TWI778996B - 具有品質控制追蹤劑的陣列 - Google Patents

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Abstract

一種陣列包括有包括複數個離散孔之載體、安置於該複數個離散孔各者中之凝膠物質及接枝於該複數個離散孔各者中之該凝膠物質的品質控制追蹤劑。該品質控制追蹤劑包含(a)包含裂解位點之可裂解核苷酸序列，及(b)可偵測標籤；且在一些態樣中，為具有可偵測標籤及非反應性核苷酸序列或引子核苷酸序列之可裂解核苷酸序列。

Description

具有品質控制追蹤劑的陣列
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2016年12月22日申請之美國臨時申請案第62/438,284號之權益，其內容以全文引用的方式併入本文中。
序列表之參考
經由EFS-Web與此一起提交之序列表以全文引用的方式併入本文中。文件名稱為ILI104B_IP-1477-US_Sequence_Listing_ST25.txt，文件之大小為7,476位元組，且文件之創建日期為2017年12月20日。
本發明係關於具有品質控制追蹤劑的陣列。
生物陣列包括於用於偵測、分析及/或定序分子，包括去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid；DNA)及核糖核酸(ribonucleic acid；RNA)之各種工具中。在此等申請案中，陣列經工程改造以包括核酸序列，該等核酸序列適用作定序或擴增引子或適用作用於人類及其他生物體中之基因中所存在之核苷酸序列之探針。除此等應用以外，生物陣列可用於偵測及評估各種分子、分子家族、基因表現量、單核苷酸多形現象及基因分型。
一般而言，基因定序涉及測定一定長度之遺傳物質中的核苷酸或核酸，諸如DNA或RNA之片段的序列。正在分析的鹼基對序列愈來愈長，且 所得序列資訊可用於多種生物資訊方法中以在邏輯上將片段裝配在一起以便可靠地測定出衍生出該等片段的遺傳物質之延伸長度之序列。已研發出自動化的基於計算機之特性片段之檢查，且其已用於基因組繪圖、基因及其功能之鑑別、一些病狀及疾病病況之風險評估等。在某些應用中，使例如經修飾目標核酸與陣列表面上之定序或擴增引子雜交，擴增，且測定其基因序列。
在其他實例中，個別DNA及RNA探針可在陣列載體上之幾何柵格中(或隨機)之小位置連接。例如來自已知個人或生物體之測試樣品可暴露於柵格，以使得互補片段在陣列中之個別位點與探針雜交。接著可藉由在該等位點上掃描特定頻率之光來檢查陣列，從而利用片段雜交所處之位點的螢光鑑別出何種片段存在於樣品中。
核酸官能化陣列之適當功能及再現性視與其結合之核酸序列之一致顯示而定。本申請案針對品質控制組成物、陣列及保證核酸序列一致沈積於陣列表面上且在任何陣列之後續製造及儲存之後保持序列之方法。
在某些態樣中，本發明針對一種陣列，其包括包含該複數個離散孔各者之載體、安置於該複數個離散孔各者中之凝膠物質及接枝於該複數個離散孔各者中之該凝膠物質之品質控制追蹤劑。在一些具體實例中，接枝於凝膠物質之品質控制追蹤劑包含(a)包含裂解位點之可裂解核苷酸序列及(b)可偵測標籤。在一些具體實例中，品質控制追蹤劑在追蹤劑之第一末端接枝於凝膠物質。在一些具體實例中，可裂解核苷酸序列包含具有第一末端及第二末端之接枝區，其中第一末端接枝於凝膠物質且第二末端連接至可裂解區，該可裂解區連接至可偵測標籤且包含裂解位點。在一些具體實例中，可裂解核苷酸序列包含非反應性核苷酸序列，且在一些情況下，接枝區包含非反應性核苷酸 序列。在其他具體實例中，可裂解核苷酸序列包含引子核苷酸序列，且在一些情況下，接枝區包含引子核苷酸序列。
在一些具體實例中，可偵測標籤在裂解位點連接至品質控制追蹤劑或可裂解核苷酸序列。在其他具體實例中，可偵測標籤在遠離裂解位點及接枝第一末端之位置連接至品質控制追蹤劑或可裂解核苷酸序列(例如載體-追蹤劑之接枝第一末端-追蹤劑之裂解位點-追蹤劑上之可偵測標籤)，且在其他具體實例中，該位置在可裂解核苷酸序列之3'端。在一些具體實例中，可偵測標籤在或接近可裂解核苷酸序列之3'端連接。在一些具體實例中，可裂解核苷酸序列在其5'端接枝於凝膠物質。在一些具體實例中，可偵測標籤可藉由品質控制追蹤劑與核酸外切酶之反應而裂解。在其他具體實例中，可偵測標籤可藉由品質控制追蹤劑與醣苷酶及核酸內切酶之反應而裂解。
在一些具體實例中，裂解位點為可裂解核鹼基。在一些具體實例中，可裂解核鹼基為酵素性可裂解核鹼基。在一些具體實例中，酵素性可裂解核鹼基包含切除位點。在一些具體實例中，可裂解核鹼基容易藉由與醣苷酶及核酸內切酶或與核酸外切酶反應而發生裂解。在一些具體實例中，裂解位點包含化學可裂解連接子。在一些具體實例中，化學可裂解連接子包含鄰二醇、雙硫鍵、矽烷、偶氮苯、可光裂解基團或疊氮基。
在一些具體實例中，可偵測標籤為螢光標籤。
在一些具體實例中，品質控制追蹤劑包含(a)在3'端用螢光標籤標記之可裂解核苷酸序列，或(b)包含連接有螢光標籤之可裂解核鹼基之非反應性核苷酸序列。在一些態樣中，可裂解核苷酸序列包含引子核苷酸序列。在一些態樣中，具有品質控制追蹤劑之陣列進一步包含接枝於複數個離散孔各者中之凝膠物質之未標記引子，其中該引子包含引子核苷酸序列。預期此類陣列用於本文所述方法中之任一者中。
在一些具體實例中，品質控制追蹤劑不包含引子核苷酸序列，且陣列進一步包含個別未標記引子，該個別未標記引子包含接枝於複數個離散孔各者中之凝膠物質的引子核苷酸序列。在一些具體實例中，品質控制追蹤劑及未標記引子(且因此為引子核苷酸序列)以預先決定的比率存在於凝膠物質上。
本申請案針對一種測定接枝引子核苷酸序列之密度及/或分布之方法，其包含：提供包含複數個離散孔之載體，及安置於複數個離散孔各者中之凝膠物質，及品質控制追蹤劑及接枝於複數個離散孔各者中之凝膠物質的引子核苷酸序列；其中品質控制追蹤劑包含(a)包含裂解位點之可裂解核苷酸序列及(b)可偵測標籤；及偵測來自可偵測標籤之訊號；至少部分地基於來自可偵測標籤之訊號，測定品質控制追蹤劑之密度及/或分布；及至少部分地基於品質控制追蹤劑之測定之密度及/或分布，測定接枝引子核苷酸序列之密度及/或分布。在一些具體實例中，該方法進一步包含將品質控制追蹤劑接枝於凝膠物質。在一些態樣中，品質控制追蹤劑包含引子核苷酸序列。在其他態樣中，品質控制追蹤劑包含非反應性核苷酸序列(且無引子核苷酸序列)，且在品質控制追蹤劑接枝之前或同時及在偵測步驟之前，將引子核苷酸序列接枝於凝膠物質。在其他具體實例中，品質控制追蹤劑包含引子核苷酸序列，以使得品質控制追蹤劑之接枝用以將追蹤劑與引子核苷酸序列接枝於凝膠物質。在一些具體實例中，預先決定的比率之品質控制追蹤劑及引子核苷酸序列接枝於凝膠物質，且測定引子核苷酸序列之密度及/或分布基於偵測訊號及預先決定的比率。在一些具體實例中，該方法進一步包含藉由在裂解位點之裂解反應自品質控制追蹤劑移除可偵測標籤。在一些情況下，移除藉由酵素性裂解或化學裂解實現。在一些情況下，移除藉由在裂解位點與醣苷酶及核酸內切酶或與核酸外切酶反應而實現。在其他情況下，移除藉由將可裂解核苷酸序列連接至可偵測標 籤之連接子分子之化學反應而實現。
在本文所揭示方法之一實施例中，品質控制追蹤劑接枝於載體上之孔中之凝膠物質。品質控制追蹤劑例如使用螢光來偵測，其中可偵測標籤為螢光標籤，且至少部分地基於偵測訊號或螢光，測定接枝於凝膠物質之引子核苷酸序列之密度、或分布、或密度及分布。在一些態樣中，該方法包含將品質控制追蹤劑接枝於載體上之孔中之凝膠物質，使用螢光偵測品質控制追蹤劑，至少部分地基於螢光，測定接枝於凝膠物質之引子核苷酸序列之密度、或分布、或密度及分布。在一些態樣中，該方法進一步包含在裂解位點自品質控制追蹤劑裂解可偵測標籤。
在另一態樣中，本發明針對一種將品質控制追蹤劑及引子核苷酸序列共接枝於陣列之方法，其包含：將品質控制追蹤劑及引子核苷酸序列以預先決定的比率組合以形成接枝混合物；使接枝混合物暴露於載體上之孔中的凝膠物質；及培育接枝混合物及凝膠物質，從而將品質控制追蹤劑及引子核苷酸序列共接枝於凝膠物質。在一些態樣中，品質控制追蹤劑為在3'端用螢光標籤標記之可裂解核苷酸序列或螢光標籤連接至可裂解核鹼基之非反應性核苷酸序列。在一些態樣中，該方法進一步包含藉由偵測來自可偵測標籤之訊號來偵測接枝品質控制追蹤劑；及至少部分地基於偵測訊號及預先決定的比率，測定接枝於凝膠物質之引子核苷酸序列之密度、或分布、或密度及分布。在一些態樣中，接枝品質控制追蹤劑使用螢光偵測，且至少部分地基於螢光及預先決定的比率，測定接枝於凝膠物質之引子核苷酸序列之密度、或分布、或密度及分布。在其他態樣中，接著如本文所述將包含共接枝凝膠物質之載體用於測定接枝引子核苷酸序列之密度及/或分布之方法中。在其他態樣中，該方法進一步包含如本文所述經由酵素性裂解或化學裂解在裂解位點自可裂解核苷酸序列移除可偵測標籤。
在另一態樣中，本發明針對一種將品質控制追蹤劑接枝於陣列之方法，其包含將品質控制追蹤劑接枝於載體上之孔中的凝膠物質，其中品質控制追蹤劑包含有包含裂解位點之可裂解核苷酸序列及可偵測標籤，其中可裂解核苷酸序列包含具有第一末端及第二末端之接枝區，其中第一末端接枝於凝膠物質且第二末端連接至可裂解區，該可裂解區連接至可偵測標籤且包含裂解位點。在一些態樣中，品質控制追蹤劑在接枝區中，亦即在品質控制追蹤劑接枝區之接枝第一末端與裂解位點之間包含引子核苷酸序列。藉由此排列，裂解位點之裂解使未標記引子序列接枝於凝膠物質。在一些態樣中，根據本文所述之裂解方法，該方法進一步包含在裂解位點裂解品質控制追蹤劑，從而提供缺乏接枝於凝膠物質之可偵測標籤的引子序列。
在另一態樣中，本發明針對一種接枝混合物，其包含有包含引子核苷酸序列之引子及品質控制追蹤劑，其中引子及品質控制追蹤劑以預先決定的比率存在於混合物中。
10:陣列
12:基材/載體
14:線/流動通道
16:位點
16':孔
18:間隙區域
20:引子核苷酸序列
20':引子核苷酸序列
22:品質控制追蹤劑
22A:品質控制追蹤劑
22B:品質控制追蹤劑
22C:品質控制追蹤劑
22D:品質控制追蹤劑
22E:品質控制追蹤劑
24:凝膠物質
24':凝膠襯墊
26:孔口
27:可裂解核苷酸序列
27':可裂解核苷酸序列
28:螢光標記
29:殘餘部分
29':殘餘部分
29":殘餘部分
30:切除位點
31:可裂解部分
31':可裂解部分
31":可裂解部分
32:非反應性核苷酸序列
32':非反應性核苷酸序列
34A:連接子分子
34B:連接子分子
34C:連接子分子
34D:連接子分子
34E:連接子分子
34F:連接子分子
50:方法
52:將品質控制追蹤劑接枝於載體上孔中之凝膠物質
54:使用螢光偵測品質控制追蹤劑
56:至少部分地基於螢光，測定接枝於凝膠物質之引子核苷酸序列之密度、或分布、或密度及分布
參考以下實施方式及附圖，本發明之實例之特徵及優點將變得顯而易見，在以下實施方式及附圖中，類似的元件符號對應於類似但或許不相同的組件。出於簡潔起見，具有先前所描述功能之元件符號或特徵可以或不可結合出現該等元件符號或特徵之其他附圖來描述。
圖1為根據本發明之實施例陣列之圖解圖像，說明陣列之總體配置設計且詳述個別位點之排列；圖2A至圖2D為橫截面視圖，其一起說明形成陣列之方法的實施例；圖3A至圖3D為本文所揭示之品質控制追蹤劑之不同實施例的示 意性說明；圖4描述包括連接子分子之品質控制追蹤劑之若干實施例，及可用於裂解連接子分子之化學物質之實施例；圖5為描繪品質控制方法之實施例之流程圖；圖6A及圖6B分別為接枝有引子且雜交了互補含染料寡核苷酸(TET QC)之對照流量槽之螢光影像及接枝有本文所揭示之品質控制追蹤劑之一實施例的流量槽之螢光影像；圖6C為描繪圖6A及圖6B之接枝表面之品質控制追蹤劑螢光相對於TET螢光的曲線；圖7A及圖7B分別說明接枝有本文所揭示之品質控制追蹤劑之一實施例的流量槽之初始螢光影像(在團簇產生之前)及成簇後螢光影像(在團簇產生之後)；圖8A及圖8B展示圖7A及圖7B之接枝流量槽之接枝後品質控制追蹤劑螢光之曲線及成簇後品質控制追蹤劑螢光之曲線；圖9A及圖9B分別展示使用圖7A及圖7B接枝流量槽在一個定序週期(C1)之後紅色通道之讀取1(R1)螢光強度之曲線及讀取2(R2)螢光強度之曲線；圖10A及圖10B分別展示使用圖7A及圖7B之接枝流量槽在一個定序週期(C1)之後綠色通道之讀取1(R1)螢光強度之曲線及讀取2(R2)螢光強度之曲線；圖11A及圖11B分別展示圖7A及圖7B之接枝流量槽之參考基因組的讀取1(R1)序列比對之曲線及讀取2(R2)序列比對之曲線；及圖12A及圖12B分別展示圖7A及圖7B之接枝流量槽之讀取1(R1)定序錯誤率之曲線及讀取2(R2)定序錯誤率之曲線。
應瞭解，除非另外規定，否則本文所用之術語將採用其在相關領域中之普通含義。本文所用之若干術語及其含義闡述於下文中。
除非上下文另有明確規定，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。
如本文所用，「烷基(alkyl)」係指完全飽和(亦即不含雙鍵或參鍵)之直鏈或分支鏈烴鏈。烷基可具有1至20個碳原子。烷基實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第三丁基、戊基、己基及其類似基團。舉例而言，名稱「C1-4烷基(C1-4 alkyl)」指示在烷基鏈中存在一至四個碳原子，亦即烷基鏈選自由以下組成之群：甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基及第三丁基。
