TWI807410B - 用於抑制冠狀病毒的方法以及用於治療冠狀病毒感染相關疾病的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示一種用於抑制冠狀病毒的方法，其包括對一有此需要的個體投藥以維生素A酸以及至少一種二價金屬離子。本發明亦揭示一種用於治療冠狀病毒感染相關疾病的方法，其包括對一有此需要的個體投藥以維生素A酸以及至少一種二價金屬離子。
Description
本件申請案主張於2020年9月8日提申的美國臨時申請案第63/075,557號的優先權。
本發明是有關於一種用於抑制冠狀病毒以及用於治療冠狀病毒感染相關疾病的方法，以及更特別地是有關於使用維生素A酸以及至少一種二價金屬離子的組合來抑制冠狀病毒以及治療冠狀病毒感染相關疾病的方法。
冠狀病毒(Coronaviruses)是一群屬於冠狀病毒科(Coronaviridae)之正義的、單股的RNA病毒，其包括七種會感染人類的物種/分離株，亦即，人類冠狀病毒OC43(human coronavirus OC43,HCoV-OC43)、人類冠狀病毒HKU1(human coronavirus HKU1,HCoV-HKU1)、人類冠狀病毒229E(human coronavirus
229E,HCoV-229E)、人類冠狀病毒NL63(human coronavirus NL63,HCoV-NL63)、中東呼吸道症候群-關聯性冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome-related coronavirus,MERS-CoV)、嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)，以及嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)。值得注意的是，SARS-CoV-2被鑑定為引起當前爆發的冠狀病毒疾病2019(coronavirus disease 2019,COVID-19)之病毒株，該病毒株的迅速散佈被宣佈為全球性大流行，稱為COVID-19大流行。COVID-19的症狀可能是相對非特異性的(non-specific)，包括發燒、咳嗽、疲勞、生痰、嗅覺喪失、呼吸急促、肌肉與關節疼痛、頭痛以及發冷等。COVID-19症狀的進一步發展可能導致併發症，包括呼吸困難、肺炎(pneumonia)、急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress syndrome)、敗血症(sepsis)、敗血性休克(septic shock)、多重器官衰竭(multi-organ failure)，以及死亡。儘管數種COVID-19疫苗已在第III期臨床試驗期間被證實在預防有症狀的COVID-19感染方面具有高效力，來自此類疫苗的所有潛在不良反應直到在普通大眾使用前(亦即，直至進行上市後監視試驗)可能無法被知曉。
藥物重新定位(Drug repositioning)[亦稱為藥物更換用途(drug repurposing)]是對現有藥物進行新治療用途之研究。此研究方向，連同COVID-19疫苗與恢復性血漿轉輸法(convalescent plasma transfusion)的開發，正被積極地推行以開發安全且有效的COVID-19治療。實際上，數種現有的抗病毒藥物(先前被開發或用於SARS、MERS、HIV/AIDS以及瘧疾的治療)正被研究作為COVID-19治療的候選藥物。在這些藥物中有一些已經進入臨床試驗，諸如氯化奎寧(chloroquine)與羥氯奎寧(hydroxychloroquine)、地塞米松(dexamethasone)、法匹拉韋(favipiravir)、洛匹那韋(lopinavir)/利托那韋(ritonavir)、瑞德西韋(remdesivir)等。然而，依據已公佈的隨機對照試驗，這些藥物中尚無被顯示出能明顯有效降低COVID-19患者的死亡率。因此，仍然有迫切的需要去尋找能有效對抗SARS-CoV-2的其他類藥物。
SARS-CoV-2基因體與SARS-CoV所具者共有高度序列相同性。為了達致病毒增殖循環(virus proliferation cycle)以及病毒傳播(viral spread)，SARS-CoV-2與SARS-CoV這兩者皆必不可少地依賴兩種病毒蛋白酶(viral proteases)的活性，亦即，主蛋白酶(main protease)[Mpro，亦被稱為3CLpro或非結構性蛋白5(non-structural protein 5,nsp5)]以及似木瓜素蛋白酶(papain-like protease)[PLpro，非結構性蛋白3(nsp3)的蛋白酶
領域(protease domain)]。PLpro作為潛在標的，由於該酵素在病毒多蛋白(viral polyproteins)的切割與成熟、複製酶-轉錄酶複合物(replicase-transcriptase complex)的組裝(assembly)以及宿主反應的破壞中扮演重要的角色。儘管PLpro與3CLpro的首要功能是以協同方式加工病毒多蛋白，PLpro具有從宿主細胞蛋白質除去泛素(ubiquitin)以及IFN-刺激基因因子15(IFN-stimulatory gene factor 15,ISG15)的額外功能，而使冠狀病毒能夠迴避宿主的先天性免疫反應[亦即，PLpro不僅與病毒複製有關，亦有關於受感染的細胞中信號級聯(signaling cascades)的失調，而此會導致周圍未感染細胞的細胞死亡]。因此，藥物被設計來標靶PLpro以對抗SARS-CoV-2。
