcggtgactggtgactactactacggtatggacgtctggggcccaggcaccctggtcaccgtctcctcg |
14 (胺基酸) | NI-308.5J10 可變重鏈 (VH) 序列 - N54T 突變 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTTGKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSS |
16 | NI-308.5J10 VH-CDR2 序列 - N54T 突變 | RTYTTGKTTYTYNPSLES |
19 | NI-308.5J10 VH-CDR2 序列 - G55S 突變 | RTYTNSKTTYTYNPSLES |
22 | NI-308.5J10 VH-CDR2 序列 - G55T 突變 | RTYTNTKTTYTYNPSLES |
25 | NI-308.5J10 可變輕鏈 (VK) 質體 (SDD 152) | EIVLTQSPLSLSVTPGEPASISCRSPRSLLHTNGYTYLDWYLQRPGQSPQLLIFLASNRASGVPDRFSGSGSGTNFTLRISGVEADDVGVYYCMQGLQPSWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
26 | NI-308.5J10-hIgG1 可變重鏈 (VH) 質體 (SDD 151) | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTNGKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
27 | NI-308.5J10 可變輕鏈 (VK) 質體 (SDD 177) - N75D 突變 | EIVLTQSPLSLSVTPGEPASISCRSPRSLLHTNGYTYLDWYLQRPGQSPQLLIFLASNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISGVEADDVGVYYCMQGLQPSWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
28 | NI-308.5J10-hIgG1 可變重鏈 (VH) 質體 (SDD 173) - N54S 突變 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTSGKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
29 | NI-308.5J10-hIgG1 可變重鏈 (VH) 質體 (SDD 174) - N54T 突變 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTTGKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
30 | NI-308.5J10-hIgG1 可變重鏈 (VH) 質體 (SDD 175) - G55S 突變 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTNSKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
31 | NI-308.5J10-hIgG1 可變重鏈 (VH) 質體 (SDD 176) - G55T 突變 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTNTKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
32 | NI-308.5J10-Fab-6His 可變重鏈 (VH) 質體 (SDD 178) | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTNGKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCHHHHHH |
33 | NI-308.5J10-Fab-6His 可變重鏈 (VH) 質體 (SDD 179) - N54S 突變 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTSGKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCHHHHHH |
34 | NI-308.5J10-Fab-6His 可變重鏈 (VH) 質體 (SDD 180) - N54T 突變 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTTGKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCHHHHHH |
35 | NI-308.5J10-Fab-6His 可變重鏈 (VH) 質體 (SDD 181) - G55S 突變 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTNSKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCHHHHHH |
36 | NI-308.5J10-Fab-6His 可變重鏈 (VH) 質體 (SDD 182) - G55T 突變 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTNTKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCHHHHHH |
61 | 合成二肽重複蛋白 (GA)15 | CHHHHHHGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA |
62 | 合成二肽重複蛋白 (GP)15 | CGPGPGPGPGPGPGPGPGPGPGPGPGPGPGP |
63 | 合成二肽重複蛋白 (GR)15 | CGRGRGRGRGRGRGRGRGRGRGRGRGRGRGR |
64 | 合成二肽重複蛋白 (PA)15 | CPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPA |
65 | 合成二肽重複蛋白 (PR)15 | CPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR |
66 | 二肽重複蛋白肽 GA | GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA |
67 | 二肽重複蛋白肽 GP | GPGPGPGPGPGPGPGPGPGPGPGPGPGPGP |
68 | 二肽重複蛋白肽 GR | GRGRGRGRGRGRGRGRGRGRGRGRGRGRGR |
69 | 二肽重複蛋白肽 PA | PAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPA |
70 | 二肽重複蛋白肽 PR | PRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR |
71 | 合成二肽重複蛋白 (GA)20 | GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAHHHHHH |
72 | 合成二肽重複蛋白 (GA)10 | GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAHHHHHH |
73 | 合成二肽重複蛋白 (GA)6 | GAGAGAGAGAGAHHHHHH |
74 | 合成二肽重複蛋白 (GA)5 | GAGAGAGAGAHHHHHH |
75 | 合成二肽重複蛋白 (GA)4 | GAGAGAGAHHHHHH |
76 | 合成二肽重複蛋白 (GA)3 | GAGAGAHHHHHH |
77 | 合成二肽重複蛋白 (GA)2 | GAGAHHHHHH |
以上揭露內容總體上描述了本發明。除非另有說明,否則本文使用之術語給出在the Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, 2000年修訂且2003年重印, ISBN 0 19 850673 2中提供之定義。在整個本說明書之文本中引用了若干文件。完整書目引用可以在緊鄰申請專利範圍之前的說明書末尾找到。所有引用之參考文獻(包括本申請案中引用之參考文獻、授權專利、公開專利申請案,包括背景部分及製造商之規格、說明書等)之內容以引用之方式明確併入本文;然而,不承認所引用之任何文件確實為相對於本發明之先前技術。
藉由參考以下具體實例可以獲得更完整之理解,此等實例在本文中僅出於說明目的而提供,且不意欲限制本發明之範圍。
實例
實例 1 :抗 -( 聚 -GA) 二肽重複 (DPR) 蛋白抗體之分離及鑒定
靶向聚-GA二肽重複(DPR)蛋白、其片段、C9orf72-DPR之人源抗體及/或其片段基於國際申請案WO 2016/050822 A2中描述之方法鑒定,該申請案之揭露內容以引用之方式併入本文。特別地,藉由Schafer-N(Copenhagen,Denmark)合成且純化聚-GA二肽重複蛋白(GA
15: H-CHHHHHH(GA)
15-OH) (SEQ ID NO: 61)。然後經由雙官能接頭(SMCC)將聚-GA二肽重複蛋白偶聯至牛血清白蛋白(BSA)。隨後,使用96孔微量培養板(Corning)進行直接ELISA,該等微量培養板用塗佈緩衝液(15 mM Na
2CO
3, 35 mM NaHCO
3, pH 9.42)中濃度為5 μg/ml之非偶聯或BSA偶聯之聚-GA二肽重複蛋白或BSA(Sigma-Aldrich,Buchs,Switzerland)塗佈。將非特異性結合位點在室溫下用含有2%BSA之PBS/0.1%Tween