烷基可經鹵基或鹵素取代，該鹵基或鹵素意謂元素週期表之第7欄之放射穩定原子中之任一者，例如氟、氯、溴或碘。此基團稱為「烷基鹵化物(alkyl halide)」。
如本文所用，「烯基(alkenyl)」或「烯烴(alkene)」係指含有一或多個雙鍵之直鏈或分支鏈烴鏈。烯基可具有2至20個碳原子。烯基實例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基及其類似基團。烯基可表示為例如「C2-4烯基(C2-4 alkenyl)」，其指示烯基鏈中存在兩至四個碳原子。
如本文所用，「炔基(alkynyl)」或「炔烴(alkyne)」係指含有一或多個參鍵之直鏈或分支鏈烴鏈。炔烴可具有2至20個碳原子。炔烴基團可命名為例如「C2-4炔基」，其指示在炔烴鏈中存在兩至四個碳原子。
「醯胺基(amido)」官能基係指
Figure 106145312-A0305-02-0010-2
，其中R為可連接至螢 光標籤之任何基團，R'為H，且R"為可連接至核苷酸序列之任何基團。
「胺基(amino)」官能基係指-NRaRb基團，其中Ra及Rb各自獨立地選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳環、C6-10芳基、5至10員雜芳基及5至10員雜環基，如本文所定義。
如本文所用，「芳基(aryl)」係指在環主鏈中僅含有碳之芳族環或環系統(亦即兩個或更多個共用兩個相鄰碳原子之稠合環)。當芳基為環系統時，該系統中之各環為芳族環。芳基可具有6至18個碳原子，其可表示為C6-18。芳基之實例包括苯基、萘基、薁基(azulenyl)及蒽基。
「疊氮(azide)」或「疊氮基(azido)」官能基係指-N3。
如本文所用，術語「連接(attached)」係指兩個事物彼此接合、緊固、黏著、相連或結合之狀態。舉例而言，核酸可藉由共價或非共價鍵連接至物質，諸如凝膠物質。共價鍵之特徵在於原子之間共用電子對。非共價鍵為不涉及電子對共用之化學鍵，且可包括例如氫鍵、離子鍵、凡得瓦力(van der Waals force)、親水相互作用及疏水相互作用。
如本文所用，「碳環基(carbocyclyl)」意謂在環主鏈中含有碳原子之環或環系統。當碳環基為環系統時，兩個或更多個環可以稠合、橋連或螺連接方式接合在一起。碳環基可具有任何飽和度，其限制條件為環系統中之至少一個環不為芳族環。因此，碳環基包括環烷基、環烯基及環炔基。碳環基可具有3至20個碳原子(亦即C3-20)。
如本文所用，「環烯基(cycloalkenyl)」或「環烯(cycloalkene)」意謂具有至少一個雙鍵之碳環基環或環系統，其中環系統中並無環為芳族環。實例包括環己烯基或環己烯及降冰片烯或降冰片烷基 (
Figure 106145312-A0305-02-0011-4
)。亦如本文所用，「雜環烯基(heterocycloalkenyl)」或「雜環烯 (heterocycloalkene)」意謂在環主鏈中具有至少一個雜原子之碳環基環或環系統，其具有至少一個雙鍵，其中環系統中並無環為芳族環。
如本文所用，「環炔基(cycloalkynyl)」或「環炔(cycloalkyne)」意謂具有至少一個參鍵之碳環基環或環系統，其中環系統中 並無環為芳族環。實例為環辛炔(
Figure 106145312-A0305-02-0012-10
)。另一實例為雙環壬炔(亦即 雙環環系統，諸如
Figure 106145312-A0305-02-0012-9
)。亦如本文所用，「雜環炔基 (heterocycloalkynyl)」或「雜環炔(heterocycloalkyne)」意謂在環主鏈中具有至少一個雜原子之碳環基環或環系統，其具有至少一個參鍵，其中環系統中並無環為芳族環。
如本文所用，術語「化學裂解(chemical cleavage)」係指自載體移除品質控制追蹤劑或其一部分之化學反應。
如本文所用，術語「可裂解核苷酸序列」係指可在切除位點或在連接子分子斷裂之單股核酸序列。
當提及條項之集合使用時，術語「各(each)」意欲鑑別該集合中之單獨條項，但未必指代該集合中之每一條項。若揭示內容或上下文另外明確規定，則可存在例外狀況。
如本文所用，術語「酵素性裂解(enzymatic cleavage)」係指一種利用核酸內切酶或核酸外切酶自載體移除品質控制追蹤劑或其一部分之方法。
如本文所用，術語「切除位點(excision site)」係指由酶靶向之核苷酸或核苷酸之鹼基(亦即核鹼基)。品質控制追蹤劑或其一部分可在切除位點裂解。此類裂解可涉及單一酵素性步驟或多個酵素性步驟(例如鹼基修飾、或切除繼之以裂解)。
如本文所用，術語「螢光標籤」係指以化學方式連接至核苷酸序列之螢光團。螢光標籤可連接至核苷酸序列之3'末端、非反應性核苷酸序列之可裂解核鹼基、或連接核苷酸序列之連接子分子。
如本文所用，術語「凝膠物質」意欲意謂可透過液體及氣體之半剛性物質。通常，凝膠物質為當吸收液體時可膨脹且當藉由乾燥移除液體時可收縮之水凝膠。
如本文所用，術語「接枝(grafted)」意欲意謂共價鍵結且並非僅經由非共價相互作用連接，諸如雜交。在一些情況下，品質控制追蹤劑、可裂解核苷酸序列、非反應性核苷酸序列及/或引子或引子核苷酸序列藉由在追蹤劑或序列上之官能基與凝膠物質中之官能基之間形成共價鍵而接枝於凝膠物質。如本文所用，術語「共接枝(co-graft)」係指接枝超過一種實體。
如本文所用，「雜芳基(heteroaryl)」係指在環主鏈中含有一或多個雜原子之芳族環或環系統(亦即兩個或更多個共用兩個相鄰原子之稠合環)，該雜原子為除碳外之元素，包括(但不限於)氮、氧及硫。當雜芳基為環系統時，該系統中之各環為芳族環。雜芳基可具有5至18個環成員。
如本文所用，「雜環基(heterocyclyl)」意謂在環主鏈中含有至少一個雜原子之非芳族環或環系統。雜環基可以稠合、橋連或螺連接方式接合在一起。雜環基可具有任何飽和度，其限制條件為環系統中之至少一個環不為芳族環。在環系統中，雜原子可存在於非芳環或芳環中。雜環基可具有3至20個環成員(亦即構成環主鏈之原子的數目，包括碳原子及雜原子)。雜環基可表示為「3至6員雜環基」或類似名稱。在一些實例中，雜原子為O、N或S。
如本文所用，術語「肼(hydrazine)」或「肼基(hydrazinyl)」係指-NHNH2基團。
如本文所用，術語「腙(hydrazone)」或「腙基(hydrazonyl)」係指基團Ra(Rb)C=N-NH2，其中Ra及Rb為本文先前所定義。
如本文所用，「羥基(hydroxyl)」為-OH基團。
如本文所用，術語「間隙區域(interstitial region)」係指基材/ 載體中或表面上與基材或表面之其他區域隔開的區域。舉例而言，間隙區域可將陣列之一個特徵與陣列之另一特徵隔開。彼此隔開之兩個特徵可為離散的，亦即彼此不接觸。在另一實施例中，間隙區域可將特徵之第一部分與特徵之第二部分隔開。在許多實施例中，間隙區域為連續的，然而特徵為離散的，例如如同原本連續的表面中所界定之複數個孔之情況一般。由間隙區域提供之分隔可為部分隔開或完全隔開。間隙區域可具有不同於表面上界定之特徵之表面材料的表面材料。舉例而言，陣列之特徵可具有一定量或濃度之凝膠物質及品質控制追蹤劑，該量或濃度超過間隙區域中所存在之量或濃度。在一些實施例中，凝膠物質及品質控制追蹤劑可不存在於間隙區域。
如本文所用，術語「連接子分子(linker molecule)」係指在一個末端包括可連接至可偵測或螢光標籤之官能基且在另一末端包括可連接至核苷酸序列之官能基的分子。連接點為共價鍵。類似地，如本文所用，術語「連接(linked)」係指兩個實體經由一或多個共價鍵直接或經由連接子分子連接。
如本文所用，「氧化腈(nitrile oxide)」意謂「RaC=N+O-」基團，其中Ra選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳環基、C6-10芳基、5至10員雜芳基及5至10員雜環基。製備氧化腈之實例包括藉由用chloramide-T處理或經由基於亞胺醯氯[RC(Cl)=NOH]之作用由醛肟原位生成。
如本文所用，「硝酮(nitrone)」意謂「RaRbC=NRc+O-」基團，其中Ra及Rb為本文先前所定義且Rc選自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳環基、C6-10芳基、5至10員雜芳基及5至10員雜環基，如本文中所定義。
如本文所用，「核苷酸」包括含氮雜環鹼基、糖及一或多種磷酸酯基。核苷酸為核酸序列之單體單元。在RNA中，糖為核糖，且在DNA中， 為去氧核糖，亦即不具有存在於核糖中之2'位處之羥基的糖。含氮雜環鹼基(亦即核鹼基)可為嘌呤鹼基或嘧啶鹼基。嘌呤鹼基包括腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)及其經修飾之衍生物或類似物。嘧啶鹼基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)及其經修飾之衍生物或類似物。去氧核糖之C-1原子鍵結至嘧啶之N-1或嘌呤之N-9。
本文所提及之「非反應性核苷酸序列(non-reactive nucleotide sequence)」可為並未主動參與所進行之特定DNA或RNA合成之任何核酸序列。在一些實施例中，非反應性核苷酸序列可構成品質控制追蹤劑之一部分。舉例而言，非反應性核苷酸序列可為作為可裂解核苷酸序列之一部分的聚T序列或聚A序列，該可裂解核苷酸序列亦包括切除位點。對於另一實施例，非反應性核苷酸序列可與所用/正使用之引子核苷酸序列正交，且因此非反應性核苷酸序列將不參與利用引子核苷酸序列之DNA或RNA合成。
如本文所用，「預先決定的比率」係指混合物中兩種化合物之間的比率。在製備混合物之前測定該比率。該比率為混合物中組分之濃度或莫耳濃度之比率，或為摻合以製造混合物之兩種組分溶液之體積之比率。在一些態樣中，「預先決定的比率」係指凝膠物質上蹤劑及引子之比率，且在此類情況下，該比率基於與凝膠物質反應之組分之比率且視需要考量兩種組分之任何不同反應性。在一些態樣中，追蹤劑及引子之混合物的預先決定的比率設為引子(或引子混合物，其中使用超過一種引子序列)之體積百分比。
如本文所用，「引子核苷酸序列(primer nucleotide sequence)」定義為充當DNA或RNA合成之起始點的單股核酸序列(例如單股DNA或單股RNA)。定序引子之5'末端可經修飾以使得與凝膠物質進行偶合反應。定序引子長度可為任何數目之鹼基長且可包括多種非天然核苷酸。在一實施例中，定序引子為短股，包括20至50個鹼基。
如本文所用，術語「未標記(untagged)」意謂核苷酸序列無螢光標籤與其連接。
「品質控制追蹤劑」包括核苷酸序列及連接至核苷酸序列之螢光標籤。品質控制追蹤劑之螢光標籤在品質控制方法中能夠偵測到。品質控制追蹤劑之螢光標籤亦能得以移除，且追蹤劑之殘餘部分能夠參與定序方法或在定序方法期間為非反應性的。
如本文所用，「位點」係指載體上或載體中所界定之位置，在載體中可連接凝膠物質及品質控制追蹤劑。
術語「基材(substrate)」及「載體(support)」在本文中可互換使用，且指有位點位於其中或上面之表面。載體通常為剛性的且不可溶於水性液體中。載體對於用以改質凝膠物質之化學反應可為惰性。舉例而言，載體對於用以在本文所闡述之方法中將品質控制追蹤劑連接至凝膠物質之化學反應可為惰性的。適合載體之實例包括玻璃及經改質或官能化之玻璃、塑膠(包括丙烯酸聚合物、聚苯乙烯及苯乙烯及其他材料之共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚胺甲酸酯、聚四氟乙烯(諸如來自Chemours之TEFLON®)、環狀烯烴/環烯烴聚合物(cyclo-olefin polymer，COP)(諸如來自Zeon之ZEONOR®)、聚醯亞胺等)、耐綸、陶瓷、二氧化矽或基於二氧化矽之材料、矽氧烷、矽及經改質矽、碳、金屬、無機玻璃及光纖束。
「硫醇」官能基係指-SH(例如
Figure 106145312-A0305-02-0016-11
)。
如本文所用，術語「四
Figure 106145312-A0305-02-0016-51
(tetrazine)」及「四
Figure 106145312-A0305-02-0016-52
基(tetrazinyl)」係指包含四個氮原子之六員雜芳基。四
Figure 106145312-A0305-02-0016-53
可視需要經取代。
如本文所用，「四唑(tetrazole)」係指包括四個氮原子之五員雜環基。四唑可視需要經取代。
如本文所用，術語「孔(well)」係指完全由載體表面之間隙 區域包圍之具有表面開口之載體中之離散凹面特徵。孔在表面中其開口處可具有多種形狀中之任一者，包括例如圓形、橢圓形、正方形、多邊形、星形(具有許多頂點)等。與表面正交獲得之孔的橫截面可為曲線、正方形、多邊形、雙曲線、錐形、角形等。
在一些具體實例中，可裂解核苷酸序列可經由酵素性裂解或化學裂解而裂解。
在一些情況下，可裂解核苷酸序列包含連接螢光標籤之連接子分子，其中連接子分子包含可經由酵素性裂解或化學裂解而裂解之部分。在一些實施例中，連接子分子包含鄰二醇且化學裂解藉由氧化條件，諸如高碘酸鈉(NaIO4)來實現。在其他具體實例中，連接子分子包含雙硫鍵且化學裂解由硫醇或三級膦實現；或連接子分子為矽烷且化學裂解由酸或氟離子實現；或連接子分子為偶氮苯且化學裂解由過二硫酸鈉(Na2S2O4)實現；或連接子分子為可光裂解基團且化學裂解由光實現；或連接子分子為疊氮基且化學裂解由三級膦實現。在第二態樣之另一實施例中，該方法進一步包含使用核酸外切酶自非反應性核苷酸序列之可裂解核鹼基裂解螢光標籤。
