TWI759178B - 中國倉鼠卵巢細胞基因組之靶向嵌入位點 - Google Patents

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Abstract

本發明係描述用於靶向插入外源基因之特定CHO基因組位點。該等位點位於選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 16之序列內。

Description

中國倉鼠卵巢細胞基因組之靶向嵌入位點
本發明係關於用於靶向插入外源基因之特定CHO基因組位點。該等位點位於選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 16之序列內。
中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)細胞常用於產生具有適當轉譯後修飾(諸如糖基化)之治療蛋白。用於產生高產量細胞的傳統隨機嵌入細胞系開發(cell line development；CLD)方法需要篩選大量細胞是耗時且勞力密集之過程。開發出用於蛋白表現之細胞株的基本目標是經過多代培養後仍能表現出具高產率及穩定性之生產蛋白質。將轉殖基因(transgene)靶向嵌入(Targeted integration；TI)至活性及穩定的染色體區中對於重組蛋白之穩定表現是令人期望的。理想情況下，靶向嵌入之細胞株的表現效價及穩定性主要應取決於嵌入位點。因此，藉由利用TI-CLD策略，可能僅需要篩選數百個細胞就可以找到高產量細胞株。
在一個態樣中，本文提供一種經工程改造細胞。該細胞含有一個外源核酸分子，該核酸分子係插入在該經工程改造細胞的基因組中，其中該經工程改造細胞係藉由包括下列的程序獲得：將用以把外源核酸分子插入至宿主細胞基因組中之表現增強序列內的靶向位點之構築體引入至宿主細胞中，該表現增強序列與選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 16或其片段的序列至少80%相同。舉例而言，該表現增強序列可選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 16。 在一些實施例中，該構築體為包括外源核酸分子之同源重組構築體，該外源核酸分子兩側分別接第一同源臂及第二同源臂，該第一同源臂係與靶向位點上游的序列同源，而該第二同源臂係與靶向位點下游的序列同源。 在一些實施例中，該表現增強序列選自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14及SEQ ID NO: 16。 在一些實施例中，該宿主細胞為CHO細胞。 該經工程改造細胞在靶向位點處可含有外源核酸分子。另外或除此之外，該經工程改造細胞在脫靶位點處可含有外源核酸分子，其中該經工程改造細胞與對照細胞相比，會表現出較高程度之外源核酸分子。 在一些實施例中，該外源核酸係編碼多肽。 在另一態樣中，本文描述一種產生含有外源核酸分子之經工程改造細胞的方法。該方法包括將用以把外源核酸分子插入至宿主細胞基因組中之表現增強序列內的靶向位點之構築體引入至宿主細胞中，該表現增強序列與選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 16或其片段的序列至少80%相同，由此該外源核酸便可插入至宿主細胞中之基因組位點中，以產生經工程改造細胞。該外源核酸可編碼多胜肽。 在一些實施例中，該構築體為包括外源核酸分子之同源重組構築體，該外源核酸分子兩側分別接第一同源臂及第二同源臂側接，該第一同源臂係與靶向位點上游的序列同源，而該第二同源臂係與靶向位點下游的序列同源。 在一些實施例中，該宿主細胞為CHO細胞。 在一些實施例中，該表現增強序列選自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14及SEQ ID NO: 16。 