®-20(Sigma-Aldrich,Buchs,Switzerland)封閉1 h。將B細胞條件培養基自記憶B細胞培養板轉移至ELISA板,且在RT下溫育1小時,然後與偶聯有HRP之驢抗人IgG Fcγ特異性抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, USA)及偶聯有HRP之山羊抗人IgA特異性抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, USA)一起溫育。藉由在標準比色檢定中量測HRP活性來判定結合。僅顯示培養基中含有之抗體與聚-GA DPR而不與BSA結合之B細胞培養物經歷抗體選殖。
實例 2 :抗體序列之測定
上述經鑒定抗(聚-GA)DPR抗體之可變區之胺基酸序列基於其mRNA序列來測定,參見圖1A-F。簡言之,收穫所選非永生化記憶B細胞培養物之活B細胞。隨後,萃取產生所選抗-(聚-GA)DPR抗體之細胞之mRNA且將其轉化為cDNA,且藉由PCR擴增編碼抗體可變區之序列,將其選殖到質體載體中且測序。簡言之,將代表人免疫球蛋白種系庫之所有序列家族之引子組合用於擴增前導肽、V-區段及J-區段。使用5'-端之前導肽特異性引子及3'-端之恆定區特異性引子進行第一輪擴增(Smith等人, Nat Protoc. 4 (2009), 372-384)。對於重鏈及κ輕鏈,使用5'端之V區段特異性引子及3'端之J區段特異性引子進行第二輪擴增。對於λ輕鏈,使用5'端之V區段特異性引子及3'端之C區特異性引子進行第二輪擴增(Marks等人, Mol. Biol. 222 (1991), 581-597;de Haard等人, J. Biol. Chem. 26 (1999), 18218-18230)。
在重組表現完整抗體後,藉由在ELISA上重新篩選來進行具有所要特異性之抗體純系之鑒定。將可變重鏈及輕鏈序列以「正確閱讀框」插入表現載體中,使可變區序列與編碼5'端及3'端之前導肽之序列、與編碼適當恆定域之序列互補,從而達成完整人IgG1抗體之重組表現。為此,引子含有限制性位點,該等限制性位點經設計以促進將可變重鏈及輕鏈序列選殖到抗體表現載體中。藉由將免疫球蛋白重鏈RT-PCR產物框內插入攜帶信號肽及人或小鼠免疫球蛋白γ1之恆定域之重鏈表現載體中來表現重鏈免疫球蛋白。藉由將κ輕鏈RT-PCR產物框內插入輕鏈表現載體中來表現κ輕鏈免疫球蛋白,該輕鏈表現載體提供信號肽及人κ輕鏈免疫球蛋白之恆定域。藉由將λ輕鏈RT-PCR產物框內插入λ輕鏈表現載體中來表現λ輕鏈免疫球蛋白,該λ輕鏈表現載體提供信號肽及人或小鼠λ輕鏈免疫球蛋白之恆定域。
在將Ig-重鏈表現載體及κ或λ Ig-輕鏈表現載體共轉染到HEK 293或CHO細胞(或人或小鼠來源之任何其它合適受體細胞株)中後獲得功能性重組單株抗體。隨後使用標準蛋白A管柱純化自條件培養基中純化重組人單株抗體。可以使用瞬時或穩定轉染之細胞以無限量產生重組人單株抗體。可以藉由直接使用Ig表現載體或藉由將Ig可變區重新選殖到不同表現載體中來建立產生重組人單株抗體之細胞株。亦可以自此等Ig可變區產生諸如F(ab)、F(ab)2及scFv之衍生物。
藉由與資料庫諸如Abysis(http://www.bioinf.org.uk/abysis/)中可獲得之參考抗體序列相比較來判定框架及互補決定區,且使用Kabat編號方案(http://www.bioinf.org.uk/abs/)進行注釋。
實例 3 :對 C9orf72 二肽重複蛋白之 ELISA EC
50 分析
為了測定重組人源C9orf72抗體NI-308.5J10對C9orf72聚-GA DPR之結合特異性及半數最大有效濃度(EC
50),進行ELISA EC
50分析。簡言之,藉由Schafer-N(Copenhagen, Denmark)合成且純化二肽重複蛋白:(GA)15: H-CHHHHHH(GA)
15-OH (SEQ ID NO: 61);(GP)
15: H-C(GP)
15-OH (SEQ ID NO: 62);(GR)
15: H-C(GR)
15-OH (SEQ ID NO: 63);(PA)
15: H-C(PA)
15-OH (SEQ ID NO: 64);(PR)
15: H-C(PR)
15-OH (SEQ ID NO: 65)。將96孔微量培養板(Corning Incorporated, Corning, USA)用塗佈緩衝液(15 mM Na
2CO
3, 35 mM NaHCO
3, pH 9.42)中濃度為5 μg/ml或20 μg/ml之二肽重複蛋白肽塗佈。將非特異性結合位點在RT下用含有2%BSA之PBS/0.1%Tween®-20(Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland)封閉1 h。將NI-308.5J10稀釋至指定濃度且在RT下溫育1 h,然後與偶聯有HRP之驢抗人IgG Fcγ特異性抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, USA)一起溫育。藉由在標準比色檢定中量測HRP活性來判定結合。
藉由使用GraphPad Prism軟體(San Diego, USA)進行非線性迴歸來估計EC
50值。藉由間接ELISA測定人源抗體NI-308.5J10對C9orf72二肽重複蛋白肽(GA)
15(SEQ ID NO: 66)、(GP)
15(SEQ ID NO: 67)、(GR)
15(SEQ ID NO: 68)、(PA)
15(SEQ ID NO: 69)及(PR)
15(SEQ ID NO: 70)之結合特異性及EC
50。抗體NI-308.5J10以亞奈莫耳範圍內之結合親和力來特異性識別聚-GA DPR蛋白(表3,圖2)。總之,藉由RTM™篩選對健康老年人供體群體進行之高通量免疫譜庫分析導致人單株抗體之成功選殖及重組產生,該人單株抗體以高親和力特異性靶向C9orf72六核苷酸擴增相關之聚-GA DPR。
表 3 :人源抗體NI-308.5J10對5種C9orf72 DPR蛋白之EC
50分析。
實例 4 :對經 BSA 偶聯 DPR 肽之結合親和力
EC 50[nM] | |||||
抗體 | (GA) 15 (SEQ ID NO: 66) | (GP) 15 (SEQ ID NO: 67) | (GR) 15 (SEQ ID NO: 68) | (PR) 15 (SEQ ID NO: 70) | (PA) 15 (SEQ ID NO: 69) |
NI-308.5J10 | 0.26 | - | - | - | - |
為了測定重組人源NI-308.5J10抗體對與牛血清白蛋白(BSA)偶聯之聚-GA C9orf72二肽重複蛋白肽之半數最大有效濃度(EC
50),進行ELISA EC
50分析。簡言之,藉由Schafer-N(Copenhagen, Denmark)合成且純化聚-GA二肽重複蛋白:(GA)
15: H-CHHHHHH(GA)
15-OH (SEQ ID NO: 61)。然後經由雙官能接頭(SMCC)將聚-GA DPR蛋白肽偶聯至牛血清白蛋白(BSA)。將96孔微量培養板(Corning Incorporated,Corning,USA)用塗佈緩衝液(15 mM Na
2CO
3, 35 mM NaHCO
3, pH 9.42)中濃度為5 μg/ml之聚-GA BSA偶聯或未偶聯之二肽重複蛋白肽塗佈。將非特異性結合位點在RT下用含有2%BSA之PBS/0.1%Tween®-20(Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland)封閉1 h。將NI-308.5J10稀釋至指定濃度且在RT下溫育1 h,然後與偶聯有HRP之驢抗人IgG Fcγ特異性抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, USA)一起溫育。藉由在標準比色檢定中量測HRP活性來判定結合。
藉由使用GraphPad Prism軟體(San Diego, USA)進行非線性迴歸來估計EC
50值。測定BSA偶聯及未偶聯聚-GA DPR對於抗體NI-308.5J10之可比較結合親和力(表4,圖3)。總之,在此等實驗條件下,抗體NI-308.5J10以與疏水塗佈肽相當之親和力來識別與BSA載體蛋白偶聯之聚-GA DPR肽。
表 4 :對BSA偶聯及未偶聯C9orf72 DPR肽之結合親和力。
實例 5 :對不相關致澱粉樣蛋白之結合特異性分析
EC 50[nM] | |||
抗體 | 肽 | BSA- 偶聯肽 | 未偶聯肽 |
NI-308.5J10 | (GA) 15(SEQ ID NO: 66) | 0.16 | 0.23 |
為了判定NI-308.5J10重組抗體之靶特異性,如下進行間接ELISA。將96孔微量培養板(Corning Incorporated,Corning,USA)用塗佈緩衝液(15 mM Na
2CO
3, 35 mM NaHCO
3, pH 9.42)中濃度為每種肽5 μg/ml之(GA)
15(SEQ ID NO: 66)、(GP)
15(SEQ ID NO: 67)、(GR)
15(SEQ ID NO: 68)、(PA)
15(SEQ ID NO: 69)或(PR)
15(SEQ ID NO: 70)肽或濃度為5-10 μg/ml之不相關靶蛋白塗佈。將非特異性結合位點在RT下用含有2%BSA之PBS/0.1%Tween
®-20(Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland)封閉1 h。將NI-308.5J10抗體以4 nM濃度稀釋且在RT下溫育1 h。使用偶聯有HRP之驢抗人IgG Fcg特異性抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, USA)測定結合,然後在標準比色檢定中量測HRP活性。以高於中值之倍數增加計算靶蛋白之信號。藉由間接ELISA判定NI-308.5J10人源抗體之靶特異性,評估抗體與C9orf72二肽重複蛋白及七種不相關澱粉樣蛋白形成蛋白(IAPP、Ab、HD、TTR、a-syn、Tau、TDP-43)之結合。如圖4所示,人源抗體NI-308.5J10顯示出對聚-GA DPR肽之高結合特異性,其與不相關致澱粉樣蛋白不存在交叉反應性或交叉反應性最小。
實例 6 : C9orf72 二肽重複蛋白之西方墨點分析
為了判定重組人源C9orf72抗體NI-308.5J10對C9orf72聚-GA二肽重複蛋白之結合特異性,進行免疫墨點分析。藉由Schafer-N(Copenhagen, Denmark)合成且純化二肽重複蛋白肽: (GA)
