TWI796892B

TWI796892B - 萃取杭菊中之黃酮苷元的方法、由此方法獲得的萃取物以及抗發炎醫藥組成物

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Publication number: TWI796892B
Application number: TW110148329A
Authority: TW
Inventors: 姚心然; 陳俞汶; 呂居勳; 潘一紅; 陳玟吟; 楊宗霖; 佳佳吳
Original assignee: 財團法人工業技術研究院
Priority date: 2021-12-23
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2023-03-21
Also published as: TW202325326A

Abstract

提供一種萃取杭菊中之黃酮苷元(flavone aglycones)的方法。該方法包括：(a) 將一杭菊原料浸泡於一水或水溶液中以進行一浸泡程序3.5小時以上，以獲得一浸泡樣本；以及(b) 將一萃取溶劑加入該浸泡樣本中以進行一萃取程序5-60分鐘，以獲得一萃取液。該杭菊原料包括一杭菊之下列部位的至少一者：全株、根、莖、葉與花。

Description

萃取杭菊中之黃酮苷元的方法、由此方法獲得的萃取物以及抗發炎醫藥組成物

本揭露係關於一種萃取杭菊中之黃酮苷元的方法、由此方法獲得的萃取物以及抗發炎醫藥組成物。

杭菊屬於菊科(Asteraceae)植物，為多年生草本植物，主要產於臺灣及中國大陸等亞洲地區。

杭菊之頭狀花序經乾燥後可作為飲品，且其也屬於傳統上之藥用植物。現代藥理研究顯示，杭菊具有抗氧化、抗發炎、抗病毒、抗腫瘤、神經保護及心血管保護作用。杭菊中含菊苷、氨基酸、黃酮類及各種維生素與微量元素。杭菊的化學成分複雜，其中黃酮類化合物、三萜類化合物與揮發油是其主要有效成分，然而，由於產地與品種不同，不同來源之杭菊的化學成分組成與含量具有差異性。

黃酮類化合物是植物合成的一種二次代謝產物，它在植物的生長、發育、開花、結果以及抗菌防病等方面有重要的作用，黃酮類化合物在植物體中通常與糖結合成糖苷類，小部分以游離態(aglycones)的形式存在。先前的研究顯示游離苷原的黃酮類較糖苷類衍生物有較佳的抗發炎活性。近年來許多研究人員嘗試以酵素水解或微生物發酵的方法來將黃酮類糖苷衍生物水解成游離苷原，然而額外添加酵素方式或微生物發酵的方式，使萃取成本大幅提升。

因此，目前亟需一種新穎之黃酮苷元萃取方式，其可有效萃取出杭菊之黃酮苷元，但又不需任何酵素之添加及/或微生物處理。

本揭露提供一種萃取杭菊中之黃酮苷元(flavone aglycones)的方法，包括：(a) 將一杭菊原料浸泡於一水或水溶液中以進行一浸泡程序3.5小時以上，以獲得一浸泡樣本；以及(b) 將一萃取溶劑加入該浸泡樣本中以進行一萃取程序5-60分鐘，以獲得一萃取液。該杭菊原料包括一杭菊之下列部位的至少一者：全株、根、莖、葉與花、該杭菊原料與該水或水溶液的重量比為1:10-35，該浸泡程序係於20至70℃下進行，該水或水溶液具有3.0至9.5之pH值，且該浸泡樣本包括一經浸泡之杭菊原料與一浸泡液。又，該杭菊原料與該萃取溶劑的重量比為1:10-35，該萃取溶劑包括甲醇、乙醇或乙酸乙酯，該萃取程序於15至50℃下進行，且該萃取液含有黃酮苷元。

本揭露也提供一種杭菊萃取物，其係藉由上述之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法所獲得。

本揭露還提供一種抗發炎之醫藥組成物，包括：一杭菊萃取物，其係藉由上述之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法所獲得；以及一藥學上可接受之載體或鹽類。

為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：

本揭露係提供一種萃取杭菊中之黃酮苷元(flavone aglycones)的方法。而，上述黃酮苷元可包括，但不限於，木犀草素、芹菜素等或其組合。

本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，僅需經由一水或水溶液的浸泡步驟，即可在不須外加任何酵素的情況下，有效萃取出杭菊中之黃酮苷元。又，即便將本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，全程於室溫下進行，也仍可有效萃取出杭菊中之黃酮苷元。因此，本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法可有效降低萃取成本，並具有節能減碳的效果。

此外，藉由使用本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，可大幅提升杭菊原料之黃酮苷元的萃取率。

而上述本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，可包括，但不限於以下步驟。

首先，將一杭菊原料以一水或水溶液浸泡以進行一浸泡程序3.5小時以上，以獲得一浸泡樣本。而上述浸泡樣本可包括一經浸泡之杭菊原料與一浸泡液。

而於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，上述杭菊原料，可包括一杭菊之下列部位的至少一者：全株、根、莖、葉與花。在一實施例中，上述杭菊原料可為杭菊之花。在另一實施例中，上述杭菊原料可為杭菊之莖與葉。