在一些實施例中，該方法可另外包括在引入步驟之後，選擇與對照細胞相比能表現較高程度之核酸分子的經工程改造細胞。 在又一態樣中，本文描述用於將外源核酸分子插入至宿主細胞基因組中之表現增強序列內的靶向位點之構築體，該表現增強序列與選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 16或其片段的序列至少80%相同。舉例而言，該構築體可為同源重組構築體，其包括與靶向位點上游之序列同源的第一同源臂及與靶向位點下游之序列同源的第二同源臂。 在一些實施例中，該表現增強序列選自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14及SEQ ID NO: 16。 在一些實施例中，該構築體另外包括外源核酸分子，該外源核酸分子兩側側接第一同源臂及第二同源臂側接。該構築體可另外包括可操作連接至外源核酸分子的啟動子。 以下隨附圖式及實施方式中係闡述一或多個實施例之細節。從實施方式與圖式，及從申請專利範圍就可清楚明白本發明實施例之其他特徵、目標及優點。
相關申請案之交叉參考 本申請案主張2016年12月20日申請之美國臨時申請案第62/436,714號之優先權，該申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。 出乎意料地發現，基因插入在CHO細胞中某些基因組序列內之位點(亦即，靶向位點)處會有增強之表現。此外，咸發現，基因經由同源重組構築體(其經設計以將基因專一性地插入至脫靶基因組序列其中之一者中)而插入至脫靶基因組位點中亦會使表現增加。因此，此等基因組序列即為表現增強序列。 如本文中所使用，「插入位點」、「基因組位點」及「靶向位點」中之術語「位點」係指包括一或多個核苷酸(例如，1至500個核苷酸)的區域。 術語「外源核酸分子」係指坐落在細胞內的位點但該位點非為核酸分子天然位點之核酸分子。舉例而言，該核酸分子可能理所當然地存在於細胞中不同的位點處。或者，該核酸分子可能是源自不同的細胞。 除非另外說明，否則本文中所引用之CHO基因組係指中國倉鼠2013年7月組裝體(C_griseus_v1.0/criGri1)。 表現增強序列可選自與選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 16或其片段(例如，100至2000、150至1500、200至2000、100至500、250至500、200至750、500至1000、500至1500、800至1500、1000至1500或1000至2000個核苷酸)之序列至少80% (例如，85%、90%、95%、98%或99%)相同之序列。插入外源核酸分子之靶向位點可位於表現增強序列內或附近(例如，在上游或下游500個核苷酸內)的任何位置。在一些實施例中，靶向位點係在SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15內之位置1至500、200至500、50至1000、100至1000、200至1000、300至1000、400至1000、500至1000、100至2000、500至2000、700至2000、1000至2000、500至3000、1000至3000、1500至3000、2000至3000、2500至3000、500至4000、1000至4000、2000至4000、1500至5000、2500至5000、3500至5000、4500至5000、2000至6000、3000至6000、4500至6000、5000至6000或5500至6000內。 此等表現增強序列可用以產生高度表現插入在經工程改造細胞中基因組內的一或多個外源核酸分子之經工程改造細胞。在一些實施例中，該經工程改造細胞係藉由將外源核酸嵌入至CHO細胞之基因組中而產生的。該經工程改造細胞與對照細胞相比，呈現出較高的外源核酸分子表現量(例如，一倍或多倍)。 「對照細胞」係指含有相同核酸分子但該核酸分子坐落在不同位點處或藉由隨機方式插入的細胞。