15: H-CHHHHHH(GA)
15-OH (SEQ ID NO: 61);(GP)
15: H-C(GP)
15-OH (SEQ ID NO: 62);(GR)
15: H-C(GR)
15-OH (SEQ ID NO: 63);(PA)
15: H-C(PA)
15-OH (SEQ ID NO: 64);(PR)
15: H-C(PR)
15-OH (SEQ ID NO: 65)。然後經由雙官能接頭(SMCC)將DPR蛋白肽偶聯至牛血清白蛋白(BSA)。簡言之,藉由使用補充有抗氧化劑之Novex® NuPAGE® MES SDS電泳緩衝液(Life Technologies Europe B.V., Zug, Switzerland)進行梯度SDS-PAGE(Novex® Bis-Tris NuPAGE® 4-12%; Life Technologies Europe B.V., Zug, Switzerland)來解析BSA偶聯之二肽重複蛋白肽(0.5 μg)。然後藉由使用Novex® NuPAGE®轉移緩衝液2x(Life Technologies Europe B.V., Zug, Switzerland)在經甲醇活化之PVDF膜(Immobilon®-P Transfer Membrane, Merck & Cie, Schaffhausen, Switzerland)上對經解析蛋白質進行電轉染(Novex® Semi-Dry Blotter, 1 h, 25V)。將非特異性結合位點在4℃下(或者,在RT下1 h)用含有2%BSA之PBS/0.1%Tween®-20(Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland)(PBST)封閉過夜。將NI-308.5J10抗體以10 nM濃度稀釋,且在RT下溫育1 h(或者在4℃下溫育過夜)。在RT下將膜在PBST中洗滌三次,持續15 min,且然後在RT下與偶聯有HRP之驢抗人IgG Fcγ特異性抗體(1:20000或1:10000稀釋,Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, USA)一起溫育1 h。藉由使用ECL及ImageQuant 350偵測(GE Healthcare, Otelfingen, Switzerland)進行膜顯色來判定抗體結合。
藉由西方墨點分析判定人源抗體NI-308.5J10與BSA偶聯之C9orf72二肽重複蛋白(GA)
15(SEQ ID NO: 66)、(GP)
15(SEQ ID NO: 67)、(GR)
15(SEQ ID NO: 68)、(PA)
15(SEQ ID NO: 69)及(PR)
15(SEQ ID NO: 70)之結合特異性。抗體NI-308.5J10特異性識別DPR蛋白聚-GA(圖5)。總之,人源抗體NI-308.5J10可以在SDS PAGE及西方墨點後識別BSA偶聯之聚-GA DPR肽。所觀察到之結合模式與藉由ELISA分析獲得之結果一致。
實例 7 :藉由間接 ELISA 表徵重複序列長度依賴性結合
為了判定重組人源抗體308.5J10與具有不同重複序列大小之C9orf72 DRP之結合親和力,進行ELISA EC
50分析。簡言之,藉由Schafer-N(Copenhagen, Denmark)合成且純化二肽重複蛋白肽: GA
20: H-(GA)
20HHHHHH-NH
2(SEQ ID NO: 71);GA
10: H-(GA)
10HHHHHH-NH
2(SEQ ID NO: 72);GA
6: H-(GA)
6HHHHHH-NH
2(SEQ ID NO: 73);GA
5: H-(GA)
5HHHHHH-NH
2(SEQ ID NO: 74);GA
4: H-(GA)
4HHHHHH-NH
2(SEQ ID NO: 75);GA
3: H-(GA)
3HHHHHH-NH
2(SEQ ID NO: 76);GA
2: H-(GA)
2HHHHHH-NH
2(SEQ ID NO: 77)。將96孔微量培養板(Corning Incorporated, Corning, USA)用塗佈緩衝液(15 mM Na
2CO
3, 35 mM NaHCO
3, pH 9.42)中濃度為50 μg/ml之二肽重複序列蛋白肽塗佈。將非特異性結合位點在RT下用含有2%BSA之PBS/0.1%Tween®-20(Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland)封閉1 h。將NI-308.5J10稀釋至指定濃度且在RT下溫育1 h,然後與偶聯有HRP之驢抗人IgG Fcγ特異性抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, USA)一起溫育。藉由在標準比色檢定中量測HRP活性來判定結合。藉由使用GraphPad Prism軟體(San Diego, USA)進行非線性迴歸來估計EC
50值。
在疏水性肽塗佈後,藉由間接ELISA測定抗體NI-308.5J10對具有不同重複序列長度之C9orf72聚-GA DPR蛋白之結合親和力。對於第一次可偵測結合,抗體NI-308.5J10需要至少6個GA重複序列。偵測到具有10(SEQ ID NO:79)或20(GA)-重複序列(SEQ ID NO:82)之聚-GA DPR之高親和力結合,其反映在亞奈莫耳範圍之EC
50中(表5,圖6)。總之,人源NI-308.5J10抗體顯示出在缺乏與較短重複序列大小之結合之情況下與聚-GA DPR之重複序列長度依賴性結合、及與經延長之二肽重複序列之優先高親和力結合。
表 5 :抗體NI-308.5J10之C9orf72聚-GA重複序列長度依賴性結合。
實例 8 :藉由生物層干涉術表徵結合特性
EC 50[nM] | |||||||
抗體 | (GA) 2 (SEQ ID NO: 71) | (GA) 3 (SEQ ID NO: 72) | (GA) 4 (SEQ ID NO: 73) | (GA) 5 (SEQ ID NO: 74) | (GA) 6 (SEQ ID NO: 75) | (GA) 10 (SEQ ID NO: 76) | (GA) 20 (SEQ ID NO: 77) |
NI-308.5J10 | - | - | - | - | 13.8 | 0.30 | 0.29 |
為了測定NI-308.5J10抗體與(GA)
15(SEQ ID NO:66)二肽重複(DPR)肽之結合常數(K
D、K
a、K
d),已進行了生物層干涉術(BLI)。藉由Schafer-N(Copenhagen, Denmark)合成且純化聚-GA二肽重複蛋白肽: (GA)
15: H-CHHHHHH(GA)
15-OH (SEQ ID NO: 61)。將純的凍乾(GA)
15(SEQ ID NO:66)以10 mg/ml之濃度溶解於DMSO(Sigma-Aldrich,Buchs,Switzerland)中且儲存在-20℃下。簡言之,在Octet RED96儀器(Pall ForteBio LLC, Fremont, USA)上進行生物層干涉實驗。將Octet胺反應性(AR2G)生物感測器用於共價固定(GA)
15(SEQ ID NO:66)二肽重複蛋白肽。用EDC(1-乙基-3-[3-二甲基胺基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽;20 mM水溶液;Pall ForteBio LLC, Fremont, USA)及s-NHS(N-羥基磺基琥珀醯亞胺;10 mM水溶液;Pall ForteBio LLC, Fremont, USA)活化AR2G生物感測器持續300 s,然後將10 mM乙酸鹽緩衝液pH 6(Pall ForteBio LLC, Fremont, USA)中之5 μg/ml(GA)
15(SEQ ID NO:66)肽加載至生物感測器表面持續600 s。在加載肽後,用1 M乙醇胺pH 8.5(Pall ForteBio LLC, Fremont, USA)淬滅AR2G生物感測器持續300 s,在動力學緩衝液(Pall ForteBio LLC, Fremont, USA)中漂洗持續120 s(基線),且在經稀釋動力學緩衝液(在PBS中1:10)中評估不同濃度(30、15、7.5、3.75及1.875 nM)之人NI-308.5J10抗體結合持續600 s。在動力學緩衝液中評估抗體解離持續800 s。藉由收集具有僅PBS參考之資料來引用所有結合資料。藉由使用Octet系統軟體(Pall ForteBio LLC,Fremont,USA)進行資料分析,同時用1:1交互模型進行K
a/K
d全域擬合。在擬合時用來自GraphPad(San Diego, USA)之Prism軟體繪製BLI感測圖。
抗體NI-308.5J10以高親和力KD(0.15±0.02 nM) 結合至聚-GA DPR肽,具有高結合速率常數(K
a=(1.63±0.05)×10
5M
-1s
-1)及在約相同範圍中之解離常數(K
d= 2.4±0.4)×10
-5s
-1)(圖7及表6)。總之,抗體NI-308.5J10以高親和力識別聚-GA DPR肽。
表 6 :抗體NI-308.5J10對聚-GA DPR 肽之結合常數(K
D、K
a、K
d)
實例 9 :藉由生物層干涉術進行競爭性結合測定
抗體 | KD (M) | K a(Ms -1) | K d(s -1) |
NI-308.5J10 | (1.5 ± 0.2) x 10 -10 | (1.63 ± 0.05) x 10 5 | (2.4 ± 0.4) x 10 -5 |
為了判定抗體NI-308.5J10及NI-mAb參考之抗原決定基競爭組,已進行了生物層干涉術(BLI)。藉由Schafer-N(Copenhagen, Denmark)合成且純化聚-GA二肽重複蛋白肽: (GA)
15: H-CHHHHHH(GA)
15-OH (SEQ ID NO: 61)。將純的凍乾(GA)
15(SEQ ID NO:66)以10 mg/ml之濃度溶解於DMSO(Sigma-Aldrich,Buchs,Switzerland)中且儲存在-20℃下。簡言之,在Octet RED96儀器(Pall ForteBio LLC, Fremont, USA)上進行生物層干涉術實驗。將Octet胺反應性(AR2G)生物感測器用於共價固定(GA)
