KR102478977B1 - 주형-비의존성 핵산을 합성하는 방법 및 키트 - Google Patents

주형-비의존성 핵산을 합성하는 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

핵산을 합성하는 방법은 3' 말단에 보호되지 않은 뉴클레오사이드 염기 및 3' 하이드록실기를 갖는 개시인자를 제공하는 단계, 패밀리-B DNA 중합효소의 보존적 촉매 중합효소 도메인을 적어도 갖는 핵산 중합효소를 제공하는 단계, 뉴클레오타이드 단량체를 제공하는 단계, 및 핵산 중합효소 및 2가 양이온인 적어도 하나의 유형의 금속 보조인자의 존재, 및 주형의 부재 하에 개시인자를 뉴클레오타이드 단량체에 노출시켜, 뉴클레오타이드 단량체가 개시인자에 혼입되도록 하는 단계를 포함한다. 키트는 개시인자, 핵산 중합효소, 뉴클레오타이드 단량체, 및 적어도 하나의 유형의 금속 보조인자를 포함하고, 본 방법에 따라 사용된다.

Description

주형-비의존성 핵산을 합성하는 방법 및 키트
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 12월 23일에 출원된 미국 특허 출원 제 16/725,420호의 우선권을 주장하며, 상기 문헌의 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 개시내용은 핵산 합성을 위한 방법 및 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 주형-비의존성(template-independent) 핵산 합성을 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.
DNA 주형을 사용하는 신규한 DNA 합성은 지난 수십 년 동안 개발되었다. 현재 사용 가능한 주형-비의존성인 DNA 합성 방법 중 포스포라미다이트 기반 화학적 DNA 합성은 1980년대 초반부터 널리 알려졌지만 기본적으로는 그 이후로 변함이 없다. 포스포라미다이트 기반 화학적 DNA 합성은 하나의 뉴클레오사이드를 고체 지지체에 연결된 다른 뉴클레오사이드에 추가하기 위해 탈차단, 커플링, 캡핑 및 산화 단계를 포함한 4개의 연속적인 반응 단계가 필요하다. 그러나, 포스포라미다이트 기반 화학 DNA 합성의 주요 단점 중 하나는 전술한 반응 단계에서 불가피한 유해 화학 물질의 사용이다.
환경 보호에 대한 요구가 높아짐에 따라 DNA 합성에 적용할 수 있는 녹색 기술이 연구자들의 주목을 받고 있다. 따라서 유해 화학물질의 사용을 크게 줄일 수 있는 효소적 DNA 합성은 더 긴 가닥 생성, 더 낮은 오류율, 더 빠른 주기 시간, 더 낮은 생성 비용 등과 같은 장점이 있기 때문에 유망해 보인다.
주형-비의존성 효소 DNA 합성에 대해 논하자면, 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT)는 4개의 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTP) 모두를 DNA 가닥의 3' 말단에 추가하는 주형-비의존성 DNA 중합효소인 것으로 밝혀졌다. TdT는 저충실도 DNA 중합효소의 X 패밀리에 속한다. TdT 기반 DNA 합성은 TdT에 의한 단일 뉴클레오타이드 추가와 그 후, 합성되는 단일 가닥 DNA 가닥의 확장된 3'-말단에서 3'-보호기를 제거하는 두 가지 반응 단계만 필요하다. TdT 및 그 상동체는 수많은 DNA 합성 플랫폼에 적용되었지만 TdT를 기반으로 하는 주형-비의존성 효소 DNA 합성은 산물 길이, 시약 재사용성, 주기 시간 등의 불만족으로 인해 상용화되기가 어렵다.
따라서, 본 발명의 목적은 종래 기술의 단점 중 적어도 하나를 완화할 수 있는 핵산을 합성하는 방법 및 키트를 제공하는 것이다.
본 방법은 3' 말단에 보호되지 않은 뉴클레오사이드 염기 및 3' 하이드록실기를 갖는 개시인자를 제공하는 단계, 패밀리-B DNA 중합효소의 보존적 촉매 중합효소 도메인을 적어도 갖는 핵산 중합효소를 제공하는 단계, 뉴클레오타이드 단량체를 제공하는 단계, 및 핵산 중합효소 및 2가 양이온(cation)인 적어도 하나의 유형의 금속 보조인자의 존재, 및 주형의 부재 하에 개시인자를 뉴클레오타이드 단량체에 노출시켜, 뉴클레오타이드 단량체가 개시인자에 혼입되도록 하는 단계를 포함한다.
키트는 상기 기재된 개시인자, 상기 기재된 핵산 중합효소, 상기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 유형의 금속 보조인자, 및 상기 기재된 바와 같은 뉴클레오타이드 단량체를 포함한다. 키트는 위에서 기재한 방법에 따라 사용된다.
본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 첨부 도면을 참조하여 실시형태에 대한 다음의 상세한 설명에서 명백해질 것이고:
도 1은 패밀리-B DNA 중합효소를 사용한 신규한 핵산 합성 방식이다.
도 2는 KOD1exo-DNA 중합효소를 이용하여 상이한 반응 온도에서 얻은 주형-비의존성인 핵산 합성 산물을 나타내는 변성 우레아-폴리아크릴아미드 겔의 이미지이며, 기호 "S"는 개시인자 DNA의 위치를 나타내고;
도 3은 Ventexo-DNA 중합효소를 이용하여 상이한 반응 온도에서 얻은 주형-비의존성인 핵산 합성 산물을 나타내는 변성 우레아-폴리아크릴아미드 겔의 이미지이며, 기호 "S"는 개시인자 DNA의 위치를 나타내고;
도 4는 Pfuexo- DNA 중합효소를 이용하여 상이한 반응 온도에서 얻은 주형-비의존성인 핵산 합성 산물을 나타내는 변성 우레아-폴리아크릴아미드 겔의 이미지이며, 기호 "S"는 개시인자 DNA의 위치를 나타내고;
도 5는 Vent exo- DNA 중합효소, KOD1 exo- DNA 중합효소, 또는 Pfu exo- DNA 중합효소를 이용하여 Mg2+ 단독 또는 Mn2+와 조합하여 얻은 주형-비의존성 핵산 합성 산물을 나타내는 변성 우레아-폴리아크릴아미드 겔 이미지이며, 기호 "S"는 개시인자 DNA의 위치를 나타내고 기호 "V", "K" 및 "P"는 각각 Vent exo- DNA 중합효소, KOD1 exo- DNA 중합효소, 및 Pfu exo- DNA 중합효소를 나타낸다.
임의의 선행 기술 간행물이 본 명세서에서 언급되는 경우, 그러한 언급이 그 간행물이 대만 또는 기타 국가에서 해당 기술 분야의 일반적인 통상의 지식의 일부를 형성한다는 인정을 구성하지 않는다는 것을 이해해야 한다.
본 명세서의 목적상, "~를 포함하는"이라는 단어는 "~를 포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미하고, "~를 포함하는"이라는 단어는 상응하는 의미를 갖는다는 것이 명확하게 이해될 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술적, 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 당업자는 본 개시내용의 실시에 사용될 수 있는 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 균등한 많은 방법 및 재료를 인식할 것이다. 실제로, 본 개시내용은 기재된 방법 및 재료에 제한되지 않는다.
