TWI839105B - 用於治療和預防冠狀病毒感染的藥物組合物 - Google Patents
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Abstract
在本文中我們使用Delta病毒株的棘蛋白為抗原開發一種COVID-19疫苗,以提供對抗Delta病毒株的更全面保護,並可能提供對抗其他已知變異株的一定程度的保護。該疫苗結合了基於皂素的奈米粒子形式ISCOM(免疫刺激組合物)佐劑,相比傳統QS-21可提供在T細胞反應上更好的免疫原性。表現出最佳免疫原性的候選疫苗將被進一步開發以進入臨床試驗。
Description
本申請案主張於2022年2月7日提交的美國臨時申請案第63/307,579號及於2022年10月24日提交的美國臨時申請案第63/380,585號的優先權,該些申請案的內容透過引用全部併入本文。
本申請包含一序列表,其係透過電子方式以XML格式提交,透過引用將其全部併入本文。 該XML文本係於2023年2月7日創建,檔名為「OBIP-8PCT_SEQList_CT26.xml」,大小為3,217位元組。
本揭露係關於一種2019冠狀病毒疾病(COVID-19)疫苗,其可針對廣大範圍的嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)變異株提供保護。本揭露提供的COVID-19疫苗(OBI-BCVax)係將Delta病毒株的棘蛋白(spike protein)與基於QS-21的免疫刺激組合物(AB801-ISCOM及OBI821-ISCOM)佐劑加以組合。
自2019年12月SARS-CoV-2大流行爆發以來,截至2022年10月,全球已有超過6.15億的確診病例和650萬的死亡病例。此大流行的持續和廣泛傳播對全球經濟和公共衛生產生了巨大影響。至今已有龐大的努力被投入疫苗開發以控制此一流行病。到目前為止,多達34種疫苗已被官方許可作為疫苗基礎劑或加強劑(Polack FP等人,2020年;Baden LR等人,2021年;Falsey AR等人,2021年;Stephenson KE等人,2021年)。然而,病毒的持續進化使得在不到兩年的時間裡出現了數種變異株,如Alpha、Beta、Gamma、Delta和目前居於主流的Omicron病毒株(Hadj Hassine I,2022;Thakur V和Ratho RK,2022)。鑒於大多數COVID-19疫苗是基於野生型病毒株開發,新出現的變異株能夠逃脫誘發的免疫反應而危害疫苗的保護力。Lopez Bernal表示,與Alpha變異株感染相比,一劑疫苗對抗Delta變異株的效力明顯較低(Lopez Bernal等人,2021)。一些研究指出二劑疫苗接種後,對Delta病毒株的血清中和效價相比對野生型者明顯降低,且對Omicron病毒株的中和活性也明顯降低(Schubert M等人,2022;Andrews N等人,2022;Smid M等人,2022)。這些觀察結果清楚地表示,現有疫苗的保護力可能對新出現的變異株不夠充分。針對變異株的次世代疫苗可能是提高保護力的一條有效途徑。本文之研究旨在開發一種次世代疫苗,無論其作為疫苗基礎劑或者加強劑接種都能誘發對包括Delta和Omicron病毒株在內的變異株的免疫力。
世界衛生組織每週流行病學更新(WHO Weekly Epidemiological Updates;https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants/)定期提供以下更新:SARS-CoV-2分類、需關注變異株(Variants of Concerns,VOCs)的地理分佈、及該些變異株基於研究發表的表型特徵摘要(傳播性、疾病嚴重程度、再次感染風險、及對診斷和疫苗表現的影響)。目前世界衛生組織賦予標籤的病毒株包括:Alpha、Beta、Gamma、Delta及Omicron病毒株。
本揭露提供一種免疫原,其包含具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列的一改造冠狀病毒棘蛋白、與該SEQ ID NO:1之胺基酸序列有至少90%序列同一性的一變異株蛋白、或一免疫活性片段。
在一些實施例中,該冠狀病毒是嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)。
在一些實施例中,該變異株是D614G、Alpha、Beta、Gamma、Delta、Lambda、Omicron病毒株或其組合。
在一些實施例中,該變異株是Delta病毒株。
在一些實施例中,該變異株是Omicron病毒株。
在一些實施例中,該改造冠狀病毒棘蛋白以三聚體形式存在。
在一些實施例中,該改造冠狀病毒棘蛋白能引起針對野生型冠狀病毒棘蛋白的一增強免疫反應。
在一些實施例中,該增強免疫反應是免疫球蛋白M(IgM)效價增加、免疫球蛋白G(IgG)效價增加、或中和抗體效價增加。
本揭露亦提供一種疫苗,包含一免疫原及一佐劑。進一步地,該免疫原包含具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列的一改造冠狀病毒棘蛋白、與SEQ ID NO:1之胺基酸序列有至少90%序列同一性的一變異株蛋白、或一免疫活性片段。
