TWI772766B

TWI772766B - 奈米粒子及其製備方法與用途

Info

Publication number: TWI772766B
Application number: TW109109678A
Authority: TW
Inventors: 陳韻晶; 魯才德; 宋雲傑
Original assignee: 國立清華大學
Priority date: 2019-10-09
Filing date: 2020-03-23
Publication date: 2022-08-01
Also published as: US11517588B2; US20210106615A1; TW202114646A

Abstract

本發明提供一種奈米粒子及其製備方法與用途。

Description

奈米粒子及其製備方法與用途

本發明是有關於一種奈米粒子及其製備方法與用途。

根據美國癌症協會(American Cancer Society)的統計，肝癌是男性癌症中的第二主要死因。根據美國國家癌症研究所(National Cancer Institute)的統計，肝癌從2007至2013年的5年存活率在美國僅有17.6%。在台灣，2014年的肝癌新案例有11,358人，且死於肝癌的有8,179人。由於肝癌的高發生率及低存活率，發展出有效治療肝癌的策略實有其必要性。

腫瘤微環境(tumour microenvironment,TME)的一個公認的方面是維持腫瘤生長的血管之形成。但是，促血管生成與抗血管生成信號之間的不平衡會導致血管異常。由異常新血管組成的TME促使惡性進展的多個方面，諸如轉移及免疫抑制，並導致對化學療法及癌症免疫療法的抗性。與細胞毒性治療劑結合使用時，透過使腫瘤血管功能正常化來調節TME是一種提高抗癌功效的治療策略。

針對新生血管形成的抗血管生成療法有望治療癌症。然而，它僅在最初減少腫瘤血管並提供適度的存活益處。該治療還與重大的不良反應有關，包括誘導腫瘤缺氧，募集促血管生成及促炎性基質細胞以及減少化療藥物的滲透。作為簡單減少腫瘤血管的替代方案，幾種抗血管生成劑，諸如貝伐單抗(bevacizumab)、索拉非尼(sorafenib)及舒尼替尼(sunitinib)，也被證明可以作為潛在的血管正常化劑。用低劑量的抗血管生成藥物治療可暫時使腫瘤血管正常化，從而在與化學療法結合使用時可改善血管功能並協同抑制癌症進展。但是，必須調節抗血管生成劑的劑量及給藥時間，以實現血管生成及抗血管生成特性的微妙平衡，以使血管正常化。由於狹窄的正常化窗口，在臨床環境中使用抗血管生成劑進行血管正常化方法的應用仍然具有挑戰性。因此，本領域的研究人員迫切需要研發出用於調節腫瘤血管的新治療劑。

一氧化氮(NO)是一種多功能信號分子，在介導癌症的形成及發展中起著至關重要的作用。化學療法產生的高濃度一氧化氮直接誘導各種腫瘤的細胞毒性。內皮細胞中合成的一氧化氮不僅介導血管生成，還維持血管穩態及內皮功能。血管周圍一氧化氮梯度的產生可使腫瘤血管正常化，從而提高了對抗癌治療的反應。儘管該療法具有治療癌症的潛力，但是開發具有臨床實用性的基於一氧化氮的藥理療法仍然是主要的挑戰。各種有機(硝酸鹽/亞硝酸鹽及S-亞硝基硫醇(S-nitrosothiols))及無機(金屬亞硝醯基(metal nitrosyl))化合物被合成作為一氧化氮傳遞劑。但是，大多數一氧化氮傳遞劑的半衰期短，生物利用度低級腫瘤標靶性差，限制了它們在體內的功效。因此，本領域的研究人員積極研發新穎的一氧化氮傳遞劑以供治療癌症。

奈米粒子(nanoparticle,NP)在臨床醫學上可被用來遞送藥物(例如抗癌藥物)至標靶部位，因此在奈米技術領域及醫藥領域被認為具有高潛力。此外，奈米粒子的應用更包括藥物/基因遞送、光動力療法(photodynamic therapy)及MRI造影。相較於一般藥物，奈米粒子的好處包括腫瘤標靶配位子可修改性(tumor targeting ligands modifiability)、低毒性及較佳的藥物動力學。然而，習知的奈米粒子常會產生生物相容性差、穩定性不佳、對正常組織產生損傷及在到達目標部位前即降解的缺點。

為解決上述問題，若能開發出生物相容性及穩定性佳、對正常組織不會產生損傷、可治療癌症(例如肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC))、增強肝癌藥物之效用、增強肝癌疫苗之效用、及緩解腫瘤缺氧的新穎奈米粒子，將會對本領域的技術帶來相當大的突破，並造福有此需求的廣大族群。

有鑑於此，本發明之目的為提供一種奈米粒子，包含一核心。核心包含至少一個一氧化氮供體，且該核心透過一水包油(oil-in-water)單一乳化反應被包覆在一聚合物及一脂質中，以形成該奈米粒子。

本發明之另一目的為提供一種製備一奈米粒子的方法，包含以下步驟：(a)將一核心、一聚合物及一脂質溶於一有機相；(b)將該有機相添加至去離子水中，並進行一超音波處理，然後透過一水包油(oil-in-water)單一乳化反應得到一乳化物；以及(c)將該乳化物進行一離心處理，並收集沉澱物，然後將該沉澱物散浮於一緩衝液中，得到該奈米粒子；其中該核心包含至少一個一氧化氮供體，且該聚合物及該脂質透過該水包油單一乳化反應包覆該核心。

在本發明的一實施例中，奈米粒子具有一介於107nm~131nm的粒徑。

在本發明的一實施例中，該一氧化氮供體是雙亞硝基鐵錯合物(dinitrosyl iron complexes,DNICs)。

在本發明的一實施例中，該聚合物是聚乳酸聚乙醇酸(Poly[D,L-lactide-co-glycolide],PLGA)。

在本發明的一實施例中，該脂質為一乳化劑或一穩定劑。

在本發明的一實施例中，該乳化劑是D-α-生育酚聚乙二醇1000丁二酸酯(D-α-Tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate,TPGS)；且該穩定劑是選自於下列所構成之群組：1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000],DSPE-PEG)、膽固醇、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phophocholine,DOPC)及其任意組合。

本發明之另一目的為提供一種如前所述的奈米粒子用於製備一治療癌症之醫藥品的用途。

在本發明的一實施例中，該癌症是肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。

在本發明的一實施例中，該奈米粒子持續釋放一氧化氮。

在本發明的一實施例中，該奈米粒子的有效濃度為至少0.1mg/kg。

本發明之另一目的為提供一種如前所述的奈米粒子用於製備一增強肝癌藥物之效用的促效劑(agonist)之用途。

在本發明的一實施例中，該肝癌藥物是多柔比星(doxorubicin)或腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)。

本發明之另一目的為提供一種如前所述的奈米粒子用於製備一緩解腫瘤缺氧(tumor hypoxia)之醫藥品的用途。

本發明之另一目的為提供一種如前所述的奈米粒子用於製備一增強肝癌疫苗之效用的促效劑(agonist)之用途。

綜上所述，本發明奈米粒子之功效在於：生物相容性及穩定性佳、對正常組織不會產生損傷、可治療癌症(例如肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC))、增強肝癌藥物之效用、增強肝癌疫苗之效用、及緩解腫瘤缺氧。此外，本發明奈米粒子大幅改善一氧化氮供體在生物體中快速的半衰期，並能夠長時間的持續釋放一氧化氮，應用本發明奈米粒子可以作為抗癌治療藥劑，對於抑制腫瘤有傑出的效果，令其作為癌症輔劑，改善腫瘤微環境，可以大幅度增加化療、免疫治療和大分子蛋白治療的功效。本發明奈米粒子亦可以同時搭載不同的化療藥物，進行共同性的遞送。

以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

圖1是本發明奈米粒子的示意圖及穿透式電子顯微鏡影像圖。

圖2A是在不同的pH條件下，游離態的DNIC和本發明奈米粒子破壞DNIC的動力學數據圖。

圖2B是血清中從游離態DNIC及奈米粒子中DNIC破壞的動力學數據圖。

圖3是本發明奈米粒子在累積釋放一氧化氮上的效用之數據圖。

圖4A是本發明奈米粒子在抗癌上的效用之數據圖。

圖4B是本發明奈米粒子在抗癌上的效用之另一數據圖。

圖4C是本發明奈米粒子在抗癌上的效用之另一數據圖。

圖4D是本發明奈米粒子在抗癌上的效用之另一數據圖，其中ID/mL表示每mL的注射劑量(injected dose per mL)。

圖4E是本發明奈米粒子在抗癌上的效用之另一數據圖。

圖4F是本發明奈米粒子在抗癌上的效用之另一數據圖。

圖4G是本發明奈米粒子在抗癌上的效用之另一數據圖。

圖4H是本發明奈米粒子在抗癌上的效用之另一數據圖。

圖4Ia~圖4If是本發明奈米粒子在抗癌上的效用之數據圖。

圖4J是本發明奈米粒子在抗癌上的效用之另一數據圖，其中

表示對照組；

表示奈米粒子中DNIC的濃度為0.05mg/kg；

表示奈米粒子中DNIC的濃度為0.1 mg/kg；

表示奈米粒子中DNIC的濃度為0.25mg/kg；

表示奈米粒子中DNIC的濃度為0.5mg/kg；●表示奈米粒子中DNIC的濃度為1mg/kg；。

圖5A是本發明奈米粒子在低劑量正常化HCC中腫瘤血管的數據圖。

圖5B是本發明奈米粒子在腫瘤血管正常化上的效用之染色圖。

圖5C是本發明奈米粒子在腫瘤血管正常化上的效用之數據圖。

圖5D是本發明奈米粒子在腫瘤血管正常化上的效用之另一數據圖。

圖5E是本發明奈米粒子在腫瘤血管正常化上的效用之另一數據圖。

圖5F是本發明奈米粒子在腫瘤血管正常化上的效用之染色圖。

圖5Ga~圖5Gc顯示低劑量奈米粒子可正常化人類HCC(JHH-7)模型中腫瘤血管。

圖5H是本發明奈米粒子在腫瘤血管正常化上的效用之染色圖。

圖5I是本發明奈米粒子在低劑量增強藥物遞送效率並增強抗癌效力的治療方案。

圖5J是本發明奈米粒子在低劑量增強藥物遞送效率並增強抗癌效力的數據圖。

圖5K是分析DOX和BSA腫瘤滲透的治療方案之示意圖。

圖5L顯示在處理和未處理(對照組)小鼠中植入後24天原位HCC腫瘤的體積。

圖5M顯示低劑量奈米粒子(0.1mg/kg)對血管正常化治療的反應中FITC-BSA在腫瘤中的滲透率。

圖5N顯示TRAIL治療與低劑量奈米粒子的結合顯著增加了腫瘤中細胞凋亡的誘導。

圖5O顯示低劑量奈米粒子(0.1mg/kg)與重組TRAIL蛋白(LD：5mg/kg或HD：20mg/kg，用於HCA-1 HCC模型)聯合治療時原位HCC腫瘤的體積。