因此，本發明之目的是提供一種用於抑制冠狀病毒的方法，其可以減低先前技術的至少一個缺點，以及其包括對一有此需要的個體投藥以維生素A酸以及至少一種二價金屬離子。
本發明之另一個目的是提供一種用於治療冠狀病毒感染相關疾病的方法，其可以減低先前技術的至少一個缺點，以及其包括對一有此需要的個體投藥以維生素A酸以及至少一種二價金屬離子。
本發明的其他特徵與優點在以下參照隨文檢附的圖式之具體例的詳細說明中將變得明顯，其中：圖1顯示實施例2中各組的50%組織培養感染劑量(TCID50)，其中符號“*”表示：當與對照組作比較，p<0.05，符號“**”表示：當與對照組作比較，p<0.01，以及符號“***”表示：當與對照組作比較，p<0.001。
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：術語“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及術語“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
在開發抗冠狀病毒的藥物上，申請人意外地發現到：維生素A酸與至少一種二價金屬離子的組合可在活體外以及活體內抑制冠狀病毒上提供協同效用(synergistic effect)，因此預期該組合可以作為對抗冠狀病毒[特別是引起冠狀病毒疾病2019(COVID-19)的嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型(SARA-CoV-2)]之潛在藥物-更換用途的試劑。
因此，本發明提供一種用於抑制冠狀病毒的方法，其包括對一有此需要的個體投藥以維生素A酸以及至少一種二價金屬離子。
如本文中所使用的，術語“抑制冠狀病毒”意指冠狀病毒複製量的減少以及冠狀病毒複製的完全停滯，或者使冠狀病毒感染減緩、阻斷、停滯或中止。
如本文中所使用的，術語“投藥(administration)”或“投予(administering)”意指藉由任何合適的途徑將一預定的活性成分導入、提供或遞送至一個體中以執行其預期功能。
如本文中所使用的，術語“個體(subject)”意指任何感興趣的動物，諸如人類、猴子、牛、綿羊、馬、豬、山羊、狗、貓，小鼠，以及大鼠。在某些具體例中，該個體是人類。
在某些具體例中，該維生素A酸是13-順-維生素A酸(13-cis-retinoic acid)。
依據本發明，該至少一種二價金屬離子可選自於由下列所構成的群組：Zn2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+，以及它們的組合。在某些具體例中，該至少一種二價金屬離子是Zn2+或Mg2+。在一例示性具體例中，該至少一種二價金屬離子是Zn2+。在另一例示性具體例中，該至少一種二價金屬離子是Zn2+與Mg2+的組合。
依據本發明，該方法可進一步包括對該個體投藥以至少一種選自於由下列所構成的群組中之單價金屬離子：K+、Na+，以及它們的組合。
在某些具體例中，當該至少一種二價金屬離子與該至少一種單價金屬離子組合使用時，該至少一種二價金屬離子是Zn2+與Mg2+的組合，以及該至少一種單價金屬離子是K+。
依據本發明，該至少一種二價金屬離子與該至少一種單價金屬離子的濃度可落在1mM至600mM、1mM至400mM、1mM至200mM或10mM至150mM的範圍內。
依據本發明，該冠狀病毒可選自於由下列所構成的群組：嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)、中東呼吸道症候群冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)、人類冠狀病毒229E(human coronavirus 229E,HCoV-229E)、人類冠
狀病毒OC43(HCoV-OC43)、人類冠狀病毒NL63(HCoV-NL63)、人類冠狀病毒HKU1(HCoV-HKU1)，以及它們的組合。在一例示性具體例中，該冠狀病毒是SARS-CoV-2。
依據本發明，該維生素A酸與該至少一種二價金屬離子可以被分開地、同時地或依序地投藥。在某些具體例中，該維生素A酸與該至少一種二價金屬離子是被依序地投藥。在一例示性具體例中，該至少一種二價金屬離子是在該維生素A酸被投藥之前被投藥，以及該至少一種二價金屬離子與該維生素A酸的投藥之間的時間間隔為至少1小時。
依據本發明，該維生素A酸、該至少一種二價金屬離子以及該至少一種單價金屬離子可以藉由一選自於下列所構成的群組中之投藥途徑而被投藥：口服投藥(oral administration)、非經腸道投藥(parenteral administration)，以及呼吸道投藥(respiratory tract administration)。
依據本發明，該維生素A酸、該至少一種二價金屬離子以及該至少一種單價金屬離子可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服、非經腸道或呼吸道投藥的劑型。該劑型的實例可包括，但不限於：無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablets)、片劑(troches)、口含錠(lozenges)、膠囊(capsules)、散粉劑(dispersible powder)、顆粒劑(granule)、溶液