舉例而言，可藉由將含有核酸分子之pCHO1.0載體隨機嵌入至CHO宿主細胞之基因組中來產生對照細胞。CHO聯盟(CHO Consortium)亦已確立出各種潛在的基因組位點。可藉由將核酸分子特定地插入至此等位點中之一者中來產生對照細胞。可以mRNA含量或蛋白含量測量表現量。因為經工程改造細胞或對照細胞可含有超過一個所插入核酸分子之複本，因此比較結果可藉由測定每複本之表現量加以標準化。 熟習此項技術之執業者可測定出該等表現增強序列中之一者內或附近的靶向位點是否能增強核酸分子之表現。只要位點可以增強表現且能夠讓核酸分子穩定的嵌入，則表現增強序列內或附近之靶向位點的精確位置並不重要。位點選擇亦取決於用以插入基因之基因組編輯技術(genome editing technique)。 本文所描述之經工程改造細胞可藉由包括以下的程序獲得：將用以把外源核酸分子插入至宿主細胞基因組中之表現增強序列內的靶向位點之構築體引入至宿主細胞中。 儘管該等方法及構築體可用以將核酸分子專一性地插入在表現增強序列中之一者內，但仍然會出現偏離位點之插入(off-site insertion)。咸發現，含有此類偏離位點插入之經工程改造細胞亦會使所插入核酸分子之表現增加。不意欲受理論束縛，咸信此類偏離位點插入攜載著衍生自表現增強序列之同源重組構築體中的同源臂(或其片段)。因此，本文所描述之經工程改造細胞係指在表現增強序列中之一者內的靶向位點處或在不同位點處具有插入的外源核酸分子。 許多不同的方法可用以在基因組位點處插入外源核酸分子。此等方法包括同源重組修復(homologous directed repair)、非同源末端接合(non-homologous end-joining)、基於鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease ；ZFN)之方法、基於TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease；轉錄活化子樣效應子核酸酶)之方法及CRISPR (ClusteredRegulatoryInterspacedShortPalindromicRepeat；成簇且規律間隔之短回文重複序列)/Cas9方法。 可設計出用於將外源核酸分子插入本文所述之表現增強序列中之一者內或附近的靶向位點處的同源重組(HR)構築體。構築體包括與靶向位點上游之序列同源的第一同源臂及與靶向位點下游之序列同源的第二同源臂。各同源臂可包括例如200至1500個核苷酸(例如，200至250、200至400、250至500、300至500、400至600、450至650、500至800、550至750、650至900、800至1000、950至1200或1000至1500個核苷酸)。HR構築體可另外包括介於兩個同源臂之間的多個選殖位點，如此可以使得待插入至基因組中之基因接合至構築體。另一種方式是，可使用此項技術中已知之技術(例如，PCR)來構築含有兩側分別接兩個同源序列之基因的HR構築體。 HR構築體可用於TALEN或CRISPR/Cas9系統中，以便將核酸分子插入至細胞之基因組中。 靶向位點可視所使用的基因組編輯方法加以選擇。TALEN及CRISPR/Cas9方法兩者皆係因在基因組靶向位點引入雙股DNA斷裂而起作用的。根據所選擇的位點，可設計出及建構出在靶向位點處帶有待插入核酸分子的HR構築體。 TALEN係利用嵌合核酸酶，該核酸酶含有轉錄活化子樣效應子(transcription activator-like effector；TALE)蛋白之人工DNA結合區域及限制性核酸內切酶FokI之催化區域。因為被TALE蛋白質所識別之DNA密碼業已解密，所以可以設計出用於識別任何DNA序列之人工DNA結合區域。為了最小化偏離位點效應，TALEN方法可使用一對嵌合核酸酶，其各自可識別雙股DNA斷裂位點之任一側上的序列。熟習此項技術之執業者應能夠設計出定向於所選擇位點之TALEN構築體。 CRISPR/Cas9需要專一性辨認靶向位點之gRNA以及核酸內切酶Cas9。