圖5P顯示CCl₄誘導的HCC模型的治療方案。

圖5Q顯示低劑量奈米粒子治療後，CCl₄誘導的HCC中吡莫尼唑陽性染色指示腫瘤缺氧區域。

圖5R顯示用流式細胞儀測定的低劑量奈米粒子治療後HCC中Hoechst 33342陽性細胞的百分比。

圖5S顯示在CCl₄誘導的自發性HCC模型中，低劑量奈米粒子可以減少腫瘤缺氧。

圖5T顯示TRAIL療法與低劑量奈米粒子的結合可增加CCl₄誘導的HCC腫瘤的凋亡誘導。

圖6A顯示TAM分析的治療時間表。

圖6Ba~圖6Bd顯示在CCl₄誘導的HCC模型中，低劑量奈米粒子重編程免疫抑制性TAM，並增加腫瘤浸潤性T細胞。

圖6C顯示透過流式細胞儀檢測，低劑量奈米粒子增加了腫瘤中的CD4和CD8 T細胞。

圖6D顯示流式細胞術確定T細胞亞群的閘控策略。

圖6E顯示DNIC觸發了HCA-1 HCC細胞中SP1的活化。

圖6F是本發明奈米粒子對腫瘤微環境的重編程之數據圖。

圖6G是本發明奈米粒子對腫瘤微環境的重編程之西方墨點染色圖。

圖6H是本發明奈米粒子對腫瘤微環境的重編程之西方墨點染色圖及免疫螢光圖。

圖6I是本發明奈米粒子對腫瘤微環境的重編程之治療方案。

圖6Ja及圖6Jb顯示cGM-CSF修飾的全細胞癌疫苗的生成和功能分析。

圖6K顯示低劑量奈米粒子和疫苗治療的組合可顯著降低腫瘤大小。

圖6L顯示低劑量奈米粒子和疫苗治療的組合在原位HCC模型中可增加總生存率。

圖6M顯示透過流式細胞術(n=10小鼠)，在植入或未使用奈米粒子和/或HCC疫苗治療後24天，檢測HCA-1腫瘤中顆粒酶B陽性CD8 T細胞的百分比。

圖6N顯示透過免疫螢光染色，在植入或未使用奈米粒子和/或HCC疫苗治療後24天，檢測HCA-1腫瘤中顆粒酶B陽性CD8 T細胞的百分比。

圖7A顯示游離DNIC調節轉移性病變中的TME並抑制HCC的轉移進程。

圖7B顯示游離DNIC調節轉移性病變中的TME並抑制HCC的轉移進程。

圖7C顯示用ImageJ量化來自侵襲的圖像(n=10個生物學獨立的樣品)和傷口癒合分析(n=3個生物學獨立的樣品)。

圖7D顯示DNIC在缺氧條件下(1%氧氣)逆轉HCA-1細胞的EMT表現型。

圖7E顯示自發發生的肺轉移模型的治療方案。

圖7Fa及圖7Fb顯示在用奈米粒子處理的小鼠中，原位HCA-1 HCC模型中自發發生的肺轉移性結節的數量減少。

圖7G顯示與原位HCA-1 HCC模型中未治療的對照組相比，低劑量的奈米粒子治療不影響原發腫瘤大小。

圖7Ha~圖7Hc顯示用奈米粒子處理後，自發發生的轉移性肺結節中量化TME中的變化。

圖7I顯示了肺轉移性結節中CD31 ⁺凝集素⁺染色指示的功能性血管的代表性免疫螢光圖像。

圖7J顯示用高劑量(1mg/kg)或低劑量(0.1mg/kg)奈米粒子治療後自發發生的轉移性肺結節中具有周細胞覆蓋(NG2/CD31)的功能性血管變化的量化。

圖7K顯示用奈米粒子處理後自發發生的轉移性肺結節中Hoechst 33342陽性細胞(n=8小鼠)的百分比。

圖7La及圖7Lb顯示低劑量奈米粒子重編程自發性轉移性肺結節中的免疫抑制TAM。

圖7M顯示用奈米粒子處理後自發發生的轉移性肺結節中CD4和CD8 T細胞的浸潤。

圖7N顯示實驗性肺轉移模型的治療方案及治療成效。

定義

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。

如本文中所使用的用語「奈米粒子(nanoparticle)」意指粒徑小於1μm的粒子。較佳地，本發明的奈米粒子具有一介於107nm~131nm的粒徑。

如本文中所使用的用語「促效劑(agonist)」意指可直接、間接或實質誘導、促進或增強另一分子之生物活性或受體活化的分子。

如本文中所使用的用語「腫瘤缺氧(tumor hypoxia)」意指正常與腫瘤組織之間在氧氣位準(oxygen level)上具有生理差異，其中相較於正常組織，腫瘤組織中的氧分壓(partial pressure of oxygen)減少。

依據本發明，醫藥品可利用熟習此藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或口服地(orally)投藥的劑型，這包括，但不限於，注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)以及類似之物。

依據本發明，醫藥品可以一選自於下列所構成的群組中的非經腸道途徑來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)、舌下投藥(sublingual administration)以及穿皮投藥(transdermal administration)。

依據本發明，醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該醫藥上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑 (lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它們的組合。

依據本發明，下面實施例所用的統計學分析是使用GraphPad Prism 6進行。根據數據分佈，使用學生t-檢定(Student’s t-test)或曼惠特尼U檢定(Mann-Whitney U-test)比較兩組之間的差異。單因子變異數分析(One-way ANOVA)及事後比較檢定(Tukey post hoc test)用於比較3或更多組之間的差異。數值呈常態分佈，比較組之間的變異相似。p-值小於0.05被認為具有統計學顯著性。

以下實驗所用到的鼠肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)細胞株HCA-1、人肝細胞癌細胞株JHH-7、Hep3B及人類肺纖維母細胞(Human Lung Fibroblasts)HLF由Dr.Dan Duda(波士頓麻薩諸塞州總醫院)提供。人肝細胞癌細胞株Mahlavu由Dr.Han-Chung Wu(中研院，台灣)提供。人單核細胞株THP-1(ATCC^®TIB-202^TM)購自ATCC。HUVECs從食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC)獲得(BCRC編號為H-UV001)。鑑定細胞株並測試支原體(mycoplasma)。HCA-1和Mahlavu細胞在高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)中培養；JHH-7和HLF細胞在DMEM/F12培養基中培養；Hep3B細胞在最低必需培養基Alpha(MEMα)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中培養；THP-1細胞保持在RPMI-1640(紐約州康寧)中。所有培養基均補充有10%的胎牛血清(FBS)和1%的抗生素(青黴素和鏈黴素，HyClone，Logan，UT)。在含有20% FBS、ECGS(30μg/mL)、肝素(25U/mL)和L-麩胺酸(L-glutamine)(2mM)的199號培養基(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中培養HUVECs。透過與20ng/mL佛波醇12-肉荳蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)培育72小時，THP-1細胞分化為巨噬細胞。

依據本發明，聚乳酸聚乙醇酸(Poly[D,L-lactide-co-glycolide],PLGA)(50/50，固有黏度：0.17dl/g)是購自於Green Square Materials Incorporation(台灣桃園)；1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000],DSPE-PEG)、膽固醇、及1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phophocholine,DOPC)是購自於Avanti Polar Lipids(Alabama,USA)；D-α-生育酚聚乙二醇1000丁二酸酯(D-α-Tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate,TPGS)及二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自於Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。

實施例1. 本發明奈米粒子的製備及特性

首先，根據Lu,T.T.et al.Anionic Roussin’s red esters(RREs)syn-/anti-[Fe(mu-SEt)(NO)₂]₂(-)：the critical role of thiolate ligands in regulating the transformation of RREs into dinitrosyl iron complexes and the anionic RREs.Inorg.Chem. 47,6040-6050(2008)文獻所述方法合成雙亞硝基鐵錯合物(dinitrosyl iron complexes,DNICs)[Fe(μ-Set)₂(NO)₄](包覆在奈米粒子中的DNIC，其為一種一氧化氮供體)及[Fe(μ-SCH₂CH₂OH)₂(NO)₄](游離態的DNIC)。聚乳酸聚乙醇酸(Poly[D,L-lactide-co-glycolide],PLGA)(50/50，固有黏度：0.17dl/g)購自Green Square Materials Incorporation(台灣桃園)及1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000],DSPE-PEG)、膽固醇及1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phophocholine,DOPC)購自Avanti Polar Lipids(美國阿拉巴馬州)。D-α-生育酚聚乙二醇1000丁二酸酯(D-α-Tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate,TPGS)及二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。

接著，以下列流程合成NBD-DNIC[(NBD-NHCH₂CH₂S)Fe(NO)₂]₂：將Fe(NO)₂(四甲基乙二胺)(Fe(NO)₂(Tetramethylethylenediamine))(1mmol)加入到含有NBD-NHCH₂CH₂SH(1mmol)的燒瓶中。將混合物溶液攪拌60分鐘，並在減壓下除去溶劑。透過從THF/己院中再結晶來純化得到的深褐色固體。產量：0.292g,91.4%。FTIR(THF)1812(w),1779(vs),1752(s)cm^-1(ν_NO)。

之後，以下列流程製備奈米粒子並測定其特性：本發明奈米粒子是透過水包油(oil-in-water)單一乳化反應來製備。將PLGA(0.75mg)、DSPE-PEG(0.0807mg)、D-α-生育酚聚乙二醇1000丁二酸酯(D-α-Tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate,TPGS)(0.375mg)、膽固醇(0.0375mg)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phophocholine,DOPC)(0.0375mg)和DNIC(0.15mg)溶解在63μL有機相中。接著，將有機相滴加到441μL去離子水中(油和水的體積比=1/7)。在冰上用20個超音波處理循環總共1分鐘40秒形成乳化物。每個循環包括5秒鐘的超音波脈衝，隨後是Q125超音波器(Qsonica，Newtown，CT，美國)的5秒鐘脈衝關閉時間(功率40W)。為了獲得奈米粒子，將乳化物在25,001rcf下以25,001rcf離心20分鐘。將所得的沉澱物再散浮於PBS緩衝液中，得到奈米粒子。奈米粒子大小和表面電荷透過Zetasizer(300HS，Malvern Instruments Ltd.，伍斯特郡，英國)測定。使用穿透式電子顯微鏡(H-7500，Hitachi High-Tech，東京，日本)測定奈米粒子大小和形態。

圖1是本發明奈米粒子的示意圖及穿透式電子顯微鏡影像圖，其中比例尺為200nm。數據顯示平均值±s.e.m.，來自5個實驗。表1顯示本發明奈米粒子的大小和形態，其中PDI表示多分散性指數(polydispersity index)；EE表示包覆效率(encapsulation efficacies)；Zeta表示界達電位(zeta potentials)。