在一實施例中，上述杭菊原料可經過一前處理，但不限於此。上述前處理包括，乾燥處理、粉碎處理等或其任意組合。在一實施例中，上述前處理包括乾燥處理與粉碎處理。

又，於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，執行上述浸泡程序的時間除了須為3.5小時以上之外，並無特殊限制，而可依據當時操作環境（如溫度、濕度、壓力等）、杭菊原料之重量、杭菊原料之狀態（如粉碎化程度、含水量）及/或所欲採用之浸泡溫度等而定。例如，可為約3.5至96小時、約4至96小時、約5至96小時、約5至72小時、約3.5小時、約4小時、約5小時、約6小時、約10小時、約12小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約20小時、約21小時、約24小時、約27小時、約30小時、約36小時、約40小時、約48小時、約60小時、約72小時、約96小時等，但不限於此。在一實施例中，於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，上述浸泡程序進行約5、17或24小時。在另一實施例中，於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，上述浸泡程序進行約5、24、48或72小時。

又，於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，執行上述浸泡程序的溫度可為約20℃至70℃，約20℃至65℃、約25℃至70℃或室溫至約70℃、約25℃至60℃或室溫至約60℃、約25℃至50℃或室溫至約50℃、約25℃至40℃或室溫至約40℃、約20℃、約25℃、室溫、約40℃、約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃，但不限於此。在一實施例中，於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，上述浸泡程序係於室溫下進行。在另一實施例中，於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，上述浸泡程序係於約50℃下進行。

而於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，上述杭菊原料與上述水或水溶液的重量比並無特殊限制，只要上述水或水溶液得以覆蓋上述杭菊原料，以使上述杭菊原料浸泡於其中即可。在一實施例中，上述杭菊原料與上述水或水溶液的重量比可為約1:10-35，如，約1:15-30、約1:15-20、約1:10、約1:15、約1:20、約1:25、約1:30等，但不限於此。在一特定實施例中，上述杭菊原料與上述水或水溶液的重量比可為約1:20。

於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，上述水或水溶液具有約3.0至9.5之pH值，例如約4.0至9.5之pH值、約5.0至9.2之pH值、約3.0之pH值、約4.0之pH值、約5.0之pH值、約7之pH值、約7.18之pH值、約9.0之pH值、約9.2之pH值、約9.5之pH值等、但不限於此。

接著，於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，在將一杭菊原料以一水或水溶液浸泡以進行一浸泡程序3.5小時以上，以獲得一浸泡樣本之後，將一萃取溶劑加入該浸泡樣本中以進行一萃取程序，以獲得一萃取液。上述萃取液含有黃酮苷元。

上述萃取溶劑並無特別限制，只要可溶解於上述浸泡樣本或經浸泡之杭菊原料中之黃酮苷元，且不對其產生負面影響即可。上述萃取溶劑的例子，可包括，但不限於，甲醇、乙醇、乙酸乙酯，或其任意之組合。上述乙醇之濃度可為約50-95%，但不限於此。在一實施例中，上述萃取溶劑為乙醇。

於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，執行上述萃取程序的時間，並無特殊限制，而可依據當時操作環境（如溫度、濕度、壓力等）、浸泡樣本或經浸泡之杭菊原料之體積及/或重量及/或所欲採用之萃取溫度等而定。例如，可為約5至60分鐘、約10至60分鐘、約10至55分鐘、約10至45分鐘、約10至40分鐘、約15至30分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約20分鐘、約25分鐘、約30分鐘、約35分鐘、約40小時、約45小時、約50小時、約55小時、約60小時等，但不限於此。在一實施例中，於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，上述萃取程序進行約30分鐘。

又，於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，執行上述萃取程序的溫度可為約15℃至50℃，約15℃至45℃、約20℃至40℃、約25℃至40℃或室溫至約40℃、約15℃、約20℃、約25℃、室溫、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃等，但不限於此。在一實施例中，於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，上述萃取程序係於室溫下進行。

而於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，上述杭菊原料與上述萃取溶劑的重量比並無特殊限制。在一實施例中，上述杭菊原料與上述萃取溶劑的重量比可為約1:10-35，如，約1:15-30、約1:15-20、約1:10、約1:15、約1:20、約1:25、約1:30等，但不限於此。在一特定實施例中，上述杭菊原料與上述萃取溶劑的重量比可為約1:20。

在一實施例中，本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，上述萃取程序可於震盪或攪拌下進行，但不限於此。上述震盪可包括，但不限於，超音波震盪、旋轉震盪等。又，上述攪拌之方式可以一攪拌器，如漿式攪拌器、電磁攪拌器等進行攪拌，但也不限於此。

