TWI766485B - 用於模板-非依賴性核酸合成的方法以及套組 - Google Patents
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Abstract
一種用於合成核酸的方法包括:提供一起始子,其具有位於3’末端的一未受保護的核苷鹼基以及一3’羥基;提供一核酸聚合酶,其具有至少一個B家族DNA聚合酶的守恆性催化聚合酶領域;提供一核苷酸單體;以及在該核酸聚合酶與至少一種屬於二價陽離子的金屬輔因子存在下,並且在不存在模板下,令該起始子暴露於該核苷酸單體,藉此該核苷酸單體被併入該起始子。一套組包括該起始子、該核酸聚合酶、該核苷酸單體,以及至少一種的金屬輔因子,且是依據該方法來使用。
Description
本件申請案主張於2019年12月23日提申的美國臨時申請案第16/725,420號的優先權,該申請案以其整體被併入本案以作為參考資料。
本發明揭示一種用於核酸合成的方法與套組,特別是一種用於模板-非依賴性核酸合成的方法與套組。
在過去的幾十年間,免除DNA模板的DNA從頭合成(De novo
DNA synthesis)已經被開發。在目前可用的模板-非依賴性的DNA合成方法中,亞磷醯胺(phosphoramidite)-為基礎的化學DNA合成自1980年代初期就已經被熟知,但此後基本上維持不變。該亞磷醯胺-為基礎的化學DNA合成需要四個連續的反應步驟,包括去阻隔(de-blocking)、偶合(coupling)、加帽(capping)以及氧化(oxidation)步驟,俾以將一核苷附加至繫於一固體支撐物的另一核苷。然而,亞磷醯胺-為基礎的化學DNA合成的主要缺點之一是在上述反應步驟中無法避免有害化學物質的使用。
由於對環境保護的需求不斷提升,適用於DNA合成的綠色科技已引起了研究人員的注意。因此,可大幅降低有害化學物質使用的酵素DNA合成(enzymatic DNA synthesis)由於具有諸如較長股生成、較低錯誤率、較快速的循環時間、較低生產成本等優點,而看似具有前景。
就模板-非依賴性酵素DNA合成(template-independent enzymatic DNA synthesis)而言,末端去氧核苷酸轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)已經被發現是一可將所有四種去氧核苷三磷酸(deoxynucleoside triphosphates, dNTPs)附加至DNA股的3’末端(3’ termini)之模板-非依賴性DNA聚合酶(template-independent DNA polymerase)。TdT屬於低-準確度(low-fidelity) DNA聚合酶的X家族(X Family)。TdT-為基礎的DNA合成(TdT-based DNA synthesis)僅需兩個反應步驟,亦即從正被合成中之單股DNA股所延伸的3’-端(extended 3’-end)藉由TdT來單一核苷酸添加以及繼而移除3’-保護基(3’-protective group)。儘管TdT及其同源物(homologs)已被應用於許多DNA合成平台,基於TdT之模板-非依賴性酵素DNA合成由於令人不滿意的產物長度、試劑可再用性、循環時間等而難以被商品化。
發明概要
因此,本發明之目的是提供一種用於合成核酸的方法以及套組,其可以減低先前技術的至少一個缺點。
該方法包括提供一起始子(initiator),其具有位於3’末端的一未受保護的核苷鹼基(nucleoside base)以及一3’羥基(3’ hydroxyl group);提供一核酸聚合酶(nucleic acid polymerase),其具有至少一個B家族DNA聚合酶(family-B DNA polymerase)的守恆性催化聚合酶領域(conservative catalytic polymerase domain);提供一核苷酸單體(nucleotide monomer);以及在該核酸聚合酶與至少一種屬於二價陽離子(divalent cation)的金屬輔因子(metal cofactors)存在下,並且在不存在模板下,令該起始子暴露於該核苷酸單體,藉此該核苷酸單體被併入該起始子。
該套組包括一如上所述的起始子、一如上所述的核酸聚合酶、至少一種如上所述的金屬輔因子,以及一如上所述的核苷酸單體。該套組是依據如上所述的方法來使用。
發明的詳細說明
要被瞭解的是:若有任何一件前案刊物在此被引述,該前案刊物不構成一個下述承認:在台灣或任何其他國家中,該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了本說明書之目的,將被清楚地瞭解的是:術語“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”,以及術語“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義,在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料,它們可被用於實施本發明。當然,本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
