TWI777347B - 非纖維形式薄膜與細胞層片 - Google Patents

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Abstract

提供一種非纖維形式薄膜，其成分包括一膠原蛋白以及一聚酯類高分子。該聚酯類高分子於該非纖維形式薄膜中的含量為1-60 wt%。又該非纖維形式薄膜於一水性液體中具有1-200 μm/小時的膨脹速率或0.1-2%/小時的單位時間膨脹比率。

Description

非纖維形式薄膜與細胞層片
本揭露係關於一種薄膜，且特別關於一種可具有動態尺寸變化之非纖維型式薄膜，以及由細胞貼附於此薄膜生長而成的細胞層片。
再生醫學細胞治療的主要目的在於進行替換、修復、改善或再生人體的各種組織和器官。於傳統的再生醫學中，通常將細胞懸浮液或其與細胞複合載體支架的組合投遞細胞至患部。儘管傳統的再生醫學細胞治療方式雖然已經大幅促進了再生醫學領域的發展，然而，細胞懸浮液的獲得，往往需藉由胰蛋白酶(trypsin)來使細胞懸浮，而此步驟通常會破壞細胞的表面蛋白質。一旦細胞表面蛋白質遭到破壞，細胞功能就會受到影響。當細胞表面蛋白質遭到破壞後，細胞-細胞間以及細胞-細胞外間質(extracellular matrix, ECM)間之作用力即會降低。此細胞間之相互作用，以及細胞外基質的生成，對於維持組織功能是必不可少的功用。使用胰蛋白酶來收穫細胞懸浮液，對於細胞的黏附與增生能力皆會產生負面影響，導致注射細胞懸浮液後，細胞於植入部位分佈不均勻或是修復效率降低，甚至導致移植部位發炎等不良反應。
由於細胞層片之製作不須經蛋白水解酶處理，且於細胞層片上細胞間的相互作用和細胞片的結構皆得到了良好的保存，因此以細胞層片進行細胞治療組織再生的技術成為近幾年來逐漸崛起的細胞投遞方式。又細胞層片技術，具有較高的細胞濃度與更均勻的細胞分佈，從而提高了組織再生能力。除此之外，在細胞層片之製作中，細胞受到培養基質及基材等刺激，可誘導成具不同特性之細胞。此種現象在具有替換或恢復受損組織功能的間質幹細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)尤其明顯。而於細胞層片建構初期引導幹細胞趨向特定功能的分化細胞，並維持這些細胞特徵，為當前最具挑戰性之細胞培養程序。
目前主要利用兩種方式達到誘導細胞分化，其一為藉由化學刺激來誘導細胞分化，而另一種則為利用物理性的機械力刺激或利用細胞貼附之基材的表面結構的刺激來誘導細胞分化。由於化學刺激因所使用的配方濃度梯度與作用時間難以控制，因此以物理特性的機械刺激及基材表面結構製作的仿生環境，具有較佳之控制效果，並且應用的範圍更大。
機械刺激與基材表面結構刺激對間質幹細胞的分化具有決定性的影響。因此，為優化及引導幹細胞預分化至特定組織的細胞特徵，目前亟需一種新穎之基材，其可同時提供機械刺激與基材表面結構刺激以誘導細胞分化。
本揭露提供一種非纖維形式薄膜，其成分包括：一膠原蛋白以及一聚酯類高分子。該聚酯類高分子於該非纖維形式薄膜中的含量為1-60 wt%。又該非纖維形式薄膜於一水性液體中具有1-200 μm/小時的膨脹速率或0.1-2%/小時的單位時間膨脹比率。
本揭露也提供另一種非纖維形式薄膜，係由一方法所製備。該方法包括：(a) 配製一混合溶液；以及(b) 將該混合溶液進行乾燥以形成一薄膜。該混合溶液之溶質，包括：一膠原蛋白以及一聚酯類高分子，其中該聚酯類高分子於該溶質中的含量為0-60 wt%。該混合溶液之溶質溶劑包括，一全氟化碳溶劑。又，該薄膜於一水性液體中具有1-200 μm/小時的膨脹速率或0.1-2%/小時的單位時間膨脹比率。
本揭露還提供一種細胞層片，包括：任何上述非纖維形式薄膜；以及至少一細胞層於該非纖維形式薄膜上。該細胞層係由複數個細胞所構成，且該複數個細胞係以相同方向排列。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：
本揭露可提供一種非纖維形式薄膜，其可為一生物可分解之薄膜，且此薄膜在一水性液體中，可隨著時間而具有尺寸之動態變化。上述水性液體並無特殊限制，只要不對薄膜產生負面影響及可。水性液體的例子，可包括，但不限於，水、緩衝溶液、培養液等。
上述本揭露之非纖維形式薄膜可具有細胞承載能力，並可應用於細胞培養。而在上述本揭露之非纖維形式薄膜應於細胞培養時，由於在細胞培養液中，其尺寸會具有動態變化，因此在細胞培養期間，其可持續提供貼附於其上生長之細胞一物理性機械力，如一拉伸之應力，及細胞貼附之表面之結構變化的刺激，而無須對薄膜及/或細胞提供外加之機械力及/或化學刺激，即可使貼附於其上之細胞以相同方生長，並可促進細胞分化。
而上述本揭露之非纖維形式薄膜可由一方法所製備，而此方法包括，但不限於，以下步驟。
首先，配製一混合溶液。
所配製之混合溶液的溶質濃度，並無特別限制，可依照需要進行調整，只要不會對形成薄膜有負面影響即可。例如，所配製之混合溶液的溶質濃度，可依照配製混合溶液當時之環境（如環境之溫度、濕度、壓力等）、所採用之溶劑的種類、後續薄膜形成時所處之環境（如環境之溫度、濕度、壓力等）、所欲採用之成膜方式等進行調整，但不限於此。例如，溶質於混合溶液中的濃度可為約0.5-20 wt%，如約0.5 wt%、約0.8 wt%、約1 wt%、約3 wt%、約5 wt%、6 wt%、約7 wt%、約8 wt%、約9 wt%、約10 wt%、約11 wt%、約12 wt%、約13 wt%、14 wt%、15 wt%、16 wt%、17 wt%、18 wt%、19 wt%、20 wt%，但不限於此。
又，上述混合溶液的溶質，可包括，但不限於，一膠原蛋白以及一聚酯類高分子。
而聚酯類高分子於上述溶質中的含量可為約1-60 wt%，例如，約1-55 wt%、約1-50 wt%、約10-50 wt%、約5 wt%、約10 wt%、約15 wt%、約20 wt%、約25  wt%、約30  wt%、約35  wt%、約40  wt%、約45  wt%、約50  wt%、約55  wt%、約60  wt%等，但不限於此。
而於上述溶質中，膠原蛋白與聚酯類高分子之重量比可為約0.6-99:1，例如，約95:5、約90:10、約85:15、約80:20、約75:25、約70:30、約65:35、約60:40、約55:45、約50:50、約45:55、約40:60等，但不限於此。
在一實施例中，上述溶質可由膠原蛋白與聚酯類高分子所組成，而膠原蛋白與聚酯類高分子之重量比可為約0.6-99:1，例如，約95:5、約90:10、約85:15、約80:20、約75:25、約70:30、約65:35、約60:40、約55:45、約50:50、約45:55、約40:60等，但不限於此。
上述溶質中之膠原蛋白並無特別限制，其可包括任何類型之膠原蛋白。上述膠原蛋白的例子，可包括以下之至少一者：第一型膠原蛋白(type I collagen)、第二型膠原蛋白(type II collagen)、第三型膠原蛋白(type III collagen)等，但不限於此。在一實施例中，上述膠原蛋白為第一型膠原蛋白。
上述溶質中之聚酯類高分子的分子量，可依據需要而定，也無特別限制。例如，上述聚酯類高分子的分子量可為約50,000-1,500,000 Da，如中分子量（約50,000-200,000 Da）、高分子（約800,000-1,500,000 Da）、約50,000 Da、約60,000 Da、約70,000 Da、約80,000 Da、約90,000 Da、約100,000  Da、約150,000  Da、約200,000 Da、約250,000  Da、約300,000 Da、約400,000、約500,000Da、約800,000Da、約1,000,000Da、約1,500,000 Da等，但不限於此。在一實施例中，上述聚酯類高分子的分子量可為約80,000 Da。
又，上述溶質中之聚酯類高分子的固有黏度，也可依據需要而定，而無特別限制。例如，上述聚酯類高分子的固有黏度可為約0.15-7 dl/g，例如約0.15-0.3 dl/g、約0.35-0.45 dl/g、約0.8-1.2 dl/g、約1.3-1.6 dl/g、約1.6-2.4 dl/g、約2.0-2.8 dl/g、約 3.5-5.5 dl/g。在一實施例中，上述聚酯類高分子的固有黏度可為約4.5dl/g。