此外，在一實施例中，本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，更包括於將一杭菊原料以一水或水溶液浸泡以進行一浸泡程序3.5小時以上，以獲得一浸泡樣本的步驟，與將一萃取溶劑加入浸泡樣本中以進行一萃取程序，以獲得一萃取液的步驟之間，移除上述浸泡樣本中之上述浸泡液。亦即，萃取溶劑僅與上述經浸泡之杭菊原料反應。

又，在一實施例中，本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，更包括將一萃取溶劑加入該浸泡樣本中以進行一萃取程序，以獲得一萃取液的步驟之後，對上述萃取液進行一固液分離程序，以獲得一上清液，而上述上清液含有上述黃酮苷元。

上述固液分離程序並無特殊限制，只要可將萃取液中之固體與液體分離及可。固液分離程序的例子，可包括，但不限於離心或過濾等。

又，於一特定實施例中，本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，可更包括在獲得上述上清液之後，進一步自上述上清液分離與純化出上述黃酮苷元。

或者，於另一特定實施例中，本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，可更包括在獲得上述上清液之後進一步對該上清液進行一濃縮程序，以獲得一濃縮液，而上述濃縮液含有上述黃酮苷元。又，於此特定實施例中，本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，還可更包括在獲得濃縮液之後，自上述濃縮液分離與純化出上述黃酮苷元。

在一特定實施例中，於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，上述杭菊原料為該杭菊之花。又於此特定實施例中，上述浸泡程序係進行5至72小時，上述杭菊原料與該水或水溶液的重量比為1:15-20，上述浸泡程序係於室溫至50℃下進行，上述水或水溶液具有5.0至9.2之pH值，且上述萃取溶劑為乙醇。而於此特定實施例中，本揭露之萃取杭菊黃酮苷元的方法對該杭菊原料的黃酮苷元萃取率可為2-30 mg黃酮苷元/g杭菊原料。

在另一特定實施例中，於本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法中，上述杭菊原料為該杭菊之莖與葉。又於此特定實施例中，上述浸泡程序係進行5至72小時，上述杭菊原料與該水或水溶液的重量比為1:15-20，上述浸泡程序係於室溫至50℃下進行，上述水或水溶液具有5.0至9.2之pH值，且上述萃取溶劑為乙醇。而於此特定實施例中，本揭露之萃取杭菊黃酮苷元的方法對該杭菊原料的黃酮苷元萃取率可為2-25 mg黃酮苷元/g杭菊原料。

基於上述，本揭露也可提供一種杭菊萃取物，其可藉由任何上述本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法所獲得。

又，上述本揭露之杭菊萃取物，具有優良的抗發炎功效。

因此，本揭露也提供一種抗發炎之醫藥組成物，其可包括，但不限於，藉由任何上述本揭露之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法所獲得的一杭菊萃取物。

上述本揭露也提供一種抗發炎之醫藥組成物，可更包括一藥學上可接受之載體或鹽類，但不限於此。

上述藥學上可接受之載體可包括，但不限於溶劑、分散媒(dispersion medium)、套膜(coating)、抗菌與抗真菌試劑與一等滲透壓與吸收延遲(absorption delaying)試劑等與藥學投予相容者。對於不同的給藥方式，可利用一般方法將藥學組合物配製成劑型(dosage form)。

又，上述藥學上可接受之鹽類可包括，但不限於鹽類包括無機陽離子，例如，鹼金屬鹽類，如鈉、鉀或胺鹽，鹼土金族鹽類，如鎂、鈣鹽，含二價或四價陽離子之鹽類，如鋅、鋁或鋯鹽。此外，也可是為有機鹽類，如二環己胺鹽類、甲基-D-葡糖胺，胺基酸鹽類，如精胺酸、離胺酸、組織胺酸、麩胺酸醯胺。

再者，本揭露之醫藥組成物可被投予至一需要此醫藥組成物之一個體，但不限於此。而本揭露之醫藥組成物的給藥途徑可包括非口服、口服、經由吸入噴霧(inhalation spray)或藉由植入貯存器(implanted reservoir)的方式，但不限於此。非口服可包括，但不限於，塗擦患部、皮下(subcutaneous)、皮內(intracutaneous)、靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、關節內(intraarticular)動脈(intraarterial)、滑囊(腔)內(intrasynovial)、胸骨內(intrasternal)、蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位內(intralesional)注射以及灌注技術等。

而塗擦之局部使用的形式可包括軟膏、乳劑、液劑、凝膠等，但不限於此。

此外，上述需要被投予此醫藥組成物之個體可包括，但不限於，一脊椎動物。又，上述脊椎動物可包括魚類、兩棲類、爬蟲類、鳥類或哺乳類，但不限於此。哺乳類的例子可包括，但不限於，人類、猩猩、猴子、馬、驢、狗、貓、兔子、天竺鼠、大鼠與小鼠。在一實施例中，上述個體可為人類。