由圖1及表1可見，透過將DNIC[Fe(μ-Set)₂(NO)₄]包覆到脂質-PLGA奈米粒子中來組裝本發明奈米粒子(圖1)。穿透式電子顯微鏡和動態光散射分析顯示，本發明奈米粒子包含均勻分散的球體，平均直徑為119±12nm，多分散性指數(PDI)為0.146±0.030。DNIC包覆的裝載效率(EE)約為80±5%。

實施例2. 本發明裝載有DNIC的奈米粒子及游離態DNIC的穩定性測試

將游離態DNIC和本發明奈米粒子用PBS緩衝液或乙酸緩衝液(pH 4.0或5.5)散浮，然後在37℃、200rpm的迴轉式振盪器(Orbital Shaker)中作用。在不同的時間點收取溶液，將其溶於DMSO中，並透過UV分光光度計在360nm下進行分析。

在37℃的生理和酸性pH條件下，評估DNIC分解的動力學曲線以及伴隨的NO從奈米粒子的釋放。圖2A是在不同的pH條件下，游離態的DNIC和本發明奈米粒子破壞DNIC的動力學數據圖。將游離態的DNIC和奈米粒子在PBS緩衝液或乙酸緩衝液中於4.0~7.4的pH中反應，並使用UV分光光度計在360nm下測量DNIC的破壞(n=5獨立樣品)。結果以初始DNIC的百分比表示。與7.4 pH下的奈米粒子相比，**表示P=0.0094和***表示P=0.0004。

圖2B是血清中(pH 7.4)從游離態DNIC及奈米粒子中DNIC破壞的動力學數據圖。將游離態的DNIC和奈米粒子在含有10%胎牛血清的PBS中於37℃作用。使用UV分光光度計在360nm下測量DNIC的破壞。結果以初始DNIC的百分比表示(n=3個樣品)。所有數據均顯示為平均值±s.e.m.。由圖2A及2B可見，將DNIC包覆到奈米粒子中可改善其穩定性，延長半衰期為24.4±2.5小時，而在生理條件(pH值為7.4)下游離態的DNIC表現為3.9±1.5小時。此外，在生理條件(pH值為7.4)下以奈米粒子形式存在的DNIC的分解速率要慢於在酸性條件下(pH為4.0)觀察到的分解速率(圖2A)。這種差異可能歸因於PLGA的不同降解速率以及在不同pH條件下裝載在奈米粒子中的DNIC的穩定性，其中於低pH值時，PLGA的水解速度會比較快，因此會影響釋放。pH依賴的奈米粒子分解表明在酸性內體/溶酶體(endosomes/lysosomes)中從奈米粒子有效釋放了一氧化氮，同時也使一氧化氮滲透並分布到腫瘤微環境(TME)或進入癌細胞。

實施例3. 本發明奈米粒子在累積釋放一氧化氮上的效用評估

接著，使用NO-專一性4,5-二胺基-N,N,N',N'-四乙基羅丹明(4,5-diamino-N,N,N',N'-tetraethylrhodamine,DAR-1)螢光探針評估隨時間從本發明奈米粒子累積釋放的一氧化氮(NO)。

在pH 7.4和37℃下探討一氧化氮從游離態DNIC或本發明奈米粒子的釋放曲線。簡言之，將游離態DNIC和本發明奈米粒子用PBS緩衝液懸浮。將最終濃度為20μM的DAR-1加入溶液中，然後在37℃、200rpm的迴轉式振盪器上作用。在不同的時間點，收取溶液，並使用微盤分析儀(Spark 10M，Tecan，德國)測量螢光強度(在560nm處激發，在595nm處放射)。

圖3是本發明奈米粒子在累積釋放一氧化氮上的效用之數據圖。在生理條件(pH值為7.4)下，NO從游離態DNIC和本發明奈米粒子中釋放出來。將游離態DNIC和本發明奈米粒子在pH 7.4的PBS緩衝液中作用，並根據NO專一性探針DAR-1的螢光強度(560nm激發和595nm放射)測量NO的釋放。結果以與時間0相比的倍數變化表示(游離態DNIC，n=5；奈米粒子；n=4個獨立樣品)。與游離態DNIC相比，*表示P=0.0159。FL表示螢光強度。

由圖3可見，與在活體外從游離態DNIC迅速釋放出NO的過程(在最初的兩個小時期間)相反，從奈米粒子穩定釋放出NO的過程持續了2至48小時。

上述結果顯示，本發明奈米粒子對於將NO持續遞送和控制釋放到腫瘤中是理想的。

實施例4. 本發明奈米粒子在抗癌上的效用評估

4.1 活體外實驗

首先，對病人進行存活分析。319例肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者的NOS2和NOS3 mRNA資料來自癌症基因體圖譜(Cancer Genome Atlas)。從cBio portal網站下載mRNA表現數據和無病生存數據。計算NOS2和NOS3 mRNA表現位準(level)的總和來計算患者的風險評分。將患者分為高表現或低表現組，風險評分的中位數作為閾值。使用Kaplan-Meier方法獲得高表現和低表現組的生存曲線，並使用對數排序檢定(log-rank test)進行比較(雙側)。

肝細胞癌(HCC)中的誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和內皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)衍生的NO可能是腫瘤進展和血管生成的重要調節子。美國癌症基因體圖譜資料庫(Cancer Genome Atlas database)的分析確定了eNOS和iNOS表現與HCC更好的無病存活率(又稱無復發存活期)(p=0.036)之間呈正相關。這表明NO傳遞進入肝癌的可能的治療益處(圖4A、圖4B、表2及表3，其中圖4A及圖4B高低為該種基因整體表現量較高或較低)。在圖4B中，雖然不顯著，eNOS或iNOS表現與無病存活率(DFS)增加相關(分別為P=0.142，P=0.169)。生存曲線比較為使用對數排序的Mantel-Cox測試(雙側)執行。

以下實驗所用到的反轉錄定量即時PCR(Reverse transcription quantitative real time PCR)的流程如下：使用RNeasy Mini套組(Qiagen,CA,USA)，從HUVECs或與流分選的腫瘤相關巨噬細胞中萃取總RNA。使用高容量cDNA反轉錄套組(High-Capicity cDNA Reverse Transcription Kit)(Applied Biosystems,CA,USA)合成cDNA。使用用於Arignase-1、CCL17、CCL22、IL10、MRC1、CXCL9、IL-1β、TNF-α、CXCL-11、NOS2、NOS3、Snail、Slug、Zeb1、Zeb2、Trim28、纖維連接蛋白(Fibronectin)、中間絲(Vimentin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、PD-L1、S1PR1、ANGPT1、PDGF-B、VEGFA、ANGPT2、EGF、IL-6、PPARγ、TGFβ、GAPDH和β-肌動蛋白(β-actin)的專一性引子(表2)，並使用Real-Time SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,CA,USA)在QPCR系統上測定相對基因表現。比較閾值循環法(comparative threshold cycle method)用於計算基因表現的倍數變化，將其以β-肌動蛋白標準化。

在表3中，iNOS在HCA-1小鼠肝癌細胞中表現較低，在正常的FL83B肝細胞(從食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC)獲得(BCRC編號為60325))中表現較高。iNOS和eNOS mRNA在HCA-1細胞和FL83B肝細胞中的表現透過定量PCR檢測(n=4生物學獨立的樣品)。所有數據均顯示為平均值±s.e.m.，使用雙尾曼惠特尼U(Mann-Whitney U)檢定進行分析。*表示P=0.0286。

在表4中，iNOS和eNOS均以較低的表現位準表現於腫瘤組織中，以較高的表現位準表現於健康肝組織中。從原位HCA-1 HCC模型解剖組織。iNOS和eNOS nRNA表現水平分別為透過定量PCR測定(n=5隻小鼠)。所有數據均顯示為平均值±s.e.m.使用雙尾曼惠特尼U(Mann-Whitney U)檢定進行分析。*表示P=0.0286，**表示P=0.0079。

接著，測量游離態DNIC及本發明奈米粒子的細胞毒性。將HCC細胞和HUVECs在無血清培養基中暴露於游離態DNIC或本發明奈米粒子48小時。處理後，加入15μL的5mg/mL 3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)試劑，並在37℃下作用3小時。吸取培養基，並加入50μL的DMSO。使用UV-Vis掃描儀*Multiskan GO，Thermo，USA)在570nm下測量吸光值。

本發明測量游離態DNIC及其奈米級配方奈米粒子對HCC細胞株和人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的細胞毒性，HUVEC是研究血管生成的內皮細胞模型。游離態DNIC在人HCC(Mahlavu、Hep3B、JHH-7及HLF)和鼠類HCC(HCA-1)細胞株和HUVEC中顯示出細胞毒性(圖4C)。在圖4C中，游離態DNIC和奈米粒子在HCC細胞和HUVEC中顯示出細胞毒性(n=5個生物學獨立的樣品)。

在大多數體外HCC細胞中，發現本發明奈米粒子的細胞毒性顯示的IC₅₀值是游離NO供體的IC₅₀值的兩倍。體外細胞毒性降低可能是由於NO從奈米粒子緩慢釋放所致。儘管在體外用奈米粒子觀察到有限的直接細胞毒性，但本發明進一步研究了其在體內應用的潛力，在這種應用中，它可以有效地將NO釋放並持續釋放到HCC中，並伴隨其他治療產生協同的抗癌作用。

4.2 活體內實驗

接著，本發明在使用HCA-1生成的原位鼠HCC模型中評估了本發明奈米粒子的藥代動力學和生物分佈。C3H/HeNCrNarl雄性小鼠和雄性裸鼠購自國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center)(台灣台北)。將HCA-1小鼠肝癌細胞原位植入6~8週齡雄性C3H小鼠的肝臟中。將人類HCC JHH-7細胞原位植入6~8週齡雄性裸鼠的肝臟中。所有動物均受到美國國家科學院(National Academy of Sciences)發布的“實驗動物的護理和使用指南”的人道關懷，所有研究程序和實驗方案均獲得了清華大學動物研究委員會(Animal Research Committee of National Tsing-Hua University)(新竹，台灣)認可。

藥代動力學和組織分布實驗的流程如下：將帶有HCA-1細胞原位植入物的C3H/HeNCrNarl雄性小鼠靜脈內注射游離態DNIC(10mg/kg)或奈米粒子(7.5mg/kg)。在不同時間點，從眼眶竇收集200μL血液，並與50μL的1000U/mL肝素(Sigma，美國)混合。為了評估組織分佈，在投藥後四小時，犧牲小鼠。收集組織並在裂解緩衝液(10mM Tris-HCl、1% Triton X-100、0.1% SDS、0.1% SDC和140mM NaCl)中均質。將組織裂解物在冰上保持30分鐘，並在25℃下以25,001rcf在4℃下離心30分鐘，並收集上清液。透過電子順磁共振(electron paramagnetic resonance)(EPR plus，Bruker，德國)測量DNIC信號。將HSCH₂CH₂OH(1mM)添加到血清或組織裂解物中，以將所有DNIC轉化為EPR活性形式進行分析。根據透過DNIC或奈米粒子的量獲得的標準曲線計算DNIC濃度。