又，上述溶質中之聚酯類高分子的種類也無特別限制，只要其為生物可分解的即可。上述聚酯類高分子的例子，可包括，但不限於，聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚甘醇酸(polyglycolic acid,PGA)、聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutyrate,PHB)、聚羥基戊酸酯(polyhydroxyvalerate,PHV)等，或上述之任意組合。在一實施例中，上述溶質中之聚酯類高分子可為聚己內酯。在另一實施例中，上述溶質中之聚酯類高分子可為聚乳酸。
而上述混合溶液之溶劑，可包括一全氟化碳溶劑，但不限於此。上述全氟化碳溶劑的例子，可包括，但不限於，六氟異丙醇(Hexafluoroisopropanol)、六氟丙酮(Hexafluoroacetone)、1,1,1-三氯三氟丙酮(1,1,1-Trichlorotrifluoroacetone)、三氟乙酸(Trifluoroacetic acid)、全氟過氫菲(Perfluoroperhydrophenanthrene)、全氟甲基環己烷(Perfluoro(methylcyclohexane)等，或上述之任意組合。上述混合溶液之溶劑可作為上述溶質中之膠原蛋白與聚酯類高分子的共溶劑，且可使膠原蛋白與聚酯類高分子於上述混合溶液中均勻分布。又，上述溶劑可使膠原蛋白於上述混合溶液與所形成之薄膜中，同時存在天然形式(native form)與變性形式(denatured form)。在一實施例中，上述混合溶液之溶劑為六氟異丙醇。
接著，於上述混合溶液配製完成後，將上述混合溶液進行乾燥以形成一薄膜，而獲得上述本揭露之非纖維形式薄膜。
將上述混合溶液進行乾燥以形成一薄膜之方式並無特別限制，只要上述混合溶液得一形成一薄膜形態即可。在一實施例中，可將上述混合溶液倒於一模具中，之後乾燥以形成薄膜。在另一實施例中，可將上述混合溶液倒於一平板上，再利用刮刀進行刮膜，之後乾燥以形成薄膜。
在一實施例中，所獲得之非纖維形式薄膜可為多孔薄膜。此實施例中，聚酯類高分子於上述溶質中的含量可為約45-60 wt%，例如，約45 wt%、50 wt%、約55 wt%、約60 wt%等，但不限於此。又於此實施例中，多孔薄膜之孔洞的孔洞尺寸可為約1-50 μm，如約5-50 μm、約10-50 μm、約15-50 μm、約1-45 μm、約1-40 μm、約1-30 μm、約1 μm、約5 μm、約10 μm、約15 μm、約20 μm、約25 μm、約30 μm、約35 μm、約40 μm、約45 μm、約50 μm，但不限於此。
於上述所獲得之非纖維形式薄膜可為多孔薄膜的實施例中，在上述製備本揭露之非纖維形式薄膜的方法中，所配製之混合溶液的溶質，可由膠原蛋白與聚酯類高分子所組成，而聚酯類高分子可包括以下之至少一者：聚己內酯、聚乳酸、聚甘醇酸、聚羥基丁酸酯、聚羥基戊酸酯等，但不限於此。而在一特定實施例中，在所獲得之非纖維形式薄膜為多孔薄膜的情況下，於上述製備本揭露之非纖維形式薄膜的方法中，所配製之混合溶液的溶質，係由膠原蛋白與聚酯類高分子所組成，而聚酯類高分子為聚己內酯。又於此特定實施例中，聚己內酯的分子量可為約50,000-200,000 Da，例如約80,000 Da，但不限於此。
在另一實施例中，所獲得之非纖維形式薄膜可為無孔薄膜。此實施例中，聚酯類高分子於上述溶質中的含量可為約1 wt%以上但低於45 wt%，例如，約1-40 wt%、約5-40 wt%、約10-40 wt%、約15-35 wt%、約20-30 wt%、約1 wt%、約3 wt%、約5 wt%、約10 wt%、約15 wt%、約20 wt%、約25 wt%、約30 wt%、約35 wt%、約40 wt%、約44 wt%等，但不限於此。
於上述所獲得之非纖維形式薄膜可為無孔薄膜的實施例中，在上述製備本揭露之非纖維形式薄膜的方法中，所配製之混合溶液的溶質，可由膠原蛋白與聚酯類高分子所組成，而聚酯類高分子可包括以下之至少一者：聚己內酯、聚乳酸、聚甘醇酸、聚羥基丁酸酯、聚羥基戊酸酯等，但不限於此。而在一特定實施例中，在所獲得之非纖維形式薄膜為無孔薄膜的情況下，於上述製備本揭露之非纖維形式薄膜的方法中，所配製之混合溶液的溶質，係由膠原蛋白與聚酯類高分子所組成，而聚酯類高分子為聚乳酸。又於此特定實施例中，聚乳酸的固有黏度可為約0.15-7.0 dl/g，例如約4.5 dl/g，但不限於此。
另外，在一實施例中，上述製備本揭露之非纖維形式薄膜的方法，除了上述配製一混合溶液的步驟與將上述混合溶液進行乾燥以形成一薄膜的步驟之外，也可更包括在上述混合溶液進行乾燥以形成一薄膜的步驟之後，將所形成之薄膜進行一交聯處理，以形成一經交聯之非纖維形式薄膜。
上述針對薄膜之交聯處理的進行時間，並無特殊限定，可視需要進行調整。例如，針對薄膜之交聯處理的進行時間，可依照進行交聯處理當時之環境（如環境之溫度、濕度、壓力等）、薄膜之構成成分及/或成分的含量、所採用之交聯方式或交聯劑、所欲獲得之薄膜強度、薄膜之用途等進行調整，但不限於此。例如，針對薄膜之交聯處理的進行時間，可為約0.1-10小時，例如，約0.1小時、約0.5小時、約1小時、約1.5小時、約2小時、約2.5小時、約3小時、約5小時、約6小時、約8小時、約10小時等，但不限於此。
此外，上述針對薄膜之交聯處理可以一交聯劑進行，但不限於此。上述交聯劑的例子，可包括，甲醛(formaldehyde)、戊二醛(glutaraldehyde)、乙二醛(glyoxal)、丙二醛(malondialdehyde)、琥珀醛(succinyl dialdehyde)、苯二甲醛(phthalaldehyde)、雙醛澱粉(dialdehyde starch)、聚丙烯醛(polyacrolein)、聚甲基丙烯醛(polymethacrolein)，或上述之任意組合，但不限於此。
在一實施例中，上述針對薄膜之交聯處理可以甲醛，例如10%甲醛蒸氣進行，而針對薄膜之交聯處理的進行時間可為約0.1-10小時，例如，約0.1小時、約0.5小時、約1小時、約1.5小時、約2小時、約2.5小時、約3小時、約5小時、約6小時、約8小時、約10小時等，但不限於此。
依據前方所述可知，上述用於製備本揭露的非纖維形式薄膜之方法中，混合溶液之溶劑可使膠原蛋白於混合溶液與所形成之薄膜中，同時存在天然形式與變性形式。而由於所形成之薄膜中，同時存在天然膠原蛋白與變性膠原蛋白，因此當本揭露之非纖維形式薄膜接觸一液體時，薄膜中之天然膠原蛋白及變性膠原蛋白分子因水合作用力的影響，而與聚酯類高分子之間的作用力產生彼此競爭效應，而使薄膜具有動態膨脹或拉伸的物理特性。
亦即，如同前方所述，由上方所述之任何方法所製備之本揭露的非纖維形式薄膜在一液體中，可隨著時間而具有尺寸之動態變化。
而本揭露的非纖維形式薄膜在一液體中之尺寸動態變化程度，如膨脹或拉伸程度，可藉由在上述用於製備本揭露的非纖維形式薄膜之方法中，針對混合溶液之溶質，選擇不同之構成成分及/或成分含量來調整、或者在薄膜經過交聯處理的情況下，藉由調整交聯處理之時間來調整等，但不限於此。例如，可藉由調整混合溶液之溶質中的膠原蛋白與聚酯類高分子的重量比例、可藉由調整混合溶液之溶質中之聚酯類高分子之種類與分子量/固有黏度、及/或在薄膜經過交聯處理的情況下，可藉由調整交聯處理之時間來調整本揭露的非纖維形式薄膜在一液體中之尺寸動態變化程度。
在一實施例中，由上方所述之任何方法所製備之本揭露的非纖維形式薄膜，於一水性液體中可具有約1-200 μm /小時的膨脹速率，例如，約5-200 μm/小時、約10-200 μm/小時、約10-150 μm/小時、約1 μm/小時、約2 μm/小時、約5 μm/小時、約10 μm/小時、約11 μm/小時、約100 μm/小時、約103 μm/小時、約110 μm /小時、約120 μm/小時、約130 μm/小時、約140 μm/小時、約148μm/小時、約150 μm/小時、約200 μm/小時等，但不限於此。在另一實施例中，上述非纖維形式薄膜於一水性液體中可具有約0.1-2%/小時的單位時間膨脹比率，約0.1-1.5%/小時、約0.1-1%/小時、約0.1-0.5%/小時、約0.1-0.2%/小時、約0.2-2%/小時、約0.5-2%/小時、約0.1-2%/小時、約0.15-2%/小時、約0.1%/小時、約0.2%/小時、約0.5%/小時、約1%/小時、約1.5%/小時、約2%/小時，但不限於此。