實施例

A. 材料

A-1. 杭菊原料之前處理

A-1-1. 杭菊之花的前處理

杭菊之花採收後，先放置於室溫下萎凋2個小時（時間勿超過6小時），使其均勻失水。

接著，將杭菊之花進行乾燥程序，使其水分含量低於10%。上述乾燥程序可為50℃乾燥4-8小時、60℃乾燥4-8小時或是70℃乾燥2-4小時。然後，將上述經乾燥之杭菊之花以粉碎機粉碎，以獲得杭菊之花的乾燥粉碎物。

A-1-2. 杭菊之莖與葉的前處理

杭菊莖與葉採收後，不用經過萎凋程序，即以45℃乾燥48小時，使其水分含量低於10%。

然後，將上述經乾燥之杭菊之莖與葉以粉碎機粉碎，以獲得杭菊之莖與葉的乾燥粉碎物。

A-2. 具不同pH值之緩衝溶液的配製

A-2-1. pH 2.7、pH 5.0與pH 7.18之檸檬酸鹽-磷酸鹽(citrate-phosphate)緩衝溶液的配製

分別配製0.1 M 檸檬酸(citric acid)（2.1 g溶於100 mL水）儲備溶液與0.2 M Na ₂HPO ₄（2.84 g溶於100 mL水）儲備溶液。

(1) pH 2.7之檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝溶液的配製

將89.1 mL之上述0.1 M 檸檬酸儲備溶液與10.9 mL之上述0.2 M Na ₂HPO ₄儲備溶液混合，以獲得成pH 2.7之檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝溶液。

(2) pH 5.0之檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝溶液的配製

將53.25 mL之上述0.1 M 檸檬酸儲備溶液與46.75 mL之上述0.2 M Na ₂HPO ₄儲備溶液混合，以獲得成pH 5.0之檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝溶液。

(3) pH 7.18之檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝溶液的配製

將17.65 mL之上述0.1 M 檸檬酸儲備溶液與82.35 mL之上述0.2 M Na ₂HPO ₄儲備溶液混合，以獲得pH 7.18之檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝溶液。

A-2-2. pH 9.0之碳酸氫鹽(carbonate-bicarbonate)緩衝溶液的配製

將0.11 g之無水碳酸鈉(anhydrous sodium carbonate)與0.756 g之碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)加水定量至100 mL並混合，以獲得pH 9.0之碳酸氫鹽緩衝液。

B. 分析方法

高效液相層析法(high performance liquid chromatography, HPLC)

依據下列條件以高效液相層析法來分析樣本中的黃酮苷元。

層析管柱種類：Hypersil Gold aQ 3um, 4.0×150 mm或等同物

偵測波長：254 nm

pump流速：1.0 mL/分鐘

每一樣品分析時間：55分鐘

管柱溫度：35℃

總注射體積：20 μL

移動相配製：移動相A= 0.1 %磷酸水溶液；移動相B= 層析級乙腈

表1

時間（分鐘）	移動相A	移動相B
0	85	15
30	70	30
45	50	50
50	10	90
51	85	15
55	85	15

C. 實驗方法與結果

實施例1

浸泡時間對於杭菊之花的成分影響

將1 g之上述杭菊之花的乾燥粉碎物加入20 mL之RO水，並置於室溫下0、1、5或17個小時，以形成一浸泡樣本。

接著，將20 mL之95%乙醇加入上述浸泡樣本中並震盪搖晃30分鐘以形成一萃取液。

然後，將上述萃取液進行一固液分離程序，並將所獲得之上清液，進行高效液相層析，以確認具不同浸泡時間的萃取液的化學成份變化，其中選擇兩個黃酮苷元，芹菜素(apigenin)與木犀草素(luteolin)作為杭菊萃取物的指標成分。