在此態樣之一個實施例中，品質控制追蹤劑包含可裂解核苷酸序列，且可裂解核苷酸序列包括切除位點。在一實施例中，可裂解核苷酸序列為引子核苷酸序列。
在此態樣之另一實施例中，品質控制追蹤劑為可裂解核苷酸序列，且可裂解核苷酸序列包括連接螢光標籤之連接子分子。在一些具體實例中，連接子分子包含選自由以下組成之群的官能基：二醇、雙硫鍵、矽烷、偶氮苯、可光裂解基團及疊氮基。在此態樣之此另一具體實例中，可裂解核苷酸序列進一步包括連接至連接子分子之引子核苷酸序列。
在此態樣之另一實施例中，品質控制追蹤劑為非反應性核苷酸 序列，且非反應性核苷酸序列進一步包括切除位點。
陣列之此態樣可進一步包含接枝於複數個離散孔各者中之凝膠物質的未標記引子核苷酸序列，其中品質控制追蹤劑及未標記引子核苷酸序列以預先決定的比率存在。
應瞭解，陣列之此態樣之任何特徵可以任何所期望的方式及/或組態組合在一起。
在該方法之第一態樣之一實施例中，品質控制追蹤劑為可裂解核苷酸序列，且可裂解核苷酸序列為引子核苷酸序列。在此實施例中，方法可進一步包含在測定引子核苷酸序列之密度、或分布、或密度及分布之後，自引子核苷酸序列裂解螢光標籤。
在該方法之第一態樣之另一實施例中，品質控制追蹤劑為可裂解核苷酸序列；在偵測之前引子核苷酸序列未標記；該方法進一步包含將引子核苷酸序列接枝於凝膠物質；可裂解核苷酸序列及引子核苷酸序列以預先決定的比率存在；且引子核苷酸序列之密度、或分布、或密度及分布之測定基於螢光及預先決定的比率。該方法之第一態樣之此其他實施例可進一步包含自可裂解核苷酸序列裂解螢光標籤。裂解經由酵素性裂解及/或化學裂解實現。
在該方法之第一態樣之另一實施例中，品質控制追蹤劑為非反應性核苷酸序列；引子核苷酸序列未標記；在偵測之前，該方法進一步包含將引子核苷酸序列接枝於凝膠物質，其中非反應性核苷酸序列及引子核苷酸序列以預先決定的比率存在；且引子核苷酸序列之密度、或分布、或密度及分布之測定基於螢光及預先決定的比率。該方法之第一態樣之此另一實施例可進一步包含使用核酸外切酶自非反應性核苷酸序列之可裂解核鹼基裂解螢光標籤。
應瞭解，該方法之第一態樣之任何特徵可以任何期望的方式組合在一起。此外，應瞭解，該方法及/或陣列之第一態樣之特徵之任何組合可在 一起使用，及/或此等態樣中之任一者或兩者的任何特徵可與本文所揭示之實例中之任一者組合。
在第二態樣之一個實施例中，該方法進一步包含經由酵素性裂解或化學裂解自可裂解核苷酸序列裂解螢光標籤。在第二態樣之此實施例之一些情況下，品質控制追蹤劑為可裂解核苷酸序列，可裂解核苷酸序列包括連接螢光標籤之連接子分子，且以下中之一者：連接子分子包含二醇且化學裂解由高碘酸鈉(NaIO4)實現；或連接子分子包含雙硫鍵且化學裂解由硫醇或三級膦實現；或連接子分子為矽烷且化學裂解由酸或氟離子實現；或連接子分子為偶氮苯且化學裂解由過二硫酸鈉(Na2S2O4)實現；或連接子分子為可光裂解基團且化學裂解由光實現；或連接子分子為疊氮基且化學裂解由三級膦實現。
在第二態樣之另一實施例中，該方法進一步包含使用核酸外切酶自非反應性核苷酸序列之可裂解核鹼基裂解螢光標籤。
應瞭解，該方法之此第二態樣之任何特徵可以任何期望的方式組合在一起。此外，應瞭解，第一態樣及/或第二態樣之特徵之任何組合可在一起使用，及/或此等態樣中之任一者或兩者之任何特徵可與本文所揭示之陣列及/或實施例中之任一者的特徵中之任一者組合。
本文所揭示之陣列之實例包括若干位點，其各自具有連接至凝膠物質之品質控制追蹤劑之實施例。品質控制追蹤劑包括引子核苷酸序列或與引子核苷酸序列以預先決定的比率存在，且因此可在品質控制方法中用以測定引子核苷酸序列之密度及/或分布。品質控制追蹤劑包括可用於品質控制方法中且可自追蹤劑裂解以使得其不干擾定序之螢光標籤。在一些情況下，包括品質控制追蹤劑會減少對為達到品質控制目的進行雜交及去雜交之需要。本文所揭示之實施例使得能夠評定載體上引子核苷酸序列之密度及/或分布，而不必加載定序試劑及樣品且不必進行定序工作流程中之初始步驟。
本文所闡述且申請專利範圍中所列舉之態樣及實施例可鑒於以上定義加以理解。
現參看圖1，描繪陣列10之實施例。一般而言，陣列10包括基材或載體12及跨越載體12之線或流動通道14。流動通道14各包括多個位點16，其藉由間隙區域18彼此隔開。在各位點16處，至少品質控制追蹤劑22連接至凝膠物質(24、24'，例如在圖2D中)。在一些情況下，除品質控制追蹤劑22以外，個別引子核苷酸序列20、20'亦連接至凝膠物質24。
圖1中所示且本發明中所論述之陣列10可安置於流量槽中或形成為流量槽之一部分，該流量槽為包括各種載劑流體、試劑等可在上面流動的固體表面之腔室。在一實施例中，流量槽可包括經由密封材料(例如黑色聚醯亞胺或另一適合結合材料)結合至頂部基材之陣列10。結合在載體12、密封材料及頂部基材之結合區中進行。結合區可位於各流動通道之間以使得密封材料以物理方式使一個流動通道14與相鄰流動通道14隔開(以防止交叉污染)，且可位於流量槽外圍處(以密封流量槽免遭外部污染)。然而，應瞭解，結合區及密封材料可視實施方案而定位於任何所需區中。結合可經由雷射結合、擴散結合、陽極結合、共晶結合、電漿活化結合、玻璃料結合或此項技術中已知之其他方法實現。
可與陣列10整合及/或易用於本發明方法中之流量槽及相關流體系統及偵測平台之其他實例描述於例如Bentley等人，NATURE 456：53-59(2008)，WO 04/018497；美國專利第7,057,026號；WO 91/06678；WO 07/123744；美國專利第7,329,492號；美國專利第7,211,414號；美國專利第7,315,019號；及美國專利第7,405,281號及美國專利公開案第2008/0108082號中，各文獻以全文引用的方式併入本文中。
在一些應用中，流量槽用以在反應自動化裝置中(諸如在核苷 酸定序儀中)執行受控化學或生物化學反應。孔口26可鑽穿載體12。藉由連接至孔口26，反應自動化裝置可在密封流動通道14中控制試劑及產物流動。在一些應用中，反應自動化裝置可調整流量槽之壓力、溫度、氣體組成及其他環境條件。此外，在一些應用中，孔口26可鑽孔於頂部基材中或載體12與頂部基材中。在一些應用中，密封流動通道14中所發生之反應可藉由成像或量測熱、光發射及/或螢光經由頂部基材及/或載體12監測。
應瞭解，流動通道14之特定取向、位點16等可不同於圖1中所示之流動通道之特定取向、位點。在一些實例中，位點16為連續的，且因此無需由間隙區域18隔開。
現將參考圖2A至圖2D更詳細地描述圖1之陣列10及製造陣列10之實施例。
圖2A描述位點16界定於其中且藉由間隙區域18隔開之載體12。此載體12具有圖案化表面。「圖案化表面(patterned surface)」係指固體載體12之暴露層中或上面之不同區域(亦即位點16)之排列。舉例而言，位點16中之一或多者可為存在一或多種品質控制追蹤劑22，且在一些情況下，個別引子核苷酸序列22之特徵。特徵可由間隙區域18隔開，在特徵中存在品質控制追蹤劑22及個別引子核苷酸序列20。可設想位點16之多種不同配置設計，其包括有規則、重複及非規則圖案。在一實施例中，為緊密堆積及改良密度，將位點16安置於六邊形柵格中。其他配置設計可包括例如直線(亦即長方體)配置設計、三角配置設計等。作為實施例，位點16之配置設計或圖案可為呈行及列之x-y格式。在一些其他實例中，配置設計或圖案可為位點16及/或間隙區域18之重複排列。在另外其他實施例中，配置設計或圖案可為位點16及/或間隙區域18之無規排列。圖案可包括點、小片、孔、柱、條帶、漩渦、線、三角形、矩形、圓形、弧線、方格、格子花、對角線、箭頭、方形及/或交叉影線。可用於 本文所闡述之實施例中之圖案化表面之其他實施例描述於美國專利第8,778,849號；第9,079,148號；及第8,778,848號，及美國專利公開案第2014/0243224號中，各文獻以全文引用的方式併入本文中。
配置設計或圖案之特徵可關於界定區域中位點16之密度(亦即位點16數目)。舉例而言，位點16可以大致2百萬個/平方毫米之密度存在。密度可經調整達不同密度，包括例如以下密度：至少約100個/平方毫米、約1,000個/平方毫米、約10萬個/平方毫米、約1百萬個/平方毫米、約2百萬個/平方毫米、約5百萬個/平方毫米、約1千百萬個/平方毫米、約5千萬個/平方毫米或更大。或者或另外，密度可經調整而不超過約5千萬個/平方毫米、約1千萬個/平方毫米、約5百萬個/平方毫米、約2百萬個/平方毫米、約1百萬個/平方毫米、約10萬個/平方毫米、約1,000個/平方毫米、約100/平方毫米或更小。進一步應瞭解，載體12上位點16之密度可在選自以上範圍之下限值中之一者與上限值中之一者之間。作為實施例，高密度陣列之特徵可為位點16隔開小於約100nm，中密度陣列之特徵可為位點16隔開約400nm至約1μm，且低密度陣列之特徵可為位點16隔開大於約1μm。
配置設計或圖案之特徵亦可或替代性地關於平均間距，亦即位點16之中心距相鄰間隙區域18之中心的間距(中心距)。圖案可為有規則的以使得關於平均間距之變化係數較小，或圖案可為不規則的，在此情況下，變化係數可能相對較大。在任一情況下，平均間距可為例如至少約10nm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約5μm、約10μm、約100μm或更大。或者或另外，平均間距可為例如至多約100μm、約10μm、約5μm、約1μm、約0.5μm、約0.1μm或更小。位點16之特定圖案的平均間距可在選自以上範圍的下限值中之一者與上限值中之一者之間。在一實施例中，位點16之間距(中心距)為約1.5μm。
在一些實例中，位點16為孔16'，且因此載體12在其表面中包括孔16'之陣列。孔16'(或諸如形狀、橫截面等組態不同之其他位點16)可使用多種技術製成，包括例如光微影、奈米壓印微影、衝壓技術、壓花技術、模製技術、微蝕刻技術、印刷技術等。如熟習此項技術者所瞭解，所用技術將視載體12之組成及形狀而定。
孔16'可為微米孔(至少一個尺寸處於微米級，例如約1μm至約1000μm)或奈米孔(至少一個尺寸處於奈米級，例如約1nm至約1000nm)。各孔16'之特徵可為其容積、孔開口面積、深度及/或直徑。
各孔16'可具有能夠限制液體之任何容積。可選擇最小或最大容積，例如以適應陣列10之後續使用所期望的輸送量(例如多路傳輸量(multiplexity))、解析度、分析物組成、或分析物反應性。舉例而言，容積可為至少約1×10-3μm3、約1×10-2μm3、約0.1μm3、約1μm3、約10μm3、約100μm3或更大。或者或另外，容積可為至多約1×104μm3、約1×103μm3、約100μm3、約10μm3、約1μm3、約0.1μm3或更小。應瞭解，凝膠物質24可填充孔16'之容積之全部或一部分。個別孔16'中凝膠物質24之體積可大於上文指定之值、小於上文指定之值或在上文指定之值之間。
可根據如上文關於孔容積所闡述之類似準則選擇表面上之各孔開口所佔之面積。舉例而言，表面上之各孔開口的面積可為至少約1×10-3μm2、約1×10-2μm2、約0.1μm2、約1μm2、約10μm2、約100μm2或更大。或者或另外，面積可為至多約1×103μm2、約100μm2、約10μm2、約1μm2、約0.1μm2、約1×10-2μm2或更小。
各孔16'之深度可為至少約0.1μm、約1μm、約10μm、約100μm或更大。或者或另外，深度可為至多約1×103μm、約100μm、約10μm、約1μm、約0.1μm或更小。
在一些情況下，各孔16'之直徑可為至少約50nm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約10μm、約100μm或更大。或者或另外，直徑可為至多約1×103μm、約100μm、約10μm、約1μm、約0.5μm、約0.1μm、約50nm或更小。
在形成之陣列10中，將凝膠物質24安置於離散孔16'各者中。將凝膠物質24安置於各孔16'中可如下來實現：首先如圖2B中所示用凝膠物質24塗佈載體12之圖案化表面，且接著例如經由化學或機械拋光至少自結構化載體12表面上孔16'之間的間隙區域18移除凝膠物質24。此等過程使至少一些凝膠物質24保留於孔16'中，但自結構化載體12之表面上孔16'之間的間隙區域18移除或失活至少大體上所有凝膠物質24。因此，此等過程產生用於定序之凝膠襯墊24'(圖2D)，該等凝膠襯墊在具有多個循環之定序操作中可為穩定的。
尤其適用的凝膠材料24將符合其駐存之位點16之形狀。一些適用的凝膠材料24可(a)符合其駐存之位點16(例如孔16'或其他凹面特徵)之形狀且(b)其體積至少大體上不超過其駐存之位點16之容積。
適合的凝膠物質24之一個實例包括由式(I)表示之聚合物：
Figure 106145312-A0305-02-0024-12
其中：R1為H或視需要經取代之烷基；R A 選自由以下組成之群：疊氮基、視需要經取代之胺基、視需要經取代之烯基、視需要經取代之腙、視需要經取代之肼、羧基、羥基、視需要經取代之 四唑、視需要經取代之四
Figure 106145312-A0305-02-0025-54
、氧化腈、硝酮及硫醇；R5選自由以下組成之群：H及視需要經取代之烷基；各-(CH2)p-可視需要經取代；p為1至50範圍內之整數；n為1至50,000範圍內之整數；及m為1至100,000範圍內之整數。