而根據前方內容，本揭露也可提供另一種非纖維形式薄膜。此非纖維形式薄膜同樣可為一生物可分解之薄膜，且在一水性液體中，可隨著時間而具有尺寸之動態變化。又，此非纖維形式薄膜可具有細胞承載能力，並可應用於細胞培養，並在應於細胞培養時，由於可持續提供貼附於其上生長之細胞一物理性機械力，如一拉伸之應力，而可使貼附於其上之細胞以相同方生長，並可促進細胞分化。上述水性液體並無特殊限制，只要不對薄膜產生負面影響及可。水性液體的例子，可包括，但不限於，水、緩衝溶液、培養液等。
上述非纖維形式薄膜於水性液體中可具有約1-200 μm /小時的膨脹速率，例如，約5-200 μm/小時、約10-200 μm/小時、約10-150 μm/小時、約1 μm/小時、約2 μm/小時、約5 μm/小時、約10 μm/小時、約11 μm/小時、約100 μm/小時、約103 μm/小時、約110 μm/小時、約120 μm/小時、約130 μm/小時、約140 μm/小時、約148 μm/小時、約150 μm/小時、約200 μm/小時等，但不限於此。
或者，上述非纖維形式薄膜於水性液體中可具有約0.1-2%/小時的單位時間膨脹比率，例如，約0.1-1.5%/小時、約0.1-1%/小時、約0.1-0.5%/小時、約0.1-0.2%/小時、約0.2-2%/小時、約0.5-2%/小時、約0.1-2%/小時、約0.15-2%/小時、約0.1%/小時、約0.2%/小時、約0.5%/小時、約1%/小時、約1.5%/小時、約2%/小時，但不限於此。
而上述非纖維形式薄膜之成分可包括，但不限於，一膠原蛋白以及一聚酯類高分子。又，聚酯類高分子於上述非纖維形式薄膜中的含量可為約1-60 wt%，例如，約1-55 wt%、約1-50 wt%、10-50 wt%、約5 wt%、約10 wt%、約15 wt%、約20 wt%、約25  wt%、約30  wt%、約35  wt%、約40  wt%、約45  wt%、約50  wt%、約55  wt%、約60  wt%等，但不限於此。在一實施例中，上述非纖維形式薄膜中之膠原蛋白可同時具有天然形式與變性形式。
而於上述非纖維形式薄膜中，膠原蛋白與聚酯類高分子之重量比可為約0.6-99:1，例如，約95:5、約90:10、約85:15、約80:20、約75:25、約70:30、約65:35、約60:40、約55:45、約50:50、約45:55、約40:60等，但不限於此。在一實施例中，上述非纖維形式薄膜之成分可由膠原蛋白與聚酯類高分子所組成，而膠原蛋白與聚酯類高分子之重量比可為約0.6-99:1，例如，約95:5、約90:10、約85:15、約80:20、約75:25、約70:30、約65:35、約60:40、約55:45、約50:50、約45:55、約40:60等，但不限於此。
上述非纖維形式薄膜之成分中之膠原蛋白並無特別限制，其可包括任何類型之膠原蛋白。在一實施例中，上述膠原蛋白的例子，可包括，但不限於以下之至少一者：第一型膠原蛋白、第二型膠原蛋白、第三型膠原蛋白等。在一特定實施例中，上述膠原蛋白為第一型膠原蛋白。
上述非纖維形式薄膜之成分中之聚酯類高分子的分子量，可依據需要而定，也無特別限制。例如，上述聚酯類高分子的分子量可為約50,000-1,500,000 Da，如中分子量（約50,000-200,000 Da）、高分子（約800,000-1,500,000 Da）、約50,000 Da、約60,000 Da、約70,000 Da、約80,000 Da、約90,000 Da、約100,000  Da、約150,000  Da、約200,000 Da、約250,000  Da、約300,000 Da、約400,000、約500,000Da、約800,000Da、約1,000,000Da、約1,500,000 Da等，但不限於此。在一實施例中，上述聚酯類高分子的分子量可為約80,000 Da。
又，上述非纖維形式薄膜之成分中之聚酯類高分子的固有黏度可為約0.15-7 dl/g，例如約0.15-0.3 dl/g、約0.35-0.45 dl/g、約0.8-1.2 dl/g、約1.3-1.6 dl/g、約1.6-2.4 dl/g、約2.0-2.8 dl/g、約 3.5-5.5 dl/g。在一實施例中，上述聚酯類高分子的固有黏度可為約4.5 dl/g。
又，上述非纖維形式薄膜之成分中之聚酯類高分子的種類也無特別限制，只要其為生物可分解的即可。上述聚酯類高分子的例子，可包括，聚己內酯、聚乳酸、聚甘醇酸、聚羥基丁酸酯、聚羥基戊酸酯等，或上述之任意組合，但不限於此。在一實施例中，上述非纖維形式薄膜之成分中之聚酯類高分子可為聚己內酯。在另一實施例中，上述非纖維形式薄膜之成分中之聚酯類高分子可為聚乳酸。
在一實施例中，上述非纖維形式薄膜可為多孔薄膜。此實施例中，聚酯類高分子於上述非纖維形式薄膜中的含量可為約45-60 wt%，例如，約45 wt%、50 wt%、約55 wt%、約60 wt%等，但不限於此。又於此實施例中，多孔薄膜之孔洞的孔洞尺寸可為約1-50 μm，如約5-50 μm、約10-50 μm、約15-50 μm、約1-45 μm、約1-40 μm、約1-30 μm、約1 μm、約5 μm、約10 μm、約15 μm、約20 μm、約25 μm、約30 μm、約35 μm、約40 μm、約45 μm、約50 μm，但不限於此。
在上述非纖維形式薄膜可為多孔薄膜的實施例中，非纖維形式薄膜的成分，可由膠原蛋白與聚酯類高分子所組成，而聚酯類高分子可包括以下之至少一者：聚己內酯、聚乳酸、聚甘醇酸、聚羥基丁酸酯、聚羥基戊酸酯等，但不限於此。而在一特定實施例中，在上述非纖維形式薄膜為多孔薄膜的情況下，非纖維形式薄膜的成分，係由膠原蛋白與聚酯類高分子所組成，而聚酯類高分子為聚己內酯。又於此特定實施例中，聚己內酯的分子量可為約50,000-200,000 Da，例如約80,000 Da，但不限於此。
在另一實施例中，上述非纖維形式薄膜可為無孔薄膜。此實施例中，聚酯類高分子於上述非纖維形式薄膜中的含量可為約1 wt%以上但低於45 wt%，例如，約1-40 wt%、約5-40 wt%、約10-40 wt%、約15-35 wt%、約20-30 wt%、約1 wt%、約3 wt%、約5 wt%、約10 wt%、約15 wt%、約20 wt%、約25 wt%、約30 wt%、約35 wt%、約40 wt%、約44 wt%等，但不限於此。
在上述非纖維形式薄膜可為無孔薄膜的實施例中，非纖維形式薄膜的成分，可由膠原蛋白與聚酯類高分子所組成，而聚酯類高分子可包括以下之至少一者：聚己內酯、聚乳酸、聚甘醇酸、聚羥基丁酸酯、聚羥基戊酸酯等，但不限於此。而在一特定實施例中，在上述非纖維形式薄膜為無孔薄膜的情況下，非纖維形式薄膜的成分，係由膠原蛋白與聚酯類高分子所組成，而聚酯類高分子為聚乳酸。又於此特定實施例中，聚乳酸的固有黏度可為約0.15-7.0 dl/g，例如約4.5 dl/g，但不限於此。
另外，在一實施例中，上述非纖維形式薄膜可為一未經交聯之薄膜，或可為一經交聯之薄膜。
而上述經交聯之薄膜，可經過一交聯處理。交聯處理的進行時間，並無特殊限定，可視需要進行調整。例如，針對薄膜之交聯處理的進行時間，可依照進行交聯處理當時之環境（如環境之溫度、濕度、壓力等）、薄膜之構成成分及/或成分的含量、所採用之交聯方式或交聯劑、所欲獲得之薄膜強度、薄膜之用途等進行調整，但不限於此。例如，針對薄膜之交聯處理的進行時間，可為約0.1-10小時，例如，約0.1小時、約0.5小時、約1小時、約1.5小時、約2小時、約2.5小時、約3小時、約5小時、約6小時、約8小時、約10小時等，但不限於此。
此外，上述交聯處理可以一交聯劑進行，但不限於此。上述交聯劑的例子，可包括，甲醛(formaldehyde)、戊二醛(glutaraldehyde)、乙二醛(glyoxal)、丙二醛(malondialdehyde)、琥珀醛(succinyl dialdehyde)、苯二甲醛(phthalaldehyde)、雙醛澱粉(dialdehyde starch)、聚丙烯醛(polyacrolein)、聚甲基丙烯醛(polymethacrolein)等，或上述之任意組合，但不限於此。