(solutions)、懸浮液(suspensions)、乳劑(emulsions)、糖漿(syrup)、酏劑(elixirs)、濃漿(slurry)、滴劑(drops)、噴霧(sprays)、氣溶膠(aerosols)，以及類似之物。
該非經腸道投藥的實例可包括、但不限於：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、胸膜內注射(intrapleural injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)、動脈內注射(intraarterial injection)、關節內注射(intraarticular injection)、滑液內注射(intrasynovial injection)、椎管內注射(intrathecal injection)、顱內注射(intracranial injection)，以及舌下給藥(sublingual administration)。
該呼吸道投藥的實例可包括、但不限於：經鼻/鼻內投藥(nasal/intranasal administration)、咽內投藥(intrapharyngeal administration)、氣管內投藥(intratracheal administration)，以及支氣管內投藥(intrabronchial administration)。在一例示性具體例中，該維生素A酸、該至少一種二價金屬離子以及該至少一種單價離子是被經鼻投藥。
依據本發明，該維生素A酸、該至少一種二價金屬離子以及該至少一種單價離子可與一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)一起被
投藥。該藥學上可接受的載劑的實例可包括，但不限於：溶劑(solvents)、緩衝液(buffers)、乳化劑(emulsifiers)、懸浮劑(suspending agents)、分解劑(decomposers)、崩解劑(disintegrating agents)、分散劑(dispersing agents)、黏結劑(binding agents)、賦形劑(excipients)、安定劑(stabilizing agents)、螯合劑(chelating agents)、稀釋劑(diluents)、膠凝劑(gelling agents)、防腐劑(preservatives)、潤濕劑(wetting agents)、潤滑劑(lubricants)、吸收延遲劑(absorption delaying agents)、脂質體(liposomes)，以及類似之物。藥學上可接受的載劑的選用與數量是落在熟習此技藝者的專業素養內。
本文所使用的術語“脂質體”意指一特徵為具有一透過一個或多個形成囊泡的雙層膜而與外部介質隔離的水性內部空間之顆粒。單層或多層囊泡的雙層膜通常是由脂質(亦即，合成或天然來源之兩性分子，其包含有空間上分離的疏水與親水領域)所形成。
例示性脂質體可以是電中性的、帶正電荷的或帶負電荷的脂質體。
一般而言，適於本發明的脂質體的雙層膜包含一脂質混合物，其通常包含有二脂肪鏈脂質(dialiphatic chain lipids)，諸如磷脂(phospholipids)、二甘油酯(diglycerides)、二脂肪醣脂(dialiphatic glycolipids)；單脂質(single lipids)，諸如神經鞘磷
脂(sphingomyelin)以及醣神經鞘脂質(glycosphingolipid)；類固醇(steroids)，諸如膽固醇(cholesterol)；以及它們的衍生物；以及它們的組合。磷脂的實例可包括，但不限於：1,2-月桂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DLPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DMPC)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DPPC)、1-棕櫚醯基-2-硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(1-palmitoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,PSPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(1-palmitoyl 2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine,POPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DSPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DOPC)、氫化大豆磷脂醯膽鹼(hydrogenated soy phosphatidylcholine,HSPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-外消旋-甘油)[1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol)](鈉鹽)(DMPG)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-外消旋-甘油)[1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho(1’-rac-glycerol)](鈉鹽)(DPPG)、1-棕櫚醯基-2-硬脂
醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-外消旋-甘油)[1-palmitoyl-2 stearoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol)](鈉鹽)(PSPG)；1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-外消旋-甘油)[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac glycerol)](鈉鹽)(DSPG)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-外消旋-甘油)[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol)](鈉鹽)(DOPG)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷-L-絲胺酸(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)(鈉鹽)(DMPS)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷絲胺酸(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)(鈉鹽)(DPPS)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷絲胺酸(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)(鈉鹽)(DSPS)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷絲胺酸(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)(鈉鹽)(DOPS)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸鹽(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate)(鈉鹽)(DMPA)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸鹽(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate)(鈉鹽)(DPPA)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸鹽(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphate)(鈉鹽)(DSPA)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸鹽(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate)(鈉鹽)(DOPA)、1,2-二棕櫚醯基-9n-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-dipalmitoyl-9n-glycero-3-
phosphoethanolamine,DPPE)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,POPE)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,DSPE)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,DOPE)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-肌醇)[1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myoinositol)](銨鹽)(DPPI)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸肌醇(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol)(銨鹽)(DSPI)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-肌醇)[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1-myo-inositol)](銨鹽)(DOPI)、心磷脂(cardiolipin)、L-a-磷脂醯膽鹼(L-a-phosphatidylcholine,EPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-乙基磷膽鹼(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine,18：1 