申請人意外地發現到:B家族DNA聚合酶(family-B DNA polymerases)[其被熟知為模板-依賴性DNA聚合酶(template-dependent DNA polymerases)]可被用來進行模板-非依賴性核酸合成(template-independent nucleic acid synthesis)[亦即,核酸從頭合成(de novo
nucleic acid synthesis)]。參閱圖1,例示了使用B家族DNA聚合酶之核酸從頭合成的流程圖。
B家族DNA聚合酶[亦稱為B型DNA聚合酶(type-B DNA polymerases)]為複製與修復的聚合酶,其固有地具有一催化聚合酶領域(catalytic polymerase domain),與一3’至5’核酸外切酶領域(3’ to 5’exonuclease domain),且可以在細菌(bacteria)、古細菌(archaea)、真核生物(eukaryotes)以及病毒(viruses)中被發現。術語“催化聚合酶領域”意指一蛋白質的結構部分或區域之胺基酸序列(amino acid sequence)之,其具有該蛋白質的催化DNA/RNA聚合酶活性,而其不含有其他催化活性,諸如編輯活性(editing activity)[例如,3’至5’核酸外切酶領域的校正活性(proofreading activity)]、用於在複製期間岡崎引子(Okazaki primers)的切除(excision)之活性,以及與其他蛋白質交互作用的活性。B家族DNA聚合酶的催化聚合酶領域具有一共同的整體結構,其類似於右手而由拇指、手掌以及手指領域所組成的。最守恆的區域是含有催化位址的手掌領域。
B家族DNA聚合酶的實例包括,但不限於,細菌的B家族DNA聚合酶(例如Pol II)、真核生物的B家族DNA聚合酶(例如Polα、Polδ和Polε,以及Polζ)、古細菌的B家族DNA聚合酶(例如Pol B、Pol BI、Pol BII、Pol BIII、9°N、Kod1、Pfu、Tgo,以及Vent),以及病毒的B家族DNA聚合酶(例如HSV-1、RB69、T4、B103,以及Φ29)。
因此,本發明提供一種用於合成核酸的方法,其包括:
提供一起始子(initiator),其具有位於3’末端的一未受保護的核苷鹼基(nucleoside base)以及一3’羥基(3’ hydroxyl group);
提供一核酸聚合酶(nucleic acid polymerase),其具有至少一個B家族DNA聚合酶(family-B DNA polymerase)的守恆性催化聚合酶領域(conservative catalytic polymerase domain);
提供一核苷酸單體(nucleotide monomer);以及
在該核酸聚合酶與至少一種屬於二價陽離子(divalent cation)的金屬輔因子(metal cofactors)存在下,並且在不存在模板下,令該起始子暴露於該核苷酸單體,藉此該核苷酸單體被併入該起始子。
如本文中所用的,“核酸(nucleic acid)”、“核酸序列(nucleic acid sequence)”或“核酸片段(nucleic acid fragment)”等術語意指呈單-股(single-stranded)或雙-股(double-stranded)形式的去氧核糖核苷酸序列(deoxyribonucleotide sequence)或核糖核苷酸序列(ribonucleotide sequence),且當中包含有已知的天然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)或人造化學仿效物(artificial chemical mimics)。如本文中所用的,“核酸”此術語可與“寡核苷酸(oligonucleotide)”、“聚核苷酸(polynucleotide)”、“DNA”、“RNA”、“基因(gene)”、“cDNA”和“mRNA”交換使用。
一般而言,“模板(template)”是一含有目標核苷酸序列的聚核苷酸。在一些情況下,術語“目標序列(target sequence)”、“模板聚核苷酸(template polynucleotide)”、“目標核酸(target nucleic acid)”、“目標聚核苷酸(target polynucleotide)”、“核酸模板(nucleic acid template)”、“模板序列(template sequence)”以及它們的變化可交換使用。具體而言,術語“模板”意指一股核酸,於該股核酸上,一互補的複本(complementary copy)透過模板-依賴性核酸聚合酶(template-dependent nucleic acid polymerase)的活性由核苷酸或核苷酸類似物而被合成之。在雙螺旋(duplex)中,依照慣例,該模板股(template strand)被描繪且被描述為“底(bottom)”股。相似地,該非-模板股(non-template strand)通常被描繪且被描述為“頂(top)”股。該模板股也可稱為“正義(sense)”股,而該非-模板股則被稱為“反義(antisense)”股。
