TWI786096B - 癌症免疫療法之新穎生物標記 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種於開始癌症免疫療法之前預測有效患者之技術。本發明提供一種使用受驗體之T細胞受體(TCR)多樣性作為該受驗體對癌症免疫療法之應答性之指標的方法。又,本發明提供一種包含免疫檢查點抑制劑之組合物,其係用以對於T細胞之TCR多樣性高之受驗體治療癌症。又,本發明亦關於一種使用此種TCR多樣性之伴隨醫藥。
Description
本發明係關於癌症免疫療法之領域。更詳細而言,關於一種受驗體對癌症免疫療法之應答性之預測、及基於預測之使用癌症免疫療法之治療。於另一態樣中,本發明係關於一種大規模高效率庫分析之新穎用途。更詳細而言,本發明係關於一種使用藉由大規模高效率庫分析所獲得之多樣性指數而預測受驗體對癌症免疫療法之應答性。
作為對癌症之治療,癌症免疫療法受到關注。尤其是免疫檢查點抑制劑、例如作為抗PD-1抗體之納武單抗(nivolumab)相對於針對非小細胞肺癌之先前標準治療之歐洲紫杉醇,於總生存時間方面顯示出大幅度超過之結果,而成為標準治療。 然而,於受到免疫檢查點抑制劑之患者中,有顯示出癌症之發展停止或者癌症緩解之顯著效果之患者,另一方面,於抗PD-1抗體臨床試驗中可見3個月以內病情惡化之「無效群」。但是,能夠高效率地判定無效群之方法尚屬未知。
[解決問題之技術手段] 於本發明之1個實施形態中,提供一種使用T細胞之T細胞受體(TCR)多樣性作為對癌症免疫療法之應答性之指標的方法。一般而言,癌症免疫療法由於係利用生物體防禦機制者,故而存在對於治療之應答之個體差異,業界探索出能夠於治療之前判定其個體差異之生物標記(例如T細胞中之表現特定之表面標記之細胞的比率、腫瘤中表現之表面蛋白質等)。然而,被認為會攻擊腫瘤之細胞之組成(例如CD8+
PD-1+
細胞之比率)等在對癌症免疫療法之見效患者與未見效患者間並無差異(圖4),無法用作生物標記。本發明者等人驚奇地發現受驗體之T細胞之TCR多樣性可用於預測受驗體對治療之應答。例如,針對肺癌患者,對抗PD-1抗體(Nivolumab)有效之患者為20~30%。包含免疫檢查點抑制劑之癌症免疫療法多數情況下非常昂貴,若能夠在開始利用抗PD-1抗體等之治療之前預測有效患者,則能夠實現更有效之治療,避免浪費醫療費,而有助於降低高昂之社會保障費用。因此,本發明提供一種用以預測對癌症免疫療法之應答性的新穎生物標記。 於本發明之1個實施形態中,癌症免疫療法包括投予免疫檢查點抑制劑。免疫檢查點抑制劑可為PD-1抑制劑。PD-1抑制劑可為包含納武單抗或派姆單抗(pembrolizumab)之抗PD-1抗體。本發明之1個實施形態提供一種使用T細胞之T細胞受體(TCR)多樣性作為對免疫檢查點抑制劑之應答性之指標的方法。 作為TCR多樣性,利用複數個指標,例如為夏儂指數、辛普森指數、逆辛普森指數、標準化夏儂指數、DE指數(例如DE50指數、DE30指數、DE80指數)或獨特指數(例如Unique30指數、Unique50指數、Unique80指數)等。於本發明之較佳之實施形態中,TCR多樣性為DE指數。於本發明之更佳之實施形態中,TCR多樣性為DE50指數。 於本發明之1個實施形態中,TCR多樣性係受驗體之T細胞之TCR多樣性。於1個實施形態中,可使用T細胞抑制系統細胞表面標記為陽性者作為T細胞。或者於另一實施形態中,可使用T細胞刺激系統細胞表面標記為陽性者作為T細胞。作為T細胞,使用選自由CD8、PD-1、CD28、CD154(CD40L)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、CD27、CD152(CTLA-4)、CD366(TIM-3)、CD223(LAG-3)、CD272(BTLA)、CD226(DNAM-1)、TIGIT及CD367(GITR)所組成之群中之1個以上之細胞表面標記為陽性之T細胞的TCR多樣性。於1個實施形態中,T細胞較佳為CD8+
。於進一步之實施形態中,T細胞為CD8+
,且T細胞抑制系統細胞表面標記為陽性。於進一步之實施形態中,T細胞為CD8+
,且T細胞刺激系統細胞表面標記為陽性。於進一步之實施形態中,T細胞為CD8+
,且T細胞抑制系統細胞表面標記及T細胞刺激系統細胞表面標記為陽性。於1個實施形態中,T細胞為CD8+
,且選自由PD-1、CD28、CD154(CD40L)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、CD27、CD152(CTLA-4)、CD366(TIM-3)、CD223(LAG-3)、CD272(BTLA)、CD226(DNAM-1)、TIGIT及CD367(GITR)所組成之群中之1個以上之細胞表面標記為陽性。於1個實施形態中,T細胞係選自由CD8+
PD1+
、CD8+
4-1BB+
、CD8+
TIM3+
、CD8+
OX40+
、CD8+
TIGIT+
及CD8+
CTLA4+
T細胞所組成之群中。較佳為T細胞可為CD8+
PD-1+
T細胞。T細胞可為末梢血液中之T細胞。 TCR多樣性可採用TCRα之多樣性,或者採用TCRβ之多樣性。於本發明之1個實施形態中,此種TCR多樣性較高係表示受驗體為見效患者。 本發明之另一實施形態包括對TCR多樣性較高之受驗體實施癌症免疫療法之操作。於1個實施形態中,提供一種包含免疫檢查點抑制劑之組合物,其係用以對於T細胞之TCR多樣性較高之受驗體治療癌症。於進一步之實施形態中,提供一種包含免疫檢查點抑制劑之組合物,其係用以對於末梢血液中之CD8+
PD-1+
T細胞之TCR多樣性較高之受驗體治療癌症。 於一部分實施形態中,於受驗體之TCR多樣性高於閾值之情形時,表示受驗體為癌症免疫療法之見效患者。於另一實施形態中,於受驗體之TCR多樣性低於閾值之情形時,表示受驗體為癌症免疫療法之未見效患者。於使用DE指數之情形時,可使用對讀段數進行標準化之DE指數,或者藉由與對讀段數進行調整之閾值之比較,表示受驗體為癌症免疫療法之見效患者。於1個實施形態中,於受驗體之TCRα之標準化為30000個讀段之DE50指數為0.39%以上之情形時,表示受驗體為見效患者。於另一實施形態中,於受驗體之TCRβ之標準化為30000個讀段之DE50指數為0.24%以上之情形時,表示受驗體為見效患者。可藉由標準化為任意之讀段數之DE50指數和與該讀段數對應之閾值的比較,表示受驗體為見效患者或者受驗體為未見效患者。讀段數與閾值之組合之例子於本說明書中有提供。 於一部分實施形態中,基於ROC(Receiver Operating Characteristic analysis,受驗者操作特性分析)分析而確定閾值。於一部分實施形態中,基於特異度而確定閾值,例如將高於非應答之最大值之值設為閾值。於一部分實施形態中,基於感度而確定閾值,例如將低於應答者之最低線之值設為閾值。於本發明中,亦可包括確定此種閾值之步驟,又,可使用如此確定之閾值。 本發明之1個實施形態係包括自受驗體單離T細胞之步驟、及測定T細胞之TCR多樣性之步驟之方法,T細胞可單離選自由CD8、PD-1、CD28、CD154(CD40L)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、CD27、CD152(CTLA-4)、CD366(TIM-3)、CD223(LAG-3)、CD272(BTLA)、CD226(DNAM-1)、TIGIT及CD367(GITR)所組成之群中之1個以上之細胞表面標記為陽性者。於1個實施形態中,T細胞較佳為CD8+
。於進一步之實施形態中,T細胞為CD8+
,且T細胞抑制系統細胞表面標記為陽性。於1個實施形態中,T細胞係選自由CD8+
PD1+
、CD8+
4-1BB+
、CD8+
TIM3+
、CD8+
OX40+
、CD8+
TIGIT+
及CD8+
CTLA4+
T細胞所組成之群中。於進一步之實施形態中,T細胞為CD8+
,且T細胞刺激系統細胞表面標記為陽性。尤佳為包括自受驗體之末梢血液樣本單離CD8+
PD-1+
T細胞之步驟、及測定CD8+
PD-1+
T細胞之TCR多樣性之步驟的方法。 使用大規模高效率TCR庫分析有由於可鑑定低頻度(1/10,000~1/100,000或其以下)之基因,故而較佳之情形。本發明之1個實施形態包括藉由包括大規模高效率TCR庫分析之方法而確定TCR多樣性之步驟。本發明之1個實施形態係使用藉由大規模高效率TCR庫分析所確定之TCR多樣性作為受驗體之醫療狀態、尤其是對治療之應答性之指標的方法。 本發明之1個實施形態係關於一種診斷受驗體對癌症免疫療法之應答性之方法,其包括如下步驟:於活體外測定受驗體之T細胞之TCR多樣性;及於TCR多樣性較高之情形時,判定為受驗體對癌症免疫療法應答性良好。或者於TCR多樣性較低之情形時,亦可判定受驗體對癌症免疫療法應答性差。T細胞可為CD8+
PD-1+
。進而,T細胞可為源自受驗體之末梢血液者。 本發明之另一實施形態係關於一種診斷受驗體對癌症免疫療法之應答性之方法,其包括如下步驟:自受驗體獲得末梢血液樣本;藉由包括大規模高效率TCR庫分析之方法而測定受驗體之末梢血液中之T細胞之TCR多樣性;及於TCR多樣性較高之情形時,判定為受驗體對癌症免疫療法應答性良好。或者於TCR多樣性較低之情形時,亦可判定受驗體對癌症免疫療法應答性差。T細胞可為CD8+
PD-1+
。 於本發明之進一步之實施形態中,提供一種診斷受驗體對癌症免疫療法之應答性,治療受驗體之癌症之方法,其包括如下步驟:自受驗體獲得末梢血液樣本;測定受驗體之末梢血液中之T細胞之TCR多樣性;及於TCR多樣性高於基準值之情形時,對受驗體實施癌症免疫療法。T細胞可為CD8+
PD-1+
。 又,本發明提供一種技術,其係使用藉由大規模高效率庫分析所獲得之多樣性指數,預測受驗體對癌症免疫療法之應答性。 例如,本發明提供以下之項目。 (項目1)一種方法,其係使用受驗體之T細胞之T細胞受體(TCR)多樣性作為該受驗體對癌症免疫療法之應答性之指標。 (項目2)如上述項目記載之方法,其中上述T細胞為CD8+
,且1個以上之T細胞抑制系統細胞表面標記為陽性。 (項目3)如上述項目中任一項記載之方法,其中上述T細胞為CD8+
,且1個以上之T細胞刺激系統細胞表面標記為陽性。 (項目4)如上述項目中任一項記載之方法,其中上述T細胞為CD8+
,且選自由PD-1、CD28、CD154(CD40L)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、CD27、CD152(CTLA-4)、CD366(TIM-3)、CD223(LAG-3)、CD272(BTLA)、CD226(DNAM-1)、TIGIT及CD367(GITR)所組成之群中之1個以上之細胞表面標記為陽性。 (項目5)如上述項目中任一項記載之方法,其中上述T細胞為CD8+
PD-1+
T細胞。 (項目6)如上述項目中任一項記載之方法,其中上述T細胞為上述受驗體之末梢血液中之T細胞。 (項目7)如上述項目中任一項記載之方法,其中上述癌症免疫療法包括投予免疫檢查點抑制劑。 (項目8)如上述項目中任一項記載之方法,其中上述免疫檢查點抑制劑為PD-1抑制劑。 (項目9)如上述項目中任一項記載之方法,其中上述PD-1抑制劑為納武單抗或派姆單抗。 (項目10)如上述項目中任一項記載之方法,其中上述TCR多樣性係以夏儂指數、辛普森指數、逆辛普森指數、標準化夏儂指數、Unique50指數、DE30指數、DE80指數或DE50指數表示。 (項目11)如上述項目中任一項記載之方法,其中上述TCR多樣性係以DE50指數表示。 (項目12)如上述項目中任一項記載之方法,其中上述TCR為TCRα。 (項目13)如上述項目中任一項記載之方法,其中於標準化為以下之表中所記載之讀段數中之任一者之上述受驗體之DE50指數為與該表中所記載之該讀段數對應之閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,或者於未達該閾值之情形時,表示該受驗體為未見效患者。 [表1A]
(項目14)如上述項目中任一項記載之方法,其中上述TCR為TCRβ。 (項目15)如上述項目中任一項記載之方法,其中於標準化為以下之表中所記載之讀段數中之任一者之上述受驗體之DE50指數為與該表中所記載之該讀段數對應之閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,或者於未達該閾值之情形時,表示該受驗體為未見效患者。 [表1B]
(項目16)如上述項目中任一項記載之方法,其進而包括如下步驟: 自該受驗體之末梢血液樣本單離CD8+
PD-1+
T細胞;及 確定該CD8+
PD-1+
T細胞之TCR多樣性。 (項目17)如上述項目中任一項記載之方法,其中上述TCR多樣性係藉由包括大規模高效率TCR庫分析之方法而確定。 (項目18)一種包含免疫檢查點抑制劑之組合物,其係用以對於T細胞之TCR多樣性較高之受驗體治療癌症。 (項目18A)如上述項目記載之組合物,其具有上述項目中任一項或複數項所記載之特徵。 (項目19)如上述項目中任一項記載之組合物,其中上述T細胞為CD8+
,且1個以上之T細胞抑制系統細胞表面標記為陽性。 (項目20)如上述項目中任一項記載之組合物,其中上述T細胞為CD8+
,且1個以上之T細胞刺激系統細胞表面標記為陽性。 (項目21)如上述項目中任一項記載之組合物,其中上述T細胞為CD8+
,且選自由PD-1、CD28、CD154(CD40L)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、CD27、CD152(CTLA-4)、CD366(TIM-3)、CD223(LAG-3)、CD272(BTLA)、CD226(DNAM-1)、TIGIT及CD367(GITR)所組成之群中之1個以上之細胞表面標記為陽性。 (項目22)如上述項目中任一項記載之組合物,其中上述T細胞為CD8+
PD-1+
T細胞。 (項目23)如上述項目中任一項記載之組合物,其中上述T細胞為上述受驗體之末梢血液中之T細胞。 (項目24)如上述項目中任一項記載之組合物,其中上述免疫檢查點抑制劑為PD-1抑制劑。 (項目25)如上述項目中任一項記載之組合物,其中上述PD-1抑制劑為納武單抗或派姆單抗。 (項目26)如上述項目中任一項記載之組合物,其中上述受驗體之T細胞之TCR多樣性係以夏儂指數、辛普森指數、逆辛普森指數、標準化夏儂指數、Unique50指數、DE30指數、DE80指數或DE50指數表示。 (項目27)如上述項目中任一項記載之組合物,其中上述受驗體之T細胞之TCR多樣性係以DE50指數表示。 (項目28)如上述項目中任一項記載之組合物,其中上述TCR為TCRα。 (項目29)如上述項目中任一項記載之組合物,其中標準化為以下之表中所記載之讀段數中之任一者之上述受驗體之DE50指數為與該表中所記載之該讀段數對應的閾值以上。 [表1C]
(項目30)如上述項目中任一項記載之組合物,其中上述TCR為TCRβ。 (項目31)如上述項目中任一項記載之組合物,其中標準化為以下之表中所記載之讀段數中之任一者之上述受驗體之DE50指數為與該表中所記載之該讀段數對應的閾值以上。 [表1D]