在一些實施例中,該佐劑是選自由氫氧化鋁、弗式佐劑(Freund’s adjuvant)、CpG佐劑、QS-21佐劑、AB801佐劑、及AB801-ISCOM佐劑所組成的群組。
本揭露提供了一種COVID-19疫苗,其可提供對抗SARS-CoV-2變異株的保護力,特別是對Delta及Omicron變異株。該疫苗可作為保護力加強劑,用於已經接種過針對變異株的任何類型疫苗的個體。
本揭露進一步提供一種預防冠狀病毒感染或增強個體對抗冠狀病毒感染之免疫力的方法。該方法包含對一有需要的個體施用有效量的前述免疫原或疫苗。
本文中所用的冠詞「一」及「一種」係指一個或多於一個(即至少一個)該冠詞在文法上的受詞。舉例來說,「一元件」係指一個元件或多於一個元件。
本文中所用的「有效量」係指足以減輕冠狀病毒感染的症狀和跡象的疫苗或醫藥組合物的劑量。
術語「個體(subject)」可以指患有病毒感染的一脊椎動物或被認為需要治療的一脊椎動物。個體包括所有溫血動物,例如哺乳動物,例如靈長類動物,及較佳地為人類。個體亦可以是非人靈長類動物。術語「個體」包括家養動物,如貓、狗等,家畜(例如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)及實驗室動物(例如小鼠、兔、大鼠、沙鼠、豚鼠等)。因此,本揭露範圍涵蓋獸醫用及醫用製劑。
SARS-CoV-2病毒表面的棘蛋白(S蛋白)透過與宿主細胞的ACE2受體結合,在促進病毒感染中發揮重要作用。這使得S蛋白成為疫苗開發的主要目標抗原,其可誘導阻斷病毒感染之中和抗體。
在英國、巴西、美國加州、印度、南非及世界其他地區出現了SARS-CoV-2的不同變異株。Delta變異株B.1.617.2(印度變異株)和Omicron變異株(B.1.1.529)被發現會增加傳播力和再感染率。現有疫苗對這些變異株,特別是對Delta和Omicron變異株的中和活性降低,這可能會增加再感染率,導致進一步變異以及大流行的傳播。儘管疫苗接種率高,但在一些國家仍有感染再次出現,因此迫切需要開發一種能夠中和這些變異株的疫苗。
我們意在藉由使用Delta病毒株的棘蛋白作為抗原來開發這類疫苗,以提供對變異株更全面的保護。在本文中,我們使用Delta病毒株的棘蛋白為抗原開發了一種COVID-19疫苗(OBI-BCVax),以提供對抗Delta病毒株的更全面保護,並可能提供對抗其他已知變異株的一定程度的保護。該疫苗結合了基於皂素(saponin)的奈米粒子形式佐劑ISCOM (immune stimulating complex,免疫刺激組合物),相比傳統QS-21可提供在T細胞反應上更好的免疫原性。
在一實施例中,該大體上籠狀的奈米粒子的粒徑係介於10-5000 nm,該二數值是由動態光散射(DLS)測量而得。
在一實施例中,該大體上籠狀的奈米粒子中的皂素和膽固醇的比例為介於1:1和10:1;而DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,1,2-二油醯-順-甘油-3-磷酸膽鹼)和膽固醇的比例為介於1:1和10:1。
在另一實施例中,該大體上籠狀的奈米粒子中的AB801、膽固醇及DOPC (1,2-二油醯-順-甘油-3-磷酸膽鹼)的比例為介於1:1:1和10:1:10,較佳為5.2:1:2。
基於上述概念,本揭露之研究評估Delta株SARS-CoV-2棘蛋白與AB801-ISCOM佐劑組合的免疫原性,以確定適合進一步開發的COVID-19候選疫苗(OBI-BCVax)。
實施例
實施例1:SARS-CoV-2病毒棘蛋白之製備及特徵分析
為了生成SARS-CoV-2棘蛋白,將含有Delta病毒株棘蛋白序列的一質體轉染ExpiCHO-S 細胞(Thermo Fisher Scientific;貨號A29127)。圖1顯示用於生產delta-S蛋白的蛋白序列設計。一種人類鼻病毒的3C蛋白酶(HRV3C)識別序列被插入棘蛋白和組胺酸(His)標籤之間的序列,以便純化後去除His標籤。其後,使用NEBuilder DNA組裝試劑組(Azenta Life Sciences)將該DNA連接至pcDNA3.4表現載體(Thermo Fisher)。與野生型SARS-CoV-2棘蛋白序列相比,Delta株SARS-CoV-2棘蛋白含有T19R、G142D、EF156-157刪除、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N等突變,該些突變位點與已確知的B.1.617.2變異株一致。依細胞存活狀況,在轉染後8-11天收集培養上清液。用鎳(Ni)管柱(HisPur™ Ni-NTA Resin;Thermo Fisher Scientific;貨號88821)純化含有棘蛋白的細胞培養上清液。沖提樣品以Amicon
®Ultra-15離心過濾裝置(Merck KgaA;貨號UFC9100)濃縮並儲存在4°C。純化的delta-S蛋白透過12% SDS-PAGE驗證,如圖2所示。在變性條件下,該S蛋白在140 KDa處顯示出一主要條帶,其與S蛋白單體的分子量相符。
分子篩-紫外光譜(SEC-UV)分析