術語“併入(incorporated)”或“併入(incorporation)”意指成為一核酸的一部分。在關於核酸前驅物(nucleic acid precursors)的併入之術語學上存在已知的彈性。例如,核苷酸dGTP是去氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)。當併入DNA中,dGTP變成dGMP,亦即一去氧鳥苷單磷酸部分(deoxyguanosine monophosphate moiety)。雖然DNA不包括dGTP分子,人們可能會說將dGTP併入DNA中。
術語“起始子”意指一核酸要由此而被從頭合成的單核苷(mononucleoside)、單核苷酸(mononucleotide)、寡核苷酸(oligonucleotide)、多核苷酸(polynucleotide),或者它們經修飾的類似物。術語“起始子”亦可意指具有一3’羥基的異核酸(Xeno nucleic acids, XNA)或肽核酸(peptide nucleic acids, PNA)。
依據本發明,該起始子可具有一選自於下列的序列:非-自我互補的序列(non-self complementary sequence)與非-形成自我互補的序列(non-self complementarity forming sequence)。術語“自我互補的(self complementary)”意指一序列(例如核苷酸序列或PNA序列)自我摺疊[例如,該序列的一個區域與該序列的另一個區域結合或雜交(hybridizes)],而產生了可供作為一用於核酸合成的模板之一類似於雙螺旋(duplex)、雙-股的結構。取決於序列的互補區域如何貼近在一起,該股可形成,例如,髮夾環(hairpin loops)、交聯(junctions)、凸起(bulges)或者內環(internal loops)。術語“形成自我互補的(self complementarity forming)”被使用來描述一序列(例如一核苷酸序列、XNA,或一PNA序列),當該序列供作為模板時,一互補的延伸部分由此形成(亦即,一自我-互補的序列以該供作為模板的序列為基礎而形成)。例如,形成自我互補的序列可為“ATCC”。當“ATCC”序列供作為模板時,互補於該序列之延伸部分“GGAT”被形成(亦即,自我-互補序列“ATCCGGAT”被形成)。
術語“守恆性(conservative)”或“守恆的(conserved)”被用來描述含有在複數個具有相同結構和/或功能的蛋白質中相同的胺基酸殘基(amino acid residues)之領域。守恆的胺基酸殘基的區域對於蛋白質結構或功能可能是重要的。因此,在三維蛋白質中所鑑定出連續守恆的胺基酸殘基對於蛋白質結構或功能可能是重要的。
例如,如Albà (2001),Genome Biology
, 2(1):reviews3002.1至review3002.4中所報導,B家族DNA聚合酶具有區域I與II (Regions I and II),其形成催化聚合酶領域活性位址的一部分,且其可能分別含有守恆的胺基酸殘基“DT”與“SLYPS”。區域I可能橫跨胺基酸殘基512至582、胺基酸殘基513至582或583,或者胺基酸殘基535至604。區域II可能跨越胺基酸殘基375至441或442,或者胺基酸殘基397至464。
依據本發明,該核酸聚合酶可進一步具有一3’至5’核酸外切酶領域,且可為一選自於由下列所構成之群組中的B家族DNA聚合酶:細菌的B家族DNA聚合酶、真核生物的B家族DNA聚合酶、古細菌的B家族DNA聚合酶,以及病毒的B家族DNA聚合酶。在一些具體例中,該B家族DNA聚合酶是選自於由下列所構成之群組:極端嗜熱古生菌KOD1 (Thermococcus kodakaraensis
KOD1)的B家族DNA聚合酶、激烈火球菌(Pyrococus furious
,Pfu
)的B家族DNA聚合酶,以及濱海熱球菌(Thermococcus lito ralis
)(Vent)的B家族DNA聚合酶。
依據本發明,該B家族DNA聚合酶的3’至5’核酸外切酶領域是不活化的。另擇地,該B家族DNA聚合酶的3’至5’核酸外切酶的活性可以是被減低的。又另擇地,該B家族DNA聚合酶的3’至5’核酸外切酶領域可保持不變,且在本發明的方法中,可使用抑制劑來抑制該B家族DNA聚合酶的3’至5’核酸外切酶領域。
依據本發明,另擇地,該核酸聚合酶可僅具有前述的守恆性催化聚合酶領域。在一些具體例中,該核酸聚合酶最初被設計為僅具有前述之原始的守恆性催化聚合酶領域。在其他具體例中,該核酸聚合酶是一原始具有3’至5’核酸外切酶領域的B家族DNA聚合酶,且該領域已經從該核酸聚合酶中被移除。