在一實施例中，上述交聯處理可以甲醛，例如10%甲醛蒸氣進行，而針對薄膜之交聯處理的進行時間可為約0.1-10小時，例如，約0.1小時、約0.5小時、約1小時、約1.5小時、約2小時、約2.5小時、約3小時、約5小時、約6小時、約8小時、約10小時等，但不限於此。
此外，本揭露也可提供一種培養細胞的方法，其可包括，但不限於，於一培養液中將一細胞培養於上述任何本揭露之非纖維形式薄膜上。
由於上述任何本揭露之非纖維形式薄膜可具有細胞承載能力，且在培養液中，其尺寸會具有動態變化，因此在細胞培養期間，其可持續提供貼附於其上生長之細胞一物理性機械力，如一拉伸之應力，及細胞貼附之表面之結構變化的刺激，而無須對薄膜及/或細胞提供外加之機械力及/或化學刺激，即可使貼附於其上之細胞以相同方生長，及/或可促進細胞分化。
於上述本揭露之培養細胞的方法中所採用之細胞，可依照需要進行選擇，並無特別限制。例如，細胞之種類可依據所需之應用領域進行選擇，但不限於此。在一實施例中，需將細胞應用於活體中之組織再生，則可採用具分化能力之細胞於上述本揭露之培養細胞的方法中。而具分化能力之細胞的例子，可包括，但不限於，維母細胞(fibroblast)、成肌細胞(myoblasts)、上皮細胞(epithelial cells)、內皮細胞(endothelial cells)、前驅細胞(progenitor cells)、肌腱細胞(tenocyte)、幹細胞(stem cells)、間質幹細胞(mesenchymal stem cells)、骨髓幹細胞(bone marrow stem cells)、脂肪幹細胞(adipose derived stem cells)等。
而在上述本揭露之培養細胞的方法中，用於培養細胞的培養液，可依據需要進行選擇，並無特別限制。例如，可依據所欲培養之細胞、所欲使細胞達成之狀態等進行選擇，但不限於此。
又，在上述本揭露之培養細胞的方法中，培養細胞的時間，可依據需要進行調整，並無特別限制。例如，培養細胞的時間可依照細胞種類、細胞生長情況、培養細胞之環境（如環境之溫度、濕度等）、所採用之培養液等進行調整。在一實施例中，培養細胞之時間可為約1-28天，例如，約1天、約1.5天、約2天、約3天、約5天、約6天、約7天、約10天、約14天、約21天、約28天等，但不限於此。
另外，在上述本揭露之培養細胞的方法中，培養細胞的溫度，可依據需要進行調整，並無特別限制。例如，培養細胞的溫度可依照細胞種類、細胞生長情況、所採用之培養液等進行調整。在一實施例中，培養細胞之溫度可為約30-40℃，例如，約30℃、約32℃、約35℃、約36、約37℃、約37.5℃、約38℃、約39℃、約40℃等，但不限於此。
又，於上述本揭露之培養細胞的方法中，上述細胞於非纖維形式薄膜上可生長為至少一層之細胞。換言之，於上述本揭露培養細胞的方法中，上述細胞於非纖維形式薄膜上可生長為單層之細胞，或生長為複數層之細胞。
在一實施例中，上述本揭露之培養細胞的方法，可更包括，於上述細胞於非纖維形式薄膜上生長為至少一層之細胞之後，於與上述培養液相同或不同之一培養液中，將與上述細胞不同種類的細胞，培養於具有此至少一層之細胞的非纖維形式薄膜上，以使此不同之細胞也可生長為至少一層之細胞。此步驟可依據需要重複進行，而於每次重複此步驟時，所選擇之細胞為與前一次不同。
而關於不同細胞之選擇與培養條件，可參考上方關於細胞選擇、培養液選擇、培養時間與培養溫度等段落，因此不於此贅述。
另外，相似地，本揭露也可提供一種形成細胞層片的方法，其可包括，於一培養液中將一細胞培養於上述任何本揭露之非纖維形式薄膜上，以使細胞以同方向生長於上述任何本揭露之非纖維形式薄膜上並形成至少一細胞層，而形成一細胞層片，但不限於此。
由於上述任何本揭露之非纖維形式薄膜可具有細胞承載能力，且在培養液中，其尺寸會具有動態變化，因此在細胞培養期間，其可持續提供貼附於其上生長之細胞一物理性機械力，如一拉伸之應力，及細胞貼附之表面之結構變化的刺激，而無須對薄膜及/或細胞提供外加之機械力及/或化學刺激，即可使貼附於其上之細胞以相同方生長，並可促進細胞分化，而獲得一細胞層片，其具有同方向排列之複數個細胞的至少一細胞層。
在一實施例中，上述本揭露之形成細胞層片的方法，可更包括，於上述細胞以同方向生長於非纖維形式薄膜上並形成至少一細胞層之後，將與此細胞不同種類的細胞，培養於具有此至少一細胞層的非纖維形式薄膜上，以使此不同之細胞也可生長為至少一細胞層。此步驟可依據需要重複進行，而於每次重複此步驟時，所選擇之細胞為與前一次不同。
而關於細胞之選擇與培養條件，可參考上方關於本揭露之培養細胞的方法之段落中，關於細胞選擇、培養液選擇、培養時間與培養溫度等的說明，因此不於此贅述。
再者，根據上述，本揭露也可提供，一種細胞層片，其可包括，但不限於，上述任何本揭露之非纖維形式薄膜，與至少一細胞層於上述任何本揭露之非纖維形式薄膜上，其中上述細胞層可由複數個細胞所構成，而上述複數個細胞可以相同方向排列。在一實施例中，本揭露之細胞層片中的細胞，可具有較佳之分化能力。
在一實施例中，本揭露之細胞層片可具有複數層細胞層，而各層細胞中之細胞可為相同或不同。
於上述本揭露之細胞層片之細胞，可依照需要進行選擇，並無特別限制。例如，細胞之種類可依據細胞層片所欲應用之領域進行選擇，但不限於此。在一實施例中，需將細胞層片應用於活體中之組織再生，則可採用具分化能力之細胞於上述本揭露之細胞層片中。而具分化能力之細胞的例子，可包括，但不限於，維母細胞(fibroblast)、成肌細胞(myoblasts)、上皮細胞(epithelial cells)、內皮細胞(endothelial cells)、前驅細胞(progenitor cells)、肌腱細胞(tenocyte)、幹細胞(stem cells)、間質幹細胞(mesenchymal stem cells)、骨髓幹細胞(bone marrow stem cells)、脂肪幹細胞(adipose derived stem cells)。
實施例
實施例1：薄膜之製備
1. 製備例1
非纖維形式薄膜：100 wt%之膠原蛋白
將第一型膠原蛋白與作為溶劑之六氟異丙醇(Hexafluoroisopropanol, HFP)均勻混合，以配製一10%(w/w) 膠原蛋白溶液。
將15g之此膠原蛋白溶液倒入一鐵氟龍模具(其底面尺寸為7cm*7cm)，並放置於化學抽氣櫃乾燥以形成薄膜。
於乾燥並形成薄膜後，將薄膜自模具取出，以10%甲醛(formaldehyde)進行交聯1小時。之後，獲得一經交聯之非纖維形式薄膜，其膠原蛋白含量為100wt%。
2.製備例2
非纖維形式薄膜：90wt%膠原蛋白與10wt%之聚己內酯(polycaprolactone,PCL)
將1.574g之第一型膠原蛋白與0.17g之聚己內酯(Mw：80,000Da)添加於17.9g之作為溶劑之六氟異丙醇中並均勻混合，以配製一混合溶液。
將此混合溶液倒入一鐵氟龍模具(其底面尺寸為7cm*7cm)，並放置於化學抽氣櫃乾燥以形成薄膜。
於乾燥並形成薄膜後，將薄膜自模具取出，以10%甲醛進行交聯1小時。之後，獲得一經交聯之非纖維形式薄膜，其膠原蛋白含量為90wt%。
3.製備例3
非纖維形式薄膜：80wt%膠原蛋白與20wt%之聚己內酯
將1.36g之第一型膠原蛋白與0.34g之聚己內酯(Mw：80,000Da)添加於16g之作為溶劑之六氟異丙醇中並均勻混合，以配製一混合溶液。
將此混合溶液倒入一鐵氟龍模具（其底面尺寸為7 cm*7 cm），並放置於化學抽氣櫃乾燥以形成薄膜。
於乾燥並形成薄膜後，將薄膜自模具取出，以10%甲醛進行交聯1小時。之後，獲得一經交聯之非纖維形式薄膜，其膠原蛋白含量為80 wt%。
4. 製備例4
非纖維形式薄膜：80 wt%膠原蛋白與20 wt%之聚己內酯，交聯1.5小時
將第一型膠原蛋白、聚己內酯（Mw: 80,000 Da）與作為溶劑之六氟異丙醇均勻混合，以配製一溶質濃度為10%(w/w)混合溶液，其中第一型膠原蛋白與聚己內酯之重量比為8:2。
將此混合溶液倒入一鐵氟龍模具（其底面尺寸為7 cm*7 cm），並放置於化學抽氣櫃乾燥以形成薄膜。
於乾燥並形成薄膜後，將薄膜自模具取出，以10%甲醛進行交聯1.5小時。之後，獲得一經交聯之非纖維形式薄膜（交聯時間1.5小時），其膠原蛋白含量為80 wt%。
5. 製備例5
非纖維形式薄膜：80 wt%膠原蛋白與20 wt%之聚己內酯，交聯2小時