15(SEQ ID NO:66)二肽重複蛋白肽。用EDC(1-乙基-3-[3-二甲基胺基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽;20 mM水溶液;Pall ForteBio LLC, Fremont, USA)及s-NHS(N-羥基磺基琥珀醯亞胺;10 mM水溶液;Pall ForteBio LLC, Fremont, USA)活化AR2G生物感測器持續300 s,然後將10 mM乙酸鹽緩衝液pH 6(Pall ForteBio LLC, Fremont, USA)中之5 μg/ml(GA)
15(SEQ ID NO:66)肽加載至生物感測器表面持續600 s。在加載肽後,用1 M乙醇胺pH 8.5(Pall ForteBio LLC, Fremont, USA)淬滅AR2G生物感測器持續300 s,在動力學緩衝液(Pall ForteBio LLC, Fremont, USA)中漂洗持續120 s(基線)。然後以成對方式評估NI-308抗體之靶標結合:參考NI-308抗體(15 nM,在動力學緩衝液(Pall ForteBio LLC, Fremont, USA)中)與(GA)
15(SEQ ID NO:66)肽進行結合(持續800 s),隨後直接結合(持續800 s)競爭性NI-308抗體(15 nM,在動力學緩衝液(Pall ForteBio LLC, Fremont, USA)中)。藉由收集具有僅PBS參考之資料來引用所有結合資料。藉由使用Octet系統軟體(Pall ForteBio LLC,Fremont,USA)進行資料分析。用來自GraphPad(San Diego, USA)之Prism軟體繪製BLI感測圖。
藉由NI-308.5J10抗體與靶標之預先結合消除了抗體NI-mAb參考與C9orf72二肽重複蛋白肽(GA)
15(SEQ ID NO:66)之結合(圖8A),這表明NI-mAb參考抗體識別亦由NI-308.5J10抗體靶向之結合抗原決定基。藉由NI-mAb參照抗體與靶標之預先結合不會阻斷抗體NI-308.5J10與C9orf72 DPR肽(GA)
15(SEQ ID NO:66)之結合(圖8B),這表明該抗體可能識別聚-GA肽上之其它構形抗原決定基。總之,抗體NI-308.5J10及NI-mAb參考識別共同結合抗原決定基且抗體NI-308.5J10與抗體NI-mAb參考相比可能識別聚-GA肽上之其它構形抗原決定基。
實例 10 :藉由 SDS PAGE 進行抗體完整性分析
為了評估重組人NI-308.5J10抗體之純度及完整性,已進行了SDS PAGE分析。簡言之,藉由瞬時轉染CHO-S細胞來表現人NI-308.5J10抗體,且藉由在FPLC系統(ÄKTApurifier; GE Healthcare Life Sciences)上進行蛋白A親和純化來純化該抗體。在PD-10管柱(GE Healthcare Life Sciences)脫鹽後,在PBS中調配該抗體。在還原條件下藉由使用補充有抗氧化劑之Novex
®NuPAGE
®MES SDS運行緩衝液(Life Technologies Europe B.V., Zug, Switzerland)進行梯度SDS-PAGE(Novex
®Bis-Tris NuPAGE
®4-12%; Life Technologies Europe B.V., Zug, Switzerland),然後進行考馬斯藍染色(Novex
®SimplyBlueTM SafeStain, Life Technologies Europe B.V., Zug, Switzerland),解析2及10 μg經純化重組人NI-308.5J10抗體。因此,重組人NI-308.5J10抗體在還原條件下之SDS-PAGE分析揭示了對應於預期大小之抗體重鏈及輕鏈之兩個主要條帶。未偵測到明顯之污染或蛋白水解降解產物(圖9)。
實例 11 :對死後人 C9orf72-FTLD 及非神經病學對照腦組織中 DPR 聚集物病理之結合分析
為了評估抗體NI-308.5J10與源自人C9orf72-FTLD患者及非神經病學對照之死後小腦組織中之C9orf72二肽重複蛋白之結合,已進行了結合分析。簡言之,藉由在1 mM EDTA緩衝液pH 8.3中蒸煮且微波輻射12 min(600 W)來預處理來自3位具有C9orf72六核苷酸重複擴增之FTLD患者及1位非神經病學對照受試者(BiOBANC HCB-IDIBAPS, Barcelona, Spain)之小腦之經福爾馬林固定、經石蠟包埋5 μm切片以用於抗原修復。藉由在RT下用甲醇中之3%H
2O
2處理10 min來達成內源性過氧化物酶活性之淬滅。將非特異性結合位點在RT下用PBS/5%血清(馬/山羊)/4%BSA封閉1 h。在封閉步驟後,在4℃下將切片與20 nM濃度之人源NI-308.5J10抗體溫育過夜。用生物素化驢抗人IgG(H+L)(1:350稀釋,Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, USA)或抗兔二抗(1:250稀釋,Vector Laboratories; Burlingame, USA)進行偵測,且用Vectastain Elite ABC套組(Vector Laboratories, Burlingame, USA)擴增抗體信號,並用二胺基聯苯胺(DAB, Thermo Scientific, Rockford, USA)偵測。使用Eukitt®封固劑(O. Kindler GmbH;Freiburg,Germany)安裝載玻片。使用Dotslide VS120載玻片掃描儀(Olympus Schweiz AG,Switzerland)進行亮視野造影。藉由對來自患有FTLD之所選患者及非神經病學對照受試者之小腦切片進行免疫組織化學分析,評估NI-308.5J10與病理性C9orf72二肽重複蛋白之結合。如圖10所示,人源NI-308.5J10抗體顯示出在所測試C9orf72-FTLD病例之小腦顆粒細胞層中之顯著神經元細胞質包涵體、神經元核內包涵體及營養不良神經突。相反,非神經病學對照小腦對所測抗體呈陰性(圖10)。總之,人源抗體NI-308.5J10特異性偵測C9orf72-FTLD病例之小腦顆粒細胞層中之C9orf72二肽重複蛋白,而在對照小腦中未觀察到染色,這證明了抗體之高靶標特異性。
實例 12 :鑒定 NI-308.5J10 中之輕鏈糖基化及重鏈 Asn54 脫醯胺
為了鑒定轉譯後修飾,已進行了質譜分析。在用PNG酶F(Prozyme)進行去糖基化之前,藉由加熱使NI-308.5J10 hIgG1變性且用RapiGest(Waters,Inc)處理。在處理後,在37℃下將蛋白質用4 M尿素中之40 mM DTT及10 mM EDTA變性1小時。將RapiGest用0.5%TFA在37℃淬滅1小時,且在LCT Premier質譜儀(Waters,Inc)上分析。在TSKgel Phenyl-5PW管柱(2.0×75 mm,10 μm,TOSOH Bioscience)上達成輕鏈及重鏈之分離。藉由使用MaxEnt 1軟體(Waters,Inc) 進行反摺績來產生分子量。經還原NI-308.5J10之完整質量分析顯示輕鏈之N-糖基化位點幾乎完全被雜合/複合聚糖佔據,且所偵測到之重鏈對應於經預測之pyroGLu23-475。
然後,進行了胰蛋白酶消化/質譜分析。簡言之,將抗體NI-308.5J10還原、烷基化、沉澱且用胰蛋白酶消化。在室溫下,使用2 M尿素、0.15 M tris-HCl、2 mM CaCl
2pH 7.6及5 mM甲胺中之7%(w/w)胰蛋白酶(Promega)進行胰蛋白酶消化持續8小時。為了移除N-聚糖,在溫育6小時後向混合物中加入1.25 mU PNGasF(Prozyme)。在LC-MS分析前,向消化物中加入尿素至最終濃度為4 M。在由UPLC及Xevo G2-S QTof質譜儀(Waters,Inc)組成之LC-MS系統上分析消化混合物。用具有梯度溶離(TFA/乙腈)之Acquity HSS T3 C18管柱(2.1×150 mM,Waters,Inc)來達成消化物之分離。使用BiopharmaLynx軟體處理LC-MS肽作圖資料。以人工方式驗證鑒定。根據離子計數來估算修飾量。分析顯示,重鏈之Asn54極易受到脫醯胺作用。超過85%之HC Asn54為脫醯胺化的,在該樣品中約85%為isoAsp形式。結果概述於表7中。在NI308.5J10Fab之晶體結構中亦觀察到54位之isoAsp。
表 7 :NI308.5J10中Asn殘基脫醯胺之結果
實例 13 : NI-308.5J10 變異體之設計及突變之驗證
氧化位點 | % 脫醯胺 |
LC N33 | 2 |
HC N54 | 96 |
HC N391 | 1.7 |
HC N396 | 0.3 |
選擇一個NI-308.5J10輕鏈突變以移除輕鏈糖基化位點(N75D)。選擇四個NI-308.5J10重鏈突變以移除易脫醯胺之天冬醯胺(N54S,N54T)或55位之甘胺酸(G55S,G55T)。設計構築體以用於表現作為完整人IgG1之變異體。為了表現Fab,設計含有具有C-端六組胺酸標籤之變異體之VH及CH1區之構築體(SEQ ID NO:84)。序列列於表8中。
表 8 :經修飾之NI-308.5J10抗體之胺基酸序列
SEQ ID NO | 質體# | 經修飾之位置 | 胺基酸序列 |
27 | SDD177 | VL-N75D | EIVLTQSPLSLSVTPGEPASISCRSPRSLLHTNGYTYLDWYLQRPGQSPQLLIFLASNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISGVEADDVGVYYCMQGLQPSWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
28 | SDD173 | VH-N54S 完整 hIgG1 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTSGKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