圖4D是本發明奈米粒子在抗癌上的效用之另一數據圖，其中ID/mL表示每mL的注射劑量(injected dose per mL)。在圖4D中顯示不同配方中DNIC的血清濃度曲線(游離DNIC，n=5小鼠；奈米粒子，n=6小鼠)。由圖4D可見，與靜脈內投藥後的游離態DNIC相比，本發明奈米粒子顯著延長了DNIC的循環。

表5比較DNIC在原位HCA-1腫瘤的C3H小鼠中不同配方(游離態DNIC和奈米粒子)的藥代動力學參數，其中非隔室分析(Non-compartmental analysis)用於藥代動力學參數分析，AUC表示曲線下面積；CL表示間隙(clearance)；H表示小時；t_1/2表示半衰期；V_ss表示穩態容積分配。表4顯示與游離態DNIC相比，裝載有DNIC的奈米粒子的半衰期(t_1/2)增加了25倍。

圖4E顯示DNIC在不同配方中的組織分佈(游離態DNIC，n=4小鼠；奈米粒子，n=5小鼠)，其中ID/g表示每克注射劑量；*表示與游離態DNIC相比，P=0.0159。靜脈內給藥後四小時，與游離態DNIC相比，觀察到奈米粒子中DNIC的肝臟吸收增加。更重要的是，使用本發明奈米粒子導致HCC腫瘤中DNIC的大量積累(圖4E)，而游離態DNIC在腫瘤中的遞送和積累卻很差(圖4E)。這些結果表明，本發明奈米粒子具有比游離態DNIC更好的腫瘤標靶能力，而對於其他器官(例如心臟、脾臟、肺臟及腎臟)則無顯示出明顯的標靶能力。

接著，NBD標記的DNIC用於追蹤游離態DNIC和奈米粒子的細胞內傳遞，NO專一性螢光探針DAR-1用於評估HCC中游離DNIC和奈米粒子釋放的NO的滲透性。在圖4F中，向小鼠靜脈內注射裝載NBD標記的DNIC的奈米粒子或游離態NBD標記的DNIC(7.5mg/kg)後四小時，HCC腫瘤的顯微照片顯示DNIC攝取(綠色)和NO釋放(紅色)，其中4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(一種能夠與DNA強力結合的螢光染料)為藍色，比例尺為50μm。實驗獨立地重複兩次。由圖4F可見，與游離態DNIC相比，本發明奈米粒子在HCC腫瘤中對腫瘤的吸收增加導致NBD標記的DNIC的滲透增加以及NO的釋放。

在圖4G中，從奈米粒子釋放的NO位於血管周邊區域。在小鼠中靜脈內投藥奈米粒子或游離態DNIC(10mg/kg)後四小時，使用DAR-1在腫瘤中檢測到NO釋放(紅色)。箭頭指示血管周圍NO梯度。比例尺為20μm。用Zeiss LSM 780共軛焦顯微鏡對NO的釋放進行成像和定量(來自四隻小鼠的n=7個切片圖像)。實驗獨立地重複兩次。

由圖4F及圖4G可見，從NBD標記的DNIC/奈米粒子釋放的NO不僅在血管周邊區域(與CD31陽性細胞相鄰)中集中並與NBD標記的DNIC/奈米粒子部分共定位，而且滲透到腫瘤組織中，導致血管周邊NO梯度升高。

接著，本發明評估了透過奈米粒子實現增強的NO積累是否導致原位鼠(HCA-1)和人(JHH-7)HCC模型中的腫瘤生長抑制。圖4H是本發明奈米粒子處理方案的示意圖。在圖4H中，植入HCC細胞10天後，在第10、12、14、17、19和21天用不同劑量的奈米粒子處理小鼠，並在第24天測量腫瘤大小(對照組，n=15小鼠；1mg/kg奈米粒子，n=15小鼠；0.05和0.1mg/kg奈米粒子，n=10小鼠；0.25mg/kg奈米粒子，n=4小鼠；0.5mg/kg奈米粒子，n=7小鼠)。所有數據均顯示為平均值±s.e.m.。圖4Ia~圖4If顯示空白奈米粒子對腫瘤微環境和腫瘤生長的影響，其中圖4Ia~圖4Ic顯示全身注射空白奈米粒子(未包覆DNIC的奈米粒子)未改變MVD；圖4Ia：腫瘤缺氧；圖4Ib：被抗-NG2/抗-CD31雙染的功能性血管的比例；圖4Ic：與未處理的對照組相比，原位HCA-1腫瘤中的抗NG2/抗CD31雙染的周細胞覆蓋率(pericyte coverage)(未處理的對照組，n=10；空白奈米粒子，n=9)；圖4Id及圖4Ie顯示空白奈米粒子處理後，HCA-1腫瘤組織中CD4(d)和CD8(e)T細胞浸潤保持不變(未處理的對照組，n=10小鼠；空白奈米粒子，n=6小鼠)；圖4If：空白奈米粒子處理的原位HCA-1 HCC模型中的腫瘤大小(未處理的對照組，n=15小鼠；空白奈米粒子，n=4小鼠)。所有數值均表示平均值±s.e.m。使用雙尾曼惠特尼U檢定進行分析。

由圖4H及4Ia~4If可見，在HCA-1和JHH-7模型中，高劑量的奈米粒子處理(DNIC：0.5-1mg/kg)均顯著抑制了HCC的生長，其中圖4Ia~4If說明單只有奈米粒子載體不會有治療的效果，效果都是因為奈米粒子載體搭載DNIC。

圖4J顯示奈米粒子的體內投藥未顯示全身毒性，其中在所有奈米粒子治療組中，小鼠的體重均無明顯變化，在存在或缺少用不同劑量的奈米粒子治療的情況下，在植入後24天測量體重(對照組，n=14隻小鼠；0.05、0.1、0.5和1mg/kg奈米粒子，n=7隻小鼠；0.25mg/kg奈米粒子，n=5隻小鼠)。數據顯示為平均值±s.e.m.。

表6顯示本發明奈米粒子的毒性資料。測量健康C3H小鼠中未處理(對照組)或用1mg/kg奈米粒子處理的小鼠血清中肝臟酵素位準。處理後24小時取血清樣品(n=6隻小鼠)。數據顯示為平均值±SD。ALT表示丙胺酸轉胺酶(alanine aminotransferase)；AST表示天門冬胺酸轉胺酶；ALP表示鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)；γ-GT表示γ-麩胺醯基轉胜肽酶(gamma glutamyl transpeptidase)。

表7顯示在健康C3H小鼠中用PBS對照組、游離態DNIC和低劑量奈米粒子(0.1mg/kg)處理後1小時和24小時記錄血壓。健康C3H小鼠的收縮壓和舒張壓透過不同處理後的Visitech Systems測量(n=4小鼠)。數據顯示為平均值±SD。

本實施例的結果表明，本發明奈米粒子以劑量依賴性方式顯示出抗癌作用。在動物安全性研究中，本發明奈米粒子具有良好的耐受性，與未治療的小鼠相比，無體重減輕，血壓和肝臟酵素位準無變化(圖4J及表7)。

實施例5. 本發明奈米粒子在腫瘤血管正常化上的效用評估

以下實驗所用到的腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)處理流程如下：從Addgene(Plasmid # 21811；Cambridge，MA，USA)購買了His₆標記的人類TRAIL(aa95-281)表現質體(pQE-hTR)。為了表現His₆-TRAIL，將該質體轉形到BL21(DE3)細菌中，並透過Ni-NTA瓊脂珠上的親和層析(affinity chromatography)純化。

向原位HCC小鼠注射TRAIL(2.5、5或20mg/kg/劑量，十劑，每週五劑)和低劑量奈米粒子(0.1mg/kg)。第一次處理後兩週，犧牲小鼠進行進一步分析。

以下實驗所用到的肝癌藥物多柔比星(doxorubicin,DOX)灌注及處理流程如下：植入HCC細胞10天後，對小鼠靜脈內注射奈米粒子(0.1mg/kg/劑量，六劑，每週三劑)。處理2週後，給小鼠靜脈內注射DOX(8mg/kg)。注射後一小時，將腫瘤組織包埋在Tissue-Tek(OCT化合物)中，並在液氮中冷凍。將腫瘤組織切成薄片(10μm厚)到載玻片上，並用DAPI(Vector Laboratories，Burlingame，CA)複染。藉由使用共焦雷射掃描顯微鏡(LSM780，Zeiss，德國)對DOX灌注進行成像。圖像是每組三隻小鼠的代表性切片。

為了評估聯合療法的治療效果，在植入後10天開始，將具有或不具有低劑量奈米粒子(0.1mg/kg)的DOX(1或4mg/kg)靜脈內投藥於患有原位HCC的小鼠。治療2週後評估腫瘤體積。

以下實驗所用到的藉由TUNEL染色評估細胞凋亡之流程如下：根據製造商的操作指引，使用TACSTM TdT套組(R & D Systems，明尼蘇達州明尼阿波利斯市，MN)對冷凍的腫瘤切片進行染色。在隨機選擇的視野中計數凋亡細胞。

以下實驗所用到的活體顯微鏡(intravital microscopy)的操作流程如下：靜脈內注射BSA-FITC(40mg/kg)後，在Zeiss LSM 780顯微鏡上用10X Achroplan IR透鏡(NA=0.4)進行多光子成像。使用LSM 780中的高靈敏度38通道Quasar檢測器(high-sensitivity 38-channel Quasar detector)收集了鎖定在920nm的鈦藍寶石雷射(Ti-sapphire laser)的兩光子激發和500~600nm內發射的光子。在LSM 780中獲得了1024 x 1024像素的成像幀(Imaging frames)，每5分鐘以每秒1幀的速度總計30分鐘。圖像是每組三隻小鼠的代表性切片。

以下實驗所用到的免疫染色之流程如下：將腫瘤組織包埋在Tissue-Tek(OCT化合物)中，並保持在-80℃冷凍。然後，將組織切片(10μm厚)並在-20℃的丙酮中固定10分鐘，並用PBS洗滌。然後，將切片在室溫下用5%牛血清白蛋白溶液封閉1小時，並與抗CD31(ab28364，Abcam，MA，USA)、顆粒酶B(ab4059，Abcam，MA，USA)、PD-L1(Clone 10F.9G2,Biolegend,CA,USA)或NG2(clone 132.38,Millipore,CA,USA)的一抗在4℃培育過夜。將切片用PBS洗滌，並與Alexa Fluor^® 488或Alexa Fluor^® 647抗兔IgG二抗(Life Technologies，Grand Island，NY)在室溫下培育1小時。用PBS洗滌切片，並用DAPI(Vector Laboratories，Burlingame，CA)複染。透過使用共焦雷射掃描顯微鏡(LSM780，Zeiss，德國)對所有切片成像。