(項目32)如上述項目中任一項記載之組合物,其中上述受驗體之TCR多樣性係藉由包括大規模高效率TCR庫分析之方法而確定。 (項目33)一種診斷受驗體對癌症免疫療法之應答性之方法,其包括如下步驟: 於活體外測定該受驗體之T細胞之TCR多樣性;及 於該TCR多樣性較高之情形時,判定該受驗體對癌症免疫療法應答性良好,或者於該TCR多樣性較低之情形時,判定該受驗體對癌症免疫療法應答性差。 (項目33A)如上述項目記載之方法,其具有上述項目中任一項或複數項記載之特徵。 (項目34)一種診斷受驗體對癌症免疫療法之應答性之方法,其包括如下步驟: 自該受驗體獲得末梢血液樣本; 藉由包括大規模高效率TCR庫分析之方法而測定該受驗體之末梢血液中之T細胞之TCR多樣性;及 於該TCR多樣性較高之情形時,判定該受驗體對癌症免疫療法應答性良好,或者於該TCR多樣性較低之情形時,判定該受驗體對癌症免疫療法應答性差。 (項目34A)如上述項目記載之方法,其具有上述項目中任一項或複數項記載之特徵。 (項目35)一種診斷受驗體對癌症免疫療法之應答性,治療該受驗體之癌症之方法,其包括如下步驟: 自該受驗體獲得末梢血液樣本; 測定該受驗體之末梢血液中之T細胞之TCR多樣性;及 於該TCR多樣性高於基準值之情形時,對該受驗體實施癌症免疫療法。 (項目35A)如上述項目記載之方法,其具有上述項目中任一項或複數項記載之特徵。 (項目36)一種方法,其係使用藉由包括大規模高效率庫分析之方法所確定之庫之多樣性作為受驗體對治療之應答性之指標。 (項目36A)如上述項目記載之方法,其具有上述項目中任一項或複數項記載之特徵。 (項目37)如上述項目中任一項記載之方法,其中上述治療係與免疫反應相關之治療。 (項目38)如上述項目中任一項記載之方法,其中上述庫分析為TCR庫分析。 (項目39)如上述項目中任一項記載之方法,其中表示上述受驗體之TCR多樣性之多樣性指數為閾值以上係該受驗體為見效患者之指標,或者該多樣性指數未達閾值係該受驗體為未見效患者之指標,並且該閾值係基於ROC分析而確定,或者基於感度而確定,或者基於特異度而確定。 (項目40)如上述項目中任一項記載之方法,其中表示上述受驗體之TCR多樣性之多樣性指數為閾值以上係該受驗體為見效患者之指標,或者該多樣性指數未達閾值係該受驗體為未見效患者之指標,並且該閾值係對該受驗體之多樣性指數之算出中所使用之讀段數進行標準化而獲得者。 於本發明中,意指上述一個或複數個特徵除所明示之組合以外,亦可進而加以組合而提供。本發明之又一實施形態及優點若視需要閱讀以下之詳細之說明而瞭解,則被業者辨識。 [發明之效果] 關於本發明,進行容易進行試樣採集之末梢血液細胞中之TCR庫分析所獲得之多樣性指標可用作用以預測癌症免疫療法之效果的生物標記。藉此,可進行伴隨治療或個別改良,可降低社會保險費,對個人而言可受到確實之治療。
以下,一面示出最佳之形態一面說明本發明。應瞭解於本說明書之整體,單數形式之表現只要未特別提及,則亦包含其複數形式之概念。因此,應瞭解單數形式之冠詞(例如,於英語之情形時,為「a」、「an」、「the」等)只要未特別提及,則亦包含其複數形式之概念。又,應瞭解本說明書中所使用之用語只要未特別提及,則以該領域中通常使用之含義使用。因此,只要未另外定義,則本說明書中所使用之所有專業用語及科學技術用語具有與本發明所屬之領域之業者一般瞭解者相同的含義。於矛盾之情形時,本說明書(包含定義)優先。 以下,適當說明本說明書中特別使用之用語之定義及/或基本技術內容。 (癌症免疫療法) 於本說明書中,「癌症免疫療法」係指使用生物所具有之免疫功能而治療癌症之方法。於癌症免疫療法中,大致進行區分,存在藉由強化對癌症之免疫功能所進行之癌症免疫療法、及藉由抑制癌症之免疫逃逸功能所進行之癌症免疫療法。進而,癌症免疫療法有使體內之免疫功能活化之主動免疫療法、及藉由使於體外使免疫功能活化或者增殖之免疫細胞返回至體內所進行之被動免疫療法。 發現藉由本發明中所記載之方法,可以TCR庫之多樣性作為指標而預測對此種癌症免疫療法之治療效果之應答性。 作為癌症免疫療法之例,可列舉:非特異性免疫活化劑、細胞激素療法、癌症疫苗療法、樹狀細胞療法、過繼免疫療法、非特異性淋巴球療法、癌抗原特異性T細胞療法、抗體療法、免疫檢查點抑制療法、CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,嵌合抗原受體T細胞免疫)療法等。 使用免疫檢查點抑制劑之免疫檢查點(抑制)療法近年來受到大量之關注(Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2012 Mar 22; 12(4): 252-64.)。認為癌細胞於表面表現各種蛋白質,但其係自由T細胞等免疫細胞所引起之攻擊逃逸,故而於通常之狀態下,僅藉由生物體之免疫功能無法排除癌組織。免疫檢查點抑制劑係藉由抑制承擔自此種癌組織向免疫功能之抑制信號之傳遞之配體-受體相互作用等,可實現藉由生物體之免疫功能之有效率之癌症之排除。本發明之1個實施形態係使用T細胞(例如CD8+
PD-1+
T細胞)之T細胞受體(TCR)多樣性作為用以預測受驗體對如下記載之免疫檢查點抑制劑之應答性之指標的方法。本發明之另一實施形態係對基於T細胞受體(TCR)多樣性所選擇之(應答性之)受驗體投予如下所示之免疫檢查點抑制劑的方法。於另一實施形態中,提供一種中斷或中止或逃逸對基於T細胞受體(TCR)多樣性判明並非為應答性之受驗體之免疫檢查點抑制劑之方法。 免疫檢查點抑制劑之代表性之例為PD-1抑制劑。作為PD-1抑制劑,可列舉:作為抗PD-1抗體之納武單抗(Nivolumab;以OpdivoTM
之形式銷售)及派姆單抗(Pembrolizumab;以KeytrudaTM
之形式銷售),但並不限定於該等。於1個較佳之實施形態中,可選擇納武單抗作為對象。雖然不希望受到理論所束縛,但作為較佳為使用納武單抗之療法之一個原因,在於在實施例中顯示若使用藉由本發明之大規模高效率TCR庫分析所算出之多樣性指數,則可明確地識別應答性之受驗者與非應答性受驗者,判明尤其藉由使用DE50指數之特定之閾值,可明確地區別應答性及非應答性。認為當然,關於其他PD-1抑制劑,亦可相同程度地利用多樣性指數。 認為抗PD-1抗體係藉由解除由PD-1信號所引起之T細胞活化之抑制而發揮抗癌效果。認為若PD-1(programmed death 1,程序性死亡受體1)與PD-L1或PD-L2相互作用,則作為酪胺酸脫磷酸化酶之一種之SHP-2募集於PD-1之細胞質區,使作為T細胞受體信號傳遞蛋白質之ZAP70不活化,藉此抑制T細胞之活化(Okazaki, T., Chikuma, S., Iwai, Y. et al.: A rheostat for immune responses: the unique properties of PD-1 and their advantages for clinical application. Nat. Immunol., 14, 1212-1218(2013))。除此以外,亦認為PD-L1亦與CD80相互作用而抑制T細胞活化(Butte, M. J., Keir, M. E., Phamduy, T. B. et al.: PD-L1 interacts specifically with B7-1 to inhibit T cell proliferation. Immunity, 27, 111-122(2007))。 認為PD-1係於浸潤於癌組織之殺手T細胞及自然殺手細胞中高度地表現,因腫瘤上之PD-L1而免疫應答減弱。若藉由抗PD-1抗體而抑制由該PD-1信號所引起之免疫應答之減弱,則可獲得抗腫瘤免疫應答之增強效果。 作為免疫檢查點抑制劑之另一例,可列舉PD-L1抑制劑(例如作為抗PD-L1抗體之阿維單抗(avelumab)、度伐魯單抗(durvalumab)或阿特朱單抗(atezolizumab))。 PD-L1抑制劑係將上述PD-1路徑與PD-L1之側結合而進行抑制,產生抗腫瘤免疫應答。 作為免疫檢查點抑制劑之另一例,可列舉CTLA-4抑制劑(例如作為抗CTLA-4抗體之易普利姆瑪(ipilimumab)或替西利姆單抗(tremelimumab))。 CTLA-4抑制劑係以與PD-1抑制不同之路徑使T細胞活化,產生抗腫瘤免疫應答。T細胞係藉由表面之CD28與CD80或CD86相互作用而活化。然而,認為即便為暫時活化之T細胞,於表面表現之CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4,細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4)亦以高於CD20之親和性優先與CD80或CD86相互作用,藉此抑制活化。CTLA-4抑制劑係抑制CTLA-4,而防止抑制CD20與CD80或CD86之相互作用,藉此產生抗腫瘤免疫應答。 於進一步之實施形態中,免疫檢查點抑制劑可以TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin containing protein-3,T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3)、LAG-3(lymphocyte activation gene-3,淋巴細胞活化基因-3)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)或TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain,Ig和ITIM域T細胞免疫受體)等免疫檢查點蛋白質作為目標。 認為如上所述之免疫檢查點抑制對自身組織之免疫應答,但於病毒等抗原長時間存在於生物體內之情形時,亦於T細胞免疫檢查點增加。認為關於腫瘤組織,亦成為長時間存在於生物體內之抗原,故而藉由該等免疫檢查點而逃逸抗腫瘤免疫,如上所述之免疫檢查點抑制劑係使此種逃逸功能無效化,發揮抗腫瘤效果。 於本發明之1個實施形態中,提供一種預測具有癌症之受驗體對癌症免疫療法之應答性之指標。 於本發明中,作為成為對象之癌症,可列舉:肺癌、非小細胞肺癌、腎(腎細胞)癌、前列腺癌、胃癌、睾丸癌、肝(髒)癌、皮膚癌、食道癌、黑色素瘤、胰腺癌、胰臟癌、骨腫瘤・骨肉瘤、大腸癌、軟組織腫瘤、膽道癌、多發性骨髓瘤、惡性淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、膀胱癌、喉頭癌、子宮癌(體部・頸部)、頭頸癌、卵巢癌、乳癌等,但並不限定於該等。於本發明之1個實施形態中,提供一種使用具有肺癌之受驗體之TCR多樣性作為受驗體對癌症免疫療法之應答性之指標的方法。 (TCR多樣性) 藉由免疫系統之生物體防禦機制較大地依賴於主要由T細胞或B細胞所承擔之特異性免疫。T細胞或B細胞能夠不與自身之細胞或分子進行反應,特異性地辨識並攻擊病毒或細菌等外來性之病原體。因此,T細胞或B細胞具有可利用細胞表面上表現之受體分子而辨識、識別自身抗原以及源自其他生物之多樣化之抗原的機制。於T細胞中,T細胞受體(T cell receptor,TCR)係作為抗原受體而發揮作用。藉由來自該等抗原受體之刺激而傳遞細胞內信號,炎症性細胞激素或趨化激素等之產生提高,增進細胞增生,而開始各種免疫應答。 TCR係藉由辨識鍵結在抗原呈現細胞上表現之主要組織相容基因複合體(Major histocompatibility complex,MHC)之肽鍵結槽中之肽(peptide-MHC complex,pMHC),而識別自身與非自身,並且辨識抗原肽(Cell 1994, 76, 287-299)。TCR係包含2個TCR多肽鏈之異源二聚物受體分子,有通常之T細胞所表現之αβ型TCR、及具有特殊功能之γδ型TCR。α及β鏈TCR分子係與複數個CD3分子(CD3ζ鏈、CD3ε鏈、CD3γ鏈、CD3δ鏈)形成複合體,傳遞抗原辨識後之細胞內信號,而開始各種免疫應答。伴隨病毒感染而於細胞內增生之病毒抗原、或源自癌細胞之癌抗原等內源性抗原係作為抗原肽而呈現於I型MHC分子上。又,源自外來微生物之抗原係藉由內噬作用被攝入至抗原呈現細胞中,受到處理後呈現於II型MHC分子上。該等抗原係分別利用CD8+
T細胞或CD4+
T細胞所表現之TCR而加以辨識。亦已知關於經由TCR分子之刺激,重要的是CD28、ICOS、OX40分子等共刺激分子。 TCR基因包含於基因組上編碼為不同區域之大量V區域(variable region,可變區,V)、J區域(joining region,連接區,J)、D區域(diversity region,多變區,D)、與恆定區域之C區域(constant region,恆定區,C)。於T細胞之分化過程中,該等基因片段係藉由各種組合進行基因再構成,α鏈及γ鏈TCR係表現包含V-J-C之基因,β鏈及δ鏈TCR係表現包含V-D-J-C之基因。藉由該等基因片段之再構成而創造多樣性,並且於V與D或D與J基因片段之間發生1個以上之鹼基之插入或缺失,藉此形成無規之胺基酸序列,而製作出多樣性更高之TCR基因序列。 TCR分子與pMHC複合體表面直接結合之區域(TCR足跡)包含V區域內之富於多樣性之互補決定區域(complementarity determining region,CDR)CDR1、CDR2及CDR3區域。其中,CDR3區域包含V區域之一部分、藉由無規序列所形成之V-D-J區域及J區域之一部分,而形成最富於多樣性之抗原辨識部位。另一方面,其他區域被稱為FR(framework region,構架區),發揮形成成為TCR分子骨架之結構的作用。於胸腺中之T細胞之分化成熟過程中,β鏈TCR最先進行基因再構成,與pTα分子締合而形成pre-TCR複合體分子。其後,α鏈TCR進行再構成,形成αβTCR分子,並且於未形成功能性αβTCR之情形時,於另一α鏈TCR基因對偶基因中發生再構成。已知受到胸腺中之正、負之選擇,選擇出具有適當之親和性之TCR,而獲得抗原特異性(Annual Review Immunology, 1993, 6, 309-326)。 T細胞係產生對特定抗原具有較高之特異性的1種TCR。生物體中藉由存在多個抗原特異性T細胞,可形成多樣化之TCR庫(repertoire),作為對各種病原體之防禦機制而有效地發揮作用。 於本說明書中,「TCR多樣性」係指某一受驗體之T細胞受體之庫(repertoire)之多樣性,業者可使用該領域中公知之各種方法進行測定。將表示TCR多樣性之指數稱為「TCR多樣性指數」。作為TCR多樣性指數,可利用該領域中公知之任意者,例如可將夏儂韋爾指數(Shannon-Weaver index)、辛普森指數(Simpson index)、逆辛普森指數(Inverse Simpson index)、標準化夏儂韋爾指數(Normalized Shannon-Weaver index)、DE指數(例如DE50指數、DE30指數、DE80指數)或獨特指數(例如Unique50指數、Unique30指數、Unique80指數)等多樣性指數應用於TCR而利用。 1種方法係針對試樣中之T細胞使用多少各V鏈,使用特定之Vβ鏈特異性抗體,藉由流式細胞儀分析表現各Vβ鏈之T細胞之比率(FACS分析)。 除此以外,基於自人類基因組序列獲取之TCR基因之資訊,研究藉由分子生物學方法之TCR庫分析。有自細胞試樣萃取RNA,合成互補DNA後,將TCR基因進行PCR(polymerase chain reaction,聚合酶鏈反應)擴增而定量之方法。 核酸自細胞試樣之萃取可使用RNeasy Plus Universal Mini Kit(QIAGEN)等本技術領域中公知之工具進行。可自溶解於TRIzol LS試劑中之細胞,使用RNeasy Plus Universal Mini Kit(QIAGEN)進行所有RNA之萃取及純化。 互補DNA自所萃取之RNA之合成可使用Superscript IIITM