每次注入10 µg樣品進行分析,以SARS-CoV-2棘蛋白作為對照樣品(SST)。採用SRT SEC-500, 7.8x300 mm管柱(Sepax Technologies;貨號215500-7830),流動相為pH 7.0的150 mM 磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline,PBS)。以0.5 mL/min進行等位沖提及在30分鐘收集樣品。圖3顯示純化的SARS-CoV-2棘蛋白以SEC管柱分析並以紫外光偵測的層析圖譜。分析結果顯示無論His標籤是否移除,86-90%的蛋白質均以三聚體形式存在,9-13%為高分子量群體(%HMWS)。
實施例2:SARS-CoV-2棘蛋白與人血管收縮素轉化酶2 (ACE2)的結合活性
為了確定人ACE2與Delta株SARS-CoV-2棘蛋白的結合動力學,在Octet儀器(ForteBio)上進行生物膜干涉量測(biolayer interferometry,BLI)實驗。首先,抗人IgG Fc捕捉(AHC)生物感測器捕捉帶有Fc標籤的ACE2蛋白。以檢測緩衝液(PBS中含0.1%牛血清白蛋白(BSA)、0.05% Tween 20)稀釋SARS-CoV-2棘蛋白,S蛋白的最終濃度為0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50 nM。結果顯示於圖4。在檢測緩衝液中,測量指定濃度的ACE2與S蛋白的結合常數和解離常數分別達600秒和900秒。結合速率(on-rate)和解離速率(off-rate)經測定為3.45×10
5(M
-1S
-1)和1.11×10
-4(S
-1),而KD值之計算係採用1:1全域適配模型(global fit model)及ForteBio的資料分析軟體。圖4顯示SARS-CoV-2棘蛋白的KD為3.22E-10 (0.32 nM)。其結合親和力相比其他研究團隊報告的Delta病毒株S蛋白的研究結果(KD = 41 nM)高10倍(Lan J等人,2020;Walls AC等人,2020;Wang Y等人,2022),這可能是由於本文的delta-S蛋白檢測得較低的解離速率。
實施例3:ISCOM佐劑之製備
OBI821佐劑是一種基於皂素的佐劑,其衍生自皂樹(
Quillaja saponaria(QS) Molina)的樹皮。依據物理化學資料的比對,OBI821佐劑在結構上類似於QS-21佐劑。OBI821和QS-21皆以混合異構物的形式存在。OBI821佐劑物質(AS)中共有六種異構物。這六種異構物可分為三組:1990-V1、1990-V2及1858。每組包含二種位置異構物(regioisomers),可標識為A群和B群。OBI821佐劑的細節揭露於PCT申請案公開第 WO2019/191317號。
AB801佐劑也是一種基於皂素的佐劑,其衍生自皂樹(
Quillaja saponariaMolina)的樹皮。依據物理化學資料的比對,AB801佐劑在結構上與OBI821佐劑相似。然而,AB801佐劑物質(AS)中共有7種異構物。AB801的化學結構列於下方式(I):
式(I)
該七種異構物列於表1。圖5D顯示AB801的液相層析質譜(LC-MS)圖,其指示AB801的主要異構物為AB801-1858 (尖峰1:23.5%)及AB801-1990(尖峰3:67.1%)。然而,AB801-1872(尖峰2:2.3%)及AB801-2004(尖峰4:4.8%)異構物只存在於AB801中,不存在於OBI821中。
表1. AB801佐劑物質(AS)的七種異構物
參考號 | R 0 | R 1 | R 2 | R 3 |
AB801-1990-V1A | 木糖 | 芹菜糖 | 脂肪醯基 | H |
AB801-1990-V1B | 木糖 | 芹菜糖 | H | 脂肪醯基 |
AB801-1990-V2A | 木糖 | 木糖 | 脂肪醯基 | H |
AB801-1990-V2B | 木糖 | 木糖 | H | 脂肪醯基 |
AB801-1858 | 木糖 | H | 脂肪醯基/H | H/脂肪醯基 |
AB801-2004 | 鼠李糖 | 芹菜糖或木糖 | 脂肪醯基/H | H/脂肪醯基 |
AB801-1872 | 鼠李糖 | H | 脂肪醯基/H | H/脂肪醯基 |
AB801-ISCOM是由AB801(Amaran)、膽固醇(Sigma)及DOPC (1,2-二油醯-順-甘油-3-磷酸膽鹼)(Avanti)組成。將膽固醇2.32 mg及DOPC 4.72 mg溶於1.5 mL氯仿(chloroform),放入10 mL圓底燒瓶中。在150 mbar真空條件及水浴溫度為45±5°C的旋轉濃縮儀上使氯仿揮發,形成脂質膜結構。用含有12 mg AB801及120 mg β-OG (Octyl-beta-D-glucopyranoside,辛基-beta-D-吡喃葡萄糖苷)的9 mL三羥甲基胺基甲烷緩衝液(Tris buffered Saline,TBS)與該脂質膜進行水合,並將混合物在室溫下搖晃二小時。此溶液被轉移至截留分子量為1 KDa的RC透析膜中,使用SpectraFlo™透析系統在4±2°C下對8 L TBS攪拌透析48小時。透析後,自該溶液取樣測試β-OG的殘留量和顆粒大小(IPC)。最終,在無菌操作台中經由過濾將溶液滅菌。