在式(I)結構中，一般熟習此項技術者應瞭解「n」及「m」次單元為以隨機次序存在於聚合物中之重現次單元。一般熟習此項技術者亦將認識到其他單體組分可存在於聚合物中。
凝膠物質24之特定實例為聚(N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺-共-丙烯醯胺(「PAZAM」)(描述於例如美國專利公開案第2014/0079923 A1號及第2015/0005447 A1號，各文獻以全文引用的方式併入本文中)，其包含以下所示結構：
Figure 106145312-A0305-02-0025-13
其中n為1至20,000範圍內之整數，且m為1至100,000範圍內之整數。如同式(I)一般，一般熟習此項技術者將認識到，「n」及「m」次單元為以隨機次序存在於聚合物結構中之重現單元。
PAZAM之分子量可在約10kDa至約1500kDa之範圍內，或在特定實施例中可為約312kDa。
在一些實施例中，PAZAM為線性聚合物。在一些其他具體實例中，PAZAM為輕度交聯聚合物。在其他實例中，PAZAM包含分支。
適合的凝膠材料24之其他實例包括具有膠態結構之彼等凝膠材料，諸如瓊脂糖；或具有聚合物網狀結構之彼等凝膠材料，諸如明膠；或具有交聯聚合物結構之彼等凝膠材料，諸如聚丙烯醯胺聚合物及共聚物、無矽烷丙烯醯胺(silane free acrylamide；SFA，參見例如美國專利公開案第2011/0059865號，其以全文引用的方式併入本文中)或SFA之疊氮化形式。適合的聚丙烯醯胺聚合物之實例可由丙烯醯胺及丙烯酸或含有乙烯基之丙烯酸形成，如例如WO 2000/031148(以全文引用的方式併入本文中)中所述，或由形成[2+2]光致環加成反應之單體形成，例如如WO 2001/001143或WO 2003/0014392(各文獻以全文引用的方式併入本文中)中所述。
凝膠物質24可為預成型凝膠物質。預成型凝膠材料可使用旋塗或浸漬、或正壓或負壓下之凝膠流動、或美國專利第9,012,022號中所闡述之技術塗佈，該文獻以全文引用的方式併入本文中。浸漬或浸塗可為選擇性沈積技術，視所用載體12及凝膠物質24而定。舉例而言，將圖案化載體12浸漬於預成型凝膠物質24中，且凝膠物質24可選擇性地填充位點16(亦即凝膠物質24並未沈積於間隙區域18上)，且可能不需要拋光(或另一移除製程)。
可使用旋塗或浸漬、或正壓或負壓下之凝膠流動、或美國專利第9,012,022號中所闡述之技術將預成型PAZAM塗佈於圖案化載體12上。PAZAM之連接亦可藉由化學反應以形成共價鍵，或經由矽烷化表面之表面起始原子轉移自由基聚合(surface initiated atom transfer radical polymerization，SI-ATRP)進行。
在一些實例中，載體表面用烯烴衍生之矽烷處理，其中烯烴部分可為線性、分支或環狀的。在一些實施例中，矽烷試劑為(RO)3Si-連接子-烯烴，且在其他實施例中，矽烷試劑(RO)3Si-C2-6伸烷基-環烯，且在其他實施例中，矽烷試劑為(RO)3Si-CH2CH2-降冰片烯，其中各R為C1-4烷基或為甲基或乙 基。諸如PAZAM之凝膠物質24在熱或紫外線條件下共價鍵結至烯烴衍生之矽烷。
在其他實例中，載體12表面可用胺基衍生之矽烷，諸如胺丙基-三烷氧基矽烷(aminopropyl-trialkoxysilane，APTS)，例如3-胺丙基-三甲氧基矽烷(3-aminopropyl-trimethoxysilane，APTMS)或3-胺丙基-三乙氧基矽烷(3-aminopropyl-triethoxysilane，APTES)預處理，以將矽共價連接至表面上之一或多個氧原子(不希望受機制約束，各矽可鍵結至一個、兩個或三個氧原子)。將此以化學方式處理之表面烘烤以形成胺基單層。胺基接著與磺基-HSAB反應以形成疊氮基衍生物。21℃下1J/cm2至30J/cm2之能量下之紫外線活化會產生活性氮烯物種，其可容易經歷與PAZAM之多種插入反應。
於載體12上塗佈PAZAM之其他實施例描述於美國專利公開案第2014/0200158號中，其以全文引用的方式併入本文中)，且包括紫外線(UV)介導之PAZAM單體與胺官能化表面之連接，或涉及活性基團(丙烯醯氯或其他含烯烴或炔烴之分子)之熱鍵聯反應及PAZAM之後續沈積及熱應用。
凝膠物質24可由塗覆液體，隨後形成凝膠物質24而形成。塗覆隨後形成凝膠物質24之液體之實施例為用呈液體形式之無矽烷丙烯醯胺及N-[5-(2-溴乙醯基)胺基戊基]丙烯醯胺(N-[5-(2-bromoacetyl)aminopentyl]acrylamide，BRAPA)塗佈位點16之陣列且在表面上藉由聚合反應使試劑形成凝膠。以此方式塗佈陣列可使用如美國專利公開案第2011/0059865號中所闡述之化學試劑及程序。
凝膠物質24可共價連接至載體12(在位點16)或不可共價連接至載體12。聚合物與位點16之共價連接有助於在多次使用期間在陣列10之整個使用期限中使凝膠維持於結構化位點16中。然而，如上文及許多實施例中所示，凝膠物質24無需共價連接至位點16。舉例而言，無矽烷丙烯醯胺(silane free acrylamide，SFA)不共價連接於載體12之任何部分。
如上所述，圖2C說明自間隙區域18移除凝膠物質24。移除可經由拋光來實現。拋光可為機械及/或化學處理過程。
機械拋光可藉由對固體載體12(其上具有凝膠物質24)之表面施加研磨力來進行。實施例方法包括用珠粒漿料研磨、用薄片或織物擦拭、刮擦或其類似方法。應瞭解。用於拋光之珠粒可為或不可為球形，且可具有不規則形狀、多邊形形狀、卵形形狀、細長形狀、圓柱形形狀等。珠粒之表面可為平滑或粗糙的。多種粒子中之任一者可適用作拋光用珠粒。拋光之一個實施例包括使用塗佈有3μm二氧化矽珠粒漿料(於水中10% w/v)之無絮(潔淨室級)拭布以自間隙區域18移除凝膠物質24。拋光轉盤/研磨機亦可與此漿料一起使用。機械拋光亦可使用流體噴射或氣體(例如空氣或惰性氣體，諸如氬氣或氮氣)噴射以自間隙區域18移除凝膠來實現。
可使用化學拋光技術，諸如丙烯醯胺之水解或基於自由基之降解(例如經由暴露於過氧化苯甲醯或稀過氧化氫)。在此形式之拋光期間，可提供呈固體、液體、氣體或電漿狀態之化學物質。因此，電漿拋光可適用於一些實施例。
拋光亦可涉及化學及機械拋光方法之組合，其中使用含有粒子之膠態懸浮液的化學漿料進行機械剝離且接著以化學方式溶解來自間隙區域18之凝膠物質24之置換部分。
拋光或清潔間隙區域18之其他方法包括基於黏著劑之技術，例如塗覆對凝膠物質24具有親和力之剛性平坦黏著劑膜，從而與間隙區域18中之凝膠物質24均勻接觸(例如經由化學鍵聯)之技術。機械移除/剝離此黏著劑膜將導致自間隙區域18機械移除凝膠物質24，同時使凝膠物質24保留於位點16中。
在一個實施例中，可如下將接枝硫代磷酸鹽之SFA自載體12表面上之間隙區域18移除：可將水沾濕之沃特曼拭布(Whatman wipe)輕觸氧化鋁(約100mg，0.3um)或鋼珠粒，且接著可使用均勻壓力以小同心圓將形成之漿料在載體(其上具有接枝硫代磷酸鹽之SFA)之表面上摩擦，且接著可使用清潔的水潤濕沃特曼拭布自表面移除漿料及接枝硫代磷酸鹽之SFA。
亦可使用本文中所例示用於自間隙區域18移除凝膠物質24之機械及化學拋光方法以使間隙區域18之凝膠物質失活，無論是否移除該凝膠物質24。舉例而言，就連接品質控制追蹤劑22及個別引子核苷酸序列20、20'之能力而言，可使該凝膠物質24失活。
在將凝膠物質24安置於各孔16'中之後，將品質控制追蹤劑22及在一些情況下之個別引子核苷酸序列20、20'接枝於凝膠物質24。所用連接技術且是否包括個別引子核苷酸序列20、20'部分視所利用之品質控制追蹤劑22而定。品質控制追蹤劑22之各種實施例示於圖3A至圖3D及圖4中。現將描述各實施例。
圖3A描述品質控制追蹤劑22A之一實施例，該品質控制追蹤劑與個別引子核苷酸序列20、20'包括於凝膠物質24/凝膠襯墊24'上。在此實施例中，品質控制追蹤劑22A為在3'端用螢光標籤28標記之可裂解核苷酸序列27，且引子核苷酸序列20、20'為未標記引子核苷酸序列。
圖3A之可裂解核苷酸序列27在5'端可包括能夠連接至凝膠物質24之官能基。此官能基之實例包括炔烴、降冰片烷基(或其他環烯基)、無銅點擊部分(copper free click moiety)(例如二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DIBO)、其他環炔或其他基團)及硫醇。此官能基可基於所用凝膠物質24進行選擇。舉例而言，炔烴、降冰片烷基及無銅點擊部分可經由點擊反應與PAZAM之疊氮反應，且硫醇可與SFA反應。在一些具體實例 中，官能基為炔烴。
圖3A之可裂解核苷酸序列27亦可在3'端包括能夠連接至螢光標籤28之官能基。在寡核苷酸合成期間可使用之此官能基之實例為5'-二甲氧基三苯甲基-5-[N-(三氟乙醯胺基己基)-3-丙烯亞胺基]-2'-去氧尿苷、3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基磷酸酯(亦即胺基改質劑C6 dT)。其他實例包括5'-二甲氧基三苯甲基-N-二甲基甲脒-5-[N-(三氟乙醯胺基)-3-丙烯亞胺基]-2'-去氧胞苷、3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基磷酸酯(胺基改質劑C6 dC)及使用固體載體，諸如(2-二甲氧基三苯甲氧基甲基-6-茀基甲氧羰基胺基-己烷-1-丁二醯基)-長鏈烷基胺基-CPG。3'端之官能基可基於所用螢光標籤28進行選擇。
可偵測或螢光標籤28可為可例如在3'端(或在或接近3'端)連接至可裂解核苷酸序列27之任何適合的螢光團。適合的螢光標記28之實例包括Texas Red®(磺醯氯染料，ThermoFisher Scientific)、Cy7®、Cy7.5®或磺基-花青7 NHS酯(花青染料，來自Lumiprobe)、紅色波長染料(諸如TEXTM615(Exiqon))、螢光染料(諸如Alexa Fluor®系列中之彼等螢光染料(ThermoFisher Scientific))、Atto染料(例如Atto 488，其結構為：
Figure 106145312-A0305-02-0030-14
，Atto-Tec系列，來自Atto-Tec)、 FAMTM燃料(螢光素之衍生物，Integrated DNA Technologies)、
Figure 106145312-A0305-02-0030-55
螢光團(諸如CAL Fluor®染料(例如CAL Fluor®金540、CAL Fluor®橙460、CAL Fluor®紅590、CAL Fluor®紅610及CAL Fluor®紅635，來自LGC Biosearch Technologies))、吲哚羰花青染料(諸如Quasar®染料(例如Quasar® 570、Quasar® 670及Quasar® 705，來自LGC Biosearch Technologies))或一般熟習 此項技術者已知之任何其他適合的螢光團。其他實例包括DylightTM488(胺反應性染料)或最大發射大致518nm之螢光團。在一些態樣中，螢光標籤為
Figure 106145312-A0305-02-0031-56
螢光團。在一些態樣中，
Figure 106145312-A0305-02-0031-57
螢光團之最大發射在540至640nm、或540至570nm、或580至640nm之範圍內。在其他態樣中，
Figure 106145312-A0305-02-0031-58
螢光團之最大發射在585至640nm之範圍內。在其他態樣中，
Figure 106145312-A0305-02-0031-59
螢光團在光譜之紅色區中發射。在其他態樣中，
Figure 106145312-A0305-02-0031-60
螢光團之最大發射為大致591nm、或610nm、或637nm。其他適合的可偵測標籤包括非螢光標籤，諸如電漿子奈米粒子(藉由例如SPR感測來偵測)或量子點。在一些態樣中，可偵測標籤由諸如NHS之胺基反應性基團衍生，以使得偶合至寡核苷酸序列。
螢光標籤28可使用諸如模板定向接合、聚合酶介導之寡核苷酸延伸、化學合成等任何適合的方法連接至可裂解核苷酸序列27。螢光標籤28之連接可在核苷酸合成期間(例如使用允許合成互補的螢光團標記之DNA的突變型DNA聚合酶或在固相寡核苷酸合成期間使用經螢光標籤修飾之單體)或在核苷酸合成之後(例如經由偶合化學反應使標籤28結合於先前位於3'位置安置之官能基上)進行。
可裂解核苷酸序列27之此實例包括可裂解部分31及殘餘部分29。可裂解部分31包括螢光標籤28(及用以連接螢光標籤28之任何官能基)、核苷酸之任何序列及切除位點30。因此，當序列27暴露於靶向位於切除位點30之核苷酸的酶時，可移除可裂解核苷酸序列27之可裂解部分31。在酵素性裂解之後仍保持連接至凝膠物質24之可裂解核苷酸序列27之部分29為非反應性核苷酸序列，且因此不參與或干擾待進行或正進行之定序操作。殘餘部分可為短聚T或聚A序列，或可為與亦連接至凝膠物質24之引子核苷酸序列20、20'正交之序列。