EPC)、L-a-磷脂醯乙醇胺(L-a-phosphatidylethanolamine,EPE)、二甲基二(十八烷基)銨(dimethyldioctadecylammonium bromide,DDAB)、1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane,DOTAP)、1,2-二-氧-十八烯基-3-三甲基銨丙烷(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane,DOTMA)，以及3β-[N-(N’,N’-甲基胺乙烷)-胺甲醯基]
膽固醇鹽酸鹽{3β-[N-(N’,N’-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride}。
適合的脂質可以是一或多種前述脂質的脂質混合物、或是一或多種前述脂質與一或多種未列在上述的其他脂質、膜穩定劑或抗氧化劑的混合物。
該雙層膜中的脂質莫耳百分比可以是等於或小於大約50、45、40、35、30、25、20、15、10、5或者介於其間的任一數值或數值範圍(例如，大約5-50%、大約5-45%、大約5-40%、大約5-35%、大約5-30%、大約5-25%、大約5-20%、大約5-15%，或大約5-10%)。
該雙層膜的脂質可以是一第一脂質與一第二脂質的混合物。該第一脂質可選自於實質上由下列所構成的群組：卵磷脂(phosphatidylcholine,PC)、HSPC、DOPC、POPC、DSPC、DPPC、DMPC、PSPC以及它們的組合，以及該第二脂質是選自於實質上由下列所構成的群組：磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine)、磷脂醯甘油(phosphatidylglycerol)、PEG-DSPE、DPPG、DOPG、DOTAP、DOTMA、DDAB以及它們的組合。在其他具體例中，該雙層膜中的第一脂質的莫耳百分比為大約50、45、40、35、30、25、20、15、10或者介於其間的任一數值或數值範圍(例如，大約5-50%、大約5-
45%、大約5-40%、大約5-35%、大約5-30%、大約5-25%、大約5-20%、大約5-15%，或大約5-10%)，以及該雙層膜中的第二脂質的莫耳百分比是介於0.1至大約15、14、13、12、11、10、9、8、7之間或者介於其間的任一數值或數值範圍(例如，大約0.1-15%、大約0.1-10%、大約0.5-15%、大約0.5-10%或大約0.5-7%)。該雙層膜中的第一脂質、第二脂質以及膽固醇的莫耳%大約為25-50%：0.1-15%：15-55%、5-50%：0.1%-15%：10-40%或25-50%：0.5-10%：5-20%。該(等)第一磷脂(DSPC)以及該(等)第二磷脂(DOPE或DDAB)可以呈4：1至6：1的莫耳比例。
該脂質體的雙層膜進一步包含有小於55莫耳百分比的類固醇，較佳地是膽固醇。在該雙層膜中的類固醇(諸如膽固醇)的莫耳%可以是大約15-55%、大約20-55%、大約25-55%、大約15-50%、大約20-50%、大約25-50%、大約15-45%、大約20-45%、大約25-45%、大約15-40%、大約20-40%或大約25-40%。在該雙層膜中的脂質以及膽固醇的莫耳%可以是大約25-50%：15-55%、25-50%：20-55%或25-50%：15-50%。該(等)磷脂以及膽固醇可以呈1：1至3：1的莫耳比例。在該雙層膜中的第一脂質、第二脂質以及膽固醇的莫耳%可以是大約25-50%：0.1-15%：15-55%、5-50%：0.1%-15%：10-40%，或25-50%：0.5-10%：5-20%。
包封有一捕獲劑(trapping agent)的脂質體可藉由任何已知或之後開發的技術而被製備。例如，多層囊泡(multilamellar vesicle,MLV)的脂質體可直接藉由經水合之選定的脂質組成物之脂質膜(lipid film)、噴霧乾燥粉末或凍乾塊與捕獲劑來形成；SUV脂質體以及LUV脂質體可以藉由超音波(sonication)、均質化(homogenization)、微流體化(microfluidization)以及擠壓(extrusion)來對MLV脂質體調整大小而得到。
該維生素A酸、該至少一種二價金屬離子以及該至少一種單價金屬離子的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的病毒感染與病況之嚴重性，以及要被治療的個體之年齡、身體狀況與反應。前述的治療劑之每日劑量可呈單一劑量或是分成數個劑量。
本發明亦提供一種用於治療冠狀病毒感染相關疾病的方法，其包括對一有此需要的個體投藥以如上所述的維生素A酸以及如上所述之至少一種二價金屬離子。該冠狀病毒感染可以由如上所述的冠狀病毒所引起。治療方法中的投藥細節是相同於上述的抑制方法所具者。