除了交聯處理之時間調整為2小時，其他製備條件與步驟皆與製備例4相同。
6. 製備例6
非纖維形式薄膜：80 wt%膠原蛋白與20 wt%之聚己內酯，交聯3小時
除了交聯處理之時間調整為3小時，其他製備條件與步驟皆與製備例4相同。
7. 製備例7
非纖維形式薄膜：70 wt%膠原蛋白與30 wt%之聚己內酯
將2.38 g之第一型膠原蛋白與1.08 g之聚己內酯（Mw: 80,000 Da）添加於21.76 g之作為溶劑之六氟異丙醇中並均勻混合，以配製一混合溶液。
將此混合溶液倒入一鐵氟龍模具（其底面尺寸為7 cm*7 cm），並放置於化學抽氣櫃乾燥以形成薄膜。
於乾燥並形成薄膜後，將薄膜自模具取出，以10%甲醛進行交聯1小時。之後，獲得一經交聯之非纖維形式薄膜，其膠原蛋白含量為70 wt%。
8. 製備例8
非纖維形式薄膜：50 wt%膠原蛋白與50 wt%之聚己內酯
將2.34 g之第一型膠原蛋白與2.34 g之聚己內酯（Mw: 80,000 Da）添加於46.3 g之作為溶劑之六氟異丙醇中並均勻混合，以配製一混合溶液。
將此混合溶液倒入一鐵氟龍模具（其底面尺寸為7 cm*7 cm），並放置於化學抽氣櫃乾燥以形成薄膜。
於乾燥並形成薄膜後，將薄膜自模具取出，以10%甲醛進行交聯1小時。之後，獲得一經交聯之非纖維形式薄膜，其膠原蛋白含量為50 wt%。
9. 製備例9
非纖維形式薄膜：90 wt%膠原蛋白與10 wt%之聚乳酸(polylactic acid, PLA)
將4.61g之第一型膠原蛋白與0.512g之右旋聚乳酸(poly (D-lactic acid), PDLA) (4.5 dl/g)添加於68.89g之作為溶劑之六氟異丙醇中並均勻混合，以配製一混合溶液。
將69.15 g之 此混合溶液倒入一鐵氟龍模具（其底面尺寸為20 cm*20 cm），並放置於化學抽氣櫃乾燥以形成薄膜。
於乾燥並形成薄膜後，將薄膜自模具取出，以10%甲醛進行交聯1小時。之後，獲得一經交聯之非纖維形式薄膜，其膠原蛋白含量為90 wt%。
10. 製備例10
非纖維形式薄膜：70 wt%膠原蛋白與30 wt%之聚乳酸
將3.32 g之第一型膠原蛋白與1.42 g之聚乳酸(Poly(D,L-lactide))(4.5 dl/g)添加於69.89 g之作為溶劑之六氟異丙醇中並均勻混合，以配製一混合溶液。
將69.15g 之此混合溶液倒入一鐵氟龍模具（其底面尺寸為20 cm*20 cm），並放置於化學抽氣櫃乾燥以形成薄膜。
於乾燥並形成薄膜後，將薄膜自模具取出，以10%甲醛進行交聯1小時。之後，獲得一經交聯之非纖維形式薄膜，其膠原蛋白含量為70 wt%。
11. 比較製備例1
非纖維型式薄膜：100 wt%膠原蛋白（以酸性水溶液為溶劑）
將第一型膠原蛋白與作為溶劑之酸性水溶液(pH 3)均勻混合，以配製一1%(w/w)膠原蛋白溶液。
將此膠原蛋白混合溶液倒入一鐵氟龍模具（其底面尺寸為13 cm*13 cm），並放置於化學抽氣櫃乾燥以形成薄膜。
於乾燥並形成薄膜後，將薄膜自模具取出，以10%甲醛進行交聯1小時。之後，獲得一經交聯之非纖維形式薄膜，其膠原蛋白含量為100 wt%。
12. 比較製備例2
非纖維型式薄膜：90 wt%膠原蛋白與10 wt%之聚己內酯（以酸性水溶液為溶劑）
將第一型膠原蛋白與聚乙烯吡咯烷酮(Povidone (K30))添加於作為溶劑之酸性水溶液(pH 3)中並均勻混合，以配製一混合溶液（第一型膠原蛋白濃度為0.9% (w/w)，聚乙烯吡咯烷酮濃度為0.1% (w/w)）。
將67 g之此混合溶液倒入一鐵氟龍模具（其底面尺寸為13 cm*13 cm），並放置於化學抽氣櫃乾燥以形成薄膜。
於乾燥並形成薄膜後，將薄膜自模具取出，以10%甲醛進行交聯1小時。之後，獲得一經交聯之非纖維形式薄膜，其膠原蛋白含量為90 wt%。
13. 比較製備例3
電紡薄膜：100 wt%之膠原蛋白
將第一型膠原蛋白與作為溶劑之六氟異丙醇均勻混合，以配製一10%(w/w)膠原蛋白溶液。
以此膠原蛋白溶液為原料，藉由一電紡裝置（針頭25-26G，溶液流量0.15 mL/小時，電壓5-6kV）進行電紡以形成一電紡薄膜。將製作完成之電紡薄膜以10%甲醛進行交聯1小時。之後，獲得一經交聯之電紡薄膜，其膠原蛋白含量為100 wt%。
14. 比較製備例4
電紡薄膜：50 wt%膠原蛋白與50 wt%之聚己內酯
將第一型膠原蛋白、聚己內酯（Mw: 80,000 Da）與作為溶劑之六氟異丙醇均勻混合，以配製一溶質濃度為10%(w/w)混合溶液，其中第一型膠原蛋白與聚己內酯之重量比為1:1。
以此混合溶液為原料，藉由一電紡裝置（針頭25-26G，溶液流量0.15 mL/小時，電壓5-6 kV）進行電紡以形成一電紡薄膜。將製作完成之電紡薄膜以10%甲醛進行交聯1小時。之後，獲得一經交聯之電紡薄膜，其膠原蛋白含量為50 wt%。
實施例2
傅立葉轉換紅外線光譜分析(Fourier-transform infrared spectroscopy, FTIR)
將製備例1所製備之非纖維型式薄膜（100 wt%膠原蛋白（於其製備中以六氟異丙醇為溶劑））與比較製備例1所製備之非纖維型式薄膜（100 wt%膠原蛋白（於其製備中以酸性水溶液為溶劑））進行傅立葉轉換紅外線光譜分析。結果如第1A圖所示。
又，表1與表2顯示，於膠原蛋白於傅立葉轉換紅外線光譜分析中所顯示之各波峰所代表的結構（根據Olena S. Rabotyagova et al, “Collagen structural hierarchy and susceptibility to degradation by ultraviolet radiation” Materials Science and Engineering C 28 (2008), pp. 1420–1429）。
表1、醯胺吸收帶I(amide I)區域之波段構成要素的分配
位置(cm -1) 分配
1690 分子間關係。聚集之類膠原蛋白胜肽的螺旋 β轉折(β-turn)
1675 於三股螺旋(triple helix)型式之膠原蛋白，具備來自α螺旋(α-helix)與β轉折的貢獻（C=O之蛋白質醯胺伸縮振動）
1660 非脯胺酸(non-proline)與非羥脯胺酸(non- hydroxyproline)之無規則鏈(random chain)的貢獻
1646-1650 無規捲曲構造(random coli conformation)：醯亞胺(imide)殘基（於無規則捲曲形式之醯胺吸收帶I） 於變性狀態之左向(left-handed)3-10螺旋
1630 部分β褶板(β-sheet)區
表2、醯胺吸收帶II(amide II)區域之波段構成要素的分配
位置(cm -1) 分配 註釋
1565 羧基基團 N-H彎曲振動以及C-N伸縮振動 D與E的側鏈
1549 於三股螺旋型式之醯胺吸收帶II 於三股螺旋型式之膠原蛋白
1530 於一無規捲曲中之醯胺吸收帶II 由於變性之鬆散結構(disordered structure)
1515 酪胺酸(tyrosine)側鏈 F至Y之轉換
依據表1及表2可知，位於1549 cm -1之波峰代表膠原蛋白三股螺旋之特徵，位於1530 cm -1之波峰代表變性膠原蛋白的鬆散結構，位於1646-1650 cm -1之波峰與位於1660 cm -1之波峰代表無規則捲曲之膠原蛋白結構表現。
因此，依據第1A圖之結果與表1與表2可知，相較於比較製備例1所製備之非纖維型式薄膜（100 wt%膠原蛋白（於其製備中以酸性水溶液為溶劑）），製備例1所製備之非纖維型式薄膜（100 wt%膠原蛋白（於其製備中以六氟異丙醇為溶劑））之醯胺吸收帶II彎曲(amide II band)明顯由原本位於1548.9cm -1之波峰偏移到位於1537.5cm -1之波峰，表示三股螺結構減少且變性膠原蛋白結構增加。
又，進一步將第1A圖中顯示之製備例1中所製備之非纖維型式薄膜（100 wt%膠原蛋白（於其製備中以六氟異丙醇為溶劑））與比較製備例1所製備之非纖維型式薄膜（100 wt%膠原蛋白（於其製備中以酸性水溶液為溶劑））傅立葉轉換紅外線光譜，進行擬合(fitting)，結果如第1B圖與表3所示。
表3
比較製備例1所製備之非纖維型式薄膜（於其製備中以酸性水溶液為溶劑） 製備例1所製備之非纖維型式薄膜（於其製備中以六氟異丙醇為溶劑）