在一些具體例中,該起始子是呈單-股形式。
在一些具體例中,該起始子具有至少五個核苷酸。在一例示性的具體例中,該起始子具有四十五個核苷酸。
在一些具體例中,該起始子是在範圍落在10℃至90℃的溫度下暴露於該核苷酸單體中,和/或該起始子是在不小於8.0 (例如,8.8)的pH下暴露於該核苷酸單體中。
依據本發明,該核苷酸單體可為一天然核酸核苷酸(natural nucleic acid nucleotide),其組成要素為一糖(sugar)、一磷酸酯基團(phosphate group)以及一氮鹼基(nitrogen base)。該糖可為RNA中的核糖(ribose)或DNA中的2’-去氧核糖(2’-deoxyribose)。取決於所要合成的核酸是DNA或RNA,該氮鹼基是選自於腺嘌呤(adenine)、鳥嘌呤(guanine)、尿嘧啶(uracil)、胞嘧啶(cytosine),以及胸腺嘧啶(thymine)。另擇地,該核苷酸單體可以是在三個組成要素中的至少一個上進行修飾的核苷酸。舉例來說,該修飾可發生在鹼基(base)的層級上,產生一經修飾的產物[諸如肉苷(inosine)、甲基-5-去氧胞苷(methyl-5-deoxycytidine)、去氧尿苷(deoxyuridine)、二甲胺基-5-去氧尿苷(dimethylamino-5-deoxyuridine)、二胺基-2,6-嘌呤(diamino-2,6-purine)或者溴-5-去氧尿苷(bromo-5-deoxyuridine),以及任何其他允許雜交之經修飾的鹼基]、在糖的層級上(例如,藉由類似物來置換去氧核糖),或者,在磷酸酯基團的層級上[例如,硼酸酯(boronate)、烷基膦酸酯(alkylphosphonate),或者硫代磷酸酯衍生物(phosphorothioate derivatives)]。
依據本發明,該核苷酸單體具有一選自於下列的磷酸酯基團:單磷酸酯(monophosphate)、雙磷酸酯(diphosphate)、三磷酸酯(triphosphate)、四磷酸酯(tetraphosphate)、五磷酸酯(pentaphosphate),以及六磷酸酯(hexaphosphate)。
依據本發明,金屬輔因子(metal cofactor)是選自於由下列所構成之群組:Mg2+
、Ca2+
、Sr2+
、Ba2+
、Mn2+
、Co2+
、Fe2+
、Ni2+
、Cu2+
、Zn2+
,以及它們的組合。在一例示性的具體例中,該輔因子是Mg2+
。在另一具體例中,該輔因子是Mg2+
和Mn2+
的組合。
依據本發明,該核苷酸單體具有一可移除的阻隔部分(removable blocking moiety)。該可移除的阻隔部分之實例包括但不限於,一3’-O-阻隔部分(3’-O-blocking moiety)、一鹼基阻隔部分(base blocking moiety),以及它們的組合。
該具有一可移除的阻隔部分之核苷酸單體亦意指為一可逆性終止子(reversible terminator)。因此,該具有3’-O-阻隔部分的核苷酸單體亦意指為3’-阻隔的可逆性終止子(3’-blocked reversible terminator)或3’-O-修飾的可逆性終止子(3’-O-modified reversible terminator),且該具有鹼基阻隔部分的核苷酸單體亦意指為3’-未阻隔的可逆性終止子(3’-unblocked reversible terminator)或3’-OH未阻隔的可逆性終止子(3’-OH unblocked reversible terminator)。
如本文中所用的,術語“可逆性終止子”意指為一經化學修飾的核苷酸單體。當該可逆性終止子藉由一聚合酶而被併入於一增長中的核酸時,它阻斷了核苷酸單體進一步藉由該聚合酶而併入。該“可逆性終止子”鹼基與核酸可藉由化學或物理處理而被去保護(deprotected),而在該去保護之後,該核酸可藉由一聚合酶而被進一步延伸。
3’-O-阻隔部分的實例包括,但不限於,O-疊氮甲基(O-azidomethyl)、O-胺基(O-amino)、O-烯丙基(O-allyl)、O-苯氧乙醯基(O-phenoxyacetyl)、O-甲氧乙醯基(O-methoxyacetyl)、O-乙醯基(O-acetyl)、O-(對甲苯)磺酸酯[O-(p-toluene)sulfonate]、O-磷酸酯(O-phosphate)、O-硝酸酯(O-nitrate)、O-[4-甲氧基]-四氫噻喃基{O-[4-methoxy]-tetrahydrothiopyranyl}、O-四氫噻喃基(O-tetrahydrothiopyranyl)、O-[5-甲基]-四氫呋喃基{O-[5-methyl]-tetrahydrofuranyl}、O-[2-甲基,4-甲氧基]-四氫吡喃基{O-[2-methyl,4-methoxy]-tetrahydropyranyl}、O-[5-甲基]-四氫吡喃基{O-[5-methyl]-tetrahydropyranyl},以及O-四氫硫代呋喃基(O-tetrahydrothiofuranyl)、O-2-硝芐基(O-2-nitrobenzyl)、O-甲基(O-methyl),以及O-醯基(O-acyl)。