結果如第1圖所示。由第1圖可清楚得知，木犀草素與芹菜素於萃取液中之含量隨著杭菊之花的浸泡時間增加而增加。

實施例2

浸泡時間對於杭菊之花的黃酮苷元萃取量的影響

為探討浸泡時間對於杭菊之花的兩個黃酮苷元指標成分，芹菜素與木犀草素的萃取量的影響，進行以下試驗與分析。

將1 g之上述杭菊之花的乾燥粉碎物加入20 mL之RO水，並置於室溫下0、5、24、48或72個小時，以形成一浸泡樣本。

取1 mL的上述浸泡樣本，以10,000 rpm離心10分鐘，並將所獲得之上清液作為浸泡液的樣品。

另將20 mL之95%乙醇加入剩餘的上述浸泡樣本中並震盪搖晃30分鐘以形成一萃取液。

取1 mL的上述萃取液，以10,000 rpm離心10分鐘以進行固液分離程序，並將所獲得之上清液作為萃取液的樣品。

將上述浸泡液的樣品與萃取液的樣品進行高效液相層析，以確認其芹菜素與木犀草素含量。結果如表2與第2圖所示。

表2、杭菊之花在不同浸泡時間（室溫下）下所獲得之浸泡液與萃取液之芹菜素與木犀草素的單位藥材萃取量（萃取率）

浸泡時間（小時）	芹菜素 (mg/g 藥材)	木犀草素 (mg/g 藥材)	芹菜素+木犀草素 (mg/g藥材)	芹菜素+木犀草素 (mg/g藥材)
浸泡液	萃取液	浸泡液	萃取液	浸泡液	萃取液
0	0.85	0.51	0.19	0.20	1.04	0.71
1	0.92	1.17	0.20	0.35	1.12	1.52
5	0.85	3.55	0.28	0.92	1.13	4.47
24	0.31	9.43	0.16	2.72	0.47	12.15
48	0.24	13.05	0.14	3.35	0.38	16.4
72	0.00	12.57	0.08	3.09	0.08	15.66

表2與第2圖的結果顯示，浸泡液之芹菜素與木犀草素的萃取量隨著杭菊之花的浸泡時間增加而減少，而相對於此，萃取液之芹菜素與木犀草素的單位藥材萃取量，隨著杭菊之花的浸泡時間的增加而增加。

杭菊之花於室溫下浸泡48小時所獲得的萃取液顯示最高之芹菜素與木犀草素的單位藥材萃取量。相較於杭菊之花之未浸泡（浸泡0小時）的萃取液，對每克杭菊之花僅能萃取出0.71 mg的芹菜素與木犀草素，杭菊之花於室溫下浸泡48小時所獲得的萃取液，對每克杭菊之花能萃取出16.4 mg的芹菜素與木犀草素，其萃取量被大幅提升至2300%。

而關於浸泡液中芹菜素與木犀草素的萃取量隨著浸泡時間增加而減少的原因，推測可能是由於在浸泡液中源自糖苷黃酮類水解的黃酮苷元對水的溶解性不佳而發生沉澱，且因此在將等量的95%乙醇加入浸泡液而成為上述萃取液後，黃酮苷元即回溶於溶液中，而呈現對黃酮苷元的高萃取量。

實施例3

高溫高壓前處理對於杭菊之花的黃酮苷元萃取量的影響

將1 g之上述杭菊之花的乾燥粉碎物置於高壓滅菌釜中並以120°C滅菌20分鐘。接著，將此經高溫高壓處理之粉碎物冷卻至室溫。

然後，將此經高溫高壓處理之粉碎物加入20 mL之RO水，並置於室溫下24個小時，以形成一浸泡樣本。

然後將上述萃取液進行一固液分離程序，並將所獲得之上清液，進行高效液相層析，以確認經高溫高壓處理之杭菊之花之萃取液之芹菜素與木犀草素的萃取量。

結果顯示，經高溫高壓處理之樣品，每克杭菊花之僅能被萃取出0.72 mg的芹菜素與木犀草素，而此與未高溫高壓處理的樣品可萃出高達12.15 mg的芹菜素與木犀草素，具有明顯差異。

而此可以證實於浸泡過程中之芹菜素與木犀草素含量的增加，並非來自於本身化合物自然的降解，由於依據上方結果可知，即便高溫高壓處理也無法使糖苷鍵水解。

相對於此，僅經由本揭露所採用之屬於溫和處理的浸泡程序，即可經由高效液相層析圖譜觀察到（參見第1圖）某些成分隨著浸泡時間的增加而減少，而某些成分隨著浸泡時間的增加而增加。因此推測浸泡程序，可能活化了針對杭菊內生性糖苷鍵之水解酵素的活性，進而提高芹菜素與木犀草素的萃取量。

實施例4

浸泡溫度與pH值對於杭菊之花的黃酮苷元萃取量的影響。

為探討最佳的浸泡溫度與pH值，將1 g之上述杭菊之花的乾燥粉碎物加入20 mL之RO水或具不同pH值之緩衝水溶液（pH 2.7、pH 5.0、pH 7.18與pH 9.2），並置於4℃、25℃或50℃溫度下24個小時，以形成一浸泡樣本。

然後，將上述萃取液進行一固液分離程序，並將所獲得之上清液，藉由高效液相層析來進行含量分析。

結果如第3圖所示。依據第3圖可以得知，不論杭菊之花是浸泡於RO水或是浸泡於pH 2.7至9.2的緩衝水溶液，當浸泡的溫度由4℃增加至50℃時，芹菜素與木犀草素的萃取量均隨著浸泡溫度的增加而增加。當用於浸泡杭菊之花的緩衝水溶液的pH值由2.7增加至5.0時，芹菜素與木犀草素的萃取量隨著pH值增加而增加，但是當緩衝水溶液之pH值為7.18及9.2時，芹菜素與木犀草素的萃取量則低於緩衝水溶液之pH值為5.0時之芹菜素與木犀草素的萃取量。