波峰(cm -1) 面積 比率(%) 波峰(cm -1) 面積 比率(%)
1508.8 1.219 6.57 1508.75 1.905 10.63
1527.52 0.847 4.57 1529.04 1.374 7.67
1547 2.954 15.94 1547 1.329 7.42
1563 2.857 15.41 1563 3.431 19.15
1624.02 5.915 31.91 1624.12 5.549 30.98
1625.97 0.682 3.68 1625.84 0.4784 2.67
1653.51 2.785 15.02 1655.38 2.784 15.54
1682.61 1.277 6.89 1683.54 1.064 5.94
依據第1B圖與表3所示之結果與表1與表2可知，相較於比較製備例1所製備之非纖維型式薄膜（於其製備中以酸性水溶液為溶劑），對於製備例1所製備之非纖維型式薄膜（於其製備中以六氟異丙醇為溶劑）而言，代表膠原蛋白醯胺吸收帶II三股螺旋之特徵之位於1547cm -1的波峰的面積比率為由約15.94%減少至約7.42%；代表膠原蛋白醯胺吸收帶II表現變性後之鬆散結構之位於1527cm -1之波峰的面積比率由約4.57%增加約7.67%，且代表膠原蛋白醯胺吸收帶I無規則捲曲結構之位於1653cm -1之波峰的面積比率由約15.02%增加至約15.54%。
由上述可知，相較於比較製備例1所製備之非纖維型式薄膜（於其製備中以酸性水溶液為溶劑），製備例1所製備之非纖維型式薄膜（於其製備中以六氟異丙醇為溶劑）具有較多之變性膠原蛋白，意即，製備例1所製備之非纖維型式薄膜（於其製備中以六氟異丙醇為溶劑）中，同時存在天然膠原蛋白與變性膠原蛋白。
換言之，藉由在含膠原蛋白之薄膜的製備中使用六氟異丙醇為溶劑，可使所製備之薄膜同時存在天然膠原蛋白與變性膠原蛋白。
實施例3
掃描式電子顯微鏡分析(scanning electron microscopy, SEM)
將製備例8所製備之非纖維型式薄膜（50 wt%膠原蛋白與50 wt%之聚己內酯）與比較製備例3所製備之電紡薄膜（100 wt%之膠原蛋白）以掃描式電子顯微鏡進行分析，結果分別如第2圖與第3圖所示。
第2圖顯示製備例8所製備之非纖維型式薄膜（50 wt%膠原蛋白與50 wt%之聚己內酯）的掃描式電子顯微鏡分析照片。依據第2圖可知，製備例8所製備之非纖維型式薄膜（50 wt%膠原蛋白與50 wt%之聚己內酯）為多孔非纖維型式薄膜，且其孔洞孔徑為約1 μm。
第3圖顯示比較製備例3所製備之電紡薄膜（100 wt%之膠原蛋白）的掃描式電子顯微鏡分析照片。依據第3圖可知，比較製備例3所製備之電紡薄膜（100 wt%之膠原蛋白）為一纖維式薄膜。
實施例4
薄膜膨脹試驗
將製備例與比較製備例中所製備之薄膜分別進行膨脹試驗。
1. 方法
將待側薄膜以圓形裁切器裁切，以獲得直徑為8 mm之圓形薄膜。
將圓形薄膜浸泡於一水性液體（RO純水、0.9%生理食鹽水、10mM Tri-HCl緩衝溶液、杜比可磷酸鹽緩衝液(Dulbecco’s phosphate buffered saline, DPBS)、杜比可改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM)溶液或含10%胎牛血清(fetal bovine sera, FBS)之DMEM溶液（細胞培養液）中。
於薄膜浸泡0分鐘、60分鐘、24小時、72小時、7天與14天以顯微鏡(NIKON型號)在0.75倍率下對薄膜取像，並量測薄膜之直徑(diameter)。
選定兩個時間點所測得之薄膜直徑，並可由以下公式計算薄膜之膨脹速度：
Figure 02_image001
k為膨脹速率，x1為第1個時間點，x2為第2個時間點，y1為第1個時間點所測得之薄膜直徑，y2為第2個時間點所測得之薄膜直徑。
2. 結果
(1) 關於製備例1、2、3、7與8中所製備之薄膜
製備例1中所製備之非纖維形式薄膜（100 wt%之膠原蛋白）、製備例2中所製備之非纖維形式薄膜（90 wt%膠原蛋白與10 wt%之聚己內酯）、製備例7中所製備之非纖維形式薄膜（70 wt%膠原蛋白與30 wt%之聚己內酯）與製備例8中所製備之非纖維形式薄膜（非纖維形式薄膜：50 wt%膠原蛋白與50 wt%之聚己內酯）於不同水性液體中不同時間點所測得之薄膜直徑，分別如第4A圖、第4B圖、第4C圖與第4D圖所示。
依據第4A圖、第4B圖、第4C圖與第4D圖可知，在不同水性液體中，各種薄膜之尺寸隨著時間增加皆有明顯之變化。
由各薄膜於時間點7天以前之直徑，可知，在含有兩性離子(zwitterion)之水性液體，如Tri-HCl緩衝溶液、DMEM溶液與含10%胎牛血清之DMEM溶液（細胞培養液）中，薄膜之持續澎脹效應較明顯。推測含有兩性離子之水性液體對於膠原蛋白之間的氫鍵作用較顯著，而因此導致薄膜之水合效果較佳與膨脹速度較快。
又，薄膜之水合效果在DMEM溶液與含10%胎牛血清之DMEM溶液（細胞培養液）尤其明顯。由於DMEM溶液與細胞培養液除了兩性離子之外，還含有胺基酸成份，而此亦增加膠原蛋白薄膜之水合作用，因此薄膜於其中其膨脹速度遠大於在其他水性液體（RO純水、生理食鹽水、Tri-HCl緩衝溶液或磷酸鹽緩衝液）中。
另外，將第4A圖、第4B圖、第4C圖與第4D圖所示之製備例1中所製備之非纖維形式薄膜（100 wt%之膠原蛋白）、製備例2中所製備之非纖維形式薄膜（90 wt%膠原蛋白與10 wt%之聚己內酯）、製備例7中所製備之非纖維形式薄膜（70 wt%膠原蛋白與30 wt%之聚己內酯）與製備例8中所製備之非纖維形式薄膜（非纖維形式薄膜：50 wt%膠原蛋白與50 wt%之聚己內酯）於含10%胎牛血清之DMEM溶液於不同時間點所測得的薄膜直徑，整合於第5A圖。
再者，依據於含10%胎牛血清之DMEM溶液中各薄膜於時間點60分鐘於所測得的直徑與於時間點14天於所測得的直徑，來計算各薄膜之膨脹速率。結果如第5B圖所示。
又，分別計算相較於時間點60分鐘，於各種水性溶液中各薄膜於時間點7天與時間點14天的膨脹比。膨脹比的計算公式如下所示： 膨脹比(%)=（薄膜於第2個時間點的直徑-薄膜於第1個時間點的直徑）/薄膜於第1個時間點的直徑*100 於此試驗中，第1個時間點為60分鐘，第2個時間點為7天或14天。
結果如表4所示。
表4、相較於時間點60分鐘，於各種水性溶液中各薄膜於時間點7天與時間點14天的膨脹比率
    膨脹比(%)
製備例1中所製備之薄膜（100 wt%之膠原蛋白） 時間 RO純水 0.9%生理食鹽水 Tri-HCl緩衝溶液 磷酸鹽緩衝液 DMEM 含10%胎牛血清之DMEM溶液
7天 3.16 3.00 12.39 3.46 13.99 13.86
14天 12.32 12.69 25.61 14.94 25.18 25.85
製備例2中所製備之薄膜（90 wt%膠原蛋白與10 wt%之聚己內酯） 時間 RO純水 0.9%生理食鹽水 Tri-HCl緩衝溶液 磷酸鹽緩衝液 DMEM 含10%胎牛血清之DMEM溶液
7天 11.01 6.17 15.03 7.65 20.78 16.18
14天 18.52 16.48 23.50 22.29 40.03 31.82
製備例3中所製備之薄膜（80 wt%膠原蛋白與20 wt%之聚己內酯） 時間 RO純水 0.9%生理食鹽水 Tri-HCl緩衝溶液 磷酸鹽緩衝液 DMEM 含10%胎牛血清之DMEM溶液
7天 4.20 4.37 6.63 5.83 9.86 9.04
14天 11.34 14.26 21.67 17.62 28.02 23.42
製備例7中所製備之薄膜（70 wt%膠原蛋白與30 wt%之聚己內酯） 時間 RO純水 0.9%生理食鹽水 Tri-HCl緩衝溶液 磷酸鹽緩衝液 DMEM 含10%胎牛血清之DMEM溶液
7天 0.10 7.04 7.38 3.35 12.19 15.00
14天 11.70 16.91 16.85 20.58 39.73 41.64
製備例8（50 wt%膠原蛋白與50 wt%之聚己內酯） 時間 RO純水 0.9%生理食鹽水 Tri-HCl緩衝溶液 磷酸鹽緩衝液 DMEM 含10%胎牛血清之DMEM溶液
7天 -4.48 -3.53 -2.13 -3.47 3.89 4.86
14天 4.60 4.64 4.65 3.97 11.29 12.34