靶向位點係為與基因組其餘部分相比具獨特性的且緊靠在原型間隔體鄰近基元(ProtospacerAdjacentMotif，PAM)之上游的任何序列(約20個核苷酸)。當Cas9/gRNA複合物結合至靶向位點時，Cas9會裂解DNA。SEQ ID NO: 7內的兩個例示性PAM示於圖1中，而SEQ ID NO: 9內的一個例示性PAM示於圖2中。熟習此項技術之執業者能夠設計出定向於靶向位點之CRISPR/Cas9構築體。 待插入之外源核酸可包括可操作地連接至在該工程改造細胞中具有功能性的啟動子之序列，該序列係編碼多肽。該啟動子序列對於編碼序列而言可為內源性的。在一些實施例中，該編碼序列可操作地連接至異源啟動子序列。該外源核酸分子之表現可利用此項技術中已知之技術進一步優化。舉例而言，可藉由將核酸分子連接至較強啟動子及/或一或多種轉錄強化子元素來進一步增強表現。 可使用此項技術中已知之方法來驗證外源核酸分子至細胞之基因組中之嵌入。將該經工程改造細胞培養在可表現核酸分子的適合條件下，使用此項技術中已知之方法(例如，ELISA或RT-PCR)亦可測定該經工程改造細胞是否展現出增強之表現。 此外，無論表現增強序列是處於其天然基因組基因座或處於不同的基因座，因表現增強序列可發揮表現增強作用，因此其等可包括於用於基因之短暫表現的表現載體中。舉例而言，表現載體可含有基因及一或多個表現增強序列。如果包含超過一個表現增強序列，則該等表現增強序列可以串聯方式配置，其等之間可具有或不具有間隔體。該載體可引入至宿主細胞中以短暫表現該基因。 此項技術中已知之各種宿主細胞可用以產生本文所描述之經工程改造細胞。此等宿主細胞可包括任何哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞為CHO細胞。 本文所描述之經工程改造細胞可用於各種商業及實驗應用。特定言之，該等細胞可用於產生治療蛋白。 以下特定實例應視為說明性的，且不以任何方式限制本發明之其餘部分。無需進一步詳細描述，咸信熟習此項技術者即可根據本文的描述充分最大程度地利用本發明。 實例 吾等藉由將含有赫賽汀基因之pCHO1.0載體隨機嵌入至CHO-S宿主細胞的基因組中，預先產生兩個CHO細胞系，3C8及3G7。3C8及3G7分別具有基因的12個及5個複本且會產生3g/L及2.5g/L基因產物。分析此等兩個細胞株中的嵌入位點。參見以下表1。Srxn1、Adh5、Asphd/Josd2、Tenm3、Siva1、Syne1、Smarcc1及Rsg19位點分別位於SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14及SEQ ID NO: 16內。 表1. 3C8及3G7細胞株之嵌入位點
細胞系 位點 位置
3C8 Srxn1 SEQ ID NO: 2
Adh5 SEQ ID NO: 4
Aspdh/Josd2 SEQ ID NO: 6
Tenm3 SEQ ID NO: 8
3G7 Siva1 SEQ ID NO: 10
Syne1 SEQ ID NO: 12
Smarcc1 SEQ ID NO: 14
Rgs19 SEQ ID NO: 16
3C8細胞株中之Tenm3嵌入位點展示於圖1中。在3C8細胞株中，兩個黑色方塊之間的序列經刪減掉，而將帶有赫賽汀基因的pCHO1.0載體插入其中。3G7細胞株中之Siva1內的嵌入位點展示於圖2中。 吾等藉由使用CRISPR技術，將赫賽汀基因插入至CHO宿主細胞之基因組中來測試Tenm3嵌入位點。參看圖1，所使用的兩個CRISPR目標序列係以灰色突出顯示，且PAM係經加框。用於嵌入赫賽汀基因之上游及下游同源序列係以粗體展示於圖1中。 將CRISPR載體及同源重組供體載體轉染至CHO-S及DXB11宿主細胞中。細胞在轉染後48小時經分類及回收。使用不同濃度之嘌呤黴素(10µg/ml、50 µg/ml或100 µg/ml)及MTX (100nM、500nM或1000nM)以選擇含有經嵌入基因之細胞。參見以下的表2及表3。使用FACS或限制稀釋法以選擇出用來建立單細胞株。使用T7E1分析及Junction-PCR分析來驗證赫賽汀基因嵌入至預定位點的情況。 利用ELISA分析經以嘌呤黴素及MTX選擇出之CHO細胞群中所插入赫賽汀基因之表現。吾等藉由將該基因插入至三個其他的嵌入位點中來產生三個對照組細胞株(對照1、對照2及對照3)，此三個嵌入位點是由CHO聯盟所找到。插入在Tenm3嵌入位點內之基因的每複本表現效價(mg/L/複本)顯著高於三個對照組。參見表2、表3、圖3及圖4。 表2. CHO-S宿主細胞中之Tenm3位點處之靶向嵌入