(Invitrogen)等本技術領域中公知之任意之反轉錄酶而進行。 關於TCR基因之PCR擴增,業者可使用本技術領域中公知之任意之聚合酶而適當進行。然而,可謂於TCR基因之類之變動較大之基因之擴增中,若可以「非偏向性」進行擴增,則有為了進行準確之測定而有利之效果。 作為用於PCR擴增之引子,使用設計多個各TCR V鏈特異性引子,分開藉由即時PCR法等進行定量之方法;或將該等特異性引子同時擴增之方法(Multiple PCR)法。然而,於對各V鏈使用內源性控制進行定量之情形時,若利用之引子較多,則亦無法進行準確之分析。進而,於Multiple PCR法中,有引子間之擴增效率之差引起PCR擴增時之偏向性的缺點。為了克服該Multiple PCR法之缺點,鶴田等人報告有於TCR基因之雙鏈互補DNA之5'末端附加轉接子後,藉由共通之轉接子引子及C區域特異性引子將所有γδTCR基因擴增之Adaptor-ligation(轉接子連接)PCR法(Journal of Immunological Methods, 1994, 169, 17-23)。進而,開發出亦應用於αβTCR基因之擴增,藉由對各V鏈特異之寡核苷酸探針進行定量之Reverse dot blot(反向斑點雜交)法(Journal of Immunological Methods, 1997, 201, 145-15.)或Microplate hybridization assay(微孔板雜交分析)法(Human Immunology, 1997, 56, 57-69)。 於本發明之較佳之實施形態中,藉由如WO2015/075939(Repertoire Genesis Inc.)中所記載之包含1種正向引子及1種反向引子之1集之引子,於不改變存在頻度之情況下將包含所有同型或亞型基因之TCR基因進行擴增,確定TCR多樣性。如下所述之引子設計係對非偏向性之擴增較有利。 著眼於TCR或BCR基因之基因結構,不於具有高程度之多樣性之V區域設定引子,於其5'末端附加轉接子序列,藉此將包含所有V區域之基因擴增。該轉接子係於鹼基序列上任意之長度與序列,最佳為20鹼基對左右,可使用10鹼基至100鹼基之序列。附加於3'末端之轉接子係藉由限制酶去除,藉由與20鹼基對之轉接子相同之序列之轉接子引子、及對作為共通序列之C區域特異之反向引子進行擴增,藉此將所有TCR基因擴增。 自TCR或BCR基因信使RNA,藉由反轉錄酶合成互補鏈DNA,繼而合成雙鏈互補DNA。藉由反轉錄反應或雙鏈合成反應而合成包含不同之長度之V區域之雙鏈互補DNA,於該等基因之5'末端部藉由DNA連接酶反應而附加包含20鹼基對及10鹼基對之轉接子。 可於TCR之α鏈、β鏈、γ鏈、δ鏈之C區域設定反向引子,將該等基因擴增。設定於C區域之反向引子係與TCR之各Cβ、Cα、Cγ、Cδ之序列一致,且於其他C區域序列設定具有不會引發之程度之失配之引子。C區域之反向引子係以可進行與轉接子引子之擴增之方式,考慮鹼基序列、鹼基組成、DNA熔解溫度(Tm)、自互補序列之有無,最佳地製作。藉由在除於C區域序列中之對偶基因序列之間不同之鹼基序列以外之區域設定引子,可將所有對偶基因均一地擴增。為了提高擴增反應之特異性,進行複數個階段之nested(巢式)PCR。 任一引子均針對不包含於對偶基因序列之間不同之序列之序列,引子候補序列之長度(鹼基數)並無特別限制,為10~100鹼基數,較佳為15~50鹼基數,更佳為20~30鹼基數。 使用此種非偏向性之擴增係對低頻度(1/10,000~1/100,000或其以下)之基因之鑑定較有利,從而較佳。 藉由對如上所述般擴增之TCR基因進行定序,可自所獲得之讀段資料確定TCR多樣性。 自人類試樣對TCR基因進行PCR擴增,利用下一代序列分析技術,藉此可自先前獲得小規模且V鏈使用頻度等有限之資訊之TCR庫分析,實現獲取選殖水準之更詳細之基因資訊而進行分析之大規模高效率TCR庫分析。 定序之方法只要可確定核酸試樣之序列,則並無限定,可利用本技術領域中公知之任意者,較佳為使用下一代定序(NGS)。作為下一代定序,可列舉:焦磷酸定序、藉由合成之定序(定序生物合成)、藉由接合之定序、離子半導體定序等,但並不限定於該等。 藉由將所獲得之讀段資料映射於包含V、D、J基因之參照序列,可導出獨特讀段數,確定TCR多樣性。 於1個實施形態中,所使用之參照資料庫係對每一V、D、J基因區域準備。典型地為對由IMGT(international ImMunoGene Tics information system,國際免疫遺傳學資訊系統)公開之每一區域,使用每一對偶基因之核酸序列資料集,但並不限於此,只要為對各序列分配唯一之ID之資料集,則可利用。 以所獲得之讀段資料(包含視需要進行修整等適當之處理者)作為輸入序列集,與每一基因區域之參照資料庫進行同源性檢索,記錄最接近之參照對偶基因及與該序列之對準。此處,於同源性檢索中,除C以外,使用失配容許性較高之演算法。例如於使用一般之BLAST(Basic Local Alignment Search Tool,基本局域對準搜索工具)作為同源性檢索程式之情形時,對每一區域進行視窗尺寸之縮短、失配處罰之降低、空隙處罰之降低等設定。於最接近之參照對偶基因之選擇中,以同源性得分、對準長度、核心長度(連續一致之鹼基序列之長度)、一致鹼基數作為指標,按照確定之優先順序應用該等。關於本發明中所使用之確定V及J之輸入序列,以參照V上之CDR3開頭及參照J上之CDR3末尾作為記號,抽選CDR3序列。藉由將其轉譯為胺基酸序列,用於D區域之分類。於可準備D區域之參照資料庫之情形時,將同源性檢索結果與胺基酸序列轉譯結果之組合作為分類結果。 藉由上述,對輸入集中之各序列指定V、D、J之各對偶基因。繼而,藉由以輸入集整體算出V、D、J之各出現頻度、或其組合之出現頻度,導出TCR庫。根據分類所要求之精確度,出現頻度係以對偶基因為單位或者以基因名稱為單位算出。後者係藉由將各對偶基因轉譯為基因名稱而可進行。 可於對讀段資料指定V區域、J區域、C區域後,合計一致之讀段,按獨特讀段(不具有其他相同之序列之讀段),算出試樣中所檢測出之讀段數及占總讀段數之比率(頻度)。 可使用樣本數、讀段種類、讀段數等資料,使用ESTIMATES或R(vegan)等統計分析軟體算出多樣性指數或類似性指數。於較佳之實施形態中,使用TCR庫分析軟體(Repertoire Genesis Inc.)。 可自如上所述般獲得之各獨特讀段之讀段數資料求出多樣性指數。例如,夏儂韋爾指數(Shannon-Weaver index)(亦簡稱為夏儂指數)、辛普森指數(Simpson index)、標準化夏儂韋爾指數(Normalized Shannon-Weaver index)及DE50指數可按照以下數式算出。N:總讀段數,ni
:第i個獨特讀段之讀段數,S:獨特讀段數,S50
:占全部讀段之50%之上位獨特讀段之數 [數1] 辛普森指數(1-λ)[數2] 夏儂-韋納指數(H')[數3] 標準化夏儂-韋納指數(H')[數4][數5]作為其他多樣性之指標,亦可使用逆辛普森指數(1/λ)、森下之β指數、McIntosh之均衡度指數、McNaughton之優勢度指數、元村之1/α、Fisher之多樣度指數、Sheldon之eH'
、Pielou之均衡度指數、Preston之1/σ2
、森下之繁榮指數Nβ、Pielou之H'N等。包含DE50指數之DE指數亦可藉由比率或百分比(%)記載,業者可明確且適當地瞭解所記載之數值之含義,換算閾值等而實施本發明。DE指數可以占全部讀段之任意之比率(1~99%)之上位獨特讀段之數/獨特讀段數的形式算出,可用作本發明中之多樣性指標。 作為DE指數,除DE50指數以外,亦可使用基於Sx
(x=0~100之任意之數值)之DEX指數代替S50
(占全部讀段之50%之上位獨特讀段之數)。例如,亦可使用使用S30
(占全部讀段之30%之上位獨特讀段之數)及S80
(占全部讀段之80%之上位獨特讀段之數)之DE30指數及DE80指數。又,DE指數可使用對讀段數進行標準化之值(例如對80000個讀段、30000個讀段、10000個讀段等進行標準化)。 又,亦可使用作為DE指數之分子之直接使用Sx
之UniqueX指數。作為獨特指數,例如可列舉:Unique30、Unique50或Unique80指數等。 (大規模高效率TCR庫分析) 於本發明之較佳之實施形態中,使用大規模高效率TCR庫分析而測定TCR多樣性。於本說明書中,「大規模高效率庫分析」記載於WO2015/075939(該文獻之發明係於本說明書中,其全部內容視需要作為參考而引用),於對象為TCR之情形時,稱為「大規模高效率TCR庫分析」。大規模高效率庫分析係使用資料庫定量地分析受驗體之庫(Repertoire)(T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區域)之方法,該方法包括如下步驟:(1)提供自該受驗者非偏向性地擴增之包含T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列之核酸試樣;(2)確定該核酸試樣中所包含之該核酸序列;及(3)基於所確定之該核酸序列,算出各基因之出現頻度或其組合,導出該受驗體之庫,上述(1)包括以下之步驟:(1-1)以源自成為目標之細胞之RNA試樣作為模板而合成互補DNA;(1-2)以該互補DNA作為模板而合成雙鏈互補DNA;(1-3)對該雙鏈互補DNA附加共通轉接子引子序列而合成附加有轉接子之雙鏈互補DNA;(1-4)使用該附加有轉接子之雙鏈互補DNA、包含該共通轉接子引子序列之共通轉接子引子、及第1 TCR或BCR之C區域特異性引子而進行第1 PCR擴增反應,且該第1 TCR或BCR之C區域特異性引子係以如下方式設計:對該TCR或BCR之目標C區域充分地特異,且包含與其他基因序列不存在同源性之序列,且於擴增之情形時,於下游於亞型間包含不一致鹼基;(1-5)使用(1-4)之PCR擴增產物、該共通轉接子引子及第2 TCR或BCR之C區域特異性引子而進行第2 PCR擴增反應,且該第2 TCR或BCR之C區域特異性引子係以如下方式設計:包含於較該第1 TCR之C區域特異性引子之序列更下游之序列中具有與該TCR或BCR之C區域完全匹配之序列,但與其他基因序列不存在同源性之序列,且於擴增之情形時,於下游於亞型間包含不一致鹼基;及(1-6)使用(1-5)之PCR擴增產物、於該共通轉接子引子之核酸序列包含第1追加轉接子核酸序列之附加共通轉接子引子、及將第2追加轉接子核酸序列及分子鑑定(MID Tag)序列附加於第3 TCR或BCR之C區域特異性序列之附轉接子之第3 TCR之C區域特異性引子而進行第3 PCR擴增反應,且該第3 TCR之C區域特異性引子係以如下方式設計:包含於較該第2 TCR或BCR之C區域特異性引子之序列更下游之序列中具有與該TCR或BCR之C區域完全匹配之序列,但與其他基因序列不存在同源性之序列,且於擴增之情形時,於下游於亞型間包含不一致鹼基,該第1追加轉接子核酸序列係適於與DNA捕捉珠之結合及emPCR反應之序列,該第2追加轉接子核酸序列係適於emPCR反應之序列,該分子鑑定(MID Tag)序列係用以以可鑑定擴增產物之方式,賦予唯一性之序列。該方法之具體之詳細內容係記載於WO2015/075939,業者可適當參照該文獻及本說明書之實施例等而實施分析。 於本發明之1個實施形態中,提供一種使用T細胞之亞群之TCR多樣性之方法。於1個實施形態中,可使用T細胞抑制系統細胞表面標記為陽性者作為T細胞。或者於另一實施形態中,可使用T細胞刺激系統細胞表面標記為陽性者作為T細胞。例如可使用選自由CD8、PD-1、CD28、CD154(CD40L)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、CD27、CD152(CTLA-4)、CD366(TIM-3)、CD223(LAG-3)、CD272(BTLA)、CD226(DNAM-1)、TIGIT及CD367(GITR)所組成之群中之1個以上之細胞表面標記為陽性之T細胞之亞群的TCR多樣性。於1個實施形態中,T細胞係選自由CD8+
PD1+
、CD8+
4-1BB+
、CD8+
TIM3+
、CD8+
OX40+
、CD8+
TIGIT+
及CD8+
CTLA4+
T細胞所組成之群中。 於本說明書中,「T細胞刺激系統細胞表面標記」係指傳遞使T細胞活化之信號之細胞表面分子。作為「T細胞刺激系統細胞表面標記」之例,可列舉:CD28、CD154(CD40L)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)或CD27等,但並不限定於該等。 於本說明書中,「T細胞抑制系統細胞表面標記」係指傳遞抑制T細胞之信號之細胞表面分子。作為「T細胞抑制系統細胞表面標記」之例,可列舉:PD-1、CD152(CTLA-4)、CD366(TIM-3)、CD223(LAG-3)、CD272(BTLA)、CD226(DNAM-1)、TIGIT或CD367(GITR)等,但並不限定於該等。 雖不受理論限制,但可認為表現此種細胞表面標記之T細胞亞群之TCR多樣性較高係於其亞群中確實地存在具有辨識癌組織之表面抗原之TCR者,故而藉由利用免疫檢查點抑制劑之治療,容易受益。 T細胞之亞群例如為CD8+
T細胞之群。較佳為為CD8+
,且表現1個以上之免疫檢查點分子之T細胞亞群,例如為為CD8+
,且選自由PD-1、CD28、CD154(CD40L)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、CD27、CD152(CTLA-4)、CD366(TIM-3)、CD223(LAG-3)、CD272(BTLA)、CD226(DNAM-1)、TIGIT及CD367(GITR)所組成之群中之1個以上之細胞表面標記為陽性之T細胞的亞群。於1個實施形態中,T細胞為CD8+
。於一部分實施形態中,可使用T細胞刺激系統細胞表面標記為陽性之T細胞之亞群之TCR多樣性、T細胞抑制系統細胞表面標記為陽性之T細胞之亞群之TCR多樣性、或T細胞刺激系統細胞表面標記及T細胞抑制系統細胞表面標記為陽性之T細胞之亞群之TCR多樣性。於一部分情形時,T細胞之亞群可為PD-1+
T細胞之群。TCR之多樣性可針對每一T細胞之亞群而確定,於本發明之較佳之實施形態中,T細胞之亞群為CD8+
PD-1+