此外,除了透析法(Julia M等人,2006),我們還嘗試了不同方法(例如脂質膜水合(lipid-film hydration)、乙醇注射(ethanol injection)或逆乙醇注射(reverse ethanol injection)來製備ISCOM基質。透過動態光散射(DLS)分析OBI821-ISCOM的特徵,其結果列於表2。
表2. OBI821-ISCOM的動態光散射(DLS)特徵分析
製備方法 | OBI821:膽固醇:DOPC | DLS測得顆粒大小 | |
Z-平均粒徑(nm) | 多分散指數(PDI) | ||
水合膜 | 5.2:1:2 | 143.08 | 0.286 |
131.6 | 0.28 | ||
139.2 | 0.301 | ||
水合膜 | 4:1:6 | 122.26 | 0.243 |
125.83 | 0.257 | ||
122.12 | 0.274 | ||
水合膜 | 5:1:1 | 71 | 0.245 |
74.88 | 0.249 | ||
73.64 | 0.249 | ||
乙醇注射 | 5.2:1:2 | 4207.76 | 0.185 |
1465.39 | 0.275 | ||
2924.15 | 0.297 | ||
逆乙醇注射 | 5.2:1:2 | 193.61 | 0.145 |
192.12 | 0.164 | ||
189.73 | 0.161 | ||
透析法 | 5.2:1:2 | 46.78 | 0.085 |
透析法 | 5:1:1 | 61.09 | 0.20 |
如前所述(Lendemans DG等人,2006),將前述成分依5.2:1:2的比例混合,然後經透析形成ISCOM奈米粒子基質。簡言之,將磷脂膽鹼(phosphatidylcholine)及膽固醇溶解於氯仿,並在一玻璃瓶中使其混合。將所得溶液轉移至一圓底燒瓶內,在真空下用旋轉濃縮儀使氯仿揮發,接著在Tris緩衝液(TBS)中加入AB801和β-OG (Sigma)。其後,將混合物轉移到震盪器,並在室溫下攪動至獲得一光學上透明的微胞溶液(micellar solution)。將該溶液轉移至截留分子量為1 KDa的透析膜中,對1 L TBS進行透析,以去除過多的膽固醇或DOPC。每8至16小時更換一次緩衝液,持續48小時,以產生平均粒徑為40 nm的AB801-ISCOM。
將delta-S蛋白配製於20 mM Tris (pH 8.0)、150 mM 氯化鈉(NaCl)溶液中,並將AB801-ISCOM配製於145 mM TBS (pH 7.4)溶液中。該delta-S蛋白與ISCOM依3:2的比例混合,而後稀釋得到delta-S蛋白的最終濃度為20 μg/mL及AB801-ISCOM的最終濃度為13.3 μg/mL。EM影像是以負染色法取得。將一滴樣品溶液(4 μL)置於輝光放電鍍碳的銅網上,再用去離子水清洗。以2% (w/v)醋酸鈾(uranyl acetate)染色45秒後,用濾紙移除溶液,並將該銅網放置在操作台上,使其在拍照前風乾。該EM影像是在成功大學(臺灣台南)的國際巨分子與奈米醫學創新研發中心(IMANI)使用JEM-1400穿透式電子顯微鏡(JEOL)記錄,該顯微鏡配備有場發射電子源,加速電壓為120 keV。該影像是用照像系統(Model 895;Gatan, Inc. Ultrascan 4000 4K x 4K CCD)拍攝,放大倍率為80,400倍,微失焦-0.75-1.81 μm。
ISCOM之製備係透過將AB801、膽固醇及DOPC依5.2:1:2的比例混合,其後進行透析,經4次緩衝液更換。透過透析可得到均質的ISCOM奈米粒子。該奈米粒子的大小經由動態光散射(DLS)測定平均為40 nm,多分散指數(PDI)為0.138,說明該奈米粒子的單分散性良好(圖5A)。
利用穿透式電子顯微鏡(TEM)對ISCOM的結構特徵進行分析。如圖5B所示,觀察到均勻且一致的籠狀結構。當delta-S蛋白與AB801-ISCOM混合,如圖5C(右上方)所示,大部分S蛋白在TEM下呈獨立的三聚體,這與SEC分析的結果一致。此外,如圖5C(右下)所示,在S蛋白存在的情況下,AB801-ISCOM維持其籠狀結構。TEM結果顯示,籠狀的ISCOM和S蛋白之間沒有相互作用,並且沒有檢測到聚集現象。
實施例4:COVID-19候選疫苗(OBI-BCVax)免疫原性評估之動物研究
4-1:OBI-BCVax在小鼠中的免疫原性
7週大的雌性BALB/c小鼠(每組n = 5)透過肌肉注射(IM) delta-S蛋白(10 μg)與不同候選佐劑的組合進行免疫注射,該候選佐劑包括氫氧化鋁(50 μg)加CpG 1018 (10 μg)、AB801 (5 μg或10 μg)、以及AB801-ISCOM (5 μg或10 μg)。對照組的小鼠只注射S蛋白(10 μg)。所有小鼠在第0天及第14天接受二次注射。小鼠在第一次免疫接種後的第28天被犧牲,收集各小鼠的脾臟和血清作進一步分析。