將杭菊之花僅以RO水浸泡之芹菜素與木犀草素的萃取量，則略低於將杭菊之花以pH值為5.0之緩衝水溶液的芹菜素與木犀草素的萃取量。而RO水於浸泡杭菊之花後的pH值經測定後為4.5，符合上述當用於浸泡杭菊之花的緩衝水溶液之pH值由2.7增加至5.0時，芹菜素與木犀草素的萃取量隨著pH值增加而增加的觀察結果。雖然在RO水浸泡後所萃取出芹菜素與木犀草素的萃取量略低於在pH值5.0的緩衝水溶液浸泡後所萃取出芹菜素與木犀草素的萃取量，然而直接以RO水浸泡係為一個更簡單、方便與節省成本的操作方式。

實施例5

以50%乙醇水溶液浸泡萃取

將1 g之上述杭菊之花的乾燥粉碎物加入40 mL之50%乙醇水溶液並搖晃均勻，且之後置於室溫下1、5或24個小時，以形成一浸泡樣本。

將上述浸泡樣本震盪搖晃30分鐘以形成一萃取液。

然後，將上述萃取液進行一固液分離程序，並將所獲得之上清液，藉由高效液相層析來進行含量分析。結果如表3所示。

表3、50%乙醇水溶液浸泡後之芹菜素與木犀草素的萃取量

浸泡時間（小時）	芹菜素 (mg/g FW)	木犀草素 (mg/g FW)	芹菜素+木犀草素 (mg/g FW)
萃取液	萃取液	萃取液
1	0.42	0.18	0.6
5	0.45	0.21	0.66
24	0.52	0.31	0.83

FW：杭菊之花的重量。

依據表3可知，以50%乙醇水溶液執行浸泡程序，並無法增加芹菜素與木犀草素的萃取量。

實施例6

浸泡時間對於杭菊之莖與葉的成分影響

杭菊於花朵採收後，其莖葉一般當作農業廢棄物丟棄。而於本研究發現，杭菊之莖與葉亦含有大量的黃酮糖苷類成分。儘管杭菊之莖與葉中所含之黃酮苷元的糖基衍生物與花的不同，然而其主要仍衍生自芹菜素與木犀草素。因此，若杭菊之花經由浸泡的過程，係經由活化杭菊內生性糖苷類水解酵素而促使黃酮苷元的萃取量增加，則屬於同一植物之不同部位的莖與葉，則也可能產生相同的效果。又，若藉由浸泡的方式可提高莖與葉之芹菜素與木犀草素的萃取量，則將可賦予作為農業廢棄物之杭菊的莖與葉高經濟價值，並達成廢棄物再利用的功效。

將1 g之上述杭菊之莖與葉的乾燥粉碎物加入20 mL之RO水，並置於室溫下0、1、5、24、48或72個小時，以形成一浸泡樣本。

然後，將上述萃取液進行一固液分離程序，並將所獲得之上清液，進行高效液相層析，以確認具不同浸泡時間的萃取液的化學成份變化。結果如第4圖所示。

依據第4圖所示之高效液相層析圖譜，分別計算出萃取液中之芹菜素與木犀草素的萃取量。結果如第5圖與表4所示。

表4、杭菊之莖與葉在不同浸泡時間（室溫下）下所獲得之浸泡液與萃取液之芹菜素與木犀草素的單位藥材萃取量（萃取率）

浸泡時間（小時）	芹菜素 (mg/g LW)	木犀草素 (mg/g LW)	芹菜素+木犀草素 (mg/g LW)
萃取液	萃取液	萃取液
0	0.19	0.11	0.3
1	0.85	0.47	1.32
5	1.38	1.32	2.7
24	2.05	2.48	4.53
48	2.34	3.35	5.69
72	2.16	3.12	5.28

LW：杭菊之莖與葉重量。

而由第5圖及表4的結果顯示，杭菊之莖與葉在室溫下浸泡固定時間後，芹菜素與木犀草素的萃取量隨著浸泡時間增加而增加，其中相較於未經浸泡的樣品每克杭菊之莖與葉僅能分別萃取出0.3mg之芹菜素與木犀草素，杭菊之莖與葉經浸泡48小時之後，其每克能萃取出之芹菜素與木犀草素的總量可達到5.69mg，總萃取量增加1890%，萃取率被顯著提升。

實施例7

杭菊之莖與葉之萃取物的抗氧化活性分析

1. 杭菊之莖與葉之萃取物的製備

CML-A：將10 g之上述杭菊之莖與葉的乾燥粉碎物加入200 L 水，並置於室溫下浸泡24小時，以形成一浸泡樣本。接著，將浸泡樣本離心且之後丟棄水層。將殘渣再加入200 L 95%乙醇，並震盪搖晃30分鐘，之後進行固液分離，且將所獲得之萃取液進行減壓濃縮乾燥。