본 출원인은 놀랍게도 주형-의존성 DNA 중합효소로 잘 알려진 패밀리-B DNA 중합효소가 주형-비의존성 핵산 합성(즉, 신규한 핵산 합성)을 수행하는데 사용될 수 있음을 발견했다. 도 1을 참조하면, 패밀리-B DNA 중합효소를 이용한 신규한 핵산 합성 방식이 도시되어 있다.
패밀리-B DNA 중합효소(B형 DNA 중합효소로도 알려짐)는 필수적으로 촉매 중합효소 도메인 및 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 도메인을 갖고 박테리아, 고세균, 진핵생물 및 바이러스에서 발견될 수 있는 복제 및 복구 중합효소이다. 용어 "촉매 중합효소 도메인"은 단백질의 촉매 DNA/RNA 중합효소 활성을 보유하고 편집 활성(예를 들어, 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 도메인의 교정 활성), 복제 중 Okazaki 프라이머의 절단 활성, 및 다른 단백질과의 상호작용 활성과 같은 다른 촉매 활성을 포함하지 않는 단백질의 아미노산 서열의 구조 일부분 또는 영역을 지칭한다. 패밀리-B DNA 중합효소의 촉매 중합효소 도메인은 오른손과 유사하고 엄지, 손바닥 및 손가락 도메인으로 구성된 공통된 전체 구조를 가지고 있다. 가장 잘 보존된 영역은 촉매 부위를 포함하는 손바닥 도메인이다.
패밀리-B DNA 중합효소의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 박테리아 패밀리-B DNA 중합효소 (예를 들어, Pol II), 진핵생물 패밀리-B DNA 중합효소 (예를 들어, Pol α, Pol δ, 및 Pol ε, 및 Pol ζ), 고세균 패밀리-B DNA 중합효소 (예를 들어, Pol B, Pol BI, Pol BII, Pol BIII, 9°N, Kod1, Pfu, Tgo, 및 Vent), 및 바이러스 패밀리-B DNA 중합효소 (예를 들어, HSV-1, RB69, T4, B103 및 Φ29)를 포함한다.
따라서, 본 개시내용은 다음을 포함하는 핵산을 합성하는 방법을 제공한다:
3' 말단에 보호되지 않은 뉴클레오사이드 염기 및 3' 하이드록실기를 갖는 개시인자를 제공하는 단계;
패밀리-B DNA 중합효소의 보존적 촉매 중합효소 도메인을 적어도 갖는 핵산 중합효소를 제공하는 단계;
뉴클레오타이드 단량체를 제공하는 단계; 및
핵산 중합효소 및 2가 양이온인 적어도 하나의 유형의 금속 보조인자의 존재, 및 주형의 부재 하에 개시인자를 뉴클레오타이드 단량체에 노출시켜, 뉴클레오타이드 단량체가 개시인자에 혼입되도록 하는 단계.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산", "핵산 서열" 및 "핵산 단편"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 서열을 지칭하며, 천연 발생 뉴클레오타이드 또는 인공 화학물질 모방체를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은 사용 중인 용어 "올리고뉴클레오타이드", "폴리뉴클레오타이드", "DNA", "RNA", "유전자", "cDNA" 및 "mRNA"와 상호 혼용된다.
일반적으로, "주형"은 표적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 예에서, 용어 "표적 서열", "주형 폴리뉴클레오타이드", "표적 핵산", "표적 폴리뉴클레오타이드", "핵산 주형", "주형 서열" 및 이의 변형은 상호혼용된다. 구체적으로, "주형"이라는 용어는 주형-의존성 핵산 중합효소의 활성을 통해 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체로부터 상보성 카피가 합성되는 핵산 가닥을 지칭한다. 이중체 내에서 주형 가닥은 관례에 따라 "하부" 가닥으로 묘사되고 기재된다. 유사하게, 비주형 가닥은 종종 "상부" 가닥으로 묘사되고 기재된다. "주형" 가닥은 또한 "센스" 가닥으로 지칭될 수 있고, 비-주형 가닥은 "안티센스" 가닥으로 지칭될 수 있다.
"혼입된" 또는 "혼입"이라는 용어는 핵산의 일부가 되는 것을 지칭한다. 핵산 전구체의 혼입에 관한 용어에는 알려진 가요성이 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 dGTP는 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트이다. DNA에 혼입되면 dGTP는 dGMP, 즉 데옥시구아노신 모노포스페이트 모이어티가 된다. DNA에는 dGTP 분자가 포함되어 있지 않지만 dGTP가 DNA에 혼입된다고 말할 수 있다.
용어 "개시인자"는 핵산이 신규로 합성되는 모노뉴클레오사이드, 모노뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 변형된 유사체를 지칭한다. "개시인자"라는 용어는 또한 3'-히드록실기를 갖는 제노 핵산(XNA) 또는 펩타이드 핵산(PNA)을 지칭할 수 있다.
본 발명에 따르면, 개시인자는 비-자기 상보성 서열 및 비-자기 상보성 형성 서열로부터 선택되는 서열을 가질 수 있다. "자기 상보성"이라는 용어는 서열(예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 또는 PNA 서열)이 자체적으로 접혀서(즉, 서열의 영역이 서열의 다른 영역에 결합하거나 혼성화됨) 핵산 합성을 위한 주형으로 작용할 수 있는 이중 가닥 유사 구조인 이중체를 생성함을 의미한다. 서열의 상보성 영역이 서로 얼마나 가까이 있는지에 따라 가닥은 예를 들어 헤어핀 루프, 접합부, 돌출부 또는 내부 루프를 형성할 수 있다. "자기 상보성 형성"이라는 용어는 그러한 서열이 주형으로 작용할 때 상보성 연장 부분이 형성되는 서열(예를 들어, 뉴클레오타이드 서열, XNA 또는 PNA 서열)을 기재하는데 사용된다(즉, 자기 상보성 서열은 주형 역할을 하는 이러한 서열을 기반으로 형성됨). 예를 들어, 자기 상보성 형성 서열는 "ATCC"일 수 있다. "ATCC" 서열이 주형으로 작용할 때, 그러한 서열에 상보성인 연장 부분 "GGAT"가 그러한 서열로부터 형성된다(즉, 자기 상보성 서열 "ATCCGGAT"가 형성됨).
"보존적" 또는 "보존된"이라는 용어는 동일한 구조 및/또는 기능을 갖는 복수의 단백질 중에서 동일한 아미노산 잔기를 포함하는 도메인을 기재하는데 사용된다. 보존된 아미노산 잔기의 영역은 단백질 구조 또는 기능에 중요할 수 있다. 따라서 3차원 단백질에서 확인된 인접 아미노산 잔기는 단백질 구조 또는 기능에 중요할 수 있다.
예를 들어, 문헌[Alba (2001), Genome Biology, 2(1):reviews3002.1 to reviews3002.4]에 보고된 바와 같이, 패밀리-B DNA 중합효소는 촉매적 중합효소 도메인의 활성 부위의 일부를 형성하고, 각각 보존된 아미노산 잔기 "DT" 및 "SLYPS"를 포함할 수 있는 영역 I 및 II를 가지고 있다. 영역 I은 아미노산 잔기 512 내지 582, 아미노산 잔기 513 내지 582 또는 583, 또는 아미노산 잔기 535 내지 604에 걸쳐 있을 수 있다. 영역 II는 아미노산 잔기 375 내지 441 또는 442, 또는 아미노산 잔기 397 내지 464에 걸쳐 있을 수 있다.