依據第5A圖、第5B圖與表4顯示，含70-90 wt%膠原蛋白之薄膜的膨脹比率大於含100 wt%之膠原蛋白薄膜，且薄膜在各水性液體的膨脹比率也隨著聚酯類高分子含量增加而上升。
由此可知，聚酯類高分子的添加會對於膠原蛋白之間的交聯造成阻礙，且因此影響膠原蛋白分子間之作用力，而導致含聚酯類高分子的薄膜在吸收液體後的膨脹速度增加。
相對於此，含100 wt%之膠原蛋白薄膜係經過較充分的交聯。不過由於在薄膜製備中所使用之作為溶劑的六氟異丙醇中，可使薄膜同時存在天然膠原蛋白與變性膠原蛋白（參見第1A圖與第1B圖），因此浸泡於液體中之含100 wt%之膠原蛋白薄膜仍具有膨脹特性，但其膨脹比率低於含70-90 wt%膠原蛋白之薄膜。
而關於含50 wt%膠原蛋白之薄膜，由於其聚酯類高分子的含量佔整體薄膜一半，因此對薄膜特性影響程度較高。而聚酯類高分子為疏水性材料，並不具有吸水膨脹的特性，因此，含50 wt%膠原蛋白之薄膜只有在浸泡液體至7天（168小時）後尺寸才出現微微增加。
(2) 關於製備例4、5與6中所製備之薄膜
依據製備例4中所製備之非纖維形式薄膜（80 wt%膠原蛋白與20 wt%之聚己內酯，交聯1.5小時）、製備例5中所製備之非纖維形式薄膜（80 wt%膠原蛋白與20 wt%之聚己內酯，交聯2小時）與製備例6中所製備之非纖維形式薄膜（80 wt%膠原蛋白與20 wt%之聚己內酯，交聯3小時）於含10%胎牛血清之DMEM溶液中在時間點14天與時間點60分鐘於所測得的直徑，來計算其分別之膨脹速率與單位時間膨脹比率。
單位時間膨脹比率係依據以下所示之公式來計算： 單位時間膨脹比率(%/小時)=膨脹速率/時間點60分鐘之時的薄膜直徑*100 於時間點60分鐘之時的薄膜直徑：將薄膜浸泡水性液體之後的薄膜起始直徑
結果如第6圖所示。
第6圖顯示，經過不同時間之交聯處理的薄膜的膨脹速率不同，交聯時間短之薄膜，膨脹速率較高。因此，由此可知，薄膜之膨脹速率可經由對於薄膜之交聯處理的時間來調整。
(3) 關於製備例9與10中所製備之薄膜
製備例9中所製備之非纖維形式薄膜（90 wt%膠原蛋白與10 wt%之聚乳酸）於PBS緩衝溶液中在不同時間點所測得之薄膜直徑，如第7圖所示。
又分別計算相較於時間點1小時，於PBS緩衝溶液中製備例9中所製備之非纖維形式薄膜（90 wt%膠原蛋白與10 wt%之聚乳酸）與製備例10中所製備之非纖維形式薄膜（70 wt%膠原蛋白與30 wt%之聚乳酸）於時間點7天與時間點14天的膨脹比率。結果如表5所示。
表5、相較於時間點1小時，於PBS緩衝溶液中製備例9中所製備之非纖維形式薄膜（90 wt%膠原蛋白與10 wt%之聚乳酸）與製備例10中所製備之非纖維形式薄膜（70 wt%膠原蛋白與30 wt%之聚乳酸）於時間點7天與時間點14天的膨脹比率
    膨脹比(%)
製備例9中所製備之薄膜（90 wt%膠原蛋白與10 wt%之聚乳酸） 時間 PBS
7天 10.41
14天 11.37
製備例10中所製備之薄膜（70 wt%膠原蛋白與30 wt%之聚乳酸） 時間 PBS
7天 0.75
14天 -0.87
依據第7圖與表5可知，在水性液體中，含有聚乳酸之膠原蛋白薄膜之薄膜尺寸也隨著時間而增加。
(4) 關於比較製備例3與4中所製備之薄膜
比較製備例3中所製備之電紡薄膜（100 wt%之膠原蛋白）與比較製備例4中所製備之電紡薄膜（50 wt%膠原蛋白與50 wt%之聚己內酯）於PBS緩衝溶液中不同時間點所測得之面積，如第8圖所示。
依據第8圖可知，電紡薄膜並無膨脹之效果。
實施例5
細胞培養試驗
將製備例與比較製備例中所製備之薄膜分別進行細胞培養試驗。
1. 方法
將纖維母細胞(HSF p7)以含有10%胎牛血清與Penicillin-Streptomycin (100 U/mL)的DMEM高葡萄糖培養基進行培養。
將待測薄膜以75%酒精浸泡15分鐘，之後將酒精移除並使薄膜上之酒精揮發以使薄膜乾燥。待乾燥步驟完成，即完成待測薄膜的滅菌。
接著，將薄膜以無菌水浸泡40分鐘，再以細胞培養基浸泡15分鐘。然後，將薄膜置入12孔盤之孔洞中並以塑膠環固定。將纖維母細胞 (HSF p7)以50,000個細胞/cm 2的種植密度接種於上述12孔盤之具有薄膜的孔洞中。另將纖維母細胞(HSF p7)以相同之種植密度接種於上述12孔盤之不含薄膜的孔洞中作為對照組。於隔天細胞貼附後，移除固定用之塑膠環。
以PKH67活細胞染色來觀察細胞在薄膜上的變化。於第1、3、7與14天以螢光顯微鏡拍下細胞的型態並拍照測量材料尺寸的變化。
2. 結果
(1) 關於製備例3中所製備之薄膜
製備例3中所製備之非纖維形式薄膜（80 wt%膠原蛋白與20 wt%之聚己內酯）之細胞培養試驗的結果如第9A圖與第9B圖所示。
第9A圖顯示，於細胞培養試驗中，於第1、3、7與14天細胞在製備例3中所製備之非纖維形式薄膜（80 wt%膠原蛋白與20 wt%之聚己內酯）上與在培養盤上之生長情況的照片。
第9B圖顯示，於細胞培養試驗中，於第3天細胞在製備例3中所製備之非纖維形式薄膜（80 wt%膠原蛋白與20 wt%之聚己內酯）上與在培養盤上之生長情況的照片。
依據第9A圖與第9B圖可知，細胞於本揭露之薄膜上係以相同方向生長與排列。在細胞培養液中，薄膜之尺寸隨著時間持續增加，而薄膜尺寸增加對細胞造成一個物理的機械應力而可使細胞出現同一方向生長的特性。相對於此，細胞於培養盤上之生長情況較為凌亂。
(1) 關於比較製備例2中所製備之薄膜
比較製備例2中所製備之非纖維型式薄膜（90 wt%膠原蛋白與10 wt%之聚己內酯（以酸性水溶液為溶劑））之細胞培養試驗的結果如第10圖。
依據第10圖可知，相似於細胞在培養盤上之生長情況，細胞於比較製備例2中所製備之非纖維型式薄膜（90 wt%膠原蛋白與10 wt%之聚己內酯（以酸性水溶液為溶劑））上之生長情況較為凌亂，僅偶有方向性排列。
整合前述可知，在細胞培養時，本揭露之薄膜由於具備尺寸變化，因此提供生長於其上之細胞一個物理的機械應力，及細胞貼附之表面之結構變化的刺激，而可使細胞以同一方向生長與排列，並促進細胞分化。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無。
第1A圖顯示，製備例1所製備之非纖維型式薄膜（100 wt%膠原蛋白（於其製備中以六氟異丙醇為溶劑））與比較製備例1所製備之非纖維型式薄膜（100 wt%膠原蛋白（於其製備中以酸性水溶液為溶劑））之傅立葉轉換紅外線光譜分析的結果。 第1B圖顯示，將製備例1所製備之非纖維型式薄膜（100 wt%膠原蛋白（於其製備中以六氟異丙醇為溶劑））與比較製備例1所製備之非纖維型式薄膜（100 wt%膠原蛋白（於其製備中以酸性水溶液為溶劑））之傅立葉轉換紅外線光譜進行擬合(fitting)的結果。 第2圖顯示，製備例8所製備之非纖維型式薄膜（50 wt%膠原蛋白與50 wt%之聚己內酯）的掃描式電子顯微鏡分析照片。 第3圖顯示，比較製備例3所製備之電紡薄膜（100 wt%之膠原蛋白）的掃描式電子顯微鏡分析照片。 第4A圖顯示，於薄膜膨脹試驗中，製備例1中所製備之非纖維形式薄膜（100 wt%之膠原蛋白）於RO純水、0.9%生理食鹽水、Tri-HCl緩衝溶液、杜比可磷酸鹽緩衝液(Dulbecco’s phosphate buffered saline, DPBS)、杜比可改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM)溶液與含10%胎牛血清(fetal bovine sera, FBS)之DMEM溶液（細胞培養液）中在不同時間點所分別測得的薄膜直徑。 第4B圖顯示，於薄膜膨脹試驗中，製備例2中所製備之非纖維形式薄膜（90 wt%膠原蛋白與10 wt%之聚己內酯）於RO純水、0.9%生理食鹽水、Tri-HCl緩衝溶液、杜比可磷酸鹽緩衝液、DMEM溶液與含10%胎牛血清之DMEM溶液（細胞培養液）中在不同時間點所分別測得的薄膜直徑。 第4C圖顯示，於薄膜膨脹試驗中，製備例7中所製備之非纖維形式薄膜（70 wt%膠原蛋白與30 wt%之聚己內酯）於RO純水、0.9%生理食鹽水、Tri-HCl緩衝溶液、杜比可磷酸鹽緩衝液、DMEM溶液與含10%胎牛血清之DMEM溶液（細胞培養液）中在不同時間點所分別測得的薄膜直徑。 