為了分析腫瘤缺氧，在犧牲動物前一個小時靜脈內注射缺氧標記物吡莫尼唑(pimonidazole)(Hypoxyprobe，Hypoxyprobe Inc.，60mg/kg)。使用抗Hypoxyprobe-FITC標記的抗體對吡莫尼唑進行免疫染色，以評估冷凍組織切片中的缺氧。使用共焦雷射掃描顯微鏡對所有切片成像。圖像是每組四隻小鼠的代表性切片。

為了分析功能性血管，在犧牲動物之前5分鐘靜脈內注射FITC標記的番茄(Lycopersicon esculentum)凝集素(配於PBS中100μL，Vector Laboratories，Burlingame，CA)。將腫瘤組織包埋在Tissue-Tek(OCT化合物)中，並立即在液氮中冷凍。

以下實驗所用到的腫瘤區域中的NO分布的流程如下：將具有原位植入HCA-1細胞的C3H/HeNCrNarl雄性小鼠靜脈內注射游離態DNIC和奈米粒子(10mg/kg)。投藥後四小時，犧牲小鼠。將腫瘤組織包埋在Tissue-Tek(OCT化合物)中，並立即在液態氮中冷凍。將腫瘤組織切片(10μm厚)到載玻片上。將載玻片用PBS洗滌，並與100μM DAR-1(Sigma，USA)在37℃下作用1小時。將切片用PBS洗滌並用DAPI(Vector Laboratories，Burlingame，CA)複染。透過使用共焦雷射掃描顯微鏡(LSM780，Zeiss，德國)對所有切片成像。圖像是每組四隻小鼠的代表性切片。

NO在調節TME中的血管生成和維持脈管系統功能方面起著至關重要的調節作用。為了測試NO對血管生成和血管成熟的直接作用，本發明探討了游離態DNIC處理後HUVECs中7種血管生成相關基因的表現圖譜。本發明發現3種促血管生成基因(VEGFA、ANGPT2和EGF)在HUVEC中被下調，而2種與血管成熟相關的基因(S1PR1和ANGPT1)在用NO供體DNIC處理後顯著上調(圖5A)。

圖5A是本發明奈米粒子在低劑量正常化HCC中腫瘤血管的數據圖。用RT-qPCR測定DNIC(1μM)處理後24小時，HUVEC中促血管生成和血管穩定因子的表現。結果表示為相對於未處理的對照組(n=9個生物學上獨立的樣品)的倍數變化。數據來自三個獨立的實驗。*表示P=0.0314，**表示P=0.0012和****表示P=0.0001。結果表明，暴露於DNIC可能直接重新編程內皮細胞的基因表現圖譜，從而從促血管生成表現型轉變為腫瘤中的血管穩定標記。

除了NO對血管生成和血管穩定的直接作用外，已知血管周邊NO梯度可以使扭曲的腫瘤血管結構和功能正常化。因此，本發明評估了奈米粒子在原位鼠(HCA-1)和人(JHH-7)HCC模型中對平均血管密度(mean vessel density,MVD)和血管正常化的影響。

圖5B顯示高劑量(1mg/kg)或低劑量(0.1mg/kg)奈米粒子處理後HCC腫瘤中的腫瘤血管灌注。植入HCA-1 HCC細胞10天後，在第10、12、14、17、19和21天用奈米粒子(0.1或1mg/kg)處理小鼠，並在第24天分析腫瘤。CD31陽性內皮細胞為紅色；FITC-凝集素灌注的血管為綠色。比例尺為50μm。實驗獨立地重複兩次。

圖5C顯示在植入奈米粒子處理或未處理的小鼠後24天，HCC腫瘤中平均血管密度(MVD)的量化。MVD透過CD31染色確定，並表示為總腫瘤面積的百分比(來自四隻小鼠的n=10個切片圖像)。

圖5D顯示透過CD31 ⁺凝集素⁺染色確定來自奈米粒子處理或未處理小鼠的HCC腫瘤中灌注的功能性腫瘤血管的定量，並以佔總腫瘤面積的百分比表示(來自四隻小鼠的n=10切片圖像)。

圖5E顯示用不同劑量的奈米粒子處理後HCC中Hoechst 33342陽性細胞的百分比。在第24天收穫腫瘤之前，向小鼠靜脈內注射200μg的Hoechst 33342(對照組，0.05和0.1mg/kg奈米粒子，n=8小鼠；0.25、0.5和1mg/kg奈米粒子，n=5小鼠)。

用高劑量的奈米粒子(DNIC：1mg/kg)處理可顯著降低HCC腫瘤中的MVD，從而減少了腫瘤灌注，表明NO的充分傳遞具有抗血管生成活性，參見圖5B至圖5E及圖4Ia~4If。儘管低劑量奈米粒子處理(DNIC：0.1mg/kg)不會改變腫瘤中的MVD，但它顯著增加了腫瘤灌注(Hoechst 33342⁺區域)和功能性灌注的血管(凝集素⁺CD31⁺區域)，與高劑量奈米粒子處理和對照組相比，在腫瘤中的分佈更均勻(圖5D及5E)。

圖5F顯示用高劑量(1mg/kg)或低劑量(0.1mg/kg)的奈米粒子處理後HCC中周細胞覆蓋率的定量(覆蓋面積的部分)。CD31陽性內皮細胞染成綠色，而NG2陽性週細胞染成紅色(對照組，來自四隻小鼠的n=8切片圖像；奈米粒子處理，來自三隻小鼠的n=5切片圖像)。比例尺為20μm。

圖5Ga~圖5Gc顯示低劑量奈米粒子可正常化人類HCC(JHH-7)模型中腫瘤血管，其中圖5Ga為使用高劑量(1mg/kg)或低劑量(0.1mg/kg)奈米粒子處理後，對JHH-7腫瘤中周細胞覆蓋率(覆蓋面積的部分)進行定量；CD31陽性內皮細胞，綠色；NG2陽性周細胞，紅色；圖5Gb為高劑量(1mg/kg)或低劑量(0.1mg/kg)奈米粒子處理後，吡莫尼唑陽性區域作為HCC缺氧標記的比例；圖5Gc為注射DOX後一小時以共焦顯微鏡監測DOX在腫瘤中的灌注(對照組，來自四隻小鼠的n=8切片圖像；奈米粒子，來自三隻小鼠的n=6切片圖像)。比例尺為50μm。所有數據均顯示為平均值±s.e.m.，使用普通的單因子變異數分析與Tukey的多重比較測試進行分析。

圖5H顯示高劑量(1mg/kg)或低劑量(0.1mg/kg)奈米粒子處理後，吡莫尼唑陽性區域作為HCC缺氧標記的比例(四隻小鼠的n=8切片圖像)。比例尺為100μm。數據來自兩個獨立的實驗。所有數據均顯示為平均值±s.e.m.。

與血管標記CD31和周細胞標記NG2的共染還顯示，與高劑量奈米粒子處理組和對照相比，低劑量奈米粒子增強了腫瘤血管的周細胞覆蓋率，參見圖5F、圖4Ia~4If和圖5Ga~圖5Gc，表明低劑量奈米粒子處理後，腫瘤血管系統更加成熟。因此，與高劑量的奈米粒子處理和對照組相比，低劑量的奈米粒子處理顯著減少了缺氧性腫瘤面積(如吡莫尼唑(pimonidazole)測定)，參見圖5H、4Ia~4If和5Ga~圖5Gc。總之，儘管低劑量的奈米粒子處理不具有抗血管生成特性，但與高劑量的奈米粒子處理相反，它可以使腫瘤血管正常化，並改善HCC腫瘤的血管功能和灌注。

圖5I是本發明奈米粒子在低劑量增強藥物遞送效率並增強抗癌效力的治療方案。處理流程如下：植入HCC細胞10天後，小鼠接受了多柔比星(DOX)靜脈內注射(對於HCA-1 HCC模型為4mg/kg，對於JHH-7 HCC模型為1mg/kg)進行了六次靜脈內注射(2~3天間隔)或TRAIL十次(間隔1至2天)。對於組合組，如上所示，用DOX或重組TRAIL蛋白處理的小鼠在第10、12、14、17、19和21天接受了靜脈內低劑量奈米粒子的處理。在植入後的第24天對腫瘤進行了分析。

圖5J是本發明奈米粒子在低劑量增強藥物遞送效率並增強抗癌效力的數據圖，其中透過共焦顯微鏡監測腫瘤中的DOX灌注(來自三隻小鼠的n=6切片圖像)。從兩個獨立的實驗中可以看到注射DOX一小時後腫瘤中DOX灌注的代表性圖像。比例尺為50μm。

圖5K是分析DOX和BSA腫瘤滲透的治療方案之示意圖。原位植入HCA-1細胞的C3H/HeNCrNarl雄性小鼠靜脈內注射本發明奈米粒子(0.1mg/kg/劑量，六劑，每週三劑)。處理後，給小鼠靜脈內注射DOX(8mg/kg)。注射後一小時，收集並包埋腫瘤組織。用Zeiss LSM 780共焦顯微鏡對DOX灌注進行成像和定量。為了評估BSA的滲透性，在靜脈內注射BSA-FITC(40mg/kg)之後，在Zeiss LSM 780顯微鏡上進行了多光子成像(multiphoton imaging)。

圖5L顯示在處理和未處理(對照組)小鼠中植入後24天原位HCC腫瘤的體積，其中如圖5I所述，對照組，n=15小鼠；單獨的奈米粒子，n=10小鼠；單獨的DOX和組合組，n=5小鼠。

TME中的異常腫瘤血管會對藥物的遞送和滲透產生負面影響，因此，對癌症的治療效果也具有作用。因此，本發明評估了低劑量奈米粒子處理觸發的血管正常化對藥物遞送的影響方式。本發明研究了在原位HCC模型中存在或缺少高劑量或低劑量奈米粒子下小分子化學療法(多柔比星，DOX)和基於大分子蛋白質的治療劑(腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL))的腫瘤滲透和抗癌功效(圖5I)。低劑量奈米粒子處理導致DOX滲透到原位HCC腫瘤中增加了2.5倍，而高劑量奈米粒子處理則沒有觀察到改善，參見圖5J、5Ga~圖5Gc和5K，這與奈米粒子在血管正常化上的不同劑量效應相一致。與僅用DOX處理相比，用低劑量奈米粒子處理觀察到的DOX滲透增強導致腫瘤生長顯著減少(圖5L)。

圖5M顯示低劑量奈米粒子(0.1mg/kg)對血管正常化治療的反應中FITC-BSA在腫瘤中的滲透率，透過多光子成像(n=7)在注射FITC-BSA之後監測t=5(5分鐘)和t=35(35分鐘)。比例尺為100μm。重複實驗三遍，結果相似。

圖5N顯示TRAIL治療與低劑量奈米粒子的結合顯著增加了腫瘤中細胞凋亡的誘導(單獨的對照和TRAIL，來自三隻小鼠的n=7切片圖像；組合組，來自四隻小鼠的n=10切片圖像)。數據來自兩個獨立的實驗。TRAIL治療後原位HCA-1腫瘤植入後24天時TUNEL染色的代表性免疫螢光圖像。比例尺為50μm。