使用圖3A中之品質控制追蹤劑22A(例如在本文所揭示之品質 控制方法之實施例中)以及個別引子核苷酸序列20、20'。適合的引子核苷酸序列20、20'之實例包括用於與互補序列雜交及擴增序列之正向擴增引子或反向擴增引子。適合的引子核苷酸序列20、20'之一些特定實例包括P5及/或P7引子。將P5及P7引子用於藉由Illumina公司出售之市售流量槽之表面上，用於經HiSeq®、HiSeqX®、MiSeq®、NextSeq®、Genome Analyzer®®及其他儀器平台定序。P5及P7引子以及其他定序引子20、20'可在5'端經能夠與凝膠物質24之官能基反應之基團修飾。適合的官能基之一個實例為雙環[6.1.0]壬-4-炔(BCN)，其可與凝膠物質24之疊氮反應。封端之引子之其他實例包括四
Figure 106145312-A0305-02-0032-61
封端之引子、降冰片烯封端之引子、炔烴封端之引子、胺基封端之引子、環氧基或縮水甘油基封端之引子、硫代磷酸酯基封端之引子及三唑啉二酮封端之引子。可經炔烴封端之P5及P7引子之實例包括以下： P5：5'-炔烴-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-3'(SEQ.ID NO.1)
P7：5'-炔烴-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT-3'(SEQ.ID NO.2)
及其衍生物。在一些實施例中，P7序列在G*位置包括經修飾之鳥嘌呤，例如8-側氧基-鳥嘌呤。在其他實例中，*指示在G*與相鄰3'A之間的鍵為硫代磷酸酯鍵。在一些實例中，P5及/或P7引子包括非天然連接子。
視需要，P5及P7引子中之一或兩者可包括聚T尾。聚T尾通常位於序列之5'端(例如在5'末端鹼基與炔烴單元之間)，但在一些情況下，可位於3'端。聚T序列可包括許多T核苷酸，例如2至20個。
當P5及P7引子作為實例給出時，應瞭解，在本文中所呈現之實施例中可使用任何適合的擴增引子。熟習此項技術者將瞭解設計及使用適用於捕捉及擴增核酸之引子核苷酸序列20、20'之方式，如本文中所呈現。
品質控制追蹤劑22A之實施例與P5及P7引子核苷酸序列20、20' 正交。在一些態樣中，品質控制追蹤劑包括尿嘧啶切除位點。
在一些態樣中，品質控制追蹤劑包括以下序列中之一者：
(1)5' CATCTAGGCATCTAAGCATCAAUCTTACA 3'(SEQ.ID NO.3)
(2)5' ACATACATACATACATACAUACATACA 3'(SEQ.ID NO.4)
(3)5' ATTGATTGATTGATTGATUGATTGAT 3'(SEQ.ID NO.5)其中U為裂解位點。在一些態樣中，U為尿嘧啶切除位點。
在一些態樣中，品質控制追蹤劑在序列之5'端包含聚T序列。在一些態樣中，聚T區包含2至20個、或3、4、5、6或7個T核苷酸。在一些態樣中，聚T區包含4、5或6個T鹼基。在其他態樣中，聚T區包含6個T核苷酸。在一些態樣中，序列為：(1)5'聚T-CATCTAGGCATCTAAGCATCAAUCTTACA 3'(SEQ.ID NO.6)或(2)5'聚T-ACATACATACATACATACAUACATACA 3'(SEQ.ID NO.7)或(3)5'聚T-ATTGATTGATTGATTGATUGATTGAT 3'(SEQ.ID NO.8)。
在一些態樣中，品質控制追蹤劑包括Texas Red®作為螢光標籤。在一些態樣中，品質控制追蹤劑為：5'-炔烴-CATCTAGGCATCTAAGCATCAAUCTTACA[胺基C6 dT-Texas Red]-3'(SEQ.ID NO.9)或5'-炔烴-ACATACATACATACATACAUACATACA[胺基C6 dT-Texas Red]-3'(SEQ.ID NO.10)或5'-炔烴-ATTGATTGATTGATTGATUGATTGAT[胺基C6 dT-Texas Red]-3'(SEQ.ID NO.11)。
在一些態樣中，此等追蹤劑在炔烴與序列之其餘部分之間亦包括聚T區，如本文所述。
在一些態樣中，品質控制追蹤劑為：5'-炔烴-CATCTAGGCATCTAAGCATCAAUCTTACA[胺基C6 dT-
Figure 106145312-A0305-02-0034-62
螢光團]-3'(SEQ.ID NO.12)或5'-炔烴-ACATACATACATACATACAUACATACA[胺基C6 dT-
Figure 106145312-A0305-02-0034-63
螢光團]-3'(SEQ.ID NO.13)或5'-炔烴-ATTGATTGATTGATTGATUGATTGAT[胺基C6 dT-
Figure 106145312-A0305-02-0034-64
螢光團]-3'(SEQ.ID NO.14)。
在一些態樣中，此等追蹤劑在炔烴與序列之其餘部分之間在5'端亦包括聚T區，如本文所述。
在一些態樣中，品質控制追蹤劑包含炔烴末端，且在一些態樣中，其為5'-己炔末端。使用適合的末端將追蹤劑連接至凝膠物質。
在一些態樣中，品質控制追蹤劑為：5'-炔烴-TTTTTTACATACATACATACATACAUACATACA[胺基C6 dT-
Figure 106145312-A0305-02-0034-65
螢光團]-3'(SEQ.ID NO.15)。
在一些態樣中，炔烴為己炔。在一些態樣中，U裂解位點為尿嘧啶切除位點。在一些態樣中，
Figure 106145312-A0305-02-0034-66
螢光團之最大發射在585至640nm之範圍內。在其他態樣中，
Figure 106145312-A0305-02-0034-67
螢光團在光譜之紅色區中發射。在其他態樣中，
Figure 106145312-A0305-02-0034-68
螢光團之最大發射為大致591nm、或610nm、或637nm。在一些態樣中，螢光團為Texas Red®。
在一些態樣中，其中品質控制追蹤劑包含引子序列與可偵測標籤，品質控制追蹤劑包括以下序列中之一者：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACA-3’(SEQ.ID NO.16)
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCACAC-3'(SEQ.ID NO.17)
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-3'(SEQ.ID NO.1)。
在一些態樣中，品質控制追蹤劑包括聚T區，如上文所述。在一些實施例中，品質控制追蹤劑包含以下序列中之一者：5'-(聚T或TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACA-3'(SEQ.ID NO.18)
5'-(聚T或TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUCACAC-3'(SEQ.ID NO.19)
5'-(聚T或TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-3'(SEQ.ID NO.20)。
在一些態樣中，品質控制追蹤劑包括使得可接枝於凝膠物質之末端。在一些實例中，末端為炔烴或己炔部分。因此，在一些態樣中，品質控制追蹤劑包含以下序列中之一者：5'-(炔烴)-(聚T或TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACA-3'(SEQ.ID NO.18)
5'-(炔烴)-(聚T或TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUCACAC-3'(SEQ.ID NO.19)
5'-(炔烴)-(聚T或TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-3'(SEQ.ID NO.20)。
在一些態樣中，品質控制追蹤劑包含如本文所述之
Figure 106145312-A0305-02-0035-69
螢光團或Texas Red。在一些態樣中，品質控制追蹤劑包含以下序列中之一者：5'-(炔烴)-(聚T或TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACA(胺基C6 dT-
Figure 106145312-A0305-02-0035-70
螢光團)-3'(SEQ.ID NO.21)
5'-(炔烴)-(聚T或TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUC(胺基C6 dT-
Figure 106145312-A0305-02-0036-71
螢光團)ACAC-3'(SEQ.ID NO.22)
5'-(炔烴)-(聚T或TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC(胺基C6 dT
Figure 106145312-A0305-02-0036-72
螢光團)-3'(SEQ.ID NO.23)。
當使用圖3A中之品質控制追蹤劑22A時，應瞭解，其相對於個別引子核苷酸序列20、20'以預先決定的比率存在。在本文所揭示之品質控制方法之一實施例中可以使用該預先決定的比率以間接測定個別引子核苷酸序列20、20'之密度及/或分布。
為形成圖3A中所示之實施例，可使用依序接枝或共接枝。
依序接枝可藉由使載體12(在位點16中具有凝膠物質24)暴露於含有品質控制追蹤劑22A之溶液或混合物及培育，且接著暴露於含有引子核苷酸序列20、20'之溶液或混合物及培育來實現。或者，依序接枝可藉由且載體12(在位點16中具有凝膠物質24)暴露於含有引子核苷酸序列20、20'之溶液或混合物及培育，且接著暴露於含有品質控制追蹤劑22A之溶液或混合物及培育來實現。
共接枝可藉由使載體12(在位點16中具有凝膠物質24)暴露於含有品質控制追蹤劑22A及引子核苷酸序列20、20'之溶液或混合物且接著培育來實現。使載體12暴露於此溶液或混合物可藉由將品質控制追蹤劑22A及引子核苷酸序列20、20'之混合物沈積於載體12上來實現。在一實施例中，溶液或混合物可抽吸跨過經凝膠物質24塗佈之載體12(示於圖2C中)。
在用以形成圖3A中所示實施例之接枝實施例中之任一者中，培育在預先決定的溫度下進行，該預先決定的溫度部分視所用品質控制追蹤劑22A及引子核苷酸序列20、20'而定。作為實施例，培育可在約50℃至約70℃範圍內之溫度下實現。
亦在用以形成圖3A中所示之實施例之接枝實施例中之任一者 中，溶液可包括品質控制追蹤劑22A及/或引子核苷酸序列20、20'、水、緩衝劑及催化劑。存在於同一溶液/混合物或個別溶液/混合物中之品質控制追蹤劑22A及/或引子核苷酸序列20、20'可以任何所需預先決定的比率存在。
圖3B描述品質控制追蹤劑22B之另一實施例，該品質控制追蹤劑與個別引子核苷酸序列20、20'包括於凝膠物質24/凝膠襯墊24'上。在此實施例中，品質控制追蹤劑22B為螢光標籤28連接至可裂解核鹼基之非反應性核苷酸序列32，且引子核苷酸序列20、20’為未標記引子核苷酸序列。
在進行品質控制方法之後且在進行定序的同時，品質控制追蹤劑22B之此實施例之非反應性核苷酸序列32仍保持至少大體上完整，且因此序列32與亦連接至凝膠物質24之引子核苷酸序列20、20'正交。
圖3B之非反應性核苷酸序列32在5'端可包括能夠連接至凝膠物質24之官能基。此官能基之實例包括炔烴、降冰片烷基(或其他環烯基)、無銅點擊部分(例如二苯并環辛炔(DIBO)、其他環炔或其他基團)及硫醇。此官能基可基於所用凝膠物質24進行選擇。舉例而言，炔烴、降冰片烷基及無銅點擊部分可經由點擊反應與PAZAM之疊氮反應，且硫醇可與SFA反應。
在品質控制追蹤劑22B之此實施例中，螢光標籤28連接至序列32之可裂解核鹼基。連接螢光標籤28之核鹼基為可藉由核酸外切酶裂解之核鹼基，該核酸外切酶催化特定鹼基之切除，同時使磷酸二酯主鏈保持完整。
在此實施例中，螢光標籤28可在接近序列32之3'端(例如在10個鹼基內)，但不直接在3'端連接。可使用上述螢光標記28中之任一者，只要所選標籤可共價連接至非反應性核苷酸序列32之所期望的核鹼基。
使用圖3B中之品質控制追蹤劑22B(例如在本文所揭示之品質控制方法之實施例中)以及個別引子核苷酸序列20、20'。適合的引子核苷酸序列20、20'之實例包括用於與互補序列雜交及擴增序列之正向擴增引子或反向擴 增引子。適合的引子核苷酸序列20、20'之一些特定實例包括上述P5或P7引子。
當使用圖3B中之品質控制追蹤劑22B時，應瞭解，其相對於引子核苷酸序列20、20'以預先決定的比率存在。在本文所揭示之品質控制方法之一實施例中可使用該預先決定的比率以間接測定引子核苷酸序列20、20'之密度及/或分布。
為形成圖3B中所示之實施例，可如先前所描述使用依序接枝或共接枝，但其中改用品質控制追蹤劑22B替代品質控制追蹤劑22A。在用以形成圖3B中所示實施例之接枝實施例中之任一者中，培育在預先決定的溫度下進行，該預先決定的溫度部分視所用品質控制追蹤劑22B及引子核苷酸序列20、20'而定。亦在用以形成圖3B中所示之實施例之接枝實施例中之任一者中，溶液可包括品質控制追蹤劑22B及/或引子核苷酸序列20、20'、水、緩衝劑及催化劑。存在於同一溶液/混合物或個別溶液/混合物中之品質控制追蹤劑22B及/或引子核苷酸序列20、20'可以任何所需預先決定的比率存在。