3’-未阻隔的可逆性終止子的實例包括,但不限於,7-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-7-去氮ATP {7-[(S)-1-(5-methoxy-2-nitrophenyl)-2,2-dimethyl-propyloxy] methyl-7-deazadATP}、5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-dCTP {5-[(S)-1-(5-methoxy-2-nitrophenyl)-2,2-dimethyl-propyloxy] methyl-dCTP}、1-[(5-甲氧基-2-硝苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-7-去氮-dGTP {1-[(5-methoxy-2-nitrophenyl)-2,2-dimethyl-propyloxy] methyl-7-deaza-dGTP}、5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-dUTP {5-[(S)-1-(5-methoxy-2-nitrophen-yl)-2,2-dimethyl-propyloxy] methyl-dUTP},以及5-[(S)-1-(2-硝苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-dUTP {5-[(S)-1-(2-nitrophenyl)-2,2-dimethyl-propyloxy] methyl-dUTP}。
依據本發明,該鹼基阻隔部分為一可逆性染劑-終止子(reversible dye-terminator)。可逆性染劑-終止子的實例包括,但不限於,Illumina NovaSeq的可逆性染劑-終止子、Illumina NextSeq的可逆性染劑-終止子、Illumina MiSeq的可逆性染劑-終止子、Illumina HiSeq的可逆性染劑-終止子、Illumina Genome Analyzer IIX的可逆性染劑-終止子、LaserGen的閃電終止子(lightning terminator),以及Helicos Biosciences Heliscope的可逆性染劑-終止子。
由於可逆性終止子是熟習此技藝者所熟知且常用的,其更多細節為簡潔目的於本文中被省略。儘管如此,可應用的3’-阻隔的可逆性終止子、可應用的3’-未阻隔的可逆性終止子以及對於保護與去保護可應用的條件(即用於添加和消除該可移除的阻隔部分之條件)可以在例如Gardneret al.
(2012),Nucleic Acids Research,
40(15):7404-7415、Litoshet al.
(2011),Nucleic Acids Research,
39(6):e39以及Chenet al.
(2013),Genomics Proteomics Bioinformatics,
11:34-40中找到。
依據本發明,該起始子可被連結至一固體支撐物,且具有一連結至該固體支撐物的5’端。該起始子可直接地附著至該支撐物上,或者可經由一連接子(linker)而附著至該支撐物上。
依據本發明,固體支撐物的實例包括,但不限於,微陣列(microarrays)、珠粒(beads)(經塗覆的或未-經塗覆的)、管柱(columns)、光纖(optical fibers)、擦拭棒(wipes)、硝化纖維素(nitrocellulose)、尼龍(nylon)、玻璃(glass)、石英(quartz)、重氮化膜(diazotized membranes)(紙或尼龍)、矽樹脂(silicones)、聚甲醛(polyformaldehyde)、纖維素(cellulose)、醋酸纖維素(cellulose acetate)、紙、陶瓷(ceramics)、金屬(metals)、類金屬(metalloids)、半導體材料(semiconductive materials)、磁性顆粒(magnetic particles)、塑料(plastics)[諸如聚乙烯(polyethylene)、聚丙烯(polypropylene)和聚苯乙烯(polystyrene)]、凝膠-形成物質(gel-forming materials){諸如蛋白質[例如,明膠(gelatins)]}、脂多醣(lipopolysaccharides)、矽酸鹽(silicates)、瓊脂糖(agarose)、聚丙烯醯胺(polyacrylamides)、甲基丙烯酸甲酯聚合物(methylmethracrylate polymers)、溶膠凝膠(sol gels)、多孔聚合物水凝膠(porous polymer hydrogels)、奈米結構表面(nanostructured surfaces)、奈米管(nanotubes)[諸如碳奈米管(carbon nanotubes)],以及奈米顆粒(nanoparticles)[諸如金奈米顆粒(gold nanoparticles)或量子點(quantum dots)]。