依據本發明，冠狀病毒感染相關疾病可以是冠狀病毒疾病2019(COVID-19)、嚴重急性呼吸道症候群(SARS)、中東呼吸道症候群、急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress
syndrome,ARDS)、嚴重下呼吸道疾病(severe lower respiratory tract illness)，或者類流感疾病(influenza-like illness)。在一例示性具體例中，該冠狀病毒感染相關疾病是COVID-19。
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
為了測定維生素A酸與至少一種二價金屬離子的組合是否可以抑制SARS-CoV-2，該組合對於SARS-CoV-2似木瓜素蛋白酶(papain-like protease,PLpro)活性上的活體外抑制效用首先被評估。
經密碼子-最適化(codon-optimized)之編碼野生型SARS-CoV-2 Plpro的基因序列是由Biotools(新北市，台灣)所合成，以及使用NdeI和XhoI限制位址而被次選殖至pET-21a
(Novagen)載體中，而His-標幟編碼區(-LEHHHHHH-)則被保留於C-末端(C-terminus)。
帶有經插入的SARS-CoV-2 PLPro基因的載體被轉形至大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)菌株中(Yeastern Biotech Co.,Ltd.，新北市，台灣)以供用於PLPro在其中的過表現。培養是在補充有安比西林(ampicillin)(100μg/mL)(作為一抗生素標記)的LB培養基[含有1%胰蛋白腖(tryptone)、0.5%酵母萃取物(yeast extract)，以及1% NaCl)中被執行。所得到的培養物最初是在37℃下被培養並且在200 r.p.m.下被震盪。於600nm下的光學密度(OD600)介於0.6和0.8之間時，添加異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)來達致0.4mM的最終濃度以誘導PLpro的表現。培養在18℃下以及200 r.p.m下持續進行歷時20小時。細胞是藉由離心(5,000×g)而被收集並藉由在含有50mM磷酸鈉(sodium phosphate)(pH 7.4)、1.0mM DTT、5%甘油以及100mM NaCl的裂解緩衝液中的超音波作用(sonication)而被破碎。接著細胞碎片是藉由於20,000×g下離心歷時50分鐘而被移除。將上清液裝載至5mL His-Trap HP管柱(GE Healthcare Life Sciences)中，並使用配於50mM磷酸鈉(pH 7.4)以及100mM NaCl中而呈0-500mM的梯度之咪唑(imidazole)來洗提出其中的蛋白質。使用Centricon膜(10 K載斷值，GE
Healthcare Life Sciences)來對含有His-標幟的SARS-CoV-2 PLpro之分離部分(fractions)進行匯集與濃縮。含有His-標幟的SARS-CoV-2 PLpro進一步藉由凝膠過濾層析法(gel filtration chromatography)使用在50mM磷酸鈉緩衝液(sodium phosphate buffer)(pH 7.4)中的Superdex 75凝膠過濾管柱(GE Healthcare Life Sciences)而被純化。SARS-CoV-2PLpro濃度是藉由測量於280nm下的紫外線吸光值並使用一為45270 M-1cm-1的消光係數(extinction coefficient)(ε280)而被測定。
在本實施例中第A項所得到的SARS-CoV-2 PLpro的酵素活性是使用6-員胜肽受質(6-mer peptide substrate)FRLKGG-對硝基苯胺(FRLKGG-para-nitroanilide,FG6-pNA)(純度為97%，由HPLC測得；GL Biochem Ltd.，上海，中國)藉由一以比色法為基礎的胜肽切割分析(peptide cleavage assay)而被測量。在切割分析中，該6-員胜肽基質是在Gly-pNA鍵結處被切割以釋放游離的pNA，而使得溶液的顏色轉變為黃色。酵素活性是藉由在30℃下使用一96-井微量盤分光光度計(microplate spectrophotometer)(EpochTM 2，Biotek)來持續地監測於405nm下的吸光值(A405)而被測定。
具體而言，切割分析是在一96-井微量盤中被進行。該微量盤的各井皆含有50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)，接著FG6-pNA被添加至各井中，而使得具有各種不同的FG6-pNA濃度(0.1875mM、0.375mM、0.75mM、1.5mM、3.0mM、6.0mM)之基質溶液被製備。分析混合物(每井180μL)被預培育歷時10分鐘以用於準確的溫度控制，接著將20μL的SARS-CoV-2 PLpro溶液(1.75μM)添加至該分析混合物中來起始反應。該SARS-CoV-2 PLpro溶液是藉由將本實施例中第A項所得到的SARS-CoV-2 Plpro與50mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.4)混合而被製備。由蛋白質水解所釋放的pNA濃度是藉由測量A405並使用一為9800 M-1cm-1的消光係數(ε405)(於1mM下A405=9.8)而被計算出。