圖5O顯示低劑量奈米粒子(0.1mg/kg)與重組TRAIL蛋白(LD：5mg/kg或HD：20mg/kg，用於HCA-1 HCC模型)聯合治療時原位HCC腫瘤的體積；2.5mg/kg用於JHH-7 HCC模型；對照組，n=15小鼠；僅奈米粒子，n=10小鼠；單獨TRAIL，n=5小鼠；TRAIL LD和奈米粒子的組合，n=4小鼠；TRAIL HD和奈米粒子的組合，n=6小鼠)。

本發明使用活體多光子顯微鏡(intravital multiphoton microscopy)和異硫氰酸冷光素(fluorescein isothiocyanate)標記的牛血清白蛋白(FITC標記的BSA)作為模擬基於蛋白質的大分子藥物的探針(圖5K)。與注射FITC-BSA後35分鐘的對照組相比，用低劑量奈米粒子處理導致FITC-BSA透過功能性血管進入HCC的滲透率增加了12倍(圖5M)。在有或沒有低劑量奈米粒子的帶有HCC小鼠中評估了有效觸發癌細胞中細胞死亡的基於蛋白質的治療性TRAIL的滲透性。結果發現，與僅使用TRAIL的治療相比，與低劑量的奈米粒子結合使用TRAIL的治療可顯著增加原位HCA-1腫瘤中凋亡細胞的數量(圖5N)。在原位鼠(HCA-1)和人(JHH-7)HCC模型中，聯合治療觀察到的腫瘤細胞凋亡增加導致顯著的腫瘤生長抑制(圖5O)。

本發明進一步評估了奈米粒子在具有N-亞硝基二乙胺(N-nitrosodiethylamine,DEN)和CCl₄誘導的肝纖維化以及與發炎相關的HCC小鼠中的作用(圖5P)。DEN和CCl₄誘導的鼠類HCC模型的實驗流程如下：為了化學誘導HCC，用DEN(i.p.注射1mg/kg)處理C3H/HeNCrNarl雄性小鼠(3~4週)。接著，每周用16%(V/V)四氯化碳(CCl₄)(配於橄欖油中)(0.1mL/小鼠)處理小鼠，連續21週，每周3次。為了評估奈米粒子的效果，在CCl₄處理後，向小鼠靜脈內投藥奈米粒子(DNIC：0.1mg/kg，每週三劑)或TRAIL(5mg/kg，每週五劑)。治療2週後，收集並分析肝臟中的腫瘤結節。

圖5P顯示CCl₄誘導的HCC模型的治療方案。圖5Q顯示低劑量奈米粒子治療後，CCl₄誘導的HCC中吡莫尼唑陽性染色指示腫瘤缺氧區域(n=5小鼠)。圖5R顯示用流式細胞儀測定的低劑量奈米粒子治療後HCC中Hoechst 33342陽性細胞的百分比(n=8小鼠)。圖5S顯示在CCl₄誘導的自發性HCC模型中，低劑量奈米粒子可以減少腫瘤缺氧；用共焦顯微鏡監測低劑量(0.1mg/kg)奈米粒子處理後，吡莫尼唑陽性區域作為HCC中缺氧標記的比例。實驗進行一次。比例尺為50μm。圖5T顯示TRAIL療法與低劑量奈米粒子的結合可增加CCl₄誘導的HCC腫瘤的凋亡誘導(n=7來自三隻小鼠的切片圖像)。所有數據均顯示為平均值±s.e.m.。

化學誘導的HCC模型模擬了人類中發現到的損傷纖維化HCC序列。一致地，在CCl₄誘導的HCC中，低劑量奈米粒子的治療可減少腫瘤缺氧並增加腫瘤灌注(Hoechst 33342⁺區域)，參見圖5Q、5R和5S。TRAIL療法與低劑量奈米粒子的聯合治療在CCl₄誘導的HCC中協同誘導凋亡(圖5T)。兩者合計，本發明證明與TRAIL療法和低劑量奈米粒子的聯合治療透過血管正常化和增加治療性蛋白質的滲透協同實現了抗癌功效。

實施例6. 本發明奈米粒子對腫瘤微環境的重編程

結構和功能異常的腫瘤血管系統導致高度異質和缺氧的TME，可將腫瘤相關巨噬細胞(tumour-associated macrophages,TAMs)極化為免疫抑制性M2樣表現型並阻止T細胞的腫瘤浸潤，從而導致抗腫瘤免疫反應的抑制。由於低劑量奈米粒子治療可導致血管正常化，因此本發明檢查了它是否也改變了HCC中TAM M1/M2極化狀態和T細胞浸潤。

以下實驗所用到的流式細胞術分析及細胞分選法(cell sorting)之流程如下：通過心內注射PBS灌注具有原位植入HCA-1細胞的C3H/HeNCrNarl雄性小鼠並犧牲。在DMEM培養基中，用1A型膠原蛋白酶(collagenase type 1A)(1.5mg/mL)和透明質酸酶(hyaluronidase)(1.5mg/mL)在37℃將腫瘤組織分解1小時。將細胞懸浮液染色以獲得抗體。以下抗體用於流式細胞儀分析：CD45-FITC(30-F11)、CD3e-APC(145-2C11)、CD8-PE-Cy7(53-6.7)、CD4-PE(RM4-5)、CD16/CD32 BD Fc Block(2.4G2)、7-AAD(BD Biosciences,CA,USA)；得自Biolegend,CA,USA的顆粒酶B-FITC(GB11)、CD86-APC-Cy7(GL-1)、CD206-APC(C068C2)、F4/80-PE(BM8)(eBioscience,CA,USA)。流式細胞儀數據是從BD FACSAria III流式細胞儀(Becton Dickinson，CA，USA)獲得的，並使用FACSDivaTM軟體進行分析。

為了檢測CD8 T細胞中的顆粒酶B，按照製造商的說明進行操作，將細胞懸浮液用4%多聚甲醛(paraformaldehyde)溶液固定，在Cytofix/Cytoperm溶液中滲透(BD Biosciences，CA，美國)，並用細胞內顆粒酶B-FITC抗體(BioLegend，CA，美國)染色。

根據製造商的說明(Miltenyi Biotec，德國)，使用MS管柱和抗小鼠CD11b共軛磁珠透過免疫磁分離法分離與腫瘤相關的巨噬細胞，然後對它們進行CD45-FITC(30-F11)(BD Biosciences,CA,USA)、F4/80-PE(BM8)(BD Biosciences,CA,USA)和7-AAD染色。透過BD FACSAria III流式細胞儀(Becton Dickinson，CA，USA)對7-AAD^-/CD45⁺/F4/80⁺細胞進行分選。

圖6A顯示TAM分析的治療時間表，其中將具有HCA-1細胞原位植入物的C3H/HeNCrNarl雄性小鼠靜脈內注射奈米粒子(0.1mg/kg/劑量，六劑，每週三劑)。處理後，收集TAM，並透過CD11b-微珠富集，並透過流分選法(flow sorting)進行分離。透過定量即時PCR分析不同TAM群體中的基因轉錄。

圖6Ba~圖6Bd顯示在CCl₄誘導的HCC模型中，低劑量奈米粒子重編程免疫抑制性TAM，並增加腫瘤浸潤性T細胞；圖6Ba~圖6Bb，低劑量奈米粒子在CCl₄誘導的HCC中增加M1類巨噬細胞(F4/80 ⁺ CD86 ⁺)(a)和減少M2類巨噬細胞(F4/80 ⁺ CD206 ⁺)，透過流式細胞術測量(n=8隻小鼠)；c-d，低劑量奈米粒子在CCl₄誘導的HCC中增加CD4(c)及CD8(d)T細胞，透過流式細胞術測量(對照組，n=7隻小鼠；奈米粒子，n=8隻小鼠)。所有數據均顯示為平均值±s.e.m.，使用雙尾曼惠特尼U檢定進行分析。

表8顯示低劑量奈米粒子當與原位HCC模型中的疫苗聯合使用時可將免疫抑制TAMs重編程為免疫刺激表現型，增加腫瘤浸潤性T細胞並達到協同抗癌作用，其中在HCA-1原位腫瘤中，低劑量奈米粒子(0.1mg/kg)在TAMs(n=6小鼠)中增加了M1樣基因的表現，並降低了M2樣基因的表現。使用CD11b-微珠富集TAM，並透過流分選法進行分離。與對照組相比，##表示P=0.0569，##表示P=0.0082，*表示P=0.0479，**表示P=0.0072，***表示P=0.0001。

圖6C顯示透過流式細胞儀檢測，低劑量奈米粒子增加了腫瘤中的CD4和CD8 T細胞(對照組，n=10小鼠；0.05和0.1mg/kg奈米粒子，n=8小鼠；0.25、0.5和1mg/kg奈米粒子，n=5隻小鼠)。

圖6D顯示流式細胞術確定T細胞亞群的閘控策略。

在原位HCA-1 HCC模型中用低劑量奈米粒子處理後，TAM使用CD11b-微珠富集並透過流分選法(flow sorting)分離(圖6A)。儘管DNIC並沒有直接影響體外巨噬細胞的極化(表9)，但低劑量的奈米粒子會增加體內TAM中M1型基因NOS2的表現，並降低一些M2型基因(Ccl17、Il10、Mrc1和Arg1)的表現。在CCl₄誘導的HCC模型中，始終如一地，在TME中增加了M1類巨噬細胞(F4/80 ⁺ CD86 ⁺)，減少了M2類巨噬細胞(F4/80 ⁺ CD206 ⁺)(圖6Ba~圖6Bd)。數據表明，低劑量的奈米粒子透過血管正常化將免疫抑制性TAM重編程為免疫刺激表現型(圖6Ba~圖6Bd和表8)。此外，與高劑量的奈米粒子或未處理組相比，在原位HCA-1和CCl₄誘導的HCC模型中，低劑量(DNIC：0.05和0.1mg/kg)的奈米粒子處理顯著促進了CD4⁺和CD8⁺T細胞向HCC腫瘤的浸潤，參見圖6Ba~圖6Bd、6C和6D。

以下實驗用到的西方墨點分析流程如下：細胞或組織在RIPA裂解緩衝液中裂解。細胞裂解物在10%丙烯酰胺凝膠(acrylamide gel)上分離，並轉移到PVDF膜上。將膜在5%脫脂牛奶中封閉1小時，然後與抗PD-L1和β-肌動蛋白的多株抗體(clone 122M4782，Cell Signaling，Danvers，MA)反應過夜。

以下關於DNIC觸發了HCA-1 HCC細胞中SP1的活化之操作流程如下：透過使用Lipofectamine^® 2000(Thermo Fisher Scientific,USA)轉染，建立了表現SP1報導子的HCA-1細胞。然後用游離態DNIC處理細胞。培育24小時後，裂解細胞，並透過微盤分析儀(Spark 10M，Tecan，德國)測量冷光素酶訊號。