圖3C描述品質控制追蹤劑22C之另一實施例，該品質控制追蹤劑與個別引子核苷酸序列20、20'包括於凝膠物質24/凝膠襯墊24'上。在此實施例中，品質控制追蹤劑22C為螢光標籤28連接至可裂解核鹼基(接近3'端)且具有切除位點30之非反應性核苷酸序列32'，且引子核苷酸序列20、20’為未標記引子核苷酸序列。
因為品質控制追蹤劑22C之此實施例包括連接至可裂解核鹼基之螢光標籤28，核酸外切酶可用於在已執行品質控制方法之後移除螢光標籤28。在此實施例中，非反應性核苷酸序列32'在已進行品質控制方法之後仍保持至少大體上完整，且因此非反應性核苷酸序列32'可與亦連接至凝膠物質24之引子核苷酸序列20、20'正交。
此外，因為品質控制追蹤劑22C之此實施例亦包括切除位點 30，所以酵素性裂解可用於在已進行品質控制方法之後移除非反應性序列32'之可裂解部分31'。在此實施例中，可裂解部分31'包括寡核苷酸之任何序列、沿該序列連接至核鹼基之螢光標籤28及切除位點30。在酵素性裂解之後仍保持連接至凝膠物質24之非反應性核苷酸序列32'之部分29'亦為非反應性核苷酸序列，且因此不參與或干擾待進行或正進行之定序操作。殘餘部分29'可為短聚T或聚A序列，或可為與亦連接至凝膠物質24之引子核苷酸序列20、20'正交之序列。
圖3C之非反應性核苷酸序列32'在5'端可包括能夠連接至凝膠物質24之官能基。此官能基之實例包括炔烴、降冰片烷基(或其他環烯基)、無銅點擊部分(例如二苯并環辛炔(DIBO)、其他環炔或其他基團)及硫醇。此官能基可基於所用凝膠物質24進行選擇。舉例而言，炔烴、降冰片烷基及無銅點擊部分可經由點擊反應與PAZAM之疊氮反應，且硫醇可與SFA反應。
在此實施例中，螢光標籤28可在接近序列32'之3'端(例如在10個鹼基內)，但不直接在3'端連接。可使用上述螢光標記28中之任一者，只要所選標籤可共價連接至非反應性核苷酸序列32'之所期望的核鹼基。
使用圖3C中之品質控制追蹤劑22C(例如在本文所揭示之品質控制方法之實施例中)以及個別引子核苷酸序列20、20'。適合的引子核苷酸序列20、20'之實例包括用於與互補序列雜交及擴增序列之正向擴增引子或反向擴增引子。適合的引子核苷酸序列20、20'之一些特定實例包括上述P5或P7引子。
當使用圖3C中之品質控制追蹤劑22C時，應瞭解其相對於引子核苷酸序列20、20'以預先決定的比率存在。在本文所揭示之品質控制方法之一實施例中可使用該預先決定的比率以間接測定引子核苷酸序列20、20'之密度及/或分布。
為形成圖3C中所示之實施例，可如先前所描述使用依序接枝或共接枝，但其中改用品質控制追蹤劑22C替代品質控制追蹤劑22A。在用以形成 圖3C中所示實施例之接枝實施例中之任一者中，培育在預先決定的溫度下進行，該預先決定的溫度部分視所用品質控制追蹤劑22C及引子核苷酸序列20、20'而定。亦在用以形成圖3C中所示之實施例之接枝實施例中之任一者中，溶液可包括品質控制追蹤劑22C及/或引子核苷酸序列20、20'、水、緩衝劑及催化劑。存在於同一溶液/混合物或個別溶液/混合物中之品質控制追蹤劑22C及/或引子核苷酸序列20、20'可以任何所需預先決定的比率存在。
圖3D描述品質控制追蹤劑22D之一實施例，該品質控制追蹤劑包括於凝膠物質24/凝膠襯墊24'上而無個別引子核苷酸序列20、20'。在此實施例中，品質控制追蹤劑22D為在3'端由螢光標籤28標記之可裂解核苷酸序列27'。螢光標籤28可為上述螢光團中之任一者。
可裂解核苷酸序列27'之此實例包括可裂解部分31"及殘餘部分29"。可裂解部分31"包括螢光標籤28、核苷酸之任何序列及接近3'端之切除位點30。可裂解部分31"亦可包括使螢光標籤28連接至核苷酸序列之官能基。此官能基之實例為5'-二甲氧基三苯甲基-5-[N-(三氟乙醯胺基己基)-3-丙烯亞胺基]-2'-去氧尿苷、3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基磷酸酯(亦即胺基改質劑C6 dT)。其他實例包括5'-二甲氧基三苯甲基-N-二甲基甲脒-5-[N-(三氟乙醯胺基)-3-丙烯亞胺基]-2'-去氧胞苷、3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基磷酸酯(胺基改質劑C6 dC)及使用固體載體，諸如(2-二甲氧基三苯甲氧基甲基-6-茀基甲氧羰基胺基-己烷-1-丁二醯基)-長鏈烷基胺基-CPG。此官能基可基於所用螢光標籤28進行選擇。當序列27暴露於靶向位於切除位點30之核苷酸的酶時，可移除可裂解核苷酸序列27'之可裂解部分31"。
在酵素性裂解之後仍保持連接至凝膠物質24之可裂解核苷酸序列27'之部分29"為引子核苷酸序列20、20'。在移除可裂解部分31"之後仍保留之引子核苷酸序列20、20'將參與待進行或正進行之定序操作。本文所揭示之引子 核苷酸序列20、20'之任何實施例可用於品質控制追蹤劑22D中。
圖3D之可裂解核苷酸序列27'在5'端可包括能夠連接至凝膠物質24之官能基。此官能基之實例包括炔烴、降冰片烷基(或其他環烯基)、無銅點擊部分(例如二苯并環辛炔(DIBO)、其他環炔或其他基團)及硫醇。此官能基可基於所用凝膠物質24進行選擇。舉例而言，炔烴、降冰片烷基及無銅點擊部分可經由點擊反應與PAZAM之疊氮反應，且硫醇可與SFA反應。
在3'端用螢光標籤Texas Red®標記之P5引子之實例為：5'-炔烴-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACA[胺基C6 dT-Texas Red]-3'(SEQ.ID NO.24)
在本文所揭示之品質控制方法之一實施例中可使用圖3D中之品質控制22D以直接測定作為追蹤劑22D之一部分之引子核苷酸序列20、20'之密度及/或分布。
為形成圖3D中所示之實施例，可使用一種類型之品質控制追蹤劑22D之接枝(其各包括相同引子核苷酸序列20或20')，或可使用不同類型之品質控制追蹤劑22D之共接枝(例如其中一些包括引子核苷酸序列20且其他包括不同引子核苷酸序列20')。接枝或共接枝可如先前所描述進行，但其中改用品質控制追蹤劑22D替代品質控制追蹤劑22A。
品質控制追蹤劑22E之其他實施例示於圖4中。在此等實施例中，品質控制追蹤劑22E為在3'端由螢光標籤28標記之可裂解核苷酸序列。可裂解核苷酸序列之此等實施例各包括核苷酸序列X、連接子分子34及螢光標籤28。
核苷酸序列X可為非反應性核苷酸序列(諸如序列32)或引子核苷酸序列(諸如序列20或20')。當核苷酸序列X為非反應性核苷酸序列時，可使用品質控制追蹤劑22E以及個別引子核苷酸序列20、20'(與圖3A至圖3C中所示 之實施例類似。當核苷酸序列X為引子核苷酸序列時，可單獨使用品質控制追蹤劑22E(亦即無個別引子核苷酸序列20、20')(與圖3D中所示之實施例類似)。
圖4之核苷酸序列X在5'端可包括能夠連接至凝膠物質24之官能基。此官能基之實例包括炔烴、降冰片烷基(或其他環烯基)、無銅點擊部分(例如二苯并環辛炔(DIBO)、其他環炔或其他基團)及硫醇。此官能基可基於所用凝膠物質24進行選擇。舉例而言，炔烴、降冰片烷基及無銅點擊部分可經由點擊反應與PAZAM之疊氮反應，且硫醇可與SFA反應。
連接子分子34在一個末端包括可連接至(直接地或間接地)螢光標籤28之官能基且在另一末端包括可連接至(直接地或間接地)核苷酸序列X之官能基(例如在序列X中之3'端或特定核鹼基處)。品質控制追蹤劑22E之連接子分子34提供可經歷在已進行品質控制方法之一實施例之後自品質控制追蹤劑22E至少移除螢光標籤28之裂解反應的化學鍵聯。所進行之裂解反應視所用連接子分子34而定。實例連接子分子34包括二醇、雙硫鍵、矽烷、偶氮苯、可光裂解基團及疊氮基。
二醇為含有兩個羥基之任何化學化合物。可使用線性或環狀二醇。適合的二醇之實例為鄰二醇，其中羥基連接至相鄰碳原子。鄰二醇在諸如暴露於過碘酸鹽(諸如高碘酸鈉)之氧化條件下或在酵素性條件下可裂解。適合的二醇之實例為圖4中以34A所示之酒石酸衍生之二醇。在此實施例中，胺基在二醇之各端連接至各別部分，其中之一者連接至核苷酸序列X之3'端且其中另一者經由任何適合的連接位點(例如醇、胺、甲酸)連接至螢光標籤28。二醇可藉由使品質控制追蹤劑22E暴露於高碘酸鈉(NaIO4)裂解，該高碘酸鈉可將二醇氧化裂解成為兩個醛。
雙硫鍵具有通式結構R1-S-S-R2，其中R1及R2可為烷基或芳基中 之任一者。雙硫鍵在還原條件下裂解。適合的雙硫鍵之實例在圖4中示為34B。在此實例中，雙硫鍵一端之胺基經由諸如烷基鏈之連接子在3'端連接至核苷酸 序列X，且雙硫鍵另一端之胺基形成醯胺基鍵聯(
Figure 106145312-A0305-02-0043-16
)，其中R為- (CH2)4-O-螢光標籤28，R'為H，且R"為-(CH2)2-S-S-(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)3-X。螢光標籤28經由任何適合的連接位點(例如醇、胺、甲酸)連接。在一實施例中，雙硫鍵可藉由使品質控制追蹤劑22E暴露於諸如硫醇(R3SH，其中R3可為任何適合的烷基)或三級膦(R4 3P，其中R4為任何適合的烷基)之還原條件裂解。硫醇與雙硫鍵之反應將使雙硫鍵斷裂且產生新穎雙硫鍵及自原始雙硫鍵衍生之硫醇。三級膦與雙硫鍵之反應為雙分子親核取代(SN2)反應，該反應將使雙硫鍵斷裂且產生兩個含硫產物。
如本文所用且如圖4中34C所示之矽烷包括鍵結至兩個氧原子及兩個R基團(例如其各自可為烷基或芳基)之矽原子。在此實例中，矽烷之氧原子分別連接至諸如烷基鏈之連接子，該連接子在3'端連接至核苷酸序列X且經由任何適合的連接位點(例如醇、胺、甲酸)連接至螢光標籤28。矽烷可在Si-O鍵中之一者處藉由使品質控制追蹤劑22E暴露於酸(圖4中以H+所示)或藉由用氟離子(未示於圖4中)處理裂解。
偶氮苯為由兩個藉由N=N雙鍵連接之苯環構成之化學化合物。不同官能基可在相對於N=N雙鍵之對位自苯環延伸。此等官能基可相同或不同，且實例包括醯胺基、烷基胺或羥基。適合的偶氮苯之實例在圖4中示為34D。在此實例中，官能基包括醯胺基及乙胺。醯胺基連接至諸如烷基鏈之連接子，該連接子在3'端連接至核苷酸序列X，且乙胺之胺基形成醯胺基鍵聯 (
Figure 106145312-A0305-02-0043-15
)，其中R為-(CH2)4-O-螢光標籤28，R'為H，且R"為-(CH2)2-偶氮苯- (C=O)-NH-(CH2)3-X。螢光標籤28經由任何適合的連接位點(例如醇、胺、甲 酸)連接。在一實施例中，偶氮苯可藉由使品質控制追蹤劑22E暴露於過二硫酸鈉(Na2S2O4)裂解。過二硫酸鈉與偶氮苯之反應將偶氮苯還原為兩個苯胺基團。
可光裂解基團為包括光裂解位點之非核苷酸部分，其中裂解藉由用預先決定的波長之光照射預先決定的時間而發生。可光裂解基團可用作在核苷酸序列X之3'端使任何可用胺基磷酸酯修飾連接至連接螢光標籤28之官能基的中間物。適合的可光裂解基團之實例鄰硝基苯甲基在圖4中示為34E。在此實施例中，可光裂解基團在任一端包括胺基。在此實例中，可光裂解基團一端之胺基連接至諸如烷基鏈之連接子，該連接子連接至核苷酸序列X，且可光裂解基團另一端之胺基形成醯胺基鍵聯，該醯胺基鍵聯經由-(CH2)4-O-連接至螢光標籤28。螢光標籤28經由任何適合的連接位點(例如醇、胺、甲酸)連接。在一實施例中，至少螢光標籤28自品質控制追蹤劑22E在可光裂解位點藉由使品質控制追蹤劑22E暴露於預先決定的波長之光預先決定的時間來裂解。
如本文所提及，疊氮基為包括基團N3之任何分子。適合的疊氮基之實例在圖4中示為O-疊氮基烷基34F。在此實施例中，疊氮基一端之胺基連接至諸如烷基鏈之連接子，該連接子在3'端連接至核苷酸序列X，且疊氮基另一 端之胺基形成醯胺基鍵聯(
Figure 106145312-A0305-02-0044-17
)，其中(在此實施例中)R為-(CH2)4-O- 螢光標籤28，R'為H，且R"為-(CH2)3-O-(CN3)-(CH2)-(O(CH2)2)2-(CH2)-(C=O)-NH-(CH2)3-X。螢光標籤28經由任何適合的連接位點(例如醇、胺、甲酸)連接。在一實施例中，疊氮基可藉由使品質控制追蹤劑22E暴露於三級膦(R6 3P，其中R6為經適當取代之烷基或芳基)裂解。三級膦及疊氮基經歷施陶丁格還原反應(Staudinger reduction reaction)。
本文所揭示之連接子分子34各可經歷化學裂解反應，該化學裂解反應在已進行品質控制方法之實施例之後自品質控制追蹤劑22E至少移除螢 光標籤28。殘餘部分可為非反應性核苷酸序列(將不參與定序)或引子核苷酸序列(將參與定序)。
當品質控制追蹤劑22E之核苷酸序列X為非反應性核苷酸序列時，品質控制追蹤劑22E與個別引子核苷酸序列20、20'可依序接枝或共接枝，如本文前述。當品質控制追蹤劑22E之核苷酸序列X為引子核苷酸序列20、20'時，可接枝一種類型之品質控制追蹤劑22E(其各包括相同引子核苷酸序列20或20')，或可共接枝不同類型之品質控制追蹤劑22E(例如其中一些包括引子核苷酸序列20且其他包括不同引子核苷酸序列20')。接枝或共接枝可如先前所描述進行，但其中改用品質控制追蹤劑22E之實施例替代品質控制追蹤劑22A。
再參考圖2D，描繪含有個別引子核苷酸序列20、20'之品質控制追蹤劑22的實施例。在包括引子核苷酸序列20、20'之追蹤劑22之實施例(例如追蹤劑22D及追蹤劑22E之一些實施例)中，個別引子核苷酸序列20、20'將不與追蹤劑22一起存在。