CML-B：將10 g之上述杭菊之莖與葉的乾燥粉碎物加入200 L 50%乙醇水溶液（95%乙醇:水=1:1 v/v），並震盪搖晃30分鐘，之後進行固液分離，且將所獲得之萃取液進行減壓濃縮乾燥。

CML-C：將10 g之上述杭菊之莖與葉的乾燥粉碎物加入200 L，並煮沸且加熱迴流1小時，之後進行固液分離，且將所獲得之萃取液進行減壓濃縮乾燥。

2. 抗氧化活性分析

經由單核細胞/巨噬細胞樣(RAW264.7)細胞建構之抗氧化活性分析平台，來評估上方所製備的杭菊之莖與葉萃取物對於RAW264.7細胞的影響與其抗氧化活性。

詳細實施步驟如下：將細胞分分成負對照組、正對照組與3個實驗組。負對照組為未經任何處理之細胞，正對照組為以10 µM與100 µM的芹菜素處理之細胞，3個實驗組分別為以CML-A (12.5至100 µg/mL)、CML-B (12.5至100 µg/mL)與CML-C (12.5至100 µg/mL)處理之細胞。

將RAW264.7細胞於96孔盤培養隔夜後，在正對照組與實驗組中加入100 ng/mL LPS，誘導細胞發炎。細胞繼續培養24小時後，收集細胞培養物上清液，暫存在-20℃冰箱，待後續試驗。

在細胞存活測試中，對每孔中之細胞加入50 µL的MTT (5 mg/mL)，在37°C下反應20分鐘。之後，每孔中加入150 µL的DMSO溶劑。將培養盤在定軌振盪器上搖動5分鐘，以完全溶解 MTT結晶，讀取於590 nm的吸光值。

依據以下公式計算細胞存活率(cell viability)：細胞存活率(%) =（試驗物質之螢光值/負對照組螢光值） × 100，

結果如第6A圖所示。依據第6A圖可知，杭菊之莖與葉萃取物(CML-A、CML-B與CML-C)並不影響RAW264.7細胞存活率。

在細胞一氧化氮(NO ^2-)分析中，根據製造商Promega Griess試劑盒的步驟來測量細胞培養物上清液中的亞硝酸鹽(NO ₂)量，來確定NO ₂ ^-的生成。讀取於540 nm的吸光值，計算出NO ^2-生產率(production)。結果如第6B圖所示。

第6B圖顯示，CML-A 25 µg/mL，50 µg/mL與100 g/mL以及CML-B 100 µg/mL可顯著降低NO ₂ ^-發炎因子的生成。

在細胞介白素-6 (Interleukin-6, IL-6)分析中，使用三明治酵素結合免疫吸附分析法(Sandwich Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測試。詳細實施步驟如下：

將抗體固定於96孔盤上，並置於4°C隔夜。隔日，洗去未固定抗體及雜質，再加入細胞上清液（檢體），使檢體中抗原與固定之抗體結合。在室溫反應2小時之後，洗去多餘檢體，再加入具抗原專一且帶有HRP之抗體，使檢體中抗原與此抗體結合。在室溫反應1小時之後，洗去未結合抗體，再加入酵素受質呈色。以於450 nm吸光值計算待測抗原的含量，而計算出IL-6的濃度。結果如第6C圖所示。

第6C圖顯示，CML-A 50 µg/mL與100 µg/mL可顯著降低IL-6發炎因子的表現量。

依據上方結果可知，藉由本揭露萃取方法所獲得之萃取物，具有優良的抗發炎功效。

雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

無

第1圖顯示，具不同浸泡時間之杭菊之花的萃取液的高效液相層析圖譜。第2圖顯示，杭菊之花在不同浸泡時間（室溫下）下所獲得之浸泡液與萃取液之芹菜素與木犀草素的單位藥材萃取量（萃取率）。第3A圖顯示，杭菊之花在不同pH值與不同浸泡室溫下所獲得之萃取液之芹菜素(apigenin)的單位藥材萃取量（萃取率）。FW：杭菊之花的重量。第3B圖顯示，杭菊之花在不同pH值與不同浸泡室溫下所獲得之萃取液之木犀草素(luteolin)的單位藥材萃取量（萃取率）。FW：杭菊之花的重量。第4圖顯示，杭菊之莖與葉在不同浸泡時間（室溫下）下所獲得之萃取液的高效液相層析圖譜。第5圖顯示，杭菊之莖與葉在不同浸泡時間（室溫下）下所獲得之萃取液之芹菜素與木犀草素的單位藥材萃取量（萃取率）。 LW：杭菊之莖與葉的重量。第6A圖顯示，經杭菊之莖與葉萃取液處理之RAW264.7細胞的細胞存活率。芹菜素為正對照組。數據為平均值±標準差 (n = 3)。第6B圖顯示，經杭菊之莖與葉萃取物處理之RAW264.7細胞的NO ₂ ^-發炎因子生成。芹菜素為正對照組。###:p ＜ 0.001與負對照組比較，*:p ＜ 0.05, ***:p ＜ 0.001與只有LPS處理組比較。數據為平均值±標準差 (n = 3)，統計方法為單因子變數分析one-way analysis of variance, one-way ANOVA)與鄧奈特多重比較(Dunnett’s multiple comparison)。第6C圖顯示，經杭菊之莖與葉萃取物處理之RAW264.7細胞的IL-6表現量。芹菜素為正對照組。###:p ＜ 0.001與負對照組比較，***:p ＜ 0.001與只有LPS處理組比較。數據為平均值±標準差 (n = 3)，統計方法為單因子變數分析與鄧奈特多重比較。