第4D圖顯示，於薄膜膨脹試驗中，製備例8中所製備之非纖維形式薄膜（50 wt%膠原蛋白與50 wt%之聚己內酯）於RO純水、0.9%生理食鹽水、Tri-HCl緩衝溶液、杜比可磷酸鹽緩衝液、DMEM溶液與含10%胎牛血清之DMEM溶液（細胞培養液）中在不同時間點所分別測得的薄膜直徑。 第5A圖顯示，於薄膜膨脹試驗中，製備例1中所製備之非纖維形式薄膜（100 wt%之膠原蛋白）、製備例2中所製備之非纖維形式薄膜（90 wt%膠原蛋白與10 wt%之聚己內酯）、製備例7中所製備之非纖維形式薄膜（70 wt%膠原蛋白與30 wt%之聚己內酯）與製備例8中所製備之非纖維形式薄膜（50 wt%膠原蛋白與50 wt%之聚己內酯）於含10%胎牛血清之DMEM溶液（細胞培養液）中在不同時間點所分別測得的薄膜直徑。 第5B圖顯示，於薄膜膨脹試驗中，製備例1中所製備之非纖維形式薄膜（100 wt%之膠原蛋白）、製備例2中所製備之非纖維形式薄膜（90 wt%膠原蛋白與10 wt%之聚己內酯）、製備例7中所製備之非纖維形式薄膜（70 wt%膠原蛋白與30 wt%之聚己內酯）與製備例8中所製備之非纖維形式薄膜（50 wt%膠原蛋白與50 wt%之聚己內酯）於含10%胎牛血清之DMEM溶液（細胞培養液）中的膨脹速率。 第6圖顯示，於薄膜膨脹試驗中，製備例4中所製備之非纖維形式薄膜（80 wt%膠原蛋白與20 wt%之聚己內酯，交聯1.5小時）、製備例5中所製備之非纖維形式薄膜（80 wt%膠原蛋白與20 wt%之聚己內酯，交聯2小時）與製備例6中所製備之非纖維形式薄膜薄膜（80 wt%膠原蛋白與20 wt%之聚己內酯，交聯3小時）於含10%胎牛血清之DMEM溶液中的膨脹速率與單位時間膨脹比率。 第7圖顯示，於薄膜膨脹試驗中，製備例9中所製備之非纖維形式薄膜（90 wt%膠原蛋白與10 wt%之聚乳酸）於於PBS緩衝溶液中在不同時間點所測得之薄膜直徑。 第8圖顯示，於薄膜膨脹試驗中，比較製備例3中所製備之電紡薄膜（100 wt%之膠原蛋白）與比較製備例4中所製備之電紡薄膜（50 wt%膠原蛋白與50 wt%之聚己內酯）於PBS緩衝溶液中不同時間點所測得之薄膜面積。 第9A圖顯示，於細胞培養試驗中，於第1、3、7與14天細胞在製備例3中所製備之非纖維形式薄膜（80 wt%膠原蛋白與20 wt%之聚己內酯）上與在培養盤上之生長情況的照片。 第9B圖顯示，於細胞培養試驗中，於第3天細胞在製備例3中所製備之非纖維形式薄膜（80 wt%膠原蛋白與20 wt%之聚己內酯）上與在培養盤上之生長情況的照片。 第10圖顯示，於細胞培養試驗中，於第6天細胞在比較製備例2中所製備之非纖維型式薄膜（90 wt%膠原蛋白與10 wt%之聚己內酯（以酸性水溶液為溶劑））上之生長情況的照片。
無。

Claims (34)

  1. 一種非纖維形式薄膜，其成分包括：一膠原蛋白以及一聚酯類高分子，其中該聚酯類高分子於該非纖維形式薄膜中的含量為1-60wt%，又其中該非纖維形式薄膜於一水性液體中具有1-200μm/小時的膨脹速率或0.1-2%/小時的單位時間膨脹比率。
  2. 如請求項1之非纖維形式薄膜，其中該膠原蛋白包括以下之至少一者：第一型膠原蛋白(type I collagen)、第二型膠原蛋白(type II collagen)與第三型膠原蛋白(type III collagen)。
  3. 如請求項1之非纖維形式薄膜，其中該膠原蛋白為第一型膠原蛋白。
  4. 如請求項1之非纖維形式薄膜，其中該聚酯類高分子於該非纖維形式薄膜中的含量為1-50wt%。
  5. 如請求項1之非纖維形式薄膜，其中非纖維形式薄膜之成分係由該膠原蛋白與該聚酯類高分子所組成，且該膠原蛋白與該聚酯類高分子之重量比為95：5、90：10、80：20、70：30或50：50。
  6. 如請求項1之非纖維形式薄膜，其中該聚酯類高分子的分子量為50,000-1,500,000Da。
  7. 如請求項1之非纖維形式薄膜，其中該聚酯類高分 子的固有黏度為0.15-7.0dl/g。
  8. 如請求項1之非纖維形式薄膜，其中該聚酯類高分子包括以下之至少一者：聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚甘醇酸(polyglycolic acid,PGA)、聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutyrate,PHB)與聚羥基戊酸酯(polyhydroxyvalerate,PHV)。
  9. 如請求項1之非纖維形式薄膜，其中該非纖維形式薄膜為多孔薄膜。
  10. 如請求項9之非纖維形式薄膜，其中該多孔薄膜之孔洞的孔洞尺寸為1-50μm。
  11. 如請求項9之非纖維形式薄膜，其中該聚酯類高分子為聚己內酯，其中該聚己內酯的分子量為800,000-1,500,000Da。
  12. 如請求項1之非纖維形式薄膜，其中該非纖維形式薄膜為無孔薄膜。
  13. 如請求項12之非纖維形式薄膜，其中該聚酯類高分子為聚乳酸，其中該聚乳酸之固有黏度為0.15-7.0dl/g。
  14. 一種非纖維形式薄膜，係由一方法所製備，其中該方法包括：(a)配製一混合溶液，其溶質，包括： 一膠原蛋白以及一聚酯類高分子，其中該聚酯類高分子於該溶質中的含量為1-60wt%，又，其溶劑包括，一全氟化碳溶劑；以及(b)將該混合溶液進行乾燥以形成一薄膜，其中該薄膜於一水性液體中具有1-200μm/小時的膨脹速率或0.1-2%/小時的單位時間膨脹比率。
  15. 如請求項14之非纖維形式薄膜，其中該溶質於該混合溶液中的濃度為0.5-20wt%。
  16. 如請求項14之非纖維形式薄膜，其中該膠原蛋白包括以下之至少一者：第一型膠原蛋白、第二型膠原蛋白與第三型膠原蛋白。
  17. 如請求項14之非纖維形式薄膜，其中該膠原蛋白為第一型膠原蛋白。
  18. 如請求項14之非纖維形式薄膜，其中該聚酯類高分子於該溶質的含量為1-50wt%。
  19. 如請求項14之非纖維形式薄膜，其中該溶質係由該膠原蛋白與該聚酯類高分子所組成，且該膠原蛋白與該聚酯類高分子之重量比為95：5、90：10、80：20、70：30或50：50。
  20. 如請求項14之非纖維形式薄膜，其中該聚酯類高分子的分子量為50,000-1,500,000Da。
  21. 如請求項14之非纖維形式薄膜，其中該聚酯類高分子的固有黏度為0.15-7.0dl/g。
  22. 如請求項14之非纖維形式薄膜，其中該聚酯類高分子包括以下之至少一者：聚己內酯、聚乳酸、聚甘醇酸、聚羥基丁酸酯與聚羥基戊酸酯。
  23. 如請求項14之非纖維形式薄膜，其中該非纖維形式薄膜為多孔薄膜。
  24. 如請求項23之非纖維形式薄膜，其中該多孔薄膜之孔洞的孔洞尺寸為1-50μm。
  25. 如請求項23之非纖維形式薄膜，其中該聚酯類高分子為聚己內酯，其中該聚己內酯的分子量為50,000-200,000Da。
  26. 如請求項14之非纖維形式薄膜，其中該非纖維形式薄膜為無孔薄膜。
  27. 如請求項26之非纖維形式薄膜，其中該聚酯類高分子為聚乳酸，其中該聚乳酸之固有黏度為0.15-7.0dl/g。
  28. 如請求項14之非纖維形式薄膜，其中該全氟化碳溶劑包括六氟異丙醇、六氟丙酮、1,1,1-三氯三氟丙酮、三氟乙酸、全氟過氫菲或全氟甲基環己烷。
  29. 如請求項14之非纖維形式薄膜，其中該水性液體包括水、緩衝溶液或培養液。
  30. 如請求項14之非纖維形式薄膜，其中該方法更包括於步驟(b)之後，對該薄膜進行一交聯處理。
  31. 如請求項30之非纖維形式薄膜，其中該交聯處理 之處理時間為0.1-10小時。
  32. 如請求項30之非纖維形式薄膜，其中該交聯處理係以一交聯劑進行，而該交聯劑包括甲醛、戊二醛、乙二醛、丙二醛、琥珀醛、苯二甲醛、雙醛澱粉、聚丙烯醛或聚甲基丙烯醛。
  33. 一種細胞層片，包括：請求項1或請求項14之非纖維形式薄膜；以及至少一細胞層於該非纖維形式薄膜上，其中該細胞層係由複數個細胞所構成，且該複數個細胞係以相同方向排列。
  34. 如請求項33之細胞層片，其中於該細胞包括纖維母細胞、成肌細胞、上皮細胞、內皮細胞、前驅細胞、肌腱細胞、幹細胞、間質幹細胞、骨髓幹細胞或脂肪幹細胞。
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