T細胞之群。與適當之亞群相關之TCR多樣性有於用作受驗體之醫療狀態之指標之情形時,可用作更準確之指標之情形。 分離此種T細胞之亞群之方法係於該技術領域中公知,可使用適當之細胞分選儀(例如BD FACSAria III細胞分選儀(BD Bioscience))而進行。業者可適當使用針對區別欲分離之亞群之細胞表面標記之標記抗體。若可使用自所分離之亞群萃取之核酸試樣,如上所述般進行TCR庫分析,則可確定與特定之T細胞亞群相關之TCR多樣性。 於藉由不區分特定細胞之方法調查PBMC(peripheral blood mononuclear cell,末梢血液單核球細胞)中之TCR多樣性之報告(https://meetinglibrary.asco.org/record/126066/abstract)中,報告有於不區分特定細胞之情形時,無法藉由TCR分析而顯著嚴格區別對抗PD-1抗體之見效患者及未見效患者。如於本說明書中證實般,特定之細胞群中之TCR多樣性可用於對癌症免疫療法之見效患者與未見效患者之區別的見解係預料之外者。 T細胞可使用自任意之組織取得者。作為T細胞,例如可自末梢血液、腫瘤部位、正常組織中、骨髓或胸腺等取得。於較佳之實施形態中,確定受驗體之末梢血液中之T細胞之TCR多樣性。T細胞自末梢血液之採集係非侵入性,較為簡便。 測定TCR之TCR鏈為α鏈、β鏈、γ鏈及/或δ鏈。於1個實施形態中,使用TCRα之多樣性。於另一實施形態中,使用TCRβ。 (診斷) 對癌症免疫療法之應答可基於RECIST v1.1(New response evaluation criteria in solid tumours(新版實體瘤之療效評價標準): Revised RECIST guideline(修訂後之RECIST指南)(version 1.1(1.1版本)))確定。 癌症治療之效果可根據腫瘤之尺寸之變化等,判定為完全見效(Complete Response:CR)、部分見效(Partial Response:PR)、發展(Progressive Disease:PD)或穩定(Stable Disease:SD)。 於本說明書中,「見效患者」(Responder)係指對癌症治療表現出完全見效或部分見效之受驗體。於本說明書中,「未見效患者」(Non-Responder)係指對癌症治療表現出發展或穩定之受驗體。 受驗體對癌症治療之應答性包括受驗體為「見效患者」,或者受驗體為「未見效患者」。因此,受驗體對癌症治療之應答性之判斷包括判斷受驗體為見效患者還是未見效患者之操作。 本發明之1個態樣係使用TCR多樣性,預測或判斷受驗體為「見效患者」,或者受驗體為「未見效患者」。判斷之時間較佳為於開始治療之前進行預測,但亦可為治療開始後。其原因在於判斷目前進行之治療是否適當亦具有醫療上之有用性。或者亦可使用本發明之TCR多樣性而判斷預後。例如,可使用本發明之TCR多樣性,預測見效患者成為未見效、即復發。進而,作為判斷之時間,可於實施癌症免疫療法後(例如投予免疫檢查點抑制劑後),隨時間經過而實施庫分析,根據多樣性指標判斷預後。 (較佳之實施形態) 以下,說明本發明之較佳之實施形態。瞭解到以下提供之實施形態係為了更好地瞭解本發明而提供者,本發明之範圍不應限定於以下之記載。因此,可知業者可參考本說明書中之記載,於本發明之範圍內適當進行改變。又,瞭解到本發明之以下之實施形態可單獨使用,或者組合該等而使用。 (應答性之指標) 於1個態樣中,本發明提供一種使用受驗體之T細胞之T細胞受體(TCR)多樣性作為該受驗體對癌症免疫療法之應答性、或該應答性之診斷之指標的方法。此處,TCR多樣性可以多樣性指數之形式提供。T細胞可為末梢血液中之CD8+
PD-1+
。 於另一態樣中,本發明提供一種診斷受驗體對癌症免疫療法之應答性之方法,其包括如下步驟:於活體外測定該受驗體之T細胞之TCR多樣性;及於該TCR多樣性較高之情形時,判定為該受驗體對癌症免疫療法應答性良好。或者於TCR多樣性較低之情形時,亦可判定受驗體對癌症免疫療法應答性差。T細胞可為末梢血液中之CD8+
PD-1+
T細胞。 於又一態樣中,本發明提供一種診斷受驗體對癌症免疫療法之應答性之方法,其包括如下步驟:自該受驗體獲得末梢血液樣本;藉由包括大規模高效率TCR庫分析之方法而測定該受驗體之末梢血液中之T細胞之TCR多樣性;及於該TCR多樣性較高之情形時,判定為該受驗體對癌症免疫療法應答性良好。或者於TCR多樣性較低之情形時,亦可判定受驗體對癌症免疫療法應答性差。T細胞可為末梢血液中之CD8+
PD-1+
T細胞。 雖然不希望受到理論所束縛,但本發明者等人發現若受驗體之TCR多樣性較高,即多樣性指數為較高之值,則與對癌症免疫療法之更佳之應答性相關。尤其是CD8+
PD-1+
T細胞之TCR多樣性可用作對藉由免疫檢查點抑制劑、尤其是PD-1抑制劑(例如納武單抗或派姆單抗)之治療之應答性之有利之指標。 可使用受驗體之夏儂韋爾指數(Shannon-Weaver index)、逆辛普森指數(Inverse Simpson index)、辛普森指數(Simpson index)、標準化夏儂韋爾指數(Normalized Shannon-Weaver index)、DEX指數(X為0~100,例如DE30指數、DE50指數、DE80指數等)及/或UniqueX(X為0~100,例如Unique30指數、Unique50指數、Unique80指數等),使用該等較高作為對癌症免疫療法之更佳之應答性之指標。 雖不受理論限制,但根據本發明之實施例之結果,認為於攻擊癌症之CD8+
T細胞(殺手T細胞或細胞毒殺性T細胞(CTL))群中不存在具有辨識癌組織之表面抗原之TCR者或者較少之情形時,即便抑制免疫檢查點,亦幾乎未獲得抗腫瘤效果。於TCR多樣性較高之受驗體中,確實地存在具有辨識癌組織之表面抗原之TCR者,故而可認為藉由利用免疫檢查點抑制劑之治療,容易受益。 進而,已知癌症包含複數個細胞群而非均勻之細胞群。認為該等多樣化之癌細胞係於每一細胞表現不同之癌抗原。因此,根據本發明之實施例之結果,可預測為了抑制癌細胞,必需辨識更多樣化之抗原之免疫細胞,且認為於具有多樣化之T細胞之患者中,容易發揮由免疫檢查點抑制藥所帶來之效果。 於本發明之1個實施形態中,基於受驗體之TCR之夏儂韋爾指數(Shannon-Weaver index)、逆辛普森指數(Inverse Simpson index)、辛普森指數(Simpson index)、標準化夏儂韋爾指數(Normalized Shannon-Weaver index)、DEX指數(X為0~100,例如DE30指數、DE50指數、DE80指數等)及/或UniqueX(X為0~100,例如Unique30指數、Unique50指數、Unique80指數等)之值,確定該受驗體對本說明書中所記載之任一癌症免疫療法為見效患者,或者確定並非為見效患者,或者確定為未見效患者,或者確定並非為未見效患者。 於本發明之1個實施形態中,可使用本說明書中所記載之基於多數分析之數值作為閾值。本說明書中所記載之閾值僅為例示,業者亦可基於進一步之受驗體群中之判定之結果,確定進一步之閾值而使用。於本說明書中,亦對確定閾值之方法進行揭示,本發明之方法可包括確定閾值之步驟,亦可使用按照此種方法預先確定之閾值。 多樣性指數之閾值可藉由算出一定數量之見效患者及未見效患者之多樣性指數,確定鑑別見效患者及未見效患者之數值而設定。作為鑑別之數值之確定方法,可列舉:使用見效患者群之最小值(將見效患者確實地判定為見效,感度成為100%);使用未見效患者群之最大值(不將未見效患者判定為見效患者,特異度成為100%);或者使用ROC分析(將由感度與特異度之平衡所帶來之判定之有效性最大化)。 作為其他方法,亦可藉由自未見效群或見效群之數值求出基準範圍(基準值),以超過此種基準範圍之異常值進行鑑別。基準範圍例如可為平均值±標準偏差(SD)或平均值±2SD等範圍,其基準範圍之上限或下限可設為基準值。於一部分情形時,可根據未見效群之數值算出平均值+SD或平均值+2SD等,藉此確定閾值。於一部分情形時,可根據見效群之數值算出平均值-SD或平均值-2SD等,藉此確定閾值。 於多樣性指標或閾值受到讀段數之影響之情形時,可列舉:進行讀段數之標準化處理而設定閾值;或者算出因再樣本化(重採樣)而不同之讀段數中之閾值,使用自讀段數與閾值之回歸分析等獲得之預測式(例如於設為讀段數:X,閾值:Y之情形時,可以通式Y=aX^
b等表示)而設定閾值。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之TCRα之夏儂韋爾指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可對對象患者進行消極或積極之臨床試驗而確定,於1個具體之實施形態中,閾值可於約3.2~4.4、較佳為約3.3~約4.2之範圍內設定,作為具體之閾值,例如可為約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4.0、約4.1、約4.2等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之TCRα之逆辛普森指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可對對象患者進行消極或積極之臨床試驗而確定,於1個具體之實施形態中,閾值可於約9~約19、較佳為約10~約18之範圍內設定,作為具體之閾值,例如可為約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之TCRα之辛普森指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可對對象患者進行消極或積極之臨床試驗而確定,於1個具體之實施形態中,閾值可於約0.86~約0.96、較佳為約0.88~約0.94之範圍內設定,作為具體之閾值,例如可為約0.86、約0.87、約0.88、約0.89、約0.90、約0.91、約0.92、約0.93、約0.94、約0.95、約0.96等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之TCRα之標準化夏儂韋爾指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可對對象患者進行消極或積極之臨床試驗而確定,於1個具體之實施形態中,閾值可於約0.41~約0.51、較佳為約0.42~約0.49之範圍內設定,作為具體之閾值,例如可為約0.42、約0.43、約0.44、約0.45、約0.46、約0.47、約0.48、約0.49等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之TCRα之DE50指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可對對象患者進行消極或積極之臨床試驗而確定,於1個具體之實施形態中,閾值可於約0.0007~約0.0015之範圍內設定,可於較佳為約0.0008~約0.0014、約0.0009~約0.0013、約0.0010~約0.0011等範圍內適當確定,作為具體之閾值,例如可列舉:約0.0007、約0.0008、約0.0009、約0.0010、約0.0011、約0.0012、約0.0013、約0.0014、約0.0015等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之TCRβ之夏儂韋爾指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可對對象患者進行消極或積極之臨床試驗而確定,於1個具體之實施形態中,閾值可於約3.2~約4.3、較佳為約3.4~約4.1之範圍內設定,作為具體之數值,例如可列舉:約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4.0、約4.1等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之TCRβ之逆辛普森指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可於約8~32、較佳為約10~約30之範圍內設定,作為具體之數值,例如可列舉:約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之TCRβ之辛普森指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可對對象患者進行消極或積極之臨床試驗而確定,於1個具體之實施形態中,閾值可於約0.90~約0.96、較佳為約0.92~約0.95之範圍內設定,作為具體之閾值,例如可為約0.90、約0.91、約0.92、約0.93、約0.94、約0.95、約0.96等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之TCRα之標準化夏儂韋爾指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可於約0.37~約0.48、較佳為約0.38~約0.47之範圍內設定,作為具體之數值,例如可列舉:約0.38、約0.39、約0.40、約0.41、約0.42、約0.43、約0.44、約0.45、約0.46、約0.47等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之TCRα之DE50指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可於約0.0004~約0.0012、較佳為約0.0005~約0.0012之範圍內設定,作為具體之數值,例如可列舉:約0.0005、約0.0006、約0.0007、約0.0008、約0.0009、約0.0010、約0.0011、約0.0012等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 因此,本發明之診斷受驗體對癌症免疫療法之應答性之方法可包括特定用以判定該受驗體對癌症免疫療法應答性良好之閾值的步驟。此種用以進行特定之方法可藉由進行如實施例等所例示之臨床試驗,算出多樣性指數,視需要進行統計學處理而特定。 測定受驗體之TCR多樣性所算出之如上所述之指數之值可適當四捨五入(例如若為DE50,則將小數點後5位進行四捨五入等),進行與閾值之比較。有效數字可考慮檢測極限,採用2位數或1位數。 再者,根據本說明書之實施例之結果,可採用以Responder群之平均值-SD、平均值-2SD作為下限之數值以上、以及根據ROC分析所算出之閾值。例如,與本說明書之實施例中之一部分多樣性指數相關之Responder群的平均值-SD係如下所述。 TCRα之夏儂韋爾指數:3.37 TCRα之逆辛普森指數:9.83 TCRα之標準化夏儂韋爾指數:0.422 TCRα之DE50指數:0.0013605 TCRβ之夏儂韋爾指數:3.69 TCRβ之逆辛普森指數:15.84 TCRβ之標準化夏儂韋爾指數:0.433 TCRβ之DE50指數:0.0009545 又,Responder群之平均值-2SD係如下所述。 TCRα之夏儂韋爾指數:2.66 TCRα之逆辛普森指數:-4.19 TCRα之標準化夏儂韋爾指數:0.366 TCRα之DE50指數:0.0007697 TCRβ之夏儂韋爾指數:3.03 TCRβ之逆辛普森指數:1.43 TCRβ之標準化夏儂韋爾指數:0.385 TCRβ之DE50指數:0.0005064 閾值(臨界值)之設定可使用ROC分析(Receiver Operating Characteristic analysis,受驗者操作特性分析)而進行。可利用使用ROC分析所確定之臨界值,例如進行抗PD-1抗體治療患者中之治療前之效果預測。 於ROC分析中,製作以使臨界值變化之情形時之陽性率作為感度並作為縱軸,以假陽性率(1-特異度)作為橫軸進行繪圖而成之ROC曲線。於設定臨界值之情形時,有以與ROC曲線之左上角之距離成為最小之點作為臨界值的方法;及計算距ROC曲線中之曲線下面積(AUC)成為0.500之斜虛線最遠之點、即(感度+特異度-1),以成為其最大值之點(約登指數(Youden index))作為臨界值之方法。本說明書中所記載之各多樣性指標之ROC曲線係示於圖7。基於本說明書之實施例1並根據約登指數算出之臨界值係示於表12,可使用如此例示之數值作為閾值。 於本說明書中,「感度」係指將應判定為陽性者準確地判定為陽性之概率,有若感度較高,則假陰性減小之關係。若感度較高,則可用於排除診斷(rule out)。 於本說明書中,「特異度」係指將陰性者準確地判定為陰性之概率,有若特異度較高,則假陽性減小之關係。若特異度較高,則可用於確定診斷。 例如,作為TCRα之夏儂韋爾指數之臨界值,可使用約3.7,作為TCRα之逆辛普森指數之臨界值,可使用約13,作為TCRα之標準化夏儂韋爾指數之臨界值,可使用約0.43,作為TCRα之DE50指數之臨界值,可使用約0.0012,作為TCRβ之夏儂韋爾指數之臨界值,可使用3.8,作為TCRβ之逆辛普森指數之臨界值,可使用約17,作為TCRβ之標準化夏儂韋爾指數之臨界值,可使用約0.42,作為TCRβ之DE50指數之臨界值,可使用約0.0007。 然而,並不限定於所例示之該等數值,業者可基於ROC分析,根據所需之感度及/或特異度調節閾值。