位點 嘌呤黴素(µg/ml)/MTX (nM) 效價(mg/L) 複本數 效價/複本(mg/L/複本)
對照_1 10/100 36.6 11.0 3.3
對照_2 10/100 24.8 8.4 3.0
對照_3 10/100 35.6 1.6 22.0
Tenm3 10/100 36.9 1.4 26.9
表3. DXB11宿主細胞中之Tenm3位點處之靶向嵌入
位點 嘌呤黴素(µg/ml)/MTX (nM) 效價(mg/L) 複本數 效價/複本(mg/L/複本)
對照3_10P 10/100 16.85 2.2 7.7
對照3_50P 50/500 219.32 9 24.4
對照3_100P 100/1000 231.62 12 19.3
Tenm3 10P 10/100 79.4 0.3 264.7
Tenm3 50P 50/500 267.24 2 133.6
Tenm3 100P 100/1000 298.46 2.1 142.1
吾等測試了衍生自6天批次培養物之DXB11細胞的單一細胞株，且發現其等細胞所插入的基因會增強表現。參見圖5。特定言之，DXB11-1E8、DXB11-1E2及DXB11-1G5單一細胞株經培養60代仍不會減損所增強的表現。 吾等亦使用CRISPR技術將赫賽汀基因插入至DXB11宿主細胞中之Siva1、Syne1、Smarcc1及Rgs19位點中，以產生經工程改造細胞。使用不含MTX之750 µg/ml遺傳黴素(geneticin)來選擇出具有所期望插入之細胞。此條件會選擇出具有低複本數之插入的細胞。雖然該等經工程改造細胞的複本數低，但與以隨機嵌入技術所產生的細胞(效價=約80mg/L)相比，此等經工程改造細胞亦會使該基因之表現增加。參見表4。特定言之，藉由靶向Siva1位點所產生之經篩選之細胞群的效價為235mg/L/複本。圖2展示PAM序列及用以將基因插入至Siva1位點中之兩個同源臂。 表4. DXB11宿主細胞中Siva1、Syne1、Smarcc1及Rgs19位點處之靶向嵌入
   Siva1 Syne1 Smarcc1 Rgs19
mg/L 134.01 117.44 123.71 146.71
mg/L/複本 235 135 169 177
亦測試來自Siva1細胞群之單一細胞株。如圖6及圖7中所展示，此等單一細胞株皆會使赫賽汀基因之表現增加。分析顯示，在此等單一細胞株中，儘管某些具有脫靶插入，而某些具有多個插入複本，但許多單一細胞株只有一個複本嵌入目標位置。 其他實施例 本說明書中揭示之所有特徵可以任何組合形式組合。本說明書中揭示之各特徵可以提供相同、等效或類似目的之替代性特徵取代。因此，除非另外明確說明，否則所揭示之各特徵僅為一系列通用等效或類似特徵之一個實例。 根據以上描述，熟習此項技術者可輕易地確定所述實施例之基本特徵，且在不悖離其精神及範疇之情況下可對實施例作出各種變化及修改以使其適應各種用途及條件。因此，其他實施例亦屬於申請專利範圍內。