此外,本發明提供一種用於合成核酸的套組,其包括上述的起始子、上述的核酸聚合酶、上述的核苷酸單體,以及上述的至少一種二價陽離子。該套組是依據本發明的方法來使用。
本發明將就下面的實施例來做進一步說明,但應瞭解的是,該等實施例僅供例示說明用,而不應被解釋為本發明的實施上的限制。實施例 實施例 1. 使用極端嗜熱古生菌 KOD1 (Thermococcus kodakaraensis
KOD1) 的 B 家族 DNA 聚合酶之模板 - 非依賴性核酸合成
一合成反應混合物是使用適量的下列成分而被製得:一單-股起始子,其具有序列辨識編號:1的核苷酸序列,以及一具有一未受保護的羥基之3’端與一標記有螢光素亞磷醯胺(fluorescein amidite, FAM)之5’端;去氧核苷三磷酸(deoxynucleoside triphosphates, dNTPs),其供作為核苷酸單體,且包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP;一極端嗜熱古生菌KOD1之B家族DNA聚合酶,其具有一不活化的3’至5’核酸外切酶領域且其被稱為KOD1exo-
DNA聚合酶;以及一Tris-HCl緩衝液(pH 8.8)。具體而言,該合成反應混合物含有100 nM的起始子、100 μM的dNTPs,以及200 nM的KOD1exo-
DNA聚合酶。
KOD1exo-
DNA聚合酶是如下來製備。一編碼極端嗜熱古生菌KOD1的B家族DNA聚合酶[無-內含肽(intein-free)且具有正常的3’至5’核酸外切酶領域]的基因建構物(gene construct)是由Genomics BioSci &Tech Co.(新北市,台灣)所合成。為了獲得KOD1exo-
DNA聚合酶,守恆性3’至5’核酸外切酶領域的不活化是藉由將Asp141
置換為Ala (D141A)以及將Glu143
置換為Ala (E143A)來達成,亦即修飾守恆性3’至5’核酸外切酶領域之守恆的胺基酸殘基(conserved amino residues) “DIE”。具體而言,為了完成“D141A”和“E143A”胺基酸修飾,使用Q5定點突變套組(Q5 Site-directed Mutagenesis Kit)(新英格蘭生物實驗室,伊普斯威奇,MA,美國)來對上述基因建構物上所對應的核苷酸殘基進行定點突變(site-directed mutagenesis)。將所得到的突變基因建構物於BL21(DE3)細胞中進行表現,而所表現的蛋白質是使用Akta Pure FPLC系統(GE Healthcare Life Sciences,馬爾堡,MA,美國)並依據透過HisTrap Q和Heparin管柱來進行純化。由此所得到的KOD1exo-
DNA聚合酶具有序列辨識編號:2的胺基酸序列。
將10 μL的核酸合成反應混合物在下列溫度中的一者下進行預培育歷時2分鐘:10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃,以及90℃。隨後,將適量的Mg2+
(作為輔因子)添加至各個反應混合物中以啟始模板-非依賴性核酸合成,其被允許進行歷時5分鐘。該合成是藉由添加以10 μL的2X淬火溶液(quench solution)[含有95%去-離子甲醯胺(de-ionized formamide)和25 mM乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)]而被終止。
將所得到的合成反應產物在98℃下進行變性(denaturation)歷時10分鐘。隨後,藉由一15%變性的尿素聚丙烯醯胺膠體(urea-polyacrylamide gel)來分析該合成反應產物。在膠體上的該合成反應產物是藉由Amersham Typhoon Imager (GE Healthcare Life Sciences,馬爾堡,MA,美國)來進行觀察。 結果:
如圖2所示,KOD1exo-
DNA聚合酶能在所測試的各個溫度下進行模板-非依賴性核酸合成,藉此而顯示:B家族DNA聚合酶可被用於在沒有模板的存在下合成核酸。實施例 2. 使用濱海熱球菌 (Thermococcus litoralis
)(Vent) 的 B 家族 DNA 聚合酶之模板 - 非依賴性核酸合成
模板-非依賴性核酸合成以及該反應產物之分析大體上是依據實施例1中所述的操作程序進行,除了使用濱海熱球菌(VentTM
)的B家族DNA聚合酶(其具有不活化的3’至5’核酸外切酶領域因而被稱為Ventexo-
DNA聚合酶)。Ventexo-
DNA聚合酶是以與用於製備KOD1exo-