本文所揭示之陣列10可用於品質控制方法中。此外，品質控制方法之實施例描繪於圖5中。方法50通常包括將品質控制追蹤劑22接枝於載體12上孔16'中之凝膠物質24，該品質控制追蹤劑選自由以下組成之群：在3'端用螢光標籤28標記之可裂解核苷酸序列27、27'及螢光標籤28連接至可裂解核鹼基之非反應性核苷酸序列32、32'(如元件符號52所示)；使用螢光偵測品質控制追蹤劑22(如元件符號54所示)；及至少部分地基於螢光，測定接枝於凝膠物質24之引子核苷酸序列20、20'之密度、或分布、或密度及分布(如元件符號56所示)。
品質控制方法可在單獨或與個別引子核苷酸序列20、20'組合之品質控制追蹤劑22接枝於凝膠物質24之後及在流量槽製造完成之前(例如在陣列10結合於頂部基材流量槽之前)進行。品質控制方法亦可或者可藉由完全製 成之流量槽的終端使用者進行。當品質控制方法藉由流量槽之終端使用者進行時，應瞭解，該方法可在加載任何定序工作流程試劑及DNA樣品於流量槽上之前進行。因為各品質控制追蹤劑22A、22B、22C、22D、22E包括可偵測螢光標籤28，所以不需要進行經螢光標記之互補核苷酸之雜交來作為本文所揭示之品質控制方法之一部分。
在方法50中，品質控制追蹤劑22A、22B、22C、22D、22E之各種實施例之接枝可如先前所描述實現。
實施例品質控制追蹤劑22A、22B、22C、22D、22E各包括螢光標籤28，當暴露於較短波長之入射輻射時其將發射較長波長之光。因此，偵測品質控制追蹤劑22可藉由使陣列10(或包括陣列10之流量槽)暴露於雷射發射之輻射來實現。在雷射激發之後，經由適合的螢光偵測器捕捉自各品質控制追蹤劑22A、22B、22C、22D、22E之螢光標籤28發射之螢光(根據強度)。
當品質控制追蹤劑22A、22B、22C或追蹤劑22E之一些實施例與個別引子核苷酸序列20、20'以預先決定的比率利用時，可使用來自此等品質控制追蹤劑22A、22B、22C、22E之螢光強度及預先決定的比率評定或間接測定引子核苷酸序列20、20'之密度及/或分布。螢光強度指示品質控制追蹤劑22A、22B、22C、22E之密度及/或分布，且預先決定的比率使品質控制追蹤劑22A、22B、22C、22E之資料與引子核苷酸序列20、20'相關聯。
當利用品質控制追蹤劑22D或追蹤劑22E之其他實施例(其包括引子核苷酸序列20、20')時，單獨螢光結果即可用於評定或直接測定引子核苷酸序列20、20'之密度及/或分布。品質控制追蹤劑22D、22E之此等實施例包括序列20、20'作為追蹤劑22D、22E之一部分，且因此單獨螢光強度即指示引子核苷酸序列20、20'之密度及/或分布。
在品質控制方法完成(例如工作流程之終端使用者部分)之 後，螢光標籤28可使用本文所述方法自品質控制追蹤劑22A、22B、22C、22D、22E裂解。
如上參考圖3A，品質控制追蹤劑22A包括切除位點30。因此，此實施例追蹤劑22A中螢光標籤28之裂解可經由酵素性裂解實現。使品質控制追蹤劑22A暴露於靶向位於切除位點30之核苷酸的酶。酶可在起始定序之前引入，或可引入作為定序工作流程之團簇產生過程之一部分。適合的酶之實例包括核酸外切酶(其自序列之一端移除連續核苷酸)、核酸內切酶(其裂解序列內之磷酸二酯鍵)、鹼基切除修復酶(其移除特異性鹼基以形成脫嘌呤核酸/脫嘧啶核酸(AP)位點，其接著可藉由AP核酸內切酶裂解)、限制酶(其掃描切割單股序列之品質控制追蹤劑22A之4至6個核苷酸之特定序列)等。一些特定實例示於以下表1中。
Figure 106145312-A0305-02-0047-18
在表1中，*表示螢光標籤28。N表示核苷酸，且切除位點呈粗體。
在表1中之一個實施例中，切除位點30為USER酶靶向之尿嘧啶(dU)。USER酶為尿嘧啶DNA醣苷酶(uracil DNA glycosylase，UDG)及DNA醣苷酶-解離酶核酸內切酶VIII之混合物。UDG催化尿嘧啶鹼基之切除，從而形成無鹼基(脫嘧啶核酸)位點，同時使磷酸二酯主鏈保持完整。核酸內切酶VIII之解離酶活性在無鹼基位點之3'及5'側使磷酸二酯主鏈斷裂，以使得釋放無鹼基去氧核糖。因此，追蹤劑22A在切除位點30之裂解自載體12移除序列27之部分31及螢光標籤28。在表1中之其他實施例中，切除位點30為FPG靶向之經氧化嘌呤(例如側氧基G)。FPG會識別且移除經氧化鳥嘌呤。FPG充當N-醣 苷酶與AP-解離酶。
在酵素性裂解之後仍保持連接至凝膠物質24之品質控制追蹤劑22A之部分29為非反應性核苷酸序列，且因此不參與或干擾待進行或正進行之定序操作。
如上參考圖3B，品質控制追蹤劑22B包括連接至序列32之可裂解核鹼基的螢光標籤28。使品質控制追蹤劑22B暴露於核酸外切酶，該核酸外切酶催化藉由磷酸二酯裂解切除特定鹼基。核酸外切酶可在起始定序之前引入，或可引入作為定序工作流程之團簇產生過程之一部分。舉例而言，核酸外切酶I催化連接螢光標籤28之尿嘧啶鹼基之切除。
在核鹼基裂解之後仍保持連接至凝膠物質24之品質控制追蹤劑22B之序列32為非反應性序列，且因此將不參與或干擾待進行或正進行之定序操作。
如上參考圖3C，品質控制追蹤劑22C包括連接至序列32'之可裂解核鹼基之螢光標籤28以及切除位點30。因此，此實施例追蹤劑22C中之螢光標籤28之裂解可經由酵素性裂解之上述實施例中之任一者實現。在一個實施例中，核酸外切酶可用於催化連接螢光標籤28之鹼基的切除。在另一實施例中，靶向位於切除位點30之核苷酸的酶可用於催化序列32'之部分31'的切除。在此等實施例中，酶可在起始定序之前引入，或可引入作為定序工作流程之團簇產生過程之一部分。
在核鹼基或部分31'裂解之後仍保持連接至凝膠物質24之品質控制追蹤劑22C之序列32'之部分29'為非反應性的，且因此不參與或干擾待進行或正進行之定序操作。
如上參考圖3D，品質控制追蹤劑22D包括切除位點30。因此，此實施例追蹤劑22D中之螢光標籤28之裂解可經由酵素性裂解之上述實施例中 之任一者實現。在此實施例中，在部分31"裂解之後仍保持連接至凝膠物質24之序列27'之部分29"為引子核苷酸序列20、20'，且因此不參與待進行或正進行之定序操作。
如上參考圖4，品質控制追蹤劑22E之各種實施例包括連接子分子34。此等實施例追蹤劑22E中之螢光標籤28之裂解可藉由使追蹤劑22E暴露於化學物質之經由化學裂解實現，該化學物質適用於裂解追蹤劑22E中存在之連接子分子34。參考圖4描述連接子分子34A、34B、34C、34D、34E、34F之各種實施例及相關裂解化學物質。在此等實施例中，裂解化學物質可在起始定序之前引入。
在化學裂解之後仍保持連接至凝膠物質24之品質控制追蹤劑22E之部分視進行化學裂解之核苷酸序列X而定。殘餘部分可包括非反應性核苷酸序列(其將不參與或干擾定序)或引子核苷酸序列(其將參與定序)。
儘管未示圖式於中，該方法之另一實施例包括將品質控制追蹤劑之實施例(例如22A、22B、22C及22E之一些實施例)與核苷酸序列20、20'以預先決定的比率併入接枝混合物中；使接枝混合物暴露於載體23上之孔16'中之凝膠物質24；培育接枝混合物，從而使品質控制追蹤劑22A、22B、22C及22E之一些實施例及引子核苷酸序列20、20'共接枝於凝膠物質24；使用螢光偵測品質控制追蹤劑；及至少部分地基於螢光及預先決定的比率，測定接枝於凝膠物質24之引子核苷酸序列20、20'之密度、或分布、或密度及分布。
可在螢光標籤28裂解之後進行多種定序方法或技術，包括通常稱為合成定序(sequencing-by-synthesis，SBS)、接合定序(sequencing-by-ligation)、焦磷酸測序等之技術。在此等技術中之任一者之情況下，因為凝膠物質24及連接引子核苷酸序列20、20'存在於位點16中且不存在於間隙區域18上，擴增將限於各種位點16。
簡言之，合成測序(SBS)反應可在諸如來自Illumina(San Diego，CA)之HiSeq®、HiSeqX®、MiSeq®或NextSeq®測序儀系統之系統上操作。將一組待定序之標靶DNA分子與結合之引子核苷酸序列20、20'(且不與任何非反應性核苷酸序列)雜交，且接著藉由橋式擴增或藉由動力排除擴增來擴增。變性使單股模板錨定於凝膠物質24，且產生幾百萬個雙股DNA之緻密團簇(亦即團簇產生)。接著進行定序反應。該資料與參比比對及相比，且鑑別定序差異。
為進一步說明本發明，本文給出一實施例。應瞭解，提供此實施例以達成說明之目的，且不視為限制本發明之範疇。
實施例
使用以下品質控制追蹤劑：5'-己炔-聚T尾-CATCTAGGCATCTAAGCATCAAUCTTACA[胺基C6 dT-Texas Red]-3'(SEQ.ID NO.25)
為評估用於接枝於基材表面上之P5/P7引子的品質控制之QC追蹤劑之實施例，P5/P7引子接枝混合在有10%之QC追蹤劑示蹤物及無QC追蹤劑示蹤物(對照)下製備。接枝有包括10%之QC追蹤劑示蹤物之P5/P7引子混合物之基材表面藉由量測追蹤劑螢光來評價。對照表面(無QC追蹤劑示蹤物)藉由基於雜交之TET QC來評價。TET為具有P5/P7引子之互補序列的染料標記之寡核苷酸。TET與表面上之P5/P7引子雜交，洗掉過量TET，且連接之染料的濃度藉由螢光偵測來量測。
圖6A及圖6B分別展示與互補含染料之寡核苷酸(TET QC)雜交之接枝對照基材表面之螢光影像，及包括QC追蹤劑之接枝基材表面之螢光影像。圖6C展示圖6A及圖6B之接枝表面之QC追蹤劑螢光相對於TET螢光的曲線。圖6A至圖6C中之資料展示QC追蹤劑之螢光強度與基材表面上之P5/P7密度 相關。
為評估標準團簇產生過程中接枝QC追蹤劑自流量槽表面之裂解，使用接枝有不同QC追蹤劑之流量槽。圖7A展示初始螢光影像，其展示在團簇產生之前接枝有QC追蹤劑之流量槽。圖7B展示成簇後螢光影像，其展示在團簇產生之後接枝有QC追蹤劑之流量槽。QC追蹤劑(在200nM)為：5'-己炔-聚T尾-CATCTAGGCATCTAAGCATCAAUCTTACA[胺基C6 dT-Texas Red]-3'(SEQ.ID NO.25)(200nM TRACER)
5'-己炔-聚T尾-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACA[胺基C6 dT-Texas Red]-3'(SEQ.ID NO.26)(200nM P5)
及5'-己炔-聚T尾-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACA[胺基C6 dT-Texas Red]-3'(SEQ.ID NO.26)其中校正之最終P5/P7比率為1：1。(200nM Pg(1：1))
參考圖7A之初始螢光影像，流量槽中之黑暗區域為來自QC追蹤劑之訊號；較淺區域為對照泳道(亦即不存在QC追蹤劑)。參考圖7B之成簇後螢光影像，來自QC追蹤劑之訊號大體上減小，指示在團簇形成期間QC追蹤劑發生裂解。
圖8A及圖8B分別展示圖7A及圖7B之接枝流量槽之接枝後QC追蹤劑螢光之曲線及成簇後QC追蹤劑螢光之曲線。資料展示團簇形成後之殘餘螢光最小。裂解效率在約97%至約99%之範圍內。
為評估QC追蹤劑接枝及後續裂解對下游定序量度之作用，使用圖7A及圖7B之流量槽進行定序。
圖9A及圖9B分別展示在一個定序週期(C1)之後紅色通道之讀取1(R1)螢光強度之曲線及讀取2(R2)螢光強度之曲線。資料展示紅色通道 中之C1強度最低限度地藉由使用QC追蹤劑影響。
圖10A及圖10B分別展示在一個定序週期(C1)之後綠色通道之讀取1(R1)螢光強度之曲線及讀取2(R2)螢光強度之曲線。資料展示綠色通道中之C1強度最低限度地藉由QC追蹤劑使用影響。
圖11A及圖11B分別展示參考基因組之讀取1(R1)序列比對之曲線及讀取2(R2)序列比對之曲線。資料展示使用QC追蹤劑對序列比對量度之影響較小或無影響。
圖12A及圖12B分別展示讀取1(R1)定序錯誤率之曲線及讀取2(R2)定序錯誤率之曲線。資料展示使用QC追蹤劑對定序錯誤率量度之影響較小或無影響。
額外註釋
應瞭解，前述概念(假設此類概念相互不一致)之所有組合預期為本文中所揭示之本發明主題之一部分。特定言之，在本發明結尾處出現之所主張主題的全部組合預期為本文所揭示之本發明主題之一部分。亦應瞭解，本文中明確採用的亦可出現在以引用的方式併入之任何揭示案中的術語應符合與本文所揭示之特定概念大部分一致的含義。
本說明書中引用之所有公開案、專利及專利申請案均以全文引用的方式併入本文中。
本說明書通篇提及之「一個實施例」、「另一實施例」、「一實施例」等意謂結合實施例描述之特定要素(例如特徵(feature)、結構及/或特徵(characteristic))包括於本文所述之至少一個實施例中，且可存在或可不存在於其他實施例中。另外，應瞭解，除非上下文另外明確規定，否則關於任何實施例所述之要素可在各種實施例中以任何適合的方式組合。
應瞭解，本文提供之範圍包括所陳述之範圍及所陳述範圍內之 任何值或子範圍。舉例而言，約10kDa至約1500kDa之範圍應解釋為不僅包括約10kDa至約1500kDa之明確敍述之界限，且亦包括個別值，諸如約18kDa、約325kDa、約425kDa、約1075.5kDa等，及子範圍，諸如約425kDa至約990kDa、約235kDa至約780KDa等。另外，當「約(about)」及/或「大體上(substantially)」用以描述值時，其意謂涵蓋所陳述值之較小變化(達至+/- 10%)。
儘管已詳細描述若干實施例，但應瞭解，所揭示之實施例可加以修改。因此，先前描述應被視為非限制性的。
<110> 美商伊路米納有限公司(Illumina,Inc.)