又,並不限定於本說明書之實施例所例示者,可使用進一步之與受驗體相關之資訊進行ROC分析而確定臨界值。 於1個實施形態中,可預測到若未達該等臨界值,則無法期待由抗PD-1抗體所帶來之較高之治療效果。 多樣性指標可能會有因採樣之量而受到影響之情形。即,一部分TCR多樣性之指標會根據定序之讀段數而變動。於使用此種多樣性指標之情形時,藉由進行與特定讀段數對應之標準化,能夠進行更準確之應答性之評價。夏儂、辛普森、逆辛普森指數不論讀段數為何,均成為大致固定之數值,認為尤其於作為實際之分析水準之1萬個讀段以上時,幾乎不受讀段數所影響,於此種情形時,並非必須將指數進行標準化。 DE指數有隨著讀段數增加,通常減少之傾向。認為於在受驗體之間或受驗體與參照受驗體之間定序讀段數之差變大之情形時(例如於有10倍以上之變動之情形時),藉由使用對一定之讀段數進行標準化之DE指數,可進行更準確之應答性之評價。 作為標準化之1個方法,DE指數可與於雙對數軸上與讀段數具有線性關係者近似,可基於該關係性將指數標準化。因此,可藉由將某一讀段數下之DE指數與按照線性關係調節之閾值加以比較,而進行應答性之評價。 作為線性關係之一例,本說明書之實施例中所記載之DE指數之閾值與讀段數的線性關係係由以下之式: [數6](式中,y為閾值,x為讀段數)表示,業者可使用該關係進行標準化。即,藉由將基於讀段數x所獲得之DE指數與上述y加以比較,可進行應答性之評價。又,業者亦可根據複數個定序結果,重新導出線性關係而用於標準化。 又,關於閾值之線性關係,可視為具有寬度者。例如於將多樣性指數之值設為縱軸,將讀段數設為橫軸之情形時,可帶狀地表示。亦可為如下指標之使用方法:若為其上限以上,則判定為見效者,若為其下限以下,則判定為未見效,若為中間,則醫生酌情判斷投予。變動幅度例如可使用擬合曲線(fitting curve)之95%可靠性區間,一例示於本說明書之實施例。藉由進行此種計算,可使特異度或感度最大化。 又,作為其他標準化方法,亦可根據藉由定序所獲得之讀段,對一定數量之讀段進行重採樣,基於重採樣之讀段算出多樣性指數,藉此進行標準化。重採樣可藉由自所獲得之讀段隨機取得讀段而進行。又,重採樣亦可進行複數次,於此種情形時,可使用每次試行之多樣性指數之代表值(中間值、平均值等)作為標準化之多樣性指數。 設為標準化之基準之讀段數並無限定,例如可為1000、10000、20000、40000、80000、100000或200000等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。於一部分實施形態中,使用對30000個讀段進行標準化之DE50指數。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之對TCRα之30000個讀段進行標準化之夏儂韋爾指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可對對象患者進行消極或積極之臨床試驗而確定,於1個具體之實施形態中,閾值可於約2.8~4.1、較佳為約3.9~約4.1之範圍內設定,作為具體之閾值,例如可為約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4.0、約4.1等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之對TCRα之30000個讀段進行標準化之逆辛普森指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可對對象患者進行消極或積極之臨床試驗而確定,於1個具體之實施形態中,閾值可於約8~約16、較佳為約13~約15之範圍內設定,作為具體之閾值,例如可為約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之對TCRα之30000個讀段進行標準化之辛普森指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可對對象患者進行消極或積極之臨床試驗而確定,於1個具體之實施形態中,閾值可於約0.89~約0.94、較佳為約0.92~約0.94之範圍內設定,作為具體之閾值,例如可為約0.89、約0.90、約0.91、約0.92、約0.93、約0.94等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之對TCRα之30000個讀段進行標準化之標準化夏儂韋爾指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可對對象患者進行消極或積極之臨床試驗而確定,於1個具體之實施形態中,閾值可於約0.41~約0.54、較佳為約0.50~約0.52之範圍內設定,作為具體之閾值,例如可為約0.41、約0.42、約0.43、約0.44、約0.45、約0.46、約0.47、約0.48、約0.49、約0.50、約0.51、約0.52、約0.53、約0.54等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之對TCRα之30000個讀段進行標準化之DE50指數(%)為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可對對象患者進行消極或積極之臨床試驗而確定,於1個具體之實施形態中,閾值可於約0.36~0.40等範圍內適當確定,作為具體之閾值,例如可列舉:約0.36、約0.37、約0.38、約0.39、約0.40等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之TCRβ之對30000個讀段進行標準化之夏儂韋爾指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可對對象患者進行消極或積極之臨床試驗而確定,於1個具體之實施形態中,閾值可於約3.2~約4.0、較佳為約3.7~約3.9之範圍內設定,作為具體之數值,例如可列舉:約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4.0等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之TCRβ之對30000個讀段進行標準化之逆辛普森指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可於約10~23、較佳為約12~約22之範圍內設定,作為具體之數值,例如可列舉:約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之TCRβ之對30000個讀段進行標準化之辛普森指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可對對象患者進行消極或積極之臨床試驗而確定,於1個具體之實施形態中,閾值可於約0.90~約0.97、較佳為約0.92~約0.96之範圍內設定,作為具體之閾值,例如可為約0.90、約0.91、約0.92、約0.93、約0.94、約0.95、約0.96、約0.97等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之對TCRα之30000個讀段進行標準化之標準化夏儂韋爾指數為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可於約0.42~約0.53、較佳為約0.47~約0.52之範圍內設定,作為具體之數值,例如可列舉:約0.42、約0.43、約0.44、約0.45、約0.46、約0.47、約0.48、約0.49、約0.50、約0.51、約0.52、約0.53等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 於1個實施形態中,於受驗體之CD8+
PD-1+
T細胞之對TCRα之30000個讀段進行標準化之DE50指數(%)為閾值以上之情形時,表示該受驗體為見效患者,閾值可於約0.22~約0.26、較佳為約0.23~約0.25之範圍內設定,作為具體之數值,例如可列舉:約0.22、約0.23、約0.24、約0.25、約0.26等(可使用該等特定之數值之間之其他任意之特定之數值)。 針對經標準化之多樣性指數,可使用以與上述相同之方式基於ROC分析所算出之閾值,例如針對對30000個讀段進行標準化之多樣性指數,可使用本說明書中所例示之閾值。 例如,作為對TCRα之30000個讀段進行標準化之夏儂韋爾指數之臨界值,可使用約3.9,作為對TCRα之30000個讀段進行標準化之逆辛普森指數之臨界值,可使用約14,作為對TCRα之30000個讀段進行標準化之辛普森指數之臨界值,可使用約0.92,作為對TCRα之30000個讀段進行標準化之標準化夏儂韋爾指數之臨界值,可使用約0.51,作為對TCRα之30000個讀段進行標準化之DE50指數之臨界值,可使用約0.39,作為TCRβ之對30000個讀段進行標準化之夏儂韋爾指數之臨界值,可使用3.8,作為TCRβ之對30000個讀段進行標準化之逆辛普森指數之臨界值,可使用約22,作為TCRβ之對30000個讀段進行標準化之辛普森指數之臨界值,可使用約0.95,作為TCRβ之對30000個讀段進行標準化之標準化夏儂韋爾指數之臨界值,可使用約0.51,作為TCRβ之對30000個讀段進行標準化之DE50指數之臨界值,可使用約0.24。 又,臨界值可根據目的進行調節而選擇,例如可根據(i)排除非應答患者(社會保障費之觀點),或者(ii)消除應答患者之遺漏(醫生、治療之觀點)等目的而確定。為了進行(i),可藉由將高於非應答之最高線之值設為臨界值而達成,為了進行(ii),可藉由將低於應答者之最低線之值設為臨界值而達成。關於該等值,業者可基於受驗體群之多樣性指數而確定,或者可基於本說明書中所記載之非應答及應答受驗體所表現出之多樣性指數之最大值或最小值之例而設定閾值。 一般而言,生物學標記成為具有偏差之資料,所比較之2群能夠明確地加以分離之情形較稀少。通常,若可根據多個資料而設置正常值之閾值,以其為基準判別是否為異常值,則可用作標記,例如關於Keytruda(PD-L1抗體)之應用,將PD-1高陽性設為標記,但實際之見效率為50%左右。作為標記,即便無法進行100%之預測,亦充分有價值,因此感度、特異度均能夠以100%進行2群之分離之標記(例如TCR多樣性之DE50指數)可謂非常有利。 於1個較佳之實施形態中,TCR為TCRα。於另一較佳之實施形態中,TCR為TCRβ。較佳可為TCRβ。雖然不希望受到理論所束縛,但其原因為TCRβ之多樣性指數於應答性受驗體與非應答性受驗體所顯示之數值方面不存在重疊。但是,本發明並不限定於此,亦可為TCRα。雖然不希望受到理論所束縛,但其原因在於例如顯示出能夠藉由使用DE50指數而嚴格加以區別之情況。 於1個實施形態中,本發明中所利用之多樣性可使用如下步驟算出:自受驗體之末梢血液樣本單離CD8+
PD-1+
T細胞;及測定、確定或算出CD8+
PD-1+
T細胞之TCR多樣性。 本發明之1個實施形態係一種診斷受驗體對癌症免疫療法之應答性的方法,其包括:於該TCR多樣性較高之情形時,判定為該受驗體對癌症免疫療法應答性良好之步驟。 較佳為此處算出之TCR多樣性在使用本說明書中所詳述之大規模高效率TCR庫分析(WO2015/075939)時有利。雖然不希望受到理論所束縛,但於使用其他TCR庫分析之情形時,無法檢測一部分藉由大規模高效率TCR庫分析能夠檢測之獨特讀段。因此,藉由大規模高效率TCR庫分析所算出之多樣性指數係更精細者,更準確地反映受驗體之狀況。而且,雖然不希望受到理論所束縛,但認為實際上藉由大規模高效率TCR庫分析所獲得之多樣性指數可明確地識別應答性及非應答性,相對於此,於先前之大規模高效率TCR庫分析以外之庫分析中,應答性與非應答性之識別不充分。因此,於採用使用大規模高效率庫分析所測得之TCR多樣性之情形時,與先前分析相比,可獲得更準確之評價結果。 於本發明之診斷受驗體對癌症免疫療法之應答性之方法中,在藉由包括大規模高效率TCR庫分析之方法而測定受驗體之T細胞之TCR多樣性後,於該TCR多樣性較高之情形時,判定為該受驗體對癌症免疫療法應答性良好。TCR多樣性是否較高可相對地進行判斷,或者可與預先確定之多樣性指數之閾值(例如本說明書中所記載者)進行比對而判定多樣性是否較高。而且,於多樣性指數較高之情形時,判斷為對癌症免疫療法應答性良好或者具有應答性,可適當視需要進行其後之治療。可使用之T細胞可為本說明書中所記載之任意種類中之一種或複數種T細胞,較佳可為末梢血液中之CD8+
PD-1+
T細胞。 本發明之進一步之實施形態係診斷受驗體對癌症免疫療法之應答性,治療該受驗體之癌症之方法(所謂伴隨診斷或伴隨治療),其包括如下步驟:測定受驗體之T細胞之TCR多樣性;及於該TCR多樣性高於基準值之情形時,對該受驗體實施癌症免疫療法。關於TCR多樣性之基準值或閾值,業者可基於本說明書之記載而適當地確定,其具體之多樣性指數之數值係例示於本說明書中,可適當採用。可使用之T細胞可為本說明書中所記載之任意種類中之一種或複數種T細胞,較佳為T細胞可為末梢血液中之CD8+
PD-1+
T細胞。 (免疫檢查點抑制劑之伴隨用途) 於本發明之進一步之態樣中,本發明提供一種包含免疫檢查點抑制劑之組合物,其係用以對於T細胞之TCR多樣性較高之受驗體治療癌症。本發明者等人發現將此種免疫檢查點抑制劑投予至T細胞之TCR多樣性較高之受驗體時有利。而且,關於對T細胞之TCR多樣性較低之受驗體,可判斷為未見效患者,亦可判斷為不投予免疫檢查點抑制劑,或者判斷為中斷或中止投予。測定TCR多樣性之T細胞可為本說明書中所記載之任意種類中之一種或複數種T細胞,較佳可為末梢血液中之CD8+
PD-1+
T細胞。 本發明之組合物較佳為醫藥組合物,作為作為其有效成分所包含之免疫檢查點抑制劑,例如可列舉PD-1抑制劑。作為PD-1抑制劑,可列舉作為抗PD-1抗體之納武單抗或派姆單抗。 組合物可製劑化為氣溶膠、液劑、浸膏劑、酏劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、軟膏、散劑、錠劑、溶液、懸浮液、乳液等任意之劑型。組合物可包含本技術領域中公知之任意之藥學上所容許之添加物及/或賦形劑。 本發明之組合物可藉由由業者確定之任意之適當之路徑而投予,並無限定,可列舉:靜脈注射、點滴、經口、非經口、經皮等。 於1個實施形態中,提供一種用以對於T細胞之TCR之夏儂指數、辛普森指數、標準化夏儂指數或DE50指數較高之受驗體治療癌症的組合物。於較佳之實施形態中,提供一種用以對於T細胞之TCR之DE50指數較高之受驗體治療癌症的組合物。 本發明提供一種用以對於針對末梢血液中之CD8+
PD-1+
T細胞之TCRα,標準化為30000個讀段之DE50指數為0.39%以上之受驗體治療癌症的組合物。 本發明提供一種用以對於針對末梢血液中之CD8+
PD-1+