본 발명에 따르면, 핵산 중합효소는 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 도메인을 추가로 가질 수 있으며, 박테리아 패밀리-B DNA 중합효소, 진핵생물 패밀리-B DNA 중합효소, 고세균 패밀리-B DNA 중합효소, 및 바이러스 패밀리-B DNA 중합효소로 이루어진 군에서 선택되는 패밀리-B DNA 중합효소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 패밀리-B DNA 중합효소는 서모코쿠스 코다카라엔시스(Thermococcus kodakaraensis) KOD1의 패밀리-B DNA 중합효소, 파이로코쿠스 퓨리오우스(Pyrococus furious)(Pfu)의 패밀리-B DNA 중합효소, 및 서모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis)(Vent)의 패밀리-B DNA 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따르면, 패밀리-B DNA 중합효소의 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 도메인이 불활성화될 수 있다. 대안적으로, 패밀리-B DNA 중합효소의 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 활성이 감소될 수 있다. 여전히 대안적으로, 패밀리-B DNA 중합효소의 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 도메인은 변경되지 않은 채로 남아 있을 수 있고, 억제제는 본 개시내용의 방법 동안 패밀리-B DNA 중합효소의 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 도메인을 억제하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용에 따르면, 대안적으로, 핵산 중합효소는 전술한 보존적 촉매 중합효소 도메인만을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 중합효소는 원래 전술한 보존적 촉매 중합효소 도메인만을 갖도록 설계된다. 다른 실시형태에서, 핵산 중합효소는 원래 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 도메인을 갖는 패밀리-B DNA 중합효소였으며, 이러한 도메인은 핵산 중합효소에서 제거되었다.
일부 실시형태에서, 개시인자는 단일 가닥 형태이다.
일부 실시형태에서, 개시인자는 적어도 5개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 개시인자는 45개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
일부 실시형태에서, 개시인자는 10℃ 내지 90℃ 범위의 온도에서 뉴클레오타이드 단량체에 노출되고/거나, 개시인자는 8.0 이상의 pH(예를 들어, 8.8)에서 뉴클레오타이드 단량체에 노출된다.
본 개시내용에 따르면, 상기 뉴클레오타이드 단량체는 당, 인산기 및 질소염기를 구성요소로 하는 천연 핵산 뉴클레오타이드일 수 있다. 당은 RNA의 리보스 또는 DNA의 2'-데옥시리보스일 수 있다. 합성할 핵산이 DNA인지 RNA인지에 따라 질소 염기는 아데닌, 구아닌, 우라실, 시토신 및 티민으로부터 선택된다. 대안적으로, 뉴클레오타이드 단량체는 3개의 구성 요소 중 적어도 하나에서 변형된 뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들어, 변형은 염기 수준(예를 들어, 이노신, 메틸-5-데옥시시티딘, 데옥시우리딘, 디메틸아미노-5-데옥시우리딘, 디아미노-2,6-퓨린 또는 브로모- 5-데옥시우리딘 및 혼성화를 가능하게 하는 기타 변형된 염기), 당 수준(예를 들어, 데옥시리보스를 유사체로 대체), 또는 인산염 기 수준(예를 들어, 보로네이트, 알킬포스포네이트, 또는 포스포로티오에이트 유도체)에서 발생하여 변형된 산물을 형성할 수 있다.
본 발명에 따르면, 뉴클레오타이드 단량체는 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 테트라포스페이트, 펜타포스페이트 및 헥사포스페이트로부터 선택되는 포스페이트기를 가질 수 있다.
본 발명에 따르면, 금속 보조인자는 Mg2+, Ca2+, Sr2+, Ba2+, Mn2+, Co2+, Fe2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 보조인자는 Mg2+이다. 또 다른 실시형태에서, 보조인자는 Mg2+ 및 Mn2+의 조합이다.
본 발명에 따르면, 뉴클레오타이드 단량체는 제거 가능한 차단 모이어티를 가질 수 있다. 제거 가능한 차단 모이어티의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 3'-O-차단 모이어티, 염기 차단 모이어티, 및 이의 조합을 포함한다.
제거 가능한 차단 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 단량체는 또한 가역적 종결인자로 지칭된다. 따라서, 3'-O-차단 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 단량체는 3'-차단된 가역적 종결인자 또는 3'-O-변형된 가역적 종결인자라고도 하며, 염기 차단 모이어티을 갖는 뉴클레오타이드 단량체는 또한 3'-비차단된 가역적 종결인자 또는 3'-OH 비차단된 가역적 종결인자로도 지칭된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "가역적 종결인자"는 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드 단량체를 지칭한다. 이러한 가역적 종결인자가 중합효소에 의해 성장하는 핵산에 혼입되면 중합효소에 의한 뉴클레오타이드 단량체의 추가 혼입을 차단한다. 이러한 "가역적 종결인자" 염기 및 핵산은 화학적 또는 물리적 처리에 의해 탈보호될 수 있고, 이러한 탈보호 후에 핵산은 중합효소에 의해 추가로 연장될 수 있다.
3'-O-차단 모이어티의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, O-아지도메틸, O-아미노, O-알릴, O-페녹시아세틸, O-메톡시아세틸, O-아세틸, O-(p- 톨루엔)술포네이트, O-포스페이트, O-니트레이트, O-[4-메톡시]-테트라히드로티오피라닐, O-테트라히드로티오피라닐, O-[5-메틸]-테트라히드로푸라닐, O-[2-메틸,4-메톡시]-테트라히드로피라닐, O-[5-메틸]-테트라히드로피라닐, 및 O-테트라히드로티오푸라닐, O-2-니트로벤질, O-메틸, 및 O-아실을 포함한다.
3'-비차단된 가역적 종결인자의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 7-[(S)-1-(5-메톡시-2-니트로페닐)-2,2-디메틸-프로필옥시]메틸-7-데아자dATP, 5-[(S)-1-(5-메톡시-2-니트로페닐)-2,2-디메틸-프로필옥시]메틸-dCTP, 1-(5-메톡시-2-니트로페닐)-2,2- 디메틸-프로필옥시]메틸-7-데아자-dGTP, 5-[(S)-1-(5-메톡시-2-니트로페닐)-2,2-디메틸-프로필옥시]메틸-dUTP, 및 5-[( S)-1-(2-니트로페닐)-2,2-디메틸-프로필옥시]메틸-dUTP를 포함한다.
본 발명에 따르면, 염기 차단 모이어티는 가역적 염료-종결인자일 수 있다. 가역적 염료-종결인자의 예에는 다음에 제한되는 것은 아니나, Illumina NovaSeq의 가역적 염료-종결인자, Illumina NextSeq의 가역적 염료-종결인자, Illumina MiSeq의 가역적 염료-종결인자, Illumina HiSeq의 가역적 염료-종결인자, Illumina Genome Analyzer IIX의 가역 염료 종결인자, LaserGen의 경쇄 종결인자, Helicos Biosciences Heliscope의 가역적 염료 종결인자가 포함된다.