使用抗S蛋白酵素連結免疫吸附檢測法(ELISA)測定小鼠血清IgG效價。簡言之,96孔微孔盤上塗布SARS-CoV-2不同變異株的S蛋白(Acro Biosystems),置於4°C下過夜。在PBS中以1% BSA阻斷微孔盤後,對測試樣本進行2倍連續稀釋至稀釋倍數達1:250,接著將其加入微孔盤中,在25°C下反應60分鐘。用PBST緩衝液清洗3次後,將山羊抗小鼠IgG和山葵過氧化酶(HRP)的耦合物加入溶液中,所得混合物在25°C下反應60分鐘,然後加入受質(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)及其後加入終止液(1N HCl)。以微孔盤讀盤儀讀取每個孔在450 nm處的吸光值。SARS-CoV-2病毒株係包括野生型、Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)、Gamma (P.1)、Delta (B.1.617.2)、Omicron (BA.1、BA.2及BA.5)。各樣本的效價是由高於閥值的OD值所對應最高稀釋倍數來確定。
用delta-S蛋白與各種佐劑(包括氫氧化鋁加CpG 1018、AB801及AB801-ISCOM)的組合免疫多組BALB/c小鼠。免疫時程如圖6A所示。在第0天及第14天進行二次注射後,在第28天收集血清樣本進行抗S蛋白IgG效價評估。圖6B顯示抗野生型、Delta (B.1.617.2)及Omicron (BA.1及BA.2)病毒株S蛋白的IgG效價。結果顯示AB801-ISCOM佐劑組呈現最高IgG效價,其次是AB801組及氫氧化鋁加CpG 1018組。用delta-S蛋白連同氫氧化鋁/CpG1018佐劑(50 μg/10 μg)進行免疫注射引起的IgG效價在10
5的範圍內,而用AB801-ISCOM (10 μg)作為佐劑時,IgG效價在10
6(針對Omicron病毒株)至10
7(針對Delta病毒株)的範圍內(圖6B)。
此外,佐劑(AB801及AB801-ISCOM)引發免疫反應的效果呈劑量依賴方式,其中10 µg的佐劑比5 µg的佐劑引發更高的IgG效價。當比較各治療組的免疫原性時,5 µg AB801-ISCOM佐劑組顯示出與10 µg AB801佐劑組相似的IgG效價,說明AB801-ISCOM的佐劑活性比單獨的AB801強約二倍,儘管在統計學上不顯著。
Omicron病毒株S蛋白具有超過30個突變,相比其他變異株有最多突變數,這使Omicron病毒具備更強能力來逃脫現有疫苗。此原因導致由不同變異株S蛋白開發出的疫苗在對抗Omicron病毒的效力上受到影響(Ou J等人,2022)。我們的研究中也觀察到這種現象,相比抗Delta株或抗野生型S蛋白的IgG效價為10
7,抗Omicron株S蛋白的IgG效價約為10
6(圖6B)。
偽病毒的生產和基於偽病毒的中和試驗是由中央研究院RNAi核心設施(RNAi Core Facility)進行。簡言之,用pCMV-ΔR8.91、pLAS2w.Fluc.Ppuro和編碼棘蛋白的質體共轉染HEK293T細胞以產生表現全長變異株棘蛋白的SARS-CoV-2偽病毒,前述變異株包括D614G、B.1.1.7、501Y.V2、P.1、B.1.617.2、BA.1、BA.2及BA.4/BA.5。為了進行中和試驗,將HEK293T-hACE2細胞以1.0×10
4個細胞/孔的密度植入96孔白盤,在37°C下培養16至18小時。將小鼠血清在56°C下熱滅活30分鐘,然後進行2倍連續稀釋至稀釋倍數為1:250。稀釋後的血清與1000轉導單位(transduction unit)的偽病毒等體積混合,使血清最終稀釋度為1:500,而後在37°C培育1小時。培育後,將該混合物添加至預先植入的HEK293T-hACE2細胞,在37°C下培養72小時。透過添加Bright-Glo-Luciferase試劑(Promega)觸發螢光,並依據微孔盤讀盤儀(Infinite F500,Tecan)檢測的螢光來測定相對螢光單位(relative luciferase units,RLU)。僅有偽病毒和僅有細胞的設置分別用作0%和100%抑制的對照組。50%抑制稀釋效價(ID50)表示為50%中和效價(NT50),其計算(n=3)是基於相比對照組使RLU減少50%所需的血清稀釋倍數。幾何平均效價(GMT)是由GraphPad Prism 6版軟體測定。使用單因子變異數分析(one-way ANOVA)和杜氏多重比較檢定(Tukey’s multiple comparison test)計算顯著性。
在第28天收集的血清樣本對偽病毒D614G、Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)、Gamma (P.1)、Delta (B.1.617.2)及Omicron (BA.1 and BA.2)變異株的中和活性亦予以評估。中和活性以pNT50表示,它代表被誘發的IgG在特定血清稀釋倍數下可以抑制50%偽病毒感染的效力。偽病毒中和活性與在IgG效價測定中所觀察到的水準一致。與AB801或氫氧化鋁加CpG 1018相比,AB801-ISCOM佐劑組在所有受測變異株中均表現出最高的中和活性(圖6C)。
此項研究中測試了OBI-BCVax疫苗所引發抗體對不同變異株的中和活性。觀察到對Beta和Omicron病毒株的中和活性較低,這與過往研究發表中疫苗對Beta或Omicron病毒株的有效性較低(Lefevre B等人,2021年)相似。然而,儘管活性較低,當AB801-ISCOM佐劑組在劑量為10 µg時,對Omicron BA.1和BA.2變異株的中和活性仍能達到近10