<120> 具有品質控制追蹤劑的陣列
<140> 106145312
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<160> 26
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子結合
<400> 1
Figure 106145312-A0305-02-0056-20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子結合
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (22)..(22)
<223> 8-側氧基-鳥嘌呤
<400> 2
Figure 106145312-A0305-02-0057-21
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
Figure 106145312-A0305-02-0057-22
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
Figure 106145312-A0305-02-0057-23
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
Figure 106145312-A0305-02-0058-25
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雜項特徵
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(20)
<223> 存在或不存在胸腺嘧啶鹼基
<400> 6
Figure 106145312-A0305-02-0058-24
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雜項特徵
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(20)
<223> 存在或不存在胸腺嘧啶鹼基
<400> 7
Figure 106145312-A0305-02-0059-26
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雜項特徵
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(20)
<223> 存在或不存在胸腺嘧啶鹼基
<400> 8
Figure 106145312-A0305-02-0059-27
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雜項特徵
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (29)..(29)
<223> 經由胺基修飾劑C6 dT連接子連接至腺嘌呤之紅色螢光染料
<400> 9
Figure 106145312-A0305-02-0059-28
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雜項特徵
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (27)..(27)
<223> 經由胺基修飾劑C6 dT連接子連接至腺嘌呤之紅色螢光染料
<400> 10
Figure 106145312-A0305-02-0060-30
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雜項特徵
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (26)..(26)
<223> 經由胺基修飾劑C6 dT連接子連接至胸腺嘧啶之紅色螢光染料
<400> 11
Figure 106145312-A0305-02-0060-29
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雜項特徵
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (29)..(29)
<223> 經由胺基修飾劑C6 dT連接子連接至腺嘌呤之
Figure 106145312-A0305-02-0061-73
螢光團
<400> 12
Figure 106145312-A0305-02-0061-31
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雜項特徵
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (27)..(27)
<223> 經由胺基修飾劑C6 dT連接子連接至腺嘌呤之
Figure 106145312-A0305-02-0061-74
螢光團
<400> 13
Figure 106145312-A0305-02-0061-32
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雜項特徵
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (26)..(26)
<223> 經由胺基修飾劑C6 dT連接子連接至胸腺嘧啶之
Figure 106145312-A0305-02-0062-75
螢光團
<400> 14
Figure 106145312-A0305-02-0062-33
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雜項特徵
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (33)..(33)
<223> 經由胺基修飾劑C6 dT連接子連接至腺嘌呤之
Figure 106145312-A0305-02-0062-76
螢光團
<400> 15
Figure 106145312-A0305-02-0062-34
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 16
Figure 106145312-A0305-02-0063-35
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
Figure 106145312-A0305-02-0063-36
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
Figure 106145312-A0305-02-0063-38
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
Figure 106145312-A0305-02-0064-40
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
Figure 106145312-A0305-02-0064-41
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雜項特徵
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (34)..(34)
<223> 經由胺基修飾劑C6 dT連接子連接至腺嘌呤之
Figure 106145312-A0305-02-0064-77
螢光團
<400> 21
Figure 106145312-A0305-02-0064-43
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雜項特徵
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (30)..(30)
<223> 經由胺基修飾劑C6 dT連接子連接至胞嘧啶之
Figure 106145312-A0305-02-0065-78
螢光團
<400> 22
Figure 106145312-A0305-02-0065-44
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雜項特徵
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (35)..(35)
<223> 經由胺基修飾劑C6 dT連接子連接至胞嘧啶之
Figure 106145312-A0305-02-0065-79
螢光團
<400> 23
Figure 106145312-A0305-02-0065-45
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雜項特徵
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (28)..(28)
<223> 經由胺基修飾劑C6 dT連接子連接至腺嘌呤之紅色螢光染料
<400> 24
Figure 106145312-A0305-02-0066-46
<210> 25
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雜項特徵
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(20)
<223> 存在或不存在胸腺嘧啶鹼基
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (49)..(49)
<223> 經由胺基修飾劑C6 dT連接子連接至腺嘌呤之紅色螢光染料
<400> 25
Figure 106145312-A0305-02-0066-47
<210> 26
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雜項特徵
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(20)
<223> 存在或不存在胸腺嘧啶鹼基
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (48)..(48)
<223> 經由胺基修飾劑C6 dT連接子連接至腺嘌呤之紅色螢光染料
<400> 26
Figure 106145312-A0305-02-0067-39
10‧‧‧陣列
12‧‧‧基材/載體
14‧‧‧線/流動通道
16‧‧‧位點
18‧‧‧間隙區域
20‧‧‧引子核苷酸序列
20'‧‧‧引子核苷酸序列
22‧‧‧品質控制追蹤劑
26‧‧‧孔口

Claims (56)

  1. 一種陣列，其包含：包含複數個離散孔之載體；安置於該複數個離散孔各者中之凝膠物質；及接枝於該複數個離散孔各者中之凝膠物質之品質控制追蹤劑；其中該品質控制追蹤劑包含(a)包含裂解位點之可裂解核苷酸序列及(b)可偵測標籤。
  2. 如請求項1所述之陣列，其中該可裂解核苷酸序列包含非反應性核苷酸序列。
  3. 如請求項1所述之陣列，其中該可裂解核苷酸序列包含具有第一末端及第二末端之接枝區，其中該第一末端接枝於該凝膠物質且該第二末端連接至可裂解區，該可裂解區連接至該可偵測標籤且包含該裂解位點。
  4. 如請求項3所述之陣列，其中該接枝區包含非反應性核苷酸序列。
  5. 如請求項3所述之陣列，其中該接枝區包含引子核苷酸序列。
  6. 如請求項3所述之陣列，其中該可偵測標籤在該裂解位點或在該可裂解區中遠離該裂解位點之位置連接至該可裂解核苷酸序列。
  7. 如請求項1所述之陣列，其中該裂解位點包含酵素性可裂解核鹼基。
  8. 如請求項7所述之陣列，其中該酵素性可裂解核鹼基包含切除位點。
  9. 如請求項7所述之陣列，其中該酵素性可裂解核鹼基容易藉由與醣苷酶及核酸內切酶或與核酸外切酶的反應而發生裂解。
  10. 如請求項9所述之陣列，其中該可裂解核苷酸序列在其5'端接枝 於該凝膠物質。
  11. 如請求項10所述之陣列，其中該可偵測標籤在該可裂解核苷酸序列之3'端處或接近該可裂解核苷酸序列之3'端處連接。
  12. 如請求項11所述之陣列，其中該可偵測標籤可藉由該品質控制追蹤劑與該核酸外切酶之反應而裂解。
  13. 如請求項11所述之陣列，其中該可偵測標籤可藉由該品質控制追蹤劑與該醣苷酶及該核酸內切酶之反應而裂解。
  14. 如請求項1所述之陣列，其中該裂解位點包含化學可裂解連接子。
  15. 如請求項14所述之陣列，其中該化學可裂解連接子包含鄰二醇、雙硫鍵、矽烷、偶氮苯、可光裂解基團或疊氮基。
  16. 如請求項1所述之陣列，其進一步包含未標記引子，該未標記引子包含接枝於該複數個離散孔各者中之凝膠物質的引子核苷酸序列，其中該品質控制追蹤劑及該未標記引子以預先決定的比率存在。
  17. 如請求項1所述之陣列，其中該凝膠物質包含式(I)之聚合物：
    Figure 106145312-A0305-02-0069-50
     其中：R1為H或視需要經取代之烷基；R A 選自由以下組成之群：疊氮基、視需要經取代之胺基、視需要經取代之 烯基、視需要經取代之腙、視需要經取代之肼、羧基、羥基、視需要經取代之四唑、視需要經取代之四
    Figure 106145312-A0305-02-0070-80
    、氧化腈、硝酮及硫醇；R5選自由以下組成之群：H及視需要經取代之烷基；各-(CH2)p-可視需要經取代；p為1至50範圍內之整數；n為1至50,000範圍內之整數；及m為1至100,000範圍內之整數。
  18. 如請求項17所述之陣列，其中該凝膠物質包含PAZAM。
  19. 如請求項1所述之陣列，其中該可偵測標籤為螢光標籤。
  20. 如請求項19所述之陣列，其中該螢光標籤選自由以下組成之群：磺醯氯染料、花青染料、紅色波長染料、螢光染料、螢光素之衍生物、
    Figure 106145312-A0305-02-0070-81
    Figure 106145312-A0305-02-0070-82
    螢光團及吲哚羰花青染料(indocarbocyanine dye)。
  21. 一種測定接枝於載體之引子核苷酸序列之密度、分布或密度及分布的方法，其包含：提供包含複數個離散孔之載體，及安置於該複數個離散孔各者中之凝膠物質，及品質控制追蹤劑，及接枝於該複數個離散孔各者中之凝膠物質的引子核苷酸序列；其中該品質控制追蹤劑包含(a)包含裂解位點之可裂解核苷酸序列及(b)可偵測標籤；偵測來自該可偵測標籤之訊號；至少部分地基於來自該可偵測標籤之訊號，測定該品質控制追蹤劑之密度及/或分布；及至少部分地基於該品質控制追蹤劑之測定的密度及/或分布，測定該接枝引子核苷酸序列之密度及/或分布。
  22. 如請求項21所述之方法，其進一步包含將該品質控制追蹤劑接枝於該凝膠物質。
  23. 如請求項22所述之方法，其中在該品質控制追蹤劑接枝之前或同時且在該偵測步驟之前，將該引子核苷酸序列接枝於該凝膠物質。
  24. 如請求項21所述之方法，其中該品質控制追蹤劑包含非反應性核苷酸序列。
  25. 如請求項21所述之方法，其中該品質控制追蹤劑包含該引子核苷酸序列，且該品質控制追蹤劑之接枝亦用以將該引子核苷酸序列接枝於該凝膠物質。
  26. 如請求項21所述之方法，其中該可裂解核苷酸序列包含具有第一末端及第二末端之接枝區，其中該第一末端接枝於該凝膠物質且該第二末端連接至包含該裂解位點之可裂解區，其中該接枝區之第二末端連接至該可裂解區之裂解位點。
  27. 如請求項26所述之方法，其中該接枝區包含非反應性核苷酸序列。
  28. 如請求項26所述之方法，其中該接枝區包含引子核苷酸序列。
  29. 如請求項26所述之方法，其中該可偵測標籤在該裂解位點或在該可裂解區中遠離該裂解位點之位置連接至該可裂解核苷酸序列。
  30. 如請求項21所述之方法，其中該品質控制追蹤劑及該引子核苷酸序列以預先決定的比率接枝於該凝膠物質且該引子核苷酸序列之密度及/或分布的測定是基於所偵測的訊號及該預先決定的比率。
  31. 如請求項21所述之方法，其進一步包含藉由在該裂解位點之裂解反應自該品質控制追蹤劑移除該可偵測標籤。
  32. 如請求項31所述之方法，其中該移除藉由酵素性裂解或化學裂 解實現。
  33. 如請求項21所述之方法，其中該可偵測標籤為螢光標籤且所偵測的訊號為螢光。
  34. 一種測定接枝於凝膠物質之引子核苷酸序列之密度、分布或密度及分布的方法，其包含：將品質控制追蹤劑接枝於載體上之孔中的凝膠物質，該品質控制追蹤劑選自由以下組成之群：在3'端用螢光標籤標記之可裂解核苷酸序列；及將螢光標籤連接至可裂解核鹼基之非反應性核苷酸序列；使用螢光偵測該品質控制追蹤劑；及至少部分地基於該螢光，測定接枝於該凝膠物質之引子核苷酸序列的密度、或分布、或密度及分布。
  35. 如請求項34所述之方法，其中該品質控制追蹤劑為該可裂解核苷酸序列，且其中該可裂解核苷酸序列為該引子核苷酸序列。
  36. 如請求項35所述之方法，其進一步包含在測定該引子核苷酸序列之密度、或分布、或密度及分布之後，自該引子核苷酸序列裂解該螢光標籤。
  37. 如請求項35所述之方法，其中：該引子核苷酸序列未標記；在該偵測之前，該方法進一步包含將該引子核苷酸序列接枝於該凝膠物質，其中該可裂解核苷酸序列及該引子核苷酸序列以預先決定的比率存在；及該引子核苷酸序列之密度、或分布、或密度及分布之測定是基於該螢光及該預先決定的比率。
  38. 如請求項37所述之方法，其進一步包含自該可裂解核苷酸序列 裂解該螢光標籤，其中該裂解藉由酵素性裂解或化學裂解實現。
  39. 如請求項34所述之方法，其中：該品質控制追蹤劑為該非反應性核苷酸序列；該引子核苷酸序列未標記；在該偵測之前，該方法進一步包含將該引子核苷酸序列接枝於該凝膠物質，其中該非反應性核苷酸序列及該引子核苷酸序列以預先決定的比率存在；以及該引子核苷酸序列之密度、或分布、或密度及分布之測定是基於該螢光及該預先決定的比率。
  40. 如請求項39所述之方法，其進一步包含使用核酸外切酶自該非反應性核苷酸序列之可裂解核鹼基移除該螢光標籤。
  41. 一種將品質控制追蹤劑及引子核苷酸序列共接枝於陣列之方法，其包含：將該品質控制追蹤劑及該引子核苷酸序列以預先決定的比率組合以形成接枝混合物；其中該品質控制追蹤劑包含(a)包含裂解位點之可裂解核苷酸序列及(b)可偵測標籤；使該接枝混合物暴露於載體上之孔中的凝膠物質；及培育該接枝混合物及該凝膠物質，從而將該品質控制追蹤劑及該引子核苷酸序列共接枝於該凝膠物質。
  42. 如請求項41所述之方法，其中該品質控制追蹤劑為：在3'端用螢光標籤標記之可裂解核苷酸序列；或將螢光標籤連接至可裂解核鹼基之非反應性核苷酸序列。
  43. 如請求項41所述之方法，其進一步包含： 藉由偵測來自該可偵測標籤之訊號來偵測該接枝品質控制追蹤劑；及至少部分地基於所偵測的訊號及該預先決定的比率，測定接枝於該凝膠物質之引子核苷酸序列之密度、或分布、或密度及分布。
  44. 如請求項41所述之方法，其進一步包含經由在該裂解位點的酵素性裂解或化學裂解自該可裂解核苷酸序列移除該可偵測標籤。
  45. 如請求項41所述之方法，其中該可裂解核苷酸序列包括連接該可偵測標籤之連接子分子。
  46. 如請求項45所述之方法，其中該連接子分子包含二醇、雙硫鍵、矽烷、偶氮苯、可光裂解基團或疊氮基。
  47. 如請求項41所述之方法，其中該裂解位點包含可裂解核鹼基。
  48. 如請求項47所述之方法，其進一步包含藉由該可裂解核鹼基與醣苷酶及核酸內切酶或與核酸外切酶之反應移除該可偵測標籤。
  49. 如請求項41所述之方法，其中該可偵測標籤為螢光標籤。
  50. 一種將品質控制追蹤劑接枝於陣列之方法，其包含將品質控制追蹤劑接枝於載體上之孔中的凝膠物質；其中該品質控制追蹤劑包含(a)包含裂解位點之可裂解核苷酸序列及(b)可偵測標籤；及其中該可裂解核苷酸序列包含具有第一末端及第二末端之接枝區，其中該第一末端接枝於該凝膠物質且該第二末端連接至可裂解區，該可裂解區連接至該可偵測標籤且包含該裂解位點。
  51. 如請求項50所述之方法，其中該接枝區包含引子核苷酸序列。
  52. 如請求項51所述之方法，其進一步包含在該裂解位點裂解該品質控制追蹤劑，從而移除該可偵測標籤且提供接枝於該凝膠物質之未標記引子核苷酸序列。
  53. 如請求項50所述之方法，其中該接枝區包含非反應性核苷酸序列。
  54. 如請求項53所述之方法，其進一步包含將包含引子核苷酸序列之引子以與該品質控制追蹤劑預先決定的比率接枝於該凝膠物質。
  55. 如請求項54所述之方法，其進一步包含藉由在該裂解位點之裂解反應自該品質控制追蹤劑移除該可偵測標籤。
  56. 一種接枝混合組成物，其包含：(1)包含引子核苷酸序列之引子，及(2)品質控制追蹤劑，其中該品質控制追蹤劑包含(a)包含裂解位點之可裂解核苷酸序列及(b)可偵測標籤；及其中該引子及該品質控制追蹤劑以預先決定的比率存在於該組成物中。
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