DNA聚合酶相同的操作程序(參見實施例1)來進行製備,除了使用一編碼極端嗜熱古生菌KOD1的B家族DNA聚合酶(無-內含肽且具有正常的3’至5’核酸外切酶領域)的基因建構物。Ventexo-
DNA聚合酶具有序列辨識編號:3的胺基酸序列。 結果:
如圖3所示,Ventexo-
DNA聚合酶能在所測試的各個溫度下進行模板-非依賴性核酸合成,藉此而顯示:B家族DNA聚合酶可被用於在沒有模板的存在下合成核酸。實施例 3. 使用激烈火球菌 (Pyrococus furious, Pfu
) 的 B 家族 DNA 聚合酶之模板 - 非依賴性核酸合成
模板-非依賴性核酸合成以及該反應產物之分析大體上是依據實施例1中所述的操作程序進行,除了使用Pfu的B家族DNA聚合酶(其具有不活化的3’至5’核酸外切酶領域因而被稱為Pfuexo-
DNA聚合酶)。Pfuexo-
DNA聚合酶是以與用於製備KOD1exo-
DNA聚合酶相同的操作程序(參見實施例1)來進行製備,除了使用一編碼Pfu的B家族DNA聚合酶(無-內含肽且具有正常的3’至5’核酸外切酶領域)的基因建構物。Pfuexo-
DNA聚合酶具有序列辨識編號:4的胺基酸序列。 結果:
如圖4所示,Pfuexo-
DNA聚合酶能在所測試的各個溫度下進行模板-非依賴性核酸合成,藉此而顯示:B家族DNA聚合酶可被用於在沒有模板的存在下合成核酸。實施例 4. 藉由 B 家族 DNA 聚合酶與單一類型的二價陽離子 (divalent cation) 或不同的二價陽離子組合之模板 - 非依賴性核酸合成
為了評估不同類型的二價陽離子是否會影響B家族DNA聚合酶之模板-非依賴性核酸合成的效率,進行了下列實驗。
模板-非依賴性核酸合成以及該反應產物之分析大體上是依據實施例1中所述的操作程序進行,除了:使用KOD1exo-
DNA聚合酶(實施例1中所述)、Ventexo-
DNA聚合酶(實施例2中所述)以及Pfuexo-
DNA聚合酶(實施例3中所述)中的各者;將各個合成反應混合物在70℃下進行預培育(preincubated);以及將只有Mg2+
或Mg2+
與Mn2+
的組合添加至各個反應混合物中。 結果:
如圖5所示,在兩種不同類型的二價陽離子存在下,使用三種B家族DNA聚合酶中的任一者之模板非依賴性核酸合成是更有效率的(更多新合成的核酸被發現),藉此而證明:使用不同類型的二價陽離子的組合可以增強使用B家族DNA聚合酶之模板-非依賴性核酸合成的效率。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時,本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參照被認為是示範性的具體例而被描述,應被瞭解的是:本揭露內容不限於所揭示的具體例,而意欲涵蓋被包括在最廣泛的解釋之精神與範疇中之各種不同的配置,俾以包含所有這類的修改以及等效的配置。
本發明的其他特徵與優點在以下參照隨文檢附的圖式之具體例的詳細說明中將變得明顯,其中:
圖1是使用B家族DNA聚合酶(family-B DNA polymerases)的核酸從頭合成(de novo
nucleic acid synthesis);
圖2是變性尿素聚丙烯醯胺凝膠(denaturing urea-polyacrylamide gel)的圖像,其顯示在不同反應溫度下使用KOD1exo-
DNA聚合酶所獲得之模板-非依賴性核酸合成的產物,其中符號“S”表示起始子DNA (initiator DNA)的位置;
圖3是變性尿素聚丙烯醯胺凝膠的圖像,其顯示在不同反應溫度下使用Ventexo-
DNA聚合酶所獲得之模板-非依賴性核酸合成的產物,其中符號“S”表示起始子DNA的位置;
圖4是變性尿素聚丙烯醯胺凝膠的圖像,其顯示在不同反應溫度下使用Pfuexo-
DNA聚合酶所獲得之模板-非依賴性核酸合成的產物,其中符號“S”表示起始子DNA的位置;以及
圖5是變性尿素聚丙烯醯胺凝膠的圖像,其顯示在只有Mg2+
或與Mn2+
組合的存在下使用Ventexo-
DNA聚合酶、KOD1exo-
DNA聚合酶或Pfuexo-
DNA聚合酶所獲得之模板-非依賴性核酸合成的產物,其中符號“S”表示起子始DNA的位置,符號“V”、“K”、“P”分別表示Ventexo-
DNA聚合酶、KOD1exo-
DNA聚合酶以及Pfuexo-
DNA聚合酶。
<110> 陳呈堯
<120> 用於模板-非依賴性核酸合成的方法以及套組
<130> PE-63427-WO
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<141> 2020-12-18
<150> US16/725,420
<151> 2019-12-23
<160> 4
<170> Patent In version 3.5
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 供用於模板-非依賴性核酸合成的啟動子
<210> 2
<211> 774
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KOD1(exo-)DNA聚合酶