圖6E顯示DNIC觸發了HCA-1 HCC細胞中SP1的活化，其中用游離態DNIC(0.5μM)處理後，來自SP1冷光素酶構建體轉染的HCA-1細胞的SP-1冷光素酶活性顯著降低(對照組，n=9個生物學獨立的樣品；DNIC，n=14個生物學獨立的樣品)。數據來自兩個獨立的實驗。所有數據顯示為平均值±s.e.m。使用雙尾曼惠特尼U檢定進行分析。

圖6F是本發明奈米粒子對腫瘤微環境的重編程之數據圖。圖6G是本發明奈米粒子對腫瘤微環境的重編程之西方墨點染色圖。在體外用游離態DNIC處理後，透過qRT-PCR(n=3個生物學獨立的樣品)(c)和西方墨點(Western blot)(d)分析了HCA-1細胞中PD-L1 mRNA和蛋白的表現。實驗獨立重複兩次。

圖6H是本發明奈米粒子對腫瘤微環境的重編程之西方墨點染色圖及免疫螢光圖。西方墨點分析顯示，用奈米粒子處理後，PD-L1在腫瘤中的表現降低。如圖4H所示，用奈米粒子(0.1或1mg/kg)處理具有HCA-1腫瘤小鼠。從兩個獨立的實驗顯示，植入後24天HCA1腫瘤的代表性免疫螢光圖像。比例尺為50μm。實驗獨立地重複兩次。

除了減少腫瘤中T細胞的浸潤外，免疫檢查點分子還會削弱T細胞的殺腫瘤活性。PD-L1是一種免疫抑制檢查點配體，在侵襲性HCC中高度表現，透過與其T細胞上的受體PD-1交互作用在阻斷毒殺型CD8⁺ T細胞的活化並抑制T細胞增殖中起關鍵作用。本發明的數據表明，DNIC降低了與PD-L1啟動子結合的Sp1轉錄因子的活性並調控PD-L1表現(圖6E)。正如預期的那樣，DNIC在體外以劑量依賴性方式顯著降低了鼠和人HCC細胞中PD-L1的表現(圖6F及6G)。儘管高劑量和低劑量的奈米粒子在體內均能抑制HCC腫瘤中PD-L1的表現，但僅在低劑量的奈米粒子誘導的血管正常化後才觀察到腫瘤浸潤性T細胞數量的增加(圖6H)。總的來說，這些數據表明低劑量的奈米粒子可以直接(例如，透過抑制PD-L1表現)和間接地(例如，透過血管正常化和TAM極化)觸發免疫抑制性TME向抗癌免疫的轉變。

圖6I是本發明奈米粒子對腫瘤微環境的重編程之治療方案。處理流程如下：植入HCA-1細胞7天後，向小鼠腹膜內注射4次(間隔2至3天)，用5×10⁶絲裂黴素C(mitomycin C)處理過的過度表現cGM-CSF的HCA-1細胞。對於組合組，用分泌cGM-CSF癌細胞疫苗治療的小鼠在第10、12、14、17、19和21天接受靜脈內低劑量奈米粒子。

圖6Ja及圖6Jb顯示cGM-CSF修飾的全細胞癌疫苗的生成和功能分析，其中a顯示用Lipofectamine 2000轉染的HCA-1細胞提高了GM-CSF的產量。選擇了具有最高GM-CSF表現的穩定的HCA-1 cGM-CSF選殖株，並在6cm培養盤以每孔2.5×10⁵個細胞的濃度培養24小時，然後使用ELISA(n=3個生物學獨立的樣品)確定 GM-CSF的產量；b顯示低劑量的奈米粒子和疫苗治療相結合可減少腫瘤大小；植入HCA-1細胞7天後，向小鼠腹膜內注射4次(間隔2至3天)，用5×10⁶絲裂黴素C處理過的HCA-1細胞過表現或不過表現cGM-CSF。對於聯合治療，接受上述癌細胞疫苗治療的小鼠在第10、12、14、17、19和21天接受了靜脈內低劑量奈米粒子(對照組，n=15小鼠；HCA-1疫苗和奈米粒子，n=6隻小鼠；cGM-CSF HCA-1疫苗和奈米粒子的組合，n=9隻小鼠)。所有數據均顯示為平均值±s.e.m.。

圖6K及圖6L顯示低劑量奈米粒子和疫苗治療的組合可顯著降低腫瘤大小(對照組，n=15小鼠；僅奈米粒子，n=10小鼠；僅疫苗，n=11小鼠；組合組，n=9小鼠)(圖6K)和在原位HCC模型中增加了總生存率(n=5小鼠)(圖6L)，**表示與單獨使用奈米粒子相比，P=0.0018；##表示與單獨使用疫苗相比，P=0.0064。

圖6M及圖6N顯示透過流式細胞術(n=10小鼠)(圖6M)和免疫螢光染色(圖6N)，在植入或未使用奈米粒子和/或HCC疫苗治療後24天，檢測HCA-1腫瘤中顆粒酶B陽性CD8 T細胞的百分比。從兩個獨立的實驗(DAPI，藍色；顆粒酶B，綠色；CD8⁺ T細胞，紅色)顯示了HCA-1腫瘤的代表性免疫螢光圖像。所有數據均顯示為平均值±s.e.m.。

以下實驗用到的全細胞疫苗療法之流程如下：使用Lipofectamine^®2000(Thermo Fisher Scientific，美國)和G418(300μg/mL)選擇液進行轉染，建立了表現編碼密碼子優化的GM-CSF(codon-optimized GM-CSF,cGM-CSF)的穩定HCA-1細胞。透過EDTA分離細胞，將其再散浮於PBS(10⁷細胞/mL)中，並與絲裂黴素C(50μg/mL)在37℃作用1小時。在HCC腫瘤模型中，在腫瘤植入後7天，用5×10⁶絲裂黴素C處理的細胞對小鼠進行腹膜內注射4次(間隔2至3天)。植入後第10天，將具有腫瘤的C3H/HeNCrNarl雄性小鼠靜脈內注射奈米粒子(DNIC：0.1mg/kg)六次(每週三次)。首次進行奈米粒子處理後兩週，犧牲小鼠進行分析。

最後，本發明檢查了低劑量的奈米粒子處理是否可以增強HCC疫苗療法的抗癌功效(圖6I)。特別是，本發明使用了一種免疫刺激的全細胞HCC疫苗，該疫苗由經密碼子優化的GM-CSF(codon-optimized GM-CSF,cGM-CSF)轉染的修飾的HCA-1細胞組成，可顯著提高GM-CSF的表現位準(圖6Ja及圖6Jb)。GM-CSF被廣泛用作佐劑，透過促進樹突狀細胞募集和成熟來增加免疫治療方案中的免疫反應。分泌GM-CSF的腫瘤疫苗可刺激強效、特異性和持久的抗腫瘤作用。低劑量奈米粒子和HCC疫苗治療(絲裂黴素C(mitomycin C)處理的cGM-CSF轉導的HCA-1細胞)的組合與低劑量奈米粒子單藥治療或單獨疫苗接種相比，原位HCC模型中的腫瘤進展顯著降低，整體生存率提高(圖6K及6L)。而且，如透過CD8⁺ T細胞中顆粒酶B(granzyme B)的表現所測量的，聯合治療顯著增加了HCC中毒殺型T細胞的活化(圖6M及6N)。這些數據表明低劑量的奈米粒子治療可增強HCC疫苗療法的抗腫瘤作用。

實施例7. 本發明奈米粒子在抑制遠處轉移上的效用評估

已知使原發腫瘤中的腫瘤血管正常化會損害遠端轉移。然而，在轉移性病變中血管正常化的效果仍未得到充分探索。此外，NO在轉移發生中的作用尚不清楚。因此，本發明首先評估了DNIC對體外HCC細胞轉移潛能的直接影響。

以下實驗所用到的構築pLenti DEST CMV Puro(w118-1)-GpNLuc質體的流程如下：透過Q5^® High-Fidelity DNA聚合酶(New England Biolabs)從pRetroX-Tight-MCS_PGK-GpNLuc(Antonio Amelio提供；Addgene plasmid #70185)用正向引子(5'-AAAAAAGCAGGCTCGAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCC3')(SEQ ID NO：87)和反向引子(5'-AGAAAGCTGGGTCTAGAATTACGCCAGAATGCGT-3')(SEQ ID NO：88)PCR擴增GpNLuc。凝膠純化的GpNLuc插入子和pENTR-Luc(w158-1)(Eric Campeau和Paul Kaufman提供；Addgene plasmid #17473)被NcoI和XbaI分解，並與Quick Ligation^TM套組(New England Biolabs)接合以產生pENTR-GpNLuc。pLenti DEST CMV Puro(w118-1)-GpNLuc是透過Gateway^®LR選殖(ThermoFisher Scientific)與pLenti DEST CMV Puro(w118-1)(Eric Campeau和Paul Kaufman提供；Addgene plasmid #17452)和pENTR-GpNLuc質體創建的。

以下實驗所用到的GpNluc的慢病毒(Lentivirus)生產之流程如下：HEK293T細胞與psPAX2(由Didier Trono提供；Addgene plasmid #12260)、pMD2.G(由Didier Trono提供；Addgene plasmid #12259)和pLenti DEST CMV Puro(w118-1)-GpNLuc藉由PEI(Alfa Aesar；1mg/mL聚乙烯亞胺(polyethylenimine)，線性，MW 25,000)轉染而共轉染。在轉染後18小時，用補充有10%FBS的DMEM+ GlutaMAX代替培養基，然後在轉染後48和72小時收穫病毒培養基並更換培養基。將合併的病毒培養基在4℃下以500 x g離心10分鐘，以收集病毒上清液。

以下實驗所用到的穩定HCA-1-GpNLuc細胞的生產流程如下：將5x10⁴ HCA-1細胞再散浮於補充有10% FBS和10μg/mL聚凝胺(polybrene)(Merck)的1mL DMEM+GlutaMAXTM中，添加到含有500μL GpNLuc慢病毒的6孔盤中，並在37℃與5% CO₂的條件下培養在潮濕培養箱中。轉導後72小時，將轉導的HCA-1細胞依次在6、10和15cm培養皿中擴增，用於隨後的螢光活化細胞分選(FACS)，以分離出穩定表現GpNLuc成像報導子的GFP陽性HCA1-A細胞。

以下實驗所用到的轉移分析的流程如下：將HCA-1-GPNLuc細胞(2.5×10⁶細胞/mL)注入尾側靜脈。在注射HCA-1-GPNLuc細胞後7天開始向小鼠靜脈內投藥奈米粒子(DNIC：0.1mg/kg，每週三劑)、TRAIL(5mg/kg，每週五劑)或Dox(4mg/kg，每週三劑)。在注射HCA-1-GPNLuc細胞19天後，透過測量冷光素酶活性來量化轉移負擔。收集肺組織，並在裂解緩衝液(10mM Tris-HCl、1% Triton X-100、0.1% SDS、0.1% SDC和140mM NaCl)中均質。將冷光素酶受質添加到組織裂解物中，並透過微盤分析儀(Spark 10M，Tecan，德國)進行測量。