穩定狀態酵素動力學參數是使用OriginPro 8.0軟體(OriginLab公司，美國)基於Michaelis-Menten公式藉由擬合初始速率(V0)數據而被獲得。所有測量被進行三重複。所得到的數據是以平均值±標準差來表示。
Km與kcat數值分別為2.50±0.03mM與0.85±0.01 s-1。因此，這驗證了具有蛋白酶活性的SARS-CoV2 PLPro在本實施例中第A項成功地被製備，且可被用於進行下列SARS-CoV2 PLPro抑制分析。
酵素抑制分析(enzyme inhibition assay)是在一96-井微量盤中被進行。該微量盤的各井皆含有50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)。本實施例中第A項所得到的SARS-CoV2 PLpro(0.9μM)被添加至各井中以形成一酵素溶液。
將井中的酵素溶液分成3個實驗組(亦即實驗組1至3)、3個比較組(亦即比較組1至3)以及1個對照組。將下面表1所示的對應抑制劑分別添加至各組的酵素溶液中以形成試驗混合物(總體積為180μL)。預培育被進行歷時30分鐘。
將20μL的本實施例中第B項所述的FG6-pNA(1.2mM)添加至各組的試驗混合物中以起始酵素反應。該酵素反應被允許在30℃下進行歷時300秒。酵素活性是藉由使用一96-井微量盤分光光度計(EpochTM 2，Biotek)持續地監測405nm下的吸光值
(A405)而被測定。反應速率從而被計算出[反應速率是對於300秒的總反應時間下的吸光值A405對於時間(秒)的斜率]。
抑制百分比是使用下列公式而被計算出：A=[1-(B/C)]×100 (I)
其中：A=抑制百分比
B=各組的反應速率
C=對照組的反應速率
所得到的數據是以平均值±標準差來表示。
所有組別的抑制百分比被顯示於下面表2中。
如表2所示，實驗組1至3的各個抑制百分比顯著地高於比較組1至3之所具者，這表示：與異維A酸、Zn2+，或Mg2+單獨使用相較之下，異維A酸(13-順-維生素A酸)與至少一種二價金屬離子
(在本實施例中，單獨Zn2+、單獨Mg2+，或同時這兩種離子)的組合能夠有效地抑制SARS-CoV2 PLpro的酵素活性。這個實驗結果顯示：異維A酸與二價金屬離子對於似木瓜素蛋白酶(papain-like protease)具有協同的抑制效用(synergistic inhibitory effect)，而提供了對於冠狀病毒的似木瓜素蛋白酶家族的生化性質的重要瞭解，並為有望對抗SARS-CoV2的治療策略做了準備。
由於維生素A酸與至少一種二價金屬離子的組合已被證實具有活體外抗SARS-CoV-2的抑制效用，該組合被進一步測試其活體內對SARS-CoV-2的效用。
金黃敘利亞倉鼠(5-6週大，平均體重約為100g)是得自於國家實驗室動物中心(National Laboratory Animal Center)(台北，台灣)。倉鼠被飼養於一個本技藝中所慣用之無特定病原體(specific-pathogen-free,SPF)條件下的動物房中。此外，水分與飼料被任意採食地(ad libitum)提供給所有的倉鼠。有關倉鼠的一切實驗是委託中央研究院(Academia Sinica)的實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee,ＩACUC)(台灣)並經審查以及認可。
倉鼠在12：00 PM時透過鼻內接種(intranasal inoculation)並以1×104溶菌斑形成單位(plaque-forming units,PFU)而被感染以SARS-CoV-2(得自於中央研究院基因體研究中心詹家琮博士；武漢野生型)[配於磷酸鹽緩衝的生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)中]，以建立SARS-CoV-2動物模型。SARS-CoV-2動物模型的建立被確認(數據未顯示)。
將本實施例中第A項所得到之經感染的倉鼠分成下列5組(每組n=5)：1個對照組、2個實驗組(亦即實驗組1與2)以及2個比較組(亦即比較組1與2)。分別用於這些組別的處理劑被列示於下面的表3中。
用於實驗組1與2以及比較組1與2的處理劑是由台北醫學大學(Taipei Medical University)透過本技藝中所慣用且如本
發明的詳細說明中所述的技術使用脂質體而被製備。由於本發明的主要技術特徵在於維生素A酸與至少一種二價金屬離子的組合，此處省略該脂質體的細節以求精簡。
具體而言，針對實驗組1與2的每隻倉鼠，異維A酸在感染日的8：00 AM(亦即SARS-CoV-2感染前4小時)以0.5mg/kg體重的劑量以及在感染日的8：00 PM以0.5mg/kg體重的劑量透過經鼻投藥(nasal administration)而被投予；異維A酸在感染後2天的8：00 AM與8：00 PM以0.5mg/kg體重的劑量透過經鼻投藥而被投予，每天兩次；以及Zn2+(100μM)、Mg2+(200μM)與K+(200μM)的組合在感染日以及在此之後的2天的6：00 PM至6：30 PM的時間範圍內(亦即在晚上投藥異維A酸前1.5至2小時)以30μL的劑量(針對實驗組1)或15μL的劑量(針對實驗組2)透過經鼻投藥而被投予，每天一次。針對比較組1的每隻倉鼠，異維A酸在感染日的8：00 AM(亦即SARS-CoV-2感染前4小時)以0.5mg/kg體重的劑量以及在感染日的8：00 PM以0.5mg/kg體重的劑量透過經鼻投藥而被投予；以及異維A酸在感染後2天的8：00 AM與8：00 PM以0.5mg/kg體重的劑量透過經鼻投藥而被投予，每天兩次。針對比較組2的每隻倉鼠，Zn2+(100μM)、Mg2+(200μM)與K+(200μM)的組合在感染日以及在此之後的2天的6：00PM至6：30PM的時間範圍內以30μL的劑量透過經鼻投藥而被投予，每天一次。針對對照組