29 | SDD174 | VH-N54T 完整 hIgG1 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTTGKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
30 | SDD175 | VH-G55S 完整 hIgG1 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTNSKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
31 | SDD176 | VH-G55T 完整 hIgG1 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTNTKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
32 | SDD178 | WT Fab-his | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTNGKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCHHHHHH |
33 | SDD179 | VH-N54S Fab-6H | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTSGKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCHHHHHH |
34 | SDD180 | VH-N54T Fab-6H | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTTGKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCHHHHHH |
35 | SDD181 | VH-G55S Fab-6H | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTNSKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCHHHHHH |
36 | SDD182 | VH-G55T Fab-6H | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTYTVLGGSVSDYYWSCIRQPAGKGLEWIGRTYTNTKTTYTYNPSLESRLSLSIDTSMNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARWGAVTGDYYYGMDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCHHHHHH |
為了驗證突變,已進行了NI-308.5J10抗體變異體N54S/N75D之質譜分析。5J10 N54S/N75D hIgG1之完整質量分析顯示,經還原之糖基化抗體中所偵測到之主要成分為所預測之輕鏈及具有經N-連接G0F聚糖之重鏈,這表明N75D突變為成功的。經還原之非去糖基化NI-308.5J10 N54S/N75D hIgG1之反摺績質譜。NI-308.5J10 N54S/N75D hIgG1之完整質量分析顯示,經還原之糖基化抗體中所偵測到之主要成分為經預測之輕鏈及具有經N-連接G0F聚糖之重鏈,這表明N75D突變為成功的。
圖11顯示了其中已定位突變之NI-308.5J10抗體之晶體結構。如可以自晶體結構得到,轉譯後修飾遠離抗體之結合位點。
實例 14 :產生變異體 IgG1 及 Fab
使用FectoPro轉染試劑將由N75D輕鏈與各重鏈突變體組合來組成之工程化抗體NI-308.5J10變異體瞬時轉染到CHO-S細胞中,且在24h後轉移至減小之溫度。使用上述構築體產生作為完整人IgG1且亦作為Fab之蛋白質。藉由離心收集上清液,且藉由穿過0.45um過濾器實現澄清。然後藉由親和層析,接著藉由尺寸排阻層析法純化Fab(表9)。為了純化完整IgG1蛋白,將經澄清之培養基加載到rProtein A瓊脂糖(GE healthcare)上。用20 mM Na
2HPO
4pH 7.4、150 mM NaCl洗滌管柱,且將蛋白質用25 mM NaH
2PO
4pH 2.8、100 mM NaCl溶離,用自0.5 M儲備溶液稀釋之12.5 mM Na
2HPO
4pH 8.6中和。為了純化Fab,將經澄清之培養基加載到NiExcel瓊脂糖(GE Healthcare)上,用緩衝液A(25 mM tris pH8、500 mM NaCl、10 mM咪唑)洗滌,且用含有300 mM咪唑之緩衝液A溶離。在Superdex 200 10/300管柱上在PBS中經親和純化之蛋白質純化。藉由SDS-PAGE分析經純化蛋白質之大小及同質性。對於SDS-PAGE,使樣品在來自Invitrogen之4-20%Tris-甘胺酸梯度凝膠上進行。在電泳之前,將未經還原之樣品在95℃加熱3 min。用含有100 mM DTT之樣品緩衝液處理經還原之樣品,且在電泳前在95℃加熱3 min。SDS-PAGE之結果(圖12)顯示所有蛋白質皆顯示出預期之大小,而無明顯聚集物或蛋白水解產物。
表 9 :NI-308.5J10變異體IgG及Fab之表現
實例 15 :藉由 SPR 得到蛋白質與聚 -GA 之結合
HC | LC | 4D # | 效價 (mg/l) | |||
突變 | 質體 # | 突變 | 質體 # | |||
hIgG1 | WT | SDD151 | WT | SDD152 | #6003 | 134.5 |
WT | SDD151 | N75D | SDD177 | #6207 | 132.3 | |
N54S | SDD173 | N75D | SDD177 | #6208 | 130.1 | |
N54T | SDD174 | N75D | SDD177 | #6209 | 122.4 | |
G55S | SDD175 | N75D | SDD177 | #6210 | 126.5 | |
G55T | SDD176 | N75D | SDD177 | #6211 | 129.3 | |
hIgG1-Fab-6His | WT-Fab-6His | SDD178 | WT | SDD152 | #6212 | 118.1 |
WT-Fab-6His | SDD178 | N75D | SDD177 | #6213 | 97.8 | |
N54S-Fab-6His | SDD179 | N75D | SDD177 | #6214 | 104.1 | |
N54T-Fab-6His | SDD180 | N75D | SDD177 | #6215 | 106.1 | |
G55S-Fab-6His | SDD181 | N75D | SDD177 | #6216 | 102 | |
G55T-Fab-6His | SDD182 | N75D | SDD177 | #6217 | 103 |
藉由使用Biacore T200儀器(GE Healthcare) 進行SPR來評估變異體Fab與合成聚-GA之結合。使用製造商提供之試劑及方案,自SPR緩衝液(10 mM HEPES、pH 7.2、150 mM NaCl、3.4 mM EDTA、0.05% BSA、0.005%表面活性劑P20)中之5 ng/mL溶液中,將合成生物素-8xGA以2-4 pg/mm
2捕獲在Biotin CAPture晶片(GE Healthcare)上。將在SPR緩衝液中1.23、3.7、11、33及100 nM之遞增濃度之一系列變異體抗體Fab片段溶液各自以30 μL/ min注射到經生物素-8xGA塗佈之感測器晶片上持續4 min,然後進行緩衝液洗滌,且在注射期間及最終注射後持續15 min記錄相對於無生物素-8xGA之參考感測器之結合響應。使用1:1結合模型用Biacore T200評估軟體v3.0分析資料。所有NI-308.5J10變異體顯示出與合成8x GA類似之結合動力學,其中K
D為20-30 nM。量測結果列於表10中。由於NI-308.5J10變異體Fab與合成8x GA之SPR結合概況顯示所有NI-308.5J10變異體皆顯示出與合成8x GA類似之結合動力學,其中KD為20-30 nM。
表 10 :藉由SPR量測之NI-308.5J10變異體Fab對8x GA之結合率及親和力。
實例 16 : 5J10 變異體之穩定性
結合速率,k a(M -1s -1) | 解離速率,k d(s -1) | 親和力, K D(nM) | |
5J10 WT Fab | 2.7 x10 5 | 7.8 x10 -3 | 28 |
LC N75D Fab | 2.3 x10 5 | 5.9 x10 -3 | 26 |
HC N54S/LC N75D Fab | 2.9 x10 5 | 6.0 x10 -3 | 21 |
HC N54T/LC N75D Fab | 2.6 x10 5 | 7.6 x10 -3 | 30 |
HC G55S/LC N75D Fab | 1.8 x10 5 | 4.4 x10 -3 | 24 |
HC G55T/LC N75D Fab | 2.0 x10 5 | 4.4 x10 -3 | 22 |
對NI-308.5J10變異體進行了另外的分子穩定性測試。所有變異體藉由差示掃描量熱法(VP-DSC,MicroCal)產生之熱穩定性概況均相似,其中CH2域(完整IgG1)之解構溫度約為72℃,Fab之解構溫度範圍為79-81℃,CH3域之解構溫度> 86℃(表11)。
表 11 :NI-308.5J10變異體之熱穩定性。對於完整IgG,藉由DSC觀察到之三個主要熔化轉變發生在以下溫度:T
m1,其表徵hFc CH2域之解折疊;T
m2,其表徵Fab(CH1,VH,CL,VL)之解折疊;及T
m3,其表徵hFc CH3域之解折疊。對於5J10 hIgG1,由於與T
m2(*)之重疊而無法判定T
m1及T
m3。對於Fab,觀察到一個解構轉變,其表徵Fab(CH1、VH、CL、VL)之解折疊。
實例 17 :用於研究 C9orf72 DPR 蛋白之致病機制之基於細胞之模型
分子 | Tm 1 CH2 | Tm 2 Fab | Tm 3 CH3 |
5J10 hIgG1 | * | 80.2 | * |