T細胞之TCRβ,標準化為30000個讀段之DE50指數為0.24%以上之受驗體治療癌症的組合物。 (大規模高效率TCR庫分析之新穎用途) 於1個態樣中,提供一種使用藉由包括大規模高效率TCR庫分析之方法所確定之庫之多樣性作為受驗體對治療之應答性之指標的方法。該方法係藉由包含1種正向引子及1種反向引子之1集之引子,於不改變存在頻度之情況下將包含所有同型或亞型基因之TCR基因或BCR基因進行擴增,確定庫之多樣性。如本說明書所記載,亦如WO2015/075939所記載般,該引子設計係對非偏向性之擴增較有利。 於使用其他庫分析之情形時,無法檢測一部分藉由大規模高效率庫分析能夠檢測之獨特讀段。因此,藉由大規模高效率庫分析所算出之多樣性指數係更精細者,更準確地反映受驗體之狀況。而且,雖然不希望受到理論所束縛,但認為實際上藉由大規模高效率庫分析所獲得之多樣性指數可明確地識別對治療之應答性及非應答性,相對於此,於先前之大規模高效率庫分析以外之庫分析中,對該治療之應答性與非應答性之識別不充分。 於1個實施形態中,成為對象之治療係與免疫反應相關之治療。於另一較佳之實施形態中,所利用之庫分析為TCR庫分析。 (註釋) 於本說明書中,「或」係於可採用文章中所列舉之事項之「至少1個以上」時使用。「或者」亦相同。於本說明書中,於明確記載為「2個值」之「範圍內」之情形時,於該範圍內亦包含2個值本身。 本說明書中所引用之科學文獻、專利、專利申請案等參考文獻之全部內容係分別以與具體地記載者相同之程度,於本說明書中作為參考而引用。 以上,為了容易進行瞭解,示出較佳之實施形態而說明本發明。以下,基於實施例說明本發明,但上述說明及以下之實施例僅供於例示之目的,並非以限定本發明之目的提供。因此,本發明之範圍既不限定於本說明書中具體地記載之實施形態,亦不限定於實施例,僅由申請專利範圍限定。 [實施例] 以下,記載實施例。於必需之情形時,於以下之實施例中,所有實驗均按照兵庫醫科大學倫理委員會所批准之準則實施。又,遵照文部科學省、厚生勞動省、經濟產業省製作之「與以人為對象之醫學系統研究相關之倫理準則」(2014年12月22日26文科振第475號厚生勞動省發科1222第1號醫政發1222 第1號)之準則進行。又,依據人類基因分析研究之倫理準則。實驗係於兵庫醫科大學倫理委員會中之審查後,批准後實施。試劑種類係使用具體地記載於實施例中之製品,但亦可以其他製造商(Sigma-Aldrich,和光純藥,Nacalai,R&D Systems,USCN Life Science INC等)之同等品代替。 (實施例1:受到抗PD-1抗體治療之患者之TCR多樣性) (1.材料及方法) 1.1.末梢血液單核球細胞(PBMC)之分離 於12例肺癌患者中之抗PD-1抗體(nivolumab,Opdivo)治療開始前,於含肝素之採血管中採集8 mL全血。全血係藉由使用Ficoll-Hypaque之比重離心分離而分離PBMC,藉由血球計對細胞數進行計數。單離之PBMC直接進行免疫細胞染色,或者懸浮於細胞用冷凍保存液STEM-CELLBANKER中並保管於液態氮中。 1.2.利用抗CD8抗體及抗PD-1抗體之雙重染色 PBMC係按照下述順序進行免疫染色。 1.冷凍保管之細胞為了去除STEM-CELLBANKER,懸浮於染色緩衝液(Stain Buffer)(PBS(phosphate buffer saline,磷酸鹽緩衝液),0.1% BSA(bovine serum albumin,牛血清白蛋白),0.1%疊氮化鈉(Sodium Azide))中,於離心後捨棄上清液,藉此清洗2次。 2.將新鮮或保管PBMC以成為1×106
/tube之方式懸浮於染色緩衝液中,以1,000 rpm於4℃下離心5分鐘。 3.細胞係於100 μL之抗體稀釋液(5 μl/test抗人類CD8抗體,2.0 μg抗人類PD-1抗體)中,於室溫下於遮光下染色30分鐘。 4.於抗體染色後,懸浮於2 mL之染色緩衝液中,以1,000 rpm於4℃下離心5分鐘後,捨棄上清液,藉此清洗2次。 5.於清洗後,懸浮於100 μL之染色緩衝液中,添加5 μL之7-AAD,於遮光下於室溫下反應10分鐘。 6.於細胞中加入500 μL之染色緩衝液,進行過濾。 7.染色細胞係使用BD FACSAria III細胞分選儀(BD Bioscience),對7AAD-
CD8+
PD-1+
細胞群進行分選分離。 8.分選之細胞係轉移至1.5 mL之Eppendorf管中,以1,000 rpm於4℃下離心5分鐘。 9.殘留50 μL之上清液並去除染色緩衝液後,加入750 μL之TRIzol LS試劑(Invitrogen)並進行移液,藉此溶解細胞。 10.於溶解之TRIzol液中加入200 μL之DEPC Water,調整為1000 μL後,於藉由Vortex之混合後,於-80℃下進行冷凍保管。 1.3.RNA萃取 自溶解於TRIzol LS試劑中之細胞之所有RNA之萃取及純化係使用RNeasy Plus Universal Mini Kit(QIAGEN)而進行。使用Nanodrop吸光度計(Thermo Scientific)或TapeStation2200(Agilent)對純化之RNA進行定量。 1.4.互補DNA及雙鏈互補DNA之合成 為了使用萃取之RNA,合成互補DNA,將1.25 μL之BSL-18E引子(表1)與3.75 μL之RNA加以混合,於70℃下退火8分鐘。 [表1]
於冰上進行冷卻後,於下述組成中於核糖核酸酶抑制劑(RNAsin)之存在下進行反轉錄反應,合成互補DNA。 [表2]
繼而,於下述雙鏈DNA合成緩衝液中,於大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA連接酶、核糖核酸酶H之存在下,於16℃下保溫2小時,合成雙鏈互補DNA。進而,使T4 DNA聚合酶於16℃下反應5分鐘,進行5'末端平滑化反應。 [表3]
雙鏈DNA係於藉由MiniElute Reaction Cleanup Kit(QIAGEN)進行管柱純化後,於下述T4連接酶緩衝液中,於P20EA/10EA轉接子(表4)及T4連接酶之存在下,於16℃下保溫整夜,進行接合反應。 [表4]
以與上述相同之方式藉由管柱進行純化之附加有轉接子之雙鏈DNA為了去除附加於3'末端之轉接子,使用Not I限制酶(50 U/μL,Takara),以下述組成消化。 [表5]
再者,消化時間可適當變更。 1.5. PCR 自雙鏈互補DNA,使用表2所示之共通轉接子引子P20EA及C區域特異性引子(CG1、CK1或CL1),進行1st
PCR擴增。PCR係以如下所示之組成,將95℃ 20秒、60℃ 30秒、72℃ 1分鐘之循環進行20個循環。 [表6]
其次,使用1st
PCR擴增產物,使用P20EA引子及C區域特異性引子(CA2或CB2),以如下所示之反應組成進行2nd
PCR。PCR係以如下所示之組成,將95℃ 20秒、60℃ 30秒、72℃ 1分鐘之循環進行20個循環。 [表7]
將所獲得之2nd
PCR擴增產物10 μL使用Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter)而對擴增產物進行純化。以最終溶出液30 μL中之5 μL作為模板,進行Tag附加PCR。於擴增中,使用圖1所示之P22EA-ST1-R及mCG-ST1-R、mCK-ST1-R或mCL-ST1-R引子。PCR循環係將95℃ 20秒、60℃ 30秒、72℃ 1分鐘進行20個循環。 [表8]
將所獲得之Tag PCR擴增產物10 μL使用Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter)而對擴增產物進行純化。以最終溶出液30 μL中之2 μL作為模板,使用Nextera XT Index Kit v2 SetA(Illumina),附加INDEX。PCR循環係將95℃ 20秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒進行12個循環。為了確認PCR擴增,藉由2%瓊脂糖凝膠電泳而確認10 μL之擴增產物。所獲得之INDEX化PCR擴增產物係使用Qubit 2.0 Fluorometer(Thermo Fisher Scientific)進行定量,稀釋至適當之濃度後,使用MiSeq定序儀(Illumina)進行定序。定序裝置之操作及順序係按照MiSeq使用說明書及手冊。 藉由定序所獲得之Fastq資料係使用Repertoire Genesis公司之庫分析軟體(Repertoire Genesis),進行已知之參考序列與V、D、J及C區域之對照及CDR3胺基酸序列之確定。將序列相同者設為獨特讀段,對其複製數進行計數,藉此求出占整體之比率。 1.6.多樣性指數之算出 自所獲得之各獨特讀段之讀段數資料求出多樣性指數。夏儂韋爾指數(Shannon-Weaver index)、辛普森指數(Simpson index)、逆辛普森指數(Inverse Simpson index)(1/λ)及DE50指數係按照以下數式算出。N:總讀段數,ni
:第i個獨特讀段之讀段數,S:獨特讀段數,S50
:占全部讀段之50%之上位獨特讀段之數 [數7] 辛普森指數(1-λ)[數8] 夏儂-韋納指數(H')[數9] 標準化夏儂-韋納指數(H')[數10]計算係於Repertoire Genesis公司之分析伺服器中作為庫分析程式之分析程式之一部分實施(http://www.repertoire.co.jp/)。除此以外,亦對使用S30
(占全部讀段之30%之上位獨特讀段之數)及S80
(占全部讀段之80%之上位獨特讀段之數)代替S50
(占全部讀段之50%之上位獨特讀段之數)之DE30指數及DE80指數、直接使用S部分之獨特指數進行計算。 (2.結果) 2.1.臨床評價 於抗PD-1抗體治療開始前及治療後3個月後進行患者胸部CT或PET影像診斷,基於腫瘤量之形態評價及腫瘤量之變化而評價治療效果(圖1)。一部分患者之效果判定結果(完全見效、部分見效、穩定、發展)及主要之治療經過係示於表9。將一部分患者之胸部CT影像示於圖2。圖2所示之4例中之2例患者係於治療後3個月之時間判定為部分見效(PR),其他2例判定為未見效。 [表9]
2.2. FACS分選 使用於12例肺癌患者治療前所採集之PBMC而進行FACS分析。PBMC係藉由PE-Cy7標記抗人類CD8抗體及FITC標記抗PD-1抗體進行染色。藉由FSC/SSC設門而去除淋巴球成分,進而,藉由7AAD而去除死細胞。藉由FACS Aria III細胞分選儀收集7AAD-
CD8+
PD-1+
T細胞,溶解於TRIzol LS RNA萃取試劑中。於圖3中示出FACS分析之結果之一部分。示出藉由FSC/SSC之淋巴球門(上段)及CD8抗體及PD-1抗體之雙重染色(下段)。針對淋巴球成分,藉由FACS分選而分取7AAD-
CD8+
PD-1+
細胞成分(P3)(圖3)。 針對各患者中之CD8+
PD-1+
細胞占淋巴球之比率、及CD8+
PD-1+
細胞占CD8+
T細胞之比率,於抗PD-1抗體治療見效患者(n=6)與未見效患者(n=6)之間加以比較(圖4)。前者表現出未見效患者與見效患者相比較高之傾向,另一方面,後者未見明確之差異。 2.3. CD8+
PD-1+
T細胞之TCR庫分析 使用藉由FACS分選所回收之CD8+
PD-1+
T細胞,按照方法所記載之方法進行藉由下一代定序儀之TCR基因之廣泛之鹼基序列的確定。將藉由FACS分選所回收之細胞數及RNA量示於表10。將自各樣本所獲得之TCR讀段數、指定之讀段數、同框讀段數及獨特讀段數示於表11。 [表10]
[表11]
關於所獲得之TCR讀段數及獨特讀段數,作為未見效患者之患者4最多,未見TCR讀段數或獨特讀段數與治療效果之關聯性。 2.4.使用多樣性指標之CD8+
PD-1+
T細胞之治療患者之間之多樣性比較 為了於抗PD-1抗體治療患者之間比較CD8+
PD-1+
T細胞之多樣性,使用自12例肺癌患者試樣確定序列之TCR讀段資料而算出多樣性指標,並加以比較。使用各獨特讀段及其讀段數(複製數),按照方法中記載之數式算出多樣性指標。作為多樣性指標,使用夏儂-韋納指數、標準化夏儂-韋納指數、辛普森指數、逆辛普森指數及DE50指數(圖5及6)。有意義差檢定係使用非參數之曼恩-惠尼檢定(兩側檢定)。關於TCRα鏈,夏儂-韋納指數係與未見效患者相比,對於見效患者顯示出顯著高之值(平均值±標準偏差,未見效患者vs.見效患者,2.796±0.9519 vs. 4.081±0.7124,P=0.0411)。同樣地,標準化夏儂-韋納指數、逆辛普森指數及DE50之多樣性指標分別為0.3327±0.1018 vs. 0.4771±0.05547(P=0.0260)、7.530±4.906 vs. 23.85±14.02(P=0.0152)、0.0006220±0.0003472 vs. 0.001951±0.0005909(P=0.0022),與未見效患者相比,均對於見效患者顯示出顯著高之值。又,同樣地關於TCRβ鏈,所有指標均與未見效患者相比,對於見效患者顯示出顯著高之值。平均值±標準偏差分別為3.129±0.6742 vs. 4.345±0.6555、P=0.0087(夏儂-韋納指數);0.3528±0.0612 vs. 0.4815±0.04832、P=0.0087(標準化夏儂-韋納指數);8.198±3.551 vs. 30.25±14.41、P=0.0087(逆辛普森指數);0.0003910±0.00007243 vs. 0.001403±0.0004480、P=0.0022(DE50)。根據該等結果,可知關於CD8+
PD-1+
T細胞之多樣性,見效患者明顯高於未見效患者。 2.5.臨界值之設定 為了進行抗PD-1抗體治療患者中之治療前之效果預測,使用ROC分析(Receiver Operating Characteristic analysis)而進行各多樣性指標之臨界值之設定。於ROC分析中,製作以使臨界值變化之情形時之陽性率作為感度並作為縱軸,以假陽性率(1-特異度)作為橫軸而繪製之ROC曲線。於設定臨界值之情形時,有如下方法:將與ROC曲線之左上角之距離成為最小之點設為臨界值;及計算距ROC曲線中之曲線下面積(AUC)成為0.500之斜虛線最遠之點、即(感度+特異度-1),將成為其最大值之點(Youden index)設為臨界值。將各多樣性指標之ROC曲線示於圖7。DE50係與其他多樣性指標相比,TCRα、TCRβ均AUC顯示出最高值,提示預測能力最優異。各多樣性指標之臨界值係使用R程式(ROCRpackage)根據約登指數而算出,並示於表12。若未達該等臨界值,則預測無法期待由抗PD-1抗體所產生之較高之治療效果。 [表12]
又,雖然不希望受到理論所束縛,但觀察到與TCRα庫多樣性相比,TCRβ庫多樣性有可更明確地嚴格區別之傾向。又,觀察到若為DE50指數,則任一庫均有可更明確地嚴格區別之傾向。 (3.探討) 已知CD8+
PD-1+
T細胞係藉由抗PD-1抗體解除免疫抑制,而發揮抗腫瘤效果。根據本實驗,可知越是肺癌患者之末梢血液中之CD8+
PD-1+