以下實驗所用到的移行侵入分析(Transwell invasion assay)的流程如下：使用QCM ECMatrix 24孔細胞侵入分析(EMD Millipore，美國)檢查細胞侵入。將HCA-1細胞接種在沒有血清的頂室中。將含有10% FBS的DMEM-H添加到下腔室。培育72小時後，將下表面的細胞用4%多聚甲醛(PFA，配於PBS中)固定。將室在PBS中沖洗並用1%結晶紫(配於90%乙醇中)染色30分鐘。對於每種實驗條件，透過顯微鏡(IX83，Olympus，日本)對10個影像場拍照並定量。

圖7A及圖7B顯示游離DNIC調節轉移性病變中的TME並抑制HCC的轉移進程，其中在用不同劑量的游離態DNIC處理72小時後，進行了HCA-1細胞的侵襲(圖7A)和傷口癒合測定(圖7B)。實驗獨立重複兩次。

圖7D顯示DNIC在缺氧條件下(1%氧氣)逆轉HCA-1細胞的EMT表現型。在不同劑量的游離態DNIC處理後24小時，透過qRT-PCR測定mRNA位準(對照組和缺氧，n=3；0.5和1μM DNIC，n=5；5μM DNIC，n=6個生物學獨立的樣品)。

圖7E顯示自發發生的肺轉移模型的治療方案，其中帶有HCA-1細胞的原位植入物的C3H/HeNCrNarl雄性小鼠向靜脈內內注射奈米粒子(0.1或1mg/kg/劑量，六劑，每週三劑)。治療2週後收集肺結節用於進一步分析。

圖7Fa及圖7Fb顯示在用奈米粒子處理的小鼠中，原位HCA-1 HCC模型中自發發生的肺轉移性結節的數量減少了(對照組，來自11隻小鼠的n=33個肺葉；低劑量奈米粒子，來自23隻小鼠的n=69個肺葉；高劑量奈米粒子，來自19隻小鼠的n=57個肺葉)。H & E染色圖像顯示肺部轉移性腫瘤結節。比例尺為200μm。數據是平均值±s.e.m.。

圖7Ha~圖7Hc顯示用奈米粒子處理後，自發發生的轉移性肺結節中量化TME中的變化，包括平均血管密度(CD31⁺/DAPI，三隻小鼠的n=7切片圖像)、腫瘤缺氧(吡莫尼唑⁺/DAPI，四隻小鼠的n=8切片圖像)和灌注的功能性血管(CD31⁺凝集素⁺/DAPI，三隻小鼠的n=5切片圖像)。

圖7I顯示了肺轉移性結節中CD31 ⁺凝集素⁺染色指示的功能性血管的代表性免疫螢光圖像。比例尺為50μm。實驗獨立重複兩次。

圖7K及圖7M顯示用奈米粒子處理後自發發生的轉移性肺結節中Hoechst 33342陽性細胞(n=8小鼠)的百分比(圖7K)以及CD4和CD8 T細胞的浸潤(n=9小鼠)(圖7M)，有如流式細胞術所測量的。

圖7La及圖7Lb顯示低劑量奈米粒子重編程自發性轉移性肺結節中的免疫抑制TAM，其中低劑量奈米粒子在患有原位HCA-1腫瘤的小鼠自發發生的轉移性肺結節中增加M1類巨噬細胞(F4/80 ⁺ CD86 ⁺)(a)和M2類巨噬細胞(F4/80 + CD206 ⁺)(b)，有如流式細胞術測量的(對照組及0.1mg/kg奈米粒子，n=5隻小鼠；1mg/kg奈米粒子，n=4隻小鼠)。

DNIC處理顯著抑制了HCA-1細胞的遷移和侵襲，參見圖7A至圖7C。此外，在缺氧條件下培養的HCA-1細胞中，DNIC以劑量依賴的方式阻止了上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)標記的增加和E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表現的降低(圖7D)。本發明進一步檢查了奈米粒子傳遞的DNIC對原位HCA-1腫瘤小鼠肺轉移進展的影響。治療在接種腫瘤後第18天開始，以模擬晚期HCC的治療程序(圖7E)。低劑量(0.1mg/kg)的奈米粒子可以顯著抑制肺轉移的發生(圖7Fa及圖7Fb)，而不會影響原發性HCC腫瘤負荷(圖7G)。本發明奈米粒子可能透過抑制HCC細胞中的EMT並重新編程前轉移性TME來調節轉移抑制。

與奈米粒子對原發性HCC的抗血管生成作用相一致，在肺轉移中投藥高劑量奈米粒子(1mg/kg)後觀察到腫瘤MVD降低和腫瘤缺氧增加(圖7Ha~圖7Hc)。相反，用低劑量的奈米粒子正常化腫瘤血管進行治療，如功能性血管增多(凝集素⁺ CD31 ⁺和NG2 ⁺ CD31 ⁺血管)，參見圖7Ha~圖7Hc、7I和7J，和腫瘤灌注(Hoechst 33342⁺區域)(圖7K)，並透過將TAM極化為免疫刺激表現型(圖7La及圖7Lb)並增加肺轉移中T細胞的浸潤(圖7M)來重新編程腫瘤免疫微環境。

圖7N顯示實驗性肺轉移模型的治療方案及治療成效，其中靜脈內注射HCA-1-GpNLuc細胞(配於200μL PBS中為5.0×10⁵個細胞)7天後，小鼠接受多柔比星(DOX)(4mg/kg，IV)處理六次(2~3天間隔)或TRAIL(5mg/kg，靜脈內注射)十次(間隔為1至2天)。對於組合組，小鼠在第7、9、11、14、16和18天接受了低劑量的奈米粒子(0.1mg/kg，靜脈內注射)。在第19天透過測量HCA-1-GpNLuc細胞的冷光素酶活性來分析和量化實驗性肺轉移負荷(對照組，n=11小鼠；TRAIL，n=13小鼠；DOX，n=6小鼠；奈米粒子和組合組，n=7小鼠)。所有數據均顯示為平均值±s.e.m.。

最後，本發明研究了在用來評估治療劑對轉移性生長的直接影響之實驗性肺轉移模型中當結合化學療法(DOX)和大分子TRAIL治療時，用低劑量奈米粒子正常化轉移性HCC中TME是否對抑制轉移生長表現出協同作用(圖7N)。透過靜脈內注射5×10⁵HCA-1-GpNLuc細胞建立HCA-1-GpNLuc HCC實驗性肺轉移模型，並在注射腫瘤細胞後第7天開始治療。低劑量的奈米粒子與DOX或TRAIL聯合療法可協同抑制實驗性肺轉移模型中的轉移生長(圖7N)。

綜上所述，本發明奈米粒子生物相容性及穩定性佳、對正常組織不會產生損傷、可治療癌症(例如肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC))、增強肝癌藥物之效用、增強肝癌疫苗之效用、及緩解腫瘤缺氧。此外，本發明奈米粒子大幅改善一氧化氮供體在生物體中快速的半衰期，並能夠長時間的持續釋放一氧化氮，應用本發明奈米粒子可以作為抗癌治療藥劑，對於抑制腫瘤有傑出的效果，令其作為癌症輔劑，改善腫瘤微環境，可以大幅度增加化療、免疫治療和大分子蛋白治療的功效。本發明奈米粒子亦可以同時搭載不同的化療藥物，進行共同性的遞送。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

<110> 國立清華大學

<120> 奈米粒子及其製備方法與用途

<130> 108B0445-I1

<160> 88

<170> PatentIn version 3.5

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Claims

一種奈米粒子，包含：一核心，包含至少一個一氧化氮供體，且該核心透過一水包油(oil-in-water)單一乳化反應被包覆在一聚合物及一脂質中，以形成該奈米粒子，其中該脂質包含D-α-生育酚聚乙二醇1000丁二酸酯(D-α-Tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate,TPGS)；該奈米粒子具有一為0.116~0.176的分散性指數(polydispersity index,PDI)。
如申請專利範圍第1項所述的奈米粒子，其具有一介於107nm~131nm的粒徑。
如申請專利範圍第1項所述的奈米粒子，其中該一氧化氮供體是雙亞硝基鐵錯合物(dinitrosyl iron complexes,DNICs)。
如申請專利範圍第1項所述的奈米粒子，其中該聚合物是聚乳酸聚乙醇酸(Poly[D,L-lactide-co-glycolide],PLGA)。
如申請專利範圍第1項所述的奈米粒子，其中該脂質進一步包含一選自於下列所構成之群組中的組分：1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000],DSPE-PEG)、膽固醇、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phophocholine,DOPC)及其任意組合。
一種用於製備一奈米粒子的方法，包含以下步驟：(a)將一核心、一聚合物及一脂質溶於一有機相；(b)將該有機相添加至去離子水中，並進行一超音波處理，然後透過一水包油(oil-in-water)單一乳化反應得到一乳化物；以及(c)將該乳化物進行一離心處理，並收集沉澱物，然後將該沉澱物散浮於一緩衝液中，得到該奈米粒子；其中該核心包含至少一個一氧化氮供體，且該聚合物及該脂質透過該水包油單一乳化反應包覆該核心，其中該脂質包含D-α-生育酚聚乙二醇1000丁二酸酯(D-α-Tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate,TPGS)；該奈米粒子具有一為0.116~0.176的分散性指數(polydispersity index,PDI)。
如申請專利範圍第6項所述的方法，其中該奈米粒子具有一介於107nm~131nm的粒徑。
如申請專利範圍第6項所述的方法，其中該一氧化氮供體是雙亞硝基鐵錯合物(dinitrosyl iron complexes,DNICs)。
如申請專利範圍第6項所述的方法，其中該聚合物是聚乳酸聚乙醇酸(Poly[D,L-lactide-co-glycolide],PLGA)。
如申請專利範圍第6項所述的方法，其中該脂質進一步包含一選自於下列所構成之群組中的組分：1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000],DSPE-PEG)、膽固醇、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phophocholine,DOPC)及其任意組合。
一種如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的奈米粒子用於製備治療癌症之醫藥品的用途。
如申請專利範圍第11項所述的用途，其中該癌症是肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。
如申請專利範圍第11項所述的用途，其中該奈米粒子持續釋放一氧化氮。
如申請專利範圍第11項所述的用途，其中該奈米粒子的有效濃度為至少0.1mg/kg。
一種如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的奈米粒子用於製備增強肝癌藥物之效用的促效劑(agonist)之用途。
如申請專利範圍第15項所述的用途，其中該肝癌藥物是多柔比星(doxorubicin)或腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)。
一種如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的奈米粒子用於製備緩解腫瘤缺氧(tumor hypoxia)之醫藥品的用途。
一種如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的奈米粒子用於製備一增強肝癌疫苗之效用的促效劑(agonist)之用途。