가역적 종결인자는 당업자에게 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되기 때문에, 간결함을 위해 이에 대한 더 이상의 세부사항은 생략된다. 그럼에도 불구하고, 적용 가능한 3'-차단된 가역적 종결인자, 적용 가능한 3'-비차단된 가역적 종결인자, 보호 및 보호 탈보호를 위한 적용 가능한 조건(즉, 제거 가능한 차단 모이어티를 추가 및 제거하기 위한 조건)은 예를 들어 문헌[Gardner et al. (2012), Nucleic Acids Research, 40(15):7404-7415, Litosh et al. (2011), Nucleic Acids Research, 39(6):e39, 및 Chen et al. (2013), Genomics Proteomics Bioinformatics, 11:34-40]에서 찾을 수 있다.
본 발명에 따르면, 개시인자는 고체 지지체에 연결되고 고체 지지체에 연결된 5' 말단을 가질 수 있다. 개시인자는 지지체에 직접 부착될 수 있거나 링커를 통해 지지체에 부착될 수 있다.
본 발명에 따르면, 고체 지지체의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 마이크로어레이(microarray), 비드(bead)(코팅 또는 비코팅), 컬럼(column), 광섬유(optical fiber), 와이프(wipe), 니트로셀룰로스(nitrocellulose), 나일론(nylon), 유리(glass), 석영(quartz), 디아조화 막(diazotized membrane)(종이 또는 나일론), 실리콘(silicone), 폴리포름알데하이드(polyformaldehyde), 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 종이(paper), 세라믹(ceramic), 금속(metal), 준금속(metalloid), 반도체 재료(semiconductor material), 자성 입자(magnetic particle), 플라스틱(plastic), 겔-형성 재료(gel-forming material)[예를 들어, 단백질(예를 들어, 젤라틴), 지질다당류, 실리케이트, 아가로스, 폴리아크릴아미드, 메틸메타크릴레이트 중합체], 졸 겔(sol gel), 다공성 중합체 하이드로겔, 나노구조 표면(nanostructured surface), 나노튜브(nanotube)(예를 들어, 탄소 나노튜브), 및 나노입자(nanoparticle)(예를 들어, 금 나노입자 또는 양자점)를 포함한다.
또한, 본 개시내용은 상기 개시인자, 상기 핵산 중합효소, 상기 뉴클레오타이드 단량체, 및 상기 2가 양이온 중 적어도 1종을 포함하는 핵산 합성을 위한 키트를 제공한다. 키트는 본 개시내용의 방법에 따라 사용된다.
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 기재될 것이다. 그러나, 하기 실시예는 단지 예시의 목적으로 의도된 것이며 실제로 본 개시내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안됨을 이해해야 한다.
실시예
실시예 1. 서모코쿠스 코다카라엔시스 KOD1의 패밀리-B DNA 중합효소를 이용한 주형-비의존성 핵산 합성
합성 반응 혼합물을 적절한 양의 하기 성분을 사용하여 제조하였다: 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 및 보호되지 않은 히드록실기를 보유하는 3' 말단 및 플루오레세인 아미다이트 (FAM)로 표지된 5' 말단을 갖는 단일 가닥 개시인자; dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP를 포함하는 뉴클레오타이드 단량체로 작용하는 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTP); 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 도메인이 불활성화되고, KOD1 exo- DNA 중합효소로서 지칭되는 서모코쿠스 코다카라엔시스 KOD1의 패밀리-B DNA 중합효소; 및 Tris-HCl 완충액 (pH 8.8)을 포함한다. 구체적으로, 합성 반응 혼합물은 100 nM의 개시인자, 100 μM의 dNTP 및 200 nM의 KOD1exo- DNA 중합효소를 포함하였다.
KOD1 exo- DNA 중합효소를 다음과 같이 제조하였다. 서모코쿠스 코다카라엔시스 KOD1(인테인이 없고 정상적인 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 도메인을 가짐)의 패밀리-B DNA 중합효소를 인코딩하는 유전자 구조를 Genomics BioSci & Tech Co.(New Taipei City, Taiwan)에 의해 합성하였다. KOD1exo- DNA 중합효소를 얻기 위해 Asp141을 Ala(D141A)로, Glu143을 Ala(E143A)로 변이시켜, 즉, 3'에서 5'으로의 보존적 엑소뉴클레아제 도메인의 보존된 아미노산 "DIE"를 변형시켜, 3'에서 5'으로의 보존적 엑소뉴클레아제 도메인의 불활성화를 달성했다. 구체적으로, 아미노산 변형 "D141A" 및 "E143A"를 달성하기 위해, 앞서 언급한 유전자 작제물 상의 상응하는 뉴클레오타이드 잔기를 Q5 부위 지정 돌연변이 유발 키트(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 사용하여 부위-지정 돌연변이유발에 적용하였다. 생성된 돌연변이 유전자 작제물을 BL21(DE3) 세포에서 발현시키고, 발현된 단백질을 HisTrap Q 및 Heparin 컬럼을 통해 Akta Pure FPLC 시스템(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, USA)을 사용하여 순차적으로 정제하였다. 이렇게 얻어진 KOD1exo- DNA 중합효소는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다.
10 μL의 핵산 합성 반응 혼합물을 10℃, 20℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 70℃, 80℃, 및 90℃ 중 하나의 온도에서 2분 동안 사전 인큐베이션하였다. 이어서, 각각의 반응 혼합물에 보조인자로 작용하는 Mg2+를 적당량 첨가하여 주형-비의존성 핵산 합성을 개시하고 5분 동안 진행시켰다. 10 μL의 2X 켄칭(quencing) 용액(95% 탈이온화된 포름아미드 및 25 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 포함)을 첨가하여 합성을 종료하였다.
생성된 합성 반응 산물을 98℃에서 10분 동안 변성시켰다. 이어서, 합성 반응 산물을 15% 변성 우레아-폴리아크릴아미드 겔로 분석하였다. 젤의 합성 반응 산물을 Amersham Typhoon Imager(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, USA)로 시각화했다.
결과:
도 2에 도시된 바와 같이, KOD1 exo- DNA 중합효소는 시험된 각각의 온도에서 주형-비의존성인 핵산 합성을 수행할 수 있어, 주형의 부재 하에 패밀리-B DNA 중합효소를 사용하여 핵산을 합성할 수 있음을 나타낸다.
실시예 2. 서모코쿠스 리토랄리스(Vent)의 패밀리-B DNA 중합효소를 이용한 주형-비의존성 핵산 합성
주형-비의존성인 핵산 합성 및 반응 산물의 분석을 불활성화된 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 도메인을 갖고, 따라서 Vent exo- DNA 중합효소로 지칭되는 서모코쿠스 리토랄리스(Vent)의 패밀리-B DNA 중합효소를 사용하는 것을 제외하고는 일반적으로 실시예 1에 기재된 절차에 따라 수행하였다. Vent exo- DNA 중합효소를 서모코쿠스 리토랄리스의 패밀리-B DNA 중합효소(인테인이 없고 정상적인 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 도메인 포함)를 인코딩하는 유전자 작제물을 사용한 것을 제외하고, KOD1 exo- DNA 중합효소의 제조를 위한 것과 동일한 절차 (실시예 1 참조)에 따라 제조하였다. Vent exo- DNA 중합효소는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는다.