T細胞之多樣性較高之患者,對抗PD-1抗體之治療效果越高。腫瘤浸潤T細胞係辨識腫瘤特異性抗原,發揮抗腫瘤效果。腫瘤細胞係於腫瘤化之過程中蓄積較多之基因突變,產生正常細胞中未表現之新生抗原(neoantigen)。已知免疫檢查點抑制藥等之免疫療法對蓄積更多之基因突變之腫瘤之效果較高。認為為了抑制腫瘤,更大量之新生抗原成為T細胞之靶較為重要。推測於對抗PD-1抗體有效之患者體內,存在於治療之前與經免疫抑制之大量新生抗原反應的多樣化之T細胞。推測該等係藉由抗PD-1抗體而解除抑制,帶來更高之治療效果。針對肺癌患者,對抗PD-1抗體(Nivolumab)有效之患者為20~30%。若可於抗PD-1抗體治療前預測有效患者,則可實現更有效之治療,避免浪費醫療費。若進行容易進行試樣採集之末梢血液細胞之TCR庫分析,並利用多樣性指標作為生物標記,則期待可進行迄今為止無法實現之抗PD-1抗體治療之效果預測。 (實施例2:根據讀段數之多樣性指數變化之研究) 多樣性指數可能會受到樣本數、即藉由定序所獲得之讀段數所影響而發生變動。因此,自實施例1中所獲得之各受驗體之資料,藉由隨機採樣而取得一定讀段數(100、300、1000、3000、10000、30000、80000),分別算出基於該讀段之多樣性指數(夏儂-韋納指數、辛普森指數、標準化夏儂指數、逆辛普森指數、DE30指數、DE50指數、DE80指數、Unique30指數、Unique50指數、Unique80指數),並進行繪圖。重採樣係試行100次,使用各多樣性指標之中間值作為對各讀段數進行標準化之值。與TCRα及TCRβ之多樣性指數相關之根據讀段數之變化分別示於圖8及圖9。 夏儂、辛普森、逆辛普森指數不論讀段數為何,均成為大致固定之數值,認為若為尤其是作為實際之分析水準之1萬個讀段以上,則幾乎不受讀段數影響。另一方面,DE指數受到讀段數之影響,觀察到若讀段數變多則指數降低之傾向。關於作為DE50以外之DE指數之DE30、DE80,亦顯示出相同之傾向。因此,認為關於DE指數,於使用特定之數值作為閾值之情形時,設定考慮到讀段數之影響之閾值較有利。 進而,將實施例1之見效群及未見效群之TCR多樣度指數示於圖10及11,並將標準化為30000個讀段之比較之結果示於圖10及11。針對各受驗體,將各多樣性指數標準化為100、300、1000、3000、10000、30000及80000個讀段之值係示於以下之表13~33。於Clinical之欄中示出各受驗體之治療效果。Res_min表示應答群中之指數之最小值,Non_max表示非應答群中之指數之最大值。於表13~33中,Discrim表示應答群中之指數之最小值是否大於非應答群中之指數之最大值。應答群與非應答群之間之多樣性指數之t統計值係示於t檢定之欄。 [表13]
[表14]
[表15]
[表16]
[表17]
[表18]
[表19]
[表20]
[表21]
[表22]
[表23]
[表24]
[表25]
[表26]
[表27]
[表28]
[表29]
[表30]
[表31]
[表32]
針對如此標準化之多樣性指數,檢定實施例1中所檢測之見效群(n=6)與未見效群(n=6)之有意義差是否於任一讀段數下均同樣地檢測到。有意義差檢定係藉由異方差、t檢定而進行。結果係示於表13~32,夏儂、辛普森、DE50等實施例1中所使用之所有多樣性指數不會受到讀段數之影響,表現出有意義差。認為讀段數雖影響DE50指數等DE指數之絕對值,但不影響有意義差,由多樣性指數所帶來之效果預測之意義不變。 因此,多樣性指數可對讀段數進行標準化而加以比較,於絕對值發生變化之DE指數之情形時,可謂與特定之閾值之比較係對讀段數進行標準化較有利。 進而,可知關於DE50值,根據實施例1之資料,見效群與未見效群之分離較佳。於本實施例中,調查是否於標準化為一定讀段數(100、300、1000、3000、10000、30000、80000)之情形時,亦同樣地嚴格區別性較佳。探索表示如見效群之最小值超過未見效群之最大值之「明顯」之分離(ROC曲線之AUC成為1)的指數及讀段數,關於此種指標,於表13~32之Discrim之欄中表示為是。證實於DE50中,可實現此種完全之分離。又,有於DE30中有意義差消失之情況,但可知於DE50指數中,讀段數亦自10000個讀段至80000個讀段表現出大致相同程度之識別性。證實於DE指數中,DE50值最佳,無法預測之嚴格區別性可藉由使用DE50而達成。 進而,對使用此種標準化之多樣性指數而評價應答性之情形時使用之閾值進行研究。首先,基於將各多樣性指數標準化為各讀段數之情形時之值,進行ROC分析,求出閾值。基於ROC分析所算出之各多樣性指數之臨界值係示於以下之表33(TCRα)及表34(TCRβ)。例如,算出之針對各讀段數之閾值可於使用對各讀段數進行標準化之指數而評價應答性之情形時使用。 [表33]
[表34]
進而,為了確定根據(i)排除非應答患者(社會保障費之觀點),或者(ii)消除應答患者之遺漏(醫生、治療之觀點)等目的而使用之閾值,對標準化為30000個讀段之情形時之各多樣性指數之閾值進一步進行研究。標準化為30000個讀段之非應答及應答受驗體所表現出之多樣性指數之最大值或最小值之例、及基於ROC分析之閾值係示於以下之表35(TCRα)及表36(TCRβ)。藉由基於此種值之例而設定閾值,可進行如達成上述目的之應答性之評價。 [表35]
[表36]
進而,對由隨機重採樣所引起之多樣性指數之閾值之變動進行研究。對針對各多樣性指數,自基於標準化為各讀段數之值之ROC分析所算出之閾值進行繪圖(圖12及圖13)。與夏儂、辛普森、逆辛普森指數、獨特指數相關之閾值不論讀段數為何,均成為大致固定之數值。發現表現出隨著讀段數之增加而減少之傾向之DE指數的閾值係於log-log圖(雙對數)中近似於一次函數(圖12及圖13)。尤其於實際之分析中使用之可能性較高之3000個讀段以上的圖中,相關係數亦非常高。關於DE50指數,α鏈可與y=1892.344x^(-0.8239)近似,β鏈可與y=993.116x^(-0.8072)近似(x=讀段數,y=DE50指數之閾值)(圖14)。因此,認為藉由將對某一讀段數算出之DE50指數與根據上述關係導出之該讀段數中之DE50指數之閾值加以比較,可評價受驗體之應答性。 關於其他DE指數,可如下般進行近似。 [數11](x=讀段數,y=DE指數之閾值) 為了研究應用此種線性關係之範圍,計算與該等擬合曲線相關之95%可靠性區間。計算之95%可靠性區間係示於下述表37。 [表37]
進而,於各點之資料(值)變動10%之情形時,求出於最大及最小值下斜率及截距以哪一程度變動。結果係示於以下之表38。 [表38]
又,關於見效者之判定,可使用見效患者之最小值及/或未見效患者之最大值作為閾值,亦對此種值相對於讀段數之線性變動進行研究。亦可實現若為Res_Min以上則稱為見效,若為NonRes_Max以下則稱為未見效之區別使用。變動之結果係示於以下之表39。 [表39]
(實施例3:免疫抑制分子表現T細胞成分中之TCR多樣性) (1.材料及方法) 1.末梢血液單核球細胞(PBMC)之分離 於含肝素之採血管中採集1例抗PD-1抗體(nivolumab,Opdivo)治療見效患者之全血20 mL。藉由使用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)之比重離心分離而分離PBMC,藉由血球計對細胞數進行計數。單離之PBMC係懸浮於細胞用冷凍保存液STEM-CELLBANKER(TaKaRa Bio)中,保管於-80℃超低溫冷凍庫中。 2. PBMC之抗體染色 PBMC係按照下述順序進行免疫染色。 2.1 將冷凍保管之PBMC加以溶解,使表41所示之細胞數懸浮於染色緩衝液中。 2.2 為了去除STEM-CELLBANKER,懸浮於染色緩衝液中後,以800×g於4℃下離心5分鐘,清洗2次。 2.3 使細胞懸浮於染色緩衝液中,按照隨附說明書之指示而添加下述表40之抗體,於遮光、室溫下與細胞反應30分鐘。 [表40]
2.4 於清洗後,懸浮於100 μL之染色緩衝液中,添加5 μL之7-AAD,於遮光下於室溫下反應10分鐘。 2.5 於細胞中加入500 μL之染色緩衝液,進行過濾後,使用BD FACSAria III細胞分選儀(BD Bioscience)或FACSMelody細胞分選儀(BD Bioscience),將上述分選成分進行分選分離。 2.6 分選成分係藉由以800×g於4℃下離心5分鐘而回收。 2.7 殘留上清液250 μl並去除後,加入750 μl之Trizol LS試劑(Invitrogen)並進行移液,將細胞溶解。 2.8 RNA萃取後之TCR庫分析係按照實施例1之「1.3. RNA萃取」、「1.4.互補DNA及雙鏈互補DNA之合成」及「1.5. PCR」之方法實施。 2.9 於抗體染色後,懸浮於2 mL之染色緩衝液中,以800×g於4℃下離心5分鐘後,捨棄上清液,藉此清洗2次。 (2.結果) 將CD8+
PD1+
、CD8+
4-1BB+
、CD8+
TIM3+
、CD8+
OX40+
、CD8+
TIGIT+
及CD8+
CTLA4+
T細胞成分占淋巴球之比率(%)、及藉由FACS分選所回收之細胞數示於表41。回收共表現CD8及各分子標記之約1×104
~1×105
之T細胞,自該等T細胞成分萃取RNA,按照慣例進行TCR庫分析。將TCR序列分析之結果、自各試樣所獲得之總讀段數、獨特讀段數、同框讀段數示於表42a及表42b。於任一試樣中均可獲得10萬個以上之讀段。 [表41]
[表42a]
[表42b]
(各T細胞成分之間之TCR庫之共通性) 針對藉由TCR庫分析所獲得之TCR選殖之序列,將CD8P+
PD1+
、CD8+
4-1BB+
、CD8+
TIM3+
、CD8+
OX40+
、CD8+
TIGIT+
及CD8+
CTLA4+
T細胞成分之間共通之選殖加以比較。將所有成分間或複數種成分間共通存在之TCR選殖示於表43。可知CD8+
PD-1+
成分中高頻度地存在之TCR選殖亦高頻度地存在於CD8+
4-1BB+
、CD8+
TIM3+
、CD8+
OX40+
、CD8+
TIGIT+
或CD8+
CTLA4+
成分。該情況提示有CD8+
PD-1+
T細胞共表現4-1BB、TIM3、OX40、TIGIT或CTLA4分子之可能性。又,對TCR選殖之讀段數調查各T細胞成分之間之關聯(圖15)。高頻度地存在之TCR選殖係共通存在於各T細胞成分,表現出較高之關聯。其次,調查CD8+
PD-1+
T細胞與CD8+
4-1BB+
、CD8+
TIM3+
、CD8+
OX40+
、CD8+
TIGIT+
或CD8+
CTLA4+
T細胞之間共通之TCR選殖之讀段的比率(表44)。CD8+
PD-1+
之TCR選殖占各成分之讀段之比率係與對照之CD8+
T細胞相比,明顯於CD8+
4-1BB+
、CD8+
TIM3+
、CD8+
OX40+
、CD8+
TIGIT+
或CD8+
CTLA4+
T細胞中較高。該情況提示CD8+
PD-1+
T細胞中所含有之腫瘤特異性T細胞之腫瘤特異性TCR亦高頻度地包含於4-1BB、TIM3、OX40、TIGIT或CTLΑ-4陽性之T細胞成分中。根據該等情況,期待末梢血液中之CD8+
4-1BB+
、CD8+
TIM3+
、CD8+
OX40+
、CD8+
TIGIT+
、CD8+
CTLA4+
之任一T細胞成分均可用作TCR多樣性之生物標記。 [表43][表44]
對自治療見效患者之PBMC藉由FACS分選所分離之CD8+
PD1+
、CD8+
4-1BB+
、CD8+
TIM3+
、CD8+
OX40+
、CD8+
TIGIT+
及CD8+
CTLA4+
成分實施TCR庫分析,算出夏儂指數、標準化夏儂指數、逆辛普森指數、DE50指數。其結果為CD8+
PD1+
T細胞之多樣性指數表現出與相同之患者之CD8+
4-1BB+
、CD8+
TIM3+
、CD8+
OX40+
、CD8+
TIGIT+
或CD8+
CTLA4+
T細胞相同程度的多樣度。又,任一成分均以與治療見效患者(n=6)之CD8+
PD-1+
T細胞相同之程度,表現出明顯高於未見效患者(n=6)之CD8+
PD-1+
T細胞之多樣性指數(圖16及圖17)。根據該等情況,期待可不限於CD8+
PD1+
T細胞,分析具有4-1BB+
、TIM3+
、OX40+
、TIGIT+
或CTLA4+
等T細胞表面標記之CD8+
T細胞,藉此用作免疫檢查點抑制藥之治療效果預測之生物標記。 (註釋) 如上所述,使用本發明之較佳之實施形態而例示本發明,但瞭解到本發明應僅藉由申請專利範圍解釋其範圍。瞭解到本說明書中所引用之專利、專利申請案及文獻應其內容本身與本說明書中具體地記載者同樣地,其內容作為對本說明書之參考而引用。 [產業上之可利用性] 進行容易進行試樣採集之末梢血液細胞中之TCR庫分析所獲得之多樣性指標可用作用以預測癌症免疫療法之效果的生物標記。 [序列表非關鍵文字] 序列編號1:BSL-18E引子 序列編號2:P20EA引子 序列編號3:P10EA引子 序列編號4:P22EA-ST1-R引子 序列編號5:CA1引子 序列編號6:CA2引子 序列編號7:CA-ST1-R引子 序列編號8:CB1引子 序列編號9:CB2引子 序列編號10:CB-ST1-R引子 序列編號11~60:實施例3中之各TCRβ鏈選殖之CDR3序列
圖1係表示用以預測受到利用抗PD-1抗體之治療之患者之治療效果之TCR庫分析之例示性之順序的圖。 圖2A係表示受到利用抗PD-1抗體之治療之患者#1及患者#2之治療開始前及治療開始後之藉由CT影像診斷所獲得之臨床評價的圖。 圖2B係表示受到利用抗PD-1抗體之治療之患者#3之治療開始前及治療開始後之藉由CT影像診斷所獲得之臨床評價、及患者#4之治療開始前及治療開始後之藉由FDG-PET影像診斷所獲得之臨床評價的圖。 圖3係表示針對患者#1之FACS分析之結果之圖。 圖4係表示抗PD-1抗體見效患者與未見效患者之間之PD1陽性細胞之比較的圖。表示抗PD-1抗體治療見效患者(Responder,n=6)及未見效患者(Non-Responder,n=6)之治療前之CD8+
T細胞中之PD1+
細胞的比率(左)、及CD8+
PD1+
細胞占末梢血液細胞之淋巴球成分之比率(右)。PD1+
細胞占CD8+
T細胞中之比率係於兩群中幾乎不存在差異。 圖5A~E係表示治療前PD-1抗體見效患者與未見效患者之間之TCRα之多樣性指標之比較的圖。於治療抗PD-1抗體治療患者(n=12)之前,自患者全血單離末梢血液單核球細胞,藉由FACS分選儀區分CD8+
PD-1+
細胞。自CD8+
PD1+
細胞萃取RNA,實施大規模高效率TCR庫分析,算出其多樣性指數(TCRα)。使用夏儂指數(A)、標準化夏儂指數(B)、辛普森指數(C)、逆辛普森指數(D)及DE50指數(E)之多樣性指數,於PD-1抗體見效患者(Responder,n=6)與未見效患者(Non-Responder,n=6)之間加以比較。於所有多樣性指數中,PD-1抗體治療見效患者與未見效患者相比表現出較高之多樣性。 圖6A~E係表示治療前PD-1抗體見效患者與未見效患者之間之TCRβ之多樣性指標之比較的圖。自抗PD-1抗體治療患者之治療前之CD8+
PD1+
細胞萃取RNA,實施大規模高效率TCR庫分析,算出其多樣性指數(TCRβ)。使用夏儂指數(A)、標準化夏儂指數(B)、辛普森指數(C)、逆辛普森指數(D)及DE50指數(E)之多樣性指數,於PD-1抗體見效患者(Responder,n=6)與未見效患者(Non-Responder,n=6)之間加以比較。其結果為於所有多樣性指數中,PD-1抗體治療見效患者與未見效患者相比表現出較高之多樣性。 圖7係對於使用實施例1中所使用之各患者之TCRα及TCRβ之多樣性指數之各者作為指標之情形時,使閾值進行各種變化時之感度及1-特異度進行繪圖而成之ROC曲線。上圖係使用TCRα之多樣性指數者,下圖係使用TCRβ之多樣性指數者。 圖8係表示與TCRα相關之各多樣性指數(夏儂指數、標準化夏儂指數、辛普森指數、逆辛普森指數、DE30指數、DE50指數、DE80指數、Unique30指數、Unique50指數及Unique80指數)之與讀段數對應之變化的圖。藉由自實施例1中所獲得之資料對各種讀段數進行隨機重採樣,算出與各讀段數對應之多樣性指數,針對各受驗者對100次隨機重採樣之中間值進行繪圖。各點係表示本說明書實施例1之各受驗體(n=12)。橫軸係重採樣讀段數(對數),縱軸係多樣性指數之值。關於DE指數,縱軸亦以對數軸表示。關於各個體,於各指數中使用相同之顏色而顯示。 圖9係表示與TCRβ相關之各多樣性指數(夏儂指數、標準化夏儂指數、辛普森指數、逆辛普森指數、DE30指數、DE50指數、DE80指數、Unique30指數、Unique50指數及Unique80指數)之與讀段數對應之變化的圖。藉由自實施例1中所獲得之資料對各種讀段數進行隨機重採樣,算出與各讀段數對應之多樣性指數,針對各受驗者對100次隨機重採樣之中間值進行繪圖。各點係表示本說明書實施例1之各受驗體(n=12)。橫軸係重採樣讀段數(對數),縱軸係多樣性指數之值。關於DE指數,縱軸亦以對數軸表示。關於各個體,於各指數中使用相同之顏色而顯示。 圖10A(A~D)係表示治療前PD-1抗體見效患者與未見效患者之間之TCRα之標準化為30000個讀段之多樣性指標之比較的圖。於治療抗PD-1抗體治療患者(n=12)之前,自患者全血單離末梢血液單核球細胞,藉由FACS分選儀區分CD8+