4的範圍。此一結果表明,以delta-S蛋白為抗原並且以AB801-ISCOM為佐劑的OBI-BCVax可以提供對抗大多數現有變異株(包括BA.1和BA.2在內)的保護(圖6D)。結果顯示,OBI-BCVax誘發對Delta病毒株的中和活性最強,其次按效力高低依序為Alpha、D614、Gamma、Omicron BA.1、BA.2及Beta病毒株。
4-2:細胞激素(cytokine)分析及T細胞反應
將收集自免疫小鼠的脾臟細胞研磨成單細胞懸浮液。該懸浮細胞以2×10
6個細胞/孔的密度植入U型底面96孔盤,並用SARS-CoV-2 S1混合胜肽庫(2 μg/mL,Mabtech)刺激18-20小時。收集該些細胞以進行表面及細胞內標記物染色。首先用抗CD4和抗CD8抗體對細胞表面染色,然後用抗IFN-γ、抗IL-4及抗Granzyme B抗體(Biolegend)進行胞內染色。由Navious EX流式細胞儀(Beckman Coulter)獲取所有流式細胞儀資料,並以Kaluza軟體進行分析。
小鼠IFN-γ、IL-2及IL-4的ELISpot檢測係依據試劑組說明書(Mabtech)進行。簡言之,將收集自免疫小鼠的脾臟細胞研磨成單細胞懸浮液。該懸浮細胞以250,000個細胞/孔的密度植入ELISpot 96孔盤,試驗重複進行。在37°C下以0.4 μg/孔SARS-CoV-2 S1混合胜肽庫(Mabtech)刺激細胞18-20小時,然後用Mabtech ASTOR ELISpot讀盤儀計算斑點數量。
除了評估抗體效價及中和活性,我們亦評估了OBI-BCVax免疫後的T細胞反應。在第28天收集免疫小鼠的脾臟細胞進行CD4和CD8 T細胞群分析。相比氫氧化鋁加CpG 1018組,AB801佐劑組和AB801-ISCOM佐劑組在10 μg的劑量下使CD4
+IFN-γ
+細胞群顯著增加。就CD4
+IL-4
+細胞群而言,各治療組間沒有差異。AB801-ISCOM組以劑量依賴方式誘發CD4
+IFN-γ
+和CD4
+IL-4
+細胞群,但此現象未見於AB801組(圖7A)。
對CD8 T細胞而言,相比氫氧化鋁加CpG 1018組,AB801佐劑組和AB801-ISCOM佐劑組(5 µg和10 µg)皆顯示出明顯更多的CD8
+IFN-γ
+細胞。此外,AB801-ISCOM佐劑組(10 µg)相較AB801組(10 µg)表現出使CD8
+IFN-γ
+群體更大幅增加。另外,在AB801-ISCOM佐劑組檢測到明顯高量的CD8
+Granzyme B
+細胞(圖7B),而在AB801組沒有觀察到CD8
+Granzyme B
+細胞的增加。綜上,這些結果說明ISCOM在引發T細胞反應方面發揮重要作用。
已知第一型輔助性T細胞(Th1)及第二型輔助性T細胞(Th2)在免疫反應中扮演重要角色,Th1型細胞激素傾向於產生用於殺死細胞內病原體的促發炎反應,而Th2細胞涉及對細胞外病原體的防禦。Th1作用細胞的特點是產生發炎性細胞激素,如IFN-γ、TNF-α及IL-2,其能刺激巨噬細胞、NK細胞、CD8
+細胞毒殺性T細胞。Th2作用細胞的特點是產生抗發炎細胞激素,如IL-4、IL-5及IL-13。對於有效的疫苗而言,產生高度的Th1反應以誘發細胞毒殺性T細胞是很重要的。
有鑑於此,我們接著分析細胞激素的產生情況。第28天收集得的脾臟細胞以S蛋白胜肽庫刺激,並用ELISpot檢測法評估IL-2 (Th1)、IFN-γ (Th1)及IL-4 (Th2)的細胞分泌量。結果顯示,AB801或AB801-ISCOM佐劑組以劑量依賴方式誘導IL-2,且其誘導程度較氫氧化鋁加CpG 1018佐劑組更高。在各治療組中,當劑量為10 µg時,AB801-ISCOM組顯示出最高程度的IL-2誘導,分別比AB801組和氫氧化鋁加CpG 1018組高約2至8倍。類似的模式在IFN-γ也可觀察到,AB801-ISCOM (10 µg)在各治療組中誘導IFN-γ的量最高(約比AB801組高2倍),這表示ISCOM在誘導Th1反應上是有效的。此外,IL-4 ELISpot的結果還顯示,與氫氧化鋁加CpG 1018佐劑組相比,AB801佐劑組和AB801-ISCOM佐劑組在10 μg劑量下的斑點數量均較多,但增加的程度不如在IL-2和IFN-γ的增加幅度高(圖7C)。為了進一步評估OBI-BCVax候選疫苗的T細胞反應極化狀況(Th1或Th2),計算ELISpot中IFN-γ/IL-4的比值,如圖7D所示。當該比值大於1時,認定疫苗誘導的Th1反應大於Th2反應。在本研究中,AB801組和AB801-ISCOM組在10 µg時的該比值分別為4和7,表示這兩種佐劑都能誘導明顯較高程度的Th1反應。
4-3:OBI-BCVax作為加強劑的免疫原性研究
在OBI-BCVax作為加強劑的免疫原性研究中,BALB/c小鼠在第0天及第14天經由肌肉注射被施予delta-S蛋白(10 µg)和佐劑AB801-ISCOM (2 µg、5 µg或7.5 µg)。在第28天犧牲8隻小鼠中的5隻,其餘3隻小鼠則持續監測至第84天以評估免疫反應的持續時間。此外,在第56天對曾接受過二次注射的一組動物(n = 5)施加抗原delta-S蛋白(10 µg)和AB801-ISCOM佐劑(7.5 µg)的加強劑,在4週後即第84天犧牲動物。治療細節如圖8A所示。為了進行免疫原性分析,在每次注射前和第14、28、56、70及84天收集所有動物的血液樣本。在第84天從犧牲動物身上收集脾臟。