5J10-LC N75D hIgG1 | 72.9 | 80.0 | 87.0 |
5J10-LC N75D, HC N54S hIgG1 | 72.6 | 80.6 | 87.2 |
5J10-LC N75D, HC N54T hIgG1 | 72.9 | 79.0 | 86.7 |
5J10-LC N75D, HC G55S hIgG1 | 72.7 | 79.7 | 86.9 |
5J10-LC N75D, HC G55T hIgG1 | 72.5 | 79.8 | 86.9 |
5J10 Fab | NA | 80.2 | NA |
5J10-LC N75D Fab | NA | 80.2 | NA |
5J10-LC N75D, HC N54S Fab | NA | 80.7 | NA |
5J10-LC N75D, HC N54T Fab | NA | 79.3 | NA |
5J10-LC N75D, HC G55S Fab | NA | 80.2 | NA |
5J10-LC N75D, HC G55T Fab | NA | 80.2 | NA |
最近在新興細胞培養及動物模型中之報道提供了異常C9orf72 DPR蛋白毒性之證據。例如,細胞培養系統中細胞質聚-GA之毒性由May等人 (Acta Neuropathol. 128 (2014), 485-503)及Zhang等人 (Acta Neuropathol. 128 (2014), 505-524)報道。
如對於τ-(Yanamandra等人, Ann. Clin. Transl. Neurol. 2 (2013), 278-288)及α-突觸核蛋白(Tran等人, Cell Rep. 7 (2014), 2054-2065)所示,為了判定是否可以藉由用本發明之抗體進行處理來預防DPR病理學之擴散,以類似方式使用活體外C9orf72 DPR毒性檢定。特別地,產生合成DNA序列以驅動含有150個二肽重複序列之單個DPR蛋白在ATG依賴性轉譯中表現。採用隨機密碼子策略以確保僅表現所選單個DPR蛋白質序列。為了驅動DPR蛋白在神經元細胞諸如SH-SY5Y、NSC-34、Neuro-2a、iPSC衍生之神經元及原代神經元中表現,將合成DNA序列選殖到由神經元特異性Thy1.2啟動子調節之表現載體中。為了在多種真核細胞諸如HEK293T、U-2 OS、HeLa及Cos細胞中高水準表現,將合成DNA序列選殖到由CMV啟動子調節之表現載體中。衍生自C9orf72患者纖維母細胞之人iPSC衍生之神經元及轉移分化神經元(iNeuron)代表另外的C9orf72 DPR蛋白細胞培養模型。
此等細胞模型可用於測試本發明抗體之治療效用。本發明抗體之治療效果之評估及確認可以藉由經由線粒體及/或半胱天冬酶活性檢定法監測細胞活力、經由細胞溶解及/或膜滲漏檢定法監測細胞毒性、及經由免疫組織化學檢定監測細胞DPR蛋白擴散之抑制來進行。
實例 18 :在 C9orf72 病理學之基因轉殖小鼠模型中驗證抗 DPR 抗體之治療效用
針對易聚集及/或錯誤折疊之蛋白質開發之免疫療法方法在若干神經退行性疾病之臨床前及臨床研究中產生了有希望的結果。如WO 2016/050822 A2之實例15中所述,進行主題抗DPR抗體在C9orf72病理學之基因轉殖小鼠模型中之治療效用之驗證。此外,已開發出C9orf72 BAC基因轉殖小鼠品系,其顯示C9orf72疾病之病理學標誌,包括來自RAN轉譯之RNA病灶及二肽重複蛋白以及相關之認知缺陷及存活表現型(Liu等人, Neuron 90 (2016), 521-34及Jiang等人, Neuron 90 (2016), 535-50),該等品系適用於證實抗-DPR抗體之治療效用。此外,合適基因轉殖小鼠品系,即表現具有約500個六核苷酸重複之人C9orf72基因之所謂C9-500 BAC基因轉殖小鼠品系,可自Jackson Laboratory,600 Main Street,Bar Harbor,ME USA 04609以FVB/NJ-Tg(C9orf72)500Lpwr/J商購獲得。該品系之半合子小鼠出現年齡依賴性麻痹、焦慮樣行為、存活率降低及大腦及脊髓之廣泛神經變性,伴有有義/反義RNA灶之積累及RAN蛋白與TDP43之聚集。C9-500小鼠允許研究急性、快速進展性疾病以及緩慢進展性疾病。因此,此為用於研究家族性肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS或Lou Gehrig病)及額顳葉癡呆(FTD)中C9orf72重複序列長度依賴性毒性增加之模型,且因此為用於確認主題抗體治療效用之較佳小鼠模型。
此外,同時開發了其它動物模型;參見例如Simone等人(2018),同上中描述之果蠅模型及國際申請案WO 2018/064600中描述之非人動物模型。將自此類動物模型產生之活體內資料轉化為對應人類疾病之療法之策略亦為熟習此項技藝者已知的;參見例如Picher-Martel等人, Acta Neuropathologica Communications 4 (2016), 1-29。特別地,可以自Aducanumab之開發中獲得指導,該Aducanumab為一種能夠靶向阿茲海默病患者腦中之β-澱粉樣蛋白(Aβ)之重組人源抗體,且迄今為止在I期及II期臨床試驗中顯示出有希望的結果。在國際申請案WO 2008/081008中描述了Aducanumab之前導抗體之產生及其生物化學及免疫組織化學性質以及在阿茲海默病小鼠模型中之活體內生物活性之研究,該申請案之揭露內容以引用之方式併入本文。如WO 2008/081008之實例4中所示,當以3 mg/kg之劑量腹膜內且每週投與時,抗Aβ抗體能夠在阿茲海默病基因轉殖小鼠模型中改善異常認知行為且使得β-澱粉樣蛋白斑塊負荷減少。如可在臨床試驗中證實的,該小鼠模型中使用之劑量及治療方案亦證明在臨床試驗中為有效的,其中已經研究了1與10 mg/kg之間(包括3 mg/kg)之劑量。因此,引起疾病之病理性蛋白質之基因轉殖小鼠模型可以很好地用於預測人類患者中給定抗體之治療效用。
關於主題抗體及其變異體之投藥方式及劑量,基於過度表現引起疾病之人超氧化物歧化酶1(SOD1)突變異體從而導致肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)之症狀發展之基因轉殖小鼠的外周抗體治療之治療潛力研究,在抗SOD1抗體之直接腦輸注及外周投藥後,可以證明治療為有效的,特別是當以3至30 mg/kg之劑量每週腹膜內(i.p.)注射投與時;參見Maier等人, 2018, Science Translational Medicine。由於與經錯誤折疊且經聚集SOD1存在於患有ALS之患者之腦中類似地,含有聚-GA-DPR之蛋白質自C9orf72基因轉譯且可甚至共聚集,因此謹慎地預期主題抗體及其變異體在相同劑量方案中為有效的,亦即每週以3至30 mg/kg腹膜內注射。因此,在一較佳實施例中,將抗DPR抗體及其DPR結合片段調配在醫藥組成物中,將其設計成每週以3至30 mg/kg之劑量經由腹膜內注射來投與。因此,亦根據本發明每週以3至30 mg/kg之劑量腹膜內注射主題抗體為較佳投藥方案。
此外,由於人免疫系統內之進化優化及親和力成熟,本發明之抗體提供了有價值之治療工具,此歸因於自具有高概率優異安全性概況且缺乏免疫原性之健康人受試者中分離。可以藉由上述出版物中描述之測試方法用人抗體替代小鼠抗體來提供對此等預期治療效果之確認。
無
圖 1 :人抗體NI-308.5J10及其變異體之可變區之胺基酸序列。框架(FR)及互補決定區(CDR)予以指示,且CDR經加下劃線。使用Kabat編號方案(參閱http://www.bioinf.org.uk/abs/;Kabat等人, U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」 (1983),其在所提到之網路參考文獻中提及且在WO 2016/050822 A2之表1中在第39及40頁中給出,其以引用之方式併入本文。除非另有說明,否則提及本發明之抗體或其DPR結合片段、變異體或衍生物中特定胺基酸殘基位置之編號係根據Kabat編號系統,然而該編號系統為理論上的且可能不同等地適用於本發明之各種抗體。例如,取決於第一CDR之位置,後續CDR可以在任一方向上移位。因此,在關於圖1及/或序列表中之CDR之指示之任何不經意之錯誤或不一致之情況下,基於本申請案之揭露內容,亦即抗體NI-308.5J10之可變重鏈(V
H)及可變輕鏈(V
L)胺基酸序列,熟習此項技藝者很好地根據Kabat來判定正確的CDR序列,該編號系統應用於定義要求保護之抗體及其DPR結合片段。(A)如SEQ ID NO:2及7所示之抗體NI-308.5J10之可變重鏈VH及輕鏈VK序列;(B)SEQ ID NO:12所示之具有胺基酸取代N54S之抗體NI-308.5J10變異體之可變重鏈序列VH。可變重鏈及輕鏈序列之CDR內之較佳胺基酸取代以粗體表示,包括存在於(c)至(e)所示之可變重鏈序列及(f)所示之可變輕鏈序列中之彼等者。如在說明書中進一步解釋的,在CDR及/或框架區內,保守性胺基酸取代係較佳的,其考慮到單獨或與相鄰胺基酸一起之原始胺基酸之物理化學性質,如在Mirsky等人, Mol. Biol. Evol. 32 (2014) 806-819在第813頁圖6中所說明,特別是LG模型,例如使得兩個胺基酸之位置改變,例如,在VL-CDR3中,「PS」變成「SP」,該改變已經在具有相似但不相同之結合特徵之人源抗聚 GA抗體之可變輕鏈中發現,這可能歸因於在一或多個其它CDR中另外超過兩個胺基酸取代。(C)SEQ ID NO:15所示之具有胺基酸取代N54T之抗體NI-308.5J10變異體之可變重鏈序列VH;(D)SEQ ID NO:18所示之具有胺基酸取代G55S之抗體NI-308.5J10變異體之可變重鏈序列VH;(E)SEQ ID NO:21所示之具有胺基酸取代G55T之抗體NI-308.5J10變異體之可變重鏈序列VH;(F)SEQ ID NO:24所示之具有胺基酸取代N75D之抗體NI-308.5J10變異體之可變輕鏈序列VK。
圖 2 :C9orf72二肽重複蛋白之結合特異性及EC
50測定。人源NI-308.5J10抗體對C9orf72二肽重複蛋白肽(GA)
15(¡)(SEQ ID NO:66)、(GP)
15()(SEQ ID NO:67)、(GR)
15之EC
50()(SEQ ID NO:68)、(PA)