결과
도 3에 도시된 바와 같이, Vent exo- DNA 중합효소는 시험된 각각의 온도에서 주형-비의존성인 핵산 합성을 수행할 수 있으며, 이에 따라 패밀리-B DNA 중합효소를 사용하여 주형의 부재 하에 핵산을 합성할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3. 파이로코커스 퓨리어스(Pfu)의 패밀리-B DNA 중합효소를 이용한 주형-비의존성 핵산 합성
주형-비의존성 핵산 합성 및 반응 산물의 분석은 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제가 불활성화되고, 따라서 Pfu exo- DNA 중합효소로 지칭되는 Pfu의 패밀리-B DNA 중합효소를 사용한 것을 제외하고는, 일반적으로 실시예 1에 기재된 절차에 따라 수행하였다. Pfu exo- DNA 중합효소를 Pfu의 패밀리-B DNA 중합효소(인테인이 없고 정상적인 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 도메인 포함)를 인코딩하는 유전자 작제물을 사용한 것을 제외하고, KOD1 exo- DNA 중합효소의 제조를 위한 것과 동일한 절차 (실시예 1 참조)에 따라 제조하였다. Pfu exo- DNA 중합효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는다.
결과:
도 4에 도시된 바와 같이, Pfu exo- DNA 중합효소는 시험된 각각의 온도에서 주형-비의존성인 핵산 합성을 수행할 수 있으며, 이로써 패밀리-B DNA 중합효소를 사용하여 주형의 부재 하에 핵산을 합성할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 4. 단일 유형의 2가 양이온 또는 상이한 2가 양이온의 조합에 의한 패밀리-B DNA 중합효소에 의한 주형-비의존성 핵산 합성
상이한 유형의 2가 양이온이 패밀리-B 중합효소에 의한 주형-비의존성 핵산 합성의 효율에 영향을 미칠 수 있는지를 평가하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
주형-비의존성 핵산 합성 및 반응 산물의 분석을 KOD1 exo- DNA 중합효소(실시예 1에 기재됨), Vent exo- DNA 중합효소 (실시예 2에 기재됨) 및 Pfu exo- DNA 중합효소(실시예 3에 기재됨)를 사용하고; 각각의 합성 반응 혼합물을 70℃에서 사전 인큐베이션하고; Mg2+ 단독 또는 Mn2+와 조합된 Mg2+를 각각의 반응 혼합물에 첨가한 것을 제외하고, 실시예 1에 제시된 절차에 따라 일반적으로 수행하였다.
결과
도 5에 도시된 바와 같이, 3개의 패밀리-B DNA 중합효소 중 어느 하나를 사용한 주형-비의존성 핵산 합성은 2가지 상이한 유형의 2가 양이온의 존재하에서 더 효율적이었고(더 신규로 합성된 핵산이 발견됨), 따라서 패밀리-B 중합효소를 사용한 주형-비의존성 핵산 합성의 효율성이 다른 유형의 2가 양이온의 조합을 사용하여 향상될 수 있다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참조문헌은 그 전문이 참조문헌으로서 본 명세서에 포함된다. 모순되는 경우 정의를 포함한 본 출원의 설명이 우선한다.
본 개시내용은 예시적인 실시형태로 고려되는 것과 관련하여 설명되었지만, 본 개시내용은 개시된 실시형태로 제한되지 않고 가장 넓은 해석의 사상 및 범위 내에 포함된 다양한 배열을 포함하여, 그러한 모든 수정 및 균등한 배열을 포함하도록 의도된 것으로 이해되어야 한다.
서열목록
<110> Chen, Cheng-Yao
<120> 주형-비의존성 핵산 합성을 위한 방법 및 키트
<130> PE-63427-WO
<160> 4
<170> 버전 3.5 특허
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 인공 서열
<220>
<223> 주형-비의존성 핵산 합성을 위한 개시인자
<400> 1
ctcggcctgg cacaggtccg ttcagtgctg cggcgaccac cgagg 45
<210> 2
<211> 774
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> KOD1(exo-) DNA 중합효소
<400> 2
Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile
1 5 10 15
Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg
20 25 30
Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile
35 40 45
Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Thr
50 55 60
Val Lys Arg Val Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val
65 70 75 80
Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile
85 90 95
Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr
100 105 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro
115 120 125
Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Ala Ile Ala Thr
130 135 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Val
165 170 175
Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Arg Glu Met Ile Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr
195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu
210 215 220
Lys Leu Gly Ile Asn Phe Ala Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
245 250 255
His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr
260 265 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln Pro Lys Glu
275 280 285
Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr Thr Ala Trp Glu Thr Gly Glu Asn
290 295 300
Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr
305 310 315 320
Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu
325 330 335
Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu
340 345 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala
355 360 365
Pro Asn Lys Pro Asp Glu Lys Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr
370 375 380
Glu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile
385 390 395 400
Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His
405 410 415
Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp
420 425 430
Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe
435 440 445
Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys
450 455 460
Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp
465 470 475 480
Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr
485 490 495
Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser
500 505 510
Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Lys Glu Ile
515 520 525
Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Gly Phe
530 535 540
Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala
545 550 555 560
Met Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu
565 570 575
Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys
580 585 590
Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu
595 600 605
Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala
610 615 620
Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val Glu Lys Ala Val
625 630 635 640
Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro
645 650 655
Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Asp
660 665 670
Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala
675 680 685
Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu
690 695 700
Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe
705 710 715 720
Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln
725 730 735
Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys
740 745 750
Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Ser Ala Trp
755 760 765
Leu Lys Pro Lys Gly Thr
770
<210> 3
<211> 774
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> Vent(exo-) DNA 중합효소
<400> 3
Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Lys Asp Gly Lys Pro Ile Ile
1 5 10 15
Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Leu Asp Pro
20 25 30
His Phe Gln Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile
35 40 45
Glu Glu Ile Lys Ala Ile Lys Gly Glu Arg His Gly Lys Thr Val Arg
50 55 60
Val Leu Asp Ala Val Lys Val Arg Lys Lys Phe Leu Gly Arg Glu Val
65 70 75 80
Glu Val Trp Lys Leu Ile Phe Glu His Pro Gln Asp Val Pro Ala Met
85 90 95
Arg Gly Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr
100 105 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro
115 120 125
Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Leu Leu Ala Phe Ala Ile Ala Thr
130 135 140
Phe Tyr His Glu Gly Asp Glu Phe Gly Lys Gly Glu Ile Ile Met Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile
165 170 175
Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Asn Glu Arg Glu Met Ile Lys
180 185 190
Arg Phe Val Gln Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Ile Ile Thr
195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Leu Pro Tyr Leu Ile Lys Arg Ala Glu
210 215 220
Lys Leu Gly Val Arg Leu Val Leu Gly Arg Asp Lys Glu His Pro Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ile Gln Arg Met Gly Asp Ser Phe Ala Val Glu Ile Lys Gly
245 250 255
Arg Ile His Phe Asp Leu Phe Pro Val Val Arg Arg Thr Ile Asn Leu
260 265 270
Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Leu Gly Lys Thr
275 280 285
Lys Ser Lys Leu Gly Ala Glu Glu Ile Ala Ala Ile Trp Glu Thr Glu
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Glu Ser Met Lys Lys Leu Ala Gln Tyr Ser Met Glu Asp Ala Arg Ala
305 310 315 320
Thr Tyr Glu Leu Gly Lys Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala
325 330 335
Lys Leu Ile Gly Gln Ser Val Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly
340 345 350
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Leu Ala Pro Asn Lys Pro Asp Glu Glu Glu Tyr Lys Arg Arg Leu Arg
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Thr Thr Tyr Leu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp
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Glu Asn Ile Ile Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile
405 410 415
Val Thr His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Glu Lys Glu Gly Cys Lys
420 425 430
Asn Tyr Asp Val Ala Pro Ile Val Gly Tyr Arg Phe Cys Lys Asp Phe
435 440 445
Pro Gly Phe Ile Pro Ser Ile Leu Gly Asp Leu Ile Ala Met Arg Gln
450 455 460
Asp Ile Lys Lys Lys Met Lys Ser Thr Ile Asp Pro Ile Glu Lys Lys
465 470 475 480
Met Leu Asp Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Leu Leu Ala Asn Ser Tyr
485 490 495
Tyr Gly Tyr Met Gly Tyr Pro Lys Ala Arg Trp Tyr Ser Lys Glu Cys
500 505 510
Ala Glu Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg His Tyr Ile Glu Met Thr Ile
515 520 525
Arg Glu Ile Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr
530 535 540
Asp Gly Phe Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Glu Lys Pro Glu Leu Ile Lys
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Lys Lys Ala Lys Glu Phe Leu Asn Tyr Ile Asn Ser Lys Leu Pro Gly
565 570 575
Leu Leu Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Leu Arg Gly Phe Phe Val
580 585 590
Thr Lys Lys Arg Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Arg Ile Thr Thr
595 600 605
Arg Gly Leu Glu Val Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu
610 615 620
Thr Gln Ala Lys Val Leu Glu Ala Ile Leu Lys Glu Gly Ser Val Glu
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Lys Ala Val Glu Val Val Arg Asp Val Val Glu Lys Ile Ala Lys Tyr
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Arg Val Pro Leu Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp
660 665 670
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675 680 685
Leu Ala Ala Arg Gly Ile Lys Val Lys Pro Gly Thr Ile Ile Ser Tyr
690 695 700
Ile Val Leu Lys Gly Ser Gly Lys Ile Ser Asp Arg Val Ile Leu Leu
705 710 715 720
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740 745 750
Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Ser Ser Lys Gln Thr Gly Leu
755 760 765
Asp Ala Trp Leu Lys Arg
770
<210> 4
<211> 775
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> Pfu(exo-) DNA 중합효소
<400> 4
Met Ile Leu Asp Val Asp Tyr Ile Thr Glu Glu Gly Lys Pro Val Ile
1 5 10 15
Arg Leu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Lys Phe Lys Ile Glu His Asp Arg
20 25 30
Thr Phe Arg Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ile
35 40 45
Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Gly Glu Arg His Gly Lys Ile Val Arg
50 55 60
Ile Val Asp Val Glu Lys Val Glu Lys Lys Phe Leu Gly Lys Pro Ile
65 70 75 80
Thr Val Trp Lys Leu Tyr Leu Glu His Pro Gln Asp Val Pro Thr Ile
85 90 95
Arg Glu Lys Val Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Phe Glu Tyr
100 105 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro
115 120 125
Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys Ile Leu Ala Phe Ala Ile Ala Thr
130 135 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly Pro Ile Ile Met Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Glu Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile
165 170 175
Asp Leu Pro Tyr Val Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Arg Ile Ile Arg Glu Lys Asp Pro Asp Ile Ile Val Thr
195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Ser Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Ala Lys Arg Ala Glu
210 215 220
Lys Leu Gly Ile Lys Leu Thr Ile Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
225 230 235 240
Met Gln Arg Ile Gly Asp Met Thr Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
245 250 255
His Phe Asp Leu Tyr His Val Ile Thr Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr
260 265 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu
275 280 285
Lys Val Tyr Ala Asp Glu Ile Ala Lys Ala Trp Glu Ser Gly Glu Asn
290 295 300
Leu Glu Arg Val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Ala Thr Tyr
305 310 315 320
Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ile Gln Leu Ser Arg Leu
325 330 335
Val Gly Gln Pro Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu
340 345 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Val Ala
355 360 365
Pro Asn Lys Pro Ser Glu Glu Glu Tyr Gln Arg Arg Leu Arg Glu Ser
370 375 380
Tyr Thr Gly Gly Phe Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu Asn
385 390 395 400
Ile Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr
405 410 415
His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Leu Glu Gly Cys Lys Asn Tyr
420 425 430
Asp Ile Ala Pro Gln Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Ile Pro Gly
435 440 445
Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile
450 455 460
Lys Thr Lys Met Lys Glu Thr Gln Asp Pro Ile Glu Lys Ile Leu Leu
465 470 475 480
Asp Tyr Arg Gln Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly
485 490 495
Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu
500 505 510
Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Ile Glu Leu Val Trp Lys Glu
515 520 525
Leu Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile Asp Thr Asp Gly
530 535 540
Leu Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Gly Glu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Lys
545 550 555 560
Ala Leu Glu Phe Val Lys Tyr Ile Asn Ser Lys Leu Pro Gly Leu Leu
565 570 575
Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys
580 585 590
Lys Arg Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Val Ile Thr Arg Gly
595 600 605
Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln
610 615 620
Ala Arg Val Leu Glu Thr Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Glu Ala
625 630 635 640
Val Arg Ile Val Lys Glu Val Ile Gln Lys Leu Ala Asn Tyr Glu Ile
645 650 655
Pro Pro Glu Lys Leu Ala Ile Tyr Glu Gln Ile Thr Arg Pro Leu His
660 665 670
Glu Tyr Lys Ala Ile Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Lys Leu Ala
675 680 685
Ala Lys Gly Val Lys Ile Lys Pro Gly Met Val Ile Gly Tyr Ile Val
690 695 700
Leu Arg Gly Asp Gly Pro Ile Ser Asn Arg Ala Ile Leu Ala Glu Glu
705 710 715 720
Tyr Asp Pro Lys Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn
725 730 735
Gln Val Leu Pro Ala Val Leu Arg Ile Leu Glu Gly Phe Gly Tyr Arg
740 745 750
Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Thr Ser
755 760 765
Trp Leu Asn Ile Lys Lys Ser
770 775