由於全球大多數人至少接種了二劑COVID-19疫苗,對OBI-BCVax作為加強劑的潛力也進行了評估。除了在第0天及第14天接受二次注射的小鼠組別之外,研究中還納入在第56天進行第三次注射的一組小鼠。施加方案如圖8A所示。8隻接受二次疫苗注射的小鼠中有5隻在第28天被犧牲,其餘3隻小鼠被保留下來並繼續監測IgG效價及中和活性,以評估二劑疫苗注射後免疫反應的持久性。依照圖8A所示的時程表採集各組的血清樣本,以評估抗S蛋白的IgG效價和對現有變異株的中和活性。相比只接受二次注射的小鼠,接受加強劑的組別顯示出抗Delta和BA.2病毒株的IgG效價上升,更重要的是,抗BA.5病毒株的IgG效價在第84天顯著增加(圖8B)。IgG效價的時間歷程顯示於圖8C。對於接受二次注射的小鼠,IgG效價在第4週達到高峰水準,並維持同一水準直到第12週小鼠被犧牲(圖8C)。在接受加強劑的小鼠中,針對Delta和BA.2病毒株以及BA.5病毒株,IgG效價被進一步刺激到更高水準(圖8B及圖8C)。
使用第84天收集的血清樣本來評估加強劑對Delta (B.1.617.2)和Omicron (BA.2和BA.4/BA.5)病毒株的偽病毒中和活性。與IgG效價的研究結果一致,加強劑相比只注射二次的組別引發更高的中和活性,如圖8D所示。無論有無給予加強劑,對Delta病毒株的中和活性在統計學上沒有差異。然而,儘管只接受二次注射的小鼠對BA.2或BA.4/BA.5病毒株的中和活性有限,但接受加強劑的小鼠的中和活性可達到10
4水準(圖8D)。
將連續稀釋的血清與SARS-CoV-2 Delta變異株(臺灣疾病管制署,病毒株號1144)或Omicron BA.1變異株(臺灣疾病管制署,病毒株號16804)在37°C下培養1小時。感染性病毒顆粒的數量以半數組織培養感染劑量(TCID50)的100倍計算。該混合物接著被添加至預先植入Vero E6細胞的培養盤,進行4天培養。該細胞以10%甲醛固定,並以0.5%結晶紫(crystal violate)染色20分鐘。培養盤用水清洗以便對感染狀況進行評分。用Reed和Muench方法計算50%保護效價。圖8E顯示在第84天收集的免疫小鼠血清對SARS-CoV-2 Delta和BA.1變異株的活病毒中和效價。類似的趨勢在偽病毒中和活性測試中也可觀察到,說明OBI-BCVax誘導的免疫力能夠中和Delta及Omicron病毒株的感染。
T細胞群分析顯示,接受加強劑後,CD8
+IFN-γ
+及CD8
+Granzyme B
+細胞群也有增加(圖8F)。綜上,這些結果說明OBI-BCVax作為大範圍對抗各種變異株的加強劑具有很好的潛力。
雖然已對本發明的具體部分予以描述和說明,該些部分應被視為僅是在說明本發明,而非對本發明基於所附請求項之解釋加上限制。本說明書中引用的所有出版物和專利申請案出於各種目的透過引用全部納入本文,如同特定且單獨地指定各別出版物或專利申請案出於各種目的透過引用被全部納入。儘管為了使人清楚理解,已透過說明和舉例的方式對上述發明的一些細節進行描述,但對本領域中具通常知識者而言,基於本發明的教示很容易能在不偏離所附請求項的精神或範圍內對其進行某些變更和修改。
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無
參考所附圖式並結合以下詳細說明可以對本揭露有更完整的理解。圖式中說明的實施例僅是為了例示本揭露的內容,不應解釋為本揭露受到該實施例的限制。
圖1係Delta病毒株之棘蛋白(delta-S)序列的線形圖。如圖所示,delta-S蛋白的突變位點包括T19R、G142D、∆156-157、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R及D950N。
圖2係delta-S蛋白在變性條件下進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析的結果,蛋白質係以InstantBlue染色。
圖3顯示delta-S 蛋白的特徵;候選棘蛋白係透過分子篩-紫外光譜(SEC-UV)分析其特徵。
圖4顯示delta-S蛋白和人血管收縮素轉化酶2(ACE2)之間的結合活性。
圖5係AB801-ISCOM的大小特徵以及AB801-ISCOM與delta-S蛋白三聚體的穿透式電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)影像。圖5A係對AB801-ISCOM進行動態光散射(dynamic light scattering,DLS)分析,經重複分析以證明一致性。圖5B係AB801-ISCOM的穿透式電子顯微鏡(TEM)影像。圖5C係OBI-BCVax的電子顯微鏡(EM)負染色結構分析,OBI-BCVax是由delta-S蛋白及AB801-ISCOM組成。該EM影像顯示delta-S蛋白呈均勻分布的三聚體結構;delta-S蛋白的大小約為20 nm,AB801-ISCOM的大小約為40 nm。圖5D係AB801佐劑的液相層析質譜(LC-MS)圖。