15(¿)(SEQ ID NO:69)、(PR)
15()(SEQ ID NO:70)及BSA對照(r)之EC
50藉由間接ELISA測定。抗體NI-308.5J10以0.26 nM之結合親和力特異性識別C9orf72 DPR蛋白肽(GA)
15(SEQ ID NO:66)。
圖 3 :BSA偶聯及未偶聯之C9orf72二肽重複蛋白肽之EC
50測定。使用間接ELISA,測定人源NI-308.5J10抗體對BSA偶聯()及未偶聯(¡)C9orf72二肽重複蛋白肽(GA)
15(SEQ ID NO:66)、(GP)
15(SEQ ID NO:67)、(GR)
15(SEQ ID NO:68)、(PR)
15(SEQ ID NO:69)、(PA)
15(SEQ ID NO:70)或BSA對照(r)之半數最大有效濃度(EC
50)。抗體NI-308.5J10以相似之結合親和力識別BSA偶聯(0.16 nM)及未偶聯(0.23 nM)C9orf72 DPR蛋白肽。
圖 4 :人源抗-(聚-GA)DPR抗體NI-308.5J10與不相關聚集蛋白之結合特異性分析。抗體與C9orf72(GA)
15(SEQ ID NO:66)、(GP)
15(SEQ ID NO:67)、(GR)
15(SEQ ID NO:68)、(PR)
15(SEQ ID NO:70)及(PA)
15(SEQ ID NO:69)肽及5種不相關致澱粉樣蛋白之結合藉由間接ELISA測定。抗體NI-308.5J10-顯示與C9orf72(GA)
15(SEQ ID NO:66)肽之結合,不存在與不相關分析物之顯著脫靶結合。在20 nM濃度下測試NI-308.5J10抗體。
圖 5 :NI-308.5J10抗體對C9orf72二肽重複蛋白之結合選擇性。藉由西方墨點分析來測定人源抗體NI-308.5J10 C9orf72對BSA偶聯之C9orf72二肽重複蛋白肽(GA)
15(SEQ ID NO:66)、(GP)
15(SEQ ID NO:67)、(GR)
15(SEQ ID NO:68)、(PA)
15(SEQ ID NO:69)及(PR)
15(SEQ ID NO:70)之結合選擇性。C9orf72聚-GA DPR蛋白經抗體NI-308.5J10識別。
圖 6 :抗體NI-308.5J10之C9orf72 DPR蛋白重複序列長度依賴性結合。藉由間接ELISA測定人源NI-308.5J10抗體對C9orf72聚-GA二肽重複蛋白肽之二肽重複序列長度依賴性結合特異性及半數最大有效濃度(EC
50)。抗體NI-308.5J10分別以在13.8 nM、0.30 nM及0.29 nM之EC
50下之結合親和力靶向DPR蛋白肽(GA)
6(SEQ ID NO:80)、(GA)
10(SEQ ID NO:79)及(GA)
20(SEQ ID NO:82)。圖6按出現順序分別揭示了SEQ ID NO:77、76、75、74、73、72及71。
圖 7 :藉由生物層干涉術表徵NI-308.5J10與聚-GA C9orf72二肽重複蛋白肽之結合。使用生物層干涉術測定抗體NI-308.5J10對C9orf72二肽重複蛋白肽(GA)
15(SEQ ID NO:66)之結合常數KD、K
a及K
d。生物層干涉術(BLI)感測圖顯示NI-308.5J10與經固定之合成(GA)
15肽(SEQ ID NO:66)之結合。以各種濃度運行抗體:30、15、7.5、3.75及1.875 nM。一式三份進行量測。感測圖顯示各測試抗體濃度之單次量測,但是對於最高濃度而言,另外顯示第二資料集。抗體NI-308.5J10顯示(1.5 ± 0.2) x 10
-10M之KD、(1.63 ± 0.05) x 10
5M
-1s
-1之K
a及(2.4 ± 0.4) x 10
-5s
-1之K
d。
圖 8 :藉由生物層干涉術來表徵NI-308.5J10及參考人源抗聚-GA DPR抗體(NI-mAb參考)競爭性結合至聚-GA C9orf72 DPR肽。使用生物層干涉術測定抗體NI-308.5J10及NI-mAb參考對於C9orf72 DPR肽(GA)
15(SEQ ID NO:66)之競爭性結合模式。生物層干涉術(BLI)感測圖顯示NI-308.5J10(A)及NI-mAb參考(B)與經固定之合成(GA)
15肽(SEQ ID NO:66)之競爭性結合。
圖 9 :抗體NI-308.5J10之完整性分析。2或10 μg重組人源NI-308.5J10抗-C9orf72聚-GA DPR抗體之SDS-PAGE分析,然後進行考馬斯藍染色。偵測到對應於預期大小之抗體重鏈及輕鏈的兩個主要條帶。
圖 10 :NI-308.5J10偵測FTLD患者中之病理性C9orf72二肽重複蛋白聚集物。(A)人源NI-308.5J10抗體揭示了所選C9orf72-FTLD病例之小腦顆粒細胞層中之病理性神經元細胞質包涵體、神經元核內包涵體及營養不良神經突。相反,非神經病學對照小腦對NI-308.5J10染色呈陰性。(B)由抗體NI-308.5J10偵測之所選C9orf72-FTLD病例之小腦顆粒細胞層中神經元C9orf72 DPR包涵體之代表性高倍放大影像。
圖 11 :其中已經定位了突變N54S、N54T、G55S、G55T及N75D之NI-308.5J10抗體之晶體結構。如可自晶體結構得到的,轉譯後修飾遠離抗體之結合位點。
圖 12 :NI-308.5J10抗體變異體之完整性分析。由N75D輕鏈與各重鏈突變異體之組合組成之工程化NI-308.5J10抗體變異體以完整人IgG1及Fab形式產生。藉由SDS-PAGE分析經純化蛋白質之大小及同質性,
上部:人IgG1:泳道1,NI-308.5J10 WT/WT;泳道2,NI-308.5J10變異體WT/N75D;泳道3,NI-308.5J10變異體N54S/N75D;泳道4,NI-308.5J10變異體N54T/N75D;泳道5,NI-308.5J10變異體G55S/N75D;泳道6,NI-308.5J10變異體G55T/N75D;
下部:經his標記之Fab:泳道1,WT-Fab-6His/WT NI-308.5J10;泳道2,NI-308.5J10變異體WT-Fab-6His/N75D;泳道3,NI-308.5J10變異體N54S-Fab-6His/N75D;泳道4,NI-308.5J10變異體N54T-Fab-6His/N75D;泳道5,NI-308.5J10變異體G55S-Fab-6His/N75D;泳道6,NI-308.5J10變異體G55T-Fab-6His/N75D。所有蛋白質均顯示出預期大小,而無明顯聚集物或蛋白水解產物。
圖 13A :DPR Ab-1 Fab與GA(例如,聚(GA)之結合。如表面電漿共振所示,DPR Ab-1之Fab片段結合(GA)
8重複序列(SEQ ID NO:81)。
圖 13B :DPR Ab-1之Fab片段結合GA重複肽,如晶體結構所示。
<110> 百健MA公司(BIOGEN MA INC.) 紐立慕公司(NEURIMMUNE AG)
<120> 人源抗-(聚-GA)二肽重複序列(DPR)抗體
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<210> 1
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(372)
<223> /注=「NI-308.5J10可變重鏈(VH)序列」
Claims (27)
- 一種能夠結合自染色體9開放閱讀框72(C9orf72)基因轉譯之具有至少6個重複序列(GA)6(SEQ ID NO:80)之聚甘胺酸-丙胺酸(GA)之二肽重複序列(DPR)之抗體或其DPR結合片段,其中該抗體或其DPR結合片段在其可變區中包含以下六個互補決定區(CDR):(a)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列的VH-CDR1,包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列的VH-CDR2,包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VH-CDR3,包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的VL-CDR1,包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VL-CDR2,及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的VL-CDR3;(b)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列的VH-CDR1,包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的VH-CDR2,包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VH-CDR3,包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的VL-CDR1,包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VL-CDR2,及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的VL-CDR3;(c)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列的VH-CDR1,包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的VH-CDR2,包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VH-CDR3,包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的VL-CDR1,包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VL-CDR2,及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的VL-CDR3;(d)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列的VH-CDR1,包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的VH-CDR2,包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VH-CDR3,包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的VL-CDR1,包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VL-CDR2,及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的VL-CDR3;或(e)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列的VH-CDR1,包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的VH-CDR2,包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VH-CDR3, 