Claims

一種萃取杭菊中之黃酮苷元(flavone aglycones)的方法，包括： (a) 將一杭菊原料浸泡於一水或水溶液中以進行一浸泡程序3.5小時以上，以獲得一浸泡樣本；其中該杭菊原料包括一杭菊之下列部位的至少一者：全株、根、莖、葉與花；該杭菊原料與該水或水溶液的重量比為1:10-35；該浸泡程序係於20至70℃下進行；該水或水溶液具有3.0至9.5之pH值；且該浸泡樣本包括一經浸泡之杭菊原料與一浸泡液；以及 (b) 將一萃取溶劑加入該浸泡樣本中以進行一萃取程序5-60分鐘，以獲得一萃取液；其中該杭菊原料與該萃取溶劑的重量比為1:10-35；該萃取溶劑包括甲醇、乙醇或乙酸乙酯；該萃取程序於15至50℃下進行；且該萃取液含有黃酮苷元。
如請求項1之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該杭菊原料係經過一前處理。
如請求項2之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該前處理包括以下至少一者：乾燥處理；以及粉碎處理。
如請求項1之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，更包括於步驟(a)與步驟(b)之間，移除該浸泡樣本中之該浸泡液。
如請求項1之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該浸泡程序係進行5至96小時。
如請求項1之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該杭菊原料與該水或水溶液的重量比為1:15-30。
如請求項1之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該浸泡程序係於室溫至70℃下進行。
如請求項1之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該水或水溶液具有4.0至9.5之pH值。
如請求項1之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該萃取程序係進行10至40分鐘。
如請求項1之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該杭菊原料與該萃取溶劑的重量比為1:15-30。
如請求項1之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該萃取程序係於室溫至40℃下進行。
如請求項1之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該乙醇之濃度為50%至95%。
如請求項1之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該萃取程序係於震盪或攪拌下進行。
如請求項13之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該震盪包括超音波震盪或旋轉震盪。
如請求項13之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該攪拌之方式包括以漿式攪拌器或電磁攪拌器進行攪拌。
如請求項1之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該杭菊原料為該杭菊的花。
如請求項16之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該浸泡程序係進行5至72小時，該杭菊原料與該水或水溶液的重量比為1:15-20，且該浸泡程序係於室溫至50℃下進行，該水或水溶液具有5.0至9.2之pH值，且該萃取溶劑為乙醇。
如請求項17之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該萃取杭菊黃酮苷元的方法對該杭菊原料的黃酮苷元萃取率為2-30 mg黃酮苷元/g杭菊原料。
如請求項1之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該杭菊原料為該杭菊的莖與葉。
如請求項19之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該浸泡程序係進行5至72小時，該杭菊原料與該水或水溶液的重量比為1:15-20，且該浸泡程序係於室溫至50℃下進行，該水或水溶液具有5.0至9.2之pH值，且該萃取溶劑為乙醇。
如請求項20之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該萃取杭菊黃酮苷元的方法對該杭菊原料的黃酮苷元萃取率為2-25 mg黃酮苷元/g杭菊原料。
如請求項1之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，更包括於步驟(b)之後執行步驟(c)，對該萃取液進行一固液分離程序，以獲得一上清液，其中該上清液含有該黃酮苷元。
如請求項22之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，更包括於步驟(c)之後，自該上清液分離與純化出該黃酮苷元。
如請求項22之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，更包括於步驟(c)之後執行步驟(d)，對該上清液進行一濃縮程序，以獲得一濃縮液，其中該濃縮液含有該黃酮苷元。
如請求項24之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，更包括於步驟(d)之後，自該濃縮液分離與純化出該黃酮苷元。
如請求項1之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法，其中該黃酮苷元包括木犀草素、芹菜素或其組合。
一種杭菊萃取物，係藉由如請求項1-26之任一項之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法所獲得。
一種抗發炎之醫藥組成物，包括：杭菊萃取物，係藉由如請求項1-26之任一項之萃取杭菊中之黃酮苷元的方法所獲得；以及一藥學上可接受之載體或鹽類。