SEQUENCE LISTING <110> Chen, Cheng-Yao <120> METHOD AND KIT FOR TEMPLATE-INDEPENDENT NUCLEIC ACID SYNTHESIS <130> PE-63427-WO <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Initiator for template-independent nucleic acid synthesis <400> 1 ctcggcctgg cacaggtccg ttcagtgctg cggcgaccac cgagg 45 <210> 2 <211> 774 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KOD1(exo-) DNA polymerase <400> 2 Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile 1 5 10 15 Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg 20 25 30 Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Thr 50 55 60 Val Lys Arg Val Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val 65 70 75 80 Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile 85 90 95 Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro 115 120 125 Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Ala Ile Ala Thr 130 135 140 Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Val 165 170 175 Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Arg Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu 210 215 220 Lys Leu Gly Ile Asn Phe Ala Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr Thr Ala Trp Glu Thr Gly Glu Asn 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365 Pro Asn Lys Pro Asp Glu Lys Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr 370 375 380 Glu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile 385 390 395 400 Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His 405 410 415 Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp 420 425 430 Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe 435 440 445 Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys 450 455 460 Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp 465 470 475 480 Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr 485 490 495 Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 500 505 510 Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Lys Glu Ile 515 520 525 Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Gly Phe 530 535 540 Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala 545 550 555 560 Met Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu 565 570 575 Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys 580 585 590 Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu 595 600 605 Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala 610 615 620 Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val Glu Lys Ala Val 625 630 635 640 Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro 645 650 655 Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Asp 660 665 670 Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala 675 680 685 Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu 690 695 700 Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe 705 710 715 720 Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln 725 730 735 Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys 740 745 750 Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Ser Ala Trp 755 760 765 Leu Lys Pro Lys Gly Thr 770 <210> 3 <211> 774 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Vent(exo-) DNA polymerase <400> 3 Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Lys Asp Gly Lys Pro Ile Ile 1 5 10 15 Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Leu Asp Pro 20 25 30 His Phe Gln Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 Glu Glu Ile Lys Ala Ile Lys Gly Glu Arg His Gly Lys Thr Val Arg 50 55 60 Val Leu Asp Ala Val Lys Val Arg Lys Lys Phe Leu Gly Arg Glu Val 65 70 75 80 Glu Val Trp Lys Leu Ile Phe Glu His Pro Gln Asp Val Pro Ala Met 85 90 95 Arg Gly Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro 115 120 125 Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Leu Leu Ala Phe Ala Ile Ala Thr 130 135 140 Phe Tyr His Glu Gly Asp Glu Phe Gly Lys Gly Glu Ile Ile Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile 165 170 175 Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Asn Glu Arg Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Phe Val Gln Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Ile Ile Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Leu Pro Tyr Leu Ile Lys Arg Ala Glu 210 215 220 Lys Leu Gly Val Arg Leu Val Leu Gly Arg Asp Lys Glu His Pro Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ile Gln Arg Met Gly Asp Ser Phe Ala Val Glu Ile Lys Gly 245 250 255 Arg Ile His Phe Asp Leu Phe Pro Val Val Arg Arg Thr Ile Asn Leu 260 265 270 Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Leu Gly Lys Thr 275 280 285 Lys Ser Lys Leu Gly Ala Glu Glu Ile Ala Ala Ile Trp Glu Thr Glu 290 295 300 Glu Ser Met Lys Lys Leu Ala Gln Tyr Ser Met Glu Asp Ala Arg Ala 305 310 315 320 Thr Tyr Glu Leu Gly Lys Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala 325 330 335 Lys Leu Ile Gly Gln Ser Val Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly 340 345 350 Asn Leu Val Glu Trp Tyr Leu Leu Arg Val Ala Tyr Ala Arg Asn Glu 355 360 365 Leu Ala Pro Asn Lys Pro Asp Glu Glu Glu Tyr Lys Arg Arg Leu Arg 370 375 380 Thr Thr Tyr Leu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp 385 390 395 400 Glu Asn Ile Ile Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile 405 410 415 Val Thr His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Glu Lys Glu Gly Cys Lys 420 425 430 Asn Tyr Asp Val Ala Pro Ile Val Gly Tyr Arg Phe Cys Lys Asp Phe 435 440 445 Pro Gly Phe Ile Pro Ser Ile Leu Gly Asp Leu Ile Ala Met Arg Gln 450 455 460 Asp Ile Lys Lys Lys Met Lys Ser Thr Ile Asp Pro Ile Glu Lys Lys 465 470 475 480 Met Leu Asp Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Leu Leu Ala Asn Ser Tyr 485 490 495 Tyr Gly Tyr Met Gly Tyr Pro Lys Ala Arg Trp Tyr Ser Lys Glu Cys 500 505 510 Ala Glu Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg His Tyr Ile Glu Met Thr Ile 515 520 525 Arg Glu Ile Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr 530 535 540 Asp Gly Phe Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Glu Lys Pro Glu Leu Ile Lys 545 550 555 560 Lys Lys Ala Lys Glu Phe Leu Asn Tyr Ile Asn Ser Lys Leu Pro Gly 565 570 575 Leu Leu Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Leu Arg Gly Phe Phe Val 580 585 590 Thr Lys Lys Arg Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Arg Ile Thr Thr 595 600 605 Arg Gly Leu Glu Val Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu 610 615 620 Thr Gln Ala Lys Val Leu Glu Ala Ile Leu Lys Glu Gly Ser Val Glu 625 630 635 640 Lys Ala Val Glu Val Val Arg Asp Val Val Glu Lys Ile Ala Lys Tyr 645 650 655 Arg Val Pro Leu Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp 660 665 670 Leu Lys Asp Tyr Lys Ala Ile Gly Pro His Val Ala Ile Ala Lys Arg 675 680 685 Leu Ala Ala Arg Gly Ile Lys Val Lys Pro Gly Thr Ile Ile Ser Tyr 690 695 700 Ile Val Leu Lys Gly Ser Gly Lys Ile Ser Asp Arg Val Ile Leu Leu 705 710 715 720 Thr Glu Tyr Asp Pro Arg Lys His Lys Tyr Asp Pro Asp Tyr Tyr Ile 725 730 735 Glu Asn Gln Val Leu Pro Ala Val Leu Arg Ile Leu Glu Ala Phe Gly 740 745 750 Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Ser Ser Lys Gln Thr Gly Leu 755 760 765 Asp Ala Trp Leu Lys Arg 770 <210> 4 <211> 775 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pfu(exo-) DNA polymerase <400> 4 Met Ile Leu Asp Val Asp Tyr Ile Thr Glu Glu Gly Lys Pro Val Ile 1 5 10 15 Arg Leu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Lys Phe Lys Ile Glu His Asp Arg 20 25 30 Thr Phe Arg Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ile 35 40 45 Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Gly Glu Arg His Gly Lys Ile Val Arg 50 55 60 Ile Val Asp Val Glu Lys Val Glu Lys Lys Phe Leu Gly Lys Pro Ile 65 70 75 80 Thr Val Trp Lys Leu Tyr Leu Glu His Pro Gln Asp Val Pro Thr Ile 85 90 95 Arg Glu Lys Val Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Phe Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro 115 120 125 Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys Ile Leu Ala Phe Ala Ile Ala Thr 130 135 140 Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly Pro Ile Ile Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Glu Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile 165 170 175 Asp Leu Pro Tyr Val Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Phe Leu Arg Ile Ile Arg Glu Lys Asp Pro Asp Ile Ile Val Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly Asp Ser Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Ala Lys Arg Ala Glu 210 215 220 Lys Leu Gly Ile Lys Leu Thr Ile Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240 Met Gln Arg Ile Gly Asp Met Thr Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr His Val Ile Thr Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Ala Asp Glu Ile Ala Lys Ala Trp Glu Ser Gly Glu Asn 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Ala Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ile Gln Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Val Gly Gln Pro Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Val Ala 355 360 365 Pro Asn Lys Pro Ser Glu Glu Glu Tyr Gln Arg Arg Leu Arg Glu Ser 370 375 380 Tyr Thr Gly Gly Phe Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu Asn 385 390 395 400 Ile Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr 405 410 415 His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Leu Glu Gly Cys Lys Asn Tyr 420 425 430 Asp Ile Ala Pro Gln Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Ile Pro Gly 435 440 445 Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile 450 455 460 Lys Thr Lys Met Lys Glu Thr Gln Asp Pro Ile Glu Lys Ile Leu Leu 465 470 475 480 Asp Tyr Arg Gln Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly 485 490 495 Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu 500 505 510 Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Ile Glu Leu Val Trp Lys Glu 515 520 525 Leu Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile Asp Thr Asp Gly 530 535 540 Leu Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Gly Glu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Lys 545 550 555 560 Ala Leu Glu Phe Val Lys Tyr Ile Asn Ser Lys Leu Pro Gly Leu Leu 565 570 575 Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys 580 585 590 Lys Arg Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Val Ile Thr Arg Gly 595 600 605 Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln 610 615 620 Ala Arg Val Leu Glu Thr Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Glu Ala 625 630 635 640 Val Arg Ile Val Lys Glu Val Ile Gln Lys Leu Ala Asn Tyr Glu Ile 645 650 655 Pro Pro Glu Lys Leu Ala Ile Tyr Glu Gln Ile Thr Arg Pro Leu His 660 665 670 Glu Tyr Lys Ala Ile Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Lys Leu Ala 675 680 685 Ala Lys Gly Val Lys Ile Lys Pro Gly Met Val Ile Gly Tyr Ile Val 690 695 700 Leu Arg Gly Asp Gly Pro Ile Ser Asn Arg Ala Ile Leu Ala Glu Glu 705 710 715 720 Tyr Asp Pro Lys Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn 725 730 735 Gln Val Leu Pro Ala Val Leu Arg Ile Leu Glu Gly Phe Gly Tyr Arg 740 745 750 Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Thr Ser 755 760 765 Trp Leu Asn Ile Lys Lys Ser 770 775

Claims (20)

  1. 핵산을 합성하기 위한 방법으로서,
    3' 말단에 보호되지 않은 뉴클레오사이드 염기, 및 3' 하이드록실기를 갖는 개시인자(initiator)를 제공하는 단계;
    패밀리-B DNA 중합효소(family-B DNA polymerase)의 보존적 촉매 중합효소 도메인을 적어도 갖는 핵산 중합효소를 제공하는 단계;
    뉴클레오타이드 단량체를 제공하는 단계; 및
    핵산 중합효소 및 적어도 한 유형의 2가 양이온의 금속 보조인자의 존재 하에, 그리고 주형(template)의 부재 하에 개시인자를 뉴클레오타이드 단량체에 노출시켜, 뉴클레오타이드 단량체가 개시인자에 혼입되도록 하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 개시인자는 비-자기 상보성 서열(non-self complementary sequence) 및 비-자기 상보성 형성 서열로부터 선택된 서열을 갖는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 개시인자는 고체 지지체(solid support)에 연결되고 고체 지지체에 연결된 5' 말단을 갖는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 고체 지지체는 마이크로어레이, 비드(bead), 컬럼, 광섬유, 와이프(wipe), 니트로셀룰로스, 나일론, 유리, 석영, 디아조화 막(diazotized membrane), 실리콘, 폴리포름알데하이드, 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 종이, 세라믹, 금속, 준금속(metalloid), 반도체 재료(semiconductor material), 자성 입자(magnetic particle), 플라스틱, 겔-형성 재료(gel-forming material), 겔, 나노구조 표면(nanostructured surface), 나노튜브 및 나노입자로부터 선택되는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 개시인자는 10℃ 내지 90℃ 범위의 온도에서 뉴클레오타이드 단량체에 노출되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 개시인자는 8.0 이상의 pH에서 뉴클레오타이드 단량체에 노출되는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 금속 보조인자는 Mg2+, Ca2+, Sr2+, Ba2+, Mn2+, Co2+, Fe2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+ 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 핵산 중합효소는 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 도메인을 추가로 갖고, 박테리아 패밀리-B DNA 중합효소, 진핵생물 패밀리-B DNA 중합효소, 고세균(archaeal) 패밀리-B DNA 중합효소, 및 바이러스 패밀리-B DNA 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 패밀리-B DNA 중합효소인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 패밀리-B 중합효소는 서모코쿠스 코다카라엔시스(Thermococcus kodakaraensis) (KOD1)의 패밀리-B DNA 중합효소, 파이로코쿠스 퓨리오우스(Pyrococus furious) (Pfu)의 패밀리-B DNA 중합효소, 서모코쿠스 종(sp.) (9°N)의 패밀리-B DNA 중합효소, 서모코쿠스 고르고나리우스(Thermococcus gorgonarius) (Tgo)의 패밀리-B DNA 중합효소, 및 서모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) (Vent)의 패밀리-B DNA 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 패밀리-B DNA 중합효소의 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 도메인은 불활성화, 약화(attenuation) 및 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 방식으로 변형되는, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 개시인자는 단일 가닥 형태(single-stranded form)로 존재하는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 개시인자는 적어도 5개의 뉴클레오타이드 단량체를 갖는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 뉴클레오타이드 단량체는 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 테트라포스페이트, 펜타포스페이트 및 헥사포스페이트로부터 선택된 포스페이트기를 갖는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 뉴클레오타이드 단량체는 3'-O-차단 모이어티(3'-O-blocking moiety), 염기 차단 모이어티, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 제거 가능한 차단 모이어티를 갖는, 방법.
  15. 핵산을 합성하기 위한 키트(kit)로서:
    3' 말단에 보호되지 않은 뉴클레오사이드 염기, 및 3' 하이드록실기를 갖는 개시인자;
    패밀리-B DNA 중합효소의 보존적 촉매 중합효소 도메인을 적어도 갖는 핵산 중합효소; 및
    뉴클레오타이드 단량체를 포함하고,
    상기 키트는 핵산 중합효소를 이용하여 주형-비의존적 합성을 수행하는, 키트.
  16. 제15항에 있어서, 개시인자는 비-자기 상보성 서열 및 비-자기 상보성 형성 서열로부터 선택된 서열을 갖는, 키트.
  17. 제15항에 있어서, 핵산 중합효소는 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 도메인을 추가로 갖고, 박테리아 패밀리-B DNA 중합효소, 진핵생물 패밀리-B DNA 중합효소, 고세균 패밀리-B DNA 중합효소, 및 바이러스 패밀리-B DNA 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택된 패밀리-B DNA 중합효소인, 키트.
  18. 제17항에 있어서, 패밀리-B 중합효소는 서모코쿠스 코다카라엔시스 KOD1의 패밀리-B DNA 중합효소, 파이로코쿠스 퓨리오우스 (Pfu)의 패밀리-B DNA 중합효소, 서모코쿠스 종 (9°N)의 패밀리-B DNA 중합효소, 서모코쿠스 고르고나리우스 (Tgo)의 패밀리-B DNA 중합효소, 및 서모코쿠스 리토랄리스 (Vent)의 패밀리-B DNA 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
  19. 제17항에 있어서, 패밀리-B DNA 중합효소의 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 도메인은 불활성화, 약화 및 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 방식으로 변형되는, 키트.
  20. 제15항에 있어서, 뉴클레오타이드 단량체는 3'-O-차단 모이어티, 염기 차단 모이어티, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 제거 가능한 차단 모이어티를 갖는, 키트.





KR1020227024703A 2019-12-23 2020-12-21 주형-비의존성 핵산을 합성하는 방법 및 키트 KR102478977B1 (ko)

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