包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的VL-CDR1,包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VL-CDR2,及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的VL-CDR3。
- 如請求項1之抗體或其DPR結合片段,其係人源抗體。
- 如請求項1之抗體或其DPR結合片段,其係單株抗體。
- 如請求項1之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含(a)可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL),其中該VH及VL鏈胺基酸序列分別與SEQ ID NO:2及7至少90%相同。
- 如請求項1之抗體或其DPR結合片段,其中該抗體或其DPR結合片段在其可變區中包含以下六個CDR:(a)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列的VH-CDR1,(b)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的VH-CDR2,(c)包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VH-CDR3,(d)包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的VL-CDR1,(e)包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VL-CDR2,及(f)包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的VL-CDR3。
- 如請求項1之抗體或其DPR結合片段,其中該抗體或其DPR結合片段在其可變區中包含以下六個CDR:(a)包含SEQ ID NO:78之胺基酸序列的VH-CDR1,(b)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的VH-CDR2,(c)包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VH-CDR3,(d)包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的VL-CDR1,(e)包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VL-CDR2,及(f)包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的VL-CDR3。
- 如請求項5或6之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含含有SEQ ID NO:12之胺基酸序列的VH鏈。
- 如請求項5或6之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含含有SEQ ID NO:24之胺基酸序列的VL鏈。
- 如請求項5或6之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含含有SEQ ID NO:12之胺基酸序列的VH鏈及含有SEQ ID NO:24之胺基酸序列的VL鏈。
- 如請求項1之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含VH鏈,其中:(a)該VH鏈包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列;(b)該VH鏈包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列;(c)該VH鏈包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列;或(d)該VH鏈包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含VL鏈,其中:(a)該VL鏈包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列;或(b)該VL鏈包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗體或其DPR結合片段,在其可變區中包含VH鏈及VL鏈,其中:(a)該VH鏈包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列,且該VL鏈包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列;(b)該VH鏈包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列,且該VL鏈包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列; (c)該VH鏈包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列,且該VL鏈包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列;或(d)該VH鏈包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列,且該VL鏈包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列。
- 如請求項1至6中任一項之抗體或其DPR結合片段,其中(i)藉由表面電漿共振(SPR)所測定,該抗體或其DPR結合片段對於聚-(GA)8肽(SEQ ID NO:81)所具有之結合親和力對應於小於30nM之KD(解離常數),其中Ka(結合速率)小於5 x 105M-1s-1且Kd(解離速率)小於10 x 10-3s-1;及/或(ii)藉由差示掃描量熱法(VP-DSC)所測定,其Fab片段具有分別在78-82℃範圍內之熱穩定性及解構溫度Tm。
- 如請求項1至6及10至12中任一項之抗體或其DPR結合片段,進一步包含異源多肽序列。
- 如請求項1及4至6中任一項之抗體或其DPR結合片段,其係選自由單鏈Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段、及F(ab')2片段組成之群且/或為嵌合鼠-人抗體或鼠源化抗體。
- 一或多種多核苷酸,其編碼如請求項1至16中任一項之抗體或其DPR結合片段,或其免疫球蛋白VH鏈及免疫球蛋白VL鏈。
- 一或多種載體,其包含如請求項17之多核苷酸。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項17之多核苷酸或如請求項18之載體。
- 一種用於製備抗DPR抗體或其免疫球蛋白鏈之方法,該方法包含(a)培養如請求項19之宿主細胞;及(b)自該培養物中分離該抗體或其免疫球蛋白鏈。
- 如請求項1至6及10至12中任一項之抗體或其DPR結合片段,其係(i)以選自由酶、放射性同位素、螢光團、標誌、旗標及重金屬組成之群之標籤可偵測地標記;或(ii)連接至藥物。
- 一種醫藥組成物,其包含如請求項1至16及21中任一項之抗體或其DPR結合片段、如請求項17之多核苷酸、如請求項18之載體或如請求項19之宿主細胞,以及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種診斷組成物或套組,其包含如請求項1至16及21中任一項之抗體或其DPR結合片段、如請求項17之多核苷酸、如請求項18之載體或如請求項19之宿主細胞。
- 一種如請求項1至16及21中任一項之抗體或其DPR結合片段、如請求項17之多核苷酸、如請求項18之載體或如請求項19之宿主細胞之用途,其係用於製備用於預防性治療與含有DPR之蛋白質或其聚集形式相關或由其引起之疾病之藥物。
- 一種如請求項1至16及21中任一項之抗體或其DPR結合片段、如請求項17之多核苷酸、如請求項18之載體或如請求項19之宿主細胞之用途,其係用於製備用於治療性治療與含有DPR之蛋白質或其聚集形式相關或由其引起之疾病之藥物。
- 如請求項24或25之用途,其中該疾病係選自由肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、額顳葉變性(FTLD)及FTLD-ALS組成之群。
- 一種如請求項1至16及21中任一項之抗體或其DPR結合片段、如請求項17之多核苷酸、如請求項18之載體或如請求項19之宿主細胞之用途,其係用於製備用於在人或動物體內活體內偵測聚-GA DPR蛋白質或向該蛋白質靶向輸送治療及/或診斷劑之藥物。
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