圖1為包括SEQ ID NO: 7之位置1001-5537的序列。在隨機嵌入細胞株中，介於兩個黑色方塊之間的序列係經刪減掉，而帶有赫賽汀(Herceptin)基因的pCHO1.0載體則插入在其中。兩個PAM序列係加框呈現且兩個CRISPR靶向序列則以灰色突出顯示。用於基因之靶向嵌入的兩個同源臂以粗體呈現。加底線之序列為引子序列。 圖2為包括SEQ ID NO: 9之位置1100-5208的序列。黑色方塊是表示隨機嵌入細胞株中之赫賽汀基因之嵌入位點。PAM序列係加框呈現。用於基因之靶向嵌入的兩個同源臂則以粗體呈現。加底線之序列為引子序列。 圖3係呈現在CHO-S細胞中之Tenm3位點處插入之赫賽汀基因之表現(mg/L/複本)的圖式。該圖式係以下文表2中所示的資料為基礎。 圖4係呈現在DXB11細胞中之Tenm3位點處插入之赫賽汀基因之表現(mg/L/複本)的圖式。該圖式係以下文表3中所示的資料為基礎。10P、50P及100P各自係指用以選擇該等細胞之嘌呤黴素(puromycin)及MTX的濃度。10P：10 µg/ml嘌呤黴素及100nMMTX；50P：50 µg/ml嘌呤黴素及500nMMTX；100P：100 µg/ml嘌呤黴素及1000nMMTX。 圖5係呈現帶有赫賽汀基因的DXB11細胞株之表現效價(mg/L)的圖式，該赫賽汀基因係插入在Tenm3位點處。 圖6係呈現帶有赫賽汀基因的DXB11細胞株之表現效價(mg/L)的圖式，該赫賽汀基因係插入在Siva1位點處。 圖7係呈現帶有赫賽汀基因的DXB11細胞個別純系之比生產率(QP；mg/106 個細胞/天)的圖式，該赫賽汀基因係插入在Siva1位點處。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
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Claims (15)

  1. 一種經工程改造細胞，其包含插入於該經工程改造細胞之基因組中的外源核酸分子，其中該經工程改造細胞係藉由包括下列的程序獲得：將用以把該外源核酸分子插入至宿主細胞基因組中之表現增強序列內的靶向位點之構築體引入至宿主細胞中，該表現增強序列為SEQ ID NO: 14。
  2. 如請求項1之經工程改造細胞，其中該構築體係包括外源核酸分子之同源重組構築體，該外源核酸分子兩側分別接第一同源臂及第二同源臂，該第一同源臂與該靶向位點上游之序列同源，且該第二同源臂與該靶向位點下游之序列同源。
  3. 如請求項1或2之經工程改造細胞，其中該宿主細胞為CHO細胞。
  4. 如請求項3之經工程改造細胞，其中該經工程改造細胞在該靶向位點處含有該外源核酸分子。
  5. 如請求項3之經工程改造細胞，其中該經工程改造細胞在脫靶位點處含有該外源核酸分子，其中該工程改造細胞與對照細胞相比，表現出較高程度之該外源核酸分子。
  6. 如請求項1或2之經工程改造細胞，其中該外源核酸編碼多肽。
  7. 一種產生含有外源核酸分子之經工程改造細胞的方法，其包含將用以把外源核酸分子插入至宿主細胞基因組中之表現增強序列內的靶向位點之構築體引入至宿主細胞中，該表現增強序列為SEQ ID NO: 14，由此該外源核酸插入至該宿主細胞之基因組位點中，以產生該經工程改造細胞。
  8. 如請求項7之方法，其中該構築體為包括外源核酸分子之同源重組構築體，該外源核酸分子兩側分別接第一同源臂及第二同源臂側接，該第一同源臂與該靶向位點上游之序列同源，且該第二同源臂與該靶向位點下游之序列同源。
  9. 如請求項8之方法，其中該宿主細胞為CHO細胞。
  10. 如請求項中7至9中任一項之方法，其在該引入步驟之後進一步包含選擇出與對照細胞相比會表現出較高程度之該核酸分子的經工程改造細胞。
  11. 如請求項7至9中任一項之方法，其中該外源核酸編碼多肽。
  12. 一種構築體，其用於將外源核酸分子插入至宿主細胞基因組之表現增強序列內的靶向位點中，該構築體為同源重組構築體，其包括與該靶向位點上游之序列同源的第一同源臂及與該靶向位點下游之序列同源的第二同源臂，該表現增強序列為SEQ ID NO: 14。
  13. 如請求項12之構築體，其中該宿主細胞為CHO細胞。
  14. 如請求項12或13之構築體，其進一步包含兩側分別接該第一同源臂及該第二同源臂之外源核酸分子。
  15. 如請求項14之構築體，其進一步包含可操作連接至該外源核酸分子之啟動子。
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