的每隻倉鼠，緩衝液在感染日的8：00 AM(亦即SARS-CoV-2感染前4小時)以100μL的劑量以及在感染日的8：00 PM以100μL的劑量透過經鼻投藥而被投予；以及緩衝液在感染後2天的8：00 AM與8：00 PM以100μL的劑量透過經鼻投藥而被投予，每天兩次。
在3天的處理之後，將倉鼠予以犧牲，取出它們的肺並大體上依照Lien(2021),Sci.Rep.,11(1)：8761.doi：10.1038/s41598-021-88283-8.當中所述的方法來測定病毒負荷量(viral load)。病毒效價(virus titers)是使用Reed-Muench方法而被測定以50%組織培養感染劑量(50% tissue culture infectious dose,TCID50)來表示。所有使用SARS-CoV-2的實驗皆在生物安全第三等級(biosafety level 3,BSL-3)實驗室中被執行且由中央研究院(台北，台灣)所認可。
實驗數據是藉由塔基檢定(Tukey's test)來進行分析，俾以評估各組之間的差異性。統計學顯著性是由p<0.05來表示。
參見圖1，實驗組1與實驗組2的TCID50皆顯著地低於比較組1與比較組2所具者，這說明相較於單獨使用異維A酸或單獨使用Zn2+、Mg2+以及K+的組合，異維A酸與至少一種二價金屬離子
(本實施例中為Zn2+和Mg2+的組合)以及至少一種單價金屬離子(本實施例中為K+)的組合具有較高的活體內抗SARS-CoV2效力。
從實施例1與2的結果可見，這證實了維生素A酸以及至少一種二價金屬離子可以在抑制SARS-CoV2的感染與複製以及治療SARS-CoV2感染相關疾病上提供協同用(synergistic effect)。這種組合確實可以作為藥物-更換用途的試劑。
在上面的說明中，為了說明的目的，許多具體細節已被描述以供徹底瞭解具體例。然而，對於一熟悉本技藝者而言將會明顯的是，一或多個其他具體例可在沒有這些具體細節中的部分者而被實施。亦應被瞭解的是，本說明書通篇所提及之“一個具體例(one embodiment)”、“一具體例(an embodiment)”，一帶有序號標示的具體例等等意指一特定的特徵、結構或特性可被包括在本發明的實施中。在說明中應被進一步瞭解的是，為了精簡本發明並有助於理解各種不同的發明方面之目的，各種不同的特徵有時被集合在一個單一的具體例、圖式或其說明中，在實施本發明時，若適當，來自於一個具體例的一或多個特徵或具體細節可與來自於另一個具體例的一或多個特徵或具體細節一起被實施。
雖然本發明已參照被認為是示範性的具體例而被描述，應被瞭解的是：本揭露內容不限於所揭示的具體例，而意欲涵
蓋被包括在最廣泛的解釋之精神與範疇中之各種不同的配置，俾以包含所有這類的修改以及等效的配置。
Claims (10)
- 一種含有13-順-維生素A酸以及至少一種二價金屬離子的組合供應用於製備一用來抑制嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)之醫藥品的用途，其中該至少一種二價金屬離子是Zn2+與Mg2+的組合。
- 如請求項1的用途，其中該醫藥品進一步包含至少一種選自於由下列所構成的群組中之單價金屬離子：K+、Na+，以及它們的組合。
- 如請求項1的用途，其中該13-順-維生素A酸以及該至少一種二價金屬離子是被分開地、同時地或依序地投藥。
- 如請求項1的用途，其中該至少一種二價金屬離子是在該13-順-維生素A酸被投藥之前被投藥，以及該至少一種二價金屬離子與該13-順-維生素A酸的投藥之間的時間間隔為至少1小時。
- 如請求項1的用途，其中該13-順-維生素A酸以及該至少一種二價金屬離子是由一選自於下列所構成之群組中的途徑而被投藥：口服投藥、非經腸道投藥，以及呼吸道投藥。
- 一種含有13-順-維生素A酸以及至少一種二價金屬離子的組合供應用於製備一用來治療嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染疾病之醫藥品的用途，其中該至少一種二價金屬離子是Zn2+與Mg2+的組合。
- 如請求項6的用途，其中該醫藥品進一步包含至少一種選自於由下列所構成的群組中之單價金屬離子：K+、Na+，以及它們的組合。
- 如請求項6的用途，其中該13-順-維生素A酸以及該至少一種二價金屬離子是被分開地、同時地或依序地投藥。
- 如請求項6的用途，其中該至少一種二價金屬離子是在該13-順-維生素A酸被投藥之前被投藥，以及該至少一種二價金屬離子與該13-順-維生素A酸的投藥之間的時間間隔為至少1小時。
- 如請求項6的用途，其中該13-順-維生素A酸以及該至少一種二價金屬離子是由一選自於下列所構成之群組中的途徑而被投藥：口服投藥、非經腸道投藥，以及呼吸道投藥。
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