圖6係在BALB/c小鼠中評估OBI-BCVax的免疫原性。圖6A係治療及樣本採集時程表。在第0天及第14天將delta-S蛋白(10 µg)或delta-S蛋白(10 µg)與氫氧化鋁加CpG 1018 (Alum+CpG;50 µg加10 µg,三角形標記)、AB801 (5 µg或10 µg,方形標記)或AB801-ISCOM (5 µg或10 µg,圓形標記,灰色長條)等候選佐劑之組合對BALB/c小鼠進行免疫注射。圖6B顯示在第28天收集的免疫小鼠血清針對野生型、Delta或Omicron病毒株之S蛋白的IgG效價。圖6C顯示免疫小鼠血清針對SARS-CoV-2偽病毒D614G、B.1.1.7、507Y.V2、P.1、B.1.617.2、BA.1及BA.2變異株的中和抗體效價。長條顯示幾何平均效價(GMT),誤差線表示95%信賴區間。資料採用單因子變異數分析(one-way ANOVA)。圖6D顯示AB801-ISCOM組對D614G、B.1.1.7、507Y.V2、P.1、B.1.617.2、BA.1及BA.2變異株的pNT50值(*p <0.05)。
圖7顯示OBI-BCVax免疫注射BALB/c小鼠的T細胞反應。在第0天及第14天將delta-S蛋白(10 µg)或delta-S蛋白與氫氧化鋁加CpG 1018 (Alum +CpG;50 µg加10 µg,三角形標記)、AB801 (5 µg或10 µg,方形標記)或AB801-ISCOM (5 µg或10 µg,圓形標記,灰色長條)等候選佐劑之組合對BALB/c小鼠進行免疫注射,在第28天收集脾臟細胞進行分析。圖7A係以流式細胞儀(flow cytometry)分析CD4 T細胞群,包括CD4
+IFN-γ
+及CD4
+IL-4
+細胞。圖7B係使用免疫小鼠評估CD8 T細胞群,包括CD8
+IFN-γ
+及CD8
+Granzyme B
+細胞。圖7C係利用酵素連結免疫斑點檢測法(ELISpot)分析每2.5E+5個經免疫之脾臟細胞中分泌IL-2、IFN-γ及IL-4的細胞的數量。圖7D顯示計算ELISpot結果中IFN-γ/IL-4的比值。長條表示平均值±標準偏差(SD)。統計上的顯著差異予以標示(*p < 0.05)。
圖8係在BALB/c小鼠中評估OBI-BCVax候選疫苗的免疫原性,小鼠經過加強劑注射。一組小鼠在第0天及第14天用10 µg delta-S蛋白結合不同劑量的AB801-ISCOM (7.5 µg、5 µg、或2 µg)進行免疫注射(白色長條)。另一組小鼠在第0天及第14天接受10 µg delta-S蛋白和7.5 µg AB801-ISCOM的二次注射,並在第56天接受相同劑量的加強劑注射(灰色長條)。圖8A顯示治療時程表及採樣時間。圖8B顯示在第84天收集的免疫小鼠血清針對Delta或Omicron BA.2和BA.5病毒株之S蛋白的IgG效價。圖8C顯示血清IgG反應的時間歷程。圖8D顯示在第84天收集的免疫小鼠血清針對SARS-CoV-2偽病毒B.1.617.2、BA.2及BA.4/BA.5變異株的偽病毒中和抗體效價。長條顯示幾何平均效價(GMT),誤差線表示95%信賴區間。資料採用單因子變異數分析。圖8E顯示在第84天收集的免疫小鼠血清針對SARS-CoV-2活病毒B.1.617.2和BA.1變異株的活病毒中和抗體效價。圖8F顯示以第84天收集的免疫小鼠脾臟細胞評估CD8 T細胞群,包括CD8
+IFN-γ
+及CD8
+Granzyme B
+細胞。長條表示平均值±SD。統計上的顯著差異予以標示(*p < 0.05)。
無
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Claims (8)
- 一種籠狀奈米粒子,包含1,2-二油醯-順-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、膽固醇、及萃取自皂樹(Quillaja saponaria Molina)的皂素,其中該皂素和該膽固醇的比例為介於1:1和10:1;其中該DOPC和該膽固醇的比例為介於1:1和10:1;其中該皂素是QS-21、OBI821或AB801;及其中該籠狀奈米粒子的Z-平均粒徑、厚度或顆粒大小為介於10-5000nm。
- 一種產生如請求項1所述的籠狀奈米粒子的方法,包含以下步驟:(a)製備溶解於一有機溶劑中的膽固醇和DOPC的一脂質混合物,並使該有機溶劑在45±5℃下揮發;(b)加入溶解於三羥甲基胺基甲烷緩衝液(TBS)或磷酸鹽緩衝液(PBS)中的皂素,使皂素:膽固醇:DOPC的最終比例為介於1:1:1和10:1:10,其中該皂素是QS-21、OBI821或AB801;及(c)將反應混合物冷卻至介於0-25℃。
- 如請求項2所述的方法,進一步包含:(d)透過水合膜、乙醇注射、逆乙醇注射或透析法分離形成的奈米粒子。
- 如請求項2所述的方法,其中該有機溶劑是氯仿、乙醇、丙酮、醇類或乙醚。
- 如請求項2所述的方法,其中步驟(b)中該皂素:膽固醇:DOPC的最終比例為5.2:1:2。
- 如請求項3所述的方法,其中該透析法係使用截留分子量為1KDa的透析膜。
- 如請求項2所述的方法,其中步驟(c)中該反應混合物被冷卻至介於2-8℃。
- 一種醫藥組合物,包含如請求項1所述之籠狀奈米粒子及一免疫原,其中該免疫原包含具有SEQ ID NO:1之序列的一改造冠狀病毒棘蛋白或其免疫活性片段。
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