PD-1+
細胞。自CD8+
PD1+
細胞萃取RNA,實施大規模高效率TCR庫分析,算出其多樣性指數(TCRα)。使用夏儂指數(A)、標準化夏儂指數(B)、辛普森指數(C)、逆辛普森指數(D)、DE30指數(E)、DE50指數(F)、DE80指數(G)、Unique30指數(H)、Unique50指數(I)及Unique80指數(J)之多樣性指數,於PD-1抗體見效患者(Responder,n=6)與未見效患者(Non-Responder,n=6)之間加以比較。於標準化為30000個讀段之所有多樣性指數中,PD-1抗體治療見效患者與未見效患者相比表現出較高之多樣性。 圖10B(E~J)係表示治療前PD-1抗體見效患者與未見效患者之間之TCRα之標準化為30000個讀段之多樣性指標之比較的圖。於治療抗PD-1抗體治療患者(n=12)之前,自患者全血單離末梢血液單核球細胞,藉由FACS分選儀區分CD8+
PD-1+
細胞。自CD8+
PD1+
細胞萃取RNA,實施大規模高效率TCR庫分析,算出其多樣性指數(TCRα)。使用夏儂指數(A)、標準化夏儂指數(B)、辛普森指數(C)、逆辛普森指數(D)、DE30指數(E)、DE50指數(F)、DE80指數(G)、Unique30指數(H)、Unique50指數(I)及Unique80指數(J)之多樣性指數,於PD-1抗體見效患者(Responder,n=6)與未見效患者(Non-Responder,n=6)之間加以比較。於標準化為30000個讀段之所有多樣性指數中,PD-1抗體治療見效患者與未見效患者相比表現出較高之多樣性。 圖11A(A~D)係表示治療前PD-1抗體見效患者與未見效患者之間之TCRβ之標準化為30000個讀段之多樣性指標之比較的圖。於治療抗PD-1抗體治療患者(n=12)之前,自患者全血單離末梢血液單核球細胞,藉由FACS分選儀區分CD8+
PD-1+
細胞。自CD8+
PD1+
細胞萃取RNA,實施大規模高效率TCR庫分析,算出其多樣性指數(TCRα)。使用夏儂指數(A)、標準化夏儂指數(B)、辛普森指數(C)、逆辛普森指數(D)、DE30指數(E)、DE50指數(F)、DE80指數(G)、Unique30指數(H)、Unique50指數(I)及Unique80指數(J)之多樣性指數,於PD-1抗體見效患者(Responder,n=6)與未見效患者(Non-Responder,n=6)之間加以比較。於標準化為30000個讀段之所有多樣性指數中,PD-1抗體治療見效患者與未見效患者相比表現出較高之多樣性。 圖11B(E~J)係表示治療前PD-1抗體見效患者與未見效患者之間之TCRβ之標準化為30000個讀段之多樣性指標之比較的圖。於治療抗PD-1抗體治療患者(n=12)之前,自患者全血單離末梢血液單核球細胞,藉由FACS分選儀區分CD8+
PD-1+
細胞。自CD8+
PD1+
細胞萃取RNA,實施大規模高效率TCR庫分析,算出其多樣性指數(TCRα)。使用夏儂指數(A)、標準化夏儂指數(B)、辛普森指數(C)、逆辛普森指數(D)、DE30指數(E)、DE50指數(F)、DE80指數(G)、Unique30指數(H)、Unique50指數(I)及Unique80指數(J)之多樣性指數,於PD-1抗體見效患者(Responder,n=6)與未見效患者(Non-Responder,n=6)之間加以比較。於標準化為30000個讀段之所有多樣性指數中,PD-1抗體治療見效患者與未見效患者相比表現出較高之多樣性。 圖12係表示與TCRα相關之各多樣性指數(夏儂指數、標準化夏儂指數、辛普森指數、逆辛普森指數、DE30指數、DE50指數、DE80指數、Unique30指數、Unique50指數及Unique80指數)之基於ROC分析之閾值之與讀段數對應之變化的圖。橫軸表示重採樣讀段數(對數軸),縱軸表示各指數之值。DE指數之閾值係縱軸亦以對數軸表示。瞭解到DE指數之閾值係於雙對數軸上與讀段數具有線性關係。 圖13係表示與TCRβ相關之各多樣性指數(夏儂指數、標準化夏儂指數、辛普森指數、逆辛普森指數、DE30指數、DE50指數、DE80指數、Unique30指數、Unique50指數及Unique80指數)之基於ROC分析之閾值之與讀段數對應之變化的圖。橫軸表示重採樣讀段數(對數軸),縱軸表示各指數之值。DE指數之閾值係縱軸亦以對數軸表示。瞭解到DE指數之閾值係於雙對數軸上與讀段數具有線性關係。 圖14係表示TCRα及TCRβ之DE50指數之閾值之由讀段數所引起之變化之藉由雙對數軸中之線性回歸所獲得之推定值的圖。 圖15係表示T細胞成分之讀段數之相關分析之圖。X軸表示CD8+
PD-1+
成分中之各TCRβ選殖之讀段數,Y軸表示各細胞成分(CD8+
4-1BB+
、CD8+
TIM3+
、CD8+
OX40+
、CD8+
TIGIT+
、CD8+
CTLA4+
)中之讀段數。點表示各TCRβ選殖。R表示Pearson之相關係數。 圖16係表示算出自治療見效患者之PBMC藉由FACS分選所分離之CD8+
PD-1+
、CD8+
4-1BB+
、CD8+
TIM3+
、CD8+
OX40+
、CD8+
TIGIT+
及CD8+
CTLA4+
成分中之TCRα鏈之夏儂指數、標準化夏儂指數、逆辛普森指數、%DE50指數的值(中央)。亦表示治療見效患者(n=6,左)及未見效患者(n=6,右)之CD8+
PD-1+
中之多樣性指數。治療見效患者之CD8+
PD-1+
細胞與未見效患者相比顯著高,同時CD8+
4-1BB+
、CD8+
TIM3+
、CD8+
OX40+
、CD8+
TIGIT+
及CD8+
CTLA4+
成分表現出與CD8+
PD-1+
細胞相同程度之多樣度。 圖17係表示算出自治療見效患者之PBMC藉由FACS分選所分離之CD8+
PD-1+
、CD8+
4-1BB+
、CD8+
TIM3+
、CD8+
OX40+
、CD8+
TIGIT+
及CD8+
CTLA4+
成分中之TCRβ鏈之夏儂指數、標準化夏儂指數、逆辛普森指數、%DE50指數的值(中央)。亦表示治療見效患者(n=6,左)及未見效患者(n=6,右)之CD8+
PD-1+
中之多樣性指數。各T細胞成分係與TCRα鏈同樣地表現出與CD8+
PD-1+
細胞相同程度之多樣度。
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<211> 35
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<213> 人工序列
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<223> BSL-18E_引子
<220>
<221> 未歸類特性
<222> (35)..(35)
<223> n為a、c、g、t或u
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P10EA_引子
Claims (35)
- 一種受驗體對癌症免疫療法之應答性之預測方法,其係使用受驗體之T細胞之T細胞受體(TCR)多樣性作為該受驗體對癌症免疫療法之應答性之指標,上述癌症免疫療法包括投予免疫檢查點抑制劑,上述T細胞為:(a)CD8+PD-1+T細胞;或(b)CD8+T細胞,且選自由PD-1、CD134(OX40)、CD278(ICOS)、CD27、CD152(CTLA-4)、CD366(TIM-3)、CD223(LAG-3)、CD272(BTLA)、CD226(DNAM-1)及TIGIT所組成之群中之1個以上之細胞表面標記為陽性。
- 如請求項1之方法,其中上述T細胞為選自由CD28、CD154(CD40L)、CD137(4-1BB)及CD367(GITR)所組成之群中之1個以上之細胞表面標記為陽性。
- 如請求項1之方法,其中上述T細胞為CD8+PD-1+T細胞。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中上述T細胞為上述受驗體之末梢血液中之T細胞。
- 如請求項1之方法,其中上述免疫檢查點抑制劑為PD-1抑制劑。
- 如請求項5之方法,其中上述PD-1抑制劑為納武單抗或派姆單抗。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中上述TCR多樣性係以夏儂指數、辛普森指數、逆辛普森指數、標準化夏儂指數、Unique50指數、DE30指數、DE80指數或DE50指數表示。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中上述TCR多樣性係以DE50指數表示。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中上述TCR為TCRα。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中上述TCR為TCRβ。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其進而包括如下步驟:自該受驗體之末梢血液樣本單離CD8+PD-1+T細胞;及確定該CD8+PD-1+T細胞之TCR多樣性。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中上述TCR多樣性係藉由包括大規模高效率TCR庫分析之方法而確定。
- 一種包含免疫檢查點抑制劑之組合物,其係用以對於T細胞之TCR多樣性高之受驗體治療癌症,上述T細胞之高TCR多樣性係藉由表示上述受驗體之TCR多樣性之多樣性指數為閾值以上而確定,上述T細胞為:(a)CD8+PD-1+T細胞;或(b)CD8+T細胞,且選自由PD-1、CD134(OX40)、CD278(ICOS)、CD27、CD152(CTLA-4)、CD366(TIM-3)、CD223(LAG-3)、CD272(BTLA)、CD226(DNAM-1)及TIGIT所組成之群中之1個以上之細胞表面標記為陽性。
- 如請求項15之組合物,其中上述T細胞為選自由CD28、 CD154(CD40L)、CD137(4-1BB)及CD367(GITR)所組成之群中之1個以上之細胞表面標記為陽性。
- 如請求項15之組合物,其中上述T細胞為CD8+PD-1+T細胞。
- 如請求項15至17中任一項之組合物,其中上述T細胞為上述受驗體之末梢血液中之T細胞。
- 如請求項15至17中任一項之組合物,其中上述免疫檢查點抑制劑為PD-1抑制劑。
- 如請求項19之組合物,其中上述PD-1抑制劑為納武單抗或派姆單抗。
- 如請求項15至17中任一項之組合物,其中上述受驗體之T細胞之TCR多樣性係以夏儂指數、辛普森指數、逆辛普森指數、標準化夏儂指數、Unique50指數、DE30指數、DE80指數或DE50指數表示。
- 如請求項15至17中任一項之組合物,其中上述受驗體之T細胞之TCR多樣性係以DE50指數表示。
- 如請求項15至17中任一項之組合物,其中上述TCR為TCRα。
- 如請求項15至17中任一項之組合物,其中上述TCR為TCRβ。
- 如請求項15至17中任一項之組合物,其中上述受驗體之TCR多樣性係藉由包括大規模高效率TCR庫分析之方法而確定。
- 一種診斷受驗體對癌症免疫療法之應答性之方法,其包括如下步驟:於活體外測定該受驗體之T細胞之TCR多樣性;及於該TCR多樣性高之情形時,判定該受驗體對癌症免疫療法應答性良好,或者於該TCR多樣性低之情形時,判定該受驗體對癌症免疫療法應答性差; 上述T細胞之高TCR多樣性係藉由表示上述受驗體之TCR多樣性之多樣性指數為閾值以上而確定,上述T細胞之低TCR多樣性係藉由表示上述受驗體之TCR多樣性之多樣性指數為未達閾值而確定,上述T細胞為:(a)CD8+PD-1+T細胞;或(b)CD8+T細胞,且選自由PD-1、CD134(OX40)、CD278(ICOS)、CD27、CD152(CTLA-4)、CD366(TIM-3)、CD223(LAG-3)、CD272(BTLA)、CD226(DNAM-1)及TIGIT所組成之群中之1個以上之細胞表面標記為陽性。
- 一種診斷受驗體對癌症免疫療法之應答性之方法,其包括如下步驟:自該受驗體獲得末梢血液樣本;藉由包括大規模高效率TCR庫分析之方法而測定該受驗體之末梢血液中之T細胞之TCR多樣性;及於該TCR多樣性高之情形時,判定該受驗體對癌症免疫療法應答性良好,或者於該TCR多樣性低之情形時,判定該受驗體對癌症免疫療法應答性差;上述T細胞之高TCR多樣性係藉由表示上述受驗體之TCR多樣性之多樣性指數為閾值以上而確定,上述T細胞之低TCR多樣性係藉由表示上述受驗體之TCR多樣性之多樣性指數為未達閾值而確定, 上述T細胞為:(a)CD8+PD-1+T細胞;或(b)CD8+T細胞,且選自由PD-1、CD134(OX40)、CD278(ICOS)、CD27、CD152(CTLA-4)、CD366(TIM-3)、CD223(LAG-3)、CD272(BTLA)、CD226(DNAM-1)及TIGIT所組成之群中之1個以上之細胞表面標記為陽性。
- 一種診斷受驗體對癌症免疫療法之應答性之方法,上述癌症免疫療法係用於治療該受驗體之癌症,其包括如下步驟:自該受驗體獲得末梢血液樣本;測定該受驗體之末梢血液中之T細胞之TCR多樣性;及於該TCR多樣性高於基準值之情形時,對該受驗體實施癌症免疫療法;上述T細胞為:(a)CD8+PD-1+T細胞;或(b)CD8+T細胞,且選自由PD-1、CD134(OX40)、CD278(ICOS)、CD27、CD152(CTLA-4)、CD366(TIM-3)、CD223(LAG-3)、CD272(BTLA)、CD226(DNAM-1)及TIGIT所組成之群中之1個以上之細胞表面標記為陽性。
- 一種受驗體對癌症免疫療法之應答性之預測方法,其係使用藉由包括對受驗體之T細胞進行大規模高效率庫分析之方法所確定之庫之多樣性作為受驗體對治療之應答性之指標, 上述癌症免疫療法包括投予免疫檢查點抑制劑,上述T細胞為:(a)CD8+PD-1+T細胞;或(b)CD8+T細胞,且選自由PD-1、CD134(OX40)、CD278(ICOS)、CD27、CD152(CTLA-4)、CD366(TIM-3)、CD223(LAG-3)、CD272(BTLA)、CD226(DNAM-1)及TIGIT所組成之群中之1個以上之細胞表面標記為陽性。
- 如請求項31之方法,其中上述治療係與免疫反應相關之治療。
- 如請求項31或32之方法,其中上述庫分析為TCR庫分析。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中表示上述受驗體之TCR多樣性之多樣性指數為閾值以上係該受驗體為見效患者之指標,或者該多樣性指數未達閾值係該受驗體為未見效患者之指標,並且該閾值係基於ROC分析而確定,或者基於感度而確定,或者基於特異度而確定。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中表示上述受驗體之TCR多樣性之多樣性指數為閾值以上係該受驗體為見效患者之指標,或者該多樣性指數未達閾值係該受驗體為未見效患者之指標,並且該閾值係對該受驗體之多樣性指數之算出中所使用之讀段數進行標準化而獲得者。
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