<210> 3
<211> 774
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Vent(exo-)DNA聚合酶
<210> 4
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pfu(exo-)DNA聚合酶
Claims (20)
- 一種用於合成核酸的方法,包含:提供一起始子,其具有位於3’末端的一未受保護的核苷鹼基以及一3’羥基;提供一核酸聚合酶,其具有至少一個B家族DNA聚合酶的守恆性催化聚合酶領域;提供一核苷酸單體;以及在該核酸聚合酶與至少一種屬於二價陽離子的金屬輔因子存在下,並且在不存在模板下,令該起始子暴露於該核苷酸單體,藉此該核苷酸單體被併入該起始子。
- 如請求項1的方法,其中該起始子具有一選自於下列的序列:一非-自我互補的序列與一非-形成自我互補的序列。
- 如請求項1的方法,該起始子被連結至一固體支撐物,且具有一連結至該固體支撐物的5’端。
- 如請求項3的方法,其中該固體支撐物是選自於:微陣列、珠粒、管柱、光纖、擦拭棒、硝化纖維素、尼龍、玻璃、石英、重氮化膜、矽樹脂、聚甲醛、纖維素、醋酸纖維素、紙、陶瓷、金屬、類金屬、半導體材料,磁性顆粒、塑料、凝膠-形成物質、凝膠、奈米結構表面、奈米管,以及奈米顆粒。
- 如請求項1的方法,其中該起始子是在範圍落在10℃至90℃的溫度下暴露於該核苷酸單體。
- 如請求項1的方法,其中該起始子是在不小於8.0的pH下暴露於該核苷酸單體。
- 如請求項1的方法,其中該金屬輔因子是選自於由下列所構成之群組:Mg2+、Ca2+、Sr2+、Ba2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+,以及它們的組合。
- 如請求項1的方法,其中該核酸聚合酶進一步具有一個3’至5’核酸外切酶領域,且為一選自於由下列所構成之群組中的B家族DNA聚合酶:細菌的B家族DNA聚合酶、真核生物的B家族DNA聚合酶、古細菌的B家族DNA聚合酶,以及病毒的B家族DNA聚合酶。
- 如請求項8的方法,其中該B家族DNA聚合酶是選自於由下列所構成之群組:極端嗜熱古生菌(Thermococcus kodakaraensis)(KOD1)的B家族DNA聚合酶、激烈火球菌(Pyrococus furious)(Pfu)的B家族DNA聚合酶、深海嗜熱古生菌(Thermococcus sp.)(9°N)的B家族DNA聚合酶、戈氏嗜熱古生菌(Thermococcus gorgonarius)(Tgo)的B家族DNA聚合酶,以及濱海熱球菌(Thermococcus litoralis)(VentTM)的B家族DNA聚合酶。
- 如請求項8的方法,其中該B家族DNA聚合酶的3’至5’核酸外切酶領域是以一選自於由下列所構成之群組中的方式而被修飾:去活化、減弱,以及缺失。
- 如請求項1的方法,其中該啟動子是呈單-股形式。
- 如請求項1的方法,其中該啟動子具有至少5個核苷酸單體。
- 如請求項1的方法,其中該核苷酸單體具有一選自於下列的磷酸酯基團:單磷酸酯、雙磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯,以及六磷酸酯。
- 如請求項1的方法,其中該核苷酸單體具有一選自於由下列所構成之群組中的可移除的封阻部分:一3’-O-封阻部分、一鹼基封阻部分,以及它們的組合。
- 一種合成核酸的套組,包含:一起始子,其具有位於3’末端的一未受保護的核苷鹼基以及一3’羥基;一核酸聚合酶,其具有至少一個B家族DNA聚合酶的守恆性催化聚合酶領域,以及一核苷酸單體;其中該套組是使用該核酸聚合酶進行模板-非依賴性核酸合成。
- 如請求項15的套組,其中該起始子具有一選自於下列的序列:一非-自我互補的序列與一非-形成自我互補的序列。
- 如請求項15的套組,其中該核酸聚合酶進一步具有一個3’至5’核酸外切酶領域,且為一選自於由下列所構成之群組中的B家族DNA聚合酶:細菌的B家族DNA聚合酶、真核生物的B家族DNA聚合酶、古細菌的B家族DNA聚合酶,以及病毒的B家族DNA聚合酶。
- 如請求項17的套組,其中該B家族DNA聚合酶是選自於由下列所構成之群組:極端嗜熱古生菌KOD1的B家族DNA聚合酶、激烈火球菌(Pfu)的B家族DNA聚合酶、深海嗜熱古生菌(9°N)的B家族DNA聚合酶、戈氏嗜熱古生菌(Tgo)的B家族DNA聚合酶,以及濱海熱球菌(VentTM)的B家族DNA聚合酶。
- 如請求項17的套組,其中該B家族DNA聚合酶的3’至5’核酸外切酶領域是以一選自於由下列所構成之群組中的方式而被修飾:去活化、減弱,以及缺失。
- 如請求項15的套組,其中該核苷酸單體具有一選自於由下列所構成之群組中的可移除的阻隔部分:一3’-O-阻隔部分、一鹼基阻隔部分,以及它們的組合。
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